Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Формирование резистентности у вируса простого герпеса к Н-фосфонату ацикловира

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Формирование резистентности у вируса простого герпеса к Н-фосфонату ацикловира"

Гуськова Анна Алексеевна

Формирование резистентности у вируса простого герпеса к Н-фосфонату ацикловира.

03.01.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 МЛР ¿С'2

Москва

— 2012

005014329

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН, в Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, в Учреждение Российской академии наук Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук, Скоблов Юрий Самойлович

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Дмитрий Владимирович Муха (ИОГен РАН)

Кандидат биологических наук Сергей Борисович Акопов (ИБХ РАН)

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова» Российской академии медицинских наук

Защита состоится 28 марта 2012 года в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении . науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу 117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН. Автореферат разослан 24 февраля 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук

В.А.Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Одним из самых распространенных патогенов человека является вирус простого герпеса первого типа (ВПГ-1). По данным всемирной организации здравоохранения носителями данного вируса являются 95% населения Земли. У большинства инфицированных людей данное заболевание протекает в виде везикулярных высыпаний на слизистых оболочках. Однако при иммунодефицитном состоянии пациента, которое может быть вызвано ВИЧ-инфекцией или процедурами, необходимыми при пересадке органов, ВПГ-1 часто приводит к летальному исходу. ВПГ-1, попадая внутрь организма, остаётся там пожизненно. В настоящий момент не разработано лекарственных средств, которые полностью уничтожали бы ВПГ-1. За последние полвека было предложено много антигерпетических средств различной природы, однако, наибольшее распространение получили модифицированные нуклеозиды, в том числе ациклические нуклеозидные аналоги (ацикловир, ганцикловир и др.), некоторые из них вошли в широкую медицинскую практику для терапии герпетических инфекций.

Механизм действия таких нуклеозидных препаратов хорошо известен. Сначала при помощи вирусного фермента - тимидинкиназы - осуществляется фосфорилирование нуклеозида до нуклеозид-5 '-монофосфата, затем происходят два последовательных фосфорилирования с использованием ферментов клетки-хозяина до соответствующего трифосфатного производного нуклеозида. На следующем этапе, полученный модифицированный нуклеотид включается вирусспецифической ДНК-полимеразой во вновь синтезируемую цепь ДНК, что приводит к терминации биосинтеза вирусной ДНК.

Однако длительное применение нуклеозидных антигерпетических препаратов приводит к появлению штаммов ВПГ-1, устойчивых к действию этих соединений. Резистентность ВПГ-1 к нуклеозидным препаратам обусловлена одним из следующих факторов или их сочетанием: (а) полной потерей активности, изменением субстратной специфичности или понижением экспрессии вирусной тимидинкиназы, (б) понижением активности или изменением субстратной специфичности вирусной ДНК-полимеразы. Появление таких резистентных к антигерпетическим препаратам штаммов ВПГ-1 вынуждает вести поиск новых лекарственных препаратов. Данная работа является частью этого исследовательского направления. Цель и задачи исследования.

Целью данной работы является изучение механизма формирования резистентности к Н-фосфонату ацикловира у ВПГ-1.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выделение и энзимологическая характеристика тимидинкиназы ВГ1Г-1 эталонного для России штамма 12.

2. Изучение мутаций в гене тимидинкиназы ВПГ-1, приводящих к возникновению резистентности к Н-фосфонату ацикловира.

3. Изучение мутаций в гене ДНК-полимеразы ВПГ-1, приводящих к возникновению резистентности к Н-фосфонату ацикловира.

Научная иовизна полученных результатов. В данной работе впервые биохимически охарактеризована тимидинкиназа ВПГ-1 эталонного для России штамма L2. Установлены нуклеотидная и аминокислотная последовательности вирусной тимидинкиназы для штаммов ВПГ-1, резистентных к Н-фосфонату ацикловира, для лабораторного штамма L2/R, являющегося глубоко резистентным к ацикловиру и для эталонного в России штамма L2. Выявлены мутации в генах ВПГ-1 UL23 и UL30 (соответственно тимидинкиназы и ДНК-полимеразы), которые могут обуславливать резистентность штаммов ВПГ-1 к антигерпетическим препаратам (ацикловиру, Н-фосфонату ацикловира).

Обнаружено, что Н-фосфонат ацикловира взаимодействует с тимидинкиназой вируса и оказывает на нее ингибирующее действие. Обнаружен необычный спектр распределения мутаций у штаммов ВПГ-1, резистентных к Н-фосфонату ацикловира.

Практическая значимость результатов исследования. Данная работа является частью работ по исследованию новых антигерпетических средств. Полученные в данной работе результаты позволяют по-новому взглянуть на механизм действия противогерпетических препаратов и дают основу для получения в будущем новых более эффективных лекарственных средств. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов г. Новосибирск 2008 г.

Личный вклад автора в проведение исследования. Автором проведен биоинформатический анализ, выполнены молекулярно-генетические эксперименты по клонированию генов, проведены работы по характеристики фермента, сделан анализ, обработка и обобщение полученных результатов, написана и оформлена рукопись.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Внедрение результатов работы. Полученные результаты будут использованы в доклинических испытаниях Н-фосфоната ацикловира как антигерпетического препарата.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из оглавления, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Текст диссертации изложен на 100 страницах, содержит 15 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 135 источников отечественных и иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Н-фосфонат ацикловира (HpACV) (рис.1) является нуклеозидным аналогом, обладающим противогерпетическими свойствами. Данный препарат известен довольно давно, и, первоначально предполагалось, что, механизм его действия основан на том, что, попадая в клетку Н-фосфонат ацикловира, превращается в ацикловир, который действует как противовирусный агент. Но в ходе дальнейших исследований выяснилось, что некоторые штаммы ВПГ-1,

резистентные к ацикловиру, являются чувствительными к HpACV. Это указывает на то, что HpACV не может действовать только как предшественник ацикловира и, по-видимому, возможен другой механизм его действия. В данной работе мы пытались выяснить механизм действия HpACV как противогерпетического агента.

На первом этапе мы исследовали гены UL23 (тимидинкиназы) ВПГ-1 эталонного ацикловир чувствительного штамма L2 и лабораторного штамма L2/R, глубоко резистентного к ацикловиру. Мы предполагали, что биохимическая характеристика тимидинкиназ этих вирусов и отношение этих ферментов к HpACV поможет нам в дальнейших исследованиях. Сопоставляя структурные изменения в гене ТК этих штаммов и устойчивость этих вирусов к традиционным антигерпетическим агентам можно было получить информацию о «гене-мишени» для HpACV.

Одним из традиционных подходов к изучению механизма противовирусного действия модифицированного нуклеозида является получение и изучение вирусных мутантов, устойчивых к действию изучаемого соединения. Коллеги из Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН многократным пассированием эталонного штамма L2 в присутствии HpACV сумели получить популяцию ВПГ-1, резистентную к действию этого соединения, а также выделить из популяции мутантных вирусов несколько вирусных клонов. Для изучения возникшей резистентности необходимо было проанализировать штаммы чувствительные и резистентные к HpACV. Анализ спектра мутаций и их распределение в потенциальных генах-кандидатах на возникновение резистентности к HpACV позволяет определить, на каком уровне действует данный препарат.

В качестве генов-кандидатов для анализа мутаций мы отобрали гены UL23 (тимидинкиназы) и UL30 (ДНК-полимеразы) ВПГ-1. Именно мутации в данных генах, как правило, приводят к возникновению резистентности к противовирусным препаратам нуклеозидной природы. Так для ацикловира показано, что 95% случаев резистентность обусловлена мутациями в гене тимидинкиназы и только в 5% случаев мутациями в гене ДНК-полимеразы. Встречаются вирусы мутантные по обоим ферментам.

Помимо ацикловира, в литературе также описаны и другие противовирусные препараты, действие которых направлено специфически на конкретный фермент вируса. Так, например, соединение - Е-5-(2-бромвинил)-2'-дезоксиуридин (BVDU) (рис.1), попадая в клетку, фосфорилируется тимидинкиназой вируса до монофосфата. Затем уже клеточные ферменты проводят последовательные фосфорилирования до трифосфата. BVDU-трифосфат узнается только ДНК-полимеразой вируса и встраивается в растущую цепь, терминируя тем самым процесс репликации вируса.

Все известные на сегодняшний день штаммы, устойчивые к данному соединению, имеют мутации только в гене тимидинкиназы ВПГ-1. Таким образом, резистентность к BVDU автоматически указывает на то, что в данном штамме имеются мутации в гене тимидинкиназы.

о

Ш iil-.li

pH

HjN*

Н '--<!

>

.л,,

CT N О

н

V

он

МО

€

но'

ж

Рис. 1. Структурные формулы соединений: а - ацикловир (ACV); б - Н-фосфонат ацикловира (HpACV); в - фосфоноацетат (РАА); г - ганцикловир (GCV); д - £-5-(2-бромвинил)-2'-дезоксиуридин (BVDU); е - видарабин (АгаА), ж — сидофовир (CDV)

Другое соединение - сидофовир (рис.1) также встраивается ДНК-полимеразой вируса и терминирует репликацию вирусной ДНК. С химической точки зрения сидофовир является синтетическим аналогом 2'-дезокицитидин-5'-монофосфата и, следовательно, ему не требуется фосфорилирование с участием тимидинкиназы вируса. Сидофовир сразу фосфорилируется ферментами клетки до трифосфатного производного. Таким образом, резистентность к данному препарату возникает только за счет мутаций в гене ДНК-полимеразы вируса.

Поэтому анализ спектра распределения мутаций и их сопоставление с изменениями чувствительности мутантных вирусов к известным нуклеозидным антигерпетическим препаратам может дать нам полезную информацию о механизме действия HpACV.

1. Изучение генов UL23 и UL 30 ВПГ-1 штаммов L2 и L2/R.

1.1.Выделение и характеристика тимидинкиназы ВПГ-1 эталонного штамма L2.

Первым этапом нашей работы были клонирование, экспрессия, выделение и характеристика тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 1 эталонного для России штамма L2. Из государственной коллекции вирусов

Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва) нам были предоставлены SDS-лизаты клеток Vero, зараженных эталонным штаммом ВПГ-1 L2. Из суммарной выделенной ДНК с помощью ПЦР был получен ген тимидинкиназы, который был клонирован в соответствующий вектор. На первом этапе было осуществлено клонирование кодирующей области гена тимидинкиназы в экспрессионнуто систему pET23b+ (Novagen). При этом хочется отметить, что клонирование осуществлялось таким образом, чтобы получавшийся в ходе экспрессии белковый продукт не содержал в своем составе традиционный конец с несколькими остатками гистидина. Это было сделано для того, чтобы исключить возможное влияние дополнительных аминокислотных остатков на ферментативную активность получаемого белкового продукта. Очистку экспрессированной тимидинкиназы мы проводили при помощи аффинной хроматографии на колонке, содержащей аффинный сорбент, полученный на основе эпоксисефарозы с ковалентно "пришитым" З'-аминотимидином. Экспрессию тимидинкиназы в данном случае мы наблюдали (рис. 2), но, к сожалению, фермент был крайне нестабилен и очень быстро терял свою ферментативную активность даже в присутствии стабилизаторов (глицерин и тимидин).

fJP¡TMP

[у-32Р]АТР

2 3 4 5 6 7 Рис.2 Радиоавтограф хроматограммы на PEI-целлюлозе хроматографического разделения продуктов ферментативной реакции тимидинкиназы ВПГ-1 штамма L2 после экспрессии в клетках E.coli и последующей очистки на колонке, содержащей аффинный сорбент. 1 - контроль [у-32Р]АТР; 2- 5 -элюционная фракция;6-7- штамм проскок

Поэтому была предпринята попытка выделить тимидинкиназу ВПГ-1 штамма Ь2 при использовании экспрессионной системы рОЕЗО (СПАСЕТЕ). В данной экспрессионной системе мы клонировали кодирующую область тимидинкиназы таким образом, что получаемый белковый продукт на своем N1-конце имел последовательность из 6 остатков гистидина. Очистку полученного белка проводили при помощи аффинной хроматографии на сорбенте ЬП-МТА. При таком методе экспрессии нам не удалось получить достаточное количество активного фермента. Основная часть белкового продукта находилась в тельцах включения, то есть в виде нерастворимого осадка и не обладала ферментативной активностью. Изменение условий экспрессии (понижение температуры выращивания культуры) не дало желаемого результата. В результате экспрессия данного белка была осуществлена нашими коллегами из

лаборатории биотехнологий ИБХ РАН, которые клонировали кодирующую область гена тимидинкиназы в экспрессионный вектор рЕТ23Ь+, при этом получаемый белковый продукт содержал на своем С-конце последовательность из 6 остатков гистидина и имел молекулярную массу 42192 Да.

1 2 3

Рис. 3. Гель-электрофореграмма в 15% ПААГ в денатурирующих условиях рекомбинантной тимидинкиназы ВПГ-1 после всех стадий очистки (3) и клеточного лизата (2); 1 - стандарты молекулярных масс (Protein Ladder Fermentas).

Выделенный коллегами препарат после двух стадий хроматографической очистки (ионообменная, а затем аффинная хроматография на сорбенте Ni-NTA) имел чистоту не ниже 90% (см. рис.3) и не содержал примесей фосфатаз и неспецифических АТФ-аз, разрушающих [у-32Р]АТР даже при длительной инкубации. Предоставленный нам препарат фермента при хранении при +4°С в течение недели терял примерно половину ферментативной активности, при -20°С фермент мог храниться несколько месяцев без заметного снижения активности, однако, однократное замораживание-оттаивание фермента снижало его активность примерно на 30%. По субстратной специфичности в отношении акцепторов фосфатной группы предоставленный нам фермент не отличается от описанных ранее ферментов. Кроме тимидина фермент фосфорилирует 2'-дезоксицитидин, TMP, ацикловир, ганцикловир и BVDU (рис. 4). Кроме того данный фермент способен фосфорилировать некоторые синтетические аналоги нуклеозидов: d2T, d2C, FLT, ЗТС , d4T (см. рис. 4).

Оптимум pH реакции фосфорилирования тимидина и ацикловира достаточно широкий - от 7.5 до 8.5 (рис .5), что хорошо соответствует литературным данным. В то же время оптимум pH фосфорилирования TMP значительно уже. К сожалению, мы не смогли найти в литературе данные о рН-зависимости реакции фосфорилирования TMP для тимидинкиназ других штаммов ВПГ-1, и сравнить ферменты по этому параметру не представляется возможным. Для ферментативной активности ферменту абсолютно необходимы ионы Mg2+ в концентрации 2-5 мМ, а так же дитиотрейтол или ß-меркаптоэтанол в концентрации 2-5 мМ.

» * |

"P]pNuc

I • » Hii

7 2 3 4 5 <f 7

-[y-«P]ATP

Рис. 4. Радиоавтограф хроматограммы на PEI-целлюлозе аликвот реакций фосфорилирования тимидинкиназой ВПГ-1 нуклеозидов с [у-32Р]АТР в качестве донора фосфата: BVDU (2), d2C (3), dT (4), TMP (5), ACV (6), GCV (7); 1 - контроль - [у-32Р]АТР без акцептора фосфата. Стрелками отмечены местоположения [Г-32Р]АТР и область продуктов фосфорилирования нуклеозидов - [33P]pNuc.

)Яг

/

(Л) 40

3.5 4.0 ju.y

rt!

Рис. 5. Оптимум pH реакции фосфорилирования тимидинкиназой ВПГ- i тимидина (1) и TMP (2).

Важной характеристикой фермента является его сродство к субстрату. Мы определили константы Михаэлиса тимидинкиназы для реакции фосфорилирования тимидина - 1 мкМ и ацикловира - 200 мкМ. Эти величины хорошо коррелируют с опубликованными ранее данными, однако следует учесть, что у различных штаммов ВПГ-1, с различной чувствительностью к ацикловиру, сродство ферментов к тимидину и ацикловиру существенно варьирует.

Особый интерес для нас вызывал HpACV и его взаимодействие с тимидинкиназой вируса герпеса. Как следовало из вирусологических данных, предоставленных нам коллегами из Института вирусологии, данное соединение, по-видимому, не является субстратом для тимидинкиназы вируса. Полученные наши экспериментальные данные подтверждают это предположение, однако выяснилось, что HpACV весьма эффективно ингибирует ферментативное фосфорилирование ацикловира (рис. 6). Обсчет хроматограмм с помощью фосфоимиджера показал, что при концентрации HpACV 120 мкМ скорость фосфорилирования ацикловира снижается в 2 раза.

fflfi-L. | J | |

^ 111 | §

t 2 S 4 S

Рис. 6 Радиоавтограф хроматограммы на PEI-целлюлозе аликвот реакций фосфорилирования ацикловира тимидинкиназой ВПГ-1 с помощью [у- Р]АТР без ингибитора (2) и в присутствии Hp-ACV в концентрации 120 (3), 360 (4) и 720 мкМ (5); 1 - контроль - [у-32Р]АТР без акцептора фосфата. Время реакции — 20 мин. Стрелками отмечены местоположения [у- Р]АТР и область продуктов фосфорилирования нуклеозидов - ['2P]pNuc.

Подробное изучение кинетики ингибирования реакции фосфорилирования ацикловира в присутствии различных концентраций НрАСУ показало, что ингибирование носит смешанный характер (рис.7).

Рис. 7 Графики зависимости скорости фосфорилирования ацикловира от концентрации ацикловира тимидинкиназой ВПГ-1 в присутствии различных концентраций НрАСУ.

1- без НрАСУ

2- в присутствии 120 мкМ НрАСУ

3- в присутствии 360 мкМ НрАСУ

4- в присутствии 720 мкМ НрАСУ

1.2. Изучение структуры генов ТК и ДНК-полимеразы ВПГ-1 штаммов L2 и L2/R.

Из государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва) нам были предоставлены SDS-лизаты клеток Vero, зараженных эталонным штаммом ВПГ-1 L2, не имеющего устойчивости к ацикловиру и резистентным к ацикловиру штаммом ВПГ-1 L2/R, который был получен в результате серийного пассирования штамма L2 в градиенте концентраций ацикловира.

Из данных лизатов путем фенол-хлороформной экстракции мы выделили геномную ДНК полученных штаммов вируса. Гены тимидинкиназы и ген ДНК-полимеразы вируса были клонированы и затем секвенированы.

В результате проведенного исследования мы выявили мутации в функциональных доменах тимидинкиназы и ДНК-полимеразы штамма L2/R по сравнению с эталонным штаммом L2.

1.2.1. Анализ гена UL 23(тимидинкиназы).

Необходимо отметить, что тимидинкиназа вируса герпеса простого тип 1 обладает двумя наиболее важными областями, ответственными за функциональность фермента: АТФ-связывающий сайт (с51 по 63 аминокислоту) и нуклеотид-связывающий сайт (с 168 по 176 аминокислоту).

В гене тимидинкиназы ВПГ-1 штамма L2/R мы обнаружили 3 аминокислотные замены (V12A, W88R, R220H). Одна из данных замен, а именно замена валина на апанин в 12 положении, является полиморфизмом и не оказывает существенного влияния на резистентность данного шатамма. Аминокислотная замена W88R находится в консервативной области гена тимидинкиназы, соответственно она может влиять на устойчивость данного штамма к ацикловиру.

Очень интересна обнаруженная нами в этом штамме аминокислотная замена аргинина на гистидин в 220 положении (R220H). Данная замена описана в нескольких работах, но ее влияние на активность фермента до конца не выяснено. По данным одних авторов она приводит к потере чувствительности вируса к ацикловиру, пенцикловиру (PCV) и ганцикловиру (GCV), т.е. к антигерпетическим препаратам, которые являются ациклическими нуклеозидными аналогами, действие которых зависит от активности тимидинкиназы. Кроме того, те же авторы в другой своей работе показали, что замена в том же положении аргинина на лизин (R220K) совместно с другими заменами вызывает изменение субстратной специфичности тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 2. Однако в другой работе было показано, что замена аргинина на лизин никак не влияет на активность фермента. Сопоставляя литературные данные и на данные, полученные нами, мы, считаем, что эта мутация оказывает влияние на чувствительность вируса к ацикловиру только в сочетании с другими заменами.

Нашими коллегами из Института Вирусологии им. Ивановского РАН была определена чувствительность штамма L2/R к другим антигерпетическим препаратам (табл.1). Следует отметить, что для таких соединений как

ганцикловир (ОСУ) и бромвинилдезоксиуридин (ВУОи), фосфорилирование которых до соответствующих монофосфатов осуществляет вирусная тимидинкиназа, чувствительность данного штамма понижена на 1-2 порядка по сравнению с вирусом Ь2. С другой стороны, такие соединения как фосфоноуксусная кислота (РАА) и видарабин (АгаА), механизм действия которых не зависит от вирусной тимидинкиназы, подавляют репликацию штамма Ь2/Я почти также эффективно, как и эталонного штамма Ь2 (табл. 2). Таким образом, мы видим, что выявленная нами мутация 11220Н в гене тимидинкиназы меняет восприимчивость штамма Ь2 /Я к противогерпетическим препаратам, действие которых основано на взаимодействии с тимидинкиназой.

1.2.2. Анализ гена IIЬЗО (ДНК-полимеразы).

При анализе гена ДНК-полимеразы иЬЗО штамма Ь2/Я мы обнаружили девять аминокислотных замен, относительно штамма Ь2. Четыре аминокислотных замены (046М, А346Т, 8866Р и С1085Е) найдены в чувствительном к ацикловиру штамме 17, который мы также сравнили с эталонным штаммом Ь2 и использовали его как дополнительный контроль. Соответственно данные замены, по-видимому, не влияют на работу ДНК-полимеразы ВПГ-1 и, соответственно, не приводят к возникновению резистентности к ацикловиру у данного штамма. Замена 01510 находится в >Ш2-домене и согласно кристаллографическим данным расположена на большом удалении от активного центра фермента, что так же наводит нас на мысль о том, что она не может играть решающую роль в возникновении резистентности штамма 1,2/11 к ацикловиру. Замены 01и1Ю1у, Аяр741 Аэп, А5п871Авр, ОЫКМАяр не затрагивают консервативных регионов и по-видимому не влияют на работу фермента. Кроме того, замена 01и1 КМАэр была описана в одной работе у штамма чувствительного к ацикловиру как природный полиморфизм.

Таким образом, по нашим данным резистентность штамма Ь2/Я к антигерпетическим препаратам определяется в первую очередь мутациями в гене тимидинкиназы, а мутации в гене ДНК- полимеразы дают существенно меньший вклад. Необходимо отметить, что данный результат хорошо согласуется с литературными данными. Как уже отмечалось ранее у ацикловир-резистентных штаммов ВПГ-1 спектр распределения мутаций в генах тимидинкиназы и ДНК-полимеразы составляет 20:1 соответственно.

1.3. Установление ферментативной активности тимидинкиназы штамма Ь2/Я.

Глубокая резистентность штамма Ь2/11 к ацикловиру и наличие значимых мутаций в гене тимидинкиназы данного штамма указывают на возможное отсутствие ферментативной активности тимидинкиназы. Данный штамм уже давно используется, как референсный при проверке новых антигерпетических препаратов, являющихся нуклеозидными аналогами. Однако его тимидинкиназа не была охарактеризована ранее, хотя она играет важную роль

при формировании резистентности к антигерпетическим препаратам. Необходимо было выяснить, насколько мутации в гене тимидинкиназы штамма L2/R влияют на его активность.

Для этого при помощи тонкослойной хроматографии с использованием мы проверили активность тимидинкиназы в сульфаммонийнах экстрактах клеточных лизатов Е. coli после проведения экспрессии. На радиоавтографе (см. рис. 8) видно, что тимидинкиназа штамма L2/R не обладает ферментативной активностью. В дальнейшем мы пытались выделить ТК этого штамма при помощи аффинной хроматографии, однако ферментативная активность у полученного белка также не наблюдалась.

Рис.8 Радиоавтограф хроматограммы на РЕ1-целлюлозе хроматографического разделения продуктов ферментативной реакции тимидинкиназы ВПГ-1. 1- контроль [у-32Р]АТР; 2- штамм Ь2; 3- штамм Ь2Ж.

Таким образом, на основании полученных данных мы считаем, что лабораторный штамм ВПГ-1 Ь2/Я является штаммом ТК-.

2. Изучение генов 1/Ь23 и III. 30 ВПГ-1 штаммов, резистентных к Н-

фосфонату ацикловира.

Как показано выше, штамм Ь2/11 является по сути штаммом ТК", т.е. тимидинкиназа в данном штамме не обладает ферментативной активности. Однако, как видно из таблицы 1, данный штамм сохраняет чувствительность к Н-фосфонату ацикловира практически на уровне ацикловир-чувствительного штамма Ь2. Учитывая, что НрАСУ не является субстратом для тимидинкиназы ВПГ-1, мы вправе предположить, что механизм его действия реализуется через вирусную ДНК-полимеразу. Для того чтобы разобраться в этом мы проанализировали спектр мутаций в штаммах ВПГ-1, резистентных к НрАСУ.

Нашими коллегами из вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва) нам были предоставлены 9 мутантных клонов ВПГ-1, которые были получены при помощи многократного пассирования штамма Ь2 на среде, содержащей НрАСУ. Все эти клоны обладали высокой устойчивость к НрАСУ.

Таблица 1. Чувствительность вируса герпеса простого штаммов L2, L2/R и штаммов, резистентных к Н-фосфонату, к различным антигерпетическим соединениям в культуре клеток Vero Е6.

Штамм ИД50 (мкг/мл)

ACV HpACV GCV BVDU Ara-A РАА CDV

L2 0.39 15.60 1.4 0.096 15.6 31.25 3,9

L2/R >100 31.20 23 >24.7 31.25 31.25 -

1 6.25 >1000 11.25 12.35 15.6 31.25 0.49

2 6.25 1000 5.62 5.62 6.17 15.60 0.49

3 3.12 250 5.62 6.17 31.25 15.60 0.24

4 6.25 >1000 5.62 6.17 31.25 15.6 0.24

5 50 500 >45 >24.7 31.25 62.5 0.24

6 >100 1000 22.5 24.7 31.25 31.25 0.49

7 >50 1000 >45 >24.7 31.25 62.5 0.49

8 50 500 >45 >24.7 62.5 31.25 0.49

9 50 500 45 >24.7 31.25 31.25 0.24

Данные штаммы также были проверены нашими коллегами на устойчивость к уже известным антигерпетическим агентам (см.табл 1). Основываясь на этих данных полученные клоны можно разбить на две группы: глубокорезистентные к ацикловиру (5-9) и слаборезистентные к ацикловиру (14) клоны.

Для сравнения в качестве контрольных штаммов мы использовали эталонный ВПГ-1 L2, который не имеет устойчивости к антигерпетическим агентам и лабораторный штамм ВПГ-1 L2/R (см. выше). Из предоставленных SDS-лизатов клеток Vero, зараженных данными штаммами вируса герпеса простого тип 1, мы выделили ДНК и клонировали кодирующие области генов тимидинкиназы и ДНК-полимеразы. Затем мы определили их нуклеотидную последовательность и установили нуклеотидные и аминокислотные замены в данных штаммах, по сравнению с эталонным штаммом ВПГ-1 L2.

2.1. Анализ гена UL23 (тимидинкиназы).

У всех 9 мутантных штаммов вируса герпеса простого тип 1, резистентных к HpACV, имеется одна общая нуклеотидная замена С841Т,

которая приводит к образованию раннего стоп-кодона. В результате образуется укороченный белок тимидинкиназы, состоящий из 280 аминокислот (см.табл. 2).

Таблица 2. Аминокислотные замены, найденные в гене ТК у штаммов ВПГ-1, резистентных к Н-фосфонату ацикловира по сравнению с геном ТК эталонного штамма Ь2.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

12 Val—Ala Val—Ala Val—* Ala Val—»Ala Val—»Ala Val—Ala Val-» Ala Val—»Ala Val—Ala

59 Gly—Arg

138 Val—Ala

231 Met—»Val

281 Stop Slop Stop Stop Stop Stop Stop Stop Stop

Этот факт согласуется с полученными нами ранее данными о том, что HpACV взаимодействует с тимидинкиназой, ингибируя тем самым фосфорилирование ацикловира. То есть тимидинкиназа также является геном-мишенью при образовании штаммов вируса резистентных к HpACV. Необходимо было понять, является ли такая укороченная форма тимидинкиназы активной. Для этого мы протестировали ферментативную активность лизатов клеток Vero, инфицированных полученными клонами ВПГ-1, резистентными к HpACV. Анализ активности проводили при помощи тонкослойной хроматографии с использованием [у-32Р]-АТФ. В качестве контроля был взят эталонный штамм L2. Как видно из приведенного рисунка (см. рис.9А), тимидинкиназы данных штаммов частично сохранили свою способность фосфорилировать тимидин, хотя их активность ниже, чем активность тимидинкиназы эталонного штамма L2. Следовательно, такой укороченный белок не теряет полностью свою функциональную активность.

Интересно, что тестирование активности этих лизатов в аналогичных условиях в отношении фосфорилирования BVDU показало, что «укороченные» мутантные ферменты теряют способность фосфорилировать BVDU (см. рис.9В). Это согласуется и с литературными данными, где было показано, что мутация Arg281 в гене тимидинкиназы, приводящая к появлению раннего стоп-кодона в штамме ВПГ-1, способствует появлению резистентности к BVDU и может приводить к возникновению устойчивости данного штамма к ацикловиру.

А

- f Ф

< | |

м»м

0 12 3 4

В

É .

• ••♦•é éét * ♦ ^

012345 67 89 10

Рис. 9. Радиоавтограф хроматограммы на PEI-целлюлозе аликвот реакций фосфорилирования тимидина (а) и BVDU (б) тимидинкиназами различных штаммов HSV-1 с помощью реакция с лизатом неинфицированных

клеток Vero (0). с лизатами клеток Vero, инфицированных клонами 1-9 HSV-1 (1-9) и с с лизатом клеток Vero, инфицированных эталонным штаммом HSV-1/Ь2 (10). Стрелочками отмечены местоположения

[у-33Р]АТР и продуктов фосфорилирования нуклеозидов - [5'-32Р]ТМР (на рис.а) и [5'-32P]BVDUMP (на рис.б).

[5'-32P]BVDUMP - £-5-(2-бромвинил)-2'

-дезоксиуридин - [5' -32Р]-монофосфат.

Однако наличие данной мутации не может полностью объяснить полученные нами результаты. Так штаммы с 1 по 4 имеют среднюю резистентность к ацикловиру, отличающуюся от эталонного штамма L2 в 8-16 раз. А штаммы с 5-9 являются высокорезистентными к ацикловиру и отличаются от эталонного штамма L2 в 128-256 раз. В тоже время аминокислотный и нуклеотидный состав идентичный у штаммов с 3 по 8. По-видимому, вирусная тимизинкиназа является не единственным фактором, определяющим резистентность к ацикловиру у данных штаммов.

Помимо данной нуклеотидной замены есть ещё и другие мутации, найденные в гене тимидинкиназы, на которые мы обратили внимание. У штамма 2 нами была обнаружена мутация (Gly59Arg), затрагивающая АТФ-

Ш Ш Л Л ЯП Ш —[5'-32Р]ТМР

1Р Щ Щ ~ ^— з2р

t # # ; | | • Mili —[Y-32P]ATP

5 6 7 8 9 10

f | | £ ч—32P¡

Щ [5'-32P]BVDUMP

связывающий сайт тимидинкиназы. Мутации Met231Val в 1 штамме и Val 138А1а в 9 штамме не затрагивают консервативные области гена тимидинкиназы ВПГ-1 и, по-видимому, не влияют на активность данного фермента.

Важно подчеркнуть, что мутация, приводящая к возникновению стоп-кодона, обнаружена во всех 9 штаммах, резистентных к HpACV. По-видимому, эти места в гене необходимы для формирования комплекса с HpACV, и мы предполагаем, что существенную роль в данном комплексе играет С-конец белка тимидинкиназы, поскольку именно он отсутствует у всех 9 штаммов, резистентных к HpACV.

2.2. Анализ гена UL30 (ДНК-полимеразы).

Из литературных данных известно, что у ДНК-полимеразы ВПГ-1 выделяют несколько консервативных регионов. Нами были обнаружены аминокислотные замены, затрагивающие следующие консервативные регионы: II регион (с 694 по 736 аминокислоту), III регион (с 805 по 849 аминокислоту), V регион ( с 953 по 963 аминокислоту), а также б-регион (с 531 по 627 аминокислоту) (рис.10). Мутации в данных областях могут приводить к изменению активности фермента.

608 716

Asn^Ser Phe—.Ser

820 Phe->Tyr

962

Asn->Asp 1049

Leu-.Met

б- регион С II

VII

437-479 531-627 694-736 772-791

Рис. 10. Схематическое изображение расположения консервативных областей в гене иЬЗО (указаны римскими цифрами). Стрелками указаны обнаруженные нами аминокислотные замены у штаммов ВПГ-1, резистентных к НрА^, затрагивающие консервативные регионы гена ДНК-полимеразы.

При изучении гена ШЗП штаммов ВПГ-1, резистентных к НрА^, мы обнаружили мутации, которые затрагивают консервативные регионы ДНК-полимеразы вируса (рис. 10, табл. 3). Так в штамме 1 обнаружена мутация РЬе7168ег затрагивающая второй консервативный регион, а так же мутация Ьеи1049Ме1 в консервативном домене. В 6 штамме обнаружена мутация АБп6088ег в консервативном 8-регионе. Обнаружено несколько мутаций расположенных вблизи от консервативных доменов: в 3 штамме замена Азп962Азр, в 4 штамме А1а987ТЬг, в 6 штамме РЬе820Туг и в 8 штамме 01у9488ег. Хочется также отметить нуклеотидную замену А346Т, которая обнаружена во всех клонах, однако может ли она оказывать влияние на резистентность данных штаммов к Н-фосфонату ацикловира не совсем ясно.

В гене ДНК-полимеразы штамма L2/R, резистентного к ацикловиру, нами не было найдено мутаций, которые могли бы приводить к возникновению резистентности (см. выше). Мутации в НрАСУ-резистентных штаммах и ацикловир-резистентном штамме L2/R частично перекрываются. Необходимо отметить, что некоторые мутации, встречающиеся в штамме L2/R, обнаружены нами как у штаммов, имеющих среднюю резистентность к ацикловиру (1-4), так и у штаммов высоко резистентных к нему (5-9). Такое совпадение мутаций можно объяснить тем, что попадая в клетку HpACV способен частично гидролизоваться до ацикловира, то есть вирус герпеса простого находился в клетке в присутствии ацикловира и HpACV одновременно. Соответственно, при селекции популяции ВПГ-1 отбирались мутации, приводящие к устойчивости к обоим соединениям. Следует подчеркнуть, что у каждого из 9 исследованных нами штаммов ВПГ-1, резистентных к HpACV, обнаружены мутации в гене ДНК-полимеразы, которые мы можем классифицировать как мутации, затрагивающие специфичность фермента.

Не смотря на то, что у этих 9 штаммов ВПГ-1 мало изменилась чувствительность к фосфоноацетату (РАА) и видарабину (АгаА), как видно из табл. 1, у всех штаммов, резистентных к HpACV, увеличилась чувствительность к сидофовиру (CVD). Как указывалось выше, сидофовир является антигерпетическим препаратом, действие которого направлено на ДНК-полимеразу вируса. Следовательно, можно с уверенностью сказать, что мутации в гене ДНК-полимеразы у штаммов, резистентных к HpACV, приводят к изменению специфичности этого фермента.

Таким образом, мы видим, что распределение мутаций в генах тимидинкиназы и ДНК-полимеразы у штаммов ВПГ-1, резистентностных к HpACV, принципиально отличаются от аналогичного распределения для штаммов ВПГ-1, резистентных к ацикловиру. Мы можем заключить, что HpACV взаимодействует с тимидинкиназой вируса герпеса простого тип 1, приводя к возникновению мутаций в гене UL23. Однако, механизм антигерпетического действия данного соединения, по видимому, реализуется с помощью ДНК-полимеразы вируса и, как следствие, мутации именно в гене UL30 могут приводить к возникновению резистентности к HpACV.

3. Анализ связи между структурой генов ТК и ДНК-полимеразы и резистентностью к ACV и HpACV.

Таким образом, из проведенной работы мы видим, что ацикловир и HpACV имеют принципиально разные механизмы формирования резистентности у ВПГ-1. Так глубоко резистентный к ацикловиру штамм L2/R, несущий в своем геноме неактивную тимидинкиназу, чувствителен к HpACV. Его резистентность к ацикловиру может быть объяснена совокупностью мутаций W88R и R220H, обнаруженных в гене тимидинкиназы. Однако в гене ДНК-полимеразы значимых мутаций обнаружено не было, что видимо и объясняет его чувствительность к HpACV.

Таблица 3. Аминокислотные замены, найденные в гене ДНК-полимеразы у штаммов ВПГ-1, резистентных к Н-фосфонату ацикловира по сравнению с геном ДНК-полимеразы эталонного штамма Ь2.

№ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ь2/Я

-46 Авр—»Авп А$р-»А5П А$р—»Авп АБр-^Авп А5р—»А5П Азр—»Азп Аяр—»А$п

7 111 СЬ-бК'

? 140 РЬс-» Бег

- 151 Авр—»С1у Авр—»С1у

7 238 А1а-»Уа1

7 251 С1п—»Рго

7 285 Азп—»Бег

7315 Тф—»Агв

-346 А1а—»Тгр А1а—»Тгр А1а-*Тгр А1а—*Тгр А1а—»Тгр А1а—»Тгр А1а-»Тгр А1а~*Тгр А1а—«Тгр

7 484 Ье-»Мс1

7 494 АБП—»А$р

7 505 С1у—«Авр

7 567 С1у^Ои

+ 608 А*п—»Бег

+ 716 РЬс-»всг

-741 А$р—»А8п А$р—»АБП Аэр—»А5п

7 808 А1а—»ТЬг

+ 820 РЬс—»Туг

-866 Бег—»РЬс 5сг—РЬс

-871 А$п—»Аэр Абп—► Аэр Абп—»Авр Аьп—»Аэр

+/- 948 С1у—»Бег

+ 962 Ахп-»Ах|)

7 987 А1а-ТЬг

+1049 Ьей-»Ме1

71071 Аг£-»Тгр

-1085 а>—С1и С1у-С1и С1у—>С1и С1у—»б1и С1у—»С1и С1>—»01и &>-» й1и С1у—»С1и

-1104 С1и—»Авр

71121 ТЬг—»А1а ТЬг-»А1а

71188 Ьей-»Агц

+ - Мутации, затрагивающие консервативные регионы ДНК-полимеразы ВПГ-1, и приводящие к изменению работы данного фермента. - - Полиморфизм ДНК-полимеразы ВПГ-1.

+/--Мутации, находящиеся вблизи консервативных регионов ВПГ-1, могут приводить к изменению активности данного фермента.

7 - Мутации , не затрагивающие консервативные регионы ДНК-полимеразы ВПГ-1, и не описанные ранее в литературе.

Анализ 9 штаммов, резистентных к НрАСУ и имеющих различную чувствительность к ацикловиру, выявил несколько особенностей.

Во-первых, во всех 9 клонах обнаружена одинаковая мутация С841Т, приводящая к возникновению укороченного белка (280 а.к.). Однако, как нами было показано, данный белок частично сохраняет свою ферментативную активность. Наличие этой мутации у всех 9 клонов, резистентных к НрАСУ указывает на то, что данный С-конец белка важен для формирования комплекса тимидинкиназа-НрАСУ. Как нами было показано, тимидинкиназа не фосфорилирует НрАСУ, но он в свою очередь ингибирует ее активность.

Во-вторых, нами были во всех 9 штаммах обнаружены мутации в гене ДНК-полимеразы. Так у штаммов 1, 3, 4, 6, 8 данные мутации затрагивали консервативные регионы гена и, соответственно, могли влиять на резистентность данных штаммов к антигерпетическим препаратам.

Однако полученные нами данные не могут полностью объяснить результаты, полученные нашими коллегами из Института вирусологии им. Ивановского РАМН. Как видно из табл.1 штаммы с 1-4 имеют среднюю резистентность к ацикловиру, а штаммы с 5-9 являются высоко резистентными к ацикловиру. Но у штаммов с 3-8 аминокислотный и нуклеотидный состав гена тимидинкиназы идентичный. По-видимому, найденные нами, в гене ДНК-полимеразы мутации и являются основным фактором в различии устойчивости данных штаммов к ацикловиру.

Таким образом, мы видим, что у НрАСУ резистентных клонов спектр распределения мутаций отличается от штаммов, резистентных к ацикловиру. Это указывает на различие в механизмах формирования резистентности к данным антигерпетическим препаратам.

Выводы.

1. Получена и охарактеризована тимидинкиназа ВПГ-1 из эталонного для России штамма Ь2. Определены Кт: для тимидина -1 мкМ и ацикловира -200 мкМ. Установлено, что Н-фосфонат ацикловира ингибирует ферментативную активность тимидинкиназы ВПГ-1 штамма Ь2 по смешанному механизму.

2. Для эталонного штамма ВПГ-1 Ь2 установлена нуклеотидная и аминокислотная последовательности генов иЬ23 и иЬЗО (тимидинкиназы и ДНК-полимеразы).

3. Установлена нуклеотидная и аминокислотная последовательности генов ТК и ДНК-полимеразы ВПГ-1 лабораторного штамма Ь2/К, глубоко резистентного к ацикловиру. Выявлены мутации в гене \JL23 (ТК) данного штамма, обуславливающие его резистентность: \V88R, 11220Н.

4. Установлена нуклеотидная и аминокислотная последовательности генов ТК и ДНК-полимеразы ВПГ-1 9 штаммов, резистентных к Н-фосфанату ацикловира. Выявлена общая для всех штаммов мутация в гене ТК- С841Т, приводящая к получению укороченного белка, частично сохраняющего свою активность. Установлен необычный спектр мутаций в генах ТК и ДНК-полимеразы у штаммов, резистентных к Н фосфонату ацикловира.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. А. А. Гуськова, A.B. Загурный, М. Ю. Скоблов, A.B. Баранова, В. Л. Андронова, Н.К. Янковский, Г. А. Галегов, Ю. С. Скоблов. Молекулярно-генетический анализ тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 1.// Молекулярная биология, 2005, том 39, № 1, с. 155-158.

2. Гуськова A.A., Скоблов М.Ю., Андронова В.Л., Галегов Г.А., Скоблов А.Ю., Скоблов Ю.С. Тимидинкиназа вируса герпеса простого тип 1: структура гена мутантпых штаммов, резистентных к ацикловиру. Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов.// г.Новосибирск 2008, (80) 61.

3. Anna A. Gus'kova, Mikhail Yu. Skoblov, Anna N. Korovina, Maxim V. Yasko, Inna L. Karpenko, Marina K. Kukhanova, Valeria L. Andronova, George A. Galegov and Yuri S. Skoblov. Antiherpetic Properties of Acyclovir 5'Hydrogenphosphonate and the Mutation Analysis of Herpes Virus Resistant Strains.//Chem Biol Drug Des 2009; 74: 382-389.

4. A. H. Коровина, А. А. Гуськова, M. 10. Скоблов, В. Л. Андронова, Г. А. Галегов, С. Н. Кочетков, М. К. Куханова, Ю. С. Скоблов. Анализ мутаций в генах ДНК-полимераз и тимидинкиназ клинических изолятов вируса простого герпеса, резистентных к антигерпетическим препаратам.//Молекулярная биология, 2010, том 44, № 3, с. 488-496

5. В. Н. Степаненко, Р. С. Есипов, А. И. Мирошников, В. Л. Андронова, Г. А. Галегов, М. В. Ясько, А. А. Гуськова, А. Ю. Скоблов, Ю. С. Скоблов. Клонирование, экспрессия, выделение и свойства тимидиикиназы вируса герпеса простого, штамм L2.// Биоорганическая химия, 2011, том 37, № 4, с. 1-6

6. А. А. Гуськова, М. 10. Скоблов, В. Л. Андронова, Г. А. Галегов, С. Н. Кочетков, Ю. С. Скоблов. Ферментативная активность тимидинкиназы штаммов вируса простого герпеса, резистентных к Н-фосфонату ацикловира.//Биоорганическая химия, 2011, том 37, № 5, с. 1-4

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВПГ-1— вирус герпеса простого тип 1

ТК—тимидинкиназа;

ACV— ацикловир

HpACV— Н-фосфонат ацикловира;

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота;

ПЦР — полимеразиая цепная реакция;

т. п. н. — тысяча пар нуклеотидов;

п. н. — пара нуклеотидов;

SDS — додецилсульфат натрия

АТР (АТФ) — аденозинтрифосфат

TMP —тимидинмонофосфат

ПААГ — полиакриламидный гель

d2C - 2',3'-дидезоксицитидин

d2T - З'-дезокситимидин

d4T - 3'-дезокси-2',3'-дидегидротимидин

FLT - З'-фтор-З'-дезокситимидин

ЗТС - р-Ь-2',3'-дезокси-3'-тиацитидин

Подписано в печать:

20.02.2012

Заказ № 6698 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autorefcrat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гуськова, Анна Алексеевна, Москва

61 12-3/839

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

На правах рукописи

Гуськова Анна Алексеевна

Формирование резистентности у вируса

простого герпеса к Н-фосфонату ацикловира.

03.01.03 — молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор химических наук, Скоблов Юрий Самойлович.

Москва — 2012 г.

Содержание.

1. Введение..............................................................................................................4

2. Обзор литературы................................................................................................6

2.1. Вирус герпеса простого тип 1........................................................6

2.1.1. Характеристика ферментов вируса герпеса простого

тип1.....................................................................................7

2.1.2. .Тимидинкиназа ВПГ-1............................................................7

2.1.2.1. Доноры фосфора...........................................................9

2.1.2.2. Акцепторы фосфора. Противогерпетические препараты.........9

2.1.2.3. Механизм действия тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 1.........................................................................14

2.1.2.4. Структура активного центра тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 1............................................................15

2.1.3. ДНК-полимеразаВПГ-1........................................................24

2.2. Исследование мутантных генотипов штаммов ВПГ-1, резистентных к антигерпетическим препаратам..................................................26

3. Экспериментальная часть..............................................................41

3.1.Обоснование работы и поставленные задачи.............. ...................41

3.2. Материалы и методы...............................................................42

3.2.1.Материалы и оборудование.................................................42

3.2.1. Методы..........................................................................43

3.3. Результаты и обсуждение........................................................59

3.3.1. Изучение генов UL23 и UL 30 ВПГ-1 штаммов L2 и L2/R..........61

3.3.1.1. Выделение и характеристика тимидинкиназы ВПГ-1 эталонного штамма L2............................................61

3.3.1.2. Изучение структуры генов ТК и ДНК-полимеразы ВПГ-1 штаммов L2 и L2/R.................................................68

3.3.1.3. Установление ферментативной активности тимидинкиназы штамма L2/R..................................72

3.3.2. Изучение генов Ш23 и ШЗО ВПГ-1 штаммов, резистентных к Н-

фосфонату ацикловира..................... ................................73

3.3.2.1. Анализ теиаШ23 (тимидинкиназы)............................75

3.3.2.2. Анализ гена ШЗО (ДНК-полимеразы).........................79

4. Общее заключение.....................................................................84

4.1. Анализ связи между структурой генов ТК и ДНК-полимеразы и резистентностью к АСУ и НрАСУ..............................................84

5. Выводы.......................................................................................86

6. Список литературы........................................................................87

7. Список сокращений......................................................................101

8. Благодарности............................................................................102

9. Приложение 1.............................................................................103

10. Приложение 2..........................................................................107

1. Введение

Одним из самых распространенных патогенов человека является вирус простого герпеса первого типа (ВПГ-1). По данным всемирной организации здравоохранения носителями данного вируса являются 95% населения Земли. У большинства инфицированных людей данное заболевание протекает в виде везикулярных высыпаний на слизистых оболочках. Однако при иммунодефицитом состоянии пациента, которое может быть вызвано ВИЧ-инфекцией или процедурами, необходимыми при пересадке органов, ВПГ-1 часто приводит к летальному исходу. ВПГ-1, попадая внутрь организма, остаётся там пожизненно. В настоящий момент не разработано лекарственных средств, которые полностью уничтожали бы ВПГ-1. За последние полвека было предложено много антигерпетических средств различной природы, однако, наибольшее распространение получили модифицированные нуклеозиды, в том числе ациклические нуклеозидные аналоги (ацикловир, ганцикловир и др.), некоторые из них вошли в широкую медицинскую практику для терапии герпетических инфекций.

Механизм действия таких нуклеозидных препаратов хорошо известен. Сначала при помощи вирусного фермента - тимидинкиназы - осуществляется фосфорилирование нуклеозида до нуклеозид-5'-монофосфата, затем происходят два последовательных фосфорилирования с использованием ферментов клетки-хозяина до соответствующего трифосфатного производного нуклеозида. На следующем этапе, полученный модифицированный нуклеотид включается вирусспецифической ДНК-полимеразой во вновь синтезируемую цепь ДНК, что приводит к терминации биосинтеза вирусной ДНК.

Однако длительное применение нуклеозидных антигерпетических препаратов приводит к появлению штаммов ВПГ-1, устойчивых к действию этих соединений. Резистентность ВПГ-1 к нуклеозидным препаратам обусловлена одним из следующих факторов или их сочетанием: (а) полной потерей активности, изменением субстратной специфичности или понижением

экспрессии вирусной тимидинкиназы, (б) понижением активности или изменением субстратной специфичности вирусной ДНК-полимеразы. Появление таких резистентных к антигерпетическим препаратам штаммов ВПГ-1 вынуждает вести поиск новых лекарственных препаратов. Данная работа является частью этого исследовательского направления.

2. Литературный обзор

2.1. Вирус герпеса простого тип 1.

Самыми распространенными возбудителями инфекционных заболеваний являются вирусы семейства герпеса. Наиболее часто заболевания вызывают следующие вирусы: вирус простого герпеса I и II типов, вирус ветряной оспы (или герпес варицелла-зостер), вирус Эпштейна-Барр (или вирус инфекционного мононуклеоза), цитомегаловирус (ЦМВ), вирус герпеса 6-го типа и др.

Вирус герпеса человека (вирус простого герпеса) тип 1 (ВПГ-1) является самым распространенным возбудителем герпетических инфекционных заболеваний. Попадая в организм, вирус остается там пожизненно. В состоянии покоя вирус находится в отростках нейронов спинного мозга, но при развитии острой фазы заболевания данный вирус вызывает поражения слизистой оболочки полости рта, глаз и кожи и реже поражение гениталий в виде везикулярных высыпаний. Однако при иммунодефицитом состоянии пациента ситуация может резко ухудшаться и приводить к летальному исходу. Кроме того, показано, что ВПГ-1 и ВПГ-2 могут быть причиной редких, но серьезных заболеваний, таких как энцефалит или обширная неонатальная инфекция [1].

В настоящее время не найдено лекарственное средство полностью уничтожающее данный вирус. Используемые в медицинской практике антигерпетические препараты направлены на снятие острой фазы заболевания. На сегодняшний день используется несколько химических веществ для лечения герпетических инфекций [2]. Большинство из них является нуклеозидными аналогами, и их действие основывается на разнице субстратной специфичности вирусных ферментов: тимидинкиназы и ДНК-полимеразы, и ферментов клетки-хозяина [3;4].

2.1.1. Характеристика ферментов вируса герпеса простого тип 1.

ВПГ-1 содержит двухцепочечную ДНК, и его геном составляет 153 кб, в которой GC состав 68%. [5]. На сегодняшний день аннотировано 77 кодирующих областей генома ВПГ-1. Данные кодирующие области с обеих сторон фланкированы длинными терминальными повторами (9,2 и 6,6 кб). Кроме концевых повторов, в геноме вируса имеются малые микросателлитные повторы (<100 н.п.) и короткие тандемные повторы (<500 н.п.), а также встречается класс повторов VNTR [5, 6, 7].

На сегодняшний день одними из наиболее изученных генов ВПГ-1 являются гены UL23 и UL30, кодирующие тимидинкиназу и ДНК-полимеразу, соответственно. Интерес к данным генам объясним, поскольку наличие мутаций именно в этих генах приводит к возникновению резистентности штаммов ВПГ-1 к антигерпетическим препаратам.

2.1.2. Тимидинкиназа ВПГ-1.

Первое упоминание о тимидинкиназной активности ВПГ-1 было сделано в 1963 году. В этой работе было показано, что клетки, исходно дефицитные по тимидинкиназе, после инфицирования вирусом герпеса, восстанавливали способность утилизировать тимидин-НЗ (Kit S. 1963). Нуклеотидная последовательность гена тимидинкиназы ВПГ-1 была определена в 1980 году методом Максама-Гилберта [8]. Было установлено, что ген тимидинкиназы содержит открытою рамку считывания, содержащую 376 кодонов. Тремя годами позже Вальдманн установил, что тимидинкиназа вируса имеет субъединицу массой 42 кД и может образовывать димерную структуру. Этот факт он подтвердил при помощи гельфильтрации на Sephadex G100 и центрифугированием в градиенте глицерина [9]. Исследование значимости димерной структуры тимидинкиназы in vitro показало, что диссоциация димера на мономеры не влияет на полную вторичную и третичную структуры фермента [10].

Первые исследования тимидинкиназы ВПГ-1 проводились в основном на зараженных клетках Vero. Надо отметить, что основные кинетические характеристики фермента и его физико-химические свойства исследовались на клеточных лизатах или частично очищенных белковых фракциях. В ходе развития методов молекулярной биологии и биоинженерии, были использованы новые подходы к получению герпесвирусной тимидинкиназы: клонирование гена в экспрессионном векторе, наработка рекомбинантного белка в E.coli и его выделение из E.coli или инфицированных эукариотических клеток с помощью аффинной хромотографии. Благодаря разработке этих методов в сочетании с использованием сайт-направленного мутагенеза, возникла возможность наработки значительного количества чистого фермента, достаточного для изучения его физико-химических и энзимологических свойств, а также проведения рентгеноструктурного анализа. Однако не было проведено повторное полное исследование биохимических свойств очищенного фермента. До сих пор в литературе ученые цитируют часто противоречивые и не всегда достоверные данные, полученные на ранних этапах изучения тимидинкиназы вируса герпеса.

В 1978 году впервые в литературе встречается упоминание о том, что тимидинкиназа ВПГ-1 обладает второй ферментативной активностью. Так Чен и его сотрудники установили, что этот фермент является мультифункциональным, поскольку проявляет помимо тимидинкиназной активности еще и тимидилаткиназную активность, т.е. тимидинкиназа может фосфорилировать как тимидин, так и тимидинмонофосфат [И]. Эти две активности, не удалось разделить ни путем изоэлектрической фокусировки, ни при помощи аффинной хроматографии или центрифугирования в градиенте глицерина. Различие было отмечено только в инактивации фермента при его инкубации при 37°С, тимидинкиназная активность оказалась более лабильной, по сравнению с тимидилаткиназной активностью. Факт наличия второй активности был подтвержден и другими работами [12]. Следует подчеркнуть, что тимидинкиназная и тимидилаткиназная реакции различны между собой по

термодинамическим характеристикам и аналогов подобных ферментов пока более не обнаружено. На сегодняшний день достаточно подробно изучен механизм фосфорилирования тимидина, но каким образом происходит фосфорилирование тимидинмонофосфата до сих пор не известно.

2.1.2.1. Доноры фосфора.

Ещё в ранних исследованиях тимидинкиназы вируса герпеса простого тип 1 было показано, что данный фермент может использовать в качестве доноров фосфора не только АТР, но и GTP, UTP и СТР [13]. Исключением является ТТР, который ингибирует работу тимидинкиназы вируса на 50%, если его количество аналогично количеству присутствующего тимидина. Этими свойствами тимидинкиназа вируса герпеса похожа на митохондриальные тимидинкиназы человека и мыши [14].

Константа Михаэлиса тимидинкиназы вируса для АТР составляет порядка ЗОцМ. Необходимо отметить, что в разных статьях можно встретить различные значения констант Михаэлиса для данного фермента. Это объясняется тем, что вирус герпеса простого имеет большую вариабельность, и даже немутантные штаммы, которые в литературе описаны как дикий тип, имеют различия. Поэтому тимидинкиназы, полученные из разных штаммов, имеют различные кинетические характеристики. Так, константа Михаэлиса для АТФ может иметь значения от ЗОцМ до 118|iM.

Самым эффективным донором фосфора являются АТР и dATP. За тем идет по убывающей эффективности: СТР, dCTP, UTP, dUTP, GTP, dGTP.

2.1.2.2. Акцепторы фосфора. Противогерпетические препараты.

Как уже упоминалось выше, тимидинкиназа вируса герпеса простого тип 1 может фосфорилировать достаточно широкий спектр соединений. Акцепторами фосфора могут являться как природные соединения, так и их синтетические аналоги.

Природными акцепторами фосфора помимо тимидина и тимидинмонофосфата являются дезоксицитидин и дезоксиуридин [15]. Была определена константа Михаэлиса для дезоксицитидина, которая составила 5цМ.

Вследствие того, что вирус герпеса простого тип 1 является инфекционным возбудителем, достаточно много работ было проведено с целью поиска лекарственных противогерпетических препаратов. На сегодняшний день существует огромное множество разнообразных синтетических соединений, подавляющих размножение вируса в клетках хозяина. Но далеко не все из этих соединений вошли в повседневную медицинскую практику.

ню„

о

« А

*1 ш

N

J

«

Г '

X,

но

на'

0

1

кг Ч

ИСКУ

о

соон

Рис. 1. Структурные формулы соединений: а - ацикловир (АСУ); б -пенцикловир; в - сидофовир; г - ганцикловир (ОСУ); д - фоскарнет.

Как уже упоминалось выше, действие противогерпетических препаратов (рис.1) основывается на разнице в сродстве тимидинкиназы и ДНК-полимеразы вируса и клетки-хозяина к этим противогерпетическим средствам. Одними из наиболее распространенных препаратов являются следующие соединения: ацикловир, пенцикловир, ганцикловир, сидофовир (рис.1). Де-Клерком были подробно изучены механизмы действия данных соединений [16]. Несмотря на большое разнообразие противогерпетических препаратов, ацикловир является одним из самых эффективных и распространенных лекарственных средств.

Механизм действия ациклических нуклеозидных аналогов был впервые изучен

на примере ацикловира.

Ацикловир, 9-(2-гидроксиэтоксиметил) гуанин, представляет собой ациклический аналог гуанозина. На первой стадии метаболического пути происходит фосфорилирование ацикловира, с образованием монофосфата ацикловира при помощи тимидинкиназы вируса герпеса. Данный факт подтверждался тем, что способность фосфорилировать и тимидин, и ацикловир теряется в мутантных штаммах вируса герпеса простого тип 1, дефицитных по тимидинкиназе. Также на это указывает совместная миграция обоих ферментативных активностей при электрофорезе в полиакриламидном геле, и их совместная очистка при помощи аффинной хроматографии, разделяющей вирусную и клеточную тимидинкиназы [17]. Надо заметить, что при изучении субстратной специфичности тимидинкиназ вируса и клетки было показано существенно большее сродство ацикловира и его аналогов (ганцикловира и пенцикловира) к вирусной тимидинкиназе, чем к клеточной.

Вторая и третья стадии заключаются в образовании сначала дифосфата, а затем и трифосфата ацикловира. Эти этапы фосфорилирования осуществляют клеточные ферменты: ОМР-киназа и нуклеозид-дифосфат киназа [18, 19]

Трифосфат ацикловира избирательно узнается только вирусной ДНК-полимеразой и встраивается в цепь. Поскольку у трифосфата ацикловира отсутствует гидроксил в 3'-положении, то дальнейшая элонгация цепи невозможна [20]. Необходимо также отметить, что и 3'-5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы ВПГ-1 не может удалить терминальный 3'-АСУ-монофосфатный остаток, следовательно, происходит терминация репликации ДНК вируса. [21, 22].

Позднее было показано, что пенцикловир и ганцикловир действуют аналогичным образом, но являются более токсичными для клетки, чем ацикловир, поскольку их фосфорилированные производные обладают большим сродством к клеточной ДНК-полимеразе, чем фосфорилированный ацикловир.

Их противогерпетическое действие менее эффективно, и в клинической практике они применяются реже.

В неинфицированных вирусом герпеса клетках все описанные реакции фосфорилирования ацикловира происходят в очень незначительном объеме [23].

Другое соединение - сидофовир (рис.7) является с химической точки зрения С-фосфонатом и аналогом 5'-dCMP. Следовательно, фосфорилирование до монофосфата ему не требуется. То есть стадия с участием тимидинкиназы вируса в данном случае пропускается. Сидофовир сразу фосфорилируется клеточными ферментами до фосфанат-дифосфата (аналог dCTP), узнается только ДНК-полимеразой вируса, встраивается в растущую цепь, терминируя тем самым процесс репликации. Поэтому резистентность к данному препарату возникает только за счет мутаций в гене ДНК-полимеразы вируса (UL30) [24].

Помимо общеизвестного ацикловира и его аналогов, было показано, что репликация геномной ДНК вируса герпеса заметно ингибируется в клетках широким спектром пиримидновых, дезоксирибо- и арабинонуклеозидов [25]. Как бы