Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и получение диагностических тест-систем к вирусу герпеса человека 6-го типа и их применение для изучения HHV-6 инфекции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Мельниченко, Анна Валерьевна

Список сокращений и обозначений.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I. Вирус герпеса человека 6-го типа, краткая характеристика, структура, репликация, сборка вирусных частиц.

ГЛАВА 2. Клеточный тропизм и ростовые свойства HHV-6.

2. 2 Культивирование клеток в среде, содержащей ростовые протеины.

ГЛАВА 3. Патогенез, клиника, эпидемиология HHV-6.

3.1. Патогенез и пути передачи BHV-6 инфекции.

3.2. Клинические проявления HHV-6.

3.3. Эпидемиология HHV-6.

ГЛАВА 4. Диагностика и лечение HHV-6.

4.1. Лабораторная диагностика герпесвирусных инфекций.

4.2. Концентрирование и очистка вирусов.

4.3. Лечение HHV-6 инфекции.

ЧАСТЬ

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Основные реактивы и препараты, используемые в работе.

Клетки.

Вирусы.

Культивирование вируса.

Оценка жизнеспособности клеток, определение концентрации и пролиферативной активности клеток.

Консервация и деконсервация клеточных культур.

Получение лизата клеток.

Использование ростовых протеинов.

Концентрирование и очистка вируса герпеса 6-го типа.

Электронная микроскопия.

Определение концентрации белка в препаратах.

Электрофорез и иммуноблоттинг.

Иммуноферментный анализ.

Метод непрямой иммунофлюоресценции.

Статистическая обработка результатов исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 6. Оптимизация условий культивирования вируса герпеса человека 6-го типа и получение высокоактивных вируссодержащих препаратов.

6.1. Изучение динамики накопления вирусов HHV-6A и В в различных клеточных линиях и определение максимального выхода вируса.

6.2. Использование различных линий клеток при культивировании HHV-6 и адаптация к средам и сывороткам отечественного производства.

6.3. Использование ростовых протеинов при культивировании Т - лимфобластоидных клеточных линий и инфицированных HHV-6.

ГЛАВА 7. Препаративное получение концентрированных и очищенных антигенов вируса герпеса человека 6-го типа и изучение иммунобиохимических свойств.

7.1. Концентрирование и очистка вируса герпеса 6-го типа.

7.2. Исследование антигенной активности полученного препарата вируса в тИФА.

7.3. Исследование очищенного и концентрированного препарата вируса в электрофорезе.

7.4. Исследование методом электронной микроскопии.

ГЛАВА 8. Отработка оптимальных условий проведения тИФА.

8.1.Определение оптимальной концентрации антигена для сорбции.

8.2. Определение длительности и температурного режима сорбции.

ГЛАВА 9. Выявление антител к вирусу герпеса человека 6-го типа в сыворотках больных методом тИФА

9.1. Скрининговые исследования человеческих сывороток.

9.2. Определение специфичности исследуемых сывороток в отношении белков HHV-6 в иммуноблотгинге.

9.3. Сопоставление разработанных диагностических тест-систем к HHV-6 (тИФА, нИФ, иммуноблоттинга) при исследовании сывороток крови.

ГЛАВА 10. Изучение противовирусного действия ряда противовирусных препаратов на репродукцию вируса герпеса 6-го типа in vitro.

10.1. Исследование цитотоксичности препаратов ФМК и ацикловира на клетках HSB-2.

10.2. Исследование противовирусного действия препаратов ФМК и ацикловира на репродукцию вируса герпеса 6-го типа in vitro и определение ХТИ.

ГЛАВА 11. Обсуждение полученных результатов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и получение диагностических тест-систем к вирусу герпеса человека 6-го типа и их применение для изучения HHV-6 инфекции"

Вирусы семейства Herpesviridae занимают значительное место в патологии человека. По данным Всемирной организации здравоохранения заболевания, обусловленные вирусами герпеса, как причина смерти от вирусных инфекций занимают второе место после гриппа. От генерализованной герпетической или цитомегаловирусной инфекции погибает до 30% ВИЧ-инфицированных больных.

Семейство Herpesviridae состоит более чем из 100 различных вирусов, поражающих беспозвоночных и позвоночных, включая рыб, птиц и других домашних животных, и только S из них известны как патогенные для человека. Эти герпесвирусы (5 из них - ВПГ 1,2 типа, вирус герпес-зостер (VZV), Эпштейна-Барр (EBV) вирус и цитомегаловирус (CMV) известны в течение нескольких десятилетий и хорошо изучены. Используя новейшие научные разработки и методы по выделению и культивированию лимфоцитов крови человека, а также по идентификации генетического материала инфекционных агентов , были открыты еще 4 новых герпесвируса патогенные для человека в период с 1986 по 1994 годы; это - вирус герпеса человека 6-го типа вариант А и вариант В (human herpesvirus type 6 variant A, variant В -HHV-6), вирус герпеса 7-го типа (human herpesvirus type 7-HHV-7) и 8-го типа (human herpesvirus type 8 -HHV-8 or Kaposi's sarcoma herpesvirus -KSHV).

В 1986 году впервые S.Z.Salahuddin (CILIA) был выделен от больных с различными лимфопролиферативными и иммунодефицитными заболеваниями, вирус герпеса человека 6-го типа. Проведенные сероэпидемиологические исследования показали, что вирус герпеса 6-го типа,подобно другим герпетическим вирусам, широко распространен в различных странах Мира (Америка, Европа, Африка, Япония и др.). Значение HHV-6 в патологии человека продолжает интенсивно изучаться.

К настоящему времени доказана этиологическая роль этого вируса в развитии внезапной экзантемы (синоним: exantema subitum roseola infantum) - широко распространенного заболевания детей в возрасте от 3 месяцев до 3 лет - лимфопролиферативное заболевание с моноклональной пролиферацией В-клеток. Описаны случаи фатального гемофагоцитарного синдрома у 8-месячной девочки, фульминантного гепатита, тяжелые случаи менингита и менингоэнцефалитов, фатальной диссеминирующей инфекции у иммунокомпетентных детей.

В современной научной литературе дискутируется роль HHV-6 в этиологии еще одного заболевания - синдрома хронической усталости (слабости), которым страдают взрослые. Но роль HHV-6 в возникновении этого заболевания остается до конца не выясненной.

Выраженный тропизм вируса к лимфоидным и глиальным клеткам указывает на его этиологическое значение в индукции лимфопролиферативных и гематологических нарушений, а также иммунодефицитных состояний. У взрослых от 12 до 30% случаев инфекционного моноиуклеоза с длительной лимфоаденопатией, не связанного с вирусом Эпштейна-Барр, обусловленны HHV-6 инфекцией, описаны случаи тромбоцитопенической пурпуры, дисфункция печени, гистиоцитарного некротизирующего лимфаденита, прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия, тяжелая неврологическая симптоматика и патология ЦНС. ДНК HHV-6 обнаружены в лимфомных клешах при лимфогранулематозе,лимфоме Беркшта.ННУ-6 связывают с некоторыми постгрансплантационными осложнениями.Установлена способность ДНК HHV-6 неопластически трансформировать клетки NIH ЗТЗ.

Инфицирование HHV-6 происходит в раннем детстве и, как правило сопровождается бессимптомной сероконверсией и вирусоносительством. Первичная инфекция среди взрослых отмечается довольно редко. Высокие уровни антител отмечаются у больных с иммунологическими нарушениями, что обусловлено реактивацией вируса. Тяжесть и острота процесса этих заболеваний определяется инфекционной активностью этого вируса. Способность вирусов герпеса сохраняться в популяции хозяина обеспечивает существование стертых и различных атипичных клинических форм инфекции, латентное носительство. Кроме того, герпесвирусы обладают уникальной способностью к пожизненной персиситенции в организме хозяина и могут обеспечивать заболевание в ассоциации с другими вирусами и возбудителями, что значительно затрудняет диагностику. Поэтому, в создавшейся ситуации заметно повышается интерес к методам лабораторной диагностики HHV-6 инфекции и созданию тест-систем , которые отсутствуют на данный момент в нашей стране.

Приведенные данные свидетельствуют, что вирус HHV-6 ассоциируется с различной патологией человека, но роль его в возникновении этих заболеваний остается до конца не выясненной.

Открытие еще одного представителя семейства вирусов герпеса -вируса герпеса 6-го типа (вариант А и вариант В), патогенного для человека, привело к необходимости изучения биологических свойств вируса, клинических проявлений HHV-6 инфекции, к проведению сероэпидемиологических исследований по распространенности указанного агента в человеческой популяции. В нашей стране таких исследований не проводилось, поэтому проблема изучения вируса HHV-6 весьма актуальна и необходимость в таких исследований стоит очень остро.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы являлась разработка и получение современных отечественных тест-систем для диагностики HHV-6 -индуцированных инфекций человека с последующей клинической апробацией и изучением распространенности HHV-6 в человеческой популяции в нашей страны.

Для достижения этой цели ставились следующие задачи:

1. Оценка пермиссивности суспензионных клеточных культур и оптимизация условий культивирования HHV-6 на основе отечественных питательных сред и сывороток;

2. Разработать способы получения концентрированного и очищенного вируса HHV-6 в препаративных количествах;

3. Разработать и получить диагностические тест-системы к вирусу HHV-6 (тИФА, рНИФ);

4. Изучить распространение HHV-6 инфекции в человеческой популяции нашей страны.

5. Исследовать ряд противовирусных препаратов на HHV-6.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

1. Впервые показана возможность культивирования HHV-6 на отечественных питательных средах, сыворотках и ростовых протеинах;

2. Оптимизированы условия получения HHV-6 в препаративных количествах с использованием методов ультрацентрифугирования и концентрации в градиенте плотности глицерин-тартрат калия;

3. Разработаны и получены диагностические тест-системы (тИФА, РИФ, подтверждающий метод иммуноблоттинга) на основе антигена вируса HHV-6;

4. Показана возможность использования полученных систем для диагностики HHV-6 инфекции у человека;

5. Изучена антивирусная активность ряда препаратов в отношении HHV-6 инфекции in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Определены чувствительные клеточные лимфобластоидные линии для культивирования HHV-6 на отечественных питательных средах и сыворотках с использованием ростовых протеинов,полученных из сывороток свиней и крупного рогатого скота.

2. Получены диагностические тест-системы ( тИФА, нИФ, иммуноблотганга) на основе высокоактивных антигенных препаратов вируса и показана возможность их использования для выявления антител к HHV-6.

3. Установлено значительное ингибирующее действие фосфономуравьиной кислоты на репродукцию вируса герпеса 6-го типа in vitro.

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на VI - Всероссийском Симпозиуме «Биология клетки в культуре» - Санкт-Петербург, ноябрь 1999, на Научно-практическом Симпозиуме «Национальные дни лабораторной медицины России- 2001» (Москва, октябрь 2001 г.). Материалы диссертационной работы были доложены на заседании Отдела Государственной Коллекции вирусов и экспериментального производства 13 марта 2002 г Института Вирусологии. В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на заседании апробационного Совета по медицинской вирусологии Института Вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН 16 апреля 2002.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 23 источника отечественных авторов и 125 источников зарубежных авторов. Диссертация изложена на i00 страницах машинописного текста, содержит 3 таблиц, iS рисунков и S фотоснимков клеточных препаратов.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Мельниченко, Анна Валерьевна

ВЫВОДЫ:

1. Определен спектр высоко чувствительных лимфобластоидных клеточных линий, в которых отмечается максимальный выход вируса герпеса человека 6-го тапа (HHV-6); Разработаны оптимальные условия получения кулыуральных вируссодержащих суспензий.

2. Впервые показана возможность культивирования HHV-6 на отечественных питательных средах и сыворотках с использованием ростовых протеинов (РП), полученных из сывороток крупного рогатого скота и свиней, вместо эмбриональной телячьей сыворотки, что экономически эффективно.

3. Оптимизированы условия получения высокоактивных концентрированных и очищенных антигенных препаратов вируса HHV-6 с использованием методов ультрацентрифугирования в градиенте плотности тартрата калия - глицерина.

4. Впервые разработаны диагностические тест-системы на основе очищенного и концентрированного антигена вируса для выявления антител к HHV-6 методом тИФА и подтверждающим методом иммуноблоттинга, а на основе инфицированных клеточных препаратов - методом непрямой иммунофлюоресценции - нИФ.

5. Проведена апробация разработанных нами тест-систем тИФА, нИФ и иммуноблоттинга, посредством скрининга

680 сывороток крови больных различной этиологии и доноров. Выявлено, что HHV-6 широко распространен в человеческой популяции нашей страны-53%серопозитивных лиц, а в группе больных с выраженной иммуносупрессией (лимфопролиферативные заболевания и гемобластозы, трансплантация органов и тканей) - 78 % серопозитивных.

6. Сравнительный анализ противовирусного действия фосфономуравьиной кислоты (ФМК) и ацикловира в отношении репродукции HHV-6 in vitro, показал преимущество фосфономуравьиной кислоты (ХТИ=10), в сравнении с ацикловиром (ХТИ=0,9)

включения

101, 82 70, 64, 54 к Да пациент К. Лимфома пациент Сердечнососудистая операция

К.

1: 8100

1:320,-н-н-ядерные и цитоплазм, включения

101, 82 70, 64, 54 к Да

1: 8100

1:320,-н-н-ядерные и цитоплазм, включения

116, 101,82, 70, 64, 54, 41 к Да пациент П. Миелома

1:900

1:20, + слабое свечение ободка цитоплазмы

101 кДа пациент А. Болезнь Шегрена

Донор крови

1:2 700

1:100

1:160, ядерные и цитоплазм. включения 1:10,+

101, 82, 70, 64, 41 к Да

101 к Да

На рисунке Ш представлены инфицированные клетки HSB-2 в реакции нИФ с исследуемыми сыворотками.

Рис.ЗДа - (пациент Р.- диагноз острый лимфолейкоз) отмечаются свечение ядерных и цитоплазматических включений, интенивность свечения (++++) титр AT 1:640, рис.14 ;в пациент П. - миеломная болезнь, свечение цитоплазмы в виде «ободка», татр AT 1:20.

14-а

14-и

14-г контроль клетик.

При сопоставлении результатов , полученных при использовании разработанных нами диагностических тест-систем (тИФА, нИФ, иммуноблотгинг) показали совпадении в 80% случаев.

Так, при исследовании сыворотки больных с лимфопролиферативными заболеваниями на выявление AT к HHV-6 методом тИФА и реакцией нИФ, титры антител в обоих реакциях были высокими и коррелировали между собой, при этом в иммуноблоттинге эти сыворотки выявляли более интенсивные полосы в препарате вируса. Сыворотки сомнительные , дающие результат +/- необходимо всегда подтверждать в иммуноблоттинге.

В иммуноблоттинге, количество вирусных белков, выявляемых отдельными сыворотками варьирует, предполагается, что уровень экспрессии вирусных белков у разных индивидуумов различен. Сыворотки положительные в тИФА не всегда выявляли специфическое свечение в нИФ, это также указывает на то, что в различных сыворотках больных: HHV-6 могут превалировать те или иные отличающиеся по специфичности и/или аффинитету антитела.

Глава 10. Изучение противовирусного действия ряда противовирусных препаратов на репродукцию вируса герпеса человека 6-го типа in vitro.

Для изучения противовирусного действия химиопрепаратов на репродукцию вируса герпеса 6-го типа in vitro были выбраны 2 из них -ацикловир (ациклогуанозин) отечественного производства и фосфономуравьиная кислота (ФМК) - тринатриевая соль фосфономуравышой кислота). Ацикловир - как эталонный противогерпетический препарат и типичный представитель группы аналогов нуклеозидов, являющийся аномальным метаболитом и фосфономуравьиная кислота (неорганическое соединение) препарат с другим механизмом противовирусного действия в отношении герпетической инфекции. Препараты, любезно предоставлены профессором Г.А. Галеговым - рук. лаборатории химиотерапии вирусных инфекций ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И.Ивановского.

На первом этапе наших исследований было изучено действие этих препаратов на используемую в эксперименте клеточную линию HSB-2. Ю. I." Исследование шгготоксичности препаратов ФМК и ашпсловира на клетках HSB-2t

Клеточную линию HSB-2 культивировали в концентрации 5x105 кл/мл в среде RPMI-1640 с добавлением 10-15 % ЭТС, 2 мМ-Ьглутамина и 100 мкг/мл гентамицина в виде суспензии в атмосфере, содержащей 5% ССЬ и 98% влажности при t= 37° С. Перед внесением в культуру - растворы ФМК и ацикловира стерилизовали фильтрацией через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм (Millipore).

Была проанализирована цитотоксичность препаратов в культуре клеток HSB-2. Для этого использовали 24-луночные культуральные планшеты (Costar), в лунки помещали по 1,8 мл суспензии клеток, после чего в соответствующие лунки добавляли по 0,2 мл исследуемых препаратов в различных концентрациях или полную ростовую среду. Учет результатов проводили через 24, 48, 72, 96 часов культивирования клеток. Результаты опыта оценивали по снижению темпов роста культуры (подсчитывали плотность клеточной популяции) и уменьшению процента жизнеспособных клеток ( % жизнеспособности клеток определяли при подсчете в камере Горяева прокрасившихся 0,5% трипановым синим клеток).

Определяли 50% тканевую цитотоксическую дозу для каждого соединения (ТЦД50 )-Доза, вызывающая 50% изменения морфологии ткани и нарушения поглощения клетками витального красителя по сравнению с контролем. Данные по определению цитотоксичности препаратов представлены в Таблице № 8

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Мельниченко, Анна Валерьевна, Москва

1. Вотяков В.И., Бореко Е.И., Владыко Г.В., Галегов Г.А. - Первичное изучение антивирусных свойств синтетических и природных соединений.- Метод. Рекомен. Минздрав,- Минск-1986 - 30 С.

2. Дроздова Т.Н. Стандартизация сывороточного компонента вирусологических питательных сред (условия фракционирования и использования).//Дис.на соиск. уч. ст. к.б.н.-Свердповск, 1979

3. Дзагуров С.Г.,Игудин Л.И., Маркман Г.А. Способ получения ростового протеина. Авторское свидетельство СССР № 125073,1990

4. Дьяконов Л.П., Ситьков В.И., Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии),// М, 2000- 400 С.

5. Игудин Л.И., Маркман Г.А.6 Лобань С.А. Получение РП с помощью (NH^SCXi и ПЭГа и их использование в биологии и медицине.-// ЖМЭИ-1984, № 4 с. 17-21

6. Исаков В.А.,Ермоленко Д.К.,Чайка Н.А.,Норман Л.Л. Эпидемиологические аспекты инфекции, обусловленной лимфотропным вирусом герпеса 6 типа.//Журн.микробиол.-1995.-№4.-С.111-114.

7. Карпова И.П., Перевозчиков В.А., Корниенко Л.Н. и др. Очистка вируса болезни Ауески изопикническим центрифугированием. // Вопр.Вирусол.-1995- № 3- С. 130-132

8. Ю.Киллингтон Р., Пауэлл К., Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов. В кн.: Вирусология. Методы. Под ред. Мейхи Б, М., Мир,) 988-С.270-30311 .Кицак В.Я. Вирус герпеса 6 новый вирус человека.//Вопр.вирусол.-1990-М 2, С.171-172

9. Клюшник С.Ю., Березин В.Э., Новицкий В.А., Пушкарская Н.Л. -Препаративное получение очищенных антигенов вируса простого герпеса 1 типа и изучение их иммуногенных свойств.//Вопр.Вирусол 1988-№1-С.48-51

10. Корнилаева Г.В., Подчерняева Р.Я., Карамов Э.В. и др. Культивирование Т-лимфобластоидных клеточных линий в средах содержащих ростовые протеины.//Вопр.Вирусол.-1997, № 3 с.133-134

11. Королев М.Б. Электронно-микроскопические методы выявлениявирусов., М. 1980,158 с. (Итоги науки и техники. Сер. Вирусология /ВИНИТИ Т.9)

12. Львов Н.Д., И.Л.Дегтярев, П.Г.свешников. Т.А. Посевая и др. Разработка иммуноферментного теста для определения вируса простого герпеса типа 1 с использованием моноклональных антител. Вопр. Вирусол. № 1986-№ 6, с709-712.

13. Мешкова Н.П., Северин С.Б., Практикум по биохимии, Из-во Московского Университета, 1979-430С.

14. Пинаев Г.П., Методы культивирования клеток: Сборник научных трудов.-Л. .Наука,1988-31ЗС.

15. Подчерняева Р.Я., Лазаренко А.А., Гасанова Б.С. и др. Репродукция вируса простого герпеса в клетках Vero в бессывороточных средах.// Актуальные проблемы инфекционной патологии ч.З. Иммунология и биотехнология.- С-Петербург-1993, С.86

16. Подчерняева Р.Я., Конду Э.И.ДПалунова Н.В. и др.// Изучение различных ростстимулирующих белков, используемых для культивирования клеток млекопитающих.// Биотехнол.-1994, №6-с.20-23

17. Сорокина Е.А., Мартынец В.Т., Ночевный В.Т. и др. // Конструирование сухих стерильных бессывороточных и малосывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. -Биотехнол.-1998, № 1, с.67-72

18. Степина В.Н.,Афанасьева Т.А.,Евтушенко В.В.и др.Вирус герпеса человека типа 6 (HHV-6) и его распространение в стране. //Вопр. Вирусол.-1993.-N 2.-С.-66-69.

19. Урбах В.Ю. Биометрические методы.-М.:Наука,1964 416 С.

20. Шафеева Р.С., Кулагин В.Р., Крутилина Д.В. и др. Культвирование клеток в среде с ростовыми протеинами.// Цитология 2000-т.42, № 3/4, С.324.

21. Ablashi D.V.,Salahuddin S.Z.,Josephs S.F. HBLV (or HHV-6) in human cell lines.// Nature-1987-Vol.329-P.207

22. Ablashi D.V.Josephs S.F.,Buchbinder A. et al. Human B-lymphotropic virus (human Ьефе8лаги8-6).//1.\тго1.МеШ.-1988.-Уо1.21.-Р.29-48.

23. Ablashi D.V.,Balashandran N.,Josephs S.F. et al. Genomic polymorphizm, growth properties,and immunologic variations in human herpesvirus 6 izolates.//Virology.-1991.- Vol.l84.-P.545-552.

24. Agut H.,Guetard D.,Collandre H.et al. Concomitant infection by human herpesvirus 6,HTLV-1 andHIV-2.//Lancet.-1988.-Vol.l.-P.712.

25. Ando Y.,Kakimoto K.,Ekuni Y.et al. HHV-6 infection duringpregnancy and spontaneous abortion.//Lancet.-1992.-Vol.340.-P.1289.

26. Andre M.JMatz B. Antibody responses to human herpesvirus 6 and other heipesvirus.//Lancet.-1988.-Vol.2.-P.1426.

27. Asada H.,Yalcin S.,Balachandra K.et al. Establishment of titration system for human herpesvirus 6 and evaluation of neutralizing antibody response to the virus.//J.Clin.Microbiol.-1989.-Vol.27.-P.2204-2207.

28. Asano Y.,Yoshikawa T.,Suga S.et al. Viremia and neutralizing antibody response in infants with exanthem subitum.//J.Pediatr.- 1989.-Vol.l 14.- P.535-539.

29. Asano Y.,Nakashiwa T.,Yoshikawa T.et al. Severity of human herpesvirus-6 viremia and clinical findings in infants with exanthem subitum.//J.Pediatr. 1991.-Vol.ll8.-P.891-895.

30. Asano Y.,Yoshikawa T.,Suga S.etal. Clinical features of infants with primary human herpesvirus 6 infection (exanthem subitum,roseola infantum).//Pediatrics.-1994.-Vol.93.-P.104-108.

31. Balachandra K.,Ayuthaya P.I.,Auwanit W.et al. Prevalence of antibody to human herpesvirus 6 in women and children.//Microbiol.Immunol. 4989. Vol.33.-P.515-518.

32. Balachandran N.,Amelse R.E.,Zhou W.W.et al. Identification of proteins specific for human herpesvirus 6 infected human T cells.// J.Virol.-1989. Vol.63.-P.2835-2840.

33. Bapat A.R.,Bodner AJ.,Ting R.C.Y.etal. Identification and some properties of a unique DNA polymerase from cells infected with human B-lymphotropic virus.//J.Virol.-1989.-Vol.63.-P. 1400-1403.

34. Berneman Z.N., Ablashi D.V., Ge Li et al. Human herpesvirus 7 is a T-lymphotropic virus and is related to, but significantly different from, human heprsvirus 6 and human cytomegalovirus.// Proc.Natl. Acad. Sci. USA- 1992-Vol.89-P.10552-10556

35. Biberfeld P.,Petren A.L.,Eklund A.et al.Human herpesvirus 6 (HHV-6,HBLV) in sarcoidosis and limphoproliferative disorders.//;. Virol .Meth.-l 988.-Vol.21 .-P.49-59.

36. Birch J.R.,Cramar F., Edwards D.J. et al- Serum requirement for growth and immunoglobin synthesis by cultured human lymphocyte cell lines.// Dev.Biol.Stand.-1978-Vol.42.-P.165-169

37. Birch J.R. The role serum in the culture of a human lymphoblastoid cell line.// Dev.Biol.Stand.-1980-Vol.46-P.21-27.

38. Black J.B.,Sanderlin K.C.,Goldsmith C.S.et al. Growth properties of human herpesvirus 6 strain Z-29.//J.Virol.meth.-1989.-Vol.26.-P.133

39. Black J.B.,Lopez C.,Pellett P.E. et al. Induction of host cell protein synthesis by human herpesvirus 6.//Virus Res.-1991,-Vol.22. -P. 13-23.

40. Bollag D.M., Edelstein S.J. // Protein Methods- Department of Biochemistry, University of Geneva -1991,200 P.

41. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.//Anal.biochem.-1976-vol.72-p.248-254

42. Brown N.A.,Sumaya C.V.,Liu C.R.et al. Fall in human herpesvirus 6 seropositivity with age.//Lancet.-1988.-Vol.2-P.396-398.

43. Campadelli-Fiume G., Guerrini S., Xiaming L. et all.-Monoclonal antibodies to glycoprotein В differentiate human herpesvirus 6 in to two clusters, variants A or В.// J. Gen.Virol.-1993-Vol.74-P.2257-2262

44. Challoner P.B.,Smith K.T.,Parker J.D.et al.Plaque-associated expression of human herpesvirus 6 in multiple sclerosis.//Proc.Natl. Acad.Sci.USA.- 1995.-Vol.92.-P.7440-7444.

45. Chee M.S., Lawrence G.L., Barrell B.G. et al. Alpha-, beta- and gammaherpesviruses encode a putative phosphotransferase.// J. Gen. Virol.-1989-Vol.70-P.l 151-1160

46. ChenM.,Popescu N.Woodworth C.etal. Human Ьефезлогш 6 infects cervical epithelial cells and transactivates human papillomavirus gene expression.//!Vkol.-1994.-Vol.68.-P.1173-1178.

47. Chou S.,Scott K.M. Rises in antibody to human herpesvirus 6 detected by enzyme immunoassay in transplant recipients with primary cytomegalovirus infection.//J.Clm.Microbiol.-l 990.-Vol.28.-P.851 -854.

48. Chou S., Marousek G.I. Homology of the envelope glycoprotein В of human herpesvirus 6 and cytomegalovirus.// Virology-1992-Vol.l91-P.523-528

49. Chou S., Marousek G.I Analysis of interstrain varriation in putative immediate-early region of human herpesvirus 6 DNA and definition of variant-specific sequences.//Virology-l994.Vol. 198-P.370-376

50. Clark D. A.,Alexander F.E.,McCinney P.A.et all.-The seroepidemiologyof human herpesvirus 6 (HHV-6) from a case-control study of leukaemia and lymphoma.//Int.J.Cancer-1990-Vol.45-P.829-833

51. Di Luca D.,Katsafanas G.,Schirmer E.C.et al. The replication of viral DNA in human herpesvirus 6-infected cells.//Virology.-1990.-Vol. 175.- P.199-210.

52. Dewhurst S.,Chandran В., Mclntyre K.et all.-Phenotypic and genetic polymorphism among human herpesvirus 6 isolates from North American infants.//Virology-1992-Vol. 190-P.490-493.

53. Dewhurst S., Krenitsky D.M., Dykes G.et al. Human herpesvirus 6 В origin: sequence diversity requirement for two binding sites for origin-binding protein, and enchanced replication from origin multimers.// J.Virol.-1994 -Vol.68-P.6799-6803

54. Downing R.G.,Sewankambo N.,Serwadda D. Et all.-Isolation of human lymphotropic herpesvirus.//Lancet-1987-Vol. 1-P.390.

55. Efstathiou S., Barrell B.G., Lawrence G.L. et al. Identification of homologues to the human cytomegalovirus US22 gene family in human herpesvirus 6. //J.Gen. Virol.-1992. Vol.73-P.1661-1671

56. Ellinger K., Neipel F., Foa-Tomasi L. et all.-The glycoprotein В homolog of human herpesvirus 6.//J.Gen.Virol-1993-Vol.74-P.495-500

57. Ensoli B.,Lusso P.,Schachter F.et al. Human herpesvirus 6 increase HIV-l expression in co-infected T cells via nuclear factor binding to the HIV enhancer.//EMBO J.-1989.-Vol.8.-P.3019-3027.

58. Fields Virology.,Human Herpesvirus 6,Human Herpesvirus 7.,Third Edition., ed.by Fields B.N.,Knipe D.M.,Howley P.M.Lippincott-Raven Publishers. Philadelphia. 1996.-P.2587-2622.

59. Flamand L., Menezes J.-Cychs AMP-responsive element-dependet activation of Epstein-Barr virus zebra promoter by human herpesvirus -6.//J. Virol.-1996-Vol. 70-P. 1784-1791

60. Foa-Tomasi L., Guerrini S., Huang T.et all Characterization of human herpesvirus 6 (U 1102) and (GS) gp 112 and identification of the Z-29 specified homolog.// Viijlogy-19920Vol.l91-P.511-516

61. Frenkel N., Shimer E.C., Wyatt L.S. et al. Isolation of a new herpesvirus6 from CD4+ T-cells// Proc. Nat!. Acad. Sci.USA.-1990-Vol. 87-P.748-752

62. Fu-Zhang Wang. Human herpesvirurus 6 infection after allogenic stem cell transplantation. Stockolm-1999-68 P.

63. Gompels U.A.,Carrigan D.,Carss A.L.et all.Two groups of human herpesvirus 6 identified by sequence analyses of laboratory strainsand variations from Hodgkins lymphoma and bone marrow transplant patients.//J.Gen. Virol.-l993.Vol.74.-P.613-622.

64. Gompels U.A.,Nicholas J.,Lawrence G.et al.The DNA sequence of hu man herpesvirus 6:structure,coding content,and genome evolution //Virology. 1995. Vol.209.-P.29-51.

65. Hasegawa H., Utsunomiya Y., Yasakawa Y. et al. Induction of G-protein-coupled peptide receptor EBV 1 by HHV-6, HHV-7 in CD+ T-cells.// J.Virol.-1994-Vol.68-P.5326-5329

66. Higashi K., Asada H., Kurata T.et al Presens of antibody to human herpesvirus 6 in monkeys.// J.Gen.Virol.-1989-Vol.70-P.3171-3176

67. Horvat R.T.,Wood C.,Balachandran N.et all.Transactivation of Human Immunodeficiency Virus promoter by human herpesvirus 6.//J. Virol. -1989. Vol.63.-P.970-973.

68. Josephs S.F.,Salahuddin S.Z.,Ablashi D. V.et all.Genomic analyses of the Human B-lymphotropic Virus(HBLV).//Science.-1986.-Vol.234.-P.601-603.

69. Josephs S.F.,Ablashi D.V.,Salahuddin S.Z.et all.Molecular studies of HHV-6.//J.Virol.Meth.-1988.-Vol.21.-P.179-190.

70. Kazuo Y, Shizuko H., Fumihiko B. et al. // J.Infect.Dis.-1990-Vol.l61-P. 153-154

71. Kikuta H., Itami N., Matsumoto S et al. Frequency human herpesvirus 6 DNA in peripheral blood mononuclear cells with kidney transplant patients // J.Infect. Dis.-1991-Vol. 163 P.925-927

72. Kirchesch H., Mertens Т., Burkhardt U.et all -Seroconversion against human herpesvirus-6 (and other herpesviruses) and clinical illness. // Lancet -1988-Vol. 8-P.273-274.

73. Knox K.K., Pietiyga D., Harrington D.J.et all Progressive immunodeficiency and fatal pneumonitis associated with human herpesvirus 6 infection in an infant.// Clin.Infect.Dis.-1995-Vol,20-P.406-413

74. Knowles W.A., Gardner S.D. et al. High prevalence of antibody to human herpesvirus 6 and seroconversion associated with rash two infants. // Lancet-1988-Vol.2-P.912-913.

75. Komaroff A.L.Chronic fatigue syndromes:relationship to chronic viral infections.//J.Virol.Meth.-1988.-Vol.21-P.3-10.

76. Kondo K., Hayakawa Y., Mori H., Sato S. et al. Detection by polymerase chain reaction amplification of human herpesvirus 6 DNA in periferal blood of patients with exanthem subitum. // J/Clinic.Microbiol.-1990-Vol. 28-P. 970-974

77. Kondo K.,Kondo T.,Okuno T.et alLLatent human herpesvirus 6 infection of human monocytes/macrophages.//J.Gen.Virol.-1991.-Vol.72.-P. 1401-1408.

78. Krueger G.R.F.,Koch В.,Ramon A.et all.Antibody prevalence to HBLV (human herpesvirus 6,HHV-6) and suggestive pathogenicity in the general population and in patients with immune deficiency syndromes.//! ViroLMeth. 1988.-Vol.21.-P.125-131.

79. Kuzuhara K.,Ueda K.,Miyazaki C.et all.Attack rate of exanthema subitum in Japan.Lancet.-1992.-Vol.340.-P.482-484.

80. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bakteriophage T4.// Nature.- 1970.-Vol.227.-P.680-684.

81. Lawrens G.L., Chee M., Craxton M.A.et all Human herpesvirus 6 is closely related to human citomegalovirus.//J.Virol-1990-Vol.64-N 1-P.287-299

82. Levin P.H.,Neequaye J.,Yadav.et al.Geographic/ethnic differeces in human l^esvirus 6 antibody patterns.//Microbiol.lmmunol. -1992.-Vol.36.-P.169-172.

83. Levy J. A., Ferro F., Greenspain D.et all Frequent isolation of HHV-6 from saliva and high seroprevalence of the virus in the population.// Lancet-1990-Vol.335-P.1047-1050.

84. Levy J.A., Ferro F., Lennette E.T.et all Characterization of a new strain of HHV-6 (HHV-6 SF) recovered from the saliva an HIV-infected individual.//Virology-l 990-Vol. 178-P. 113-121.

85. Levy J., Landay A., Lennette E.T. HHV-6 inhibits HIV- type 1 replication in cell culture.// J. Clinical. Microbiol.- 1990-Vol. 28 -P.2362-2364

86. Linde A.,Dahl H.,Wahren B.et all- lg G antibodies to human herpesvirus 6 in children and adults both in primary Epstein-Barr virus and cytomegalovirus infections.J.Virol.Meth.-1988.-Vol.21 .-P.l 17-123.

87. Lindquester G.L., Pellett P.E. -Properties of the human herpesvirus 6 strain Z 29 genome: G+C content, length, and presens of variable length directly repeated terminal sequence elements//Virology-1991-Vol. 182-P.102-110.

88. Lopez C.,Pellett P.,Stewart J.et aLCharacteristic of human herpesvirus 6.//J.Infect.Dis.-1988.-Vol.l 57.-P. 1271 -1273.

89. Luka J.,Pirruccello D.J.,Kersey J.H.et al.HHV-6 genome in T-cell acute lymphoblastic leukaemia.//Lancet.l991.-Vol.338.-P.1277-1278.

90. Lusso P.,Markham P.D.Tschachler E.et al.In vitro cellular tropizm of human B-lymphotropic virus (human herpesvirus 6).//J.Exp.Med.-1988.- Vol. 167 .-P. 1659-1670.

91. Lusso P.,Ensoli В., Markham P.D. et al- Productive dual infection of human CD4+ T lymphocytes by HIV-1 and HHV-6. // Nature-1989-Vol.337-P.370-373

92. Malin Enbom, Pathogenesis of recently identified human herpesviruses 6 and 8 . Karolinska Institute, Solna, Sweden-2000-83 P.

93. Matis J., Lesso J., Mucha V. et al. Очистка и выделение частиц вируса герпеса простого, имеющих наружную оболочку и лишенных ee.//Acta.Virol.-PyccKoe издание-1975-Vol. 19-Р.273-280

94. McCullers J.A., Lakwman F.D., Whitley R.J. Human herpesvirus 6 is associated with focal encephalitis.// Clin.Inf.Dis-1995-Vol.21-P.571- 576

95. Michl J., Revacova D. Cultivation of mammalian cells in medium with growth-promoting proteines from calf serum.// Acta Virol.- 1966, Vol.10, P.254-259

96. Okuno Т., Sao H., Asada H.et all. Analysis of glycoprotein ofhuman herpesvirus 6 (HHV 6) using monoclonal antibodies //Virology-1990-Vol. 176-P.625-628

97. Okuno T.,Mukai T.,Baba K.et al.Outbreak of exanthema subitum in an orphanage.//J.Pediatr.-1991.-Vol.119.-P.759-761.

98. Patnai K.M., Komaroff A.L., Conley E.et al.-Prevalence of IgM antibodies to human herpesvirus 6 early antigen (p 41/38) patients with chronic fatigue syndrome.//J.Infect.Dis -1995-Vol.l72-P.1364-1367

99. Pietroboni G.R., Harnett G.B., Bucens M.R. et al. Antibody to human herpesvirus 6 in saliva. // lancet-1988-P. 1059.

100. Pietroboni G.R., Harnett G.B., Bucens M.R/ et al. Centrifucal enhancement of human immunodeficiency virus (HIV) and human herpesvirus 6 (HHV-6) infection in vitro.// J.Virol.Meth.-1989-Vol.24-P.85-90

101. Pitalia A.K., Liu-Yin J., Freemont A.J. et al.- Immunohistological detection of human herpesvirus 6 in formalin-fixed, paraffin-embedded lung tissues7// J.Med.Virol.-1993-Vol.41-P.103-107

102. Portolani M., Cermelli C., Moroni A. et al. Human herprsvirus 6 infection in infants admitted to hospital.// J.Med. Virol. 1993.Vol.39-P. 146-151

103. Rajcani J.,Yanagihara R.High serum antibody titers to human herpesvirus 6 in melanesian population.//ActaVirol.-1994.-Vol.38.-P.121-123.

104. Rodier G/. Fox E., Constantine N.T.et all-HHV-6 in Djibouti an epidemiological survey in young adults.// Transaction of the Royal Society of Tropical Med. Hygiene-1990-Vol.84-P.148-150

105. Roffman E., Albert J.P., Goff J.P.et al. Putative site for the acquisition of human herpesvirus 6 virion tegument.// J.Virol.-1990-Vol.64-P.6308-6313

106. Roizman В., Herpesviridae. In Fields Virology, Fields E., Knipe D., Howley P., (eds) 1996 pp. 222l-2230.Lippincott-Raven Publishers: Philadelphia.

107. Russler S.K.,Tapper M.A.,Carrigan D.R. et all-.Susceptibility of human herpesvirus 6 by acyclovir and guncyclovir.//Lancet.-1989.-Vol.8659.-P.382.

108. Salahuddin S.Z.,Ablashi D.V.,Markham P.D.et al. Izolation of a new virus,HBLV,in patients with lymphoproliferative disorders.//Science.-1986.-Vol.234.-P.596-601.

109. Saxinger C.,Polesky H.,Eby N.et al.Antibody reactivity with HBLV (HHV-6)in U.S.populations.//J. Virol.Meth.-l 988.-Vol.21 .-P. 199-208.

110. Shiraki K.,Okuno T.,Yamanishi K.et al.Phosphonoacetic acid inhibits replication of human heipesviras6.//Antiviral.Res.-1989.-Vol.l2.-P.311-318.

111. Streicher H.Z.,Hung C.L.,Ablashi D.V.et al.In vitro inhibition of human herpesvirus 6 by phosphonoformate.//J.Virol.Meth.-1988.-Vol.21.-P.301-304.

112. Suga S.,Yoshikawa T.,Asano Y. et al. Neutralizing antibody assay for human herpesvirus 6.//J.med.Virol.-1990.-Vol.30.-P.14-19.

113. Takahachi K., Sonoda S., Higachi K. et al. Predominant CD 4 T-lymphocyte tropism of human herpesvirus 6-related virus. // J. Virol.-1989-Vol.63-P.3161-3163

114. Takasaki Т., Ohkawa N., Sano К et al.-Elektronmicroscopic study of human herpesvirus 6-infected human T cell lines superinfected with human immunodeficirncy virus type 1.// Acta Virol.-1997-Vol.410P.221-229.

115. Tedder R.S., Briggs M., Cameron C.H. et al. A novel lymphotropic herpesvirus. //Lancet.-1987.-Vol.2-P.390-392.

116. Torelli G.,Marasca R.,Luppi M.et al.Hyman herpesvirus 6 in human lymphomas.identification of specific sequences in Hodgkin s lymphomas by polymerase chain reaction.//Blood.-1991 .-Vol.77.- P.89-99.

117. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and someapplications.// Proc.Natl.Acad.Sci.USA-1979.-Vol.76 -P.4350- 4354.

118. Ueda K^usuhara K.,Hirose M.et al.Exanthema subitum and antibody to human herpesvirus 6.//J.Infect.Dis.l989.-Vol.l59.-P.750-752.

119. Ward K.N.,Gray J.J.,Efstathiou S.et al.Primary human herpesvirus 6 infection in a patient following liver transplantation from a seropositive donor.//J.Med.Virol.-1989.-Vol.28.-P.69-72.

120. Ward K.N., Gray J.J., Fotherigham M.W. et al. IgG antibodies to human herpesvirus 6 in young children: changes in avidity of antibody correlate with time after infection.// J.Med.Virol.-1993-Vol.39-P.131-138

121. Williams M.V., Ablashi D.V., Salahuddine S.Z. et al.-Demonstration of the human herpesvirus 6-induced DNA polymerase and DNase. // Virology 1989-Vol. 173-P.223-230

122. Wrzos H., Gibbons J., Abt P.L. et al. Human herpesvirus 6 in monocytes of transplant patients.//Lancet-1990-Vol.335-P.486-487

123. Yalcin S., Mukai Т., Ami Y. et al. Experimental infection of cynomolgus and African green monkeys with human herpesvirus 6.// J.Gen.Virol.-1992.Vol. 73-P. 1673-1677

124. Yamamoto M., Black J.B., Stewart J.A.et al. Identification of a nucleocapsid protein as a specific serological marker of human herpesvirus 6 infection.// J.Clin.Microbiol.-1990-Vol.28-P. 1957-1962

125. Yamanishi K.,Okuno T.,Shiraki K.et al.Identification of human herpesvirus 6 as a causal agent for exanthem subitum.//Lancet.-1988. Vol. 1 .-P. 1065-1067.

126. Yamanishi K.,Kondo T.,Kondo K.,Hayakawa Y.,Exanthema subitum and Human Herpesvirus 6 (HHV-6) infection.//Immunobiology and Prophylaxis of Human Herpesvirus Infections, Eds. C. Lopez .et al.- New Yoric,1990.-P.29-37.

127. Yanagi K.JHarada S.,Ban F.et al.High prevalence of antibody to HHV-6 and decrease in titer with increase in age in Japan.//J. Infect.Dis.1990. Vol. 161.-P. 153-154.

128. Yasukawa M.,Yakushijin Y.,Furukawa M.et al.Specificity analysis of human CD4+ T-cell clones direct against hyman herpesvirus 6 (HHV-6),HHV-7,and human cytomegalovirus.//! Virol.-l993.-Vol.67.-P.6259-6264.

129. Yoshida Т., Yoshiyama H., Suzuki E. et al. Seroreactivity to HHV 6 polyprptides in infants with exanthema subitum and their mothers.// Eur. J. Pediatr.-1990-Vol.149-P.450

130. Yoshikawa T.,Suga S.,Asano Y.et al.Human herpesvirus 6 infection in bone marrow transplantation.//Blood.-1991.-Vol.78.-P.1381-1384.

131. Считаю свои долгом выразить благодарность научному руководителю доктору медицинских наук, профессору НДЛьвову за методическое руководство и помощь в работе.

132. Особую благодарность выражаю сотрудникам лаборатории коллекционных штаммов вирусов А.А.Никитиной, Э.В.Халецкой, А.И.Ванаг, Л.В.Паниной, О.В.Листопадовой за помощь в выполнении работы.