Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфорорганические аналоги фосфатов - субстратов и интермедиатов ферментативных реакций

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Фосфорорганические аналоги фосфатов - субстратов и интермедиатов ферментативных реакций"

т

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 547.241.057

ТЫРТЫШ

Татьяна Викторовна

ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИЕ АНАЛОГИ ФОСФАТОВ —СУБСТРАТОВ И ИНТЕРМЕДИАТОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

03.00.03 — Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1987

Работа выполнена в лаборатории химии регуляторов ферментативной активности Института молекулярной биологии АН СССР-

Научный руководитель:

кандидат химических наук,

старший научный сотрудник Н. Б. Тарусова.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Е. Н. Звонкова, доктор химических наук С. Н. Кочетков.

Ведущая организация — химический факультет Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова.

Защита состоится « £3 » .ь^И^Ш^Ч^. . 198/ г. в ^Р, часов «а заседании Специализированного совета Д 002.79.01 Института молекулярной биологии АН СССР 'по адресу: 117984, ГСП-1, Москва, В-334, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР.

Автореферат разослан » ^^^'• - ■ 1987 г.

Актуальность работы. Поиск веществ, избирательно воздействуют "на "активность ферментов, - одна из важных проблем современной энзишлогш. Эффективными и высокоизбирательными ингибиторами ферментов являются аналоги их субстратов, интермедиатов, аллосте-рических эффекторов. Такие соединения используются не только при изучении самих ферментов, но и служат основой для создания антибактериальных, антивирусных и противоопухолевых препаратов, при-меняш&хся в медицине и сельском хозяйстве, например: D -серин -аналог D-аланина - ингибитор D-аланин-синтетазы и D-аланнн-рацемазы микобактерий туберкулеза; азидотимидин - ингибитор вирусных ревертаз. Однако химические основы создания аналогов природных фосфатов, в частности, аденозин-5'-трифосфата (АТР) - субстрата многих ферментов; Р^,Р4-бис(5'-аденозил)тетрафосфата (Ар^А) - природного нуклеотдда, способного ингибировать некоторые АТР-за-Бисише ферменты; пирофосфата и др., разработаны недостаточно. Интерес к таким аналогам объясняется тем, что в них можно моделировать фосфатный фрагмент, непосредственно участвуший в ферментативной реакции. Поэтому актуальной задачей является поиск закономерностей, определяющих направленный синтез аналогов биологически важных фосфатов.

Дель работы - синтез новых фосфонатных аналогов АТР и Ар^А и изучение зависимости их физико-химических свойств от структуры для интерпретации данных о биологической активности соединений такого типа.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- синтезировать новые С-замещенные метилендифосфоновые кислоты - структурные фрашенты фосфорсодержащих цепочек аналогов нук-леотидов, являющиеся также аналогами пирофосфата;

- на основе С-замещенных метилендафосфоновых кислот синтезировать новые фосфонатнне аналоги АТР и Ар^А;

- синтезировать ряд аналогов Ар^А, различающихся структурой фосфорсодержащей цепочки;

- исследовать зависимость оптических и комплексообразугщих свойств ряда аналогов Ар^А от структуры методаот кругового дихроизма СКД) и дифференциальной УФ-спектроскопии.

Научная новизна л практическая ценность. В настоящей работе синтезированы новые фосфонатнне аналоги АТР и Ар^А, имеющие в ка-

честве структурных фрагментов фосфорсодержащей цепочки С-замещен-•ные метилендифосфоновые кислоты. Получены новые фосфонатиые аналоги пирофосфата и оксикарбонилфосфата (ангидрида фосфорной и угольной кислот) - производные метилендифосфоновых кислот с заме-" стителями, содержащими карбонильные, этоксикарбонильные и карбоксильные группировки. Разработан синтез 2-оксопропилиден-1,1-да-фосфоновой кислоты, открывающий возможности получения соединений новой группы - 2-оксоалкилиден-1,1-дафосфоновых кислот.

Исследование оптических и комплексообразующих свойств ряда аналогов Ар^А с различной структурой фосфорсодержащей цепочки позволило установить корреляцию между структурой и физико-химическими свойствами этих соединений и интерпретировать некоторые эффекты ингабирования ими ферментов.

Синтезированные соединения используются для изучения механизма действия и специфичности ферментов, катализирующих превращения пирофосфата, оксикарбонилфосфата, АТР, а также АТР-зависи-мых рецепторов мембран в МБ АН СССР, Институте физиологии им. A.A. Богомольца (Киев), Институте физиологии растений (Познань, ПНР), Институте экспериментальной биологии АН Арм.ССР, МГУ им. М.В. Ломоносова.

Публикации» По материалам диссертации опубликовано 2 статьг и тезисы.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на 2-ом Международном симпозиуме "Химия фосфора ъ биологии".

Объем работы. Диссертационная работа изложена на 136 страницах шиинописного текста и содержит 6 схем, 16 таблиц и 16 рисунков. Она состоит из введения, литературного обзора "Аналоги фосфатов - субстратов и штерыедиатов ферментативных реакций ", обсуждения результатов, экспериментальной части, приложения, выводов и списка цитируемой литературы (187 ссылок на литературные источники).

СОДЕРЖАНИЕ РАБСИЛ

Химия фосфонатов открывает широкие перспективы для синтеза аналогов природных фосфатов. Заместители при фосфонатном атоме углерода могут различаться по размерам, электроотрицательности, полярности и, следовательно, по-разному влиять на электронные, кон-формационные, комплексообразувдие и другие свойства аналогов, а.

значит, и на их способность взаимодействовать с ферментами. Богатство возможных модификаций фосфонатного углерода позволяет варьировать свойства даже такгос низкомолекулярных соединений, как пирофосфат. Однако систематические разработки в этом направлении практически отсутствует, и основным свойством известных фосфонат-ных аналогов куклеотидов, липидов, Сахаров, которое используется в энзимологических исследованиях, является их химическая и метаболическая стабильность.

Синтез С-замещенных метилендифосфоновых и фосфонуксусной кислот

Метилендифосфоновая (ЦДФ) и фосфонуксусная (ФУК) кислоты являются аналогами пирофосфата -' низкомолекулярного продукта многих ферментативных реакций. Известно, что некоторые фосфонатные аналоги пирофосфата обладают биологической активностью и попользуются как лекарственные средства. Производные ФУК и МдФ, синтезированные в поиске новых антивирусных агентов, применяются для изучения специфичности и регулирования,активности ферментов, катали-Э1фущшС превращения пирофосфата, например, РНК- и ДНК-полимераз. Значительная часть аналогов пирофосфата представляет собой производные ВДФ, замещенной по углеродному атому галогенами или скси-, алкил-, амино-группами. Однако для метилендифосфоновых кислот с ацильными, карбоксильным и алкоксикарбонильными заместителями методы синтеза не разработаны, хотя интерес к таким соединениям вполне обоснован, поскольку они содерглат полярные группировки, способные к образованию водородных и координационных саязей и определяющие, таким образом, кислотные, конформационные и комллек-сообразуюсцие свойства метилендифосфоновых кислот.

В данной работе синтезированы новые'.производные МдО (1-1У):

• Также подучено несколько других соединений фосфонатной природы (У-УП), которые вместе с соединениями 1-1У составили ряд анаг-,гов пирофосфата и оксикарбонилфосфата, предложенный для изучения л харастеризации ферментов, катализирующих их превращения (амино-ацкл-тРНК-синтетаз, пирофосфатаз, биотиновых карбоксилаз, РНК- и ДНК-полимераз).

О О НО-Р-СНЯ-Р-ОН ОН ¿н

н

и

I: К=С0СН3; й; й=С0гС2Н5; §: К=СНгС02С2Н5; !?: К=СН2С02И

0 0 0 0 0 О

" НО-Р-СНВг< НО-ё-С НБг< Н0-?-СН2<'

ОН 0С2Н^ ОН 0Н ОН СНз & (2) 1

Синтез метилендифосфоновой кислоты с ацильнш заместителем по углеродному атому (соединение I) был осуществлен впервые. Соединения П-1У получали ранее только в виде эфиров (1ХД), а не фос-фоновых кислот. Появление в последние' годы мягких реагентов для удаления фоофоэфирных защит открыло удобные пути синтеза лабильных производных фосфоновых кислот через их эфиры.

Протоны при д.-углеродном атоме в эфирах фосфоновых кислот достаточно подвижны, чтобы под действием таких оснований как Ма, №аН, К, н-С^НдЬ:, С2Н5ОТ1 отщепляться с образованием карбаниоаоз. Реакция последних с алектрофилъными агентами, например алкилгало-генидами, благодаря малой степени делокализации заряда в карбани-оне, идет однозначно по углеродному центру.

Для синтеза эфиров УШ-Х была выбрана схема 1, применявшаяся при синтезе алкилзамещенных метилендифосфоновых кислот (Ци1пЪу, 1968). Гидрид натрия быстро и количественно реагировал с тетраэти-ловым эфиром ВДФ при 0°С с образованием высокореакционноспособно-го карбаниона - натриевой соли эфира ВДФ. Реакция последнего с ал-кил- или ацилгалогенвдами- приводила к эфирам С-замещенных метилендифосфоновых кислот.

Схема 1

[(СгН50)2Р],СН2 ~ [(да)аР]/ны® [(С2Н50)2Р]СНЯ

6 О О (VI-х)

т я=сосн3? х=8г; га-. а=со2с2н^, х=сц Ь я=ск2со2сгн5, х=вг

Аналогичным способом получена бромфосфонуксусная кислота XI (схема 2). Однако, если реакция алкилирования (синтез соединения X) проходила с выходом 89$ (табл. 1), то введение по а-углероду ФУК более -лектроотрицательного заместителя - атома брома (соединение XI) сопровождалось образованием как моно-, так и ди-бром-производных ФУК. Это объяснялось побочной реакцией обмена, проте-

кающей при избытке в реакционной смеси карбанкона ФУК и обусловленной повышенной С-Н кислотностью фосфоната с электроотрицательным' заместителем по л.-углероду.

Схема 2

. «I

О И* л

(с2н?о)гРснс:ос н М-0 Вг2< о

Таблица 1

Синтез этиловых эфир о в С-замещенных метилевдифосфоновых и фосфонуксусных кислот (УШ-ХЛ)

Номер Структурная Вы- R л) ИК-спектры,

соед. формула ' i (в CHCI3), 9,см-1

уш [(с2н5о)2(о)Р]2снсоен3

к [{с2н50)2(0)р]2снс02с2н5 . x [(c2h50)2(0)Pj2chch2c02c2i XI (cghgogiojpchbrcogcghg

хп [(с9нп0)9(0)р]9с=сснз

ЪС0СН3

50 0,45 2980,1700,-1590,1400, 1250,1160,1020

36 . 0,50 2980,1790,1400,1320, 1280,1060

89 0,42 2980,1750,1400,1250, 1160,1020

42 0,44 2980,1760,1290,1200, 1150,1040

20 0,50 3000,1750,1610,1430, 1290,1200,1070

Силуфол (Kavalier, ЧССР), бензол-ацетон, 1:1.

Реакции карбаннонов эфиров МДФ с реагентами ацильного типа ранее не изучались. При добавлении к раствору натриевой соли "фх-ра ВДФ в тетрагидрофуране при -10°С продукт моноацилировани.. -.УШ) образовывался в незначительном количестве, а основным продуктом реакции было вещество, которому на основании данных ЯМР-% и -3^Р приписана структура ацетилированного енола ХП. Соединение ХП кг.те-

ло в спектре ЯМР-% сигнал с тонким расщеплением при 2,13 м.д. и

1

оинглет при 2,42 м.д.; первый соответствовал метильной группе, соседней с двойной связью, второй - ацетильной (табл. 2, схема 3). При мягкой щелочной обработке соединения ХП 0,1 н. КаОН в диокса-' не синглет при 2,42 м.д. в спектре ЯМР-% исчезал, и спектр был идентичен спектру соединения УШ.

В спектре ЯМР-^Н эфира УШ наблюдалось два сигнала, соответствующих протокам метальной группы заместителя: синглет при 2,25 м.д. и мультиплет при 2,31 м.д. Последний, по-видимому, откосился к енольной форме эфира УШ, в котором вращение вокруг С-С связей затруднено. Спектр ЯМР-^Р этого соединения содержал два дублета при 19,53 м.д. и 26,63 м.д. с константой спин-спинового расщепления 37 Гц, относящиеся к енольной форме, и синглет при 14,48 м.д. кето-фгармы эфира УШ, Сравнение интегральных интенсивностей сигналов в спектрах ЯМР показало, что кето и енольная формы существуют приблизительно в соотношении 2:3.

Предположительно соединение ХП могло образовываться при аци-лировании натриевой соли эфира УШ - продукта побочной реакции обмена ме^эду эфиром УШ и натриевой солью эфира ЩФ (схема 3). Высокая подвижность протона в л-положении к фосфонатной группе подтверждается возможностью кето-енольной таутомерии. Это делает реакции обмена преобладающей. При этом ацилированле эфира УШ идет не по углеродному, а по кислородному центру.

(СаНДр-СН-Р^НЖ

с%с,ан (с2н50)2р-с-р(ВД2

о

о о

Схема 3

ададаснсоснз

1н. ЫаОН/диоксдн

с(да)2р]гс<СНх

СН3С0Вг -ИаВг

„0С0СН5

Таблица 2

Химические сдвиги и константы спин-спинового взаимодействия в спектрах ЯМР-% и31Р аналогов пирофосфата, оксикарбонилфосфата и их эфиров*

Номер соед. - ЯМР-%, м.д. ( I, Гц) ЯМР~31Р

сн3 сн2 СН &, м.д. ( }, Гц)

I 2,72с 10,7с

П 1,3т(7), ЗН 4,24кв(7), 2Н 3,48т(19), 1Н 9,4с

ш 1,3т(7), ЗН 4,2кв(7), 2Н 2,3-2,7м, ЗН 18,74о

1У 2,3-2,7м,

У 1,28т(7), ЗН 4,2кв'(7), 2Н 4,3д(12), 1Н

У1 3,98д(13)

УП 2,5с, ЗН

3,2д(21), 2Н

Продолжение таблицы 2

УШ 1,27т(7), 12Н; +2,25с, ЗН (СОСНо) 2^51 м 3,8-4,2м, 8Н 14,48с; 19,53д, 26,63д(37)

IX 1,38т(7), 12Н; 1,28т(7), ЗН 4,0-4,8м, ЮН 3,75т(20), 1Н 10,2с

X 1,14т(7), 12Н; 1,08т(7), ЗН 3,7-4,2м, ЮН 2,4-2,8м, ЗН 19,76с

XI 1,44т(7), 6Н 1,38т(7), ЗН 4,1-4,5м, ЗН со

' хп 1,32т(7)+1,38т(7),12Н 2,13с, ЗН (СН3С0); 2,42с, ЗН (СН3С=) .3,9-4,5, 8Н 19,53д, 26,63д(37)

Спектры соединений 1-УП сняты в СБСХд, УШ-ХЛ - в Б20; внутренние стандарты: ГВДС ели трет-бутанол (ЯМР-%); внешний стандарт - 85% Н-эРСЬ (ЯМР-3^Р).

Синтез соединения УШ по схеме 3 с промежуточным гидролизом эфира Ш до УШ был неудобен, так как при этом частично расщеплялись фосфоэфирные связи, что затрудняло выделение и очистку эфира УШ. Попытки изменить направление реакции ацилирования в сторону образования эфира УШ, применяя менее реакционноспособный аце-тилхлорвд вместо ацетилбромида и понижая температуру реакции ацилирования до -50°С, не привели к успеху. Однако, изменив порядок прибавления реагентов (натриевую соль эфира ЭДФ медленно прибавляли к раствору ацетилбромида, создавая те?.; самым постоянный избыток ацетилбромида в реакционной смеси), удалось повысить выход эфира УШ до 50$ и практически подавить реакцию образования продукта ХП.

. Соединения УШ-ХП были выделены с использованием препаративной хроматографии на силикагеле и их структура подтверждена данными ЯМР-% и -Э1Р и ИК-спектроскопии (табл. 1,2).

Для превращения эфиров УШ-XI в фосфоновые кислоты использовали триметилбромсилан, позволяющий в мягких условиях, количественно удалять фосфоэфирные защиты (схема 4).

Схема 4

анчедА ÄÜ* R-Рйадд Mi£S!> R-P(O«)2

О Ö ö

При этом сложноэфирные группы в соединениях IX-XI не затрагивались. Гидролиз этилового эфира бромфосфонуксусной кислоты У проводили в 1 н. растворе щелочи. Обращает на себя внимание аномальная устойчивость сложноэфирных групп дифосфоната Ш и его эфира X к щелочному гидролизу. В то же время при кипячении в конц. HCl как эфир X, так и Ш гидролизовались до кислоты 1У. Кислотный гидролиз производных ФУК XI и У приводил к кислоте У1. Фосфоновые кислоты 1-У1 были выделены в виде ашгашиевых или натриевых солей, их структура подтверждена данными спектров HMP-^H и и ИК-спск-тров (табл. 2).

Синтез фосфонатных аналогов АТР и Ар^А

Среди фосфонатных аналогов АТР, имеющих С-замещекнне фосфонат-ные фрагменты, известны лишь галогенпродззодные, в т-м числе л бромметиленовые аналоги АТР, полученные в лаборатории хпг.птл регуляторов ферментатиз!юй активности !!МБ АН СССР и ок;.';пк:глесл oifrsx-

тивными ингибиторами Ас-СоА-карбоксилазы из печени крыс (Бирюков, Тарусова, 1985). Мы синтезировали новые фосфонатные аналоги АТР ХШ-ХУП, содержащие в виде структурных фрагментов олигофосфатной цепи остатки ФУК и метилендафосфоновых кислот I и Ш с электроот-' рицательными заместителями, отличными от галоидных.

NH2

ХШ: X=CHC0CH3j Y=QH;

ООО ¿у: X = CHCH2C02C2Hjr, Y=0H;

XJ: Х=0, V=CH2C02H

| ,_i и и и

ЙГАгО-Р-0-Р -X-f-Y

он он он тг МИг

<¡>0 то z=chcoch*;

у)-к « 8 J - ^ I Х№: Z = CHCH2C02C2Hy

он он ш он Ч—Г

НО он

Для синтеза аналогов АТР был выбран имидазоллдный метод. Соединения ХШ, Х1У получали конденсацией избытка фосфоновых кислот I и Ш соответственно с имидазолидом AMP (схема 4) с выходами 20-30$ (табл. 3).

Схема 4

0 0 О ООО т xlil: R-CQCH3

IV О /V (I II II W I —

HQ-P-CHR-P 4 n' N-P-OAdo —>-Н0РCHRPOPOAdo - R=CH2C02C2Hsr он ОН ^ ОН ОН ОН ОН

(1,8) (xlMJY)

Соединение ХУ1 - аналог одного из возможных интермедиатов, образующихся в реакции, катализируемой Ас-СоА-карбоксилазой, был синтезирован конденсацией имлдазолида моноэтилового эфира ФУК с ADP и последующим гидролизом сложноэфирной группы водным раствором щелочи (схема 5).

Схема 5

CL « ^ ADP о 9 8 9 , i н. NaOH _

7CCH2P-N -- ;CCH2POPOPOAda -- XJ

СгН50 ¿и w C2H5Q OH OH OH

Таблица 3

Синтез и свойства аналогов АТР и Ар4А ХШ-ХУП

Номер соед.

Структурная формула

Вы- т R А f Б A max, - нм( Е ) h, % гилохро-мия

20 0,18 0,26 259(15000)

29 0,10 0,39 259(15000)

40 0,45 0,30 259(15000)

16 0,36 0,15 259(24500) 18,5

15 0,20 0,32 259(27500) 8,3

ХШ Х1У ХУ ХУ1 ХУЛ

Арр[СНС0СН31р App[CKCIi'2C02C2H5Ip Аррр[СН2С02Н] (Арр)2СНС0СН3 (Арр)2СНСН2С02С2Н5

Примечание. А: Силуфол UV-254 (Kavalier, ЧССР), диоксан-25% NH^-вода: 6:1:4. Б: PEI-целлюлоза (Merck, ФРГ), 1М ысх.

Аналоги АТР к Ар^А ХУ1, ХУЛ были получены взаимодействием активированных форм фосфоновых кислот I и Ш с избытком AMP (схема 6). Для активации фосфоновых кислот с электроотрицательными заместителям, например I или ФУК, рациональным было применение карбонилдиго.вддазола. В случае ВДФ лучшие результаты давал карбо-нилдибензимидазол (Пурыпш, Тарусова, 1986), поэтому его использовали для активации кислоты Ш, имеющей алкилькый заместитель.

' О" НО-Р . он

(I Д|)

CHR

Х2С0

" о 1

н

ft

Схема 6

AMP

,CHR

0 0 0 0 AJbOPOPCHRPOPOAJO OH OH OH ON ■ (xvi, Щ

Г,®: R=C0CHS, X'N^N i

Я=СНгС02СгНУ| Х- N

Соединения ХШ-ХУП выделялись из реакционной смеси с помощью ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе ПЕ-32 л допатнитель-но очищались- гель-фильтрацией. Вещества были однородны по дс.;-щд.1 тонкослойной хроматографии (табл. 3) и расщеплялись до АЧР и соответствующих аналогов пирофосфата под действием фосфодиэстерази змеиного яда. Структура соединений ХШ-ХУП подтверждалась данными УФ-спектров л спектров ЯМР-1Н и -31Р (табл. 4 и 5).

Данные спектров ЯМР-^Н фосфонатных аналогов АТР и Ар^А (в D20 , рН 7, внутренний стандарт - трет.-бутанол)

Таблица 4

Номер соед. ■ Ь, М.д. ( J, Гц)

H-I' Н-2', Н-З', Н-4', Н-5' H-2 H-8 Прочие сигналы

ХШ 6,1д(5) . 4,2-4,9м ♦ НОБ 8,I6c 8,44c 2,34c, 3H (CH3)

Х1У 6,1д(5) 4,2-5,1м ♦ HOD 8,I7c 8,46c 1,20т(7), 3H (CH3); 4,0кв(7), 2H (O^CHg) 2,5-3,2м, 3H (CHCH2)

ХУ 6,05д(5,5) 4,0-5,Ом + HOD 7,12c 7,40c 2,9д(21), 2H <CH2)

ХУ1 5,9д(5) 4,2-4,8м + NOD 8,0c 8,I2c 2,2c, ЗН (GHg)

ХУЛ 5,95д(5) 4,2-5, Ом » HOD 8,I5c 8,42c 8,44c I,I6r(7>, ЭН (CH3); 4,08кв(7), 2H (СН2Ш3: 2,5-3,2м (CHCH2)

Таблица S

Дашше спектров Я1.1Р-3^Р аналогов АТР и Ар4А (в D 20, рН 7, внешний стандарт -

85$ Н3Р04)

Номер соед. Структурная формула &, м.д., I. Гц

рос лр Ар

ХШ Арр[СНС0СН3]р ' -9,9д 0,77дд 9,13д 26,4 12,4

Х1У Арр [СНСН2С02С2Н5] р. -10,од 12,1д 17,7с 28,4 0

ХУ1 Арр[СНС0СН3]ррА -12,0 -0,63 17,7 12,0 0,1

ХУЛ Арр[chchgcogcghg]ррА -9,9д 11,0д 28,5 0

ХУШ Ар[СН2]рррА ' -14,Од -25,5дд 18,5 23,7

14,06д 4,94дд 7,2

XIX Арр[СН2]ррА ; -11,0 7,42 21,9 6,0 3,7

XX apich^ppcciy рА 17,65 8,42 . 3,6 3,6 3,6

XXI Арр[СНВг] ррА -11,0 1,07' 22,3 9,0 -0,5

ХХП АррррА -11,19 -22,88 17,6 16,5 0,3

Ар4А и его аналоги ХУШ-ХХП, предназначенные для физико-химических исследований, были синтезированы по методикам, разработанным в лаборатории химии регуляторов ферментативной активности ИМБ АН СССР. Хроматографическая подвижность в различных системах и спектры ЯМР-31Р соедшений Х1Х-ХХД бшш идентичны полученным ра- -нее.

AplCH2]pppA (Ш!) ' Арр[СН21ррА (XIX)

. Ap[ai2]pp[CH2]pA (XX) App[CHBr]ppA (XXI) АррррА (ХХП)

Соединения ХУ1-ХХ1 составили ряд аналогов Ар^А, различающихся по числу, положению и структуре дифосфонатннх фрагментов в полифосфатной цепочке.

Соединения ХШ-ХХП имели характерные спектры УФ-поглощения с максимумом пр;: 259 км (табл. 3). При этом Ар4А и его аналоги поглощали УФ-юдучение с меньшим коэффициентом экстинкции, чем двойное эквивалентное количество мононуклеотидов (гипохромный эффект), что отмечалось ранее для доягуклеозидаллгофосфатов (Zamecnik,i969) и свидетельствовало о перекрывании плоскостей адегашовых оснований внутри молекулы (стэкинг-э^хТект). Наличие стэкинга оснований подтверждалось также сдвигом в сильные поля резонансных сигналов 2-Н и 8-Н аденкна и 1'-Н рибозы в спектрах HF,{p-% аналогов Ар4А ХУ1, ХУЛ относительно спектров аналогов АТР ХШ и Х1У с теми же метилен-дофосфоновыми фрагментам:! (табл. 4). Интенсивность УФ-поглощения аналогов JJI и ХУЛ возрастала после их-гидролиза фосфодиэстеразой змсзяюго яда до AMP и аналогов пирофосфата I и Ш (табл. 3).

Аналоги АТР ХШ, Х1У давали спектры ЯМР-^Р первого порядка, типичные для системы ядер АМХ. Известные эмпирические закономерности и анализ констант спин-спинового взаимодействия позволили отнести все сигналы # ct-, ¡>- или у-атомам фосфора (табл. 5). При это:.! в спектре аналога АТР Х1У не наблюдалось спин-спиновое взаимодействие между к у-атомами фосфора (рис. 1 а,б, табл. 5).

Атомы фосфора в олигофосфатных цепояках Ар^А и его аналогов образуют систему ядер типа АА( XX', дающую спектры высших порядков. " Спектры состоят из АА' и ХХ' частей, содержащих обычно по 10 линий и симметричных относительно центра спектра и резонансных час-

i

10

но S^mX

•J

To

20

fO V^A-

Ju

-(q

> у-

<0

-Ю S-, мл-

Рис. 1 Спектры ЯМР-31Р фосфонатных аналогов АТР ХШ (а), Х1У (б) и Ар4А ХУ1 (й), ХУП (г) в D20, внешний стандарт -85$ НзР04

тот поглощения АА' и XX' ядер фосфора ( и ^хх')» Подобный спектр имел бромфосфонатный аналог Ар^А XXI. В спектрах Ар^А и его аналогов ХУ1.Х1Х наблкщалось по 6 линий в АА1 и XX' частях (рис. 1 в), что происходит, когда одна из констант спин-спинового взаимодействия значительно меньше остальных. Предполагая, что этой константой может быть константа спин-спинового взаимодействия наиболее удаленных друг от друга сс- и л'-ядер фосфора, были рассчитаны стандартными методами остальные константы для всех

соединений (табл. 5). В спектре ЯМР~31Р аналога ХУЛ, по-видимому, как и в спектре аналога АТР Х1У, взаимодействие между £ - и ядрами фосфора практичесет отсутствовало, и спектр (рис. 1 г) являлся наложением двух идентичных спектров системы ядер АЕ и представлял собой два дублета. В спектре аналога Ар4А XX наблвдалось по триллер в АА' и XX' частях. Крайние линии триплетов были отнесены к Ag ;.одспектру вследствие их большей интенсивности. Оценивая интегральные характс котики триплета, удалось выделить линии, относящиеся к АВ подспектрам и оценить значения констант спин-спинового взаимодействия стандартным методом (табл. 5).

Исследование -комплексов Ар^А и его фосфонатных аналогов с ионами Z.n2?

Нуклеозидолигофосфаты (АТР, Ар4А, и т.д.) являются довольно сильными комллексонами двухвалентных металлов, и их поведение в биологических системах не монет рассматриваться вне зависимости от их комплексообразуюцей способности. Особенное значение это имеет при исследовании ферментов, содержащих ионы двухвалентных металлов - Zn2+, Mg2+, мп2+, например, ферментов гидролиза Ар4А, которые активируются ионами Zn2+. В последнее время были развиты подходы к изучению свойств комплексов бис(5' -нуклеозид)олигофос-фатов с ионами двухвалентных металлов с помощью оптических методов, и обнаружена зависимость характеристик комплексов от протяженности олигофосфатной цепи и характера нуклеозидаых остатков (Zamccnik, 1УОЗ).

В настоящей работе проведено исследование оптических свойств комплексов фосфонатных аналогов Ар^А ХУ1-ХХ1 с ионами Zn2+ методам;; кругового дихроизма (КД) и дифференциальной УФ-спектроскопии и сопоставление их со свойства!,и комплексов Ар^А (XXII).

Характер спектров ВД Ар^А и его аналогов определяется стэ-ккнг-взатюдействием пар адениновых оснований и структурой олиго-фосфатнсЗ цепочки. В'отсутствие ионов двухвалентных металлов спектры КД соединений ХУ1-ХХ1 имеют положительный максимум при 25G-257 нь: и отрицательный - при 278-269 нм (рис. 2), что отмечалось ранее для различных бис(5 -нуклеозид)олигофосфатов, в том числе и для Ар^А. Длинноволновой отрицательный максимум в спектре КД Ар^А обуслоглен «■/«- стэкингсм оснований. Тагам образом, интенсивность этого максимума для соединений, моделирующих Ар4А, характеризует долю конформеров, в которых основания находятся в

к/<х стэкинге. Соотношение интенсивностей положительного и отрицательного максимумов (В/Т) определяется суммарным вкладом различных конформеров в оптическую активность и различается для всех соединений ХУ1-ХХП. Положение максимумов в спектрах КД и параметр S/T для каждого из соединений ХУ1-ХХП сохранялись в интервале концентраций 10_3-10~® М, при которых далее проводились оптические измерения.

Особенностью комплексов Ар^А и гомологичных бис(5'-аденозил)-олигофосфатов с ионами Zn2+ является то, что zn2+ взаимодействует не только с фосфорными группировками, но и с основаниями. Поэтому добавление' ионов Zn2+ в растворы нуклеотидов вызывает особенно сильные изменения спектров КД. Можно предположить, что ионы Zn2+, сильно связанные с нуклеотвдами этого класса, ограничивают набор возможных конформаций, которые допускают л/к -стэкинг, а также способствуют возникновению конформаций с другими типам стэкинга.

При добавлении ионов Zn2+ к растворам аналогов Ар4А характерна было резкое падение интенсивности коротковолнового максимума КД. Изменения же интенсивности максимумов в длинноволновой области спектра для соединений ХУ1-ХХП различались. На рис. 2 а,б приведены спектры КД комплексов Ар^А и аналогов ХУ1-ХХ1 в условиях 20-кратного избытка Znci2 по отношению к нуклеотидам. Дальнейшее увеличение концентрации ZnCl2 не вызывало существенных изменений в спектрах. При добавлении этшгендишгактетрауксусной кислоты комплексы разрушались, и спектры КД становились идентичными спектрам соединений, свободных от ионов металлов.

Информация, полученная методом КД, существенно дополнялась данными дифференциальных УФ-спектров (рис. 3). Спектры КД и УФ-спектры, характеризующие комплексы аналогов ХУШ и ХУ1 сходны с соответствующими спектрами Ар^А (рис. 2, 3), что свидетельствует об аналогии их,структур. Среди симметричных 'метиленовых аналогов Ар4А с различными заместителями- (ХУ1, ХУП, XIX, XXI) аналоги XIX и XXI в составе комплексов имеют конформации, сильно отличающиеся от таковых у Ар^А. Длинноволновой максимум в спектрах КД комплексов этих соединений сдвинут на 10 нм в коротковолновую область, а дифференциальный УФ-спектр принципиально отличен от спектра комплекса Ар4А. Сравнение оптических свойств аналога ХУП и Ар^А показало, что они различаются только по данным спектров КД комплексов с нонами Zn2+, в то время как спектры КД и УФ-спектрн аналога ХУТ к Ар^А почти идентичны. Особенностью аналога XX было

-05 "

ч

Арр[СНС0СН3]ррА (Ш) ______

Арр [СНСН2С02СоК53 ррА (ХУЛ)--—а

Ар[сн2ЗрррА (:>'уш) — -

Арр[сн21ррл'(л.:-"> —

Ар[СН21рр[СН?]рА (XX) ---

Арр[СНВг]ррА"(ХХ1) -—■

АррррА (ХХП) -

зао л.им

-од -

со

Рис. 2 Спектры КД аналогов Ар^А в отсутствие ионов металла (а), в присутствии 20-кратного избытка ионов (б), сняты в 0,01 М трис-НС1, рН 7,5, 25°С, концентрация нуклеотидов 4*10~5 1

Рис. 3 Дифференциальные УФ-спектры аналогов Ар4А в присутствии 20-кратного избытка гп2+, сняты относительно растворов нуклеотидов в отсутствие ионов металлов в 0,01 М трис-НС1, рН 7,5, 25°С,концентрация нуклеотидов 2х10~5М. Условные обозначения те же, что и на рис. 2.

'Рис. 4 Спектры Щ препаратов триптофанил-т-РНК-синтетазы (7-8 м!Л), инкубированных при 37°С в 20 мМ НЕРЕЭ-ЫаОН (рН 7,5), содержащих 10 мМ мес12, 10~4 ДТТ и 5х10~4 М триптофана, в присутствии 5 мМ Арр[СНСН2С02С2Н51ррА(ХЛ1) и подвергнутый диализу: а)._- фермент, содержащий ион ¿п2"*; б)___- фермент, обработанный ХУЛ; в)----- фермент, обработанный

ХУЛ в присутствии АТР; 1}...... - в присутствии

пирофосфата.

небольшое увеличение интенсивности максимума КД при 278 нм при добавлении раствора 2пС12 и при этом сильное падение поглощения по данным УФ-спектров.

На основании изменения спектров КД нуклеотвдов. при титровании растворами 2пС12 были определены стехиометрия и константы диссоциации комплексов аналогов Ар^А с ионами 2п2+ (табл. 6). Ар^А образует комплексы с одним ионом 2п2+, связывание большого количества ионов металла происходит за счет слабых взаимодействий. .

Таблица 6

Константы дассоциацчи и стехиометрия комплексов нуклеотвдов ХУП-ХХП с ионами. 2пг*

Ном®Р Структура соединения ■ ^^ '

соед' гп2+:нуклеотид М, ±Ш

ХУ1 Арр[СН(СОСНд)] ррА .1:1 50,0 '

ХУЛ Арр[СН(СН2С02С2Н5)]ррА 1:1 1,2

ХУШ Ар[СН2]рррА 1:1 "2,5

XIX Арр[СН21ррА 2:1 2,4

XX Ар[СН2]'рр[СН21рА '1:1 0,26

XXI Арр[СНВг]ррА 1:1 20,8

XXII АррррА 1:1 . 15(15)к

Данные гашеоп1к (1Э8ЭК

У фосфонатных аналогов ХУП-ХХ сродство к ионам гп2+ выше,чем у Ар^А. Отличительным свойствомааналога XIX является образование устойчивых комплексов с двумя ионами гп2+. По-видимому, при включении остатка ВДФ между двумя фосфатами гибкость, фосфорсодержащей цепочки достаточна, чтобы обеспечить ориентацию фосфатных и фос-фонатных групп, благоприятную для образования комплекса с двумя ионами 2п2+. При этом, как показывают спектры КД и УФ (рис. 2, 3), конформационные перестройки фосфорсодержащей цепи при комплексо-образовании приводят к более значительным изменениям стэкинга ос-новазшй б соединении XIX по сравнению с Ар^А и аналогами ХУ1, ХУШ, XX.

В аналогах ХУ1, ХУП, ХП, являющихся производным соединения

XIX, объемные заместители при углеродном атоме дифосфоната создают затруднения для »информационных изменений фосфорсодержащей.цепочки, вследствие чего эти аналоги связывают сильно лишь один ион Zn2+, причем сродство аналогов ХУ1, XXI к Zn2+ заметно ..иже, чем у аналога XIX. Эффект заместителей может быть более сложным и определяться не только стерическими факторами. Для заместителей, содержащих полярные группировки, возможны другие типы взаимодействия (например, образование водородных связей), влияющих на конформацию .соединения в комплексе с металлом. Вероятно, это является причиной различия структур комплексов с Zn2+ аналогов XXI и ХУТ и сходства последнего со структурой комплекса Ар^А, подтверждаемых УФ- и КД-спектрами. В то же время аналог ХУЛ, структура комплекса которого отличается от таковой у Ар^А и других аналогов, имеет повышенное сродство к ионам Zn2+, что позволяет предположить участие сложно-эфирной группы в хелатировании металла.

Таким образом, аналоги Ар4А, объединенные по признаку сходства данных спектров КД и УФ, могут различаться по'другим признакам. Так, соединения ХУ1 и ХУШ, сходные с Ар^А по оптические свойствам, имеют разное сродство к ионам металлов_ и по-разному расщепляются фосфодиэстеразами. Соединения XIX и XXI, имеющие спектры КЦ и УФ, отличные от спектров Ар^А, различаются характеристиками комплексов с ионами металлов. Использование таких аналогов в пнгибиторном анализе позволяет сравнительно легко получить данные о специфичности и различиях родственных ферментов, а также открывает новые возможности интерпретации эффектов взаимодействия ферментов с аналогами субстратов и пути к направленному синтезу биологически активных фосфонатов с заданными свойствами.

Полученные б работе данные позволяют объяснить факт более эффективного ингибирования некоторых ферментов, (в том числе Ас-СоА-карбоксилазы) бромметиленовымп аналогами АТР (Бирюков, Амонтов, 1985), а также эффекты ингибирования ферментов, катализирующих гидролиз Ар4А, аналогами этого нуклеотида (Гурановский, 1987).

Комплексообразующие свойства соединений ХУШ и XX - ингибиторов триптофаншг-тРНК-синтетазн из поджелудочной железы быка, позволили по-новому подойти к изучению этого фермента (Меркулова, Ковалева, 1986). Способность аналогов'Ар^А образовывать комплексы "с ионами Zn2+ и достаточное сродство к участкам связывания АТР и пирофосфата обусловили возможность исследования роли иона Zn2+ в ферментативном катализе, В настоящей работе было изучено действие

на триптофати-т-РНК-синтетазу аналога Ар4А ХУЛ, который ингибиро-вал фермент, связываясь с ионом цинка в активном центре. После ин- ' кубации с ХУЦ и диализа фермент терял ион zn2+, а также и свойственен ему каталитическую активностьПотеря ферментом иона Zn2+ приводила к значительному уменьшению интенсивности максимума при 290 нм в спектрах КД (рис.4). Действие соединения ХУП на фермент тормозилось в присутствии AIP, что свидетельствовало о связывании ХУП б АТР-участке активного центра. При добавлении к инактивироБанно-к:у Ферменту ионов Zn2+ активность фермента восстанавливалась и его зьсктр ВД .соответствовал исходному спектру.(рис.4).

Помимо рассмотренного примера использования соединений, синтезированных в данной работе, другие соединения, используются в настоящее время как ингибиторы различных типов ферментов. По предварительным данным среди синтезированных производных ВД® выявлены ингибиторы пирофосфатазы,'Ас-СоА-карбоксилазы (МГУ т. М.В. Ломоносова, ИМБ АН СССР); среди аналогов AIP и Ар^А -"ингибиторы /ФР-рк-бозо-полимераэы (КЭБ Арм.ССР), Лс-СоА-карбоксилазы (HiE АН СССР).

ВЫВОДЫ

1. Получены новые* (^замещенные фосфонатные аналоги АТР и Ар4А, предназначенные для исследования АТР-зависимых ферментов, ферментов гидролиза Ар^А и пурип-завиепшх рецепторов мембран.

2. Синтезированы новые С-ацил- п С-карбэтоксиметил-метиленди-фосфоновые кислоты, предложенные в качестве аналогов пирофосфата > ■

и оксикарбонилфосфата для изучения пирофосфатаз, полимераз и биотиновых-карбоксилаз.

3. На примере 2-оксопропилиден-1,1-дифосфоновой кислоты разработан эффективный метод синтеза 2-оксоалкилиден-1,1-дифосфоно-вых кислот.

4. Методами кругового дихроизма и дифференциальной УФ-спек-троскопии изучены оптические свойства ряда фосфонатных аналогов Ар^А и их комплексов с ионами Zn2+. Показана зависимость оптических и комплексообразушдих свойств аналогов Ар^А от структуры фосфорсодержащей цепочки. Найдена корреляция между структурой фосфорсодержащей цепочки и комплексообразующими свойствами аналогов Ар^А и их ингибиторныыи свойствами в отношении некоторых ферментов.

5. Показана способность одного из синтезированных аналогов Ар^А быстро и обратимо удалять ион гп2+из активного центра трип-тофанил-тШК-синтетазы.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Тыртыш Т.В., Тарусова Н.Б. Фосфорорганические аналоги биологически активных соединений. ХУ. Синтез С-ацилфосфонатного аналога АТР и С-замещешшх метилендифосфоновых кислот - аналогов пирофосфата. - Биоорган, химия, 1986, т. 12, JS 9, с. 12821286.

.2. Taruaaova II.В., OaipomT.I., Tyrtysh T.V., Biryukov A.I. The phoaphorua analogs of P1,P^-bla(5'-adenoayl)tetraphoaphate (Ap^A). Abstracts, 2nd Intern, aymp. on "Phoaphorua chemistry towards biology", Lodz, Sept., 1986, p. 8-13. 3. larussova И.В., 03ipova T.I., Tyrtyah T.V., Biryukov A.X.

Phoophonate analogues of ^.^P-biafS'-adenozylJtetraphoaphate (Ap^A). - Inj "Biophoaphatea and their analogues, ayntheaia, structure, metabolism and activity" / Eda K.3. Bruzik and W.J. 3tec, Elsevier, Amsterdam, 1987, p. 195-200.