Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез фосфонатных производных нуклеотидов с повышенной устойчивостью к ферментам дефосфорилирования

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Шипицын, Александр Валерьевич, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

Шипицьщ Александр Валерьевич

СИНТЕЗ ФОСФОНАТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ НУКЛЕОТИДОВ С ПОВЫШЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ФЕРМЕНТАМ ДЕФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

03. 00. 03 - молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель к.х.н. Широкова Елена Анатольевна

Москва 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список использованных сокращений 3

Введение 4

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР "Синтез и некоторые свойства производных

нуклеотидов, модифицированных по а-фосфатной группе" 5

1. 5'-Амидо и 5'-тионуклеотиды 6

2.1. Фосфонаты 5 '-дезоксинуклеозидов 10

2.2. 5'-Дезокси-5'-метилфосфонаты 15 3.1. 5 '-О-Фосфонаты (модификация В) 24 3.2.5'-0-Метиленфосфонаты 36

4. Полифосфонаты и имидофосфаты с Р-Х-Р структурой 45

5. Изостерные метиленфосфонаты 56 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ \ 68

1.1. Синтез 5'-фосфонатов рибонуклеозидов 69

1.2. Синтез аналогов ШР 72

1.3. Синтез 5'-8-трифосфатов 5'-меркаптотимидинов 75

2. Синтез 2',3'-ненасыщенных ациклических аналогов нуклеотидов 79

3. Изучение стабильности карбоциклических трифосфонатов

(17а, Ь) и (18а-с) в сыворотке крови человека 85

4. Синтез полифосфонатов диаденозина и диинозина 89 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 93 ВЫВОДЫ 115 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 117

Список использованных сокращений.

ДЦК - 1М,]М-дициклогексилкарбодиимид, КДИ - 1Ч,М'-карбонилдиимидазол ДМФА - диметилформамид, Ру - пиридин, ДМСО - диметилсульфоксид ГМФТА - гексаметилфосфотриамид, DMAP - 1чГ,1!Ч-диметил-4-аминопиридин AZT - З'-дезокси-З'-азидотимидин

(d)NM(D, Т)Р - (дезокси)нуклеозид моно- (ди-, три-) фосфат

(d)AM(D, Т)Р - (дезокси)аденозин моно- (ди-, три-) фосфат, Ade - аденин

(d)CM(D, Т)Р - (дезокси)цитидин моно- (ди-, три-) фосфат, Cyt - цитозин

(d)GM(D, Т)Р - (дезокси)гуанозин моно- (ди-, три-) фосфат, Gua - гуанин

TM(D, Т)Р - тимидин моно- (ди-, три-) фосфат, Thy - тимидин

IM(D, Т)Р - инозин моно- (ди-, три-) фосфат, Hyp - гипоксантин

Ph - фенил-, Bz - бензоил-

Ме (Et, /-Рг)- метил- (этил-, изопропил-)

Tos - tf-толyoлсульфонил-, Ms - метансульфонил-

HIV- вирус иммунодефицита человека

AMV- вирус миелобластоза птиц, HSV- вирус герпеса простой

IC50 - эффективная концентрация 50% ингибирования репродукции вируса

ЕС5о - концентрация 50% ингибирования роста клеток (мера цитотоксичности)

Кт - константа Михаэлиса, vmax - максимальная скорость реакции - кинетические

параметры ферментативной реакции, характеризующие сродство субстрата к ферменту.

Введение

Модифицированные по сахарному остатку нуклеозиды являются одними из наиболее эффективных ингибиторов ряда вирусов, например, вируса ВИЧ или вируса гепатита В. Ступенчатое внутриклеточное фосфорилирование модифицированных нуклеозидов в соответствующие 5'-трифосфаты, которые, как правило, и являются активной противовирусной формой этих нуклеозидов, затруднено вследствие высокой субстратной специфичности внутриклеточных киназ. Своих же собственных киназ вирусы обычно не производят, используя готовые нуклеотиды. При этом часто лимитирующей оказывается первая стадия фосфорилирования, приводящая к 5'-монофосфатам соответствующих нуклеозидов. Использование монофосфатов модифицированных нуклеозидов в клеточных культурах, и тем более на животных и в клинических испытаниях невозможно вследствие ограниченности их транспорта в клетки и быстрого гидролиза в межклеточном пространстве и на клеточных стенках различными нуклеазами. Эти причины вызвали интерес к синтезу химически модифицированных по фосфору аналогов нуклеотидов. Многообразие возможных модификаций существенно расширяет возможности при поиске селективных ингибиторов различных ферментов. Фосфонаты по общей структуре подобны фосфатам, но имеют различия (более или менее значительные) по валентным связям, углам между ними, а также по рК соответствующих кислотных групп. Это во многих случаях существенно изменяет их субстратную специфичность к ряду ферментов, в том числе и к ферментам дефосфорилирования. Поэтому исследования в области ферментативно устойчивых фосфонатов, которые к тому же могут проникать сквозь клеточные мембраны, весьма перспективны.

ЛИТЕРАТУРНЫМ ОБЗОР

"Синтез и некоторые свойства производных нуклеотидов, модифицированных по а-фосфатной группе"

В данном обзоре будут рассмотрены фосфонатные аналоги 1ММР и ШР. На трифосфатном остатке природного сЮТР (I) стрелками показаны варианты его модификации. Аналоги фосфатов, таким образом, можно разбить на несколько условных подтипов. А) Модификация связи между 5'- метиленовой группой и

а атомом фосфора. В) Замена С А

« ч, I о |

кислотной группы а фосфата. С) в

Аналоги с модификацией а,Р- Н° Н° Н<? \—/ пирофосфатной связи. Структура (II) - это изостерные аналоги, в которых X - атом кислорода или метиленовая группа, а К - гидроксильный, дифосфатный или дифосфонатный остаток. Рассмотренные модификации нуклеиновых оснований и сахарного остатка отражают логику исследователей, синтезировавших фосфонаты активных нуклеозидных аналогов, наряду с фосфонатами природных нуюгеозидов. За рамками обзора остались эфиры фосфатов, а также Н-фосфонаты, фторфосфаты и циклофосфаты (вариант модификации В), достаточно подробно рассмотренными в обзоре [1]. По той же причине практически не разбираются свойства аналогов олигонуклеотидов, среди которых немало соединений с модификацией подобной А).

1. 5'-Амидо и 5'-тионуклеотиды

Одной из первых модификаций, которые были проведены для исследования фосфамидных аналогов нуклеотидов, явилось фосфорилирование 5'-амино-5'-дезоксинуклеозидов (схема 1) [2]. Соединения (1Уа,Ь) были получены из соответствующих (Ша,Ь) при их обработке бг/с-(2,2,2-трихлорэтокси)- или бис-(п-нитробензилокси)-хлорфосфатом в диоксане в присутствии триэтиламина, на примере тимидинового (1Уа) и аденозинового (1УЬ) аналогов.

Схема 1

h2n

и

-»►

о

В

Ov I ^PHN

>

но

Illa: B=Thy, R'=H, IVa: B=Thy, R-H, ivc: B=Thy, R'=H,

lllb: B=Ade, R'=OH IVb: B=Ade, R'=OH |Vd: B=Ade, R'=OH

i: (.R"0)2P(0)CI; EtsN, диоксин ii: \)m¡/H20, Py; 2)диэстераза, еслиR"=CCl3CH или H2/Pd/C, H20-Et0H; если R "=p-02NPhCH2

Для удаления трихлорэтильных групп с фосфора использовали последовательную обработку (IVa,b) аммиаком в водном пиридине для омыления одной группы и ферментативный гидролиз диэстеразой яда змеи второй, в случае трихлороэтильных групп. Обе нитрофенилбензильные группы удаляли каталитическим гидрированием в водном этаноле при рН 10. Ясторф и Хеттлер особо отмечают крайнюю нестабильность полученных аналогов (IVc,d) в водных буферных растворах, в физиологическом диапазоне рН от 6.5 до 9 (полный гидролиз до (IIIa,b) протекал за несколько часов) [2].

В работе Синклера и Мислоу описывается синтез и субстратные свойства трифосфата 5'-дезокси-5'-аминотимидина (Va) [3]. Соединение (Va) получили обработкой 5'-дезокси-5'-аминотимидина (Illa) натриевой солью декагидрата

триметафосфата в воде при pH 9.5. Реакция проходила за б часов при комнатной температуре и привела к продукту (Va) с 80% выходом.

5'-дезокси-5'-аминотимидинтрифосфат (Va) проявил себя как субстрат ДНК-полимеразы I из E.coli в системе с неполным набором субстратов (с заменой тимидинтрифосфата на аналог (Va)). При этом авторы отметили, что встраивание (Va) в растущую цепь ДНК происходит только в присутствии иона двухвалентного металла, причем Мп2+ предпочтительнее природного Mg2+.

В подтверждение лабильности в кислой среде олигонуклеотидов, содержащих фосфамидную связь, приводятся сравнительные данные гидролиза разбавленной уксусной кислотой. В случае природных олигонуклеотидов после 11 часов гидролиза практически отсутствуют низко-, а в случае олигонуклеотида, содержащего 5'-дезокси-5'-аминотимидин, высокомолекулярные соединения. Отмечается также то, что гидролиз фосфамидных связей происходит быстрее, чем апуринизация [3].

000

II II II НО—POPOPNH'

1 I I но он он

> но

в

Va: B=Thy Vc: B=5-IUra

000

IJ II II HO—POPOPNH

1 I I

HO OH OH

Ade

Тот же метод раскрытия триметафосфата 5,-дезокси-5'-аминонуклеозидами в водном буфере был использован Троубриджем и др. для получения аналога АТФ (Vb) [4], а Ченом и др. для синтеза трифосфата 2',5'-дидезокси-5'-амино-5-иодоуридина (Vc) [5].

Соединение (Vb) продемонстрировало субстратные свойства на уровне природного АТФ для креатинкиназы из мышцы кролика [4]. Аналог (Vc) оказался более сильным аллостерическим ингибитором тимидинкиназы из E.coli, чем природный ТТФ, и проявил иной по сравнению с трифосфатом 5-иодо-2'-

дезоксиуридина механизм действия на этот фермент. Чен и др. отмечают особо, что при рН>9.5 аминотрифосфат (Vc) практически не гидролизуется в водном растворе при 0°С [5].

Синтез монофосфатов 5'-дезокси-5'-амино- (IVe) и 5'-дезокси-5'-меркаптоинозина (Via) и сравнение их субстратных свойств с природным IMP были приведены в работе Хамптона и др. (схема 2) [6]. Для получения аналога (IVe) из 5'-дезокси-5'-аминоинозина (Шс) была использована хлорокись фосфора в присутствии пиридина. Выход аминофосфата (IVe) составил около 40%. Меркаптофосфат (Via) был получен при обработке 5'-дезокси-5'-иодоинозина (Hid) натриевой солью тиофосфорной кислоты в воде, с выходом 59%.

Схема 2

Шс IVe Hid Via

i: РОС/з, CHsCN, Py, 0-5°C ii: NCI3PSO3, H20, 22°C

Кинетические параметры обоих аналогов как субстратов IMP-дегидрогеназы из Aerobacter aerogenes оказались близкими к таковым для природного IMP при ассоциации и диссоциации фермент-субстратного комплекса, но несколько ухудшалось сродство с NAD (коферментом IMP-дегидрогеназы). Последний эффект более заметен в случае тиоаналога (Via). Максимальная скорость ферментативной реакции vmax составила 0.67 для (IVe) и 0.75 для (Via) [6] относительно таковой для IMP, принятой за единицу.

Сходным образом были синтезированы амино- (IVe) и меркапто- (Via) производные в работе Хамптона и Чу [7]. Обе структуры продемонстрировали

существенно более низкие субстратные свойства в опытах с аденилосукцинат синтетазой. Величина Vmax для (IVe) снизилась более, чем на порядок, а для (Via) оказалась на три порядка меньше таковой для IMP [7].

В работе Пателя и Экштейна для синтеза 5'-дезокси-5'-меркаптофосфатов также было использовано нуклеофильное замещение 5'-тозилата или 5'-иодида на соль тиофосфорной кислоты (схема 3) [8]. Аналоги ATP (Vd) или UTP (Ve) были получены двумя способами из соответствующих 5'-модифицированных нуклеозидов (IIIe,f). По прямой реакции (Ше) с пента(трибутиламмонийной) солью Р1-(8)-тиотрифосфорной кислоты в ДМФА выход (Vd,e) составлял 20%. При этом не наблюдалось какой-либо

зависимости от нуклеинового основания. По другому методу, эти структуры были получены в две стадии, через промежуточные фосфаты 5'-дезокси-5'-меркапто-нуклеозидов (VIb,c). Последние были получены реакцией (IIIe,f) с трис(трибутиламмонийной) солью тиофосфорной кислоты в ДМФА. Активация меркаптофосфатной группы КДИ с последующей обработкой пирофосфатом в ДМФА привела к меркаптотрифосфатам (Vd,e) с выходом 38% для аденозинового производного (Vd) и 25% для аналога UTP (Ve).

5 '-S-меркаптотрифосфат (Ve) дефосфорилируется щелочными фосфатазами (их источник и сравнение кинетических параметров дефосфорилирования с природными

схема 3

он

llle: R=l lllft R=TsO B=Ade, U га

o-po-po-ps

I I i

-*. о- а о

Vd: B=Ade Ve: B=Ura

Vlb: B=Ade Vic: B=Ura

i:

о о о ~

" 11 11 ou HO -p-o-p-O-P-SH

_ но нб h6 _

5Bu3N tДМФА

ii: (H0)2P(0)SH-3BmsN, ДМФА

iii: 1 )КДИ,ДМФА; 2) H^OyJBuM ДМФА

субстратами не приведены) до 5'-дезокси-5'-меркаптоуридина. Соединения (Ус1,е) не являются субстратами РНК-полимеразы фага Т7, но проявляют по отношению к ней слабые ингибиторные свойства [8].

Первым примером синтеза 5'-фосфонатов 5'-дезоксинуклеозидов может служить реакция, приведенная в работе [9]. Изопропилиденовое производное (Vila) было получено с выходом 49% нагреванием защищенного по 2',3-диольной группе 5'-дезокси-5'-иодоуридина (IHg) с триэтилфосфитом (схема 4). Гидролиз изопропилиденовой защиты 70% уксусной кислотой привел к диэтиловому эфиру 5'-фосфоната 5'-дезоксиуридина (Vllb) с 75% выходом. Попытки удалить этильные последнего разбавленной минеральной кислотой или 1N щелочью не привели к желаемому результату (основным продуктом был урацил).

В работе Раммлера и др. рассматривается синтез 5'-фосфоната 5'-дезокситимидина (УПс) по реакции Михаэлиса-Арбузова, исходя из 3'-ацетил-5'-дезокси-5'-иодотимидина (ШЬ) и триаллилфосфита, с последующим гидролизом ацетильной группы водно-метанольным раствором аммиака (схема 5) [10]. Суммарный выход продукта составил около 40%. Для этой реакции был выбран триаллилфосфит,

2.1. Фосфонаты 5'-дезоксинуклеозидов

Схема 4

о

о

т. к для гидролиза аллильных групп фосфоновой кислоты не требуется крайние значения рН (при выдерживании фосфоната (VIИ) с 0.5М раствором гидроксида натрия через 10 мин гликозидная связь гидролизуется на 50%). Триаллилфосфонат (УПс) гидрируют в метаноле над 5% палладием на сульфате бария, в результате чего образуется смесь ди- (5%) и моно- (47%) пропилфосфонатов, и 39% целевого продукта (\ТПа). Фосфонатфосфат (1Ха) и фосфонатдифосфат (1ХЬ) получают обработкой

О о

(СН2=СНСН20)21Ц Thy .. (НО)2Р—v Thy

НО V||c но vma

i: 1)Р(ОСН2СН=СН2)3, л 2)NH/H20, МеОН ii: H2/Pd/BaS04, МеОН имидазольного производного (Villa) 10-кратным избытком раствора трибутиламмонийной соли фосфорной или бис(трибутиламмонийной) соли пирофосфорной кислоты в ДМФА, о о о о о

НЧЧл У*

соответственно. Выходы продуктов в но но г / но но но г у

обеих реакциях составили 40%. но |Ха но 1ХЬ

При кислотном гидролизе фосфонатдифосфата (IXb) быстро образуется аналог TMP (Villa) как единственный продукт, тогда как природный ТТР в этих условиях подвергается ступенчатому гидролизу (ТТР —> TDP —> TMP). Фосфонатдифосфат (IXb) не является ни субстратом, ни ингибитором ДНК-полимеразы I из E.coli [10].

Схема 6

ii о

Вг----Vra II ^ Uга О

(еюрнсн2О,2Р-1 I (ноьМ о.

г» JXT но он

Ме Ме М е М е

Uli Vlld Vlllb

i: (o-EtOPhCH20)¡P, Л

В работе Холы из 5'-бромо-2',3'-изопропилиденуридина (Uli) и трис(2-этоксибензил)фосфита по реакции Арбузова был получен аналог UMP (1Ха), при этом для удаления защитных групп промежуточного фосфоната (VTId) была использован многостадийный гидролиз (схема 6) [11]. Суммарный выход составил 14%, основные потери приходились на гидролиз.

Синтез аналогичных фосфонатов, но на большем количестве объектов рассматривается и в работе Раджу и др. (схема 7) [12]. В качестве основного синтона была использована 5-дезокси-5-фосфинил-2,3-дибензоил-1-ацетилрибоза (Vile), полученная с суммарным выходом 39% из соответствующего производного 5-дезокси-5-бромрибозы (Illj) в три стадии: кислотного гидролиза метоксильной группы, ацетилирования промежуточного полуацеталя и реакции Арбузова с триэтилфосфитом.

Схема 7

о

BzO OBz

В' Vllf: В'-урацил

Vllg: В'=!Ч-бензоилцитозин Vllh: В'=6-хлоропурин Vlli: В'=2-бромо-6-оксопурин

BzO OBz

Illj

VHf-i

о

и

III

II

VIIIc: В=урацил Vind: В=цитозин Ville: В=аденин

BzO OBz

HO OH VlIIf: В=гуанин Vlllc-g VTIIg: В=типоксантин

Vile

i: 1 )1N НС1,диоксан; 2)Ac30, Py; 3)(ЕЮ)зР, A ii: В ГМДС, Me3Sî0S02CF3 iii: 1 )Me3SiBr/CH3CN; 2)NHyMeOH для VlIIc-fmu iii: 1 )H2/Pd/C, EtOH; 2)Me3SiBr/CH3CN; 3)ЫН3МеОНдля VlIIg

Соединение (Vile) затем гликозилируется предварительно просилилированными пиримидинами и пуринами по единой схеме. Таким путем был получены фосфонаты (VIIf-h), которые после обработки триметилбромсиланом и удаления бензоильных групп, привели к аналогам UMP (VIIIc), AMP (VIEW) с общим выходом 31% и аналогу СМР (Ville) с выходом 37%. Разница заключалась лишь в условиях аммонолиза промежуточных (VIIf-h). Из фосфоната (Vffi) были получены аналоги GMP (VlIIf) с выходом 16% и IMP (VlIIg) с выходом 18%. Синтез последнего отличался стадией восстановительного дегалогенирования атома брома при С-2 пурина (Vlli), прошедшая с практически количественным выходом.

Данные соединения не подавляли рост раковых клеток (мышиной и человеческой лейкемии, карциномы и В-лимфобластов) в концентрациях до 100 дмоль, и были неактивны против ряда вирусов (гриппа, парагриппа, герпеса, аденовируса и др.) в концентрациях до 320 цмоль [12].

Сходный подход был использован Али и др. для синтеза 5'-фосфонатов ос- и (3-аномеров 2',5'-дидезоксиуридина (VTIIh,i) [13]. Фосфонат (Vllj) был синтезирован в пять стадий из 2-дезокси-£>-рибозы. Обработка (Vllj) бис(силил)урацилом в ацетонитриле в присутствии триметилсилилтрифлата привела к смеси а- и р-аномеров. После удаления пивалоильной защиты с 2'-гидроксила были получены аналог dUMP (VlIIh) с выходом 14% и его а-аномер (Villi) с выходом 8.5%.

о

о

о

II

II

II

но

но

Ме3ССОО

Vlllh

Villi

Позднее были синтезированы 5'-фосфонаты производных 5'-дезокситимидина, модифицированных по 3'-положению (схема 8) [14]. Ключевым синтонами в этом синтезе являются З'-ксилосульфонаты (VTIk,l), обработка которых азидом, фторидом или цианидом приводит к соединениям (Vlllj-l), соответственно. Фосфонаты (УПкД) получают по реакции Арбузова из бромида (Illk) и триметилфосфита, по аналогии с методикой, опубликованной в [10], с последующим мезилированием или трифлатированием. Обработка мезилата (VTIk) азидом лития в ДМФА и последующей обработки триметилбромсиланом приводит к фосфонату (VlIIj) с выходом целевого продукта около 60%. Для синтеза фосфонатов 3',5'-дидезокси-3'-фтор- (VTIIk) и 3'-цианотимидина (VIII1) используют трифлат (VIII) и фторид или цианид тетрабутиламмония. После гидролиза эфирных групп выделяют соединение (VHIk) с выходом 40% или (VIII1) с выходом 32%, соответственно [14].

Схема 8

Вг—i но ,™У {МеО)2Р—, 9*®R Thy (НО)2Р—, 0 Thy

о о

II

|||k Vllk:R=CH3> х vulj:X=N3>

VIH: R=CF3) Vlllk: X=F,

Villi: X=C