Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление герпесвируса сибирского осетра с помощью ПЦР в режиме реального времени и молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Выявление герпесвируса сибирского осетра с помощью ПЦР в режиме реального времени и молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса"

На правах рукописи

Калабекова Фатима Султанхамидовна

ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕРИЕСВИРУСА СИБИРСКОГО ОСЕТРА С ПОМОЩЬЮ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА

03.02.02 Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 1К 2013

Покров-2013

005543373

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхо-закадемии).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии) Колбасова Ольга Львовна

Официальные оппоненты:

заведующая кафедрой ветеринарной вирусологии им. В.М. Сюрина ФГБУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Ярыгина Елена Игоревна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

ФГБУ «ВНИИЗЖ» Пыльнов Владимир Александрович

Ведущая организация:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии), г. Москва.

Защита диссертации состоится «26» «декабря» 2013 г. в «10.00» часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская область, г. Покров, Тел./факс: (09243) 6 21 25.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «22» ноября 2013 г. и размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniivvim.ru и сайте ВАК России www.vak2.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, . — Балашова

кандидат биологических наук ¿-^ Елена Алексеевна

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность работы

В связи с угрозой исчезновения ценных видов осетровых рыб и возрастающим спросом на товарную осетровую продукцию в последние годы все большее развитие получает индустриальное осетроводство. В то же время интенсификация аквакультуры осложняется возникновением болезней гидробионтов. По данным Международного эпизоотического бюро основной ущерб мировой аквакультуре наносят вирусные болезни рыб [Aquatic Animal Health Code. 12th éd., OIE, Paris, 2009].

В середине восьмидесятых годов двадцатого века от осетровых рыб был выделен первый вирус - иридовирус [Adkison, М.А., 1998]. В результате мониторинга внутренних водоемов страны и регулярных обследований рыбоводных хозяйств позднее были выделены и другие вирусы от осетровых рыб. В настоящее время у североамериканских осетровых обнаружено 10 разных вирусов, из которых наиболее опасны - аденовирус, иридовирус и два герпе-свируса белого осетра. Эти вирусы вызывают болезни у мальков и сеголетков белого осетра, являющегося главным объектом осетроводства США [R.P. Hedrick, 1985; Adkison, М.А. 1998]. Помимо США вирусы у осетровых были обнаружены в Италии и Бельгии [Ghittino, Р.,1985].

Первое сообщение об обнаружении вирусной болезни осетровых рыб, в Российской Федерации, появилось в 2006 г., когда в весенний период в Тверской области на Конаковском заводе товарного осетроводства началась массовая гибель молоди сибирского осетра (Acipenser baeri) с признаками некроге-моррагического синдрома, типичными для герпесвирусной инфекции. Выявленный патоген был изучен и идентифицирован как герпесвирус сибирского осетра [Щелкунов, И.С., 2006].

Мировая аквакультура развивается столь высокими темпами, что возможности ветеринарной науки по разработке средств и методов борьбы с болезнями существенно отстают от запросов практики. Исходя из этого, МЭБ

определило главным направлением борьбы с болезнями культивируемых гид-робионтов профилактику заболеваний, основным принципом которой является предотвращение проникновения патогенов в регионы, где они прежде отсутствовали. Это достигается путем проведения эпизоотологического мониторинга на рыбоводных предприятиях и регулированием межхозяйственных перевозок объектов разведения с учетом полученных при этом результатов.

В настоящее время в Российской Федерации утвержден только один метод идентификации выделяемых изолятов герпесвируса сибирского осетра - реакция нейтрализации с использованием референсной гипериммунной антисыворотки, получаемой во ВНИИВВиМ [Щелкунов И.С., 2007].

Данная реакция обладает известными достоинствами, но требует предварительного выделения вируса в культуре клеток, и поэтому ее использование затруднено при исследовании большого количества полевых материалов. Существенным недостатком реакции является невозможность определения с ее помощью филогенетических взаимоотношений выделенных изолятов, что достигается только с использованием молекулярно-биологических методов, в том числе и ПЦР, которая является главным инструментом активно развивающейся сегодня молекулярной эпизоотологии вирусных инфекций рыб.

1.2 Степень разработанности проблемы

Изучению биологических, физико-химических и в меныцей мере молеку-лярно-генетических свойств герпесвируса сибирского осетра посвящена работа А.И. Щелкунова. В данной работе представлено описание выявленной болезни и свойств вируса-возбудителя, оптимизированы условия его культивирования, определено таксономическое положение [Щелкунов А.И., 2010].

Работа И.Б. Прокаевой посвящена изучению гуморального иммунного ответа осетровых рыб при герпесвирусной болезни сибирского осетра, предложен способ выявления противогерпетических антител в сыворотках крови осетровых рыб на основе твердофазного иммуноферментного анализа для ретроспективной диагностики данной болезни [Прокаева И.Б., 2013].

Однако недостаточно изучены молекулярно-генетические свойства выделенных изолятов герпесвируса сибирского осетра. Не разработаны методы мо-лекулярно-генетической диагностики герпесвирусной инфекции осетровых рыб, основанных на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР), отличающихся высокой чувствительностью и специфичностью получаемых результатов.

13 Цель и задачи исследований

Целью исследования являлась разработка тест-системы для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра на основе ПЦР в режиме реального времени и проведение молекулярно - генетического анализа изолятов вируса.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. С использованием данных вепБапк рассчитать специфичные праймеры и зонд, определить оптимальные условия проведения ПЦР в режиме реального времени;

2. Разработать тест-систему для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени и рекомбинантный положительный контроль для тест-системы;

3. Отработать методику пробоподготовки и оценить диагностическую ценность проб различных органов и тканей рыб для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени;

4. Определить филогенетические взаимоотношения выделенных изолятов герпесвируса сибирского осетра.

1.4 Научная новизна результатов исследований

Впервые разработана тест-система на основе ПЦР в режиме реального времени для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра в пробах инфицированных культур клеток, органов и тканей рыб.

Впервые в Российской Федерации определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена ДНК-пролимеразы штамма 8К1/0406 и изолятов герпесвируса сибирского осетра, выделенных на территории нашей страны.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Разработана методика выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени.

Проведен молекулярно-генетический анализ участков гена ДНК-полимеразы штамма SK1/0406 и 8 изолятов герпесвируса сибирского осетра, выделенных в период 2006-2013 гг., и изучены их филогенетические взаимоотношения.

Разработаны «Методические положения по выявлению ДНК герпесвируса сибирского осетра методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 28. 05. 2012 г.

1.6 Степень достоверности и апробация работы

Степень достоверности результатов проведённых исследований подтверждена статистическими исследованиями и комиссионными испытаниями. Акт комиссионных испытаний утвержден директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 31.10.2011 г. Статистическая обработка включала расчёты средних арифметических значений, стандартных отклонений результатов полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, вычисления эволюционных дистанций с помощью программы «MEGA 5.0». Научные положения, выводы и практические предложения диссертационной работы аргументировано отражают содержание диссертации.

Результаты исследований, выполненных по теме диссертационной работы, представлены, заслушаны и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (Покров 2010-2013 гг.), Международной научно-практической конференции (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, Покров, 2011 г.), Международной конференции «Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов» (Борок - Москва, 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (УГСХА им. П.А. Столыпина, Ульяновск, 2012 г.; ГНУ ВНИТиБП Россельхозакадемии, Щелково, 2012 г.).

1.7 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите

В соответствии с формулой специальности 03.02.02 Вирусология, охватывающей проблемы исследования вирусов, генетики, биохимических и моле-кулярно-генетических аспектов, разработки мер диагностики вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследований: проблемы генетики вирусов, структурной организации генома вирусов, проблемы генной инженерии, разработки мер диагностики вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем, в диссертационной работе описано проведение исследований по созданию тест-системы на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, использование которой позволяет идентифицировать ДНК герпесвируса сибирского осетра. Также представлены результаты разработки рекомбинантной конструкции на основе плазмидного вектора, применяемого в качестве положительного контроля амплификации в данной тест-системе. Определены нуклеотидные последовательности участка гена ДНК- полимеразы штамма БК1/0406 и 8 изолятов герпесвируса сибирского осетра, выделенных на территории Российской Федерации. Проведён филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей, полученных в данной работе. Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности 4, 5, 10.

1.8 Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «КубГАУ», включённом в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

1.9 Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 34 отечественных и 108 иностранных источников; дополнена приложениями.

Диссертация содержит 11 таблиц и 22 рисунка. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

1.10 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту

1) Разработанная тест-система на основе ПЦР в режиме реального времени позволяет выявлять ДНК герпесвируса сибирского осетра методом в инфицированных культурах клеток, проб органов и тканей рыб.

2) Метод изоляции герпесвируса сибирского осетра в культуре клеток и полимеразная цепная реакция в режиме реального времени позволяют выявить ДНК вируса на разных стадиях течения инфекционного процесса

3) Результаты сравнительного анализа нуклеотидного состава участка гена ДНК-полимеразы штамма 8К1/0406 и 8 изолятов герпесвируса сибирского осетра, выделенных на территории Российской Федерации, и их филогенетические взаимоотношения.

1.11 Личный вклад автора в выполнение работы

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Отдельные этапы исследований выполнены при консультативной и практической помощи сотрудников лабораторий Здоровья гидробионтов и Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы

2.1.1 Вирус

В работе использовали штамм 5К1/0406 и изоляты 8К2/0506, ВК/0506, 8170708, БР1/1108, 8А7/0310, 588/0111, 1*85/0111, 51г6/0311 герпесвируса сибирского осетра.

При оценке специфичности тест-системы для выявления генома герпесвируса сибирского осетра на основе ПЦР в режиме реального времени использовали образцы ДНК гетерологичных вирусов, патматериала от экспериментально зараженного сеголетка сибирского осетра, гетерологичных вирусов, ин-

тактных культур клеток и биологического материала от здорового сеголетка сибирского осетра.

2.1.2 Рыба

В работе использованы: сибирский осетр (Acipenser baerï) - мальки, сеголетки, двухгодовики; русский осетр {Acipenser gueldenstaedtî) -годовики; ленский осетр {Acipenser baeri) — мальки.

2.1.3 Культуры клеток

Использовали перевиваемые клеточные линии рыб:

- пула печени, почки, селезенки (SSO-1, SSO-2) и плавников сибирского осетра, Acipenser baeri (SSF-1, SSF-2);

- кожи белого осетра, Acipenser transmontanus (WSSK-1);

- селезенки белого осетра, Acipenser transmontanus (WSS-2).

Клеточные линии SSO-1, SSO-2, SSF-1, SSF-2 получены в лаборатории

ихтиопатологии ФГУП "ВНИИПРХ". Остальные клеточные линии были любезно предоставлены нам зарубежными коллегами.

2.1.4 Плазмида и бактериальные штаммы

Конструирование рекомбинантного положительного контроля к разработанной тест-системе проводили на основе плазмидного вектора pTZ57R/T (Fermentas). Клонирование осуществляли в генетически модифицированных клетках Е. coli линии DH5a (Promega).

2.2 Методы

2.2.1 Расчет праймеров и зонда

Расчет праймеров и олигонуклеотидного зонда осуществляли с помощью программы «Oligo 4.0» на основе представленной в GenBank нуклеотидной последовательности фрагмента гена ДНК-полимеразы герпесвируса сибирского осетра [GI:288975339].

2.2.2 Выделение ДНК

При выделении вирусной ДНК использовали метод нуклеосорбции [R. Boom., 1990].

2.2.3 Оценка специфичности тест-системы

Для оценки специфичности тест-системы использовали пробы, содержащие ДНК герпесвируса сибирского осетра. В качестве отрицательных образцов - пробы органов от здоровых рыб, интактных культур клеток и гетерологичных вирусов.

2.2.4 Оценка аналитической чувствительности тест-системы

При оценке аналитической чувствительности тест-системы использовали серию последовательных десятикратных разведений образцов культурального материала герпесвируса, штамм SK1/0406 с титром инфекционной активности 7,1 lg ТЦД50/см3.

2.2.5 Оценка воспроизводимости тест-системы

Оценку воспроизводимости результатов обнаружения ДНК герпесвируса сибирского осетра с помощью разработанной тест-системы осуществляли путём анализа 8 образцов патматериала от клинически больного сибирского осетра, который выполняли независимо три квалифицированных специалиста лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

2.2.6 Нуклеотидное секвенирование и филогенетический анализ штамма SK1/0406 и изолятов герпесвируса сибирского осетра

Выделение продуктов амплификации из реакционной смеси осуществляли коммерческим набором («DNA purification kit» (Fermentas, Латвия), с последующей реамплификацией фрагментов при помощи компонентов «BigDye v. 3.1. Terminator» (Applied Biosystems, США). Реакцию с дефектными дезок-ситрифосфатами проводили в параллелях с прямым и обратным праймерами при следующих температурных режимах: 95 °С-10 секунд, 50 °С - 20 секунд, 60 °С - 4 минуты- всего 25 циклов. По окончании реакции к смеси добавляли 45 мкл 96 % этанола и 2,5 мкл 125 мМ EDTA, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10-15 минут. Затем пробы центрифугировали в течение 10-15 минут при 10000g, супернатант удаляли, а осадок промывали 75 % этанолом по той же схеме с 10-15 минутной экспозицией при комнатной температуре. Осадок после центрифугирования подсушивали, аккуратно рас-

творяли в 10-12 мкл формамида (Applied Biosystems, США). Полученную смесь денатурировали при 94 °С в течение нескольких минут и резко охлаждали во льду. Секвенирование проводили в автоматическом анализаторе Genetic Analyzer 3130XL (Applied Biosystems, США).

Данные, полученные после постановки капиллярного электрофореза, обрабатывали с помощью пакета прикладных программ SeqSqape 2.6 (Applied Biosystems) и BioEdit 7.0.

Филогенетические древа строили с использованием метода присоединения соседей; расчёт эволюционных дистанций осуществляли по алгоритму р-дистанций в программе «MEGA 5.0».

2.2.7 Культивирование герпесвируса сибирского осетра в перевиваемых культурах клеток осетровых рыб и определение его инфекционной активности

Герпесвирус сибирского осетра культивировали в перевиваемых культурах клеток в статических условиях с питательной средой 199 или 2МЕМ, содержащей 2 % фетальной сыворотки КРС, при температуре (15±0,5) °С в течение 6-12 суток до наступления 90-100 % цитопатогенного действия. Вирус вносили в дозе 0,1-0,01 ТЦЦ50/клетка. Накопление вируса в клетках линии SSO-2 составляло Ю5,7±0,,° - ю6±0'10 ТЦЦ5о/см3. Вируссодержащий материал хранили при температуре плюс (4±0,5) °С не более одного месяца или длительно при минус (70±0,5) °С. Инфекционную активность герпесвируса определяли по общепринятой методике. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД5о/см3.

2.2.8 Экспериментальное заражение рыб

Для экспериментального заражения использовали клинически здоровых сеголетков сибирского осетра. Заражение рыбы проводили штаммом SK1/0406 герпесвируса сибирского осетра методом ванн.

2.2.9 Выделение вируса от зараженных рыб

Отбор и подготовку патологического материала для исследований проводили в соответствии с действующими международными и отечественными нормативными документами по вирусологическому

исследованию рыб [Методические указания по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб; Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. 6th ed. - Paris: Office International des Épizooties, 2009].

2.2.10 Программное обеспечение и интернет-ресурсы

Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с использованием алгоритма «Clustal W» программы «Bio Edit 7.0». Дизайн олигонуклеотидных праймеров и зондов осуществляли в программе «Oligo 4.0». Специфичность рассчитанных олигонуклеотидов проверяли при помощи интернет-ресурса BLAST [blast.ncbi.nlm.nih.gov].

2.2.11 Статистическая обработка результатов исследований

Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами

[Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М.: Высшая школа, 1990. - 352 е.].

2.3 Результаты собственных исследований

2.3.1 Разработка тест-системы для выявления генома герпесвируса сибирского осетра на основе ПЦР в режиме реального времени

В связи с отсутствием в литературе информации о разработке и применении молекулярно-биологических методов для выявления генома герпесвируса сибирского осетра одним из этапов нашей работы было создание тест-системы на основе ПЦР в режиме реального времени для идентификации генома данного вируса.

Основными задачами этого этапа исследований являлись расчет специфичных праймеров и зонда, оптимизация условий постановки реакции, оценка аналитической специфичности и чувствительности тест-системы для идентификации герпесвируса сибирского осетра.

На основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генома герпесвируса сибирского осетра были рассчитаны специфичные праймеры, комплементарные гену ДНК-полимеразы (как наиболее хорошо изученному гену герпесвирусов рыб), фланкирующие фрагмент длиной 89 п.о. и флуоресцентный зонд SbSHVl-Z, комплементарный внутреннему фрагменту выбранного участка и несущий в качестве флуоресцентного красителя молекулу F AM на 5'-конце, а в качестве тушителя флуоресценции — гаситель

BHQ1 на 3'-конце.

В процессе оптимизации условий постановки ПЦР в режиме реального времени были опробованы различные режимы амплификации, буферные системы, концентрации ионов Mg2+ и dNTP. Оптимальными параметрами амплификации ДНК герпесвируса сибирского осетра является реакционная смесь объемом 25 мкл, содержащая 10 мкл деионизированной воды, 5 мкл 5 х ПЦР буфера, 2 мкл 25 мМ MgCb, по 1 мкл прямого и обратного праймера (10 пмоль), 0,5 мкл зонда (5 пмоль), 0,5 мкл dNTPs (10 пмоль), 0,25 ед. Taq- поли-меразы, 5 мкл исследуемой ДНК.

Оптимизацию температурного режима амплификации проводили на приборе Rotor Gene 6000. Оптимальный температурный режим и количество циклов составили: 3 минуты предварительной денатурации при 95 °С (1 цикл); денатурация при 95 °С - 16 секунд, отжиг праймеров при 62 °С - 26 секунд, элонгация при 71 °С - 26 секунд (5 циклов); денатурация при 95 °С - 16 секунд, отжиг праймеров 62 °С - 26 секунд - детекция, элонгация 71 °С - 26 секунд (35 циклов).

Результаты амплификации учитывали путем анализа кривых флуоресценции, после завершения реакции. Флуоресценцию измеряли при 62 °С по каналу Green (FAM).

23.2 Определение специфичности тест-системы для выявления герпесвируса сибирского осетра

При проверке специфичности тест-системы в качестве матриц была использована ДНК, выделенная из 41 пробы, в том числе 16 заведомо положительных и 25 заведомо отрицательных. Результаты исследования данных проб с помощью ПЦР в режиме реального времени были сравнены с результатами выделения вируса в культуре клеток, что наглядно представлено в таблице 1.

Таблица 1 - Определение специфичности тест-системы для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра___п=3_

№ Образцы вирусного материала Результаты Результаты выделения

п/п ПЦР-РВ вируса в культуре клеток

Культуральный материал

1 шт. 8К1/0406 + +

2 изолят БК2/0506 + +

3 изолят ВК/0506 + +

4 изолят 8170708 + +

5 изолят 8Р1/1108 + +

6 изолят 8А7/0310 + +

7 изолят 1188/0111 + +

В изолят 888/0111 + +

Патматериал от зараженного сеголетка сибирского осетра

9 Слизь с поверхности тела + +

10 Ротовой аппарат + +

11 Жабры + +

12 Грудной плавник + +

13 Печень + +

14 Почка + +

15 Селезенка + +

16 Сердце + +

Штаммы гетерологичных вирусов

17 шт. 8УСУ-ЗЛ4 вируса весенней веримии карпа - -

18 шт. 1НЫУ-10 Ж-3 вируса инфекционного некроза гемо-поэтической ткани - -

19 шт. 1РЫУ-ЛЬ финский вируса инфекционного некроза поджелудочной железы - -

20 шт. СС1У-4БЖ иридовируса карпа - -

21 шт. «Бук» вируса болезни Ауески - -

22 шт. «ТК-А/К» вируса инфекционного ринотрахеита КРС - -

23 шт. «НТ» вируса инфекционного ларинготрахеита кур - -

Интактные контрольные культуры клеток

24 580-1 пул печени, почки и селезенки

25 880-2 пул печени, почки и селезенки - -

27 плавники - -

28 ввИ-г плавники - -

29 WSS-2 селезенка - -

30 \VSSK-1 кожа - -

Биологический материал от здорового сеголетка сибирского осетра

31 Слизь с поверхности тела рыб - -

32 Грудной плавник - -

33 Селезенка - -

34 Сердце - -

35 Печень - -

36 Почка - -

37 Жабры - -

38 Мозг - -

39 Задний отдел кишечника - -

40 Отрицательный контроль - -

41 Положительный контроль + +

Примечание: «+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат

В результате исследований ДНК герпесвируса сибирского осетра выявлена в пробах культурального вируссодержащего материала и пробах органов от инфицированных рыб. Показано, что геном герпесвируса сибирского осетра не выявляется при использовании в качестве матриц препаратов ДНК, экстрагированной как из проб органов здоровых осетров, так и гетерологичных вирусов и интактных культур клеток. Таким образом, показано, что тест-система обладает 100 % специфичностью.

Результаты выявления вируса методом ПЦР в режиме реального времени полностью совпали с результатами выделения вируса в культуре клеток. 2.3.3 Оценка аналитической чувствительности тест-системы Аналитическую чувствительность тест-системы определяли амплификацией ДНК герпесвируса сибирского осетра, выделенной из последовательных десятикратных разведений образцов культурального герпесвируса сибирского осетра. В качестве исходного материала использовали штамм 8К1/0406 с титром инфекционной активности 7,1 ТЦД50/см3. Пределом чувствительности считали максимальное разведение, при котором регистрировали положительный результат.

ПК 'й ш г» з®

Рисунок 1 - Результаты ПЦР-РВ на матрице последовательных десятикратных разведений герпесвируса сибирского осетра, штамм БК1/0406 1 - исходный материал 7,1 ^ ТЦЦ зо/см3; 2-6,1 ^ТЦЦ зо/см3; 3 - 5,1 ТЦЦ 50/см3; 4 - 4,1 1ёТЦЦ 50/см3.; 5-3,1 ^ТЦД5(/см3; 6-2,1 ^ТЦЦ 50/см3; 7 — 1,1 1е ТЦЦ 50/см;3 8 - 0,1 ^ ТЦЦ 50/см3

В результате проведенных исследований установлено, что рассчитанное значение аналитической чувствительности тест-системы для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени составляет 3,1 ^ ТЦД50/см3.

23.4 Оценка повторяемости результатов, полученных при использовании тест-системы

Применение испытуемой тест-системы позволило трем независимым исследователям выявить заведомо положительные образцы, содержащие ДНК герпесвируса сибирского осетра. Ложноположительные результаты при исследовании заведомо отрицательных образцов получены не были. Это свидетельствует о воспроизводимости результатов, получаемых разными исследователями с помощью предлагаемой тест-системы (таблица 2).

Таблица 2 - Оценка повторяемости результатов, полученных при использовании тест-системы_п=3_

Наименование биологиче- Результаты, полученные

№ ского материала исследователями

пробы (пробы органов от клини- 1 2 3

чески больного сеголетка Значение по- Значение по- Значение порогово-

сибирского осетра) рогового цикла (С,) рогового цикла (С,) го цикла (СО

1 Ротовой аппарат 17,13±0,15 17,02±0,24 17,17±0,10

2 Селезенка 16,11±0,06 16,05±0,09 16,14±0,01

3 Жабры 13,34±0,10 13,44±0,04 13,46±0,02

4 Грудной плавник 15,60±0,05 15,40±0,22 15,56±0,07

5 Сердце 16,25±0,23 16,45±0,06 16,26±0,21

6 Почка 13,65±0,22 13,49±0,34 13,82±0,08

7 Слизь 13,54±0Д7 13,78±0,05 13,75±0,12

8 Печень 16,93±0,25 17,13±0,11 17,11 ±0,09

9 К- Нет значений Нет значений Нет значений

10 К+ 10,09±0,03 10,06±0,09 10,14±0,07

Таким образом, разработанная тест-система позволяет выявлять ДНК герпесвируса сибирского осетра.

В результате проведенных исследований по отработке режимов и условий проведения ПЦР в режиме реального времени разработана «Тест-система для

выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени». Специфичность, чувствительность тест-системы подтверждены комиссионными испытаниями (Акт от 31.10.2011г.). «Методические положения по выявлению ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени» утверждены академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, академиком Россельхозакадемии A.M. Смирновым 28.05.2012 г.

2.3.5 Схема подготовки проб различных органов и тканей рыб и оценка их диагностической ценности

Для исследования использовали слизь с поверхности тела и пробы органов от инфицированных или погибших рыб. Пробы органов массой не более 50-150 мг каждая, отбирали в пробирки типа Eppendorf - с 200 мкл бидистилли-рованной воды. Слизь отбирали ватными тампонами и также помещали в пробирки. Для выделения ДНК использовали 10 % суспензию органов и тканей, экстракт органов и тканей сеголетков сибирского осетра, а также слизь, разведенную в бидистиллированной воде в соотношении 1:1.

Для получения экстракта кусочки органов и тканей помещали в чистую пробирку типа Eppendorf на 1,5 мл и заливали 150-200 см3 бидистиллированной воды или физраствора. Пробирку с пробой инкубировали в течение 5 минут при температуре 64 °С в твердотельном термостате. Затем пробу центрифугировали при максимальных оборотах в течение 1 минуты, супернатант переносили в чистую пробирку и использовали для выделения ДНК герпесвируса сибирского осетра.

Органы и ткани измельчали, растирали со стерильным кварцевым песком и готовили на физрастворе 10% суспензию, которую осветляли центрифугированием. Надосадок использовали для выделения ДНК вируса.

Выделение ДНК из проб патологического материала проводили по модифицированной методике Boom et al. (1990). Для этого, к 100 мкл исследуемых образцов добавляли 500 мкл лизирующего раствора, содержащего 6М ГТЦ, инкубировали при температуре 64 °С в течение 5 минут. Далее добавляли

30 мкл силикатного сорбента, тщательно перемешивали на смесителе типа «Vortex» и инкубировали в течение 5 минут при температуре 64 °С. После этого осаждали сорбент центрифугированием в течение 30 секунд при 13000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость и добавляли к осадку 500 мкл отмывочного раствора, суспендировали и инкубировали пробы при той же температуре 5 минут. Сорбент осаждали центрифугированием в течение 30 секунд, надосадочную жидкость декантировали. К осадку добавляли 600 мкл 75 % этанола, перемешивали, центрифугировали 15 секунд, надосадочную жидкость удаляли. Осадок подсушивали в течение 10 минут при 64 °С в пробирках с открытой крышкой. К осадку добавляли 50 мкл бидистилированной воды для элюирова-ния ДНК с сорбента, перемешивали смесителе типа «Vortex» и инкубировали 2 минуты при 64 °С в закрытых пробирках. Перемешивали и инкубировали при тех же условиях 5 минут, вновь перемешивали и центрифугировали в течение 30 секунд при 13000 об/мин. Отобранную надосадочную жидкость использовали для проведения ПЦР в режиме реального времени.

В результате проведения ПЦР в режиме реального времени геном вируса выявлялся в пробах слизи, 10 % суспензии органов и тканей, экстрактов органов и тканей рыб.

Для определения наиболее ценного диагностического материала проводили экспериментальное заражение сеголетков сибирского осетра, с последующим вирусовыделением на культуре клеток SSO-2. В результате эксперимента было установлено, что вирус в больших титрах накапливается в слизи (8,65±0,18 ТЦД50/см3), плавниках (9,10±14 lg ТЦД5о/см3), жабрах (8,53±0,15 lg ТЦД50/см3), ротовом аппарате (7,81±0Д) lg ТЦД50/см3), из внутренних органов наиболее высокое содержание вируса отмечалось в печени (8,15±0,12 lg ТЦД50/см3).

В результате проведенных исследований установлено, что вирус выявляется во всех исследованных пробах, но при этом исследование слизи и плавников позволяет проводить прижизненную диагностику.

2.3.6 Сравнительная эффективность выявления гериесвируса сибирского осетра на основе ПЦР в режиме реального времени и вирусовыделе-ния в культуре клеток

Для сравнения эффективности выделения вируса нами были проведены исследования 50 сеголетков сибирского осетра 3-месячного возраста завезенных из ООО СМП «Энергетик - Э» Московской области. Молодь выглядела клинически здоровой, активно питалась и росла. Перед началом работ было проведено лабораторное диагностическое исследование завезенной молоди на наличие возможных вирусных инфекций. В результате исследования патогенных агентов обнаружено не было, геном герпесвируса сибирского осетра обнаружен не был. Экспериментальное заражение рыб герпесвирусом сибирского осетра проводили методом ванн (штамм 5К1/0406; доза заражения - 104'1 ТЦД50/см3) Для этого рыбу помещали в бак с 30 л аэрируемой воды, в которую вносили вирус до конечной концентрации 104,1 ТЦД50/см3. Экспозиция 1 час при температуре воды 15-17 °С. После заражения рыбу содержали в 120-литровых аквариумах с проточной аэрируемой водой при температуре 14 - 16 °С и кормили форелевым комбикормом АК-2ФП + 3 % растительного масла. Контрольную группу рыб содержали в отдельном аквариуме при тех же условиях.

Через две недели после заражения появились первые признаки болезни -угнетение рыбы и отказ от корма. Большинство больных осетров лежало неподвижно на дне емкости. У больных особей наблюдали развитие заболевания со следующими клиническими признаками: кровоизлияния на вентральной стороне рострума, вокруг сифона (ротового отверстия), в межлучевой ткани грудных плавников, также отмечали экзофтальмию и анемию жабр. На 16-ые сутки началась гибель осетров с характерными признаками некрогеморрагического синдрома. Клинический материал, для изучения сравнительной эффективности выявления герпесвируса сибирского осетра в материалах от рыб методом ПЦР в режиме реального времени и выделения вируса в культуре клеток, отбирали на разных стадиях течения болезни.

В инкубационном периоде для выделения вируса в культуре клеток и для ПЦР-анализа отобрали пробы слизи с поверхности тела рыб и кусочки плавников. В период развития болезни, когда клинические признаки были ярко выражены, пробы слизи с поверхности тела рыб, кусочки плавников и внутренних органов погибших рыб. В период реконвалесценции материалом для исследования являлись кусочки плавников, внутренних органов и слизь убитых рыб. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты сравнительной эффективности выявления герпе-свируса сибирского осетра в материалах от рыб с помощью ПЦР в режиме реального времени и в культуре клеток____

Л п / п Стадии инфекционного процесса Сутки после заражения Вид материала, взятый на исследования Количество проб Выявление генома герпе-свируса сибирского осетра методом ПЦР-РВ Выделение вируса в культуре клеток ББО-г

«+» «-» «+» «-»

1 Инкубационный 7 слизь 40 24 16 12 28

период плавники 40 24 16 12 28

10 слизь 40 28 12 14 26

плавники 40 28 12 14 26

2 13 слизь 40 40 0 40 0

плавники 40 40 0 40 0

16 слизь 40 40 0 40 0

плавники 40 40 0 40 0

Период развития Пробы внутренних огранов * 8 8 0 8 0

болезни 19 слизь 32 32 0 32 0

плавники 32 32 0 32 0

Пробы внутренних огранов * 14 14 0 14 0

23 слизь 18 18 0 18 0

плавники 18 18 0 18 0

Пробы внутренних огранов * 10 10 0 10 0

3 Период 32 слизь 8 8 0 2 6

реконвалесценции плавники 8 8 0 2 6

56 слизь 8 8 0 1 7

плавники 8 8 0 1 7

Пробы внутренних огранов * 8 8 0 1 7

Примечание: * печень, почки, селезенка, сердце

Таким образом, результаты исследований показали, что по эффективности выявления герпесвируса сибирского осетра в инкубационном периоде и в период реконвалесценции метод ПЦР в режиме реального времени значительно превосходит традиционный метод вирусовыделения в культуре клеток.

2.3.7 Конструирование рекомбинантного положительного контроля С целью получения положительного контроля амплификации к тест-системе для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени на основе плазмидного вектора pTZ57R (Fermentos) создали рекомбинантную конструкцию, несущую участок гена ДНК-полимеразы герпесвируса сибирского осетра штамм SK1/0406.

На матрице последовательных десятикратных разведений полученной рекомбинантной плазмиды провели количественную ПЦР в режиме реального времени, позволяющую определить число молекул ДНК в исследуемых вируссодержащих образцах. На основании полученных данных подобрана оптимальная концентрация плазмиды в качестве матрицы для постановки ПЦР в режиме реального времени, которая составляла 7500 копий на реакцию (1:10"7) (рисунок 2).

L I йкеава^нагге^дкапР&эъзгшага*! 11CW?*-тшад I- »дакиижШВЖ??»- тпяшнэдиГОМКатамаоаааидо

ОВД» ГДйавадаюга!.' 111 (MíOiWSt- Шзваажвж! 11МИИЖ

Рисунок 2 - Серия десятикратных разведений рекомбинантной плазмиды, несущей вставку участка гена ДНК-полимеразы

Таким образом, сконструированный рекомбинантный вектор может быть использован в разработанной тест-системе для выявления генома герпесвируса

сибирского осетра с помощью ПЦР в режиме реального времени в качестве положительного контроля амплификации фрагмента генома данного вируса. 2.3.8 Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса Нами была проведена работа по идентификации цитопатогенного агента выделенного при вирусологическом обследовании рыбоводного хозяйства г. Ижевск, который по характеру ЦПД отличался от штамма 8К1/0406 и изолятов, выделенных в европейской части страны. Данный изолят (БГгб/ОЗ 11) был идентифицирован в реакции нейтрализации с референсной гипериммунной антисывороткой как герпесвирус сибирского осетра (индекс нейтрализации 103,2 при разведении антисыворотки в реакционной смеси 1:100).

Для сравнительной характеристики штамма 8К1/0406 и выделенных изолятов был определен нуклеотидный состав фрагментов, полученные последовательности выравнены и сопоставлены. В результате определения нуклеотидных последовательностей у изолята 81гб/0311 было выявлено 49 нуклеотидных замен по сравнению со штаммом БК1/0406.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательности участка гена ДНК-полимеразы показал, что все изоляты герпесвируса сибирского осетра, выявленные на территории Российской Федерации, на 98 % гомологичны со штаммом 8К1/0406 герпесвируса сибирского осетра, изолят 8!г6/0311 герпесвируса сибирского осетра образует отдельный кластер и на данный момент является единственным его представителем (рисунок 3).

1-1_

зга* :№

Рисунок 3- Дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения герпе-свирусов осетровых рыб: I - Российские штамм и изоляты; II - Американские штаммы

2.3.9 Мониторинговые исследования осетроводных хозяйств на наличие герпесвируса сибирского осетра

Разработанную тест-систему применяли при обследовании осетроводных хозяйств различных регионов Российской Федерации.

Полевые материалы от осетров отбирали в рыбоводных хозяйствах Псковской, Вологодской, Смоленской областей и республики Бурятия в связи с подозрением на герпесвирусную болезнь сибирского осетра или в ходе мониторинга хозяйств на данную инфекцию. Материал отбирали прижизненно для исследования параллельно тремя разными методами: а) вирусовыделение в культуре клеток; б) выявление вирусной ДНК методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени; в) обнаружение антител к вирусу в сыворотках крови обследуемых рыб. Данные по мониторинговым исследованиям представлены в таблице 4.

зввшм

{з+кж® яш-мии ] е«г-шж | валтгда | sa-.i-ti.si

Конаковский Ижевский

Таблица 4 - Данные по обследованным осетроводным хозяйствам

Регион Вид рыбы Месяц отбора Вид материала Количество проб ПЦР-РВ Культуры клеток Выявление антител (РН)

Псковская обл. сибирский осетр декабрь слизь 60 - - +

Вологодская обл. сибирский осетр декабрь слизь 60 + - +

Смоленская обл. сибирский осетр январь слизь 60 + + н.и.

русский осетр 20

Республика Бурятия байкальский осетр май грудные плавники 25 + + н.и.

Исследования показали, что инфекция, вызываемая герпесом сибирского осетра, в хозяйствах, имела место, о чем свидетельствует обнаружение ДНК вируса в исследованных пробах грудных плавников и слизи рыб, и противовирусных антител в сыворотках крови обследованных особей.

3 ВЫВОДЫ

1. Рассчитаны специфичные праймеры и зонд, оптимизированы условия постановки ПЦР для амплификации гена ДНК-полимеразы герпесвируса сибирского осетра.

2. Разработана тест-система для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени с аналитической чувствительностью 3,1 ТЦЦ50/см3, позволяющая выявлять геном вируса в пробах слизи, органов и тканей инфицированных рыб.

3. Отработана методика пробоподготовки и определена диагностическая ценность проб различных органов и тканей рыб для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени, на основании которой выбрана слизь живых рыб, в качестве материала для проведении прижизненной диагностики данной болезни.

4. Установлено, что по эффективности выявления герпесвируса сибирского осетра в инкубационный период и период реконвалесценции ПЦР в режиме реального времени значительно превосходит метод выделения вируса в культуре клеток.

5. Установлено, что изоляты SK2/0506, ВК/0506, SL/0708, SP1/1108, SA7/0310, SSS/0111, RSS/0111, выделенные на территории Российской Федерации, идентичны, и имеют сходство 98 % со штаммом SK1/0406 герпесвируса сибирского осетра, а изолят SIz6/0311 образует отдельный кластер и на данный момент является единственным его представителем.

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Специфичные оригинальные олигонуклеотидные праймеры и зонд предлагаются для использования в целях идентификации ДНК герпесвируса сибирского осетра.

Разработанная методика по выявлению ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени для обнаружения генома данного вируса с аналитической чувствительностью 3,1 ТЦЦ5о/см3

В качестве руководства по применению разработанной тест-системы рекомендуются « Методические положения по выявлению ДНК герпесвируса сибирского осетра методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 28.05.2012 г.

5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Разработка технологии ПЦР в реальном времени для выявления герпесвируса сибирского осетра в клиническом материале / И.М. Калабеков, Ф.С. Калабекова, Т.И. Щелкунова, И.С. Щелкунов, Д.В. Колбасов // Расширенные материалы III международной конференции «Проблемы иммунологии, патологи и охраны здоровья рыб» / Москва-Борок, 2011. - С. 303-305.

2. Выявление генома герпесвируеа сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени и ее применение при обследовании рыбоводных хозяйств / Ф.С. Калабекова, И.М. Калабеков, И.С. Щелкунов // Научный журнал КубГАУ, №82(08), 2012.

3. Разработка положительного контроля к тест-системе для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени / Ф.С. Калабекова, Щелкунов И.С. // Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» / Щелково, 2012. - С. 129-132.

4. Разработка ПЦР для идентификации герпесвируса сибирского осетра / Ф.С. Калабекова, Щелкунов И.С. // Материалы П-ой конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине» / Покров, 2012. - С. 84-86.

5. Further virus characterization, diagnostics and prevention of Siberian sturgeon herpesvirus disease / Igor Shchelkunov, Andor Doszpoly, Tatiana Shchelkunova, Fatima Kalabekova, Ismail Kalabekov, Dmitry Kurenkov // USA-Russia Bilateral Workshop On Aquaculture and FishHealth USGS Western Fisheries Research Center, Seattle, WA, USA October , 2012.

6. Detection of Siberian sturgeon herpesvirus genome by Real Time PCR and its application for fish farm survey / F. Kalabekova, I. Kalabekov, O. Kolbasova // 16th Intern. Simposium of the WAVLD, Berlin, Germany, 2013. P. 239.

6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

п.о. -пар оснований

ПЦР- полимеразная цепная реакция

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области. Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калабекова, Фатима Султанхамидовна, Покров

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной

вирусологии и микробиологии

На правах рукописи ^Ои&^П^

Калабекова Фатима Султанхамидовна

ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕРПЕСВИРУСА СИБИРСКОГО ОСЕТРА С ПОМОЩЬЮ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА

03.02.02 Вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

доцент Колбасова О.Л.

Покров - 2013

Содержание

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ................................................8

1.1 Актуальность работы.................................................................................8

1.2 Степень разработанности проблемы........................................................9

1.3 Цель и задачи исследований....................................................................10

1.4 Научная новизна результатов исследований.........................................11

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы..............................11

1.6 Степень достоверности и апробация работы.........................................11

1.7 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите...........................................................12

1.8 Публикации...............................................................................................13

1.9 Структура и объем диссертации.............................................................13

1.10 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту..............................................................................................................13

1.11 Личный вклад автора в выполнение работы........................................14

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................15

2.1 Состояние осетроводства в мире и проблемы его развития................15

2.2 Вирусы и вирусные болезни рыб............................................................16

2.3 Герпесвирусы рыб....................................................................................19

2.4 Герпесвирусы осеровых рыб...................................................................23

2.5 Герпесвирусная болезнь сибирского осетра..........................................24

2.6 Эпизоотологические особенности герпесвируса сибирского осетра..25

2.7 Свойства возбудителя герпесвируса сибирского осетра......................26

2.8 Клинические признаки и патологоанатомические изменения.............27

2.9 Диагностика герпесвирусной болезни сибирского осетра..................30

2.10 Профилактика герпесвирусной болезни сибирского осетра..............33

2.11 Филогенетический анализ генома герпесвирусов рыб.......................34

2.12 Заключение по обзору литературы.......................................................40

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.....................................................42

3.1 Материалы.................................................................................................42

3.1.1 Вирус....................................................................................................42

3.1.2 Рыба......................................................................................................43

3.1.3 Культуры клеток.................................................................................43

3.1.4 Плазмида и бактериальные штаммы.................................................43

3.1.5 Питательные среды, дезагрегирующие растворы, сыворотка и антибиотики..................................................................................................43

3.1.6 Растворы и реактивы..........................................................................44

3.1.7 Лабораторное оборудование и принадлежности.............................45

3.2 Методы.......................................................................................................46

3.2.1 Расчет праймеров и зонда..................................................................46

3.2.2 Выделение ДНК..................................................................................47

3.2.3 Оценка специфичности тест-системы..............................................47

3.2.4 Параметры постановки ПЦР с электрофоретической детекцией и ПЦР в режиме реального времени.............................................................47

3.2.5 Оценка аналитической чувствительности тест-системы................48

3.2.6 Оценка воспроизводимости тест-системы.......................................49

3.2.7 Нуклеотидное секвенирование и филогенетический анализ.........49

3.2.8 Культивирование герпесвируса сибирского осетра в перевиваемых культурах клеток осетровых рыб и определение его инфекционной активности....................................................................................................49

3.2.9 Экспериментальное заражение рыб..................................................50

3.2.10 Выделение вируса от зараженных рыб...........................................50

3.2.11 Программное обеспечение и интернет-ресурсы............................50

3.2.12 Статистическая обработка результатов исследований.................50

3.3 Результаты собственных исследований.................................................50

3.3.1 Разработка тест-системы для выявления генома герпесвируса сибирского осетра на основе ПЦР в режиме реального времени...........50

3.3.2 Определение специфичности тест-системы для выявления герпесвируса сибирского осетра................................................................54

3.3.3 Оценка аналитической чувствительности тест-системы................56

3.3.4 Оценка повторяемости результатов, полученных при использовании тест-системы......................................................................57

3.3.5 Схема подготовки проб различных органов и тканей рыб и оценка их диагностической ценности....................................................................59

3.3.6 Сравнительная эффективность выявления герпесвируса сибирского осетра на основе ПЦР в режиме реального времени и вирусовыделения в культуре клеток..........................................................61

3.3.7 Конструирование рекомбинантного положительного контроля амплификации к тест-системе для выявления генома герпесвируса сибирского осетра........................................................................................63

3.3.8 Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса.......66

3.3.9 Мониторинговые исследования осетроводных хозяйств на наличие герпесвируса сибирского осетра.................................................74

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ........................80

5. ВЫВОДЫ......................................................................................................86

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.....................................................87

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...................................88

ПРИЛОЖЕНИЯ.............................................................................................104

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотные основания Бестер - гибрид белуга х стерлядь; БОЕ - бляшкообразующая единица;

ВНИИВВиМ - Всероссийский научно-исследовательский институт

ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии;

ВНИТиБП - Всероссийский научно-исследовательский и технологический

институт биологической промышленности;

ВВК - весенняя виремия карпа;

ВГС - вирусная геморрагическая септицемия;

ГНУ - государственное научное учреждение;

ГТЦ - гуанидинтиацианат;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ИФА - иммуноферментный анализ;

КЗТО - Конаковский завод товарного осетроводства;

КЗ-контрольное заражение;

мРНК - матричная РНК;

НТР - нетранс л ируемый регион;

MEM - минимально необходимая среда Игла;

мкл - микролитр;

мМ - миллимоль;

МЭБ - Международное Эпизоотическое Бюро;

НТД-нормативно-техническая документация

н.о. - нуклеотидные основания;

нм - нанометр;

п.о.- пар оснований;

ПК - положительный контроль;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

PH - реакция нейтрализации;

РТГА - реакция торможения гемагглютинации;

РФ - Российская Федерация;

С - цитозин;

СПК - сыворотка крови плода коровы; США -Соединенные Штаты Америки; Т - тимидин;

ТАЕ - трис-ацетатный буфер; ТУ-технические условия;

ТФ ИФА - твердофазный иммуноферментный анализ;

ТЦД5о - тканевая цитопатогенная доза, вызывающая поражение 50%

ФГУ - федеральное государственное учреждение;

ФГУП ВНИИПРХ - Федеральное государственное унитарное предприятие

Всероссийский научно-исследовательский институт пресноводного

рыбного хозяйства;

ЦПД - цитопатогенное действие;

ЦПЭ - цитопатический эффект;

ЭДТА (EDTA) - этилендиаминтетрауксусная кислота;

2МЕМ - минимально необходимая среда Игла с двойным набором;

А - аденин;

dNTPs - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты; F - прямой праймер (forward); G - гуанидин;

IHN - инфекционный некроз гемопоэтической ткани лососевых; IPN - инфекционный некроз поджелудочной железы; R - обратный праймер (reverse); SbSHV - герпесвирус сибирского осетра;

SSO-2- перевиваемая линия клеток пула печени, почки, селезенки сибирского осетра, Acipenser baeri;

VHSV - вирусная геморрагическая септицемия

WSS-2 - перевиваемая линия клеток селезенки белого осетра, Acipenser trans montanus.

SPD -Болезнь поджелудочной железы атлантического лосося/

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность работы

В связи с угрозой исчезновения ценных видов осетровых рыб и возрастающим спросом на товарную осетровую продукцию в последние годы все большее развитие получает индустриальное осетроводство. В то же время интенсификация аквакультуры осложняется возникновением болезней гидробионтов. По данным Международного эпизоотического бюро основной ущерб мировой аквакультуре наносят вирусные болезни рыб [39].

В середине восьмидесятых годов двадцатого века в США от осетровых рыб был выделен первый вирус - иридовирус [36]. В результате мониторинга внутренних водоемов страны и регулярных обследований рыбоводных хозяйств позднее были выделены и другие вирусы от осетровых рыб. В настоящее время у североамериканских осетровых обнаружено 10 разных вирусов, из которых наиболее опасны - аденовирус, иридовирус и два герпесвируса белого осетра. Эти вирусы вызывают болезни у мальков и сеголетков белого осетра, являющегося главным объектом осетроводства США [36; 75; 76]. Помимо США вирусы у осетровых были обнаружены в Италии и Бельгии [69].

Первое сообщение об обнаружении вирусной болезни осетровых рыб, в Российской Федерации, появилось в 2006 г., когда в весенний период в Тверской области на Конаковском заводе товарного осетроводства началась массовая гибель молоди сибирского осетра {АЫрепзег Ъаегг) с признаками некрогеморрагического синдрома, типичными для герпесвирусной инфекции. Выявленный патоген был изучен и идентифицирован как герпесвирус сибирского осетра [23].

Мировая аквакультура развивается столь высокими темпами, что возможности ветеринарной науки по разработке средств и методов борьбы с болезнями существенно отстают от запросов практики. Исходя из этого,

МЭБ определило главным направлением борьбы с болезнями культивируемых гидробионтов профилактику заболеваний, основным принципом которой является предотвращение проникновения патогенов в регионы, где они прежде отсутствовали. Это достигается путем проведения эпизоотологического мониторинга на рыбоводных предприятиях и регулированием межхозяйственных перевозок объектов разведения с учетом полученных при этом результатов.

В настоящее время в Российской Федерации утвержден только один метод идентификации выделяемых изолятов герпесвируса сибирского осетра - реакция нейтрализации с использованием референсной гипериммунной антисыворотки, получаемой во ВНИИВВиМ [30].

Данная реакция обладает известными достоинствами, но требует предварительного выделения вируса в культуре клеток, и поэтому ее использование затруднено при исследовании большого количества полевых материалов. Существенным недостатком реакции является невозможность определения с ее помощью филогенетических взаимоотношений выделенных изолятов, что достигается только с использованием молекулярно-биологических методов, в том числе и ПЦР, которая является главным инструментом активно развивающейся сегодня молекулярной эпизоотологии вирусных инфекций рыб [19].

1.2 Степень разработанности проблемы

Изучению биологических, физико-химических и в меньшей мере молекулярно-генетических свойств герпесвируса сибирского осетра посвящена работа А.И. Щелкунова. В данной работе представлено описание выявленной болезни и свойств вируса-возбудителя, оптимизированы условия его культивирования, определено таксономическое положение [20].

Работа И.Б. Прокаевой посвящена изучению гуморального иммунного ответа осетровых рыб при герпесвирусной болезни сибирского

осетра, предложен способ выявления противогерпетических антител в сыворотках крови осетровых рыб на основе твердофазного иммуноферментного анализа для ретроспективной диагностики данной болезни [16].

Однако недостаточно изучены молекулярно-генетические свойства выделенных изолятов герпесвируса сибирского осетра [58; 59]. Не разработаны методы молекулярно-генетической диагностики герпесвирусной инфекции осетровых рыб, основанных на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР), отличающихся высокой чувствительностью и специфичностью получаемых результатов [142].

1.3 Цель и задачи исследований

Целью исследования являлась разработка тест-системы для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра на основе ПЦР в режиме реального времени и проведение молекулярно - генетического анализа изолятов вируса.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) С использованием данных ОепВапк рассчитать специфичные праймеры и зонд, определить оптимальные условия проведения ПЦР в режиме реального времени;

2) Разработать тест-систему для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени и рекомбинантный положительный контроль для тест-системы;

3) Отработать методику пробоподготовки и оценить диагностическую ценность проб различных органов и тканей рыб для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени;

4) Определить филогенетические взаимоотношения выделенных изолятов герпесвируса сибирского осетра.

и

1.4 Научная новизна результатов исследований

Впервые разработана тест-система на основе ПЦР в режиме реального времени для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра в пробах инфицированных культур клеток, органов и тканей рыб.

Впервые в Российской Федерации определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена ДНК-пролимеразы штамма SK1/0406 и изолятов герпесвируса сибирского осетра, выделенных на территории нашей страны.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Разработана методика выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени.

Проведен молекулярно-генетический анализ участков гена ДНК-полимеразы штамма SKI/0406 и 8 изолятов герпесвируса сибирского осетра, выделенных в период 2006-2013 гг., и изучены их филогенетические взаимоотношения.

Разработаны «Методические положения по выявлению ДНК герпесвируса сибирского осетра методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 28.05.2012 г.

1.6 Степень достоверности и апробация работы

Степень достоверности результатов проведённых исследований подтверждена статистическими исследованиями и комиссионными испытаниями. Акт комиссионных испытаний утвержден директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 31.10.2011 г. Статистическая обработка включала расчёты средних арифметических значений, стандартных отклонений результатов полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, вычисления эволюционных дистанций с помощью программы «MEGA 5.0». Научные положения, выводы и практические

предложения диссертационной работы аргументировано отражают содержание диссертации.

Результаты исследований, выполненных по теме диссертационной работы, представлены, заслушаны и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (Покров 2010-2013 гг.), Международной научно-практической конференции (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, Покров, 2011 г.), Международной конференции «Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов» (Борок - Москва, 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (УГСХА им. П.А. Столыпина, Ульяновск, 2012 г.; ГНУ ВНИТиБП Россельхозакадемии, Щелково, 2012 г.).

1.7 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите

В соответствии с формулой специальности 03.02.02 Вирусология, охватывающей проблемы исследования вирусов, генетики, биохимических и молекулярно-генетических аспектов, разработки мер диагностики вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследований: проблемы генетики вирусов, структурной организации генома вирусов, проблемы генной инженерии, разработки мер диагностики вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем, в диссертационной работе описано проведение исследований по созданию тест-системы на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, использование которой позволяет идентифицировать ДНК герпесвируса сибирского осетра. Также представлены результаты разработки рекомбинантной конструкции на основе плазмидного вектора, применяемого в качестве положительного контроля амплификации в данной тест-системе. Определены нуклеотидные последовательности

участка гена ДНК- полимеразы штамма ЭК 1/0406 и 8 изолятов герпесвируса сибирского осетра, выделенных на территории Российской Федерации. Проведён филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей, пол