Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Этиологические особенности и клинико-иммунологические проявления современной герпетической инфекции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Этиологические особенности и клинико-иммунологические проявления современной герпетической инфекции"

РГ6 од

2 2 ВД '

На правах рукописи УДК 616.98:578.825.11]-07

БРЯЗЖИКОВА Татьяна Станиславовна

ЭТИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ СОВРЕМЕННОЙ ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ

03.00.06 — вирусология 14.00.10 — инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте гриппа Российской академии медицинских наук. Директор института доктор биологических наук О. И. Киселев.

Научные руководители:

доктор медицинских наук Юрлова Т. И. кандидат медицинских наук Исаков В. А.

Научный консультант кандидат биологических наук Мазинг Ю. А.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кузнецов О. К. доктор медицинских наук, профессор Рахманова А. Г.

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург.

Защита состоится « . » . . —. . . 1995 г.

в « часов на заседании диссертационного совета Д.074.48.01 НИИ гриппа РАМН (197022, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ гриппа РАМН. ,

Автореферат разослан « . . . . .1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Е. Е. Покровская

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Вирусы простого герпеса (ВПГ) широко циркулируют в человеческой популяции. Антитела к ВПГ 1 и 2 серотипов обнаруживаются у 98 - 100* взрослого населения (Gelger G., 1989). По данным Whitley R.J. et al. (1993) ВПГ поражает 30-40 % населения во второй половине жизни.

ВПГ являются этиологическими агентами герпетической инфекции. которую относят к оппортунистическим инфекциям. Особая тяжесть течения последних связана с иммунодефицитом, сформированным основным заболеванием.'^ В этих группах больных существует высокий риск развития вялотекущих, прогрессирующих кож-но-слизистых поражений, а также генерализации инфекционного процесса с поражением внутренних органов. Герпетическая инфекция может быть непосредственной причиной смерти таких больных.

ВПГ является этиологическим фактором.около 10% общего количества энцефалитов,однако герпетические энцефалиты сопровождаются высокой летальностью (Welsberg L.A. et al., 1988; Про-тас И. И. и др, 1989). Помимо энцефалитов ВПГ может обусловить другие тяжелые заболевания нервной системы: полирадикуломиели-ты. менингиты. В литературе последних лет обращается внимание на то, что подобные больные не получают высокоэффективного лечения ввиду отсутствия своевременной вирусологической диагностики (Farkklla М. et al.. 1993).

Нередко герпетическая инфекция протекает как самостоятельное заболевание, для которого характерен полиморфизм клинических проявлений, как в отношении локализации поражений, их распространенности и чувствительности к терапии, так и в отношении глубины и разнообразия иммунологических сдвигов, сопровождающих инфекционный процесс. В процессе терапии возможным является формирование резистентности ВПГ' -к виростати-кам, приводящее к изменению патогенеза инфекции (Hlrseh M.S., Schooley R.T., 1989).

В последние годы появились сообщения о необычных проявлениях герпетической инфекции у иммунокомпетентных лиц. Описаны случаи эзофагитов,. обусловленных ВПГ1 у взрослых (Chlen Р.. N. et а!.. 1992; Elliotts. Y. et al.. 1993), атипичного крупа.

вызванного ВПГ1 у больных гриппом после короткого курса декса-метазона (Inglls A.F.. 1993). В этиологической структуре фарингитов у взрослых в 5.1% случаев был установлен ВПГ1 (McMillan J. A. et al., 1993). Эти данные расширяют представление о роли ВПГ в инфекционной патологии иммунокомпетентных лиц.

Изменчивость вирусов простого герпеса и индивидуальные особенности защитных реакций инфицированного организма создают многообразие клинико-имыунологических проявлений герпетической 'инфекции, с которым сталкиваются клиницисты. Несмотря на пристальное внимание к проблеме герпетической инфекции специалистов различного профиля, лечение рецидивирующих форм герпетической инфекции остается нерешенной задачей, отчасти вследствие объективной сложности проблемы,, отчасти в связи с тем, что исследования носят разобщенный характер, замыкаясь подчас на весьма узких аспектах проблемы. Между тем. особенности пер-систентной инфекции требуют комплексного подхода, анализа всей сложности системы взаимодействия .возбудителя и организма с использованием достижений целого ряда современных дисциплин.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью работы является изучение этиологических особенностей и клинико-иммунологических проявлений герпетической инфекции в настоящее время.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:

- изучишь клинические особенности рецидивирующей герпетической инфекции в настоящее время;

- изучить инфекционную активность клинически! изолятов вирусов простого герпеса разных лет выделения в клеточных культурах различного происхождения;

- определить антигенный профиль клинических изслятов ВПГ по отношению к эталонному тамму и современному - ВПГ.1 /Ленинград/248/88;

~ исследовать чувствительность клинических изолятов ВПГ к некоторым химиопрепаратам. применяющимся в клинике, в том числе ацикловиру, и новым, относящимся к различным классам соединений;

/

- уточнить условия формирования резистентности ВПГ к ацик-ловиру в эксперименте in vitro;

- изучить иммунологические' реакции у больных рецидивирующей герпетической инфекцией в зависимости 'от стадии инфекцион-. дозо процесса и тяжести течения болезци:

- определить прогностические критерии течения герпетической инфекции на основе существующих лабораторных тестов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

1. Впервые изучена гетерогенность природной популяции вируса простого герпесу по комплексу биологических признаков и определена их взаимосвязь.

2. Впервые выделены различные фенотипические варианты ВПГ от одного больного одномоментно.

3. В условиях эксперимента In vitro показана динамика формирования резистентности к ацикловиру и зависимость этого процесса от дозы препарата и пассажного уровня.

4. Впервые исследована роль факторов неспецифической резистентности у больных при герпетический инфекции в зависимости от тяжести течения болезни.

5. Впервые изучена функциональная активность нейтрофиль-ных гранулоцитов у больных рецидивирующей герпетической инфекцией в разные стадии болезни.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

В качестве диагностикума для реакции связывания комплемента рекомендован и внедрен в практику в НИИ гриппа штамм ВПГ1/Ленинград/248/88. что позволило существенно (в 1.5 раза) повысить эффективность диагностики герпетической инфекции у больных. Подготовлены документы диагностического штамма для представления в ГИСК.

Издано информационно-методическое письмо "Принципы терапии больных простым герпесом" , Санкт-Петербург. 1993.

- 6 -

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Популяция клинических изолятов 1977 и 1993 годов выделения гетерогенна по биологическим и антигенным свойствам и состоит в основном из умеренно- и низкоурожайных вирусов, анти-.генный профиль большинства изолятов подобен эталону. Клинические изоляты ВПГ обладают различной чувствительностью к ацикло-виру, наряду с высокочувствительными штаммами охарактеризованы резистентные н промежуточные по чувствительности к ащкловиру варианты ВПГ.

2. Установлена зависимость формирования резистентности ВПГ к ацикловиру 1п уИго от дозы препарата и пассажного уровня. Существует прямая корреляция меаду инфекционной активностью вируса .простого герпеса в культуре клеток и чувствительностью к ацикловиру.

3. Тяжесть течения герпетической инфекции у больных связана с выраженностью изменений иммунологических реакций. При частых рецидивах инфекции отсутствуют различия в содержании сывороточного церулоплазмина, сывороточного и секреторного иммуноглобулинов класса А в стадии обострения и ремиссии. У больных часторецидивирующей формой инфекции существует угнетение фагоцитарного звена иммунитета в стадии ремиссии,- проявляющееся уменьшением абсолютного количества моноцитов в циркулирующей крови, а также истощением окислительно-восстановительного потенциала нейтрофильных гранулоцитов.

4. Установлена динамика показателей катионных белков нейтрофильных гранулоцитов в сыворотке крови и мазках периферической крови. Уровень катионных белков, определяемый в лизо-сомально-катионном тесте существенно снижен в стадии обострения герпетической инфекции, в стадия ремиссии не отличается от показателей здоровых лиц. Содержание миелопероксидазы в сыворотке крови больных в период обострения и ремиссии превышает показатели нормы, увеличение содержания сывороточного лакто-феррина коррелирует с наступлением клинической ремиссии.

- 7 -

АПРОБАЦИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на VII Конгрессе по инфекционным и'паразитарным болезням. Болгария. 1992; Первой международной конференции по иммунореабили-тации, Сочи. 1992; Симпозиуме "Новые подходы к целенаправленному конструированию противовирусных препаратов", Санкт-Петербург. 1994.

ПУБЛИКАЦИИ

Материалы диссертации изложены в 11 научных работах.■

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Работа состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения и выводов, списка литературы. Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы цель и задачи исследования, отражены научная новизна, теоретическая и практическая'значимость полученных результатов. В первой главе дан обзор современных представлений о этиологических особенностях, клинико-иммуноло-гических проявлениях герпетической инфекции и лекарственных препаратах используемых при ее лечении. Последующие разделы посвящены результатам собственных исследований, в процессе обсуждения которых представлен сравнительный анализ полученных результатов и литературных данных. Диссертация изложена на 159 страницах, иллюстрирована 34 таблицами и 2 рисунками, библиография содержит 170 источников.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Под нашим наблюдением в течении трех лет находилось 112 больных рецидивирующей герпетической инфекцией в возрасте от 16 до 58 лет. Диагноз устанавливался на основании клини-ко-анамнестических данных, подтверждался вирусологически (выделение вируса простого герпеса в клеточных культурах). серологически (реакция связывания комплемента) и методом Флуоресцирующих антител.

Для оценки иммунного статуса пациентов определят показатели гемограммы, содержания Т-лимфоцитов и их субпопуляций в теофиллиновом тесте в модификации, рекомендованной Институтом иммунологии МЗ России (Петров Р.В. и др., 1992). Функциональную, активность нейтрофилов оценивали с помощью тестов фагоци-' тоза и восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) в модификации (Петров Р.В. и др.. 1992), á тагаке лизосомально-ка-•гионного теста (Пигаревский В.Е., Мазинг D.A., 1987). Определяли уровень циркулирующих иммунных комплексов (Haskova V. et al..' 1977). Содержание лактоферрина и миелопероксидазы в сыворотке крови исследовали в иммуноферментном анализе в модификации (Зорин А.Д. и др., 1992). Трансферрин. церулоплазмин и иммуноглобулины основных классов исследовали методом радиальной иммунодиффузии в геле, по Manchlnl G. et al. (1965). Иммунологические исследования проводились совместно с ВазохиноЯ М.Ю., Алешиной Г.Н.. Черновой Т.М..

Виуисы, В работе использованы эталонные штаммы вируса простого герпеса ВПГ1/И1р-2/эталон и ВПГ2/И1-38/эталон. 6 штаммов ВПГ1 из коллекции вирусов ОРЗ Федерального центра по гриппу и ОРЗ (г. Санкт-Петербург) и 7 клинических изолятов. выделенных нами.

Были использованы иммунные кроличьи сыворотки к эталонным штаммам и штамму ВПГ1/Ленинград/248/88.

В работе использовали первичную культуру клеток почки эмбриона человека (ПЭЧ), фибробласты почки эмбриона человека, фибробласты легкого эмбриона человека (ЛЗЧ) и перевиваемую клеточную линию почки зеленой мартышки (Vero).

Методы изучения биологических свойств ВПГ. Клонирование вирусов осуществляли методом предельных разведений трехкратно. Репродукционную активность ВПГ изучали в различных тканевых культурах - эпителиальной ткани ПЭЧ, фибробластах ПЭЧ, фибропластах ЛЭЧ. а также перевиваемой культуре Vero. Результаты титрования, полученные на каждый день инкубации, обрабатывали по методу Рида и Менча. 1938. Скорость репродукции на каждый день инкубации вычисляли на основе использования метода суммы

наименьших квадратов и выражали в коэффициентах регрессии инфекционной активности (КРИА: Селиванов A.A. и др..1971). Значения КРИА использовали как показатель урожайности вирусов: высокоурожайный - > 2. умеренноурожайный — 1.5 < КРИА < 2.0, низкоурожайный - < 1.5.- Антигенный профиль-изолятов определяли в реакции нейтрализации с иммунными кроличьими сыворотками к референс-штаммам ВПГ и штамму ВПГ1/Ленинград/248/88.

Чувствительность вирусов к химиопрепаратам определяли на однослойных клеточных культурах в пробирках с оценкой результатов по цитопатогенноыу действию (ЦПД). что позволило дать количественную оценку с расчетом титра вируса (Читав н. П. и др., 1988).

Рестрикционный анализ ДНК референс-штаммов ВПГ и клинических изолятов ВПГ проводили в совместных исследованиях с к.б.н. Головиной Г.И. с использованием методов Hirt В.(1967) Kodell G, (1980). модифицированных Головиной Г. И.. '

Для идентификации ВПГ и контроля отсутствия контаминации штаммов был использован метод электронной микроскопии Бреннера и Хорна (1959). основанный на принципе негативного контрастирования.

Результаты исследований обрабатывали с применением параметрической статистики (t-критерий Стьюдента). Проводили регрессионный анализ. Расчеты проведены на персональном компьютере типа IBM-PC с помощью пакета прикладных программ для медико-биологических исследований (Statgraflcs).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Клинические проявления инфекции, обусловленной вирусами простого герпеса, отличаются большим разнообразием. Это показано результатом наших трехлетних наблюдений- амбулаторной группы больных и соответствует данным, приводимым другими авторами (Баринский И.Ф.. 1986; Пригожина В. К.. 1990). Наблюдаемая нами группа пациентов состояла в основном из лиц молодого возраста, до 40 лет - 91 больной (8155). с длительностью заболевания от 2 до 5 лет. Частота рецидивов герпетической инфекции 6 - 12 раз в год отмечена у 37 больных (333?). В качестве

особенности нашей группы больных мы отметили относительную частоту встречаемости распространенной формы герпетической инфекции. то есть наличие одновременно поражений двух и более локализаций. Эта форма инфекции по нашим наблюдениям отмечена у 10.1% пациентов. У одной из таких больных во время рецидива мы выделили из поражений различных локализаций одновременно два штамма вируса простого герпеса, отличавшихся по фенотипи-ческому профилю. Другая пара штаммов, отличавшихся по комплексу признаков, была выделена одномоментно от ребенка с распространенной формой герпетической инфекции. Ранее Оипйагоу Б. и соавт. (1980) выделяли от одного больного в разные периоды времени из поражений разной локализации штаммы ВПГ с идентичными антигенными свойствами. Мы впервые провели изучение штаммов ВПГ. выделенных одновременно от одного больного по комплексу признаков и показали, что эти штаммы отличаются по антигенным свойствам, инфекционной активности в культурах клеток и чувствительности к ацикловиру (таблица 1). Мы считаем, что наши данные подкрепляют положение о том. что клинический полиморфизм герпетической инфекции обусловлен не только индивидуальными защитными реакциями больного, но и разнообразием циркулирующих вирусов простого герпеса.

ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ И АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ

КЛИНИЧЕСКИХ И30ЛЯТ0В ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА

Особенностью вируса простого герпеса является способность к персистенции в восприимчивом организме. Герпетическая инфекция характеризуется отсутствием эпидемического распространения. инфекционный процесс ограничивается отдельными индивидами или носит характер локальных вспышек в замкнутых коллективах.

Изолированность, свойственная природным популяциям вируса простого герпеса, приводит к тому, что отдельные субпопуляции (штаммы), находясь в различных условиях существования, претерпевают адаптивные сдвиги и расходятся генетически (Цилинский Я.Я.. 1988). Ранние исследования природной популяции ВПГ касались отдельных биологических свойств вируса. Показанная в них неоднородность популяции вируса простого герпеса по антигенным

ТАБЛИЦА 1. СРАЕНИТЕЛЕНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ДВУХ ШШ.ШВ. '

ВВДЕЛЕННЫХ ОДНСЮ.<ЕНТНО ОТ БОЛЬНОГО ¡3, 8 нес.

N Епрусы Чувствительность к ацикловиру Степень антигенного рсдстаа иголятов Е 1 по ОТНОЕеНЖ! . к указанным вирусам Активность рещюдукцшиуказавных стаьгкоз в. тканевых кулаг/рак различного прокохозщешш. е КРИАл ■

умерен- Н'}ЧуЕС. реано-тент. ЕПГ1.'№г1р-2' эталон ВПГ1/Ленинград/ 248/68 пзч апител. ПЗЧ фиброб. лзч.. Чего

£ПГ1 <»:.-. Петербург/ II + 12.5 25.0 0.71 0.65 1.0 . 0

епг1<<:.-IП^тер^ург' + 50.0 50.0 0.74 1.15 1.4 0.23

* КРНА - коэффициент регрессии инфекционной активности

и биологическим свойствам, подтверждена нашими данными. Новизной нашего подхода к решению этого вопроса явилось изучение циркулирующей популяции ВПГ по комплексу признаков: инфекционной активности в различных тканевых культурах, антигенной характеристики, чувствительности к ацикловиру. Следует особо подчеркнуть. • что изучение биологических и антигенных свойств клиничесисих изолятов вируса простого герпеса разных лет выделения явилось важным этапом наших исследований для оценки взаимосвязи этих свойств и чувствительности вирусов к химиопрепа-ратам, показанной в следующем разделе работы.

Представляло определенный интерес изучение клинических особенностей течения инфекции у больных от которых были выделены конкретные штаммы ВПГ. Так мы отметили, что штаммы ВПГ. имеющие сниженную инфекционную активность в клеточных культурах и антнгенноотличный от эталона профиль, могут вызвать тяжелое течение герпетической инфекции на фоне сниженного иммунитета.

В основном популяция ВПГ, исследованная нами, состояла из - умеренно- и низкоурожайных вирусов (таблица 2). антигенный профиль большинства изолятов был идентичен эталону. Мы отметили также, что изоляты. имевшие антигенноотличный профиль, характеризовались низкой инфекционностыо в различных культурах клеток, а высокоурожайные вирусы были идентичны по антигенным свойствам эталону и полагаем наличие взаимосвязи этих признаков.

Исследование циркулирующей популяции ВПГ позволило выбрать штамм ВПГ1/Ленинград/248/88, высокоурожайный в различных клеточных системах. Детальное изучение данного штамма позволило предложить его для диагностики герпетической инфекции у больных, находившихся под нашим наблюдением. Эффективность серологической диагностики герпетической инфекции при использовании данного штамма оказалась выше в 1.5 раза по сравнен;« с эталонным штаммом.

ТАБЛИЦА 2. ИНТЕНСИВНОСТЬ РЕПРОДУКЦИИ ИЗОЛЯТОВ ВПГ В ТКАНЕВЫХ КУЛЬТУРАХ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОВДЕНИЯ В КОЭФФИЦИЕНТАХ РЕГРЕССИИ ИНФЕКЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ

Штаммы Коэффициенты регрессга инфекционной активности на указанных тканевых культурах

ПЭЧ ПЭЧ фибр. ЛЗЧ VERO

* ** * * ** « **

ВПГ1/Щр-2/ эталон . 0.7 1.2 1.1 1.8 1.1 1.5 1.8 2.5

ВПГ1/Ленинград/303/77 0.6 0.9 1.7 1.8 1.1 1.3 0.8 0.9

ВПГ1/Ленинград/309/77 0.5 0.9 1.8 2.5 0.5 0.8 0.6 1.0

ВПГ1/Ленинград/404/77 0.5 1.0 1.5 2.5 1.3 1.6 0.7 0.8

ВПП/Ленин град/405/77 0.6 0.9 1.0 1.5 1.2 1.5 0.9 1.2

ВПГ1/ЛениИград/421/77 1.3 2.0 1.6 1.9 1.1 1.4 0.6 0.9

ВПГ1/Ленин град/424/7 7 1.1 1.5 2.5 3. 0 1.3 1.4 1.3 1.7

ВПГ1/Ленинград/248/88 1.4 2.2 1.0 1.6 1.9 2.2 1.5 2.0

1ВПГ1/С-ПетерОург/12/93 0.5 0.8 1.0 1.5 1.4 1.9 2.2 2.6

ВПГ1/С-Петербург/14/93 0.7 1. 1 1.0 1.5 0 0 0.3 0.6

ВПГ1/С-Петербург/34/93 0.7 1.1 1.0 1.5 1.1 1.4 0 0

ВПГ1/С-ПетерОург/35/93 0.7 1.1 1.2 1.5 1.4 1.5 0.5 0.5

ВПП/С-Петербург/51/93 1.0 1.5 1.1 2.0 1.6 1.8 1.5 1.8

ВПГ2/Щ-38/эталон 0.6 0.8 1.2 2.3 1.5 1.8 1.2 1.6

ВПГ2/С-Петер0ург/6/93 0.6 0.9 1.0 1.5 0.8 1.1 0 0

» - КРИА средние величины »« - КРИА максимальные величины

- 14 -ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА К ХШОПРЕПАРАТАМ

Наши исследования показали варьирующую чувствительность клинических изолятов вируса простого герпеса к ацикловиру. препарату, признанному во всем мире в качестве средства проти-вогерпетической терапии (Whitley R.J., Gnann J.W.. 1992). Наряду с высокочувствительными штаммами мы описали группу резистентных и промежуточных по чувствительности к ацикловиру вариантов ВПГ. Изоляты ВПГ были выделены от больных.не принимавших адакловир ранее. Наши данные свидетельствуют о наличии резистентных к ацикловиру вариантов ВПГ в естественной циркулирующей популяции. Большинство резистентных вариантов ВПГ получено от детей до 2 лет. Резистентные штаммы характеризовались низкими репродукционными свойствами на различных тканевых культурах и имели промежуточный, либо антигенноотличный профиль по отношению к штамму ВПГ1/Ленинград/248/88. Последний характеризовался высокими репродукционными свойствами в тканевых культурах и высокой чувствительностью к ацикловиру,' антигенный профиль этого штамма был подобен эталону.

Ранее сообщалось о выделении от одного больного в разные периоды времени изолятов ВПГ. отличающихся по чувствительности к ацикловиру (Frelfeld A.G., Ostrove J.M., 1991). Новизной наших исследований явилось одновременное выделение от одного больного из поражений разной локализации штаммов ВПГ, отличающихся по чувствительности к ацикловиру, а также исследование инфекционной активности этих.. штаммов на различных тканевых культурах и антигенного профиля по отношению к эталону и современному штамму ВПГ1/Ленинград/248/88. По всем изученным признакам изоляты ВПГ,. выделенные одномоментно от одного больного. имели отличия (таблица 1). Мы считаем, что эти данные подтверждают положение о разнообразии циркулирующей популяции ВПГ и. скорее всего, отражают существовании нескольких механизмов формирования этого разнообразия - суперинфекция индивида неидентичным штаммом (Bucliman Т. G. et al.. 1978). мутации и рекомбинации отдельных клонов, составляющих локальную вирусную субпопуляцию- в инфицированном организме (Цилинский Я.Я..

1988). Мы считаем, что тестирование клинических изолятов ВПГ на чувствительность к химиопрепаратам является необходимым звеном индивидуальной тактики ведения больных герпетической инфекцией, особенно в тех случаях, когда имеет место тяжелое течение заболевания, а терапия носит неэффективный характер.

Наличие резистентных к ацикловиру вариантов ВПГ в естественной циркулирующей популяции диктует необходимость поиска новых противогерпетических химиопрепаратов с иным, чем у ацик-ловира, механизмом действия.

Проведенный скрининг новых химиопрепаратов, относящихся к различным классам соединений позволил выявить противогерпети-ческую активность амтизола 0 (3,5-диамино-1,2,4-тиодиазол) и амтизола С (амтизол-сукцинат) в опыте с предварительной обработкой этими препаратами культуры клеток легкого эмбриона человека. По всей видимости, противовирусное действие этих соединений опосредовано метаболическими процессами клеток.

Для уточнения условий формирования резистентности ВПГ к химиопрепаратам мы провели серию пассажей клинического изолята ВПГ1/Ленинград/248/88 в клеточной культуре легкого эмбриона человека в присутствии ащкловира. Иы отметили ряд закономерностей:

- чувствительность ВПГ к ацикловиру прогрессивно снижается по мере пассирования вируса в присутствии препарата;

- формирование резистентности ВПГ при использовании высоких доз происходит медленнее, чем в случае применения более низких концентраций препарата, полную резистентность мы наблюдали только при использовании доз 60-250 мкг/мл на 8 - 9 пассажах;

- инфекционная активность ВПГ в культуре клеток снижается по мере Формирования резистентности штамма к' ацикловиру, мы отметали прямую корреляцию этих признаков. Так. повышение чувствительности ВПГ к ацикловиру на 6 пассаже сопровождалось усилением репродукционной активности.

- 16 -

КЛИНШ-ИМШОЛО ГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ РЕЦИМИВИ-РУЩЕЙ ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИЕЙ.

Проведенное наш исследование иммунологических реакций у больных герпетической инфекцией показало, что тяжесть течения заболевания связана с выраженностью сдвигов в системе факторов неспецифической резистентности. Так, мы установили , что динамика сывороточного церулоплазмина, острофазового белка, выполняющего разнообразные защитные функции, более выражена у боль- • ных с редкими рецидивами заболевания по сравнению с больными часторецидивирующей формой герпеса. Мы отметили также, что у больных с редкими эпизодами герпетической инфекции в стадии рецидива достоверно снижен уровень сывороточного 18 А и достоверно выше уровень секреторного А (в слюне) по сравнению с соответствующими показателями в ремиссии. У больных с тяжелым . течением заболевания и частыми рецидивами статистически достоверных различий между периодами болезни'по данным показателям мы не обнаружили, что на наш взгляд отражает существование более полноценных защитных реакций, в том числе местных, у больных с редкими обострениями герпетической инфекции по сравнению с больными часторецидивирующим герпесом.

Значительно более высокие титры антител классов Б и М в стадии ремиссии у больных по сравнению с показателями доноров отражают, по всей видимости, хроническую антигенную нагрузку, имеющуюся у больных как с легким , так и с более тяжелым течением заболевания, и могут косвенно свидетельствовать о напряженном функционировании всей системы защитных реакций организма при персистентной инфекции.

Мы исследовали динамику иммунологических показателей, используя принцип выделения отдельных периодов (фаз) заболевания по морфологическим признакам местной воспалительной реакции: фаза 1 - наличие пузырьков, фаза 2 - образование эрозий. Фаза 3 - корочек, фаза 4 - отсутствие воспалительных изменений. Клинически фазы 1 и 2 соответствовали обострению, фаза 4 - ремиссии. а фаза 3 трактовалась как переходная от обострения к ремиссии. Удалось выявить угнетение фагоцитарного звена иммунитета у больных с частыми.рецидивами заболевания, проявляйте-

еся как снижением абсолютного количества моноцитов, так и истощением окислительно-восстановительного потенциала нейтрофи-лов в стадии клинической ремиссии. Отмеченная нами закономерность прослежена у группы пациентов с часторецидивирующей формой герпетической инфекции, а также на примере отдельных больных. Так как речь идет о персистентной инфекции, эти закономерности отражают нэ взаимоисключающие, а длительные и динамичные отношения хозяина и паразита. Таким образом, можно полагать, что угнетение фагоцитарного звена иммунитета сопутствует персистенции вируса простого герпеса.

Содержащиеся в гранулах нейтрофилов катионные белки выполняют разнообразные функции в воспалительной реакции (медиаторов воспаления, неспецифических' опсонинов при фагоцитозе, модуляторов свертывания крови и фибринолиза). Катионные белки обеспечивают мощный антимикробный потенциал нейтрофилов благодаря- комплексному воздействию на структуру и обмен веществ микроорганизмов (Пигаревский В.Ё.. 1978; Мазинг Ю. А..1991). Мы установили, что уровень секреторной активности нейтрофиль-ных гранулоцитов остается высоким на протяжении всех периодов заболевания, об этом свидетельствует высокий уровень миелопе-роксидазы в сыворотке крови у больных, достоверно превышающий соответствующий показатель доноров. По мере стихания острых проявлений болезни повышается уровень сывороточного лактофер-рина. превышающего в ремиссии показатели доноров более чем в два раза. Эта закономерность, вероятно, также отражает напряженное функционирование системы защитных реакций у больных рецидивирующей герпетической инфекцией (Таблица 3).

Повышение показателей лизосомально-катионного теста до нормальных значений в стадии клинической ремиссии является благоприятным прогностическим критерием, свидетельствующим о восстановлении антимикробного потенциала нейтрофильных гранулоцитов. Возможно, это является и компенсаторной реакцией в ответ на истощение кислородзависимого механизма биоцидности нейтрофилов. отмеченному нами у больных в стадии ремиссии.

Изучение иммунологических реакций у больных герпетической инфекцией позволило нам предложить ряд прогностических крите-

ТАБЛИЦА 3. СОДЕРЖАНИЕ ЛАКТОФЕРРИНА И МИЕЛ0ПЕР0КСИДАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ РЕЦИДИВИРУЮЩЕЙ ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИЕЙ В РАЗЛИЧНЫЕ ФАЗЫ БОЛЕЗНИ

Показатели ЛКТ МПО ЛФ

усл. ед. нг./мл нг./мл

фаза 1 1.26Ю.064*« 360+71.7# 7311134.1

фаза 2 1.4410.028* 351139.1# 1392+142.6*

фаза 3 1.44±0.039* 318139.0* 1542+186.2**

фаза 4 1.56±0.027 43И44.0# 22821216.9#

Норма 1.58Ю.01 160+20.0 1000И40. 0

Достоверность различий (Р) по сравнению с нормой: * <0,05; ** <0.001; # <0,0005.

риев на основе лабораторных тестов. Так, положительное прогностическое значение имеет повышение показателей лизосомаль-но-катионного теста, уровня сывороточного ^ А и противоположная динамика сывороточного церулоплазмина. Отмеченная динамика показателей свидетельствует о наступлении клинической ремиссии. Трехкратное повышение уровня лактоферрина в сыворотке крови в период ремииссии по сравнению с острым периодом заболевания можно, очевидно, считать благоприятным признаком, свидетельствующим о купировании острых проявлений заболевания. Однако уровень лактоферрина у больных в ремиссии двухкратно превышает показатели у доноров, что может свидетельствовать о напряженном функционировании системы защитных реакций у больных в состоянии ремиссии и отражает, по всей видимости, неблагоприятное в целом, часторецидивируюшее, течение заболевания.

Таким образом, наши исследования показывают, что факторы неспецифической резистентности играют важную роль в системе защитных реакций при рецидивирующей герпетической инфекции.

- 19 -ВЫВОДЫ

1. Показало разнообразие клинических проявлений герпетической инфекции по локализации поражений и их сочетанию, тя-аести течения заболевания.

2. Изучена гетерогенность циркулирующей популяции вирусов простого герпеса по биологическим и антигенным свойствам. Исследованная популяция клинических изолятов ВПГ разных лет выделения состояла в основном из умеренно- и низкоурожайных вариантов. антигенный профиль большинства изолятов был подобен эталону.

3. Показана различная чувствительность к ацикловиру клинических изолятов ВПГ разных лет выделения. В циркулирующей популяции наряду с высокочувствительными, нередко встречаются резистентные, а также промежуточные по чувствительности к ацикловиру варианты ВПГ. Высокочувствительные к ацикловиру изоляты отличаются высокой репродукционной активностью в клеточных культурах и имеют антигенноидентичный по отношению к эталону профиль. Напротив, резистентные варианты ВПГ имеют низкую репродукционную активность в клеточных культурах, среди них обнаружены штаммы, отличающиеся по антигенной характеристике от эталона и штамма ВПГ1/Ленинград/248/88.

4. Впервые выделены от одного больного одномоментно из поражений разной локализации изоляты ВПГ, отличающиеся по инфекционной активности в культуре клеток, антигенной характеристике и чувствительности к ацикловиру.

5. Установлена противогерпетическая активность новых соединений - амтизола 0 и амтизола С в культуре клеток. Данные препараты рекомендованы для дальнейших испытаний.

6. Установлено, что чувствительность ВПГ к ацикловиру при пассировании в культуре клеток в присутствии препарата снижается в 10 раз на 9 пассаже. Формирование резистентности ВПГ при использовании высоких доз происходит медленнее, чем в случае применения низких концентраций препарата. Одновременно снижается инфекционная активность тестируемого вируса.

- 20 -

7. Показано угнетение фагоцитарного звена иммунитета в стадии клинической ремиссии у больных рецидивирующей, герпетической инфекцией, проявляющееся снижением абсолютного количества моноцитов циркулирующей крови и истощением окислительно-восстановительного потенциала нейтрофильных гранулоцитов.

8. Обнаружена различная функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов у больных в разные периоды болезни. Уровень катиошшх белков нейтрофильных гранулоцитов. определяемый в лизосомально-катионном тесте, существенно снижен в стадии обострения, в ремиссии не отличается от показателей здоровых лиц. Уровень миелопероксидазы в сыворотке крови больных в период обострения и ремиссии достоверно превышает показатели здоровых лиц, в то время как повышение содержания сывороточного лактоферрина коррелирует с наступлением клинической ремиссии.

9. Тяжесть течения герпетической инфекции связана с выраженностью сдвигов в системе факторов неспецифической резистентности организма. Предложены прогностические критерии на основе лабораторных тестов. Повышение показателей лизосомаль-но-катионного теста, уровня сывороточного ^ А, а также снижение концентрации сывороточного церулоплазмина свидетельствует о благоприятной динамике и наступлении ремиссии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Брязжикова Т.е., Алешина Г.М., Исаков В.А.. Мазинг Ю. А. Катионные белки нейтрофильных гранулоцитов у больных рецидивирующим герпесом. // В сб. Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения. Тез докл. научной конференции 23-24 марта 1995 года. - С.-Петербург,- 1995. - С.351.

2. Брязжикова Т.С. Использование флакозида в терапии рецидивирующей герпетической инфекции. // В сб. Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения. Тез докл. научной конференции 23-24 марта 1995 года. - С.-Петербург.- 1995. - С. 350.

3. Брязжикова Т. С., Исаков В. А.. Юрлова Т. И. и др. Варьирующая чувствительность клинических пзолятов вируса простого

герпеса к ацикловиру. // В сб. Новые подходы к целенаправленному конструировании противовирусных препаратов. Тез. докл. Симпозиума (Санкт-Петербург. 5-7 октября 1994). - С.-Петербург. - 1994. - С. 17.

4. Брязжикова Т.е.. "Ермоленко Д.К.. Исаков В.А. Опыт лечения больных герпетической инфекцией. // В сб. Новые подходы к целенаправленному конструированию противовирусных препаратов. Тез. докл. Симпозиума (Санкт-Петербург. 5-7 октября 1994). - С.-Петербург. - 1994. - С.41.

5. Исаков В.А., Ермоленко Д.К.. Брязжикова Т.С. Опыт лечения больных простым герпесом. // В сб. Острые респираторные заболевания у детей. - Л. - 1991. - С. 129-137.

6. Чижов Н.П..Головина Г.И..Юрлова Т.Н.. Брязжикова Т.е. Новые подходы к химиотерапии герпесвирусных инфекций. // Антибиотики И химиотерапия. - 1993. - Т38. - N10-11. - С.75-83.

7. Исаков В.А.. Ермоленко Д.К.. Брязжикова Т.С. и др. Принципы терапии больных простым герпесом /информационно-методическое письмо/. - С.-Петербург - 1993. - 23с.

8. Ермоленко Д. К.. Исаков В. А.. Туркин В. В.. Исаков Д. В., Брязжикова Т.С. и др. Показатели неспецифической резистентности при герпесе. // В сб. НИИ им. Пастера "Актуальные проблемы инфекционной патологии". Часть 3. - Тез. докл. юбилейной конф. 25-27 мая 1993г. - С.-Петербург. - 1993. - С.22.

9. YerraoLenko D.K.. Issako1-' V.A.. Ogurtsov R.P.. Bryazz-hlkova T.S. et. al. Immunorehabllltatlon of patlents wlth herpes slmplex. // Intern. J. of Irenunorehabllltatlon. - 1994. -Nl-Suppl. - P. 383 - 384.

10. Isakov V.. Kamyshentsev M.. Voltchek I.. Fllyov L.. Yermolenko D.. Bryazzhlkova T. Applications of Immunomodulators ln the Therapy of patlents wlth herpes. //7 th Intern. Symposlum on Infectíons ln the Im;nunocomhronilsed. - 1992. -Colorado. USA. - Abstr. 146.

11. Isakov V.A. Ermolenko D.K., Kamyshentsev M.V.,Bryazz-hlkova T.S et al. Advance ln treatment of patlents wlth herpes ■slmplex. // Intern. Congress on the Management of Infection. 1992. - Arnsterdam. - Abstr. F 13.

Тцп. íiHUwj/V.l ¿Vi Тир f!?>