Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферменты крови и слезы при герпетическом кератите

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ферменты крови и слезы при герпетическом кератите"

Па правах рукописи.

Р Г Б ОД

1 3 МАЙ Ь'Ь'Ь

С О С Н ИII Дмитрий Юрьевич

ФЕРМЕНТЫ КРОВИ И СЛЕЗЫ ПРИ ГЕРПЕТИЧЕСКОМ

КЕРАТИТЕ

03.00.04 - биохимия 14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь -1996

Работа выполнена на кафедре биохимии Пермской государственной медицинской академии.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ

доктор медицинских наук, профессор Н. А. Терёхина ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор И. Ф. Елькин доктор медицинских наук, профессор Ф. X. Камилов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: МОСКОВСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

Защита состоится « ^ » О0_1996 г. в У** часов на

заседании диссертационного совета К 084.09.01. Пермской государственной медицинской академии (614600, г. Пермь, ул. Куйбышева, 39).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной медицинской а] и.

Автореферат разослан «_

1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент

Р. С. КУЗЯЕВ

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Самой распространенной вирусной инфекцией человека в настоящее время является герпетическая [И. Ф. Баринский и соавт., 1986; А. А. Каспаров, 1994; R. J.Whitley, 1990]. Вирус простого герпеса (ВПГ) ответственен за значительную долю инфекционной патологии человека [А. Г. Коломиец и соавт., 1986; В. М. Жданов, 1990]. Это обусловлено его способностью поражать различные органы и системы человеческого организма с формированием, как правило, хронически протекающих заболеваний [А. Г. Букринская, В. М. Жданов, 1991].

Заболевания, обусловленные ВПГ, занимают второе место (15,8%) после гриппа (35,8%) как причина смертности от вирусных инфекций [И. Ф. Баринский, С. JL Нестерчук, 1995]. Выявлена этиологическая роль ВПГ - 2 при раке шейки матки и карциноме предстательной железы [Г. А. Посевая и соавт., 1991; R. Ashley et al., 1994]. Внутриутробная инфекция плода, являющаяся результатом трансплацентарного проникновения вируса, приводит к развитию врожденных уродств [L. М.. Frencel, 1994]. Рост числа больных герпетической инфекцией отмечается и у детей [И. В. Хамаганова, 1993], имеются сообщения о возможной роли герпетической инфекции в развитии аутоиммунной патологии [О. В. Катышева и соавт., 1995].

В последние годы отмечена тенденция к увеличению количества заболеваний вызванных ВПГ, в том числе и герпетических поражений - органа зрения [А. А. Каспаров, 1994]. Герпес роговицы составляет среди взрослых 20-57%, а среди детей 70-80% от числа всех воспалительных заболеваний роговицы [И. Ф. Баринский и соавт., 1986; А. А. Каспаров, 1994].

Установлено, что при герпетическом кератите меняется активность ферментов слезы [Н. А. Терехина, 1990]. Состав слезной жидкости отражает состояние не только органа зрения, но и всего организма, что может быть использовано с диагностическими и прогностическими целями [Б. С. Касавина, Т. П. Кузнецова, 1978; II. А. Терехина и соавт., 1988; Н. А. Терехина и соавт., 1989; Ю. А. Петрович, Н. А. Терехина, 1990; Е. Е. Сомов, В. В. Бржеский, 1994; II. Б. Чеснокова, Т. П. Кузнецова, 1995; N. J. Van Haeringen, 1981; I. L. Kahan, 1982; M. Imayasu et al., 1992]. Анализ слезы был использован

для прогнозирования рецидивов офтальмогерпеса [Н. А. Терехина и соавт., 1988; Н. А. Терехина, 1990].

Развитие герпетического кератита сопровождается активацией процессов свободнорадикального окисления в роговице и снижением ее антиоксидантной защиты [Ю. А. Петрович и соавт., 1987; Н. А. Терехина, 1990; Уи. А. РеШтсЬ е1 а1., 1995]. При герпетическом кератите в роговице происходит резкое падение активности антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы и супероксидисмутазы, возрастает хемилюминесценция роговицы [Ю. А. Петрович и соавт., 1987; Н. А. Терехина, 1990; N. А. ТегуокЫпа, 1991]. При герпетическом кератите в роговице резко снижается содержание аскорбиновой кислоты [Г1. С. Каплунович, Г. А. Винькова, 1973]. Слезная жидкость теряет способность ингибировать образование гидроксил-радикала, из нее исчезает аскорбиновая кислота [Н. А. Терехина, 1990]. Применение в лечении больных офтальмогерпесом комплекса неферментативных антиоксидантов (витамины С и Е) показало их высокую терапевтическую активность [Н. А. Терехина и соавт., 1994]. Однако, в доступной литературе недостаточно освещены вопросы изменения активности ферментов-антиоксидантов слезы при герпетическом кератите. Показано, что активности супероксидцисмутазы нет ни в слезе здоровых ни у больных офтальмогерпесом [Н. А. Терехина, 1990].

При герпетической инфекции ВПГ способен транспортироваться по аксонам (нейрогенный путь распространения инфекции) [И. Ф. Баринский и соавт., 1986; Я.. В. Мо^еп й а1., 1992], а также и с клетками крови [А. А. Каспаров, 1994; Н. 5. Ьагееп & а1., 1984]. В инфицированных клетках ВПГ способен реплицироваться, перестраивая метаболизм этих клеток, способствуя хронизации и диссеминации герпетической инфекции [Ю. А. Петрович, Н. А. Терехина, 1990]. ВПГ, реплицируя в лимфоцитах, перестраивает их ферментные системы, снижает активность лактатдегидрогеназы, малатдепздрогеназы, глутатионпероксидазы, кислой фосфатазы, но увеличивает активность супероксиддисмутазы и гшокозо-6-фосфатдегидрогеназы [Н. А. Терехина, 1990]. В литературе мы не нашли данных об активности других антиоксидантных ферментов лимфоцитов.

Тенденция к росту числа заболевших ^офтальмогерпесом и утяжеление клинического течения заболевания с более частыми

рецидивами свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения биохимических изменений в герпесинфицированных тканях.

Целью работы явилось изучение в эксперименте и клинике активности ферментов слезы, тканей герпесинфицированного глаза, мононуклеаров периферической крови больных для выяснения отдельных биохимических звеньев патогенеза герпетического кератита, использование полученных результатов для оценки эффективности лечения.

Основные задачи исследования.

1. Исследовать содержание общего белка, лактоферрина, глюкозы, мочевой кислоты в слезе больных различными формами герпетического кератита в динамике заболевания.

2. Изучить активность антиоксидантных ферментов в слезной жидкости и мононуклеарах периферической крови человека при различных клинических формах герпетического кератита. Использовать полученные результаты для оценки эффективности лечения герпетического кератита.

3. Изучить активность аминотрансфераз, изофермептный спектр лактатдегидрогеназы в мононуклеарах периферической крови больных различными формами герпетического кератита.

4. При экспериментальном герпетическом кератите у кроликов исследовать изоферментный спектр лактатдегидрогеназы тканей переднего отдела глаза, активность каталазы и активность альфа-1-антитрипсина.

Научная новизна исследования.

Впервые проведено изучение активности ряда ферментов-антиоксидантов слезы (каталазы, глутатионредуктазы, пероксидазы) у больных с герпетическими поражениями роговицы.

Впервые изучена активность каталазы, глутатионредуктазы, аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, изоферментный спектр лактатдегидрогеназы в мононуклеарах периферической крови человека при герпетическом кератите.

При экспериментальном герпетическом кератите в водянистой влаге и тканях переднего отдела глаза изучена активность каталазы, а 1-антитрипсина, изоферментный спектр лактатдегидрогеназы.

Практическая ценность работы:

Подтверждена высокая диагностическая значимость анализа слезной жидкости для оценки состояния тканей переднего отдела глаза. Обнаружено, что выявление каталазной активности в слезной жидкости пораженного глаза свидетельствует об активном цитолизе клеток роговицы (эпителия и стромы), а обнаружение активности данного энзима на фоне проводимой терапии свидетельствует о низкой ее эффективности.

Усовершенствован метод определения активности каталазы в сыворотке крови (рационализаторское предложение № 1764), а также предложен метод определения активности каталазы в жидкостях с высоким содержанием пигментов и низким содержанием белков, например, в желчи (рационализаторское предложение № 1763). Результаты диссертации включены в курс лекций кафедры биохимии Пермской государственной медицинской академии.

Обнаруженная способность слезной жидкости вызывать неспецифическую агглютинацию в высоком титре некоторых эритроцитарных диагностикумов ограничивает использование мегода гемагглютинации эритроцитов для исследования слезы.

Полученные результаты о падении антиоксидантной защиты в тканях герпесинфицированного глаза и антиоксидантов слезной жидкости подтверждают целесообразность применения в лечении герпетического кератита комплекса неферментативных антиоксидантов и дают возможность прогнозировать наличие терапевтической активности и ферментов-антиоксидантов при данном заболевании.

Апробация диссертации:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на ежегодных кафедральных научных конференциях по клинической биохимии(Пермь, 1993, 1994, 1995, 1996) Пермской государственной медицинской академии, на конференции Кировского НИИ гематологии и переливания крови "Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины" (Киров, 1993 и 1995 гг.), на научно-практической конференции "Актуальные вопросы современной вирусологии" (Екатеринбург, 1995 г.), симпозиумах "Неинвазивные методы исследования" (Москва, 1994; 1995), на заседании кафедры биохимии ПГМА (1995 г.), на межкафедральном заседании Пермской государственной медицинской академии (1995), на

научной сессии Пермской государственной медицинской академии (1996).

Публикации.

Основные положения работы освещены в 12 опубликованных работах, 5 из них в центральной печати.

Внедрение в практику:

Результаты исследования внедрены в практику работы клинико-диагностических лабораторий городской клинической больницы N 6 г. Перми, МСЧ N 4 г. Перми, отделенческой больницы станции Пермь-2 Свердловской железной дороги, областной клинической больницы г. Перми. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедрой биохимии Пермской государственной медицинской академии.

Получены удосговерения на рационализаторские предложения N 1764 "Модифицированный метод определения активности каталазы в сыворотке крови", и N 1763 "Методика определения активности каталазы в желчи" от 25 ноября 1994 г.

Положения выносимые на защиту.

1. При герпетическом кератите происходит изменение качественного и количественного состава белков слезной жидкости, которое зависит от клинической формы заболевания и его тяжести.

2. При офтальмогерпесе изменяется метаболизм не только тканей герпесинфицированного глаза, но и мононуклеаров периферической крови.

3. Уменьшение активности пероксидазы и содержания лактоферрина в слезе, каталазы в эпителии герпесинфицированного глаза свидетельствуют о снижении антиоксидантной защиты роговицы.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 186 страницах машинописи, состоит из введения, 2 глав обзора литературы, 4 глав собственных наблюдений, обсуждения, 5 выводов, 3 практических рекомендаций, списка литературы, включающего 279 источника (из них 138 отечественных и 141 зарубежных). Иллюстрирована 29 рисунками, 8 фотографиями, 9 таблицами в тексте и 33 в приложении.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

При выполнении работы использованы биохимические, иммунохимические, статистические методы исследований. Больные герпетическими кератитами (96 человек), находились на лечении в глазных отделения областной клинической больницы г. Перми Для изучения изменений в тканях переднего отдела глаза при герпетическом кератите проведен эксперимент на кроликах.

Объектами биохимических исследований являлись: клетки фракции мононуклеаров периферической крови, сыворотка и гепаринизированная. плазма крови, а также слезная жидкость больных различными формами' герпетического кератита, водянистая влага и ткани переднего отдела глаза кролика. Контролем служила слеза и кровь доноров.

Слезоотделение стимулировали поднесенным к носу комочком ваты, смоченного 10%-ным раствором нашатырного спирта. Глазной пипеткой, не касаясь глаза, чтобы избежать даже небольшой , микротравмы, собирали слезу с внутренней поверхности нижнего века [Н. А. Терехина и соавт., 1989].

Герпетический кератит у кроликов воспроизводили при внесении 2 капель жидкости, содержащей ВПГ-1 штамм VR-з (титр 4,0, lg ЦП.Д 50/мл) на предварительно скарифицированный эпителий роговицы под местной анестезией 2%-ным раствором лидокаина. Водянистую влагу получали при пункции передней камеры глаза. Роговицу вырезали по лимбу и разделяли на эпителий, эндотелий и строму по [G. К. Smelsej-, i960], затем вырезали радужную оболочку и выделяли хрусталик. Ткани взвешивали, биохимические . исследования : проводили в суиернатантах гомогенатов тканей.

Мононуклеары выделяли из периферической кроии по [А. С. Прилуцкий и соавт., 1990; А. Воуищ, 1968], от примеси сопутствующих эритроцитов избавлялись методом гипотонического шока [Дж. Клаус, 1990]. •

Изучена активность каталазы по методу М. А. Королюка и соавт., (1988), глутатионредук,тазы по В. С. Асатиани (1969), пероксидазы по Г Попову и JI Нейковской (1971), супероксиддисмутазы по: С Чевари и соавт., (1985), аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы по S. Reitman, S. Frankel, (1957) активность а\-антитрипсина по Г. А. Яровой и

соавт., (1982) и концентрация общего белка методом М. А. Bredford (1976).

С помощью наборов реактивов и тест-систем в слезной жидкости изучали содержание лактоферрина, а-микроглобулина фертильности, сшоно-спермалыюго термостабиль-ного гликопротеида (методом двойной иммунодиффузии в агарозных гелях по Оухтерлони), С-реактивного белка (методом кольцепреципитации), ггаокозы (глюкозоксидазным методом), мочевой кислоты (уриказным методом), миоглобина и антител к хламидиям (реакцией непрямой гемагггаотинации), а также активность холинэстсразы (тест полосками Биофан С).

В водянистой влаге и тканях переднего отдела глаза, мононуклеарах периферической крови исследован изоферментный спектр лактагдегидрогеназы методом электрофореза в нолиакриламидном геле [В. J. Davis, 1964; L. Ornstein, 1964].

Статистическая обработка данных проводилась по общепринятым методикам с расчетом средней арифметической и ее стандартной ошибки. Достоверность различий оценивали с помощью критерия t Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

При развитии герпетического кератита нами выявлены изменения состава слезной жидкости, зависящие от формы и тяжести поражения роговицы.

В разгар заболевания концентрация общего белка в слезной жидкости больных древовидным кератитом и метагерпетическим кератитом с изъязвлением роговицы снижается почти в два раза (р<0,01). При дисковидном кератоиридоциклите без изъязвления роговицы достоверного снижения концентрации белка не выявлено. После лечения в слезе содержание общего белка нормализуется.

При исследовании отдельных белков слезной жидкости иммунохимическим методом обнаружено высокое содержание в слезной жидкости лактоферрина, наличие в ней слюно-спермального термостабильного ос-гликопротеида и отсутствие а-микроглобулина фертильности.

Достоверное снижение концентрации лактоферрина выявлено у больных с древовидным кератитом и метагерпетическим

керагоиридоциклитом с изъязвлением (р<0,02). у больн дисковидным кератоиридоциклитом без изъязвления выявле тенденция к снижению содержания лактоферрина (р>0,1). Этот бел активно вырабатывается секреторным эпителием слезных желез обладает не только мощным антибактериальным действием [А. Сухарев. 1992], но и антноксидантиой активностью [N. Paul Eugene al.. 1993], связывая ноны металлов с неременной валентностью

Полученные результаты свидетельствуют о том, что снижет концентрации общего белка при герпетическом кератите не моя являться только результатом усиленного слезотечения. У меньше! концентрации белков слезы в разгар заболевания является !ак результатом нарушения функции слезных желез с формирование внешнесекреторнои недостаточности, при этом степень снижет уровня общего белка и лактоферрина коррелирует с тяжестью длительностью поражения роговицы. Низкая концентрация обще белка и лактоферрина в слезе больных может считаться одним прогностически неблагоприятных факторов течения заболевания.

При изучении активности ферментов-антиоксидантов от супероксиддисмутазы, кагалазы, пероксидазы, глутатионредукт (табл. 1) у здоровых людей нами обнаружена достаточно высс активность пероксидазы, что соответствует литературным данным А. Терехпна. 1990; С. М. Урашева и соавт., 1991: R. К. Crouch et 1991], При развитии герпетического кератита выявлено снижс активности пероксидазы в слезе пораженного глаза почти в 2,4 ] (р<0,05).

Таблица № 1. Активность аншоксидашных ферментов (мкмоль/мш мл) слезной жидкости больных герпетическим кератитом.

Контроль Герпетический керагит

Каталаза 0 0.81+0,33

Псроксидаза 5,69+1,26 2,38+0,59

Суиероксндцисмутаза 0 0

1 "лутатионредуктаза 0 0

Активность супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы была обнаружена ни в слезной жидкости здоровых люде!!, ни в сл больных различными формами герпетического кератита.

IP

Слезная жидкость характеризуется высоким содержанием неферментативных антиоксидантов: витамина С [Н. А. Терехина, 1990; Н. А. Терехина и соавт., 1995] и лактоферрина. Значительное содержание аскорбиновой кислоты и высокая активность в слезе пероксидазы, вероятно, является проявлением их синергизма при реализации антиоксидантного действия: пероксидаза разрушает перекиси с восстановлением образующегося кислорода до воды, в качестве источника водорода может использоваться аскорбиновая кислота, которая при этом переходит в окисленную форму.

В разгар герпетического кератита у больных с выраженной деструкцией эпителия роговицы обнаружено появление в слезе каталазной активности. Активность энзима выявлена у всех больных метагерпетическим кератоиридоциклитом и у трети больных с древовидным кератитом. Данный факт не свидетельствует о повышении антиоксидантной активности слезной жидкости, так как слеза больных теряет способность ингибировать генерацию гидроксил-радикала [Н. А. Терехина, 1990], а является отражением цитолиза клеток роговичного эпителия при активной репликации вируса.

В эксперименте на кроликах нами установлено, что из тканей роговицы наибольшей активностью каталазы обладает эпителий.

При развитии герпетического кератита у кроликов в эпителии роговицы наблюдается резкое снижение активности каталазы (рис. 1), что является результатом активного цитолиза и подтверждается обнаружением активности энзима в слезе. В строме роговицы при герпетическом поражении глаз, наоборот, отмечено увеличение активности каталазы, что связано с ее лейкоцитарной инфильтрацией и прорастанием сосудов в очаг воспаления. При этом активность каталазы в строме пораженного глаза в несколько раз превосходит активность энзима в его эпителии (рис. 1). В случае тяжелых форм герпетического кератита источником каталазной активности слезной жидкости становится не только эпителий, но и строма. Учитывая этот факт, понятно постоянное обнаружение каталазной активности в слезной жидкости больных метагерпетическим кератоиридоциклитом с изъязвлением.

Появление активности каталазы в слезной жидкости следует расценивать как показатель активного цитолиза клеток в очаге

ч

0,25 25

25 25

й* й

Ж

К Ой ОБ К СЮ ОБ К ОР ОЭ

влага эпителий роговицы строма роговицы

Рис. № 1. Активность каталазы в водшшстой влаге (мкмоль/мнн на мл) и в тканях роговицы глаза (мкмоль/мин на г влажной ткани) кролика при герпетическом кератите.

СЮ - правый (инфицированный глаз); ОБ - левый (контрлатсральньш глаз); К - контроль.

0.15 15

0.05 5

поражения и недостаточной терапевтической эффективности проводимых лечебных мероприятий.

Выявленное нами снижение активности каталазы в пораженном вирусом эпителии роговицы и данные литературы о падении активности глутатнонпероксидазы и супероксиддисмутазы в роговице [Н. А. Терехина, 1990], снижении концентрации аскорбиновой кислоты в герпесинфицированной роговице [П. С. Каплунович. Г. А. Винькова, 1973], водянистой влаге, слезной жидкости [Н. А. Терехина. 1977] свидетельствуют об истощении не только неферментативных антиоксидаитов в клетках пораженных ВПГ, но и об угнетении ферментативного звена антиоксидантной защиты. Учитывая высокую эффективность использования неферментативных антиоксидаитов для лечения герпетического кератита [Н. А. Терехина и соавт., 1994] и выявленное нами снижение активности пероксидазы слезной жидкости и каталазы эпителия герпесинфицированной роговицы можно предполагать терапевтическую эффективность при

применении антиоксидантных ферментов для лечения герпетических поражений.

При экспериментальном герпетическом кератите нами изучено содержание ингибитора протеаз - а 1-антитрип сипа. Выявлено увеличение его концентрации в водянистой влаге передней камеры глаза. Это может быть связано как с резким увеличением проницаемости гематоофтальмического барьера, так и локальной продукцией данного белка. В строме роговицы пораженного глаза обнаружено снижение антипротеазной активности в сравнении как с контролем, так и с контрлатеральным глазом, что свидетельствует об истощении пула сц-антитрипсина, отсутствии механизмов быстрой активации его синтеза в строме роговицы при герпетическом поражении. При исследовании тканей глаза и слезы при герпетическом кератите обнаружено увеличение активности лизосомальных гидролаз [Б. С. Касавина, 1982; Н. Л. Терехина, 1990]. Вероятно данный ингибитор протеаз расходуется на инактивацию лизосомальных протеаз в очаге деструкции. Выявленное повышение содержание сц-антитрипсина в радужке, вероятно, отражает компенсаторную активацию синтеза данного белка при воспалении в переднем отделе глаза.

Известно, что воспалительные заболевания глаз сопровождаются накоплением в крови белков острой фазы, в частности С-реактивного белка (СРП) [Т. Теню й а!., 1994]. СРП присутствует в нормальной сыворотке человека и синтезируется преимущественно клетками печени, а также клетками иммунной системы. Нами не обнаружен СРП ни в слезе здоровых, ни в слезе больных офтальмогерпесом. Отсутствие СРП в заметных количествах в слезной жидкости свидетельствует, вероятно, о непроницаемости для него гематоофтальмического барьера, а также об отсутствии его локального синтеза клетками иммунной системы, расположенными в ткани слезной железы.

При исследовании изменения проницаемости гематоофтальмического барьера у больных для глюкозы и мочевой кислоты нами обнаружено, что в слезной жидкости здоровых людей содержится незначительное количество глюкозы. Концентрация глюкозы составила 0,205+0,017 ммоль/л. При развитии герпетического кератита выявлено повышение концентрации глюкозы в слезе больных в 1,3 раза. Увеличение глюкозы в слезной

жидкости коррелировало с тяжестью заболевания. При метагерпетических кератоиридоциклитах с изъязвлением выявлено наибольшее увеличение уровня глюкозы в слезной жидкости. После лечения содержание глюкозы в слезе нормализовалось. Известно, что концентрация глюкозы в слезной жидкости уменьшается при иритах, иридоциклитах и увеличивается при бактериальных и вирусных кератитах, конъюнктивитах, химических ожогах глаз; в то же время уровень глюкозы в сыворотке остается в пределах нормы [I. ТаразгЮ, 1973]. Вероятно, обнаруженное увеличение глюкозы в слезной жидкости можно объяснить тем, что при герпетическом кератите, с одной стороны, повреждается эпителий роговицы, в норме препятствующий проникновению глюкозы в слезу, а с другой стороны, как при всяком воспалении, увеличивается проницаемость сосудов. Все это приводит к более легкому проникновению глюкозы в слезную жидкость. Повышение уровня глюкозы в слезе также из-за увеличения проницаемости сосудов подтверждается более высоким содержанием глюкозы в слезной жидкости больных дисковидными кератоиридоциклитами без изъязвления. При данной форме герпетического кератита очаг локализуется преимущественно в строме роговицы и выраженной деструкции эпителия не наблюдается.

В отличие от концентрации глюкозы содержание мочевой кислоты в слезной жидкости достаточно велико. Известен способ диагностики гиперурикемии по анализу слезы [И. Л. Терехина, 1992].

Нами выявлена тенденция к снижению концентрации мочевой кислоты в образцах слезной жидкости больных древовидным кератитом и, особенно, при метагерпетическом кератоиридоциклите с изъязвлением. Обращает на себя внимание большая вариабельность содержания мочевой кислоты при тяжелых формах офтальмогерпеса: от полного ее отсутствия до концентраций значительно превышающих контроль, с последующей нормализацией уровня мочевой кислоты в слезной жидкости у реконвалесцентов. Мочевая кислота является не только конечным метаболитом распада пуриновых оснований нуклеиновых кислот, но и соединением с выраженными антиоксидантными свойствами [М. В. Кения и соавт., 1993]. Окислительно-восстановительные реакции мочевой кислоты тесно связаны с аскорбиновой кислотой. Она, как и витамин С, способна с большой эффективностью вступать в реакции с активными формами кислорода и ингибировать перекисное окисление липидов.

Учитывая тесную функциональную связь мочевой и аскорбиновой кислот, отсутствие мочевой кислоты в образцах слезной жидкости больных с наиболее тяжелыми формами герпетического кератита может быть расценено как неблагоприятный фактор течения заболевания, свидетельствующий о резком снижение антиоксидантного потенциала слезной жидкости. Наличие у части больных повышенных концентраций мочевой кислоты может быть объяснено увеличением проницаемости гематоофтальмического барьера при герпетическом кератите, а также возможным увеличением местного образования мочевой кислоты, как конечного продукта метаболизма пуриновых оснований. Интенсификация образования мочевой кислоты закономерна при любых катаболических процессах. Отмечен определенный параллелизм в изменении концентраций глюкозы и мочевой кислоты у больных дисковидными кератоиридоциклитами без изъязвления. В слезе этих больных отмечена тенденция к увеличению содержания глюкозы и мочевой кислоты, что, вероятно, отражает повышенную проницаемость клеточных мембран.

Таким образом исследование концентрации мочевой кислоты у больных герпетическим кератитом свидетельствует о наличии нескольких источников происхождения мочевой кислоты слезы и важной роли этого метаболита в защите роговицы от токсического воздействия свободных радикалов при герпетическом кератите.

Выявленная нами способность слезной жидкости вызывать агглютинацию некоторых эритроцитарных диагностикумов (были исследованы эритроцитарные диагностикумы для обнаружения концентрации миоглобина и антител к родоспецифическому антигену хламидий) указывает на наличие в ней неспецифических агглютининов и ограничивает их использование для исследования слезы.

Герпетическая инфекция сопровождается выходом ВПГ в периферическую кровь, где вирус переносится в связанном с клетками крови состоянии [А. К. Шубладзе и соавт., 1974; И. Ф. Баринский и соавт., 1986; А. А. Каспаров, 1995]. При этом ВПГ проявляет тропизм как к эритроцитам, так и к лейкоцитам [ Н. Б. Ьагееп е1 а1., 1984]. Особенный интерес представляет взаимодействие ВПГ с лейкоцитами, в частности с лимфоцитами и моноцитами, составляющими фракцию мононуклеаров периферической крови. Это обусловлено тем, что

вирус в этих клетках способен не только пассивно транспортироваться, но и активно размножаться, а также сохраняться в латентном состоянии [Ю. А. Петрович, Н. А. Терехина, 1990; Н. Teute et al., 1983]. Клетки фракции мононуклеаров играют центральную роль в развитии иммунных реакций при герпетической инфекции [И. Ф. Баринский и соавт., 1986].

При исследовании активности аминотрансфераз нами выявлено достоверное увеличение активности аспартатаминотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (AJIT) в клетках фракции мононуклеаров периферической крови больных тяжелыми формами герпетического кератита (метагернетический кератоиридоциклит с изъязвлением и дисковидный кератоиридоциклит без изъязвления) и тенденция к увеличению их активности при древовидных кератитах (рис. 2).

При этом как у доноров, так и у больных различными формами герпетического кератита активность ACT почти в три раза превосходила активность АЛТ. Обнаруженное нами увеличение активности аминотрансфераз в мононуклеарах периферической крови при герпетическом кератите свидетельствует об активации процессов переаминирования в данных клетках и связано с активацией синтеза белков, также как и обнаруженное ранее повышение активности аминотрансфераз в тканях глаза [Н. А. Терехина, 1977]. Это может быть вызвано как активной репликацией вируса, так и активацией синтеза собственных белков мононуклеаров. Последнее подтверждается появлением в периферической крови незрелых, молодых клеток иммунной системы при развитии офтальмогерпеса [Д. В. Белокриницкий и соавт., 1987].

При исследовании изоферментного спектра лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в мононуклеарах периферической крови доноров выявлено преобладание промежуточных изоферментов ЛДГ с максимальной активностью ЛДГ2. При развитии герпетического кератита обнаружено достоверное снижение относительной активности аэробных фракций ЛДГ и увеличение относительной активности анаэробных фракций.

Рис. № 2. Активность аспартатаминотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (AJIT) (нмоль/мин на 10** клеток) в мононуклеарах периферической крови больных герпетическим

кератитом.

Учитывая, литературные данные о снижении суммарной активности ЛДГ в лимфоцитах [Ю. А. Петрович и соавт., 1987; Н. А. Терехина, 1990] и результаты наших исследований изоферментного спектра ЛДГ в мононуклеарах периферической крови больных герпетическим кератитом, можно сделать вывод о том, что при развитии офгальмогерпеса в клетках фракции мононуклеаров происходит не только уменьшение активности ЛДГ, но и сдвиг в сторону анаэробного пути утилизации глюкозы. Это может быть отражением как выхода в периферическую кровь молодых лимфоцитов [Д. В. Белокриницкий и соавт., 1987], и следствием изменения соотношения "Г и В-лимфоцнтов [В. Б. Мальханов, 1982], так и результатом активной репликации ВПГ в лимфоцитах [Н. Teute et al„ 1983].

При экспериментальном герпетическом кератите нами изучен изоферментный спектр ЛДГ в тканях глаза. Обнаружено, что гкани

переднего отдела глаза кролика характеризуются индивидуальным изоферментным спектром (рис. 3).

В разгар заболевания нами не выявлено существенных изменений изоферментного спектра ЛДГ в эпителии роговицы кролика, ткани где ВПГ активно реплицируется при развитии герпетического кератита [Н. А. Терехина, 1990]. Обнаруженные же изменения изоферментов ЛДГ в строме роговицы (рис. 3) могут быть объяснены ее инфильтрацией лейкоцитами. Изоферментный спектр ЛДГ лейкоцитов характеризуется преобладанием активности промежуточных изоферментов ЛДГ [Р. Rambotti, S. Davis, 1981], поэтому инфильтрация ими" стромы роговицы сопровождается некоторым увеличением активности промежуточных форм изоферментов ЛДГ. Суммарная активность ЛДГ в строме роговицы на порядок ниже ее активности в эпителии [Н. А. Терехина, 1977; Ю. А. Петрович, с соавт., 1986], поэтому присутствие мигрировавших в очаг воспаления клеток приводит к изменению изоферментного спектра ЛДГ в строме, и практически не отражается на спектре изоферментов ЛДГ в эпителии. Данное изменение спектра ЛДГ в строме с увеличением активности анаэробных изоферментов может быть одной из причин активации анаэробного пути распада глюкозы с накоплением в роговице повышенного содержания лактата. Повышение содержания лактата является одной из причин развития отека роговицы, что приводит к прогрессироваиию гипоксии [S. Юусе, 1981]. Таким образом, происходит формирование порочного круга, увеличение активности анаэробных фракций ЛДГ сопровождается усиленным накоплением лактата, а последний, вызывая отек роговицы, способствует усилению гипоксии и дальнейшему накоплению лактата. Вероятно, данный механизм не является основным в патогенезе формирования отека роговицы, однако, может способствовать его прогрессироваиию.

Выявленное снижение активности антиоксидантных ферментов: каталазы и глутатионредуктазы в мононуклеарах свидетельствует о снижении в них антиоксидантной защиты. Это подтверждает результаты исследований Н. А. Терёхиной и Ю. А. Петровича (1992), показавших что при офтальмогерпесе увеличивается интенсивность хемилюминесценции лимфоцитов периферической крови, при резком снижении в них активности глутатионпероксидазы и

строма роговицы

водянистая влага

ЛДГ5

Рис. Л1> 3. Изменении нзоферментного спектра ЛДГ в сгроме роговицы и водянистой влаге передней камеры глаза кролика.

СЮ - правый (инфицированный глаз); ОБ - левый (кошрлатеральнын глаз); К - контроль.

компенсаторном увеличении активности супероксиддисмутазы. Очевидно, что полученные изменения активности антиоксидангных ферментов при герпетическом кератите не могут быть объяснены только изменением фракционного "состава мононуклеаров периферической крови, так как по данным литературы [С. Г. Шуратова и соавт., 1989] Т-лимфоциты характеризуются более высокой активностью каталазы и супероксидисмутазы (СОД), чем В-лимфоциты, в которых выше активность глутатионредукгазы (ГР) и глутатионпероксидазы (ГПО). Разнонаправленность сдвигов активности каталазы и СОД, а также ¡выявленное снижение ГР и описанное в литературе резкое падение -активности ГПО скорее свидетельствуют о том, что меняется не просто соотношение фракций лимфоцитов, а меняется их метаболизм.

Это может быть свидетельством истощения антиоксидантной защиты клеток не только в очаге поражения, но и во всем организме, при такой достаточно локализованной форме герпетической инфекции как офтальмогерпес. Кроме того, это, вероятно, может быть следствием присутствия ВПГ и его активной репликации в мононуклеарах периферической крови.

Возможно и другое объяснение снижения активности основных антиоксидангных ферментов и интенсификации свободно-радикального окисления в мононуклеарах периферической крови. Известно, что одним из свидетельств активации лейкоцитов периферической крови, является изменение их метаболизма с формированием так называемого "дыхательного взрыва". При этом происходит такое изменение метаболизма клеток, что они начинают генерировать значительное количество перекиси водорода, которая является мощным антибактериальным соединением. Наиболее выражены данные реакции в нейтрофйлах. Однако, генерировать активные формы кислорода могут и моноциты [А. Г. Глоба и соавт., 1992]. Процесс генерации свободных радикалов и перекиси водорода сопровождается снижением активности основных антиоксидантных ферментов. Выявленные нами изменения ферментов предполагают накопление эндогенной перекиси водорода. Способствовать ее накоплению будут и установленное ранее угнегение активности глутатионпероксидазы и увеличение активности супероксиддисмутазы [Н. А. Терсхина, 1990]. Повышение активности супероксиддисмутазы в мононуклеарах периферической крови

приводит к снижению концентрации супероксиданиона за счет его дисмутации и образованию при этом перекиси водорода. Интересным является и тот факт, что перекись водорода, соединение обладающее выраженным бактерицидным- эффектом, способна в ,низких дозах вызывать активацию лимфоцитов [А. Finazzi-Agro еХ а1., 1980], при этом экзогенная каталаза, снимает-стимулирующий эффекто в то же время ингибирование. . внутриклеточной активное! и каталазы приводит к тому,, что перекись водорода в стимулирующей концентрации уже оказывает цитолитическое действие,

Таким образом, усиление-хемитдминесценции лимфоцитов при офтальмогерпесе, : снижение активности глутатионцероксидазы, 'каталазы и глутатионредуктазы . вероятно отражают,.^ одной стороны, изменение" антиоксидантней защиты в лимфоцитах, а с другой стороны, активацию ¡реакций "дыхательного взрыва" в моноцитах, приводящих .к: локагал'юму повышению концентрации" перекиси водорода, обладающей,- стимулирующим эффектом на лимфоциты. .. ' ■

: ' Выявленные изменения .в ферментативном звене антиоксидантной системы затрагивают не только ткани переднего ' отдела глаза, но и клетки крови и зависят от тяжести и клиническ^: -• формы заболевания. --* ,

выводы. .

1. Из антиоксидантн.ых , ферментов в слезе здоровых людей обнаружена только активность пероксидазы. Активности каталазы.^ супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы не выявлено.. Уменьшение концентрации! лактоферрина и;-,,активности пероксидазы а слезной жидкости, а -также активности каталазы в эпителии. ;роговицы герпесинфицированного _ глаза свидетельствует о снижении антиоксидантной защиты роговицы при герпетическом кератите..,

2. Степень изменения активности каталазы слезы;зависит от формы герпетического •-. кератита. Изучение активности данного фермента в динамике заболевания служит показателем, эффективности проводимоголечейия. ■ ,-: :.

3. При герпетическом кератите изменяется активность ферментов в мононуклеарах периферической крови. Снижается, активность антиоксидантных - ферментов каталазы и глутатионредуктазы, что

свидетельствует об изменении антиоксидантной защиты. Повышение активности аминотрансфераз в мононуклеарах периферической крови больных офтальмогерпесом свидетельствует об усилении процессов переаминирования.

4. В мононуклеарах периферической крови больных герпетическим кератитом установлено изменение изоферментного спектра ЛДГ: достоверное снижение относительной активности аэробных фракций и увеличение анаэробных фракций ЛДГ. При развитии герпетического кератита в мононуклеарах периферической крови происходит не только уменьшение активности ЛДГ, но и сдвиг в сторону анаэробного пути утилизации глюкозы.

5. При экспериментальном герпетическом кератите у кроликов установлено снижение веса эпителия роговицы, связанное с ее активным разрушением при репликации вируса, и увеличение массы стромы роговицы из-за ее отека. Развитию отека и поражению роговицы может способствовать изменение изоферментного спектра ЛДГ в строме роговицы пораженного глаза с увеличением относительной активности анаэробных изоферментов, а также снижение активности а ¡-антитрипсина.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Для контроля за эффективностью лечения герпетических кератитов, особенно глубоких форм с изъязвлением роговицы, рекомендуется определение активности каталазы в слезной жидкости.

2. Способность слезной жидкости вызывать неспецифическую агглютинацию эритроцитарных диагностикумов в реакции непрямой гемаггтотинации ограничивает их использование для исследования слезы. Применять данные тест-системы для анализа слезы следует лишь при подтверждении специфичности реакции.

3. Учитывая снижение антиоксидантной защиты глаза, в частности уменьшение активности ферментативных антиоксидантов, представляет интерес провести изучение терапевтического эффекта ферментов-антиоксидантов при герпетических кератитах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Активность лактатдегидрогеназы и ее изоферменты в лимфоцитах периферической крови больных герпетическим кератитом // Сборник: "Обмен веществ в норме и патологии", - Тюмень, 1992. - С. 98. (соавт. Н. А. Терёхина, Р. А. Батуева, Г. А. Боровик)

2. Каталаза мононуклеаров периферической крови больных офтальмогерпесом // тезисы научной конференции КНИИГПК "Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины", -Киров, 1993. - С. 109. (соавт. Н. А. Терёхина)

3. Диагностическая и прогностическая ценность определения активности ферментов слезы при вирусных поражениях глаз // тезисы докладок симпозиума с международным участием "Неинвазивные методы исследования", - Москва, 1994. - С. 42-43. (соавт. Н. А. Терёхина, Ю. А. Петрович, Р. А. Батуева, Г. А. Боровик, С. Э. Реук)

4. Нарушение антиоксидантной защиты при герпетическом кератите и диабетической катаракте, лечение антиоксидантами // Сборник тезисов докладов VI-го съезда офтальмологов России, -Москва, 1994. - С. 380. (соавт. Ю. А. Петрович, Н. А. Терёхина, Л. В. Воскресенская, Р. А. Батуева)

5. Ферментативный анализ слезной жидкости при вирусном кератите // Клин. лаб. диагностика, - 1994. - N 6. - С. 15-17. (соавт. Н. А. Терёхина, Ю. А. Петрович, Р. А. Батуева, Г. А. Боровик, С. Э. Реук)

6. Ферменты лимфоцитов периферической крови человека при офтальмогерпесе // материалы научно-практической конференции КНИИГПК "Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины", - Киров, 1995. - С. 119-120. (соавт. Н. А. Терёхина)

7. Содержание белка в слезе больных герпетическим кератитом // сборник "Проблемы медицины катастроф", часть 1, - Пермь, 1995. - С. 193-194. (соавт. Н. А. Терехина, Л. Г. Веретенникова)

8. Значение исследования слезы и слюны в диагностике вирусных инфекций II тезисы докладов 2го симпозиума "Неинвазивные методы диагностики", - Москва, 1995. - С. 31. (соавт. Н. А. Терехина, В. А. Весна, Ю. А. Петрович)

9. Концентрация глюкозы и мочевой кислоты в слезной жидкости больных герпетическими кератитами // материалы научной

конференции "Достижения медбиофизики и клинической биохимии - в практику здравоохранения", посвященной 50-летию Победы в Великой Отечественной войне, - Киров, 1995. - С. 34. (соавт. Н. А. Терехина)

10. Изоферменты лактатдегидрогеназы тканей переднего отдела глаза при экспериментальном герпетическом кератите // материалы научной сессии Пермской государственной медицинской академии, -Пермь, 1996. - С. 47.

11. Ферменты мононуклеаров периферической крови больных герпетическим кератитом // Перм. мед. журнал, - 1996. - N 2. (соавт. Н. А. Терехина, Ю. Е. Горячев)

РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ, ВЬШОЛНЕННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Методика определения активности каталазы в желчи. Удостоверение на рационализаторское предложение N 1763, выданное Пермской государственной медицинской академией 25 ноября 1994 г. (соавт. Н. А. Терехина, В. В. Хлебников)

2 Модифицированный метод определения активности каталазы в сыворотке. Удостоверение на рационализаторское предложение N 1764, выданное Пермской государственной медицинской академией 25 ноября 1994 г. (соавт. Н. А. Терехина).

Редакция "Пермского медицинского журнала"

Тираж 100 экз.