Молекулярно-генетическая идентификация и дифференциация герпесвирусов человека

Круглова, Анна Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическая идентификация и дифференциация герпесвирусов человека
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая идентификация и дифференциация герпесвирусов человека"

На правах рукописи

КРУГЛОВА АННА ИГОРЕВНА

Молекулярно-генетическая идентификация и дифференциация герпесвирусов человека

03.00.03-молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН.

Научный руководитель:

Кандидат медицинских наук Демкин Владимир Витальевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Гараев Мансур Мухамедович

Кандидат биологических наук Сломинский Петр Андреевич

Ведущее научное учреждение:

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалея.

Защита диссертации состоится « » октября 2004 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.020.01 при НИИ вирусологии им Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д.16. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан сентября 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного

совета, доктор медицинских наук Косякова Наталья Павловна.

гоо$~ч що{

Актуальность исследования.

В своей практической деятельности врачи многих специальностей встречаются с заболеваниями, вызванными вирусами группы герпеса. В настоящее время известно 8 видов герпесвирусов человека. У человека герпесвирусы вызывают такие заболевания как оральный и генитальный герпес, ветряную оспу и опоясывающий лишай, цитомегалию, лимфому Беркита и инфекционный мононуклеоз. В последнее время с герпесвирусами связывают атеросклероз и ИБС, ревматоидный артрит и рассеянный склероз (Cermelli С, 2003, Chapenko S., 2003). По данным ВОЗ около 90% населения земного шара инфицировано одним или несколькими герпесвирусами. Первичное инфицирование, как правило, происходит в детском возрасте, после чего герпесвирус переходит в латентное состояние. Реактивация герпесвирусов из латентной формы происходит на фоне стрессов, эндокринных нарушений, у больных с первичными и вторичными иммунодефицитами, а также проходящих иммуносупрессорную терапию (например, после трансплантации органов). Существует ряд методов диагностики герпетической инфекции (выявление антигенов при помощи иммуноферментного анализа, серологическая диагностика или изоляция вируса в культуре клеток), но в последние годы все большее внимание уделяется молекулярно-генетическим способам диагностики, в особенности полимеразной цепной реакции (ПЦР). Большинство ПЦР-методов детекции направлены на выявлении только одного вида герпесвируса (Kimura H., 1991, Telenti, A., 1993, Клинчева С.А., 1994, Booran N.K., 1995). Однако, при моноспецифическом способе диагностики велика вероятность пропуска одного или нескольких видов герпесвирусов и постановке ошибочного диагноза при отсутствующей или нетипичной клинической симпоматике. Широкий спектр клинических проявлений, возникновение сочетанных герпесвирусных инфекций, увеличение частоты появления штаммов с нетипичными клиническими проявлениями заставляет пересматривать традиционные способы диагностики и искать новые подходы. В связи с этим разработка новых методов комплексной детекции и дифференциации герпесвирусов, основанных на современных знаниях генетического видового разнообразия герпесвирусов является актуальной задачей фундаментальной и практической вирусологии.

//т

Цель и задачи исследования.

Целью работы явилась разработка молекулярно-генетических подходов для комплексной детекции и дифференциации герпесвирусов человека, позволяющих решать широкий круг научно-практических задач медицинской вирусологии.

Для достижения поставленной цели был определен ряд задач:

1. Проведение компьютерного анализа современных баз данных нуклеотидных последовательностей геномов герпесвирусов для выбора наиболее консервативной генетической области.

2. Подбор праймеров и конструирование диагностических системы для комплексной детекции вирусов герпеса человека, основанных на методе ПЦР.

3. Подбор методов межвидовой генетической дифференциации герпесвирусов, основанных на своеобразии нуклеотидных последовательностей выбраной генетической области.

4. Изучение генетической стабильности выбранной мишени в природной популяции герпесвирусов.

5. Клонирование амплифицируемой генетической области всех герпесвирусов и создание банка контрольных матриц.

6. Оределение специфичности и чувствительности разработанных диагностических систем.

7. Изучение роли комплексного выявления герпесвирусов при урогенитальной патологии.

8. Определение частоты встречаемости герпесвирусов у доноров аллотрансплантанта почки. Изучение особенностей течения раннего посттрансплантационного периода у реципиентов, получивших органы от инфицированных доноров.

Научная новизна работы.

Разработан оригинальный молекулярно-генетический метод комплексной детекции и дифференциации пяти видов герпесвирусов человека: ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ и ВГЧ-8, основанный на амплификации фрагмента гена ДНК-полимеразы и последующем анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Разработан молекулярно-генетический метод одновременной детекции и дифференциации ВГЧ-6 и ВГЧ-7, основанный на мультиплексной амплификации фрагмента гена ДНК-полимеразы. Показана популяционная

генетическая стабильность маркерного фрагмента гена ДНК-полимеразы пяти видов герпесвирусов. Показана целесообразность комплексной диагностики герпесвирусов на клиническом материале урологического и гинекологического профиля и в трансплантологии.

Основные положения, выносимые на защиту-

1. Данные по изучению генетического полиморфизма гена ДНК-полимеразы герпесвирусов человека.

2. Разработка молекулярно-генетического метода комплексной детекции и дифференциации пяти видов герпесвирусов человека: ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ и ВГЧ-8.

3. Разработка молекулярно-генетического метода одновременной детекции и дифференциации ВГЧ-6 и ВГЧ-7.

4. Целесообразность проведения комплексного обследования на герпесвирусы человека в гинекологии и трансплантологии.

Практическая значимость работы.

На основе разработанных методов сконструированы диагностические системы «Пентагерп» и «Герп 67», которые позволяют в короткое время и с экономией материальных затрат проводить комплексную детекцию и межвидовую дифференциацию герпесвирусов человека в различных областях практической медицины. Документация на тест-систему, являющейся одним из вариантов системы «Пентагерп», прошла экспертизу в ФГУ Научного центра экспертизы средств медицинского применения МЗ РФ и направлена для дальнейшей экспертизы в ГИСК им. Тарасевича ПА (№ 31Р/1586-03 от 11.12.2003). Внедрение.

Получено авторское свидетельство № 2192473 от 10.11.2002 «Способ диагностики герпесвирусных инфекций».

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы были представлены на 3-й и 4-ой Всероссийских научно-практических конференциях «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2000, 2002), на 2-м Российском конгрессе по патофизиологии «Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы» (Москва, 2000), на Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Милан, 2002), на отчетной конференции Института молекулярной генетики РАН (Москва, 2003),

на конкурсе работ молодых специалистов на стипендию фонда «Будущее Молекулярной Генетики» (Москва, 2003), на Ежегодных конференциях НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН «Герпесвирусные инфекции» (Москва, 2003,2004).

По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Апробация диссертационной работы состоялась на заседания Ученого совета Института молекулярной генетики РАН, протокол № 8 от 24 мая 2004 г.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Диссертация изложена на 87 страницах, иллюстрирована 13 таблицами и 14 рисунками. Список литературы включает 93 источника (23 отечественных и 70 зарубежных).

Содержание диссертационной работы. Материалы и методы.

Штаммы вирусов.

В качестве контрольных препаратов вирусной ДНК использовали суммарную ДНК культур клеток Vero, инфицированных штаммами: УС1, Л2, ЕС, Kleiman (ВПГ-1), G и ВН (ВПГ-2), АД-169 (ЦМВ), а также лимфобластоидную перевиваемая клеточную линию P3HR1 (ВЭБ), и клеточную линию BCBL (ВГЧ-8). Препараты культур клеток получены из коллекции ГЦНИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и НИИ Канцерогенеза им. Блохина РАМН. Кроме того, использовали коммерческий препарат геномной ДНК ВГЧ-6 (НИИ эпидемиологии МЗ РФ).

Клонирование фрагментов ДНК герпесвирусов для получения контрольных препаратов.

В экспериментах по отработке аналитической чувствительности в качестве контрольной ДНК использовали клонированные фрагменты вирусной ДНК. Клонирование вирусных фрагментов проводили следующим образом. Ампликоны герпесвирусов ВПГ-1, ВПГ-2, ВЭБ, ЦМВ, ВГЧ-8 размером 800 п.н., полученные с праймерами HV1 и HV3 (см. раздел "Результаты исследований"), очищали от компонентов реакционной смеси с помощью набора Wizard™ PCR preps DNA Purification (Promega, США). Очищенные ампликоны клонировали в векторе pGEM-T (Promega, США). Полученные рекомбинантные плазмиды анализированы методом ПЦР, в результате чего были отобраны плазмиды, дающие положительный сигнал с праймерами HV1 и

HV3. Последующий отбор плазмид проводили на основе рестрикционного анализа клонированных фрагментов, при котором использовали рестриктазы Ncol, Smal для ВПГ-1 и ВПГ-2; Pstl, Smal и Ват HI для ВЭБ; Rsal и Pael для ЦМВ; Ndel и Bglllдля ВГЧ-8. Для определения чувствительности готовили 10-кратные разведения растворов плазмидных ДНК с исходной концентрацией 1 мкг/мкл. При постановке ПЦР положительный сигнал получали при разведении плазмидной ДНК в 1012 раз для ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ и в 1011 раз для ВГЧ-8.

Аналогичным образом было проведено клонирование фрагментов ДНК ВГЧ-6 и ВГЧ-7 размером 723 п.н. с праймерами П67-1 и П67-2. Для анализа рекомбинантных плазмид использовали рестриктазы Rsal, Hindlll, Xhol. Для определения чувствительности готовили 10-кратные разведения плазмидных ДНК с исходной концентрацией 1 мкг/мкл. При постановке ПЦР положительный сигнал получали при разведении плазмидной ДНК в 1012 раз для обоих вирусов.

Клинические образцы (мазки из цервикального канала и уретры) были получены из различных медицинских учреждений г. Москвы. Материалом для исследования у доноров органов служили лимфоциты селезенки. Материал предоставлен лабораторией трансплантационной иммунологии НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ. Цельная кровь от пациентов с диагнозом рассеянный склероз и инфекционный миокардит была получена из МОНИКИ. Образцы биопсии лимфомы Ходжкина получены из лаборатории молекулярной генетики ретровирусов и СПИДа Института молекулярной генетики РАН.

Выделение ДНК из инфицированных клеточных культур. Клетки промывали в lxPBS (20мМ фосфатный буфер с 0,15 М NaCl, pH 7.5). К осадку добавляли 200 мкл лизирующего буфера (10 мМ Трис-HCl рН 8.0; 0,5% Tween-20) и 100 мкг/мл протеиназы К (Sigma, USA) и инкубировали при 56°С в течение часа. Протеиназу инактивировали нагреванием при 95° С в течение 10 минут. Затем смесь центрифугировали 5 минут при 10000 об/мин и 3 мкл супернатанта анализировали в ПЦР.

Выделение ДНКизурогенитального и биопсийного материала. Соскобный материал из влагалища и уретры и биопсийный материал промывали в lxPBS. К осадку добавляли 200 мкл лизирующего буфера и обрабатывали как описано выше. В реакцию ПЦР брали 3 мкл супернатанта. ВыделениеДНКиз цельной крови.

Цельную кровь, взятую с 6 мМ ЕДТА в качестве антикоагулянта, центрифугировали в градиенте Histopaque-119 (Sigma, USA). Затем собирали лейкоцитарную фракцию и дважды промывали лейкоциты в lxPBS. К осадку лейкоцитов добавляли 100 мкл лизирующего буфера и инкубировали как описано выше. 3 мкл супернатанта анализировали в ПЦР. Выделение ДНКметодом экстракции ДНК сорбентом.

Выделение ДНК из урогенитального материала проводили согласно методике «ДНК-сорб-А» (АмплиСенс, НИИ эпидемиологии МЗ РФ) Подбор праймеров.

При сравнении нуклеотидных последовательностей геномов пяти герпесвирусов ВПГ-1(Х14112), Bnr-2(Z86099), ЦМВ(Х17403), ВЭБ(У01555) и ВГЧ-8(и93872) в программе MACAW 2.0.5 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA) были идентифицированы три консервативные области в гене ДНК-полимеразы. К каждой области подобраны праймеры HV1, HV2 и HV3, которые обеспечивали специфическую амплификацию ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ и ВГЧ-8.

При анализе геномов ВГЧ-6А (Х83413), ВГЧ-6В (AF157706) и ВГЧ-7 (U43400) в программе MACAW 2.0.5 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA) были подобраны праймеры П 67-1, П 67-2, П6, П7 в гене ДНК-полимеразы для мультиплексной амплификации. ПЦР в системе «Пентагерп».

Реакционная смесь объемом 30 мкл включала 10 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 50 мМ КС1, 0,5% Tween-20, 5% формамида, 200 мкМ каждого dNTP, 2 мМ MgCl2)

1 пкмоль праймеров HV1 и HV3 для 1 этапа и 2 пкмоль праймеров HV1 и HV2 для 2 этапа, 1 U Taq полимеразы и 3 мкл тестируемого образца.

ПЦР проводили в два этапа на амлификаторе ТЕРЦИК (Россия). Режимы амплификации на первом и втором этапах были одинаковыми — 1 цикл состоял из 4 мин при 95°С; затем 30 циклов состоящих из 30 сек при 60°С, 1 мин при 72°С и 40 сек при 95°С; 1 цикл 4 мин при 72°С. После первого этапа амплификации 1 мкл амплификата переносили в новую реакционную смесь и повторяли амплификацию. На первом этапе реакционная смесь содержала праймеры HV1 и HV3, а на втором этапе - праймеры HV1 и HV2. ПЦРв системе«Герп 67».

ПЦР - смесь объемом 30 мкл включала 10 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 50 мМ КС1, 0,5% Tween-20, 5% формамида, 200 мкМ каждого dNTP, 2 мМ MgCl2 1 пкмоль праймеров П67-1 и П67-2 для 1 этапа и 1 пкмоль праймеров П6, П7 и П67-2 для

2 этапа, 1 U Taq полимеразы и 3 мкл тестируемого образца.

ПЦР проводили в два этапа на амлификаторе ТЕРЩИК (Россия). Режимы амплификации на первом и втором этапах были одинаковыми - 1 цикл состоял из 4 мин при 95°С; затем 30 циклов состоящих из 30 сек при 55°С, 1 мин при 72°С и 40 сек при 95 °С; 1 цикл 4 мин при 72°С. После первого этапа амплификации 1 мкл амплификата переносили в новую реакционную смесь и повторяли амплификацию.

Для избежания ложноположительных результатов каждый образец исследовали в трех независимых экспериментах. ПЦР с праймерами к гену -глобину.

Данную реакцию проводили для исключения наличия ингибиторов ПЦР в исследуемых клинических образцах. ПЦР проводили на амплификаторе ТЕРЦИК (Россия) в один этап в режиме 1 цикл 4 мин при 95°С; затем 30 циклов состоящих из 30 сек при 55°С, 1 мин при 72°С и 40 сек при 95°С; 1 цикл 4 мин при 72°С. Состав реакционной смеси см. выше. Праймеры использовали в концентрации 5 пкмоль/мкл. Образование ампликонов в данной реакции подтверждало отсутствие ингибиторов в исследуемом образце. По окончании амплификации продукты реакции анализировали электрофоретически в 1,5% агарозном геле с этидием бромидом. В качестве маркера молекулярной массы ДНК использовали плазмиду pUC 19, обработанную эндонуклеазой Msp I. Размеры фрагментов: 501 / 489, 404, 331, 242, 190,147, 111/110, 67,34,26 п.н. Рестрикционный анализ.

Каждая ПЦР-позитивная реакционная смесь подверглась рестрикционному анализу с ферментами Taql и Hinfl (Fermentas, Литва). Общий объем смеси для рестрикции составлял 20 мкл, из которых 8 мкл ПЦР-смесь, 2 мкл соответствующего рестрикционного буфера и 1-2 U фермента. Реакционную смесь инкубировали 2 часа при 37°С (Hinfl) или при 65°С (Taql). Образцы после рестрикции анализировали посредством электрофореза в 1,5% агарозном геле.

Секвенирование.

Секвенирование проводили с использованием набора ThermoSequenase Cy5 Dye Termination Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech Ltd). Разделение фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ALFexpresslI фирмы Amersham BioSciences (USA).

Статистическая обработка данных.

Для описания данных использовали методы описательной статистики. Для

ч 2

сравнения качественных признаков применяли критерий х и двухуровневый критерий Фишера (при количестве наблюдений <5). Уровень статистической значимости различий был принят равным 0,05. Статистический анализ данных проводили с помощью пакета программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., USA).

Результаты собственных исследований. Конструирование диагностических систем для комплексной детекции герпесвирусов человека.

Выбор генетической мишени для комплексной детекции герпесвирусов. Несмотря на схожесть морфологических и биологических свойств, филогенетические взаимоотношения между различными видами герпесвирусов имеют достаточно сложную структуру (Karlm S. 1994, Alba M. 2001). Вариабельность геномов среди представителей разных подсемейств составляет от 54 до 65%, а внутри подсемейств от 14 до 46%. Наиболее консервативной и изученной областью генома герпесвирусов является область генома, кодирующая основной фермент репликации герпесвирусов - ДНК-полимеразу. Кроме того, ген ДНК-полимеразы отвечал ряду требований, которые были определены для выбора оптимальной генетической мишени:

- высокая степень консервативности гена среди представителей разных подсемейств;

- наличие достаточного количества нуклеотидных сиквенсов в базе данных GenBank выбранного гена у разных видов герпесвирусов человека для определения степени внутривидовой вариабельности;

- наличие в составе нуклеотидных последовательностей выбранного гена минимум двух высококонсервативных участков для всех представителей герпесвирусов человека.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена ДНК-полимеразы разных видов герпесвирусов был проведен в программе Macaw 2.0. Распределение гомологичных и негомологичных участков между различными герпесвирусами схематически показано на рисунке 1.

Этот анализ позволил разбить 8 видов герпесвирусов на две группы. В одну группу вошли 5 видов герпесвирусов: ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ, и ВГЧ-8, в другую - 2 вида: ВГЧ-6 и ВГЧ-7. Нуклеотидная последовательность гена ДНК-полимеразы вируса Варицелла-Зостер настолько сильно отличалась от

аналогичных последовательностей других видов герпесвирусов, что не вошла ни в одну из групп. Такое распределение предопределило дальнейшую тактику по разработке методов комплексной детекции герпесвирусов.

Рисунок 1. Сравнение нуклеотидных последовательностей гена ДНК-полимеразы восьми видов герпесвирусов в программе Macaw 2.0.

В примере, показанном на рисунке 1, в качестве последовательности сравнения выбрана последовательность ДНК-полимеразы ВПГ-1. Более широкие участки показывают наличие гомологии в соответствии с установленным критерием. Затемненные участки показывают совпадение нуклеотидных последовательностей.

Конструирование ПЦР-системы для комплексной детекции вируса простого герпеса 1 и 2 типа (ВПГ-1 и 2), цитомегаловируса (ЦМВ), вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) и вируса герпеса человека 8типа (ВГЧ8).

В результате компьютерного анализа гена ДНК-полимеразы было обнаружено три (1-П1) консервативных участка для пяти видов герпесвирусов -ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ, и ВГЧ-8. Эти участки имели протяженность от 20 до 27 п.н. и входили в состав фрагмента размером 800 п.н. (рисунок 2). К

каждому консервативному участку были подобраны праймеры - ИУ1, ИУ2 и ИУ3, соответственно.

Рисунок 2. Структура и расположение амплифицируемых фрагментов гена ДНК-полимеразы и локализация праймеров.

Проверку работоспособности праймеров проводили на контрольном материале в реакциях амплификации с градиентом температур отжига (50°-70°С) и количестве циклов амплификации от 30 до 45. При заданных параметрах в экспериментах с контрольными матрицами вирусов ВПГ-1, ВПГ-2 ВЭБ, ЦМВ, ВГЧ-8 с праймерами НУ1+НУ2 и НУ1+НУ3 получить видимую наработку специфичных ампликонов удалось только при условиях: Тотж=60°С, количество циклов амплификации - 45, концентрация матрицы - 105 копий в мл. При этом чувствительность реакции не позволяла определять ДНК в клиническом материале. Увеличение концентрации праймеров до 6 пкмоль/мкл, ионов магния - до 5 мМ и полимеразы до 2 ед. не позволило повысить чувствительность и специфичность реакции. Вместе с тем, при использовании в качестве матрицы амплификата, полученного после реакции с праймерами НУ1+НУ3, но не содержащего видимых количеств ампликонов, в последующей реакции с праймерами НУ1+НУ2 были получены хорошо выраженные ампликоны расчетного размера с вирусной ДНК всех пяти видов герпесвирусов. Размеры ампликонов для каждого вида герпесвируса после второго этапа соответствовали расчетным: ВПГ-1 - 531, ВПГ-2 - 531, ВЭБ - 531, ЦМВ-603, ВГЧ-8-517 п.н. (рис.3).

Таким образом, проведение амплификации в формате нестед-ПЦР, когда на первом этапе используются праймеры НУ1+НУ3, а на втором этапе -

праймеры НУ1+ИУ2, обеспечивало выявление ДНК 5 видов герпесвирусов: ВПГ-1, ВПГ-2, ВЭБ, ЦМВ, ВГЧ-8.

Рисунок 3. Амплификация 5-ти видов герпесвирусов в реакции нестед-ПЦР с праймерами НУ1+НУ2 (на первом этапе) и НУ1+НУ3 (на втором этапе). 1 2 3 4 5 М

М - маркер молекулярной массы риС19/М:зр1 1 - ВПГ-1,2 - ВПГ-2, 3 - ЦМВ, 4 - ВЭБ, 5 - ВГЧ-8

Для определения специфичности работы праймеров были поставлены реакции с препаратами вирусной ДНК, полученными из культуральной жидкости клеток, зараженных штаммами ЦМВ - АБ169, ВПГ-1 - Ы, ВПГ-2 -ВН, а также из клеточных линий Р3НЯ1 и БСБЬ, инфицированных ВЭБ и ВГЧ-8, соответственно. В качестве неспецифических образцов использовали ДНК вируса герпеса человека 6, ДНК неинфицированных культур клеток, и биологический материал (кровь, лимфоциты, урогенитальные мазки, моча, слюна), полученный от здоровых людей, либо от пациентов с установленным диагнозом невирусной этиологии (хламидиозы, микоплазмозы, туберкулез, и др.). При анализе образцов, образование ампликонов было получено только со специфическими матрицами; образцы, не содержащие специфическую вирусную ДНК, образование ампликонов не давали.

Таким образом, подобранные праймеры и условия амплификации обеспечивали эффективное и специфичное взаимодействие с ДНК любого из пяти видов герпесвирусов - ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ, и ВГЧ-8.

531 п.н. 603 п.н, 517 п.н.

Анализрестрикционногополиморфизма амплифицируемогоуниверсального фрагмента гена ДНК-полимер азы вирусов ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБи ВГЧ-8.

Размеры ампликонов, получающихся в результате двухэтапной амплификации маркерного фрагмента гена ДНК-полимеразы, для всех герпесвирусов были очень близкими или одинаковыми, что не позволяло установить видовую принадлежность обнаруженного герпесвируса. Поэтому для идентификации индивидуальных видов требовалась дополнительная аналитическая процедура.

Анализ нуклеотидной последовательности амплифицирущегося фрагмента показал, что фрагмент обладает достаточно выраженной межвидовой вариабельностью, что позволило сделать предположение о возможности дифференциации видов герпесвирусов с помощью рестрикционного анализа (ПДРФ). Выбор рестриктаз для анализа диктовался не только вопросами дифференциации, но и возможностью проведения реакции рестрикции непосредственно в ГЩР-буфере. Учитывая оба вышеназванных фактора, для рестрикционного анализа были отобраны эндонуклеазы Taql, Rsaln Шп^. Эти рестриктазы давали небольшое число фрагментов, которые должны были легко идентифицироваться при электрофоретическом анализе (таблица 1).

Рестрикционный анализ ампликонов, полученных с контрольными материалами (рисунок 4), принес ожидаемые результаты: рестриционные профили полностью соответствовали расчетным данным. Результаты рестрикционного анализа ампликонов показывают, что рестриктаза Taql позволяет получить наиболее наглядные различия в рестрикционных профилях анализируемых ампликонов и может быть использована для быстрого типирования. Рестрикционный анализ с эндонуклеазами Rsal и Нтй также дает специфические для каждого вида наборы рестрикционных фрагментов, но различия в их величинах в некоторых случаях плохо выражены, что затрудняет их идентификацию. Тем не менее, Rsal- и ИшА-профили могут быть использованы в качестве дополнительных инструментов для уточнения или подтверждения результатов типирования.

Таблица 1. Расчетные величины рестрикционных фрагментов амплифициру-щегося участка для 5 видов вирусов группы герпеса.

Герпесвирусы Размер ампликона (п.н.) Размеры рестрикционных фрагментов (п.н.)

Тад1 Яэа1 НШ

ВПГ-1 531 312*, 117,95,7 288,120,99, 24 223,185, 104,9

ВПГ-2 531 168,144,124, 95 146,104,99, 81,39,38,24 522,9

ЦМВ 603 261,261,54, 20,7 519, 87 495,108

ВЭБ 531 277,229,25 531 331,123, 54, 20,3

ВГЧ-8 517 517 517 316,96,78, 27

Рисунок 4. Рестрикционные профили для 5 видов вирусов группы герпеса.

М- маркер молекулярной массы pUC19/MspI 1 -ВПГ-1,2-ВПГ-2,3 -ЦМВ,4-ВЭБ, 5 -ВГЧ-8

Для того, чтобы выявленные рестрикционные профили можно было использовать в качестве видовых признаков герпесвирусов, необходимо было убедиться в их популяционной стабильности. С этой целью была проведена серия экспериментов, в которых изучали рестрикционный полиморфизм маркерного фрагмента у различных штаммов, а также у герпесвирусов из клинического материала от инфицированных пациентов. В исследование были отобраны 9 штаммов и культур клеток и 172 клинических образца разного происхождения (урогенитальный матерал, образцы тканей, цельная кровь) от пациентов с различными диагнозами (таблица 2).

В результате проведенного анализа 181 образцов для вирусов ВПГ-1, ЦМВ, ВЭБ, и ВГЧ-8, а также для большинства образцов ВПГ-2 не было выявлено какого-либо внутривидового полиморфизма в рестрикционных профилях.

Таблица 2. Анализ внутривидового полиморфизма маркерного фрагмента герпесвирусов среди штаммов и клинического материала.

Штаммы и клинический материал ВПГ-1 ВПГ-2 ЦМВ ВЭБ ВГЧ-8

Количество положительных образцов с расчетным профилем рестрикции по трем рестриктазам Тад1, Ауд1 и НЫй.

Штаммы и культуры клеток 4(УС,Ь2, ЕСДЯеипап) 2 (С,ВН) 1 САО-169) 1 (РНЮ) 1 (ВСВЬ)

Урогенитальные образцы 18 57 35 11 —

Образцы цельной крови от пациентов с диагнозом инфекционный миокардит - - - 6 -

Образцы цельной крови от пациентов с диагнозом рассеянный склероз - - - 2 -

Образцы биопсии лимфомы Ходжкина - - - 3 -

Лимфоциты селезенки от доноров органов 1 1 4 35 -

Однако для штамма ВН, относящегося к ВПГ-2, были получены противоречивые результаты: при рестрикции ампликона штамма ВН эндонуклеазой Тад1, рестрикционный профиль соответствовал профилю ВПГ-1,

в то время как рестриктазы Rsal и ШтА давали картину рестрикции характерную для ВПГ-2 (рис. 5).

Рисунок 5. Рестрикционный профиль для штаммов в и ВН (ВПГ 2).

Тад I Луя!

1 2 М 1 2

1-штамм ВН 2 - штамм в

М- маркер молекулярной массы риС19/Мф1

Чтобы выяснить причину найденного противоречия, ампликон штамма ВН, а также соответствующий ампликон штамма в, который является референс-штаммом ВПГ-2, были секвенированы. Определенная нуклеотидная последовательность штамма ВН представлена на рис. 6. Сравнительный анализ сиквенсов показал, что последовательности секвенированных участков у штаммов ВН и в практически одинаковы и имеют только одно различие: у штамма ВН в позиции 234 цитозин (С) был заменен на тимин (Т). Мутация локализуется в одном из сайтов рестрикции для Taql (ТСвА), что, очевидно, и приводит к изменению соответствующего профиля рестрикции.

Рисунок 6. Секвенированный фрагмент штамма ВН.

1-саосатсатс саоосссаса асстотостт саотасостс тссстосоос

ссоаоосото сосасстооа оосооассоо оастасстоо аоатсоаоот

оооооосоас оостоттстт сотоаооссс асотасосоа оаосстосто

аосатссост ососоастоо стооссатос оааосаоатс остсосооат

сссссаоаос асссссоаоо аооссотсст сстт234оасаао саасаооссо

ссатсааоот оототосаас тсоототасо ооттсассоо оотосаосас

оотсттстос сстосстоса сотооссосс ассотоасоа ссатсооссо

соаоатостс стсосоасоо сосотасото сасососост ооосооаотт

соатсаосто стооссоаст ттссооаоос ооссосоато сососссссо

отссотастс- -455

Обнаруженный рестрикционный полиморфизм в гене ДНК-полимеразы штамма ВН ВПГ-2, как показали данные секвенирования, определяется наличием точечной мутации. Эта мутация могла присутствовать в исходном изоляте или возникнуть в процессе культивирования штамма в лабораторных условиях. Чтобы проверить это предположение пять различных пассажей штамма ВН, проведенных на клетках «Vero» начиная с 1990 года, были протипированы. Полученные рестрикционные профили по трем рестриктазам -Taql, Rsal и Hinfl, - демонстрировали одну и ту же картину для всех пяти пассажей, в том числе и аномальный Taql-птрофилъ. Таким образом, выявленная мутапия либо была свойственна первичному изоляту, либо произошла в самые начальные моменты изоляции и культивирования штамма, и мутантный генотип был отобран в процессе пассирования. К сожалению, проверить это предположение не представляется возможным, так как первичный изолят штамма не сохранился. При анализе клинических проб, содержащих ВПГ-2, мы не обнаружили мутантного генотипа, характерного для штамма ВН. Это означает, что данный генотип если и встречается в природе, то, по крайней мере, в московской популяции его частота очень низка.

Конструирование ПЦР-системы для комплексной детекции и дифференциации вирусов герпеса человека 6 и 7типа (ВГЧ-6 и -7).

Сравнение нуклеотидных последовательностей гена ДНК-полимеразы вирусов ВГЧ-6 и ВГЧ-7 выявило другую картину распределения консервативных и вариабельных участков. Учитывая, что предметом исследования служили только два вида герпесвирусов, конструирование ПЦР-системы было построено по принципу мультиплексной нестед-ПЦР. С этой целью были подобраны два группоспецифических праймера П67-1 и П67-2, которые обеспечивали амплификацию на первом этапе общего для обоих вирусов обший фрагмента. Для второго этапа были подобраны два видоспецифических праймера П6 и П7, отжигающиеся на разные области фрагмента, полученного на первом этапе, что позволяет получить ампликоны разного размера для каждого вида герпесвирусов. Локализация праймеров и амплифицирующихся фрагментов показана на рисунке 7.

Рисунок 7. Локализация праймеров и амплифицирующихся фрагментов в гене ДНК-полимеразы ВГЧ-б и ВГЧ-7.

Определение специфичности выбранных пар праймеров было проведено с ДНК ВПГ-6, ВПГ-7, ВПГ-1 и -2, ЦМВ и ВЭБ, а также геномной ДНК человека. В результате ПЦР-реакции были получены специфические ампликоны только с ДНК ВГЧ-6 и ВГЧ-7, имеющие размеры 569 и 403 п.н., соответственно. Никаких неспецифических продуктов ПЦР с ДНК других герпесвирусов и геномной ДНК человека выявлено не было (рисунок 8). Также специфичность полученных ампликонов подтверждалась рестрикцией полученных продуктов амплификации (403. п.н. и 569 п.н.) рестриктазой Rsal на фрагменты 27, 250 и 292 п.н. для ВГЧ-6 и 27 и 376 п.н. для ВГЧ-7. Сконструированная система получила название «Герп 67».

Рисунок 8. Специфичность ПНР системы «Герп 67».

М- маркер молекулярной массы риС19/Мф1

1 — отрицательный контроль

2 - геномная ДНК человека

3 - ДНК ВПГ-1,4-ДНК ВПГ-2,5 - ДНК ЦМВ, 6 - ДНК ВЭБ 7 - ДНК ВГЧ-6, 8 - ДНК ВГЧ-7

Таким образом, на основе выявленных особенностей нуклеотидного полиморфизма гена ДНК-полимеразы патогенных для человека вирусов семейства Шerpesviridae были созданы две аналитические системы, совокупное использование которых обеспечивает идентификацию 7 видов герпесвирусов человека. Одна система, названная «Пентагерп», построена на принципе нестед-ПЦР с последующим ПДРФ-анализом ампликонов, и позволяет проводить детекцию и дифференциацию ВПГ-1, ВПГ-2, ВЭБ, ЦМВ, ВГЧ-8. Другая система, названная «Герп 67», построена на принципе мультиплексной ПНР и позволяет проводить детекцию и дифференциацию ВГЧ-6 и ВГЧ-7. Разработанные системы могут быть использованы для типирования новых вирусных изолятов, изучения генетической вариабельности и региональных особенностей циркулирующих типов герпесвирусов, выявления вирусных маркеров при заболеваниях с неопределенной этиологией, изучения роли герпесвирусов при различных патологических состояниях, для решения других медико-эпидемиологических задач.

Изучение видового многообразия герпесвирусов человека, выявляемых в биоматериале медицинского значения.

Определение аналитической и диагностической чувствительности систем «Пентагерп»и «Герп 67».

Чувствительность, наряду со специфичностью, является основополагающей характеристикой любой тест-системы, претендующей на выявление возбудителя в клиническом материале. В приложении к клинико-диагностическим проблемам разделяют аналитическую и диагностическую чувствительность. Только определив эти показатели можно определить область применения диагностических систем и их возможности. Для систем комплексной детекции сразу нескольких видов возбудителей, важной характеристикой является также уровень чувствительности для каждого из детектируемых видов.

Аналитическую чувствительность ПЦР-системы «Пентагерп» оценивали в экспериментах с коммерческими образцами вирусной ДНК и с плазмидными ДНК, содержащими клонированные фрагменты вирусов ВПГ-1, ВПГ-2 ЦМВ, ВЭБ, ВГЧ-8 (см. «Материалы и методы»). В первом случае матрицами вирусной ДНК являлись препараты контрольных ДНК ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ и ВЭБ (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ). Исходная концентрации ДНК по паспорту составляла для ВПГ-1 -1,7-105 копий в мл, для ВПГ-2 - 2,5-104 копий в мл, для ЦМВ -1,46-105 копий в мл, для ВЭБ - 1,28-104 копий в мл. Тестирование

десятикратных разведений контрольных ДНК в системе «Пентагерп» дало следующие показатели чувствительности системы: для ВПГ-1 - 170 копий в мл, для ВПГ-2 - 250 копий в мл, для ЦМВ - 146 копий в мл и для ВЭБ - 128 копий в мл.

В экспериментах с 10-кратными разведениями плазмидной ДНК, содержащей клонированные фрагменты вирусов минимальное количество плазмидной ДНК, выявляемое системой «Пентагерп» составило 1 фг/мл для ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ и ВЭБ, и 10 фг/мл для ВГЧ-8, что в пересчете на число копий плазмидной ДНК составило 200 геном-экв/мл для ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ и ВЭБ и 2000 г-экв/мл для ВГЧ-8. Как видно из результатов, оценка чувствительности ПЦР системы «Пентагерп», полученная двумя независимыми исследованиями, имела близкие показатели.

Аналитическую чувствительность системы «Герп 67» определяли также в двух независимых экспериментах с коммерческим препаратом ДНК ВГЧ-6 (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ) и плазмидной ДНК, содержащей клонированные фрагменты вирусов ВГЧ-6 и ВГЧ-7 (см. «Материалы и методы»). Тестирование 10-кратных разведений коммерческого препарата ДНК ВГЧ-6, содержащего 1,1-105 г-экв/мл вирусной ДНК, определило чувствительность системы «Герп 67» на уровне 100 г-экв/мл. Минимальное количество плазмидной ДНК, выявляемое системой «Герп 67», составило 1 фг/мл для ВГЧ-6 и ВГЧ-7, что в пересчете на число копий плазмидной ДНК составило 200 копий в мл.

Для сравнения диагностической чувствительности систем «Пентагерп» и «Герп 67» с коммерческим использовали ПЦР-системы ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ - «АмплиСенс ЦМВ» и «АмплиСенс ВГЧ-6». Обьектами исследования являлись ДНК ЦМВ и ВГЧ-6, соответственно. Материалом для исследования служили 75 клинических образцов для системы «Пентагерп» и 58 клинических образцов для системы «Герп 67». Все клинические образцы предварительно прошли тестирование в ПЦР системе с праймерами к гену 5-глобина. Результаты исследования показаны в таблице 3, из которой следует что различий в диагностических показателях коммерческих и разработанных нами ПЦР-систем не выявлено.

Таким образом, определение аналитической и диагностической чувствительности систем «Пентагерп» и «Герп 67» показало, что системы обладают достаточно высокой чувствительностью, соответствующей высокочувствительным коммерческим диагностическим системам, при этом

уровень чувствительности для разных видов герпесвирусов был приблизительно одинаковым.

Таблица 3. Сравнительная оценка диагностической чувствительности систем «Пентагерп» и «Герп 67» с коммерческим ГЩР-системами ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ.

ПЦР-сисгемы Количество положительных образцов Количество отрицательных образцов Р

«Пентагерп» 11 64 0,82

«АмплиСенс ЦМВ» 12 63

«Герп 67» 7 41 0,76

«АмплиСенсВГЧб» 6 42

Р - критерий х2

Значение комплексного выявления герпесвирусов в клиническом материале урологического и гинекологического профиля.

Известно, что герпетическая инфекция - одна из самых распространенных вирусных инфекций, поражающая гениталии человека. Наиболее изученными урогенитальными герпесвирусами являются ВПГ-1 и -2 типа и ЦМВ (Баринский И.Ф., 1986, Гранитов В.М., 2001, Козлова В.И. 2003). Роль вирусов ВЭБ, ВГЧ-6, -7 и -8 в гинекологической и урологической патологии остается еще мало изученной и поэтому диагностике этих герпесвирусов не уделяется достаточного внимания. Целью данного раздела являлось определение роли комплексного обследования на герпесвирусные инфекции при урогенитальной патологии.

На первом этапе исследования мы изучали видовое разнообразие герпесвирусов в урогенитальном материале. Особенностью данного этапа являлось комплексное выявление 7 видов герпесвирусов во всех клинических образцах. Материалом для исследования служили урогенитальные образцы (п=170), направленные в период 2002-2003 гг. в лабораторию молекулярной диагностики ИМГ РАН из медицинских учреждений г. Москвы для обследования на герпесвирусные инфекции. Поступающие в лабораторию клинические образцы анализировались системами «Пентагерп» и «Герп 67». При проведении ПЦР в 66 урогенитальных образцах (39%) был обнаружен

герпесвирус. При этом моноинфекция была обнаружена в 48 пробах (73%), а смешанная инфекция в 18 пробах (27%) (рисунок 9).

Рисунок 9. Представленность разных видов герпесвирусов в урогенитальном материале (п=66).

смешанная инфекция 27%

Как показано на рисунке 9, все герпесвирусы человека могут инфицировать урогенитальные органы человека. ВПГ-1 и ВГЧ-8 на данном этапе исследования обнаружены не были. При этом наиболее частыми инфекционными агентами являются наименее изученные ВЭБ, ВГЧ-6 и ВГЧ-7. Смешанные герпесвирусные инфекции также являются не редким событием. Наиболее часто встречались сочетания ВЭБ и ВГЧ-7 - 10 образцов (15%), а также ВЭБ и ВГЧ-6 -3 образца (4%). Кроме того, было отмечено, что наиболее частым сопутствующим герпесвирусом являлся ВЭБ — 16 (24%) образцов. Учитывая достаточно высокий уровень выявления всех герпесвирусов и наличие смешанных герпесвирусных инфекций, на втором этапе мы провели специальное исследование, направленное на выяснение понимания этой ситуации практически врачами. В качестве объекта исследования были выбраны два вида герпесвируса - ЦМВ и ВПГ, роль которых в урогенитальной патологии хорошо известна современной медицине. Особенность исследования состояла в том, что выборку составили пробы, которые по назначению врача направлялись на диагностику только одного вида герпесвируса (ВПГ или ЦМВ). Пробы первоначально исследовались лабораторными моноспецифическими ПЦР-системами нестед-ВПГ и нестед-ЦМВ (Баринский И.Ф., 1994, Клинчева С.А., 1994), в соответствии с направлениями врача. По

результатам этих анализов было выявлено 75 ВПГ-положительных и 35 - ЦМВ-положительных образца. Далее проводилось дополнительное исследование положительных образцов в тест-системе «Пентагерп», которое принесло следующие результаты: все ВПГ-положительные образцы дали ампликоны в тест-системе «Пентагерп», при этом в 18 случаях (24%) был типирован ВПГ-1 и в 57 случаях (76%) - ВПГ-2. Кроме этого, в 6 пробах был обнаружен второй герпесвирус - в четырех пробах это был ЦМВ, а в двух пробах — ВЭБ. Наличие ДНК ЦМВ подтвердилось во всех 35 пробах при обследовании в универсальной ПЦР-системе. Кроме этого, в четырех пробах были еще обнаружены вирусы ВПГ-1 (в двух пробах) и ВПГ-2 (в двух пробах) ( таблица 4). Полученные данные подтвердили результат предыдущих исследований, что сочетанные герпесвирусные инфекции (ВПГ+ЦМВ+ВЭБ) являются не редким случаем. Кроме этого, приведенные данные убедительно показывают, что практикующие врачи могут не подозревать об этом и пропускать такие случаи.

Таблица 4. Частота выявления герпесвирусов при урогенитальной патологии.

Моновирусные Пентагерп Дополнительно

Герпесвирусы ПЦР-системы обнаруженный

Количество положительных образцов вирус

ВПГ-1 75 18 2

ВПГ-2 57 2

ЦМВ 35 35 4

ВЭБ — - 2

Видовое типирование урогенитальных герпесвирусов дало нам еще одну интересную информацию о распределении типов вируса простого герпеса при урогенитальной патологии. Исследование отобранных 75 ВПГ-положительных образцов с использованием ПЦР-системы «Пентагерп» подтвердило наличие в них герпесвирусной ДНК. Типирование герпесвирусной ДНК с использованием рестриктаз Taql, Яза1 и Шгу1 дало следующие результаты: ВПГ -1 был идентифицирован в 18 (24%), а ВПГ 2 - в 57 (76%) образцах.

Таким образом, результаты нашего исследования позволяют сделать вывод о том, что все герпесвирусы человека (кроме ВГЧ-8) могут инфицировать урогенитальные органы человека, и комплексное обследование является необходимым звеном диагностики герпесвирусных инфекций в урогенитальной патологии.

Определение частоты встречаемости герпесвирусов у доноров аллотрансплантанта почки. Изучение особенностей течения раннего посттрансплантационного периода у реципиентов, получивших органы от инфицированных доноров.

Проблема герпесвирусных инфекций при аллотрансплантации органов хорошо известна (Войлокова Р.Я. 1992, Беляков А. М. 1998, То^ С. 2002). Источником послеоперационных инфекций может служить поступление герпесвируса с донорским органом. В связи с этим с целью определения частоты инфицирования мы провели комплексного обследования доноров аллотрансплантанта почки на 7 герпесвирусов человека (ЦМВ, ВПГ-1 и -2, ВГЧ-6, ВГЧ-7, ВЭБ, ВГЧ-8).

Материалом для исследования у доноров служили лимфоциты селезенки. У 75 (54,7%) из 137 обследованных доноров герпесвирусы обнаружены не были. У 62 (45,3%) доноров выявлен хотя бы один из герпесвирусов (частота встречаемости представлена в таблице 5). При этом моноинфекция, которая наиболее часто была представлена ВГЧ-7 (13 доноров), была обнаружена у 34 из 62 инфицированных доноров. Смешанная герпесвирусная инфекция выявлена у 28 инфицированных доноров. Наиболее часто встречалась сочетанная инфекция ВЭБ+ВГЧ-7 (12 доноров), ВЭБ+ВГЧ-6+ВГЧ-7 (5 доноров), ВЭБ+ВГЧ-6 (4 донора).

Таблица 5. Частота встречаемости герпесвирусов у доноров органов.

Герпесвирусы Количество положительных образцов

ВПГ-1 1 (0,7 %)

ВПГ-2 1 (0,7%)

ЦМВ 4 (3%)

ВЭБ 35 (25,5%)

ВГЧ-6 22 (16%)

ВГЧ-7 34 (24,8%)

ВГЧ-8 0 (0%)

Полученные результаты свидетельствуют о высоком проценте инфицированноети доноров органов герпесвирусами. Особенно обращает внимание высокая частота выявления двух и более герпесвирусов (45%) от

общего количества положительных образцов, что повышает риск осложнений после пересадки инфицированного органа.

С целью получения клинических показателей влияния инфицированности герпесвирусами донорских органов на организм реципиента по ряду параметров (срок восстановления функции трансплантанта, количество больных с бескризовым течением, количество кризов отторжения у больных, длительность пребывания реципиента после аллотрансплантации в клинике) были изучены особенности течение раннего посттрансплантационного периода (срок наблюдения от 24 до 147 дней) у реципиентов, получивших органы от доноров, инфицированных и неинфицированных герпесвирусами. Работа проводилась совместно с сотрудниками НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ. Результаты исследования показаны в таблице 6. Ретроспективно все реципиенты были разделены на 3 группы:

1) реципиенты с аллотрансплантантом от неинфицированного донора (контрольная группа);

2) реципиенты с аллотрансплантантом от инфицированного донора, получавшие после пересадки профилактическую антивирусную терапию (5-7 дневный курс ганцикловира в/в в дозе 250-500 мг);

3) реципиенты с аллотрансплантантом от инфицированного донора без профилактического лечения, но получавшие симптоматическое лечение ганцикловиром после выявления клинических признаков инфекции.

Как видно из таблицы результаты аллотрансплантации близки в 1 и 2 группах. Напротив, течение раннего посттрансплантационного периода у больных, не получавших профилактического противовирусного лечения (3 группа) имело серьезные отличия. В течение первых 10 дней функция аллотрансплантанта в 3 группе восстановилась только у 30% больных по сравнению с 85-89% в первых двух группах, при этом каждый больной перенес криз отторжения, в то время, как в первых двух группах половина больных имела бескризовое течение раннего посттрансплантационного периода. Кроме того, длительность пребывания больных в стационаре в 3 группе увеличилась в среднем на 2 недели.

На основании полученных данных можно сделать вывод о влиянии герпесвирусной инфекции у доноров на течение раннего посттрансплантационного периода у реципиента. В следствии этого возрастает определяющая роль комплексной диагностики герпесвирусов у доноров органов в проведении своевременной противовирусной терапии.

Таблица 6. Особенности течение раннего посттрансплантационного периода у разных групп реципиентов.

Исследуемые параметры Группы реципиентов

Группа 1 (П=20) Группа 2 (п=19) Группа 3 (п=10)

Восстановления функции трансплантанта до 10 дней 17 (85%) 17 (89,5%) Р*=0,525 3 (30%) Р*=0,005

Бескризовое течение 9 (45%) 9 (48%) Р*=0,568 0 Р*=0,013

Количество кризов отторжения у больного 0,65±0,15 0,55+0,15 1,0

Длительность пребывания в клинике после пересадки в днях 42,3+3,44 47,4+6,27 59,6+11,58

Р*- двусторонний точный критерий Фишера, сравнение во 2 и 3 группах проводили попарно с 1 группой.

Выводы.

1. По данным сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена ДНК-полимеразы восьми видов герпесвирусов выявлено три высоко консервативных региона для пяти видов герпесвирусов — ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ и ВГЧ-8.

2. Разработан молекулярно-генетический метод для комплексной детекции и дифференциации пяти видов герпесвирусов человека: ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ и ВГЧ-8, основанный на амплификации фрагмента гена ДНК-полимеразы и последующем анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ампликонов.

3. Разработан молекулярно-генетический метод для комплексной детекции и дифференциации ВГЧ-6 и ВГЧ-7, основанный на мультиплексной амплификации фрагмента гена ДНК-полимеразы.

4. На основе разработанных методов сконструированы диагностические системы «Пентагерп» и «Герп 67» для детекции и дифференциации разных наборов герпесвирусов человека. Показана высокая чувствительность разработанных систем, превышающая чувствительность многих коммерческих диагностических систем.

5. По результатам анализа штаммов и клинических образцов от пациентов с различными проявлениями герпесвирусных инфекций показана популяционная генетическая стабильность маркерного фрагмента гена ДНК-полимеразы пяти видов герпесвирусов.

6. Обнаружена ранее неизвестная точечная мутация в нуклеотидной последовательности гена ДНК-полимеразы длительно перевиваемого штамма ВН (ВПГ-2). Данная мутация не обнаружена в природной популяции ВПГ-2.

7. Показана высокая частота выявления в клиническом материале урологического и гинекологического профиля 6-ти видов герпесвирусов, включая ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ, ВГЧ-6 и ВГЧ-7, при этом значительную часть (27%) представляли сочетанные герпесвирусные инфекции.

8. Получены прямые эпидемиологические данные о распределении ВПГ-1 и ВПГ-2 среди пациентов с генитальным герпесом в г. Москве: ВПГ-1 определялся с частотой 24%, ВПГ-2 - 76%.

9. Показана высокая частота выявления различных видов герпесвирусов среди доноров органов (45,3%). В значительной части (до 45%) инфицированных органов выявляется более одного герпесвируса. Показано влияние герпесвирусной инфекции на течение раннего постгрансплантационного периода у реципиентов, получивших органы от инфицированных доноров.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Демкин В.В., Николаева Н.П., Корнева И.Н., Круглова А.И., Войлокова Р.Я. Использование различных вариантов ПЦР для дифференциальной диагностики инфекций, вызываемых вирусами герпетической группы. Генодиагностика в современной медицине. Сб. тез. Докл. 3-й Всероссийской научно-практ. конф. Москва 2000, стр. 205-206.

2. Войлокова Р.Я., Николаева Н.П., Витязев Г.А., Абрамов В.Ю., Середин

A.Г., Круглова А.И., Корнева И.Н., Демкин В.В. Определение инфицированности доноров аллотрансплантатов сердца и почки. 2-й Росс, конгр. по патофизиол. «Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы». Тезисы докл. Москва 2000, стр. 314.

3. Kruglova, A.I., Nikolaeva, N.P., Demkin, V.V. A PCR assay for detection and species identification of five human herpes viruses. Clin. Microbiol. Infect. 2002, v.8, suppl.l,p.l37-138.

4. Демкин В.В., Круглова А.И., Нюхалова Ю.В. Комплексная диагностика герпесвирусных инфекций у женщин с урогенитальной патологией. Сб. тезисов 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний». 2002, Москва, стр.22-23.

5. Круглова А.И., Николаева Н.П., Нюхалова Ю.В., Войлокова Р.Я., Абрамов В.Ю., Хоробрых В.В., Демкин В.В. Комплексное обследование доноров органов на вирусы группы герпеса. Сб. тезисов 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний». 2002, Москва, стр.123-124.

6. Войлокова Р.Я., Николаева Н.П., Витязев Г.А., Круглова А.И., Абрамов

B.Ю., Хоробрых В.В., Хубутия М.Ш., Порунова А.К., Демкин В.В. Влияние герпесвирусной инфекции у доноров крови и доноров аллотрансплантата на течение раннего послеоперационного периода. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2002, № 1, стр. 18-20.

7. Demkin, V.V., Kruglova, АЛ., Nikolaeva, N.P., Yurchenko J .Y. Detection and species identification of four human herpesviruses using polymerase chain reaction coupled with restriction endonuclease analysis. J. Virol. Meth., 2002; 103/2, pp. 121-128.

8. Круглова А.И., Войлокова Р.Я., Николаева Н.П., Демкин В.В., Нюхалова Ю.В., Абрамов В.Ю., Хоробрых В.В. Детекция и идентификация четырех типов герпесвирусов человека у доноров органов и больных с сердечно-сосудистой патологией. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2002, 3, стр. 40-41.

9. Круглова А.И., Николаева Н.П., Нюхалова Ю.В., Баринский И.Ф., Алимбарова Л.М., Демкин В.В. Анализ генетического полиморфизма ДНК вируса простого герпеса 1 и 2 типов из лабораторных штаммов и клинического материала от пациентов с генитальным герпесом. Вопросы вирусологии. 2004, №1, стр. 23-27

10. Демкин В.В., Круглова А.И., Николаева Н.П, «Способ диагностики герпесвирусной инфекции». Патент № 12317/100 от 8.02.2002.

Принято к исполнению 25/08/2004 Исполнено 26/08/2004

Заказ № 296 Тираж1 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat га

»175 Of

РНБ Русский фонд 2005-4

16106

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Круглова, Анна Игоревна

Список сокращений.

Введение.

Глава !.Обзор литературы.

1.1 .Общая характеристика герпесвирусов.

1.2. Строение и вариабельность генома герпесвирусов человека.

1.3. Клиническая характеристика герпесвирусных инфекций.

1.4. Значение герпесвирусов в урогенитальной патологии.

1.5. Значение герпесвирусов в трансплантологии.

1.6. Латентность герпесвирусов.

1.7. Методы диагностики герпетических инфекций.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Характеристика клинических образцов.

2.2. Штаммы вирусов и контрольные ДНК.

2.3. Выделение ДНК.

2.4. Подбор праймеров.

2.5. Полимеразная цепная реакция.

2.6. Рестрикционный анализ.

2.7. Секвенирование.

2.8. Статистическая обработка данных.

Глава 3. Результаты исследований.

3.1. Конструирование диагностических систем для комплексной детекции герпесвирусов человека.

3.1.1. Выбор генетической мишени для комплексной детекции герпесвирусов.

3.1.2. Конструирование ПЦР-системы для комплексной детекции вируса простого герпеса 1 и 2 типа (ВПГ 1 и 2), цитомегаловируса (ЦМВ), вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) и вируса герпеса человека 8 типа (ВГЧ 8).

3.1.3. Проверка работоспособности праймеров и оптимизация условий проведения ПЦР.

3.1.4. Анализ рестрикционного полиморфизма амплифицируемого универсального фрагмента гена ДНК-полимеразы вирусов ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ и ВГЧ-8.

3.1.5. Конструирование ПЦР-системы для комплексной детекции и дифференциации вирусов герпеса человека 6 и 7 типа (ВГЧ-6 и -7)

3.2. Изучение видового многообразия герпесвирусов человека, выявляемых в биоматериале медицинского значения.

3.2.1. Определение аналитической и диагностической чувствительности систем «Пентагерп» и «Герп 67».

3.2.2. Сравнение способов обработки клинического материала для ПЦР-анализа.

3.2.3. Значение комплексного выявления герпесвирусов в клиническом материале урологического и гинекологического профиля.

3.2.4. Определение частоты встречаемости герпесвирусов у доноров аллотрансплантанта почки. Изучение особенностей течения раннего посттрансплантационного периода у реципиентов, получивших органы от инфицированных доноров.

Глава 4. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая идентификация и дифференциация герпесвирусов человека"

На сегодняшний день существует ряд методов диагностики герпетической инфекции (выявление антигенов при помощи иммуноферментного анализа, серологическая диагностика или изоляция вируса в культуре клеток), но в последние годы все большее внимание уделяется молекулярно-генетическим способам диагностики. Большинство из них построено на принципе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Несовершенство таких способов диагностики отчасти связано с моноспецифическим характером систем детекции, которые не обеспечивают выявление всего многообразия видов герпесвирусов, вовлекаемых в развитие патологических состояний. Широкий спектр клинических проявлений, возникновение сочетанных герпесвирусных инфекций, увеличение частоты появления резистентных штаммов и штаммов с нетипичными клиническими проявлениями заставляет пересматривать традиционные способы диагностики и искать новые подходы. В связи с этим разработка новых методов комплексной детекции и дифференциации, основанных на современных знаниях генетического видового разнообразия герпесвирусов при различных патологических состояниях является актуальной задачей фундаментальной и практической вирусологии.

Цель и задачи исследования.

Для достижения поставленной цели был определен ряд задач:

4. Изучение генетической стабильности выбранной мишени в природной популяции герпесвирусов.

6. Оределение специфичности и чувствительности разработанных диагностических систем.

7. Изучение роли комплексного выявления герпесвирусов при урогенитальной патологии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Данные по изучению генетического полиморфизма гена ДНК-полимеразы герпесвирусов человека.

3. Разработка молекулярно-генетического метода одновременной детекции и дифференциации ВГЧ-6 и ВГЧ-7.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Круглова, Анна Игоревна

Выводы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Круглова, Анна Игоревна, Москва

1. Авакян А.А., Быковский А.Ф. Атлас анатомии и онтогенеза вирусов человека и животных.- М.: Медицина, 1970.

2. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К., Каспаров А.А., Грибенюк В.Н. Герпес: этиология, диагностика, лечение. М.: Медицина, 1986 -272 е.

3. Ведяков А. М., Долгих М. С. Детекция ДНК цитомегаловируса методом полимеразной цепной реакции в разных биологических материалах у больных с аллотрансплантантами органов// Клиническая лабораторная диагностика.-1998. № 11.- С. 19-20.

4. Войлокова Р.Я., Посевая Т.А., Мойсюк Я.Г. и соавт. Влияние герпесвирусной инфекции (цитомегаловируса и вируса простого герпеса) на результат аллаотрансплантации почки// Вопросы вирусологии.- 1992. №4.- С. 204-206.

5. Войлокова Р.Я., Николаева Н.П., Витязев Г.А., Круглова А.И., Абрамов

6. Гаранжа Т.А., Филатов Ф.П. Диагностика инфекций, вызванных вирусом Эпштейна-Барр и цитомегаловирусом, в гематологическом стационаре// Сборник «Актуальные проблемы герпесвирусных инфекций». М., 2004,1. C. 94-106.

7. Глинских Н.П. Герпесвирусы человека. В кн.: Неизвестная эпидемия: герпес. Смоленск, 1997, 32-57.

8. Гранитов В.М. Герпесвирусная инфекция,- Нижний Новгород:НГМА,2001,- 88 с.

9. Долгих М.С. Вирус герпеса 6 (HHV-6) у иммунодефицитных пациентов (часть 1 и 2)// Вестник трансплантологии и искусственных органов,- 2001, №1.- С. 51-55.- 2002, №2.- С. 50-55.

10. Исаков В.А., Борисова В.В., Исаков Д.В. Герпес: патогенез и лабораторная диагностика.- СПб.: Лань, 1999. -192 е.

11. Киселев Ф.Л., Павлиш О.А., Татосян А.Г. Молекулярные основы канцерогенеза у человека.- М.: Медицина, 1990. 320 с.

12. Козлова В.И., Пухнер А.Ф. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий. Москва: «Триада-Х», 2003 - 440 с.

13. Сборник «Актуальные проблемы герпесвирусных инфекций». М., 2004 -С. 30-31.

14. Малашенкова И.К., Дидковский Н.А., Сарсания Ж.Ш., Жарова М.А. и др. Клинические формы хронической Эпштейн-Барр- вирусной инфекции: вопросы диагностики и лечения// Лечащий врач.-2003, №9.- С. 32-39.

15. Марченко Л.А. Генитальный герпес. Новые клинические аспекты// Проблемы репродукции.- 1996, №4.- С. 29-33.

16. Марков И.С. Диагностика и лечение герпетических инфекций и токсоплазмоза. Киев: АртЭк, 2002. - стр. 156-172.

17. Посевая Т.А., Баринский И.Ф. Григорьев В.В., Шуваева Н.И. Гуморальный иммунитет к вирусу простого герпеса 2 типа у пациентов с цервикальной карциномой// Вопр. Вирусологии,- 1982, №3 С. 327-330.

18. Сенкевич Т.Г., Гибадулин Р.А., Угрюмов Е.П., Посевая Т.А., Баринский И.Ф. Типирование штаммов вируса простого герпеса методом анализа вирусной ДНК с помощью рестрикционных эндонуклеаз// Вопросы вирусологии,- 1982, № 3,- С. 330-334.

19. Феннер Ф. Б. Мак-Ослен, С. Миме, Дж. Сэмбрук, Д.Уайт. Биология вирусов животных. М.: Мир, 1977.

20. Alba MM, Das R, Orengo С A, Kellam P. Genomewide function conservation and phylogeny in the Herpesviridae// Genome Res.-2001 .-Vol. 1 l(l).-P.43-54.

21. Agut. H, Calvez V., Fillet A. Huraux J. The discovery of the three human viruses: human herpesviruses 6, 7 and 8// Bull. Acad. Natle Med.-1997.- 181, n.6.-P. 1009-1022

22. Aono, Т., S. Murakami, N. Yanagihara, and K. Yamanishi. Detection of human alpha-herpesvirus DNA using consensus primers and specific probes// Acta Otolaryngol.- 1994.- Suppl. 514.-P.132-134.

23. Balthesen M, Dreher L, Lucin P, Reddehase MJ. The establishment of cytomegalovirus latency in organs is not linked to local virus production during primary infection// J Gen Virol.- 1994,- Sep;75 ( Pt 9).-P. 2329-36.

24. Borysiewicz L.K., Sissons J. G.P. Cytotoxic T cells and human herpes virus infections// Currrent topics in Microbiology and Immunology.- 1994,- Vol. 189,-P. 124-145

25. Brytting M, Sundqvist VA, Stalhandske P, Linde A, Wahren B. Cytomegalovirus DNA detection of an immediate early protein gene with nested primer oligonucleotides//! Virol Methods.-1991.-Vol.32(2-3).-P. 127-38.

26. Campadelli-Fiume G., Mirandola P., Menotti L. Human herpesvirus 6: An emerging patogen// Emerg Infect Dis.- 1999.-Vol.-5(3).-P. 353-66.

27. Cermelli C, Berti R, Soldan SS, Mayne M, D'ambrosia JM, Ludwin SK, Jacobson S. High frequency of human herpesvirus 6 DNA in multiple sclerosis plaques isolated by laser microdissection// J Infect Dis.- 2003.- Vol. 1;187(9).-P. 1377-87.

28. Cheong WK, Thirumoorthy T, Doraisingham S, Ling AE. Clinical and laboratory study of first episode genital herpes in Singapore// Int J STD AIDS.-1990.-Vol. l.-P. 195-8.

29. Chapenko S, Millers A, Nora Z, Logina I, Kukaine R, Murovska M. Correlation between HHV-6 reactivation and multiple sclerosis disease activity// J Med Virol.- 2003,- Vol. 69(1).- P.lll-7.

30. Davison,A.J. and Scott,J.E. The complete DNA sequence of varicella-zoster virus//J. Gen. Virol.- 1986.-Vol. 67 (Pt9).-P. 1759-1816.

31. Enbom M, Strand A, Falk KI, Linde A. Detection of Epstein-Barr virus, but not human herpesvirus 8, DNA in cervical secretions from Swedish women by real-time polymerase chain reaction//Sex Transm Dis.-2001.-Vol.28(5).-P. 300-6.

32. Enright H., Haake R., Weisdorf D. et al. Cytomegalovirus pneumania after bone marrow transplantation//Transplantation.- 1993.-Vol. 55.-P. 1339-1346.

33. Espy MJ, Patel R, Paya CV, Smith TF. Comparison of three methods for extraction of viral nucleic acids from blood cultures// J. of Clin. Microbiol.-1995,-P. 41-44.

34. Fish R.N., Soderberg-Naucler C., Mills L.K., Stenglein S., Nelson J.A. Human cytomegalovirus persistently infects aortic endothelial cells// J. Virol.-1998.-Vol. 72.-P. 5661-5668.

35. Griffiths P.D., Clark D.A., Emery V.C. Betaherpesviruses in transplantant recipients//J. Antimicrob. Chemotherapy.-2000.-Vol. 45.-P. 29-34.

36. Ho M. Advances in understanding cytomegalovirus infection after transplantation// Transplant. Proc. 1994.- V.26.- P. 7-10.

37. Hopwood P.A., Brooks L., Parratt R., Hunt B.J. at all. Persistent Epstein-Barr virus infection: unrestricted latent and lytic viral gene expression in healthy immunosuppressed transplant recipients// Transplantation.- 2000,- Vol.74,-P. 194-202.

38. Horvath J, Dummer S, Loyd J, Walker B, Merrill WH, Frist WH. Infection in the transplanted and native lung after single lung transplantation// Chest.1993.- Vol. 104(3).-P.681-5.

39. Huang T.S., Klipatrick B.A. et al. Detection of human cytomegalovirus and analysis of strain variation//J. Biol. Med.-1976.-Vol. 49.-P. 29-37.

40. Hudnall SD, Chen T, Rady P, Tyring S, Allison P. Human herpesvirus 8 seroprevalence and viral load in healthy adult blood donors// Transfusion. -2003,- Vol.43(l).-P.85-90.

41. Hudnall SD, Rady PL, Tyring SK, Fish JC. Serologic and molecular evidence of human herpesvirus 8 activation in renal transplant recipients// J Infect Dis.-1998.-Vol. 178(6).-P.1791-4.

42. John A.Z. Viral infections associated with bone marrow transplantation//Oncol. Clinics of North America.-1990.- Vol. 4, No. 3.- P. 603-623.

43. Kapranos N., Petrakou E., Anastasiadou C., Kotronias D. Detection of herpes simplex virus, cytomegalovirus, and Epstein-Barr virus in the semen of men attending an infertility clinic// Fertil. Steril.- 2003.- Vol. 79.-P. 1566-70.

44. Karlin S., Mocarski E.S., Schachtel G.A. Molecular evolution of herpesviruses: genomic and protein sequence comparisons// J. of Virology.1994.- Vol.4.-P. 1886-1902.

45. Katano H., Tetsutaro S. Human herpesviruses 8 virology, epidemiology and related diseases// Jpn. J. Infect. Dis.- 2000,-Vol. 53.-P. 137-155.

46. Kawasaki S, Oshitani H, Suzuki H, Arakawa M, Mizuta K, Imaizumi M, Tsuchiya S, Konno T. PCR-RFLP analysis of cytomegalovirus infectionsassociated with bone marrow transplantation in Japanese children// Microbiol Immunol.-1999.-Vol.43(4).-P.359-64.

47. Kinghorn GR. Epidemiology of genital herpes// J Int Med Res.- 1994.-Vol.22.- P.14A-23A.

48. Klipatrick B.A. et al. Analysis of cytomegalovirus genomes with restriction endonuclease Hind III and Eco Rl// J. Virol.-1976.-Vol. 18.-P. 1095-1099.

49. Kondo K, Mukai T, Yamanishi K. Detection of human herpesvirus 6 (HHV-6) DNA by polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) of HHV-6 DNA// Nippon Rinsho.- 1992,- Vol.50.-P. 176-82.

50. Kouzarides Т., Bankier А. Т., Satchwell S.C., Weston K., Tomlinson P., Barrell B.G. Large-scale rearrangement of homologous regions in the genomes of HCMV and EBV// J. of Virology.-1987.-Vol.157.-P. 397-413.

51. Lafferty WE, Downey L, Celum C, Wald A. Herpes simplex virus type 1 as a cause of genital herpes: impact on surveillance and prevention// J Infect Dis.-2000,- Vol. 181(4).-P. 1454-7.

52. Lanham S., Herbert A., Basarab A., Watt P. Detection of cervical infection in colposcopy clinic patients// J. of Clin Microbiol.-2001,- Vol.8.- P. 2946-2950.

53. Larder B.A., Kemp S.D., Darby G. Related functional domain in virus DNA polymerases//J. EMBO.-1987.-Vol.6(l).-P. 169-175

54. Lin К., Dai C.Y., Riccardi R.P. Cloning and functional analysis of Kaposi's Sarcoma-accociated herpesvirus DNA polymerase and its processivity factor// J. of Virology.- 1998.-Vol.7.-P. 6228-6232.

55. Lowhagen GB, Jansen E, Nordenfelt E, Lycke E. Epidemiology of genital herpes infections in Sweden// Acta Derm Venereol.- 1990.-Vol.70(4).-P.330-4

56. Madhavan HN, Priya K, Bagyalakshmi R. Phenotypic and genotypic methods for the detection of herpes simplex virus serotypes// J Virol Methods.- 2003,-Vol. 108(1 ).-P.97-l 02

57. Marshall DS, Linfert DR, Draghi A, McCarter YS, Tsongalis GJ. Identification of herpes simplex virus genital infection: comparison of a multiplex PCR assay and traditional viral isolation techniques// J. Mod Pathol.-2001,- Vol. 14(3).-P. 152-6

58. Minjolle S, Michelet C, Jusselin I, Joannes M, Carrier F, Colimon R. Amplification of the six major human herpesviruses from cerebrospinal fluid by a single PCRЛ J Clin Microbiol.- 1999.-Vol. 37(4).- P.950-953.

59. Moore P.S., Gao S.J., Domingues G. et al. Primary characterization of a herpesvirus agent associated with Kaposi's sarcoma// J. Virology.- 1996-Vol.70(l).-P.549-558.

60. Nicholas J. Determination and analysis of the complete nucleotide sequence of human herpesvirus 111 J. of Virology.-1996.-Vol.70(9).- P. 5975-5989.

61. Ohashi M, Yoshikawa T, Ihira M, Suzuki K, Suga S, Tada S, Udagawa Y, Sakui H, Iida K, Saito Y, Nisiyama Y, Asano Y. Reactivation of human herpesvirus 6 and 7 in pregnant women// J Med Virol.- 2002.- Vol.67(3).-P. 354-8.

62. Pozo F, Tenorio A.Detection and typing of lymphotropic herpesviruses by multiplex polymerase chain reaction.// J Virol Methods.- 1999,- Vol.79(1).-P.9-19.

63. Rozenberg, F., and P. Lebon. Amplification and characterization of herpesvirus DNA in cerebrospinal fluid from patients with acute encephalitis.//! Clin. Microbiol.- 1991.-Vol. 29,-P.2412-2417.

64. Sarisky RT, Nguyen TT, Duffy KE, Wittrock RJ, Leary JJ: Difference in incidence of spontaneous mutations distinct between herpes simplex virus types 1 and 2// Antimicrob. Agents Chemother.- 2000,-Vol. 44.-P. 1524-1529

65. Singh N. Human herpesviruses-6, -7 and -8 in organ transplant recipients// Clin. Microbiol. Infect.- 2000,-Vol. 6.-P. 453-459.

66. Sissons J.G.P., Bain M., Wills M.R., Sinclair J.H. Latency and reactivation of human cytomegalovirus// J. of Infection.- 2002.-Vol. 44.- P.73-77

67. Smith Jo R., Field H.J. Human herpesvirus vaccines// Herpes.- 1997.-Vol. 4 (3).- P. 55-62.

68. Schonian U, Maisch B. Cytomegalovirus associated diseases of the heart// Herz. 1992,- Vol.l7(2).-P.85-90.

69. Sweet C. The pathogenicity of cytomegalovirus// FEMS Microbiology Rewiews.- 1999.-Vol.23.- P. 457-482.

70. Tasaka T, Said JW, Morosetti R, Park D, Verbeek W, Nagai M, Takahara J, Koeffler HP. Is Kaposi's sarcoma—associated herpesvirus ubiquitous in urogenital and prostate tissues?// Blood.- 1997.- Vol.89(5).-P. 1686-9.

71. Telenti, A. PCR Detection and typing of Epstein-Barr virus// Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and applications.-1993,- P. 344-349.

72. Tenorio, A., J. E. Echevarria, I. Casas, J. M. Echevarria, and E. Tabares. Detection and typing of human herpesviruses by multiplex polymerase// J.Virol. Methods.- 1993,-Vol. 44.- P.261-269.

73. Tong С. Y.W., Bacran A., Peiris J. S. M. et. al. The association of viral infection and chronic allograft nephropathy with graft dysfunction after renal transplantation// Transplantation.-2002.-Vol. 74(4).- P.576-578.

74. Toye В., Woods W., Bobrowska M., Ramotar K. Inhibition of PCR in genital and urine specimens submitted for Chlamydia trachomatis testing// J Clin. Microbiol.- 1998.- Vol. 36(8).- P. 2356-8.

75. Umene K, Inoue T, Inoue Y, Shimomura Y. Genotyping of herpes simplex virus type 1 strains isolated from ocular materials of patients with herpetic keratitis// J Med Virol.- 2003.- Vol.71(1).-P. 75-81.

76. Upton D. Allen. Human herpesvirus type 8 infections among solid organ transplantant recipients// Pediatr. Transpant.- 2002,-Vol. 6,- P. 187-192.

77. Wald, A., J. Zeh, S. Selke, R. L. Ashley, and L. Corey. Virologic characteristics of subclinical and symptomatic genital herpes infections// N. Engl. J. Med.-1995.- Vol.333.- P.770-775.

78. Yoshikawa T. Human herpesvirus-6 and -7 infections in transplantation// Pediatr. Transplant.- 2003.- Vol. 7(1).- P. 11-7.

79. Zweygberg Wirgart B, Brytting M, Linde A, Wahren B, Grillner L. Sequence variation within three important cytomegalovirus gene regions in isolates from four different patient populations// J. Clin Microbiol.- 1998-Vol.36(12).- P.3662-9.

Информация о работе

Круглова, Анна Игоревна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Молекулярно-генетическая идентификация и дифференциация герпесвирусов человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы