Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДНК-полимераза ипсилон из плаценты человека: выделение, свойства,, субстратная специфичность

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "ДНК-полимераза ипсилон из плаценты человека: выделение, свойства,, субстратная специфичность"

российская академия наук

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи УДК 577.113

МОЗЖЕРИН Дмитрий Юрьевич

ДНК-ПОЛИМЕРАЗА е ИЗ ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА: ВЫДЕЛЕНИЕ, СВОЙСТВА, СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ

03.00.03 — Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

д. б. н. Куханова 'М. К. к. х. н. Атражев А. М.

лшсквл тз

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук КУХАНОВА М.К. кандидат химических наук АТРАЖЕВ A.M.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук МИХАЙЛОВ B.C. доктор химических наук КОЧЕТКОВ С.Н.

"Ведущая dprawHsamw: Кардиологический научный центр Российской «кадеииш меДйпинских наук,

Защита диссертации состоится " £7 " ■ ^ЛЛ-СЬ^ 1993. г. ъ"^" часо» т заседаний специализированного совета Д 002.79.01 в Институте молекулярной биологии им. В.А. Знгелма{>дта РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН. Автореферат разослан " 2.-?" 1993 г. :

Ученый секретарь специализированного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы являются ферментами, ответственными за синтез ДНК в живых клетках! К насто- ' ящему.временй ДНК-полимеразы выделены из многих видов организмов от вирусов до человека. Однако, несмотря на значительный прогресс в , изучении этих ферментов, информация об их свойствах, роли в процессе синтеза ДНК достаточно противоречива. Это определяется в первую оче-, реяь сложностью строения ферментов, трудоемкостью их очистки.и разнообразием их функций. До недавнего времени считаюсь, что основной рс-пликативной ДНК-полимеразой у эукариот является ДНК-полимераза а. Только в последние.годи стало очевидно, что а репликации ДНК у эукариот принимают участие ешедве ДНК-полимеразы: ДНК-полимераза б и ДНК-полимераза е. В последние годы значительные усилия исследователей были направлены на очистку и характеризацию этих ферментов. Однако до сих пор отсутствует метод выделения гомогенного препарата ДНК-полимеразы с из плаценты человека, весьма ограничены сведения о субстратной специфичности фермента, изучение которой позволит проводить направленный синтез ингибиторов репликации ДНК с участием ДНК-полимеразы е. .

Цель и задача исследования. Основной задачей исследования была разработка метода.выделения ДНК-полимеразы е из плаценты человека, изучение субстратных свойств ДНК-полимеразы в с помощью аналогов нуклеозид 5'-трифосфатов, модифицированных по фуранозному кольцу и трифосфатной группе! Эта работа проводилась в плане исследований Лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток по сравнительному исследованию ДНК-полимераз из разных источников и механизмов катализа синтеза ДНК с помощью субстратных ингибиторов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе впервые разработан метод быстрого выделения гомогенного препарата ДНК-полимеразы г нз плаценты человека. Метод позволяет параллельно получать высокоактивный препарат ДНК-полимеразы а. Изучение физико-химических свойств полученной ДНК-полимеразы е показало, что она состояла нз одной субъединицы с молекулярной массой 170 кД,я. Впервые проведен систематический ингибиторный аналнз синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразой е с помощью аналогов нуклеозид 5'-трифос-фатов, модифицированных по фуранозному кольцу и трифосфатной груп-

не.'Показано, что ДНК-полимерам е имеет, высокую субстратную специфичность. Из испытанных соединений субстратами ДНК-полимеразы е были только три вида аналогов нуклеозид З'-трифо'сфатов; З'-змИно-2',3'-дидезоксит11мидин-5,-трифосфат(с1сГГГР(3'НН2), 1-((5-0-арабиио-фуранндил)-цитозин-5'-трифосфат (агаСТР) и ациклические аналоги 0-4'-цор-2\3'-дидезокси-2\3'-дидегидранукяеозид-5'-трифосфаты (асус1о-<!4ЫТР). Все они включались в рэстущую цель ДНК н терминировали синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой е. Найдены различия в субстратной специфичности между ДНК-полимеразой е и другими ДНК-|1рлимеразамн эукариот, а также обратными транскриптазами. : ретровирусоь. -

Объем работы. Диссертации изложена на {27 страницах, включая /2 рисунков, ^ таблиц и список цитированной литературы ссылок), работа состоит из введении, четырех глав и выводов. Глава I - Обзор литературы, Глава 2 - Материалы и методы, Глава 3 - Обсуждение и результаты. Глава 4 - Заключение.

Публикации н апробации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ и еще I находится в печати,- Результаты работы догладывались на Международном симпозиуме "Синтетические олигону-клеотиды: проблемы и перспективы практического применения" (1991, Москва), на Международной конференции "Мояекулярно-биологические аспекты диагностики и терапии СПИДа (1991, Новосибирск), на 17-м Международном конгрессе по химиотерапии (1991, Берлин), на 8-м Средиземноморском конгрессе по химиотерапии (1992, Афины), на Международной конференции "Молекулярная биология репликации ДНК" . (1992, Веггис-Швейцария).,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 .выделение ДНК-полимераз е и а из плаценты человека

Выделение ДНК-полимераз проводили при 4 "С. Весь процесс занимал 2,5 суток (без учета времени хранеиня препаратов в виде белкового осадка в сульфате аммонии). ДНК-полимеразы а й е идентифицировали по степени ингибировашш их ферментативной активности 3 ми ¡VI Н2-(р-п-бут1тфс)шл)-2'-дезоксигуантин-5'-трифосфатом (ВиГЧиЮТР), селективным ингибитором ДНК-полимеразы а.

В качестве первой стадии выделения ДНК-нолимераз а и е мы использовали колоночную хроматографию на. фосфоцелдюлозе Р-11 (ко-

лонка 5x30 см). Часто применяющаяся на первой стадии адсорбция в объеме, употребляемая для более быстрого связывания белков, оказалась недостаточно хорошей для достижения эффективного отделения балластных белков. При элюции 100-500мМ градиентом калий-фосфатного буфера мы получили два пика, одни из которых содержал ДНК-полимеразу а (фракции 9-18), а второй полимеразы а и е (фракции 23-40) (рис.1). Возможно, что эти полимеразы существуют в стабильном комплексе, чем и объясняется их совместная элюцин во втором пике. Активные фракции, содержащие ДНК-полимеразу а и смесь ДНК-полимераз а и s объединили отдельно. Концентрирование белка проводили осаждением 60% сульфатом аммония. Затем осажденные препараты второго пика с фосфоцеллюлозы, содержащие полимеразы а и е, обессоливали на колонке с Сефакрилом S-300. Применение на следующей стадии аффинного сорбента гепарин-агарозы (1,5x5см) позволило при промывке колонки 200мМ KCl в 50мМ калий-фосфатном буфере с pH 7,0 почти полностью отделить ДНК-полимеразу е от ДНК-полимеразы а н от большого количества балластных белков. Поэтому, при элюции градиентом 200-500мМ KCl приготовленном на том же буфере мы получили препарат ДНК-полимеразы в практически не содержащий активности ДНК-полимеразы а (фракции 8-15) (рис.2). Использование затем адсорбционной хроматографии на гад рокси Л апатите (ГАП) (колонка 1,5x1,5см) с элгацией 500мМ KCl привело к получению препарата, который не образовывал комплекса с моиоклональными антителами к ДНК-полимеразе а SJK-132-20, Последним сорбентом мы использовали ДЭАЭ-целлюлозу (колонка 1x1см), с которой мы элюировали фермент ЗООмМ KCl. Полученный препарат еще не был гомогенен, но не содержал эндо-нуклеазных, 5'->3' экзонуклеазной и протеазных активностей и мог быть использован для изучения терминаторных свойств ряда аналогов нуклео-зид-5'-трифосфатов методом Сэйгера. Результаты по хроматографической очистке ДНК-полимеразы е приведены в табл.1. Для дальнейшей очистки мы использовали зонально-скоростное центрифугирование в градиенте плотности глицерина {15*30% об./об.). На рис.3 показан профиль активности полученных фракций. Симметричная форма пика говорит об однородности полученного фермента, который имел коэффициент седиментации 7,8S. Денатурирующий белковый электрофорез в полиакриламид-ном геле показал, что плотность только одной полосы, соотаетствующей белку с молекулярной массой. 170 »Да четко кореллировала с «наивностью

- В^рыкзгр-

-О- виР1кЮТР+ --КСГ

6 10 14 19 22 2в 30 34 38 42

Номер фракции

Рисунок I Хроматография гомогената плаценты человека на фосфоцеллюлозе Р-Н, Активность измерялась в отсутствие и присутствии ЗмкМ ВиРЬсЮТР ,

«(ЮМ &0000 | 40000

г

ч

с 30000

I X

20000

Л

450 400

/

В

9

■ (>

360 ?

г

300 0

250 «с

§

200 ЛЭ

а

150 £

100 ? 0

БО

0 ■

Е^МСТР-

ш

Э 13 17

Номер фракции

Рисунок 2 Хроматография фракций 23-40 (рис.1) на гепарин-агарозе. Активность измерялась в отсутствие и присутствии ЗмкМ ВиРЬсЮТР

соответствующей фракции. Во фракциях 9-10 фермент был практически гомогенен (рис.4). Таким образом, из коэффициента седиментации и результатов белкового электрофореза можно заключить, что выделенная по-лимераза представляла собой односубъединичный мономерный белок с молекулярной массой 170кДа. Данный результат согласуется с полученным в лаборатории M.Y.W.T. Lee для ДНК-полимеразы г из плаценты че-' ловека, (Lee, Тоогпеу 1987). Эта группа исследователей использовала 8 хроматографических стадий, в то время как наша методика содержит только 5 стадий. Их препарат не был гомогенен и определение субъединичного состава проводилось по ренатурации белка в полиакриламидном геле или иммуноблоттингом. В других лабораториях не пользовались плацентой человека как источником для получения ДНК-полимеразы е.

Таблица 1.

Схема хроматографической очистки ДНК-полимеразы к ш плаценты человека.

Стадия очистки Кол-во Общее Суммарная Удельная Выход

белка, кол-во активность активность, активн.

мг/мл белка, мг , ед.ак . ед.акт./мг %

Грубый экстракт 34 ' 51000 - .

Фосфоцеллго- 0,47 85 37000 430 100

лоза Р-11 ' —

Сефакрил S300 4,1 49 28000 580 76

Гепарин- агароза 0.51 !6(8 17000 JOOO 46

ГАП 0,41 . ■5 • 14500 ЗООО " 39

ДЭАЭ-целлюлоза 0,32 0,45 4200 , 9300 11

Параллельно с ДНК-полимеразой е метод позволяет выделить высокоактивный препарат ДНК-полимеразы а. Для этого белковый сульфат-аммонийный осадок фракций 10-18 (рис.1 > после растворения и обессо-ливанйя на колонке с Сефакрилом S-300 был нанесен" на колонку с гидроксилапатнтом и после элгойий 500 мМ KCl белко&ые фракции разделяли на анионообмснной FPLC колонке Моно-Q HR5/5 градиентом 100-500мМ KCL Полученнии а результате фермент не был гомогенен, но не содержал загрязняющих экзо- и эндонуклеаз и был использован для i сравнительного анализа ингкбнторных и терминаторнмх свойств модифицированных аналогов. нуклеазид-5*-трифосфатов. Коэффициент ееди-

6000 7000 6000 5000

с 4000 ï

s 3000

2000 woo о

, t / / у

/ I

^САТ

BSA

4 \

5 10 - 15' Номер фракции

12 11 10 9 8 7

6 S 5 43 2 1

О

20

—•— BuPhdGTP-BuPhdGTP+ - "— Маркеры

Рисунок 3 Ультрацентрифугирование ДНК-полимеразы е а градиенте плотности глицерина, совмещенное с.калибровочным графиком седиментации маркерных белков: CAT - каталаза (11,2S), ALO - альдолаза (7.8S), BSA - бычий сывороточный альбумин (4Д8).

> ( I,

7 8 9 Ю II 12- IЪ \Н

Рисунок 4 Белковый электрофорез в денатурирующих услових фракции после ультрацентрифугирования препарата ДНК.-полимеразы е.

ментации выделенной ДНК-полимеразы а согласно методу зонально-скоростного центрифугирования составил 7,38.

Свойства ДНК-полимераз суммированы в табл.2.

Таблица 2

Сраннительные характеристики ДНК-полимераз а к е из плаценты человека " _

Свойство ДНК-полимераза

а е

Реакция с моноклональиыми антителами 8Ж-132-20 к ДНК-полимераэе а положительная отри нательная

Подавление синтеза ДНК в присутствии ЗмкМ ВиРЬ<1СТР (%> 98 4

Иншбирование синтеза ДНК афидиколином 5мкг/мл (%) 43 47

Иншбирование синтеза ДНК в присутствии 40мкМ карбоннлдифоефоната (%) 0 40

Ингибированне синтеза ДНК 0,1М \'лС1 (%) 93 80

Иигибироваиие синтеза ДНК в присутствии бмкМ агаСТР (%) 50 50

Стимулирование РСЫА синтеза ДНК нет нет

Гидролиз З'-концевых пуклеотидов в праймер-матричном комплексе {%) 0 93

Коэффициент седиментации (Б) 7,3 7,8

Молекулярная .масса каталитической субъединицы (кДа) 170-

Процессивность на поли(&\)2пп олиго(с!Т)13 |(> 10-20 >200

Активность обеих ДНК-полимераз не стимулировалась на матрице поли (с1Л) од и го (с1Т) специфическим активатором ДНК-полимеразы 5 -

ядерным антигеном пролнферируюшихся клеток (proliferating cell nuclear amigen. PCNA), что указывает на отсутствие активности последней в по-

лученных препаратах. ДНКпалимераза е имела свойственную ей 3'->5' экзонуклеазную активность, имели высокую проиессивность на матрице поли((1А) олпго(с1Т) (более 200 иуклеотидов) и заметно сильнее ингиби-ровалась селективным дли нее ингибитором - карбон илдифосфонатом. ДНК-полимераза а в свою очередь не имела 3'~>5' экзонуклеазной активности, имела невысокую проиессивность (10-20 нуклеотидов) и ингибиро-вплась ВиРЬсЮТР. Активность обеих полимераз сильно ингибировались ЮОмМ хлоридом натрия, афидиколином и агп-СТР, что яазяется отличительной чертой этих ферментов от ДНК-полимераз (5 и у. Из вышесказанного можно заключить, что выделенные ферменты действительно являются ДНК-полимеразами а и е.

2.Изучение субстратной специфичности ДНК-полимераз а и е из плаценты человека.

Нами было исследована большое количество различных аналогов 2'-дезоксинуклеоз«д-5'-трифосфатов, структуры которых приведены на рис.5 (эта часть работы проводилась совместно с Викторовой Л.С.). Оба фермента показали высокую субстратную селективность. Только три вида исследованных соединений оказались хорошими субстратами и терминаторами для ДНК-полимераз а и г из плаценты человека (выделены на рис.5 жирным шрифтом). Это 3'-амино-2',3'дидезокситимидин-5'-три-фосфат (сМТТР(3'ЫН2)), 1-{р-0-арабино-фуранидил) цитозин-5'-трифос-фат (агаСТР) и ациклические аналоги 0-4'-нор-2',3'-дидезокси-2',3'диде-гидронуклеозид-5'-трифосфаты (асус!о-с14ЫТР). Эти соединения включались в растушую цепь ДНК и терминировали синтез ДНК. На рис.6 а и рис. 6 б приведены электрофореграммы, полученные в результате электро-форетнческого разделения в 12% полиакриламидном геле продуктов, синтезированных ДНК-полимеразой е по ДНК фага М13тр10 в присутствии с!сПТР(3'>!Н2)(рис.6-а треки 3,4) и асус1о-с14МТР (рис.6-б, треки 5,6 -асус1о-с34ТТР; 7,8 - асус1о-114СТР; 9,10 - асус!о-с!4АТР). Из рисунка видно, что эти соединения эффективно включаются в растущую цепь ДНК. При . этом происходит остановка синтеза, что видно по распределению полос на авторадиограмме. Все эти соединения приблизительно с одинаковой степенью ингибировали синтез ДНК при.катализе ДНК-полимеразой е (50% ингибнрование при 15-30 кратном избытке аналогов над природным субстратом), вто время как 1-(р-С-арабино-фуранидил) цитозин-5'-три-фосфат (агаСТР) ингибировал активность полимеразы на 50% уже при 3"х кратном избытке над природным субстратом. Электрофорез в 12% поли-

акриламидном геле показал (данные не приведены), что он выступает в роли сильного кинетического терминатора.

Еше одно соединенне, 2,-дезокс1птшиднн-5'-С>-(а-фосфонометил)-р,у-дифосфат (сЩ5'-СН2)ТР), (выделено на рис.5 рамкой) являлось селективным ингибитором ДНК-полимеразы а и могло неоднократно включаться этим ферментом в цепь ДНК. Оно не яачялось субстратом более ни для одной из проверенных ДНК-полимераз, включая ДНК-лолимеразу е.

Исследование влияния других модифицированных сЮТР на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой е, показало, что все они либо встраиваются в цепь лишь при очень высоких концентрациях (при более чем 200-кратном избытке над субстратом, как это.имело место для сМТТР). либо не встраиваются вовсе. Результаты исследований суммированы в табл. 3, в которой приведены данные по влиянию указанных соединений на синтез ДНК, катализируемый различными ДНК-полиме-разами. Можно вполне определенно сказать, что ДИК-лолимеразы ей а наиболее специфичны из исследованных ДНК-полимераз. Наименьшую селективность к указанным соединениям проявляли обратные транскрип- . тазы ретровирусов ВИЧ-1 и ВМП. Терминальная дезоксинуклеотидил-трансфераза из тимуса гелеька, ДНК-полимера за 3 из печени крысы и ДНК-полимераза I из Е.соН занимали промежуточное положение.

Все три вида соединений, которые заметно ингибнрумт ДИК-полимеразу е относятся к различным группам модифицированных с)1МТР, однако можно с достаточно большой уверенностью говорить о небольшой вероятности нахождения новых ингибиторов среди 3'-замещенных аналогов. Видимо, более перспективны в этом смысле арабино-производные и, возможно, некоторые ациклические аналоги (1ЫТР.

На рис.6 а (треки 1 и 5) приведен синтез ДНК с природными субстратами, катализируемый ДНК-полимеразами е или а соответстьенно. Как видно из рисунка, оба фермента имели очень похожую, но не идентичную картину неспецифических остановок (пауз) при еннтезе ДНК. Близость паузной картины видимо можно объяснить сходством структур функциональных областей этих полимераз.

Н40,р30—I ТЬу

—I т

л-н латтр

11-=!ЧН СН3 йаТТР{3'МН СН3 )

я=мн с2н5 ааттр(зын с2н5 )

и-Ьз ааттр(з-ы3)

И-Я ddTTP{3'F)

«=N»2 (МТТРО'М^)

н4о9р3о

■и

В=-ТЬу;Су(;А<1е Асус|о-й,,МТР О

Н307Р2-РО к

—I П11У

Тр,

Н^РзС^СИ ТЪу

ат(3'-сн2)ТР

он

Н4°9р3—1 о

р

Л=СН3 И'^ОН И-СНз Н409Р30

К = С6Н5 К'=ОН Я-С6н5

он

тьу Р2Р-ат

Н409Р30—, Су1 р

«гаСТР 0Н

а4тгр

н4о,р,о-| о ТЬу

Й(ИТР(3'=СН2)

сн.

н4о9р3о

1аТТР Н4о9Р3о—, о ТЬу

он

<1ТТР(3,С113)

н4о9р3о

—1 А<1е

1аАТР О

Н4О9Р30—1 ТЬу

¿ху!оТТР(3'СН3)

р

сн.

Рисунок 5 Химические структуры аналогов с)ЫТР

■ <з>.

Л

56 %ЬЗ\о

ВЙ

« I Ъ Ч 5 С

Рисунок 6 Электрофореграмма синтеза ДНК фага М13тр 10, катализируемого ДНК-полимеразами е и а из плаценты человека в присутствии аналогов с!ЫТР.

a) Треки: I - синтез, катализируемый ДНК-полимеразой е в присутствии четырех сЗКТР; 2 - тоже, с дополнительным синтезом фрагментом Кленова; 3,5 - тоже что в I + (1сЛТР(М-12) 120мкМ н 240мкМ соответственно; 5 - синтез, катализируемый ДНК-полимера зон а и присутствии четырех <1МТР; 6 - тоже, что в 5 + 120мкМ 11(ЛТР(МН2).

b) Треки: 1 - праимер; 2 ,- синтез, катализируемый ДНК-полимеразой е в присутствии четырех (ШТР; 3 - тоже с дополнительным синтезом фрагментом Кленова, 4 - тоже, что во 2 + сШТТР(МН,) 120мкМ; 5,6 - тоже, что во 2 + асус1о-с!.,ТТР 240мкМ н 720мкМ соответственно; 7.Х - тоже, что во 2 + асус!о-и.СТР 72мкМ и 240мкМ соответственно; 9,10 - тоже, что ио 2 + асус1о-и4ЛТР 240мкМ и 720мкМ соотиетственно.

Таблица 3. Способность аналогов с)МТР терминировать синтез ДНК, какализируемый рахпичными ДНК-полимеразамн.

Аналоги с1>1ТР ДНК-полимеразы

I Е.со11 ЯТ тат Ро1. Р Ро1. а Ро1. с

с)4ТТР + + + + - -

асПТР + + + + . - ■ -

¿сГГЩЗ'К,) - + - . + - -

¿аТТРО'ННз) + + + + + +

с1ёТТР(З^Н(СН,)) - + + -

ааТТР(3'МН(СгН5)) - + + - -

ddTTP(3'F) + + + + - -

асус^-й^ТР • - + + + + +

агаСТР - Ф ф - ©Ф фф

Р2Р(СН2)СМТ - - - - ■ Ф -

Р2Р(а-СН,)(ЛТР(3'Р) + - - -

Р2Р(а-С6Н5)сПТР{ЗТ) - - - + - -

гаАТР + + + + -

1аТТР - + + - г

сШТР(3-СИ2) - + ■ + + - -

йеохуху1оТТР(3'СН,) - - - - - -

скохупЬоТЩЗ'СН,) * - - ►

1 Е.соП - ДНК-полимераза I из Е.соЦ (фрагмент Кленова); ИТ - обратные транскриптазы ретровирусов ВИЧ и ВМП; ТёТ - терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза из тимуса теленка; Ро1.р ДНК-полимераза Д из печени крысы, Го].а и Ро!.е - ДНК-полимеразы а и е из плаценты человека.- сильная терминация и ингибирование,*+" -слабое ингибирование и терминация,- нет терминаций, "©"кинетическая терминация или ингибирование.

ВЫВОДЫ

1. Разработана препаративная методика очистки, позволяющая получить близкую к гомогенности ДНК-зависимую ДНК-полимеразу е из плаценты человека, молекулярная масса которой была 170 кДа. С помощью различных критериев дискриминации показано, что выделенный фермент относится к е типу и не содержит примесей других ДНК-полимераз. Метод позволяет проводить одновременную препаративную очистку ДНК-полимеразы а.

2. Впервые проведен систематический ингибмторный анализ синтеза ДНК, катализируемого ДИК-полимеразой е с помощью аналогов нукле-_, озид-5'-трифосфагов, модифицированных по фуранозному кольцу и три-фосфатиой фуипе.

3. Показано, что ДНК-полимераза е имеет высокую субстратную специфичность. Из 20 испытанных соединений субстратами ДНК полимеразы е были только три вида аналогов нуклсознд-5'-трифосфатов; 2',3'-дндезокси-3'-амннотимидин-5'-трифосфат, |-(р-0-арабино-фуранидил)-цитозин-5'-трифосфат и ациклические аналоги 0-4'-нор-2',3'-дидеэокси-2\3'-

. дидегидронуклеоэид-5'-трифосфаты. Эти аналоги включались в растущую цепь ДНК и терминировали синтез ДНК, катализируемый ДНК-пол ммеразои t.

4. Найдены различия в субстратной специфичности между ДН К-полн-меразой е, ДНК-полимеразой а , а также обратными транскриптазами ретровирусов.

По материалам 'диссертации опубликованы работы:

1. Викторова Л.С., Моэжерин Д.Ю., Розоьская Т.А., Куханоиа М.К., Краевский A.A. Ациклические аналоги 2',3'-дндезокси-2',3'-дидегидронуклеозид-5'-трифосфатов - терминаторы синтеза ДИК, катализируемого широким набором ДНК-полимераз //Молекулярная биология,-1993.-Т.27,- С.143-152^

2. Дяткина Н.Б., Викторова Л.С., Мозжерин Д.Ю., Атражев А.М., Розенберг С.Г.; Куханова М.К., Краевский A.A. Образование фосфоноэфирных с ничей, катализируемое ДНК-полимеразамн // Молекулярная биология,-1991 .-Т.25. -С. 166Х -1700.

3. Мозжерин Д.Ю., Атражев A.M., Куханоиа М.К. Метод выделения и

■ свойства ДНК-зависимой ДНК-полимерязы е из плаценты человека 7/ Молекулярная биодогия.-1У92.-Т.26.-С,999-ШЮ.

4. Ясько М.В., Атражев A.M., Мозжерин Д.Ю., Новиков Н.А., Федоров И.И., Краевский А.А. Синтез и некоторые биохимические свойства алкилироваиных производных 2',3'-дидезокси-3'-аминотимидина // Биоорганическая химия.-1992.-Т. 18.-С.299-301.

5. Dyatkina N.B., Victorova L.S., Atrazhev A.M., Mozzherin D.Ju., Kukhanova M.K. Nucleoside 5'-(a-methylphosphonyl)-p,y-diphosphates as substrates for DNA polymerases// Nucleic Acids Research.-1991 .-V. 19.-Symp. ser.-N24.-P.238.

6. ' Krayevsky A.A., Victorova L.S., Mozzherin D.Ju., Kukhanova M.K. Acyclic 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydroniJcleoside 5'-triphosphates as termination substrates of broad set of DNA polymerases // Nucleosides and Nucleotides.-1993.-V.12.-P.83-93.

7. Mozzherin D.Y., Victorova L.S., Dyatkina N.B., Atrazhev A.M., Kukhanova M.K. Testing of several analogs of 2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates in cell-free systems with DNA polymerases a and e from human placenta // Journal of Chemotherapy. Proceedings of the 8th Mediterranean Congress of Chemotberapy.-f993.-in press.

~8. Victorova L.S., Dyatkina N.B., Mozzherin D.J., Atrazhev A.M., Krayevsky A.A., Kukhanova M.K. Formation of phospbonoester bonds catalyzed by DNA polymerase // Nucleic Acids Rcsearcli.-l992.-V.20.-P.783-789.