Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфороорганические аналоги аминокислот: синтез и использование в энзимологических исследованиях

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Фосфороорганические аналоги аминокислот: синтез и использование в энзимологических исследованиях"

!2 * -г

АКАДЕМШ НАУК СССР I-■. ^ (у , ^

ИНСТИТУТ. МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

На правах рукописи

ОСИПОВА Татьяна Ивановна

УДК 577.152:547.341

ФОСФОРОРГАШЧЕСКИЕ АНАЛОГИ АМИНОКИСЛОТ: СИНТЕЗ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ЭНЗИМОЛОШЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва'г- 1988

Работа выполнена р лаборатории химии регуляторов ферментативной активности Института молекулярной биологии All СССР

Научный руководитель: член-корреспондент MI СССР,

доктор химических наук, профессор P.M. ХОМУТОВ

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор . Э.Е. ШФАНТЬЕВ

кандидат химических наук Л.Г.' ГАБИБОВ

Ведущая организация: Кафедра биохимии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится " // " Gti,fj7tLJJ^-1988 г. в /Ос€ _часов на заседании Специализированного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии АН СССР по адресу: II7984, ГСП, Москва, В-334, ул. Вавилова, 32, ИМБ АН СССР

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР

Автореферат разослан " ^" . jC^ /^PX- 1988 г. .

Ученый секретарь •, ^

Специализированного совета j/ / / ' " • '

кандидат химических наук • • - ' A.M. Кришн

; ; ' I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

гаЧИйД

■ Актуальность проблемы. Одним из основных мотодологических приемов в исследовании функций и превращений природных веществ является использование направленным образом измененных соединений, сохраняющих подобие прототипу. Для аминокарбоновых кислот одним из наиболее перспективных классов аналогов в настоящее время являются аминофосфоновые гаслоты, некоторые из которых найдены в природе,и ряду из которых присуща выраженная биологическая активность.

Конструирование новых активных веществ в этом ряду непосредственно связано с нахождением новых ингибиторов клетевых ферментов обмена аминокислот и делает актуальным как химические, так и энзимологические исследования в этом направлении.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка новых методов синтеза фосфорорганических аналогов природных аминокислот., исследование их свойств и направленное создание на их основе новых регуляторов ферментов метаболизма аминокислот.

Научная новизна и практическая ценность. Разработан общий метод синтеза сС -кетофосфоновых кислот, аналогов оС -кетокарбо-новых кислот. Предложен новый способ получения Ы. -аминофосфоно-вых кислот, позволяющий получать изотопно-меченые соединения. Осуществлен синтез неизвестных ранее аминофосфониладенилатов -нового, типа аналогов переходного состояния и эффективных ингибиторов аминоадил-тРНК-синтетаз. Получены 2/(Зг)-аминофосфонатные ефиры. адениловой кислоты, которые являются ингибиторами ферментативного деацилирования аминоацил-тРНК. Синтезированы новые представители класса с^-аминофосфонистых кислот и на примерах аспартат&минотрансферазы и аминоацил-тРНК-сиктетаз показана их перспективность как нового' класса аналогов субстратных аминокислот. .

■ Апробация работы. Отдельные части диссертационной работы докладывались на Всесоюзной конференции по химии нуклеотидов и нуклеозидов (СССР, Рига, 1978 г.), 17 Биохимическом съезде (СССР, Ленинград, 1979 г.). Международной симпозиуме "Химия фосфора в биологии" (ЕурзекаиПольша, 1979 г.), 14 Международном симпозиуме по химии природных продуктов(ППРАС, Познань,

Польша, 1984 г.), Международном конгрессе по химии и биологии пиридоксалевого катализа (Турку, Финляндия, 1987 г.).

Публикации» По материалам диссертационной работы опубликовано 7 статей, 6 авторских свидетельств и 7 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы.

Работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками, таблицами. Список цитированной литературы содержит наименования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Настоящее исследование посвящается разработке способов получения и энзимологическому изучению аналогов аминокислот, в ко-' торых карбоксильная функция заменена на кислую фосфорсодержащую группу.

» он

и - сн - соон л - сн - р'"

I I ЧХ

Ш2 ЫН2

x о н; он; ой'; й' .

Синтез о(.-кетофосфоновых и о£-аминофосфоновых кислот и их производных

К началу наших исследований в этой области было известно несколько способов получения аминофосфоновнх кислот (I), которые были использованы для приготовления достаточно простых аналогов некоторых природных аминокислот. Однако многостадийность этих синтезов и их методическая сложность делали затруднительным получение ряда соединений, которые.были необходимы для знзи-ыологических исследований, в том числе и таких,. которые содержа-, ли радиоактивную метку. Последнее определяло критерии, которым должок был удовлетворять новый синтез агашофосфонатов - минкмаль-

нов число стадий при достаточно высоких выходах и возможность . введения метки на последних этапах.

Сопоставление известных способов получения аминокарбоновых и аминофосфоновых кислот, а также их предшественников,позволило предположить, что искомым методом могло быть восстановительное аминирование оС -кетофосфоновнх кислот (П). Однако эфиры последних, которые с высоким выходом образуются при взаимодействии хлорангидридов с триалкилфосфитами (реакция Кабачника), не удалось превратить в аминофосфонаты в обычных условиях восстановительного аминирования. Возможность же использования об-кето-фосфоновых кислот (П) в этой реакции затруднялась тем, что к началу наших исследований не было известно общего способа их получения в силу лабильной связи углерод-фосфор в стандартных условиях гидролиза эфиров фосфонатов.

Нами было найдено, что различные хлорангидриды гладко реагируют с трибензилфосфитом, давая дибензиловые эфиры -кето-фосфонатов (Ш), гидрогенолиз которых привел к искомым кислотам (П). Для получения чистых препаратов последних удобным оказалось предварительное монодебензилирование диэфиров с последующим каталитическим гидрированием.

Ы. -Кетофосфоновые кислоты (П) в водных или спиртовых растворах аммиака или первичных аминов (например, снуШд) при действии боргидрида натрия превращались в аминофосфоновые (I) или

-алкиламинофосфоновые кислоты, и таким способом были получены как известные аналоги аланина, валина, изолейцина, так и неописанные ранее об -амино- £ -карбоксиэтилфосфоновая и оС -амино-$ -карбоксипропилфосфоновая кислоты (аналоги глутамата и аспар-тата) с выходом 50-70% (считая на трибензилфосфит).

Последняя стадия протекала с высоким выходом, причем продукт легко отделялся от примесей, Поэтому способ был применен для получения - об -аминофосфоновых кислот на примере аналога валина (%,£ - оС -аминоизобутилфосфоновая кислота) с удельной активностью 70 мКи/ммоль- и свободного от радиоактивных примесей.

• Реакции аминофосфоновых кислот по аминогруппе, например, ацилирование, протекали примерно в таких ае условиях, что и соответствующие превращения аминокарбоновых кислот. Особый интерес представляло взаимодействие с альдегидами с образованием соответ-ствухщих азометинов (оснований Шиффа), поскольку химическая возможность такой реакции означала и вероятность субстратных превра-

RCHP(0)(0H)2 (IV)

NHCH2Pyr

RCP(0)(0H)o^S= RCHP(O) (OH), Я I ¿

N-CH2îyr N=CHÎ>yr

ÎJrrGHgHH^ Л If

RC0CX+P(OBz1)3-h»-RCOP(O)(OBz1)2-»-JICOP(O)COH)2-^-RCHP(0}(0H}2—»-RCHP(0)(0H)0P(0)(0H)0Ado

(III) ч ttx)^ L , (I) L (XX)

4 RC0P(0)(0H)0Bal 2 | ^ '

RCHP(0)(0H)2—i-RCHP(O)(OH)O2'(30 AMP

HHXjí711) Ш2 (VIIÏ)

RCHO + P(0)(0Et)2H + tm3-*-RCHP(0)(0Et)2-+-RCHP(0)0Et—+-RCHP(O)(0Et)0F(0)(0H)0Ado

Ц, № Ш2. № «

R » CHj (a); (CH3)2CH (tí); (CHjJgCHCI^ (в); H00CCH2 (r); HOOCCI^C^ (д). X » CF3CO; CgHçCH^OCO; HCO.

Ifrr - HOH2C OH A do = -iCH2 Ada

V-r

HO OH

щений аминофосфонатов в трансформациях, катализируемых пиридокса-левыми ферментами.

В водных растворах при нейтральных рН УФ-спектр пиридок-саль-5'-фосфата изменялся в присутствии больного избытка об -агт-ноизобутилфосфоиовой кислоты таким же образом, кок и в случае валима. В спиртовой среде взаимодействие эквимолярных количеств пи-ридоксаля и этого же фосфоната также приводило к образованию соответствующего пиридоксилиденового производного, о чем судили как по УФ-спектру реакционной смеси, так и выделением -пиридоксил-о1 -аминоизобутилфосфоната (ТУ) после добавления боргидрида натрия. Длительная инкубация смеси приводила к образования) лишь следовых количеств пиридоксамша, тогда как для валина в этих условиях неферментативное переаминирование протекало с выходом в несколько процентов. По-видимому, в этих условиях равновесие для аналога было практически полностью смещено в сторону пиридоксаля, что согласовывалось с полным превращением пиридоксамина в пирид-оксаль при действии с^-кетоизобутилфосфоновой кислоты (П, и = ■ (СН;3)2СН).

Среди производных аминофосфоновых кислот по фосфонильной группе значительное внимание было уделено мопоэфирам (У), как одноосновным аналогам аминокислот. Общим исходным соединением в синтезе простых моноалкиловых эфиров были диэфиры аминофосфона-тов СУХ), которые получались модифицированным способом Кабачни-ка-^Филдса - взаимодействием альдегидов с диалкилфосфитом в жидком аммиаке при нагревании. В одном из вариантов моноэфиры получались в качестве основного продукта при гидролизе диэфиров водной уксусной кислотой. Оригинальным способом получения простых моноэфиров явилась реакция внутримолекулярного алкилирования хлоргидра-тов диэфиров '- нагревание, хлоргидрата диэтил-( оС -аминоизобутил)-фосфонат'а (У1, й ■ (СН^СН) приводило к отщеплении хлористого этила и количественному образованию соответствующего моноэфира. Более общим способом явилась этерификация и-защищенных амино-фосфонатов СУП) с помощью Я.н-дшщмогехсилгарбодаимида, что было использовано для получения аминофосфонильных эфиров адени-ловой кислоты (УШ), как аналогов соответствующих аминоацильних эфиров:

о

О

II.-

С6Н5СН20-Р -осн2

лае • ■

Айв

он

С6Н5СН20-Р -осн2

о

Й-СН-Р(0Н)2 инг

I

он

НО-Р-ОСН.

Айо

он

изомер

снинг.

I

и

2

I г . I ,

0=>Р-0Н + 2' ОоР-ОН + 2'

Г^н

изомер

СН-Шр I й

(УШ а,б)

а: И» -СН(СН3)2; б: й= -СН2С6Н5

Эта схема предусматривала максимально мягкие условия снятия защитных групп. Конденсацией бензилового эфира АМР с И-карбо- . бензокси- сб-аминофосфоновыми кислотами под действием и.и'-ди-цшслогексилкарбодиимвда были получены промежуточные эфиры, выходы которых после очистки на ДЕАЕ-целлюлозе составляли 50-60$. Каталитическое дебензилирование проводилось над палладиевой чер- ■ нью и в водной уксусной кислоте. Выходы индивидуальных по ТСХ и электрофорезу эфиров (УШ а,б) после хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе составляли 30-40%. Под влиянием щелочной фосфатазы гидроли-зовалась только 5 -фосфоэфирная связь соединения (УШ б), что согласовывалось с известными данными об устойчивости ¿/-(аминоме-тилфосфонил)нуклеотидных эфиров к Действию этого же фермента. Полученный таким образом 2'(3')-0-(1-ашшо-2-фенилэтил-1-фосфонил)-аденозин был идентичен продукту, синтезированному ранее.

Другим видом производных ашнофосфонатов по ■ фосфонильной группе явились их ангидриды с адениловой кислотой (IX) и (X), фосфорорганические аналоги аминоациладенилатов, основных промежуточных соединений аминоацил-тРНК-синтетазной реакции..

При синтезе этих соединений ключевой стадией является образование ангидридной связи. Среди известных методов получения несимметричных пирофосфатов одним из наиболее удобных оказался способ, предусматривавший предварительную активацию фосфорилъной группы одного из компонентов в виде имвдазолвда. В первом варианте импдазолид адениловой кислоты вводился в конденсацию с

н-защшдешшми ¿¿-амннофосфоновыми кислотами.

AdoOP(О)OHImid+RCHP СО)(ОН), I

raz

Ado0P(0H)0-P(0)(OH)CHH NHZ

(IX a) R « (СН3)2СН;

(IX б) R = СбН5СН2

В качестве защитной была выбрана карбобензоксигруппа, так как удаление ее осуществляется в достаточно мягких условиях без затрагивания лабильной ангидридной связи. Следует отметить, что значительный распад последней наблюдался, если гидрогенолиз проводился в среде гидроксилсодержащего растворителя и был минимальным в среде абсолютного диметилформамода (выходы порядка 50$).

Помимо (IX а) и (IX б) аналогичным образом были получены смешанные ангидриды AMP и метил- и изобутил-фосфоновых кислот.

Во втором варианте с помощью карбонилдиимидазола активировалась ашшофосфоиовая кислота

СР,С00Н _ А1ЛР (l) + CO(Imld)2 —Z-i*- fRCH-P(0)(0H)Imld j -.....- (IX a);(IX б)

+NH3

Хотя сами oL-аминофосфоновые кислоты из-за плохой растворимости не реагировали в органических растворителях с карбонилди-имидазолом, их трифторацетаты в растворе диметилформамида быстро давали соответствующие имидазолида, которые без выделения вводились в реакции с триотаиламмониевой солью AMP. Выхода смешанных ангидридов (IX) в этом случае были порядка 25-30$, преимущество заключалось в возможности использования незащищенных по аминогруппе аминофосфонатов.

. Известно, что конденсация двух различных моноэфиров фосфорной кислоты под влиянием дициклогексилкарбодишлида обычно приводит к смеси всех возможных пирофосфатов. Однако, когда один из компонентов отличается по кислотности, наблвдается преимущественное образование несимметричного гарофосфата. При взаимодействии амянофосфоновых кислот и- AMP под действием дкцяклогексшпшрбоди-имида в среде водного пиридина,- содержащего соляную кислоту, не отмечалось образования ангидридов аминофосфояовых кислот и вссо-

да смешанных ангидридов составляли 17-24%.

(i)+ Ado0P(0)(0H)2 РСС/Нг-°> (IX а) и (IX в; r = ch3sch2ch2)

Простота последнего способа позволила получить таким образом и - с£. -аминоизобутилфосфош1л)-5 -аденилат, радиоактивный аналог (IX а) с активностью 63 мКи/ммоль.

При изыскании путей синтеза ангидрида моноэтилового эфира oL -ашноизобутидфосфоновой кислоты и AMP (X) учитывалось, что по реакционноспособности моноэфиры фосфоиовых кислот напоминают ди-эфиры фосфорной кислоты, для активации которых требуется достаточно энергичное воздействие (сульфохлориды, карбодиимиды при повышенных температурах и т.п.). Использование подобных агентов подразумевало дополнительные стадии, связанные с защитой имеющихся функциональных груш, что ставило новые проблемы, обусловленные лабильностью ангидридной связи. Эти трудности удалось обойти благодаря использованию фосгена для активации, фосфонильной груп- . пы.

(v) + coci2 —Гк-снр(о)(ос2н5)с11-^_ (х; r <> (сн3)2сн)

+НН3 -1

При обработке моноэтилового эфира cL -аминоизобутилфосфоновой кислоты фосгеном в среде абсолютного диоксана происходило, по-видимому, образование монохлорангидрида, который без выделения вводился в реакцию с AMP, что непосредственно приводило к ангидриду (X) с выходом 4СЙ.

Строение полученных смешанных ангидридов (IX) доказывалось на примере соединения (IX а), синтезированного тремя способами. Оно было гомогенным при электрофорезе в разных системах, и при рН 4,1 подвижность его отличалась от AMP и -аминоизобутилфос-фоновой кислоты. УФ-спектр соответствовал незамещенному аденози- , ну. Вещество окислялось периодами'натрия, что подтверждало наличие свободной гликольной группировки. На хроматограммах соответствующее УФ-поглощающее пятно окрашивалось нингидрином. При гидролизе соединения (IX а) (100°, 10 мин, 1 н. НС1) единственными продуктами были AMP <L -аминоизобутилфосфоновая кислота.

Для ферментативных испытаний важное значение имела устойчи-

HCHP(0)(0H)(0Rf)

HCH-NOH.+ H3P02 -s— RCHP(0)(0H)H -

ш2 ff (XI)

RCHP(0)(0H)H

I

N=CHPyr

RCP(0)(0H)H

II

N-CH2iyr ругсн2нн2 + 'RC0P(0)(0H)H

R « CH3 (а); (CH3)2CH (6); СH3SCH2CH2 (в);

X « CP^CO; C6H5CH2OCO; HCO.

RCHP(0)(0H)2

nh2 i (j>

rchp(o)<ok)2 (vii)

NHX I

RCHP(O)(OH)H -a- RCHP(0)(0H)CH3

ЫЮС (XXI) NH2 (*m)

HOOCCH2CH2 (r); HOOCCHg (д).

вость аналогов (IX)-(X)., Вше уже упоминалось об их распаде при гидрогеноли'зе соответствующих производных. Аналогичное явление наблюдалось и при ионообменной хроматографии. Сравнение устойчивости соединений (IX) показало явное влияние аминогруппы на лабильность ангидридной связи (времена полураспада при рН 1, 7, 8 и 12 составили для ангидрида 6,6 и 3 ч; для ангидрида метилфос-фоновой кислоты и AMP — 48, 48 и 48 ч соответственно).

Синтез oi -ашшофосфонистых кисло? и их производных

Среди фосфорорганических аналогов аминокислот уже давно были описаны соединения со связью Р-Н и N -алкилированной аминогруппой, а также единственное вещество со свободной аминогруппой, амшюметилфосфокистая кислота. К началу наших исследований не .существовало общего метода получения oL-аминофосфонистых кислот и, следовательно, не было возможности оценить перспективность о тих • веществ как нового класса аналогов природных аминокислот. ■

В 1978 г. P.M. Хомутовым и Т.И. Осиповой было обнаружено, -что взаимодействие оксима и фосфорноватистой кислоты приводит к oL -аминофосфонистой кислоте (XI), и этот раздел работы посвящается использованию новой реакции для получения неизвестных ранее соединений этого класса, а также их свойствам и некоторым превращениям.

Реакция альдоксимов с безводной фосфорноватистой кислотой протекала как экзотермический процесс, который становился трудно контролируемым при незначительных отклонениях от найденных условий. Более удобным оказалось проведение реакции в кипящих растворах низших спиртов с двукратным избытком фосфорноватистой кислоты по отношению к оксиму. Таким способом были получены фосфонис-тые аналоги аланина (XI a; R » сн3), валина (XI б; Ra(CH3)2CH), метионина (XI в; к=сн3сн2сн2) . глутамата (XI г; r=hoocch2ch2) и аспартата (XI д; R - нооосн2) с выходом от 5 до 60%.

Следует заметить, что ранее (N. Kreutzkamp, 1969) сообщалось, что в сходных условиях оксим и фосфорноватистая кислота образуют только продукт присоединения, об-оксиаминофосфонистую кислоту. Однако при попытке воспроизведения этой работы нам удалось выделить только (XI).

Кетоксимы и О-алкилированные оксимы также вступают в эту ре-, акции, хотя в последнем случае необходимо многочасовое нагрева-

нив в растворителях типа ТГФ или даоксане.

Достаточно очевидно, что образование (XI) включает как стадию присоединения фосфорноватистой кислоты по кратной связи с=ы, так и восстановление связи ^и-он . Хотя вопрос о механизме этой реакции еще изучается, ясно отличие ее от классической перегруппировки Бекманна - превращение оксимов под действием сильных кислот в амиды.

Кислоты (XI) являются вполне устойчивыми в обычных условиях веществами, которые разлагаются на альдегид и фосфорноватистую кислоту лишь при длительном нагревании в кислых водных растворах. Они напоминают -аминокарбоновые кислоты по ряду свойств - растворимости, хроматографической подвижности в разных системах, константам ионизации, солеобразованию.

валин

(XI, И О (СН3)2СН) (I, Я а (СН3)2СН)

рК, 2,3 1.2 1,2

рК2

9,3 7,8 5,7

РК,

10,4

Р1

5,8

4,5 5,7

В химических превращениях кислот (XI) могли затрагиваться как аминогруппа, так и достаточно реакционный гидрофосфорильный фрагмент. Однако образование N-ацилышх производных (ХП, X = НСО; сбн^сн2осо) гладко протекало в обычных условиях ацилирова-ния аминокислот. Аналогичным образом взаимодействие пиридоксалн и (XI, й=(сн3)2сн или сн3) в спиртовых растворах сначала приводило к соответствующим пиридоксилвденовым производным, последующая таутомеризацяя которых в конечном счете дала пиридоксамин, как и для обычных аминокислот в неферментативном переаминировании.

Характерным для кислот (XI) являлась легкость превращения в аминофосфонаты (I) или их производные (У) или (УП) под действием окислителей. Эти реакции могут иметь и препаративное значение, учитывая доступность (XI), простоту методик я высокие енхо-да аминофосфонатов* Ценность (XI) как исходных в синтезе других видов фосфоаналогов аминокислот была продемонстрирована превра-щением(ХП,'к • (СН3)2СН; х а С6Н^СН20С0) в соответствующую фос-финовую кислоту с выходом 1055.

1) ССС(СН^ОН,ТГф)

й/ОН 2) СН,ОНа II - СН - Р( -^-И - СИ - РС

шх Чи сн31 ■ ^сн3

4) Н+/Н20 г

Ингибирование амшоацил-тРНК-синтетаз ^ фосфороргани-ческида аналогами субстратных аминокислот и промежуточных соединений

Среди производных и аналогов аминокислотных субстратов ами-ноацил-тЕНК-синтетаз аминофосфонаты (I), как было ранее показано, не обладали субстратными свойствами и являлись слабыми ингибиторами ( К1 10 М) ферментативной реакции. Существешше различия в свойствах (I) и аминофосфонистых кислот (XI) явились основанием для исследования влияния"фосфонпстих аналогов валина (XI а; к в (сн3)2сн) и метионина (XI б; й = сн3зсн2сн2) на реакции, катализируемые соответствующими синтетазамн.

Таблица 1

' Сравнение кинетических параметров, валина и метионина и их фосфонистнх аналогов

Соединения

кто (м)

К1 (М)

Реазсцкя аминоацилироваяия тРНК

ь - валин XI а

ь - метионин XI б

ь - валин XI а

ь - метионин XI б

3 х 10"5 3,4х 10"5

Реакция АТР-РР1

2,1 х Ю-4 8,3 х Ю-4 6,0 х 10"5 1,0 х 10~3

2 х 10"4

6 х Ю-4 обмена

1

0,12 1

0,54

х> Испытания на аминоацил-тРНК-синтетазах были проведены А.И. Бирюковым.

Соединения (XI а) и (XI б) явились эффективными и специфическими ингибиторам! реакции амикоацилировання т?НК, катализируемой валил- и метионил-тИЖ-скнтетазами. Ингибированпе было обратимым и конкурентны!,! относительно обоих субстратов.

С химической точки зрения, по-видимому, вполне вероятно, что фосфонистые кислоты могут реагировать с АТР, давая соответствующие аденилаты. Оказалось, что (XI а) и (XI б) были способны заменять валин и метионин з реакциях ATP-PPi обмена, протека:-эщих с участием соответствующих скнтетаз. Сродство ях к ферментам и v_e„

ГП&л

реакций, как видно из табл. 1, были всего в несколько раз меньше субстратных. Так как эти аналога представляли собой рацематы, то эффективность их в действительности была еще вкие.

Участие (XI а) л (XI б) в реакция ATP-EPj обмена могло зависеть от нуклеофильностп Р(0)(0Н)Н фрагмента или определяться его стеркческкмя параметрами. Амшофосфонаты не участвовали в реакции ATP-PPi обмена, однако юс ангидрида с AMP, аминофосфониладенилаты, являлись эффективными ингибиторам! синтетаз, что обсу.го^тся далее. Поэтому подобие между стерическими параметрами -Р^Н и

о он

- групп, по-видимому, является более предпочтительным. Фос-

фонистые кислоты могут существовать в таутомерных формах:

о он

R - Р^-Н —-— R - р'

ОН ^он

В обычных условиях равновесие смещено в сторону четырехкоор-динационной формы. По-ввдкмому, (XI а) и (XI б) участвуют в ферментативной реакции в Р-Н форме.

Таким образом, на примерах (XI а) и (XI б) впервые показано, что в реакции активации способны участвовать и другие функциональные группы, отличающиеся от карбоксильной.

Для многих аминоацил-тРНК-синтетаз основным промежуточным соединением ферментативной реакции являются аминоациладенилаты (Х1У). Синтезированные нами фосфорорганические аналоги, аминофос-фониладенилаты (IXи X) могли представлять интерес как субстраты синтетаз, поскольку они обладают достаточно активной ангидридной связью, либо как ингибиторы, поскольку содержат все элементы обладающих высоким сродством структур (XI7).

0 0 0 0

R-CH-C-0-Р- OAdo R-CH-P-O-P- OAdo

I ) III

nh2 OH NH2 X OH

(XIV) (IX) (X)

(IX a); R«=(CH:3)2CH; X = OH (IX 6))R=C6H5CH2; X = OH (IX B)j R=CH3CH2CH2; X = OH (x); H=(CH3)2CH; X = OC2H,

Таблица 2

Ингибировакие (Ki, м) аминоацил-тЕНК-синтетаз oL -аминофосфонил-5'' -аденилатами

Соединения С и н т е т а з ы

Валил- Фенилаланил- Метионил-

ATP-PPj обмен Аминоаци-лирование тРНК АТР-РР£ обмен Аминоацн-лирование тРНК ATP-PPi обмен Аминоаци-лирование " тРНК

IX а IX б IX в X 1,4«10~7 5, МО-3 3,4«10~3 4,2>1СГ6 2,8'Ю*"7 3,4-10~3 6.2М0"3 2,7-Ю~6 3,5-Ю-3 2,0-Ю-7 4,МО"4 3,0» Ю-3 5,0-Ю-7 2,0-Ю-3 6,0 -Ю-3 2,4« Ю-3 4,0'Ю-6 4,0-Ю"3 3,5. Ю-3 2,0.Ю-7

Как видно из дашшх табл. 2, синтезированные аналоги (IX) и (X), подобные по строению определенным ампнощдоюдёнилатам (Х1У), оказались сильными и избирательными ингибиторами в реакциях АТР-P?i обмена и акиноацилирования тРНК. Специфичность строения ами-нофосфонкладенилатов, как аналогов аминоациладенилатов, следовала не только из факта слабого ингибирования "чужого" фермента (разница в несколько порядков), но и значительного ослабления торможения при изменении строения ашнофосфонатной часта адени-латов. Замена гкдроксильной группы на этокснльную у фосфора ами-нофосфонатного фрагмента лишь незначительно снижала ингибирова-нне. Торможение аминофосфокиладенилатами было конкурентным по отношению к обоим субстратам, аминокислоте и АТР, что свидетельствовало о связывании ингибитора непосредственно в активном центре

фермента.

Выше уже отмечалась активность ангидридной связи в соединениях (IX). Применительно к синтотазам это означало вероятность таких реакций, как ферментативный гидролиз Р—0—Р-связи, амино-фосфонилирование групп активного центра, взаимодействие с неорганическим пирофосфатом с образованием АТР или а?.з:нофосфонилиро-ванке тРНК.

Эти возможности были проверены экспериментально. Так, степень шгибирования валил-тРНК-синтетазы аналогом (IX а) не изменялась во времени и торможение снималось добавлением избытка ва-лина. Следовательно, пнгкбирование было обратимым, не затрагивало групп активного центра и не сопровождалось гидролизом аналога. Фермент не катализировал реакцию плрофосфоролиза аналогов, так как при инкубации (IX) с синтетазой я не было обнаружено

ор о .

АТ ■ Р. Наконец, в опытах с ангидридом ^^ - -амгшоизобупмфос-фоновбй кислоты и Л^!? было показано, что в стандартных условиях ферментативного амлноацилированиа не наблюдалось включение метни в тРНК, т.е; не происходило атиофосфонилировакие последней. Аналогичная картина торможения наблюдалась и в случае других смешанных ангидридов (IX), также оказавшихся конкуренткыми обратимыми ингзбитораст, ангидридная 'связь которых была пассивна в катализируемых сиптетазакя реакциях.

Эта особенности ангидридов (IX, X) было трудно объяснить, если рассматривать их как аминоациладенилаты, з которых —С(0)-грутша заменена на ^Р(О)—X фрагмент. Электронные и пространственные параметры этих групп отличаются настолько, что такая аналогия была бы чисто формальной. Ингибаторные свойства (IX, X)' можно лучше понять, если рассматривать фермент-ингибиторше.комплексы (Б) как аналоги тетраэдрических продуктов присоединения по карбонильной группе аминоациладенилатов (А).

ОН О 0 0

Й-СН-С-О-Р-О Айо Й-СН-Р-О-Р-ОАйо

II I , II I

НН9 2 ОН 1 X ОН '

- В - " '

(А) (Б)

Р ' - ?Н

При этом - Р - группа ангидридов Б соответствует - С -

X г

в структуре А, что объясняет как отсутствие субстратных свойств у (IX), так и высокое сродство (X).

Таким образом, для энзиматической активации карбоновых кислот с участием АТР ангидриды, подобные (IX), являются, по-видимому, первым примером использования соединений с тетраэдрическим атомом фосфора в качестве аналогов переходного состояния ферментативной реакции.

Исходя из этого, интерес представляли данные по влиянию ами-нофосфонильных эфиров (УШ), "как аналогов продукта ферментативного процесса, на реакции, катализируемые валил-тРНК-синтетазой. Соединения(УШ а: н = (СН3)2СН; б: R « с6н5сн2) слабо ингибиро- ' вали (8 х М) как реакцию АТР-РРА обмена, так к аминоацилиро-вания тРНК( Однако, аналог (УШ а) в концентрации порядка 10~4 М заметно тормозил высокоспецкфичное катализируемое ферментом де-ацилирование валил-тРНК. Ингибирование было специфичным, поскольку аналог (УШ б) оказался практически неактивным.

Таким образом, в отличие от известных ингибиторов деацили-рования соединения типа(УШ)действуют только на этот процесс, практически не влияя на прямую реакцию.

Фосфоновые и фосфонистые аналоги аспартата и . глутамата в аспартат-трансаминазной реакции

Как отмечалось в литературном обзоре, биологическая активность фосфоаналогов аминокислот и юс производных часто обусловливается влиянием их на.ферменты.метаболизма аминокислот, в том числе и на те, кофактором которых является пирвдоксаль-5''-фосфат. Кроме того, в биосинтезе и деградации природных фосфоаналогов аминокислот ключевая роль принадлежит этим же ферментам. Поскольку систематических исследований по взаимодействию фосфоаналогов субстратных аминокислот с пиридоксалевыми ферментами до сих пор не проводилось, наш был осуществлен синтез фосфоно-ьых и фосфонистых аналогов аспартата и глутамата и исследовано юс влияние на аспартатаминотрансферазу.

(СНр) соон

I " п

СН - Р(0)(0Н)Х I

нн,

(Г/)

(ш)

(ХУП)

(ХУШ) П. « 2; X * Н

п= 1; X = ОН П я 1 ; X => Н П О 2; X я ОН

(СН2)П - Р(0)(0Н)Х

СН - СООН I

кн.

2

= 1; X = ОН » 1; X = Н

(XIX) а

(XX) п

(XXI) п = 2; X я ОН (ххп) а = 2; X = Н

Из аналогов (ХУ-ХХП) соединенна (ХУ-ХУШ) были получены методами, описанными в предыдутдях разделах, а схемы синтеза остальных представлены ниже.

СН2 а ССООС2Н5

ннсосн,

1) НР(0)(0С2Н5)2

'г) н+/н2о

2) Н+/Н20

1) Н2Р(0)(0СН3)

(XXX)

(XX)

СН(СООС2Н5)2

шсосн.

1) СН =СР(0)(0С2Н5)2

2) Н+/Н20 ■

г) нУ^о_

1) СНг=СРСО)(ОС4Н9)Н

(XXI)

(XXII)

Исходным соединением в синтезе аналогов аспартата(Х1Х)и(ХХ) был ацетоаминоакриловый эфир, присоединение к которому диэтил-фосфита или метилпшофосфита приводило к соответствующим эфирам, гндролизовавшимся без выделения до соответствующих кислот. Сходным образом виналфосфонат или винилфосфонит после присоединения

ацетоаминомалонового эфира и последующего гидролиза превращались в аналоги глутамата.

Выше уже отмечалось, что аминофосфонаты образуют с пирвдок-салем нормальные шины и способны претерпевать неферментатиктое переаминирование. Однако в случае ашяюфосфонистых кислот (XI) взаимодействие с пирвдоксалем могло протекать неоднозначно, поскольку соединения с Р—Н связью способны реагировать с карбонильными соединениями и иминами. Подобные реакции могли происходить особенно легко с аналогами аспартата или глутамата (XX или ХХП) благодаря образованию циклов.

Очевидно, подобные превращения в случае фермента приводили бы к его необратимому торможению.

Оказалось, однако, что взаимодействие фосфонистых аналогов алашша (XI а), валина (XI б), и глутаминовой кислоты (ХХП) с пирвдоксалем в условиях модельного переаминирования протекало так жо, как и для соответствующих аминокислот, т.е. по уравнениям, . представленным на схеме 2. Таким образом, на основании химических экспериментов нельзя было исключить возможность ферментативного переаминирования фосфоаналогов аспартата и глутамата (ХУ- '

В стандартных условиях определения активности аспартаташ-нотралсферазы аналоги (ХУ-ХХП) оказались конкурентными ингибиторами фермента а сродством, которое было либо близким субстратному, либо в десятки раз худшим (ШКт о 1-50). Поскольку кинетические вкспериыента оставляли открытым вопрос о возможности ферментативных превращений аналогов, то было исследовано взаимодей-

РугСНО + Н2НСН(СН2)ПР(0)(0Н)Н

соон

^/ИН-СН-СООН

РугСИ

\р(0)-(СН2)п I * п

он

п » 1, 2 ,

ХХП).

л е.

9 1 л

Д<£

,-,// \\ fsf ^

ш \

l-'V Ч • I

и* h

m*

¥ #

w>

\

ч-

Л •

е\. i

\W

Ж

н

¿¿о ЗАО 360 зго 4/00 ЩО ш

Í5 ñ il

ii {0-

.3-

з-?

6-\ 5

h И

з ¿

i

о

I

л / \ / \

/¡Фл'

li J к

iff /V

«л

\ 1

\

¡II

«é '

m

о* -

V:*

s.-tt

Hl

•ex

i!

V

Л \\\ w

... W\

Ê! 4L

\

2Zo 34o }бо 3ío ¿toa

КД-^пек'ВД ^а^татаминот^ансфера^ы^у ) g gp^cy^cprai фосфошшх аналогов гд

Рис. 1 КД-спектрц та

Ш ни глутама-

ствие их с пиридоксилиденовой формой фермента. Добавление аналогов к ферменту в тех не условиях, что и субстратных аминокислот, вызвало такие же изменения УФ- и КД-спектров тран&штзы, как и в присутствии асяартата и глутамата (рис. 1). Сходная картина наблюдалась при двух значениях рН, полнота превращения фермента в аминоформу зависела от избытка аналогов, спектр и активность фермента восстанавливались после добавления избытка Ы. -кетоглу-тарата. Хотя вопрос о скорость определяющих стадиях процесса в случае соединений(ХУ-ХХП)еще исследуется, есть основания считать что введение кислотной фосфорсодержащей функции вместо карбоксильной группы субстратной аминокислоты не исключает возможности ферментативного переаминирования аналогов.

ВЫВОДЫ

1. Разработан общий метод синтеза cL -кетофосфоновых кислот.

2. Предложен новый метод синтеза d. -аминофосфоновых кислот, а также их различных производных по аминогруппе и фосфонатному фрагменту,

3. В качестве нового типа аналогов переходного состояния в синтетазной реакции предложено использовать аминофосфониладенн-латы; осуществлен их синтез и установлена их способность избирательно ингибировать аминоацил-тРНК-синтетазы,

4. Осуществлен синтез и изучены свойства неизвестных ранее представителей класса - d-аминоалкилфосфонйстых кислот, чем доказана общность использованного метода,

5. На примерах аспартатаминотрансферазы и аыиноацил-тРНК-синтетаз показана перспективность сС-аминофосфонистых кислот, как нового класса аналогов субстратных аминокислот.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1, Хомутов Р.Ы., Осипова Т.И., Еуков Ю.Н. Синтез ¿-кетофосфоновых кислот. - Изв. АН СССР. Сер. хим., 1978, Я 6, с. .13911394.

2. Хомутов P.M., Осипова Т.И. Новый метод получения оС -ашшо-

фосфонистых и o¿-аминофосфоновых кислот. - Изв. АН СССР. Сер. хим., 1978, №8, с. 1954.

3. Осипова Т.И., Бирюков А.И., Гавдурина И.А., Тарусова Н.Б., Хомутов P.M. 2' (3')-Аминофосфоновые эфиры АМР-синтетаз и избирательное ингибированле деациллрования валил-тРНК. -Биоорг. хим., 1^78, т. 4, JS 11, с. 1471-1475.

4. Biryukov. A.I., Ósipóva-T.I», Khomutov R.M. ot- -Aminophoapho-noua acidar The oubatratea of ATP-PP^ exchange reaction, catalysed Ъу aminoacyl-tRNA synthetases. - FEBS Lett., 1978, v. 91,^2,p.246-248.

5. Хомутов P.M., Осипова Т.Н., Бкрпков А.И., Ишуратов Б.Х. Ами-нофосфониладенилаты - новый тип аналогов переходного состояния.в сянтетазной реакции и эффективных ингибиторов аминоацил-

. тРНКтсинтетаз. - Биоорг. хим., 1979, т. 5v Já 1, с. 56-63.

6. Хомутов-P.M., Осипова Т.И. -c¿ -аминоизобутилфосфоновая кислота и ее ангидрид, с аденозин-5/'-фосфорной кислотой. -Изв. АН СССР. Сер. хил., 1979, Л 5, с. 110-112.

7. Хомутов P.M., Осипова Т.И., Жуков Ю.Н.,- Гандурина И.А. Синтез .

<А -аминофосфоновых кислот и их производных. - Изв. АН-СССР. Сер. хим., 1979, № 9, с. 2118-2122..

8. Тарусова Н.Б., Куханова М.К., Осипова Т.И., Бирюков А.И., Гандурина И.А., Хомутов P.M. Амкнофосфонкльные производные нуклеотидов - ингибиторы.различных этапов биосинтеза белка. -Тезисы докладов на I Всесоюзной конференции по химии нуклеотидов и нуклеозидов. - Рига¿ 1978, с. 117-118.

9. Хомутов P.M., Осипова Т.И., Бирюков А-.И. Фосфонатные аналоги ' аминоациладенилатов новый тип ингибиторов аминоацил-тРНК-

синтетаз. Тезисы докладов I Всесоюзной конференции по химии нуклеотидов и нуклеозидов. - Рига, 1978, о. 118-119.

10. Осипова Т.И., Гандурина H.A., Яковлева Г.М., Тарусова Н.Б., Хомутов P.M. Новые производные AMP - специфические ингибито- • ры различных этапов биосинтеза белка. Тезисы докладов на 1У биохимическом съезде. - М.'. Наука, 1979, с. 189.

11. Khomutov R.M., Osipova Т.I., Biryukov A.I., Taruseova N.B., Yakovleva G.M. Phoaphororganio analoge of biologically aotlve compounds. - International Symposium "Phoaphorue Cheoietry

, Directed Towards Biology", Burzenin, 1979« p. 92.

12. Бирюков А.И., Осииова Т.И., Хомутов P.M. Аммонийная соль этилового эфира ai -аминоизобутилфосфонил-б'-аденилата для инги-бировакия ферментов биосинтеза белка в клетке и способ ее получения. - Авторское свидетельство а 662558. Опубл. в "Офиц. балл. Госкошзобретений", 1979, & 18, 118. .

13. Бирюков А.И., Гандурина И.А., Осипова Т.Н.', Хомутов P.M. Натриевая соль [oL-амино- ft - метилтио)-пропилфосфонил]-5'-адени-лата дл& избирательного ингибирования ферментов биосинтеза белка в клетке и способ ее получения. Авторское свидетельство № 671290. Опубл. в "Офиц. балл, Госкомизобретений", 1979,

ß 24, 190.

• 14. Ишмуратов Б.Х., Бирюков А.И., Гандурина H.A., Осипова Т.И., Хомутов P.M. Натриевые соли . о1-аминофосфонил-5'-аденилатов для избирательного ингибирования процессов биосинтеза белка в клетке и способ их получения. - Авторское свидетельство J6 671288. Опубл. в "Офиц. бюлл. Госкомизобретений", 1979, №24, 190.

15. Бирюков А.И., Осипова Т.Н., Хомутов P.M. Натриевая соль (^ijt - оС -аминоизобутилфосфонил)-5/-аденилата для исследования процессов биосинтеза белка и способ ее получения. -Авторское свидетельство Ji 671289. Опубл. в "Офиц. бюлл. Госкомизобретений", 1979, )í 24, 190.

16. Гандурина И.А., Жуков Ю.Н., Осипова Т.И., Хомутов P.M. Способ получения oL-аминофосфоновых или N^-алкил- cd -амино-фосфоновых кислот. - Авторское сввдетельство Ä 697519. Опубл. в "Офиц. бюлл. Госкомизобретений", 1980, № 7, 140.

17. Бирюков А.И., Осипова Т.И., Хомутов P.M., Хурс E.H. U -Ами-нофосфонистые кислоты для избирательного ингибирования ферментов и способ их получения, - Авторское свидетельство Н 717062. Опубл. в "Офиц, балл. Госкомизобретений", 1980, Ä 7, 129.

18. Khurs E.H., Oslpova Т.I., Khomutov R.M. Phosphoroorganlc analogs of aspartate and glutamate are transaminated by aspartate aminotransferase. - International Congress on Chemical and Biological Aspeóte о£ Vitusin Bg Catalysis.'"Vltaaln Bg Meeting1*, Turku, Ptnland, Я987, p. 96^

, 19« Zhukov Yu.H., OslpoTa T.I., Khomutov R.M. Phosphoroorganlc

compounds for studying aspargine synthetase. ГОРАС 14th International Symposium on the Chemistry of Natural Products, July 3-14, 1984. Poznan, Poland, Abstracts II, 1984, p. 524.

20. Biryukov A.I., Osipova T.I., Tarussova N.B., Khomutov R.M. Organoiphosphorus analogs of aoyladenylates are powerful in-. hibitorS of various synthetases. - IUPAC 14th International Symposium on the Chemistry of Natural Products, July 3-14, 1984. Poznan, Poland,Abstracts II, 1984, p. 544.

Подл." в печать 21.12.8Г7г. Т - 20208 Заказ 2 5 2 5 Тираж 100 Формат 60хВ4/18 Мосхва." Типография ВАСХНИЛ