Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вирус простого герпеса типа 1 человека

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Вирус простого герпеса типа 1 человека"

На правах рукописи

КОРОВИНА АННА НИКОЛАЕВНА

ВИРУС ПРОСТОГО ГЕРПЕСА ТОПА 1 ЧЕЛОВЕКА: МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРИЧИН РЕЗИСТЕНТНОСТИ И ПОИСК НОВЫХ ИНГИБИТОРОВ

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 9 ДПР 2015

Москва 2015

00556В003

005568003

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук.

Научный руководитель:

Главный научный сотрудник Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук, доктор биологических наук М. К. Куханова.

Официальные оппоненты:

Главный научный сотрудник, Заведующая отделом молекулярной вирусологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н,Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, доктор биологических наук, профессор А. А. Кущ.

Главный научный сотрудник Лаборатории биохимии процессов онтогенеза Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н. К. Кольцова, профессор, доктор биологических наук В. С. Михайлов.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова».

Защита диссертации состоится «26» _мая_2015 г. в 11:00 часов на заседании

диссертационного Совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В. А.

Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ им. В. А. Энгельгардта РАН

(119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32). <Л ий- ¿СилТс ^ц/и/.-е^чЬ-Р'

Автореферат разослан 2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

А.М. Крицын

Общая характеристика работы. Актуальность проблемы. Вирус простого герпеса первого типа (ВПГ-1) - чрезвычайно распространенный патоген, который на протяжении как минимум двух тысячелетий является причиной малозаметной и плохо контролируемой пандемии заболеваний кожных и слизистых покровов человека. В некоторых регионах земли вирусом инфицировано от 51% до 100% населения. ВПГ-1 обычно находится в латентном состоянии, но в благоприятных условиях реактивируется и становится причиной таких заболеваний, как оральный и генитальный герпес, конъюнктивит, кератит, инфекционный энцефалит, синдром Капоши. Кроме того, наряду с цитомегаповирусом, папилломавирусом, туберкулёзной палочкой, вирус герпеса часто сопровождает ВИЧ, что значительно осложняет лечение пациентов. По некоторым данным вирус также участвует в развитии рассеянного склероза, может приводить к мужскому бесплодию и болезни Альцгеймера.

Большинство препаратов, используемых для лечения герпетических инфекций, представляют собой модифицированные нуклеозиды или их депо-формы. Действие этих препаратов направлено на подавление синтеза вирусной ДНК, катализируемого основным ферментом репликации - ДНК-полимеразой. Золотым стандартом антигерпетической терапии является ацикловир (АСУ). Механизм действия АСУ основан па его фосфорилировании вирусной тимидинкиназой до ацикловирмонофосфата (АСУМР) с последующим фосфорилированием клеточными киназами до ацикловиртрифосфата (АСУГР), дальнейшем встраивании АСУМР вирусной полимеразой в растущую цепь ДНК, что приводит к терминации ее синтеза. Следует отметить, что препараты не избавляют пациентов от рецидивирующего характера течения болезни, а результатом их длительного приёма может стать возникновение резистентных штаммов вируса. Так, до 30% пациентов, перенесших пересадку костного мозга, являются носителями штаммов ВПГ-1, резистентных к ацикловиру, и количество таких штаммов постоянно растет. В большинстве случаев причиной возникновения резистентности являются мутации в вирусной тимидинкиназе, но ч 5% случаев резистентность вырабатывается за счет мутаций в вирусной ДНК-полимеразе. Эти обстоятельства делают актуальным поиск новых антигерпетических препаратов, подавляющ™ как чувствительные, так и резистентные к антигерпесным препаратам штаммы ВПГ-1, а также изучение механизма их действия с использованием изолированных ферментов.

Целью исследования было изучение причин резистентности вируса простого герпеса первого типа в отношении антигерпетических препаратов и поиск новых ингибиторов репликации вируса. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Провести молекулярно-генетический анализ генов ДНК-полимераз и тимидинкиназ доступных клинических изолятов резистентных к ацикловиру и лабораторных клонов ВПГ-1, резистентных к HpACV и другим антигерпетическим препаратам с целью изучения причин резистентности вируса.

2. Оптимизировать экспрессию и выделение ДНК-полимеразы ВПГ и ее мутантной формы, укороченной на 140 аминокислотных остатков с N-конца полипептидной цепи.

3. Провести поиск новых ингибиторов, подавляющих репликацию ВПГ-1 в культуре клеток, которые могли бы выступить как потенциальные антигерпетические препараты, и изучить механизм их действия в системе in vitro.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В рамках работы установлены причины резистентности четырех клинических изолятов (Avil, Tot, Sha, Che) и семи лабораторных клонов ВПГ-1 с разной устойчивостью к ACV, HpACV и другим препаратам. Обнаружено 17 аминокислотных замен в гене тимидинкиназы и 45 в гене ДНК-полимеразы изученных клонов и изолятов, большинство из которых - 11 и 32, соответственно, не были описаны ранее. Влияние на чувствительность вируса к препаратам оказывали пять мутаций в тимидинкиназе и девять мутаций в ДНК-полимеразе. Среди них мутация (ДТ66) в тимидинкиназе и пять мутаций в ДНК-полимеразе ВПГ (N608S, F716L, D741N, М880Т, G948S, А987Т) были обнаружены впервые.

Впервые предложено выделение в бакуловирусной системе экспрессирована ДНК-полимераза ВПГ-1 и ее мутантный фермент с делетированными 140 N-концевыми аминокислотными остатками, содержащие гексагистидиновые тэги на N-конце, и оптимизирована методика их выделения.

Среди различных классов синтезированных производных нуклеозидов найдены новые ингибиторы репликации ВПГ-1 в культуре клеток, которые могут быть использованы для создания на их основе антигерпетических препаратов. Предложен в качестве ингибиторов ВПГ-1 новый класс соединений - производные 1,2,4-триазоло[1,5-а]пирмидин-7-она, Показана способность их трифосфатов подавлять синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой ВПГ. Установлен механизм действия новых фосфонатных производных нуклеозидов, эффективно подавляющих ВПГ-1 и ВИЧ в культуре клеток. Установлен механизм действия фосфонатных аналогов нуклеозидов, обладающих противогерпетической активностью в культуре клеток, которые фосфорилируются до дифосфатов фосфонатов, которые в свою очередь служат субстратами ДНК-полимеразы и терминируют синтез ДНК.

Апробация работы. Отдельные части работы докладывались на III конференции молодых учёных, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвященной 120 годовщине со дня рождения Н. И. Вавилова (Киев, 2007 г.), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г.), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009 г.), Международном конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (FEBS) (Санкт-Петербург, 2013 г.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ: 5 статей, 2 обзора и 4 тезиса докладов.

Объём диссертации. Диссертация изложена на 89 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной часта, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал проиллюстрирован 6 таблицами и 25 рисунками. Список цитированной литературы включает 158 наименований.

Работа выполнена при финансовой поддержке Президиума РАН (Программа «Молекулярная и клеточная биология»), Российского фонда фундаментальных исследований и программ Минобрнауки РФ.

Список использованных сокращений.

ВПГ-1 - вирус простого герпеса типа 1; ВИЧ - вирус иммунодефицита человека; ОТ - обратная транскриптаза; АСУ - ацикловир;

АСУМР - ацикловир 5'-монофосфат;

АСУТР - ацикловир 5'-трифосфат;

ОСУ - ганцикловир;

РСУ - пенцикловир;

РИА - фоскарнет;

РАА - фосфоноуксусная кислота;

НрАСУ - /7-фосфонат ацикловира;

А2Т - азидотимидин;

АгТМР - азидотимидин 5'-монофосфат;

М01 - множественность инфицирования;

РМЕА - фосфонометилэтоксиаденин;

ВУОи - 5-бромвинилдезоксиуридин;

ВУагаи - 5-бромвинилдезоксиарабиноуридин;

АгаА - арабинозиладенозин;

ЫТР - нукпеотид-5'-трифосфаты;

Ши - 5-иод-2'-дезоксиуридин.

Содержание работы. Молекулярно-генетический анализ ДНК-полнмераз и тнмидинкипаз из клинических и лабораторных клопов ВПГ-1 При лечении больных, инфицированных ВПГ-1, используют ряд нуклеозидных препаратов, из которых наиболее известен ацикловир. Однако при длительном применении этого лекарственного препарата даже у пациентов со здоровым иммунитетом возникают резистентные к нему штаммы, и тогда медикаментозное лечение становится неэффективным.

У иммунодефицитных пациентов, в том числе инфицированных ВИЧ или перенесших пересадку костного мозга, устойчивые к ACV изоляты ВПГ-1 встречаются в 7-30% случаев.

В генах тимидинкиназы и ДНК-полимеразы из клинических изолятов и лабораторных клонов ВПГ, резистентных к ацикловиру и другим препаратам, выявлено огромное количество мутаций, которые вместе или по отдельности ответственны за возникновение лекарственной устойчивости. Нами было осуществлено картирование мутаций в генах, кодирующих эти белки из четырёх клинических изолятов и семи лабораторных клонов ВПГ-1 для выявления причин потери антивирусной активности ACV, Я-фосфоната ацикловира (HpACV), фосфоноуксусной кислоты (аналога фоскарнета, ненуклеозидного ингибитора репликации ВПГ) и других антигерпетических препаратов (рис. 1). HpACV, который не используется в клинике, был выбран для анализа из-за его необычных свойств. Было показано, что это соединение подавляет как ACV-чувствительные, так и ACV-резистентные изоляты дефектные по тимидинкиназе, при этом его концентрация была всего в два раза выше, чем в случае ацикловир-чувствительных изолятов. В культурах клеток появление резистентных к HpACV клонов отмечалось через восемь пассажей, в то время как резистентность к ацикловиру была обнаружена через четыре пассажа, диапазон применяемых концентраций веществ для получения резистентных клонов составлял 100 -800 мкг/мл для HpACV и 2,5 - 100 мкг/мл для ACV. Эти результаты показывают, что резистентность к HpACV возникает существенно медленнее и при более высоких концентрациях по сравнению с ACV, что указывает на отличный от ацикловира метаболизм. Исследования метаболизма HpACV на клетках Vero показали, что после проникновения в клетку он в значительной степени непосредственно превращается в монофосфат ацикловира (ACVMP) и только небольшая его часть гидролизуется до ACV (Karpenko, Yasko, 2003).

Чувствительность клинических изолятов ВПГ-1 к антигерпетическим агентам

Совместно с Институтом вирусологии им. Д. И. Ивановского в культурах клеток была исследована антигерпетическая эффективность лекарственных препаратов и других ингибиторов репликации ВПГ (рис. 1) в отношении чувствительного к ацикловиру штамма который используют в качестве эталонного на территории РФ, лабораторному штамму LJR, который глубоко резистентен к ACV и получен пассированием инфицированных вирусом клеток в присутствии ACV, четырем клиническим изолятам, устойчивым к ACV (А vd, Tot, Sha, Che), и семи лабораторным клонам ВПГ, полученным пассированием в присутствии HpACV (Таблица 1).

о

но'

(Ь>

он

он

(с)

W

б

Рис. 1. Структурные формулы соединений, использовавшихся в работе: (а) ацикловир (ACV), (Ь) Я-фосфонат ацикловира (HpACV), (с) ганцикловир (GCV), (d) 5-йод-2'-дезоксиуридш1 (IdU), (е) бромвинилдезоксиуридин (BVDU), (f) арабинофуранозиладенин (AraA), (g) фосфоноуксусная кислота (РАА).

Из Таблицы 1 видно, что клинические изоляты ВПГ-1 в разной степени чувствительны к использованным препаратам. Чувствительность изолятов Avd и Sha к ACV понижена приблизительно в 10 раз по сравнению с эталонным штаммом L¡. Причем чувствительность этих вирусов ко всем нуклеозидным препаратам, кроме ACV, понижена максимум в два раза по сравнению со штаммом L¡.

Таблица 1. Чувствительность клинических изолятов и контрольных штаммов ВПГ-1 к антигерпетическим агентам в культуре клеток Vero Еб.

ЕС», мкг/мл

Изолят АСУ HpACV GCV IdU BVDU AraA PAA

0.39 15.6 1.4 3.9 0.096 15.6 31.25

LJR >100 31.25 23 125 >24.5 31.2 31.25

Tot 100 1000 250 >250 >24.7 250 31.25

Che 50 >500 14.05 62.5 >24.7 7.8 7.8

Avd 3.9 31.25 1.75 1.9 0.12 62.5 125

Sha 12.5 31.25 7.02 1.95 0.19 31.25 7.8

«>» - в исследованном диапазоне концентраций эффект не достигается. В таблице представлены результаты двух независимых опытов. Множественность инфекции MOI = 0,1 БОЕ/клетку. Клетки собирали через 48 часов после инфекции.

Изолят Tot глубоко резистентен ко всем испытанным нуклеозидным препаратам, но чувствителен к ненуклеозидному ингибитору РАА, активность которого не зависит от тимидинкиназы. Устойчивость штамма Tot к АгаА, отсутствующая у других штаммов, может быть связана с инактивацией или потерей специфичности в этом изоляте ферментов, непосредственно несвязанных с репликацией, например с аденозиндезаминазой, дезактивирующей препарат до значительно менее активного арабинозида гипоксантина. Изолят Che чувствителен только к АгаА и РАА.

Лабораторные НрАСУ-резистентные клоны 1-7 (Таблица 2) можно разбить на две группы в зависимости от чувствительности к антигерпетическим препаратам. Клоны 1-4 умеренно устойчивы к АСУ, GCV, IdU, BVDU, глубоко резистентны к HpACV и чувствительны к АгаА и РАА, в то время как изоляты 5-7 в равной степени глубоко резистентны ко всем испытанным соединениям кроме АгаА и РАА.

Таблица 2. Чувствительность лабораторных и контрольных изолятов ВПГ-1 к антигерпетическим агентам в культуре клеток Vero Е6.

ЕС», мкг/мл

Изолят ACV HpACV GCV IdU BVDU AraA PAA

Li 0.39 15.6 1.4 3.9 0.096 15.6 31.25

LJR >100 31.25 23 125 >24.5 31.2 31.25

1 6.25 >1000 11.25 31.25 12.35 15.6 31.25

2 6.25 1000 5.62 15.60 6.17 15.6 15.60

3 3.12 250 5.62 31.25 6.17 31.25 15.60

4 6.25 >1000 5.62 15.60 6.17 31.25 15.6

5 >100 1000 22.5 62.5 24.7 31.25 31.25

6 50 500 >45 125 >24.7 62.5 31.25

7 50 500 45 62.5 >24.7 31.25 31.25

Условия эксперимента-см. Таблицу 1.

Причиной таких различий являются мутации в генах ДНК-полимеразы и тимидинкиназы, в разной степени влияющие на чувствительность ферментов к препаратам.

Нам были любезно предоставлены лизаты описанных изолятов. Из них мы выделяли вирусные геномы, получали с помощью ПЦР гены ДНК-полимеразы и тимидинкиназы, клонировали их в вектор pGEM, секвенировали и анализировали аминокислотные последовательности ДНК-полимераз и тимидинкиназ из всех имеющихся изолятов.

Мутации в тимидинкиназе

В тимидинкиназах изученных нами клонов и изолятов ВПГ-1 были найдены следующие значащие аминокислотные замены: G59R (клон 2), ДТ66 (изолят Avit), W88R (L/R), R220H (£/Л), 281-stop (клоны 1-7) (рис. 2). Все обнаруженные замены приведены в Таблице 3, положение наиболее важных из них относительно консервативных участков фермента отмечено на рис. 2.

АТФ- НТФ-

С8язь!вающий связывающий

1 51 63 83 88 162 176_21S 222_284 289_376

а. чо < о-

О ' со со m

(ль ео ют

и-3 3 S£

| домены тимидинкиназы ВПГ

;.................консервативные участки

..............<! тимидинкиназы ВПГ

Рис. 2. Найденные аминокислотные замены и их положение в консервативных участках и доменах тимидинкиназы.

Таблица 3. Замены аминокислотных остатков в тимидинкиназе и ДНК-полимеразе изученных АСУ-устойчивых изолятов ВПГ-1 в сравнении с эталонным штаммом ¿г

Изолят Тимидинкиназа ДНК- пол им ера за

Незначащие замены Мутации с неясным эффектом Мутации, ассоциированные с резистентностью Незначащие замены Мутации с неясным эффектом Мутации, ассоциированные с резистентностью

L/R V12A W88R, R220H D46N, А346Т, S866F, G1085E, D151G

Avd V12A, M372I P155Q АТ66 D46N, А136Т, А346Т, S866F, N871D, E545D М880Т

G1085E, I5I9M 1

Tot H7R, V12A, M322L, D328V D46N, Q56R, N208D, A346T, S866F, G1085E N815S

Sha V12A R220H D46N, A346T, S866F, A1233T, I394K, P433S V585.M, E997G

Che V12A R220H DUG, D46N, A346T, S866F, S357N, S413L, D488N, I635V, G691D S706P F716L, L702P

1 V12A 281-stop D46N, A346T, G1085E, L1049M G505D F716S

2 V12A - G59R, 281-stop A346T, N871D, G1085E T1121A D741N или D741N + ТИ21А

3 V12A, M231V 281-stop D46N, Q251P, A346T, D741N, N87 ID N962D D741N или D741N + T1121A

4 V12A 281-stop W315R, S866F, N871D, R1071NV, G1085E A987T

5 V12A 281-stop A238V, A346T, N87 ID, G1085E K484.M, N494D, F820Y N608S

6 V12A - 281-stop D46N, F140S, A346T, G1085E — G948S

7 V12A, V138A 281-stop D46N, N285S, A346T, G1085E, LI188R G567E A808T

'Жирным шрифтом выделены мутации, впервые обнаруженные в ходе работы.

В литературе описана мутация 281stop, приводящая к формированию укороченного мутанта вирусной тимидинкиназы. Клоны вируса, содержащие эту мутацию, были глубоко резистентны к BVDU, BVaraLI и PCV, в то же время падение чувствительности вируса к ACV и GCV было более слабым (Andrei, Balzanni, 2005). Ферментативная активность укороченного белка была изучена нами совместно с коллегами из Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова, и было показано, что такой мутант тимидинкиназы сохраняет ферментативную активность, хотя и на более низком уровне, чем нативный фермент (Gus'kova, Skoblov, 2009).

Замена W88R (штамм ¿/Л), как показано ранее, приводит к потере активности тимидинкиназы и вносит вклад в устойчивость вируса герпеса к ацикловиру (Гуськова, Загурный, 2005).

Мутация R220H была описана в нескольких работах и приводила к потере чувствительности вируса к ацикловиру, пенцикловиру и ганцикловиру при сохранении активности вирусной тимидинкиназы к природному тимидину (Suzutani, Ishioka, 2003). По нашим данным чувствительность резистентного к ацикловиру лабораторного штамма L/R, несущего эту мутацию, к другим антигерпетическим препаратам, например GCV и BVDU также понижена на 1-2 порядка. В тоже время соединения HpACV, РАА и АгаА, механизм

действия которых не зависит от вирусной тимидинкиназы, подавляют репликацию этого штамма почти с той же эффективностью, что и штамм дикого типа.

В литературе описаны мутации G59A и G59W (Andrei, Baizarini, 2005), аналогичные найденной нами мутации G59R, затрагивающие АТР-связывающий сайт фермента. По сравнению с другими мутациями, мутация G59W приводила к высокому уровню резистентности ВПГ к BVDU и ACV и более низкому к GCV и PCV. Изученный нами клон 2, несущий мутацию G59R в тимидинкиназе, обладал аналогичными свойствами.

Деления ДТ66 (изолят Avd), находящаяся рядом с АТР-связывающим сайтом фермента, в литературе не описана и была определена в процессе нашей работы. Эта новая мутация, вероятно, вносит вклад в чувствительность фермента к антигерпетическим препаратам, так как располагается вблизи АТР-связывающего сайта в консервативном участке.

Хотя аминокислотный остаток Р155 и расположен недалеко от NTP-связывающего домена, его радикал направлен в противоположном направлении от активного центра, поэтому его замена этой аминокислоты на глютамин вряд ли оказывает влияние на чувствительность тимидинкиназы к антигерпетическим соединениям.

Остальные замены расположены вне консервативных и функциональных участков тимидинкиназы и не влияют на активность и специфичность фермента и не являются причиной формирования в изоляте Tot, клонах 1 и 3-7 резистентности к ацикловиру. Следовательно, причиной формирования резистентности, вероятно, являются мутации в ДНК-полимеразе.

Мутации в ДНК-полимеразе

Сначала мы сравнили аминокислотную последовательность ДНК-полимеразы штамма L¡ с таковой чувствительного к ACV штамма 17, который был ранее описан в литературе, чтобы в дальнейшем выявить в изучаемых клонах и изолятах замены, не оказывающие влияния на чувствительность вируса к препаратам. Такими оказались замены D46N, А346Т, S866F, N87ID, G1085E. В ДНК-полимеразе изученных нами изолятов вируса герпеса присутствовали следующие значащие аминокислотные замены: N608S, L702P, F716S, А808Т, N815S, F820Y, М880Т, N962D (рис. 3).

IV ö-reglonC II VI III I VIIV

1 140 362 594 639 701 T66 825 956 1197 1236

pre-NH2

NH2

3--S--MO I NHj

palm fingers

palm

SÜSS 5

ss»s ses г

UJO>Z -J«"- Q

I домены ДНК-полимеразы ВПГ

Рис. 3. Найденные значащие аминокислотные замены в клинических изолятах и лабораторных клонах ВПГ-1 относительно консервативных участков и функциональных доменов ДНК-полимеразы.

Все обнаруженные замены приведены в Таблице 3 (стр. 8).

В соответствии с литературными данными (Andrei, Fiten, 2007) большинство мутаций, вызывающих устойчивость вируса к ацикловиру и другим антигерпетическим препаратам, находятся в консервативных участках I (881-896), II (694-736) и III (805-849), отвечающих за связывание dNTP с ДНК-полимеразой, а также в консервативных участках IV (437-479), V (953-963), VI (772-791), VII (938-946) и в 5-участке С (531-627). Консервативный 8-участок С отвечает за 3'-5'-экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы. Мутации в этом участке могут быть существенны не только для экзонуклеазной активности, но и правильного формирования каталитического сайта фермента и, следовательно, полимеразной активности и изменения чувствительности полимеразы к препаратам (К484М, N494D, I529M, E545D, V585M).

При эффективной терминации синтеза ДНК ACVTP, необходимо связывание с праймер-матричным комплексом следующего после ACV нуклеотида, соответствующего контексту матрицы. In vitro показано, что в отсутствие следующего dNTP наблюдается только слабое подавление синтеза ДНК (Reardon, Spector, 1989). Многие штаммы вырабатывают резистентность к нуклеозидным препаратам за счёт мутаций в участках фермента, которые не вовлечены непосредственно в каталитический центр, таких как инвариантная последовательность YGDTDS (884-889). Например, консервативный мотив KKKY (938-941) и аминокислотные остатки Y818, Y884, D886 выполняют функцию обнаружения нарушений комплементарности (mismatch) и других искажений структуры дуплекса. Они координируют связывание следующего после ацикловира нуклеотида и только что сформированный ДНК-дуплекс в целом. Взаимодействия, которые образуют эти аминокислотные остатки с ДНК, замораживают фермент в конформации «закрытого» элонгационного комплекса, что может препятствовать нуклеофильной атаке АТР и, следовательно, удалению ингибитора посредством пирофосфоролиза, как в случае с обратной транскриптазой ВИЧ и AZTMP на З'-конце матрицы. Поэтому предположительным механизмом формирования резнсте1гтности может быть возникновение мутаций в этих участках.

Мутации в ДНК-полимеразах клинических изолятов

ДНК-полимераза контрольного штамма LJR содержит только вырожденные замены и замену аспарагиновой кислоты на глицин, находящуюся на большом удалении от активного центра, которая не влияет на чувствительность фермента к препаратам. Однако этот штамм содержит замены в тимидинкиназе, которые, как сказано выше, радикальным образом сказываются на чувствительности тимидинкиназы и, следовательно, вируса в целом, к ацикловиру. Таким образом, резистентность штамма L/R к антигерпетическим препаратам определяется мутациями в гене вирусной тимидинкиназы.

Изолят Avd чувствителен ко всем протестированным препаратам за исключением ацикловира и РАА. Понижение чувствительности Avd к ACV связано с мутацией н тимидинкиназе (см. выше), к РАА - с заменой М880Т, которая находится в домене «ладонь» ДНК-полимеразы (рис. 3). Согласно кристаллографическим данным, мутация М880Т расположена вблизи каталитической триады D717, D886 и D888 и неподалеку от участков связывания фосфатного остатка нуклеозидтрифосфата и ионов магния. В этом случае мутация М880Т может приводить к возникновению стерических препятствий при взаимодействии фермента и ингибитора, вследствие чего изменяется чувствительность вируса к последнему.

Замены I529M и E545D в ДНК-полимеразе изолята Avil обнаружены впервые. Они находятся в 3'-5'-экзонуклеазном домене (рис. 3) и могут влиять на чувствительность фермента к препаратам.

Таким образом, причиной понижения чувствительности изолята Avd к ацикловиру являются замены P155Q и ДТ66 в тимидинкиназе в сочетании с заменой метионина 880 на треонин в ДНК-полимеразе, а устойчивость этого изолята к РАА обусловлена заменой М880Т.

Изолят Tot - один из самых глубоко резистентных к антигерпетическим препаратам исследованных штаммов. Он резистентен не только к ACV, но и к другим соединениям (AraA, BVDU), а также к HpACV, действие которого, в отличие от АСУ, не зависит от активности вирусной тимидинкиназы (табл. 1).

ДНК-полимераза изолята Tot содержит замену N815S. Ранее показано, что такая замена обусловливает устойчивость изолята ВПГ-1 к ACV и другим нуклеозидным аналогам. Согласно кристаллографическим данным боковая цепь N815 находится напротив основания нуклеотида, взаимодействующего с активным центром фермента. Результаты анализа структуры ДНК-полимеразы с помощью компьютерного моделирования позволяют предположить, что пространственная ориентация боковой цепи остатка S815 ДНК-полимеразы изолята Tot отличается от таковой остатка N815 фермента из исходного вируса и препятствует связыванию ACV с праймер-матричным комплексом. Известно, что мутация N815S приводит к потере ДНК-полимеразой способности встраивать ACVMP в растущую цепь ДНК (Larder, Kemp, 1987). Таким образом, резистентность изолята Tot к герпетическим препаратам определяется мутацией N815S в гене вирусной ДНК-полимеразы.

Понижение чувствительности изолята Sha практически ко всем препаратам кроме ACV незначительно.

В ДНК-полимеразе изолята Sha мутация E997G находится в домене «большой палец». Боковая цепь остатка глутаминовой кислоты экспонирована наружу и обеспечивает отрицательный заряд в соответствующем участке поверхности белка. Появление глицина в этой позиции изменяет поверхностный заряд фермента, и может влиять на взаимодействие фермента с компонентами реплисомы.

Замены I394K, P433S и V585M находятся в 3'-5'-экзонуклеазном домене фермента, причем последняя расположена в высоко консервативном участке ExoIII (572-585) (рис. 3). Ранее показано, что мутации в этом районе ДНК-полимеразы влияют на чувствительность вируса к препаратам. Согласно литературным данным мутация D581A приводит к практически полной потере 3'-5'-экзонуклеазной активности фермента при частичном сохранении полимеразной активности, что снижает точность синтеза ДНК, а следовательно, увеличивает скорость возникновения мутаций в геноме вируса. Большое число аминокислотных замен в ДНК-полимеразе изолята Sha может быть результатом снижения ее 3'-5'-корректирующей активности и обусловливает резистентность вируса к ACV.

Таким образом, аминокислотные замены в 3'-5'-экзонуклеазном домене ДНК-полимеразы Sha, вероятнее всего V585M, оказывают влияние на специфичность фермента.

Изолят Che устойчив ко всем препаратам, кроме АгаА и РАА. В ДНК-полимеразе этого изолята обнаружено большое разнообразие мутаций. Среди них представляет интерес замена L702P. Аналогичная замена L702H в консервативном участке II ДНК-полимеразы ВПГ приводит к возникновению резистентности вируса к ацикловиру и сохранению чувствительности или незначительной резистентности в отношении пенцикловира и

ганцикловира (Suzutani, Ishioka, 2003). Замена гидрофобного лейцина 702 на пролин может способствовать изменению конформацин ß-листа в домене «ладонь», участвующего в координировании ионов магния и трифосфатного участка в активном центре фермента. Аналогичный эффект оказывает мутация F716L, поскольку она располагается рядом с аминокислотным остатком D717, участвующим в координации ионов магния. Описанная в литературе замена V715M приводит к потере чувствительности вируса к ацикловиру. Замена соседнего гидрофобного F716 на полярный лизин может иметь такое же сильное влияние на чувствительность фермента к этому препарату.

Мутация этой же аминокислоты имеется в ДНК-полимеразе лабораторного клона 1, резистентного к HpACV.

Мутации в ДНК-полимеразе лабораторных клонов ВПГ-1

Лабораторные клоны 1-7 получены пассированием штамма Li в присутствии Н-фосфоната ACV и в разной степени устойчивы к Я-фосфонату ацикловира, ацикловиру и другим препаратам. Клоны 1-4 умеренно резистентны к ACV, их чувствительность понижена только в 8-16 раз по сравнению с контрольным штаммом Li. Клоны 5-7 глубоко резистентны к ACV, их чувствительность понижена в 128-256 раз по сравнению с исходным штаммом Li. В тоже время аминокислотные последовательности тимидинкиназ из клонов 3-7 идентичны. Это означает, что аминокислотные замены не в тимидинкиназе, а в ДНК-полимеразе в большей степени являются определяющим фактором формирования резистентности к HpACV.

Замена F716S - единственная мутация, которая расположена в каталитическом центре ДНК-полимеразы клона 1 и влияет на чувствительность к ACV и эффективность репликации вируса, так же как другие мутации в этой области, например V715M. При этом эта замена имеется и в ACV-резистентном изоляте Che. Замена G505D находится в экзонуклеазном домене и может оказывать влияние на чувствительность фермента к препаратам. Так, например, согласно литературным данным, расположенные в этом домене замены D471A, Y538S, Y557S и Y577F влияли как на экзонуклеазную, так и на полимеразную активность фермента (Kuhn, Knopf, 1996). Замена L1049M находится в полимеразном домене «большой палец», на большом удалении от активного центра, и не может вносить вклад в чувствительность вируса к препаратам.

В ДНК-полимеразе клонов 2 и 3 имеются замены D741N и Т1121А. Возможно, они оказывают влияние на чувствительность вируса к препаратам совместно, также как комбинация мутаций S742N + D1070N приводит к 10-кратному понижению чувствительности вируса к ACV по сравнению с одиночной мутацией S742N (Andrei, Fiten, 2007).

В ДНК-полимеразе клона 3 имеется замена N962D, которая локализована в домене «большой палец» в консервативном участке V в гидрофобном окружении, поэтому замена на кислый аминокислотный остаток может приводить к локальному изменению третичной структуры фермента.

В ДНК-полимеразе клона 4 триптофан 315 заменен на аргинин, но эта аминокислота расположена на слишком большом расстоянии от активного центра фермента, чтобы оказывать влияние на его активность или специфичность. Замены А987Т и R1071W находятся в домене «большой палец» и могут являться причиной устойчивости вируса к препаратам.

Клоны 5-7 обладают одинаково высокой устойчивостью к HpACV, ACV и другим препаратам.

В ДНК-полимеразе клона 5 мы обнаружили описанную в литературе замену F820Y, которая связана с понижением чувствительности вируса герпеса к 4-оксо-дигидрохинолинам и эффект которой на чувствительность фермента к нуклеозидным препаратам неясен. Кроме того, в ДНК-полимеразе этого клона есть еще несколько мутаций в 3'-5'-экзонуклеазном домене К484М, N494D, которые могут изменять чувствительность полимеразы к ACV. Имеется также важная замена N608S в консервативном 8-участке С в непосредственной близости от активного центра, которая приводит к устойчивости лабораторного штамма ВПГ к ACV и HpACV.

ДНК-полимераза клона 6 содержит две мутации, одна из которых расположена в NH2-домене, функция которого неизвестна. Остаток G948, который заменяется серином, расположен в домене «ладонь» между консервативными участками VII и V, и может приводить к изменению локальной структуры.

Клон 7 содержит в консервативном участке III домена «пальцы» ДНК-полимеразы мутацию А808Т. Этот аминокислотный остаток находится в непосредственной близости от остатков лизина 811, аргининов 785 и 789, которые взаимодействуют с ß- и у- фосфатными группами входящего в активный центр нуклеотида. Замена глицина 567 на глутаминовую кислоту в 3'-5'-экзонуклеазном домене также оказывает влияние на специфичность ДНК-полимеразы, что, возможно, приводит к потере чувствительности к препаратам. Остальные замены кажутся нам несущественными.

Таким образом, мы установили мутации в генах ДНК-полимераз и тимидинкиназ, отвечающие за изменение активности соответствующих ферментов и вызывающие устойчивость изолятов к антигерпетическим препаратам. Мы обнаружили, что мутации в HpACV резистентных клонах частично перекрываются с мутациями, возникающими в ACV-резпстентных изолятах, что объясняется неполным превращением HpACV в ACVMP в клетке и частичным гидролизом до ACV, хотя HpACV резистентные клоны имеют индивидуальный набор мутаций (N608S, D741N, А808Т, G948S).

Часть протестированных нами препаратов используется в клинике, однако, как мы видим, они могут оказаться бесполезными, и возникающая к ним резистентность является веской причиной для поиска новых препаратов, которые были бы активны как против нативных, так и против ACV-резистентных изолятов. Наиболее желательным является одновременное подавление ВПГ и ВИЧ, поскольку ВПГ часто сопровождает ВИЧ. Для изучения механизма действия потенциальных антигерпетических препаратов для изучения механизма их действия помимо клеточных культур необходимы изолированные ферменты.

Экспрессия ДНК-полимеразы ВПГ

В литературе описано несколько путей экспрессии ДНК-полимеразы ВПГ: в клетках, инфицированных ВПГ-1, и в гетерологичных системах (в Е. coli, в дрожжевой системе и в бакуловирусной системе (Boehmer, 1996), а также предложен ряд методов ей выделения. Очистка белка из клеток, инфицированных ВПГ, а также после экспрессии полноразмерного белка в различных клеточных системах является в соответствии с литературными данными трудоёмким многостадийным процессом, включающим хроматографию на колонках с фосфоцеллюлозой, гидроксиапатитом, гепаринсефарозой и Q-сефарозой. Необходимость многостадийных хроматографических процедур связана с тем, что физико-химические свойства ДНК-полимеразы ВПГ сходны со свойствами клеточных полимераз, что затрудняет

отделение последних. Выделение полимеразы в виде белков слияния (например, с мапьтоза-связывающим белком) не получило широкого распространения (Liu, Knafels, 2006). Способ очистки фермента с помощью афинной хроматографии, основанный на сродстве ДНК-полимеразы к праймер-матрице, содержащей ACVMP на З'-конце праймера, оказался малоэффективным. Мы предложили использовать метод очистки ДНК-полимеразы вируса герпеса, содержащей гексагистидиновый фрагмент (His-tag) на N-конце фермента для выделения полимеразы как в прокариотических, так и в эукариотической системах экспрессии.

Экспрессия ДНК-полимеразы ВПГ в штаммах Е. coli Rosetta (DE3), Origami (DE3), Rosetta-gami (DE3) с помощью различных экспрессионных векторов (рЕТ-15Ь, рЕТ-44а) приводила к чрезвычайно низкому выходу белка, поэтому мы пытались использовать двуцистронную систему, которую мы применяли ранее для РНК-полимеразы вируса гепатита С (Ivanov, Korovina, 2006). Основные функциональные домены ДНК-полимеразы ВПГ расположены ближе к С-концевому фрагменту фермента, поэтому мы сконструировали новый двуцистронный вектор рЕТ-15Ь-2с, кодирующий гексагистидиновый фрагмент на N-конце полипептидной цепи. Ген UL30 был вставлен в него по сайтам Ndel (рис. 5).

рЕТ-15b-2c-UL30

Т7п(юмотор crapi 1 SO стол t Ст»рт2

—Л—^^T^I^TATCC^TTAAATAAGGAGGM^iAqjftrGGGC... САТСАТСАТСАТСАТСАТ . CTG... AGCCATATGTTT.. гоч 41.30... GCATGaL CCTCATATG— WxmpOHl **** H H H H H H NMI

щющюн 2

Рис. 5. Схема двуцистронной генно-инженерной конструкции pET-15b-2c-UL30 для выделения ДНК-полимеразы ВПГ. В плазмиду рЕТ-15Ь вставляли по сайтам Xbal и Ncol дополнительный цистрон, содержащий сайт связывания рибосом для второго цистрона. В полученный вектор рЕТ-15Ь-2с по сайту Ndel после участка, кодирующего гексагистидиновый фрагмент, вставляли ген UL30.

Однако ни экспрессия UL30 в клетках Rosetta (DE3), ни в клетках Rosetta-gami (DE3), ни с использованием двуцистронной системы не позволяла получить растворимый белок со сколько-нибудь значимым выходом.

Экспрессия и выделение ДНК-полимеразы ВПГ в бакуловирусной системе

Прокариотическая система экспрессии часто оказывается неэффективной в случае эукариотических белков, поскольку не поддерживает посттрансляционные модификации, характерные для эукариотических клеток. Кроме того, клетки Е. coli имеют отличный от эукариотического внутриклеточный окислительно-восстановительный потенциал и плохо экспрессируют белки, молекулярный вес которых превышает 100 кДа. Наиболее эффективной в таких случаях является бакуловирусная система экспрессии. Клетки насекомых Sß содержат практически такой же набор ферментов, осуществляющих посттрансляционные модификации, что и клетки млекопитающих. Кроме того, экспрессия белков млекопитающих и белков с большим молекулярным весом в этой системе наиболее предпочтительна, поскольку, во-первых, аппарат фолдинга в клетках Sß для этого подходит, во-вторых, экспрессия в этой системе занимает не так много времени, как в клетках млекопитающих. Используя эту систему, мы экспрессировали ДНК-полимеразу ВПГ-1 и ее делетированный мутант, укороченный на 140 аминокислотных остатков с N-конца. В обоих случаях ферменты содержали гексагистидиновый пептид на N-конце фермента. До начала

нашей работы функции N-концевого домена ДНК-полимеразы не были описаны в литературе, поэтому мы планировали изучить его роль.

Ген UL30 был вставлен в шаттл-вектор pFastBac HT В, кодирующий гексагистидиновый тэг. Шаттл-вектор был трансформирован в клетки DHlOBac, в которых путём транспозиции формировалась рекомбинантная бакмида. Целостность бакмид и наличие в них целевых вставок подтверждалось с помощью электрофореза в 0,5% агарозном геле и ПЦР.

Бакмиду трансфицировали в клетки насекомых 5/9, получали вирусный сток Р1, амплифицировапи его, получали вирусный сток Р2 и в клетках инфицированных этим вирусным стоком наблюдали появление белковой фракции весом 136 кДа, соответствующей ДНК-полимеразе ВПГ. Титры вирусов оценивали методом 10-кратного разведения.

Мы также сконструировали плазмиду pFastBac HT B-A140UL30, кодирующую мутант ДНК-полимеразы ВПГ-1 с делетированными 140 N-концевыми аминокислотными остатками, получили соответствующую бакмиду и трансфицировали ею клетки 5/9.

f/ Рис. 6. Электрофорез в 7,5% SDS ПААГ тотальных лизатов 1x10' клеток Sf9, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, несущим полноразмерный ген UL30 ДНК-полимеразы ВПГ-1, при множественности инфицирования (MOI) равной 0,05, 0,1, 0,5 и бакуловирусом, несущим ген делетированного мутанта A140UL30, при MOI равной 0,05, 0,1 и 0,5. Время экспрессии составляет 72 часа. На дорожку 8 нанесён лизат клеток, инфицированных бакуловирусом дикого типа, в котором отсутствует ген UL30. Дорожка 1 - маркеры молекулярных весов. (High-range rainbow molecular weight marker, Amersham, Великобритания)

Вирусным стоком P2 инфицировали клетки Sf9 при низкой множественности инфицирования (MOI) равной 0,05-0,5, оптимальной для дальнейшей амплификации вируса согласно протоколу производителя клеток (Invitrogen). При электрофоретическом анализе тотальных клеточных лизатов выход целевых белков был очень высоким, как в случае полноразмерного белка, так и его делетированной формы A140UL30, причём выход белка увеличивался при увеличении MOI (рис. 6). Однако после центрифугирования клеточных лизатов и анализа целевого белка в супернатанте и в осадке оказалось, что большая часть белка находится в нерастворимой фракции. При этом разницы в растворимости полноразмерного белка UL30 (дорожки 2-4, рис. 6) и его делетированного мутанта A140UL30 (дорожки 5-7, рис. 6) не наблюдалось. Следовательно наличие или отсутствие пре-ЫНг-домена не оказывает влияния на растворимость белка. Таким образом, дальнейшего повышения вирусного титра не требовалось.

Были предприняты попытки извлечь белок из нерастворимой фракции в полуденатурирующих условиях в присутствии 0,5M, 1M, 2М и ЗМ мочевины. Однако к успеху это не привело.

Причиной низкой растворимости белка могут быть неадекватные условия лизиса клеток. Однако варьирование состава лизирующего буфера, реагентов для лизиса (TritonX-100, NP-40, Chaps, Ы-октил-О-глюкопиранозид), концентрации соли (10 мМ-1,2 M), Tris-HCl

M 0,05 0,1 0,5 0,05 ОД 0,5 ¿gf

iirnt ¥'

— iT цу

97 кДа i

1 2 3 4 5 6 7

(10 мМ-300 мМ) - не привело к выходу белка в растворимую фракцию. Также была предпринята попытка выделения ДНК-полимеразы и ренатурации нерастворимой фракции белка в присутствии Ь-аргинина, что также не дало желаемого результата.

Мы предположили, что гексагистидиновый остаток на Ы-конце полипептидной цепи влияет на возможность выделения белка в растворимой форме, сконструировали плазмиды, несущие ген ЦЬЗО и его мутантные формы [рРаяИЗас-!, 11Ь30] и [рРа$1Вас-1, Д140Ю0] и получали соответствующие бакмиды, вирусные стоки и лизаты инфицированных клеток, как описано выше. Результаты эксперимента показаны на рис. 7. Экспрессия белка 1)Ь30 в бестеговой системе приводила к более высокому выходу белка в растворимую фракцию (дорожка 3, рис. 7).

12 3 4

Рис. 7. Электрофорез в 7,5% 81)8 ПААГ аликвоты растворимой фракции лизатов (1,7x103) клеток БГО (дорожка 1), клеток БЮ, инфицированных бакуловирусами дикого типа (дорожка 2) и рекомбинантным бакуловирусом, кодирующим белок ЦЬЗО без гексагистидинового тэга (дорожка 3). Время экспрессии составляло 72 часа. Дорожка 4 - маркеры молекулярных весов.

Однако выделение белка в бестеговой системе, как сказано выше, представляет собой сложный и трудоёмкий процесс, поэтому мы использовали в дальнейшей работе плазмиду, кодирующую белок иЬЗО с гексагистидиновым пептидом, которая даёт меньший выход белка, но более удобна в использовании.

Мы выделили полноразмерный белок 1)Ь30, содержащий гексагистидиновый тэг, понизив уровень экспрессии полимеразы использованием первого вирусного стока Р1 с самым низким вирусным титром (~5х106 БОЕ/мл). Множественность инфицирования вирусом составляло (М01 = 0,1), время экспрессии 72 часа. На рисунке 8 видно, что полоса экспрессируемого белка (дорожка 1) находится в области, соответствующей молекулярному весу целевого белка и отсутствует в дорожке 2, на которую нанесён лизат клеток неинфицированных вирусом.

,9'кдэ

Рис. 8. Электрофорез тотальных лизатов клеток Sf9 в 7,5% SDS ПААГ: 1 - клетки инфицирование рекомбинантным вирусным стоком PI, несущим ген UL30; 2 - неинфицированные клетки S/9; М - белковый маркер.

Белок был выделен и очищен с помощью аффинной хроматографии на колонках с N¡-NTA-агарозой (рис. 9) и гепарин-сефарозой. На колонку с Ni-NTA-агарозой наносили осветлённый лизат 9x106 клеток SJ9 инфицированных рекомбинантным бакуловирусом. Колонку последовательно промывали буферными растворами, содержащими 0, 10 и 50 мМ имидазола (дорожки 3, 4 и 5) и элюировали белок буферами, содержащими 100 и 200 мМ имидазола (дорожки 6 и 7). Видно, что белок плохо связывается с колонкой (дорожки 2 и 3),

поэтому его существенная часть теряется при » выделении.

/__1""н1'мМ__Рис. 9. Электрофорез в 7,5% SDS ПААГ белка UL30

м fj о 10 50 loo 200 после очистки на колонке с Ni-NTA агарозой; дорожка 1 220 кДа ; - белковый маркер, дорожка 2 - несвязанный белок,

дорожки 3-7 - фракции элюата, содержащие 0-200 мМ 136кпа имидазола (ImH).

Характеристики белка совпадали с описанными в литературе. Молекулярный вес белка составлял 136 кДа, фермент катализировал реакцию полимеризации на активированной ДНК в присутствии высоких концентраций соли (150 мМ (NHjhSOj), при которой активность других ДНК-полимераз ингибируется. Также для подтверждения свойств ДНК-полимеразы ВПГ проверили подавление синтеза ДНК, катализируемой ДНК-полимеразой в присутствии ACVTP. Соединение эффективно ингибировало реакцию полимеризации (ECso = 3 мкМ).

Аналогичные исследования были проведены с делетированным мутантом. Однако, когда фермент был экспрессирован, была опубликована работа, в которой для очистки фермента был использован фрагмент, содержащий His-tag, предложенный нами ранее, и было показано, что наличие концевого фрагмента необходимо для полноценной репликации вируса in vivo, предположительно в связи с ассоциацией ДНК-полимеразы с репликативной вилкой за счёт взаимодействия с третьим, неизвестным, партнёром (Terrell, Coen, 2012). Пре-ЫНг-домен не оказывает влияния на 5'-3'-полимеразную активность ДНК-полимеразы ВПГ или на ассоциацию с фактором процессивности UL42 in vitro. В связи с этим дальнейшая работа по изучению делетированной полимеразы ВПГ была приостановлена.

Таким образом, показано, что даже использование самых современных методик не позволяет экспрессировать ДНК-полимеразу вируса герпеса в прокариотической системе с

достаточным выходом. В бакуловирусной системе белок выделяется с достаточным выходом (~10 мкг из 1х107 клеток), а использование гексагистидинового тэга, предложенное нами, позволяет существенно упростить методику выделения белка и уже используется другими лабораториями для получения мутантных форм ДНК-полимеразы ВПГ-1.

Поиск новых антигерпетических препаратов

Мы проанализировали три класса новых соединений, которые ранее не рассматривались, как потенциально подавляющие развитие вируса герпеса. Это фосфонатные аналоги нуклеозидов, производные 1,2,4-триазолазина, 2'-фторпроизводные нуклеозидов. Мы исследовали подавление репликации вируса в клеточной системе Vero и взаимодействие NTP и дифосфатов фосфонатов с ДНК-полимеразой вируса герпеса.

Антигерпетическая активность фосфонатных аналогов нуклеозидов

В настоящее время в клинике используется три фосфонатных производных ациклических нуклеозидов, которые активируются в клетке, минуя стадию первичного фосфорилирования: аналог цитидина сидофовир, используемый для лечения цитомегаповирусной инфекции, и аналоги аденина адефовир и тенофовир, применяемые в терапии гепатита В и ВИЧ, соответственно. Таким образом, и антигерпетическое действие фосфонатных производных ACV и других аналогов нуклеозидов представляет определенный интерес.

Ранее в лаборатории были синтезированы фосфонатные (Z)- и (Е)-изомеры 9-[3-(фосфонометоксипроп)-1-ен-1-ил] аденина и карбоциклический фосфонатный аналог гуанина (рис. 10), и было показано, что первые два изомера ингибировапи репликацию ВПГ и ВИЧ в культурах клеток и имели очень низкую токсичность, Z-изомер являлся более эффективным ингибитором репликации обоих вирусов (Иванов, Андронова, 2005). Оба изомера подавляли резистентные к ацикловиру штаммы вируса, дефицитные по тимидинкиназе, так как для их активации не требуется первой стадии фосфорилирования, что делает их привлекательными в качестве потенциальных антигерпетических препаратов.

о

Г

ho-W W

Рис. 10. Фосфонатные производные нуклеозидов: (а) (2)-9-[3-(фосфонометоксипроп)-1-ен-1-ил] аденин, (Ь) (Е)-9-[3-(фосфонометоксипроп)-1-ен-1-ил] аденин, (с) карбоциклический аналог гуанозина.

Для установления механизма действия и причин низкой токсичности этих соединений в нашей лаборатории были синтезированы и изучены в качестве субстратов ДНК-полимеразы ВПГ, обратной транскриптазы ВИЧ и ДНК-полимеразы а из плаценты человека их дифосфаты. Выбор ферментов определялся следующими обстоятельствами. Во-первых, ВПГ, как указывалось ранее, в 70-90% случаев сопровождает ВИЧ-инфекцию и осложняет лечение пациентов, поэтому лекарственные препараты, подавляющие оба вируса, весьма привлекательны. Во-вторых, взаимодействие аналогов нуктеотидов с ДНК-полимеразами клетки часто является причиной их токсичности. Доступная нам ДНК-полимераза а является одной из таких полимераз.

л

ДНК полимераза ВПГ ДНК полимераза альфа

Дифосфат (а) Дифосфат (Ь) dATP Дифосфат (а)

ж*"* mm» __

т*т т**-

жж* asms* **

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0,2 0,5 1,0 1 2 5 10 0,2 5 10

Праймер

№ трека мкМ

Праймер

№ трека мкМ

Рис. И. Радиоавтограф ПААГ после разделения продуктов реакции включения синтезированных соединений в З'-конец 15'-12Р] праймер-матричного комплекса: А - ДНК-полимеразой ВПГ (треки 1-7) и ДНК-полимеразой а человека (треки 9-11). Трек 8 указывает расположение праймера, Б - ОТ ВИЧ. В состав праймер-матричного комплекса для включения дифосфатов a, b и с входили: праймер 5' - CCG ТСА ATT ССТ GTA GTC TCG - 3' и матрица 3' -GGC AGT ТАА GGA CAT CAG AGC TCG GAA CTG ATG CGA TTG ACC - 5'.

На рис. 11 представлено включение дифосфатов синтезированных соединений a, b и с в З'-конец праймера в праймер-матричной системе ДНК-полимеразой ВПГ-1, ДНК-полимеразой а человека (А) и обратной транскриптазой (ОТ) ВИЧ (Б). Видно, что изомеры были субстратами, как ОТ ВИЧ, так и ДНК-полимеразы вируса герпеса, включались в З'-конец праймера и терминировали дальнейшую элонгацию (рис. 11). Сравнение интенсивности полос, расположенных выше праймера, при одинаковой концентрации субстратов показывает, что дифосфат соединения а - более эффективный субстрат по сравнению с дифосфатом b для обоих вирусных ферментов, но не является субстратом ДНК-полимеразы а человека. Эти данные хорошо коррелируют с результатами, полученными на клеточных культурах. Дифосфат соединения с не являлся субстратом ДНК-полимеразы ВПГ, но был субстратом ОТ ВИЧ. Полосы, находящиеся ниже праймера, в случае ДНК-полимеразы ВПГ появляются в результате 3'-5'-экзонуклеазной активности фермента. Таким образом, механизм действия данных соединений заключается в их фосфорилировании до дифосфатов фосфонатов, которые избирательно включаются в цепи ДНК вируса герпеса и ВИЧ и терминируют их синтез.

Ингибирование ДНК-полимеразы ВПГ 2Т-нуклеотидами

В литературе описано огромное количество производных нуклеозидов, содержащих в различных положениях атом фтора (Watanabe, Harada, 1990). Многие из них обладают противовирусной и противораковой активностями. В терапии ВИЧ широко используется 5-фторламивудин, в нескольких работах описаны 2'-фтор-р-0-арабинонуклеозиды, которые обладают активностью против вирусов гепатита С, ВИЧ и герпеса. Ранее сообщалось, что 2'F-C подавляет рост ВПГ-1 в культуре клеток с меньшей эффективностью, чем ACV. Однако авторам не удалось показать включение 2'F-C в цепь вирусной ДНК (Wohlrab, Jamieson, 1985). Мы показали, что 2'F-ATP ингибирует реакцию, катализируемую ДНК-полимеразой ВПГ-1 с НС50 =15 мкМ и ОТ ВИЧ с ЕС50 более 100 мкМ.

Было также показано, что 2'F-NTP являются субстратами обоих ферментов и включаются в цепь ДНК. В случае ОТ ВИЧ синтез ДНК может продолжаться в присутствии

Обратная транскриптаза ВИЧ

Дифосфат (Ь) Дифосфат (а) Дифосфат (с)

- - • <т «е 3f 2Г 2? нш* "-

-JI1IL Л1 иг

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0,5 1 2 5 0,25 0,5 1 2 0,02 0,2 1

2'Р-производных до образования полноразмерных продуктов. Включение 2'Р-с1ЫМР в праймер-матричный комплекс, катализируемое ДНК-полимеразой ВПГ показано на рис. 12.

Рис. 12. Катализируемое ДНК-полимеразой ВГ1Г-1 включение 2'Р-® в З'-конец праймера. Реакционная смесь содержит: 5 или 20

мкМ <1СТР (дорожки 1 и 2); 5,20 или 50 мкМ 2Т-СТР (дорожки 3-5); элонгация 2Т-СМР на З'-конце праймера при добавлении 20 или 40 мкМ сЮТР (дорожки 6 и 7); элонгация праймера при добавлении четырех сЮТР (дорожка В); элонгация 2Т-СМР на З'-конце праймера * при добавлении с!АТР, сЮТР и ТТР (25 мкМ каждого; дорожка 9). Положение 19-членного праймера показано на дорожке 10.

ДНК-полимераза ВПГ-1 включает 2Т-СМР в праймер-123456789 10 матричный комплекс, хотя и с меньшей эффективностью, чем сЮМР (треки 3-5 и 1-2, соответственно). После включения 2'Р-СМР цепь может элонгироваться природным сЮМР (треки 6-7). Однако после включения второго 2Т-СМР согласно контексту матрицы синтез ДНК резко замедляется (трек 9). Синтез ДНК в присутствии четырех природных сШТР показан на треке 8.

Антигерпетическая активность производных триазинов

В литературе описаны 6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7(4Н)-оны, обладающие широким антивирусным действием. Например, нуклеозидные аналоги имидазоло[2,1-с]пиримидин-5-онов обладали активностью против гепатита В, а 1,2,4-триазоло[1,5-с][1,2,4]триазины были активны против некоторых штаммов вируса гриппа А и Б, и 6-арилазоло[1,5-с]пиримидин-7-оны были запатентованы как эффективные агенты против гепатита С. Ещё одним достоинством этих соединений является устойчивость и в щелочных, и в кислых средах, что существенно для синтеза соответствующих трифосфатов. Однако антигерпетические свойства этих соединений не были описаны.

Рис. 13. Структурные формулы производных 6-фенил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина и (2-5) 6-фенил-1,2,4-триазоло[5,1 -с] [ 1,2,4]триазин-9-она.

Совместно с Институтом органического синтеза им. И. Я. Постовского (Екатеринбург) нами были изучены ациклические производные 1,2,4-триазоло[1,5-а]пирмидин-9-онов как ингибиторы репликации ВПГ-1 в культуре клеток Vero, а некоторые их трифосфаты как субстраты ДНК-полимеразы ВГП. Структурные формулы соединений приведены на рис. 13.

Таблица 4. Цитотоксичность и антигерпетическая активность производных 1,2,4-триазоло[1,5-а]пирмидин-7-онов на культуре клеток Vero.

Соединение CD50, мМ Ш50, мМ SI

1а >0.8 0.05 >16

Ib >0.93 0.06 >15.4

2а-с, За >0.5 Не активны

ЗЬ >1 0.06 >16.7

Зс >0.5 0.03 >16.7

4а >0.5 Не активен

4Ь 0.95 0.015 63

4с 0.53 >0.007 <76

5а 1.13 0.07 16

5Ь >0.98 0.03 >32

5с >0.5 0.03 >16

Множественность инфекции = 0,01 БОЕ/клетка

Было показано, что синтезированные соединения проявляют умеренную антигерпетическую активность на культуре клеток Vero и низкую токсичность (таблица 4). Наиболее активными и наименее токсичными были соединения 4с и 5Ь.

Для того чтобы установить является ли ДНК-полимераза ВПГ мишенью данных соединений были синтезированы трифосфаты нескольких из них и исследованы как субстраты ДНК-полимеразы вируса герпеса. Показано, что соединения ингибируют фермент, и их активность зависит от структуры соединения (таблица 5). Данные получены в трех независимых экспериментах.

Таблица 5. Ингибирование ациклическими производными 1,2,4-триазоло[1,5-а]пирмидин-7-онов реакции элонгации праймера, катализируемой ДНК-полимеразой ВПГ-1.

Соединение IC50, мкМ

За-ТР 160±28

Зс-ТР 100118

5Ь-ТР 150±25

ACVTP 30±6

фоскарнет 10±2

Трифосфат соединения Зс (рис. 13), несущий метилтио-группу, наиболее эффективно ингибировал встраивание радиоактивномеченного АМФ в З'-конец праймер-матричного комплекса с Ю50 = 100 мкМ (таблица 5). Данные коррелируют с результатами экспериментов на клеточной культуре. Ингибирующая способность производных триазолоазина была сопоставима с таковой стандартных ингибиторов герпесной ДНК-полимеразы ацикловира и фоскарнета.

На основании полученных результатов можно предположить, что одной из мишеней этих соединений является герпесвирусная ДНК-полимераза. Неизвестно, являются ли они ингибиторами нуклеозидного типа и связываются с активным центром фермента, или ненуклеозидного и связываются с ферментом вне активного центра. Испытанные соединения представляют собой новый перспективный класс ингибиторов вируса герпеса.

Выводы

1. Молекулярно-генетическиП анализ ряда клинических изолятов ВПГ-1, резистентных к ACV, и лабораторных клонов, устойчивых к HpACV, к различным антигерпетическим препаратам и ингибиторам показал, что резистентность является следствием впервые обнаруженных, а также описанных ранее мутаций в генах ДНК-полимераз и тимидинкиназ. Характер мутаций свидетельствует о различиях в механизмах действия ACV и HpACV.

2. Разработан метод очистки ДНК-полимеразы ВПГ с помощью афинной хроматографии на Ni-NTA агарозе, что существенно упрощает процедуру выделения. Впервые экспрессирована в бакуловирусной системе мутантная форма ДНК-полимеразы ВПГ-1, лишенная npe-NH2-ÄOMena (A140UL30).

3. Охарактеризован новый класс ингибиторов репликации ВПГ - 1,2,4-триазоло[1,5-а]пирмидин-9-оны. ДНК-полимераза ВПГ-1 является одной из мишеней действия этих соединений.

4. Показано, что дифосфат (г)-9-[3-(фосфонометоксипроп)-1-ен-1-ил]аденина, подавляющего репликацию ВПГ-1 и ВИЧ в культуре клеток, является субстратом ДНК-полимеразы и ОТ этих вирусов, включается в цепи вирусных ДНК и терминирует их синтез.

5. Показано, что 2'-фторпроизводные нуклеотидов (2'F-NTP) ингибируют синтез ДНК, катализируемый ДНК полимеразой ВПГ, и утилизируются ею в качестве субстратов.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях: Статьи в журналах

1. А.Н. Коровина, М.В. Ясько, A.B. Иванов, АЛ. Хандажинская, Э.В. Карамов, Г.В. Корнилаева, М.К. Куханова «Новые ингибиторы репликации вирусов герпеса и иммунодефицита человека на основе фосфонатных аналогов нуклеозидов». Вестник московского университета Серия 2. Химия, 2008,49(2), 108-111

2. Anna A. Gus'kova, Mikhail Yu. Skoblov, Anna N. Korovina, Maxim V. Yasko, Inna L. Karpenko, Marina K. Kukhanova, Valeria L. Andronova, George A. Galegov and Yuri S. Skoblov «Antihcrpetic Properties of Acyclovir 5'-Hydrogenphosphonate and the Mutation Analysis of Herpes Virus Resistant Strains». Chemical Biology & Drug Design, 2009, 74(4), 382-389

3. S.L. Deev, M.V. Yasko, I.L. Karpenko, A.N. Korovina, A.L. Khandazhinskaya, V.L. Andronova, G.A. Galegov, T.S. Shestakova, E.N. Ulomskii, V.L. Rusinov, O.N. Chupakhin, M.K. Kukhanova «1,2,4-TriazoIoazine derivatives as a new type of herpes simplex virus inhibitors». Bioorganic chemistry, 2010,38(6), 265-270

4. А.Н. Коровина, A.A. Гуськова, М.Ю. Скоблов, B.JI. Андронова, Г.А. Галегов, С.Н. Кочетков, М.К. Куханова, Ю.С. Скоблов «Анализ мутаций в генах тимидинкиназ и ДНК-полимераз клинических изолятов вируса простого герпеса, резистентных к антигерпетическим препаратам». Молекулярная биология, 2010,44(3), 488-496

5. А.Н. Коровина, М.К. Куханова, С.Н. Кочетков «Поиск ингибиторов репликации вируса герпеса: 30 лет после ацикловира». Biotechnologie Acta, 6(4), 78-85

6. М.К. Куханова, A.II. Коровина, Ю.А. Шаркин, А.В. Ажаев, С.Н. Кочетков «2'-Фторнуклеозидтрифосфаты как субстраты вирусных репликативных нукпеотид полимераз». Молекулярная биология, 2014,48(5), 1-9

7. М.К. Куханова, А.Н. Коровина, С.Н. Кочетков «Вирус простого герпеса человека: жизненный цикл и поиск ингибиторов». Успехи биологической химии, 2014, 54, 457497

Тезисы конференций

1. Korovina A.N., Ivanov A.V., Kukhanova М.К. «Expression, functional characterization and new terminator substrates of HSV-1 DNA polymerase», Abstract book p. 127, Kyiv 2007.

2. Коровина A.IL, Куханова М.К. «Экспрессия ДНК-полимеразы ВПГ. Анализ влияния мутаций в е£ гене на устойчивость штаммов вируса герпеса к ацикловиру». Сборник тезисов стр. 56, Новосибирск 2008г.

3. Коровина А.Н. «Анализ мутаций в гене ДНК-полимеразы из клинических изолятов ВПГ». Сборник тезисов стр. 57, Казань 2009г.

4. Korovina A.N., Kukhanova М.К. «Molecular genetic analysis of DNA-polymerases and thymidine kinases from clinical and laboratory HSV isolates resistant to ACV and HpACV». Abstract book, p. 206, St. Petersburg 2013.

Подписано в печать:

07.04.2015

Заказ № 10689 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru