Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение свойств транскетолазы в результате ее взаимодействия с кофакторами и субстратами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изменение свойств транскетолазы в результате ее взаимодействия с кофакторами и субстратами"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Кафедра биохимии Биологического факультета и отдел биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского

На правах рукописи

ЕСАКОВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

ИЗМЕНЕНИЕ СВОЙСТВ ТРАНСКЕТОЛАЗЫ В РЕЗУЛЬТАТЕ ЕЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С КОФАКТОРАМИ И СУБСТРАТАМИ

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в отделе биохимии животной клетки Института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Г.А. Кочетов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.Н.Чернов

доктор химических наук

профессор А.М.Юркевич

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарда

Защита состоится 30 мая 2005 г. в 1400 часов на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 в Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119 992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета

МГУ.

Автореферат разослан

2005

г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы исследования. Транскетолаза (ТК)* катализирует одну из ключевых реакций пентозофосфатного пути превращения углеводов, реакцию расщепления кетосахаров по С-С связи, соседней с кетогруппой, и последующий перенос двууглеродного фрагмента с субстрата-донор (кетозы) на субстрат-акцептор (альдозу).

На сегодняшний день наиболее полно исследованы свойства ТК пекарских дрожжей. Фермент состоит из двух идентичных субъединиц и имеет два активных центра, расположенных на границе между контактирующими поверхностями мономеров. Активные центры характеризуются равной каталитической активностью. Кофакторами ТК являются ионы двухвалентных металлов (Са2+, и др.) и ТДФ. Показано различное влияние ионов

двухвалентных металлов на взаимодействие апоТК с ТДФ. В присутствии ионов кальция фермент характеризуется ярко выраженной неэквивалентностью и высоким сродством к коферменту. В присутствии ионов магния неэквивалентность активных центров слабо выражена или отсутствует; понижено и общее сродство ТК к ТДФ.

ТК была первым ТДФ-зависимым ферментом, для которого был сделан РСА. Естественно поэтому, что все последующие годы основное внимание было уделено изучению структуры данного фермента: аминокислотных остатков, участвующих в связывании кофакторов и субстратов, функциональных групп, целостность которых необходима для катализа, структуры активного центра, и совсем мало уделялось внимания вопросам функционирования ТК (в широком смысле этого слова), понимая под этим, в частности, изменение конформации (функциональная подвижность) молекулы фермента в результате его взаимодействия с кофакторами и субстратами. Этот круг вопросов и предстояло исследовать в данной диссертационной работе.

*Список сокращений: ТК - транскетолаза, ТДФ - тиаминдифосфат, ДОЭТДФ -дигидроксиэтилтиаминдифосфат, КД - круговой дихроизм, ГП - гидроксипируват, К5Ф -ксилулозо-5-фосфат, ДОА - дигидроксиацетон, РСА - реитгеноструктурный анализ

Цель исследования. Целью настоящей работы было исследование влияния субстратов и природы двухвалентных катионов на взаимодействие кофермента с апоТК и образование каталитически активного холофермента, а также влияния кофакторов (ТДФ и двухвалентных катионов) на конформацию и стабильность транскетолазы.

Научная новизна работы. Выявлена причина неэквивалентности активных центров к ТДФ, которая индуцируется субстратом-донором в присутствии

мё2+.

На основании полученных экспериментальных данных сформулирована концепция возможного механизма регуляции транскетолазы субстратом-донором.

Выявлена возможность ТК осуществлять каталитическое превращение атипичных субстратов доноров (галогенпроизводных пирувата).

Показано, что конформация холотранскетолазы, содержащая в качестве кофактора отличается от конформации холотранскетолазы, содержащей

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований позволили расширить наши представления о механизме функционирования ТК и возможном механизме ее регуляции.

Данные об индуцированной субстратом неэквивалентности активных центров ТК по связыванию кофермента в присутствии могут служить

основанием для формулирования темы отдельного исследования.

Результаты экспериментов, поставленных с атипичными субстратами ТК, могут быть основой для использования этих соединений в биотехнологии.

Полученные в работе результаты, заключения и выводы могут быть использованы при чтении лекций по энзимологии и биохимии, а также в лабораторной практике на кафедрах биохимии биологических факультетов и медицинских институтов.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, а также на международной конференции «Biocatalysis -2002: fundamentals & applications», (Москва 2002), III биохимическом съезде (С.-Петербург, 2002), конференции, посвященной памяти И.В.Березина (Москва, 2003), международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2004» (Москва, 2004). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы.

Объем работы составляет 140 страниц, включая 6 таблиц и 45 рисунков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Транскетолазу пекарских дрожжей выделяли по известному ранее методу [Tikhomirova, Kochetov, 1990], с некоторыми изменениями [Соловьева, 2002]. Препараты кристаллического фермента хранили в растворе сульфата аммония 50% насыщения, рН 7,6 при 4°С. Перед использованием его обессоливали на колонке с сефадексом G-50. Фермент был гомогенен, согласно данным SDS-электрофореза и имел удельную активность 18 Е/мг.

Определение концентрации белка. В растворах гомогенной ТК концентрацию белка определяли спектрофотометрически, используя

Определение активности ТК. 1) спектрофотометрически, по скорости окисления NADH (или восстановления NAD) с использованием вспомогательных ферментов, а в качестве субстратов - смеси К5Ф и рибозо-5-фосфата. 2) в системе с искусственным акцептором электронов

(феррицианидом). Эта реакция основана на окислении феррицианидом карбанионного интермедиата транскетолазной реакции, образующегося в результате расщепления субстрата-донора.

Кониентраиию ТДФ и его аналога определяли спектрофотометрически, используя коэффициент молярной экстинкции 7800 М"1 ' СМ'1 при 272,5 нм -для ТДФ, и 5900 М',-СМ"' при 297,6 нм - для Ш'-пиридил-ТДФ. Спектры поглощения снимали на спектрофотометре «Aminco DW-2000» (США), в кювете с длиной оптического пути 1 см, в 50 мМ глицил-глициновом буфере, рН 7,6, содержавшем 2,5 мМ или

Спектрофотометрическое титрование. Метод основан на том, что при связывании апоТК с коферментом в спектре поглощения появляется новая полоса в области 290-340 нм, которая отсутствовала у исходных компонентов. Ее интенсивность прямо пропорциональна доле реконструированного, каталитически активного холофермента. Взаимодействие апоТК с ТДФ и влияние на этот процесс субстратов исследовали в 50 мМ глицил-глициновом буфере, рН 7,6, содержавшем 2,5 мМ или

Расчет констант диссоциации ТДФ для двух активных центров ТК проводили по методу Диксона [Dixon, 1972]:

где

Кинетику связывания ТДФ с апоТК исследовали методом stopped-flow-спектрофотометрии на SX.18MV «Appled Photophysics» (Англия) по изменению оптической плотности при 320 нм. Смешивание проводилось 1:1 из двух шприцов, в одном - был 50 мМ глицил-глициновый буфер, рН 7,6, 2 мг/мл ТК и 2,5 мМ СаСЬ или 2,5 мМ MgClj, в другом - ТДФ (опыты без субстрата), или ТДФ в присутствии 2 мМ гидроксипирувата (опыты с субстратом-донором).

Кинетику диссоциации ТДФ из активных центров холоТК изучали методом разведения и последующей инкубации проб в течение различного промежутка времени. Оставшееся после диссоциации количество холоТК определяли по ее каталитической активности.

Спектры кругового дихроизма снимали на дихрографе Mark V, «Jobin Ivon» (Франция), в кювете с длиной оптического пути 0,1 см, в 10 мМ глицил-глициновом буфере, рН 7,6, содержавшем 2,5 мМ MgCl2 или СаС1г-Спектры триптофановой флуоресценции снимали на MPF-4 «Hitachi» (Япония), в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см, в 50 мМ глицил-глициновом буфере, рН 7,6 в присутствии 2,5 мМ или и

0,9 мМ ТДФ (^возбуждения 291 нм, 15 нм/мин) при 25°С.

Дифференциальная сканирующая калориметрия. Измерения проводили на сканирующем микрокалориметре DASM-4 «Биоприбор» (Пущино, Россия) в температурном диапазоне 20-100°С, при скорости сканирования 1 град/мин в 50 мМ глицил-глициновом буфере рН 7,6.

Кинетику термоденатурации апо- и холоТК исследовали, соответственно, при 49°С и при 57°С на спектрофотометре «Aminco DW-2000» (США), при 320 нм, в кювете с длиной оптического пути 1 см.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 1. Влияние субстратов на реконструкцию холоТК из апо- и кофермента. 1.1. В присутствии Са2+.

Спектрофотометрическое титрование ТК тиаминдифосфатом показало, что в присутствии Са2+ ГП (необратимо расщепляемый субстрат-донор) несколько повышает сродство кофермента к ТК (рис.1); значение константы диссоциации для второго активного центра снизилось с 0,76 мкМ до 0,21 мкМ. Константу диссоциации для первого активного центра (Kj1) в данной

постановке опыта нам определить не удалось, поскольку в первом активном центре происходило эквимолярное связывание с ним ТДФ.

холоТК, %

[ТДФ], мкМ

Рис. 1. Связывание апоТК с ТДФ в присутствии 2,5 мМ СаСЬ; 1 - без субстрата, 2 - в присутствии 2,5 мМ ГП.

1.2. В присутствии М,

Транскетолаза в присутствии имеет более низкое сродство к ТДФ

чем в присутствии Са2+. Можно было поэтому думать, что опыты, поставленные в присутствии могут оказаться более информативными,

чем в присутствии Са2+. Результаты таких опытов приведены на рис.2. Кривая 1 характеризует связывание ТДФ с ТК в отсутствие субстрата, а кривая 2 в присутствии ГП. Расчет соответствующих значений констант диссоциации показал, что в отсутствие субстрата они одинаковы для обоих активных центров: К^1 = К^2 = 5,2 МкМ (табл.1). В присутствии ГП константу диссоциации для первого активного центра определить не удалось,

поскольку, как и в случае с кальцием, происходило эквимолярное связывание ТДФ, что соответствует порядку величин, равному или ниже 10"8 М. Значение к/ понизилось в меньшей степени и составило 1,6 мкМ (табл.1). Таким образом, в присутствии необратимо расщепляемого субстрата-донора, при

использовании Мё2+ в качестве двухвалентного катиона, сродство двух активных центров апоТК к ТДФ увеличилось, причем в разной степени, что привело к выявлению неэквивалентности по связыванию кофермента, которая не наблюдалась в отсутствие субстрата.

Результаты аналогичных опытов, но поставленные с использованием обратимо расщепляемого субстрата-донора - ДОА, приведены на рис.3 и в табл. 1. Как следует из данных таблицы 1, ДОА, в отличие от ГП, оказывает влияние на сродство ТДФ только по отношению к первому активному центру ТК, не оказывая влияние на сродство ко второму. Как и в случае с ГП, это приводит к появлению неэквивалентности между активными центрами фермента по связыванию ТДФ.

2+

Таблица 1. Константы диссоциации ТДФ в присутствии .

Спектрофотометрическое титрование Активность

Ко' (мкМ) К/ (мкМ) Ко' (мкМ) к„: (мкМ)

Без субстрата 5,2 5,2 4,6 4,6

2,5 мМГП * 1,6 - -

10 мМ ДОА 0,16 5,2 - -

0,5 мМ К5Ф - - 0,22 4,4

10 мМ глицеральдегид 5,4 5,4 - -

0,7 мМ рибозо-5-фосфат - - 4,8 4,8

В качестве другого обратимо расщепляемого субстрата-донора мы использовали К5Ф. В данном случае количество реконструируемого холофермента регистрировали по величине транскетолазной активности после предварительной инкубации апофермента с различными концентрациями ТДФ.

Рис. 2. Связывание апоТК с ТДФ в присутствии 2,5 мМ М§СЯ2: субстрата, 2 - в присутствии 2,5 мМ ГП.

- без

Рис. 3. Связывание апоТК с ТДФ в присутствии 2,5 мМ - без

субстрата, 2 - в присутствии 10 мМ ДОА.

На рис. 4 представлены графики зависимости активности холоТК от концентрации ТДФ. Кривая 1 характеризует связывание кофермента с ТК в отсутствие субстрата, кривая 2 - в присутствии 0,5 мМ К5Ф. Значения Кв представлены в табл. 1. В отсутствие субстрата В

присутствии К5Ф, как и в случае с ДОА, сродство к ТДФ повысилось только в первом активном центре ТК и величина Ко' составила 0,22 мкМ. Сродство ТДФ ко второму активному центру не изменилось, что, как и в случае с ДОА и ГП, привело к появлению неэквивалентности активных центров ТК по связыванию ТДФ.

С использованием различных методов было исследовано влияние субстратов-акцепторов - глицеральдегида и рибозо-5-фосфата, на взаимодействие апоТК с ТДФ; и ни в одном из случаев не было выявлено влияние этих субстратов на сродство ТДФ к апоТК (табл.1). Субстраты-доноры отличаются от субстратов-акцепторов тем, что в результате их расщепления под действием ТК образуется интермедиат транскетолазной реакции - ДОЭТДФ (Рис.5). Согласно данным рентгеноструктурного анализа, ДОЭТДФ образует дополнительные, по сравнению с ТДФ, связи с аминокислотными остатками в активном центре фермента и имеет, поэтому, более высокое сродство к апобелку, чем кофермент. Отсюда следует предположение о том, что влияние субстрата-донора на взаимодействие апоТК с ТДФ обусловлено образованием интермедиата транскетолазной реакции -ДОЭТДФ.

Различное влияние обратимо и необратимо расщепляемых субстратов-доноров можно объяснить тем, что в присутствии ГП (необратимо расщепляемого субстрата-донора) образование интермедиата происходит в двух активных центрах ТК, что сопровождается повышением к ним сродства ТДФ. Это представление соответствует результатам РСА, где показано, что при добавлении ГП к кристаллу холоТК наблюдалось образование интермедиата и в том, и в другом активном центре фермента.

Рис. 4. Связывание апоТК с ТДФ в присутствии 2,5 мМ MgG2: - без субстрата, 2 - в присутствии 0,5 мМ К5Ф.

Рис. 5. Схематическое изображение ДОЭТДФ в активном центре ТК [Fiedler, et.al.,2002].

В то же время, в результате превращения обратимо расщепляемых субстратов интермедиат образуется только в одном из активных центров, что находится в соответствии с полученными ранее результатами по химической модификации холоТК. Было показано, что в отсутствие субстратов наблюдалась полная инактивация фермента в ходе химической модификации тирозиновых остатков. В присутствии же фруктозо-6-фосфата, обратимо расщепляемого субстрата-донора, степень инактивации снижалась, но только на 50%.

Дальнейшее подтверждение тому, что в основе механизма влияния субстрата-донора на взаимодействие апоТК с ТДФ лежит образование ДОЭТДФ, было получено в опытах с использованием неактивного аналога ТДФ - №'-пиридил-ТДФ. Этот аналог отличается от ТДФ тем, что у него атом азота в первом положении аминопиримидинового кольца замещен на углерод. Поэтому у него отсутствует коферментная активность и он не способен образовывать интермедиат транскетолазной реакции. Согласно данным РСА, конформации аналога и ТДФ в активном центре фермента идентичны; отсутствует лишь водородная связь между С1и418 и М'-атомом аминопиримидинового кольца, наличие которой необходимо для катализа. Данные аналог оказался удобен еще и тем, что в спектре поглощения его комплекса с ТК обнаруживается новая полоса с максимумом при 345 нм (рис.6). Это позволило исследовать влияние субстрата-донора на образование неактивного комплекса ТК-аналог методом спектрофотометрического титрования. Результаты такого рода экспериментов приведены на рис.7. Они свидетельствуют о том, что субстрат-донор не оказывает никакого влияния на взаимодействие с ТК неактивного аналога - №'-пиридил-ТДФ.

Резюмируя полученные экспериментальные данные, мы пришли к заключению, что субстрат-донор ТК не только выполняет свою основную функцию, функцию субстрата, но и повышает сродство ТДФ к ферменту.

а А

ЫЗ'-пиридил-ТДФ

Рис. 6. Разностный спектр поглощения комплекса №'-пиридил-ТДФ с ТК в 50 мМ глицил-глициновом буфере, рН 7,6: 2,5 мМ М§СЬ; 65 мкМ Ш'-пиридил-ТДФ;3,8мкМТК.

комплекс ТК с ЫЗ'-пиридил-ТДФ, %

•5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 [Ы'З-пиридил-ТДФ], мкМ

Рис. 7. Связывание апоТК с Ю'-пиридил-ТДФ в присутствии 2,5 мМ 1

- без субстрата, 2 - в присутствии 2,5 мМ ГП.

Последнее обусловлено образованием, в результате расщепления субстрата-донора, интермедиата транскетолазной реакции, ДОЭТДФ, имеющего более высокое сродство к ферменту, чем ТДФ. При наличии в среде ионов магния, субстрат индуцирует неэквивалентность активных центров по связыванию кофермента, отсутствовавшую в опытах без субстрата. Повышение, в присутствии субстрата-донора, сродства ТДФ к ТК может быть одним из механизмов регуляции фермента при низкой концентрации ТДФ в среде.

1.3. Влияние субстрата-донора на постадийное взаимодействие апотранскетолазы с ТДФ.

Для ТК показан двустадийный механизм взаимодействия апобелка с коферментом, который в общем виде описывается схемой 1.

ТК + ТДФ ТК-ТДФ ТК*-ТДФ

Схема 1.

На первой стадии происходит быстрое и легкообратимое связывание кофермента с апоТК за счет его дифосфатного остатка: образуется неактивный промежуточный комплекс ТК'ТДФ. На второй стадии осуществляется присоединение кофермента и по другим точкам с образованием достаточно стабильного, каталитически активного холофермента (ТК*-ТДФ). Вторая стадия - медленная, связанная с конформационными изменениями молекулы белка.

Для решения вопроса о том, на какую из стадий связывания апоТК с ТДФ влияет субстрат-донор, была исследована кинетика ассоциации ТДФ с активными центрами фермента и кинетика диссоциации кофермента из активных центров. На рис. 8 представлены результаты опытов stopped-flow -спектрофотометрии по изучению связывания апоТК с коферментом в присутствии

Рис. 8. Кинетика реконструкции холотранскетолазы в присутствии 2,5 мМ с использованием

различных концентраций ТДФ: 25 мМ глицил-глициновый буфер, рН7,6;2,5мМ СаС12; 6,75мкМТК.

Рис. 9. Зависимость начальной скорости ассоциации ТДФ с активными центрами ТК в присутствии 2,5 мМ от

концентрации кофермента в среде.

Рис. 10. Кинетика реконструкции холотранскетолазы в присутствии 2,5 мМ с использованием

различных концентраций ТДФ: 25 мМ глицил-глициновый буфер, рН 7,6; 2,5 мМ 6,75 мкМ ТК.

500 1000 1500 2000 2500 3000 [ТДФ], мкМ

Рис. 11. Зависимость начальной скорости ассоциации ТДФ с активными центрами ТК в присутствии 2,5 мМ от

концентрации кофермента в среде.

Из полученных данных мы определили начальные скорости реакции и построили график зависимости начальной скорости ассоциации ТДФ с апоТК от концентрации кофермента в среде (рис.9). Обсчет результатов согласно уравнению, учитывающему двустадийное связывание ТДФ с обоими активными центрами фермента:

позволил определить значения константы диссоциации (К/р на схеме 1) для каждого из двух активных центров. Они оказались одинаковыми и равнялись 320 мкМ. Также нам удалось определить и максимальную скорость последующей стадии, связанной с конформационным переходом фермента в каталитически активный комплекс ТК*-ТДФ. Зная коэффициент молярной экстинции комплекса ТК*-ТДФ при данной длине волны (X = 320 нм), определили константу скорости прямого конформационного перехода на схеме 1); полученные значения для двух активных центров были, по существу, идентичны - соответственно,

Присутствие субстрата-донора, ГП, не оказывало влияние на начальную скорость ассоциации ТДФ с апоТК, а, следовательно, не повлияло ни на ни на

Результаты экспериментов, аналогичных только что рассмотренным, но поставленных в присутствии приведены на рис. 10 и 11. Как и в случае с значения константы диссоциации промежуточного комплекса ТК ТДФ (К/р на схеме 1) и константы скорости прямого конформационного перехода (к+1 на схеме 1) для двух активных центров не различались между собой, и были равны, соответственно,

Интересно отметить тот факт, что замена одного катиона на другой не влияет на константу скорости прямого конформационного перехода в каталитически активный холофермент, а влияет лишь на стадию образования

легкодиссоциирующего комплекса ТК'ТДФ (на схеме 1): в присутствии равна 800 мкМ, в то время как в присутствии Са2+ - 320 мкМ. Что касается влияния ГП на исследованные стадии взаимодействия ТДФ с апоТК, то в данном случае, как и в экспериментах с использованием в качестве кофактора, оно отсутствовало.

На рис. 12А и 12Б представлены результаты опытов по исследованию влияния субстратов-доноров на кинетику диссоциации ТДФ из активных центров фермента, проведенных, соответственно, в присутствии или Обращает на себя внимание однотипный характер кривых на этих рисунках. Различия в степени диссоциации наблюдаются лишь в отсутствие субстратов: она существенно выше в случае холоТК реконструированной в присутствии М£2+ (кривая 1 на рис.12Б), по сравнению с холоТК, реконструированной с присутствии Са2+ (кривая 1 на рис.12А).

2, мин Ь мин

Рис. 12. Кинетика диссоциации ТДФ из холоТК, реконструированной в присутствии 2,5 мМ Са2+ (А) или 2,5 мМ М£2+ (Б), в отсутствие субстрата (1), в присутствии 2,5 мМ ГП (2), или 10 мМ ДОА (5); 50 мМ глицил-глициновом буфере рН 7,6; 1 мг/мл БСА; 1мкг/мл ТК.

Субстраты-доноры в обоих случаях снижают скорость диссоциации ТДФ; в большей степени в присутствии необратимо расщепляемого субстрата (ГП, кривые 2 на рис. 12), по сравнению с обратимо расщепляемым (ДОА, кривые 3 на рис. 12). При этом, скорость диссоциации в их присутствии (кривые 2 и 3), не зависит от исходного ее значения, обусловленного спецификой используемого катиона (кривые 1).

Таким образом, субстраты-доноры влияют только на одну стадию процесса взаимодействия ТДФ с ТК (схема 1), на стадию обратного конформационного перехода каталитически активного комплекса ТК*-ТДФ в неактивный комплекс ТК ТДФ (схема 1). Причем, таким образом, что в их присутствии скорость диссоциации ТДФ из холоТК не зависит от типа двухвалентного катиона, входящего в состав холофермента.

2. Атипичные субстраты-доноры ТК.

Атипичными субстратами-донорами ТК мы, в данном случае, называем производные пирувата у которого протон(ы) при третьем атоме углерода заменен(ы) на галоген(ы):

Пируват не способен подвергаться каталитическому превращению под действием ТК. ГП, у которого при третьем углеродном атоме находится гидроксильная группа, является эффективным субстратом ТК и, как нами теперь показано, оказывает существенное влияние на взаимодействие кофермента с апобелком. Могут ли галогенированные производные пирувата выполнять аналогичную функцию, известно не было. Такие исследования представляют интерес, кроме всего прочего, с точки зрения возможности использования указанных веществ в биотехнологическом синтезе. В таблице 2 приведены результаты наших исследований, выполненных с атипичными субстратами ТК, в сопоставлении с данными, полученными с ГП.

Наиболее активным среди моногалогензамещенных субстратов ТК оказался бромпируват: его активность в феррицианидном тесте составила 130 %, от активности, измеряемой с ГП. С хлорпируватом активность несколько ниже, чем с ГП. Фторпируват был наихудшим из исследованных моногалогензамещенных субстратов: активность ТК с ним составила 30 % от активности с ГП. Таким образом, эффективность моногалогенированных производных пирувата в качестве субстратов ТК убывает в порядке: Вг-пируват • ОН-пируват> С1-пируват > Р-пируват.

Что касается их сродства к ТК, то оно ниже, чем у ГП, и если замена ОН-группы ГП на бром не сильно сказалась на сродстве (табл. 2), то при замене на хлор, Кш возросла в 10 раз, а при замене на фтор - в 50 раз. Таким образом, сродство исследованных субстратов к ТК убывает в следующем порядке: ОН-пируват > Вг-пируват > С1-пируват > Р-пируват.

С дигалогенированными субстратами активность ТК или была такая же, как с ГП (дихлорпируват), или, если и снижалась, то незначительно (дибромпируват); снижалось, причем достаточно существенно, их сродство к ферменту (табл.2).

Таблица 2. Сравнительные характеристики галогенированных производных пирувата.

Субстрат Активность, % Кщ (80,5)5 мМ Ка1 (ТДФ), мкМ К/(ТДФ), мкМ

Без субстрата - - 5,2 5,2

Гидроксипируват 100 0,05 <0,01 1,6

Бромпируват 130 0,13 0,6 0,6

Дибромпируват 90 2,0 - -

Хлорпируват 80 0,4 1,5 1,5

Дихлорпируват 100 1,1 4,4 4,4

Фторпируват 30 2,5 - -

Чтобы оценить возможное влияние атипичных субстратов-доноров на связывание апоТК с ТДФ, мы воспользовались методом спектрофотометрического титрования. Показали, что хлорпируват повышал сродство ТДФ к апоТК, однако эффект был незначительным и проявлялся в равной степени по отношению к обоим активным центрам. Дихлорпируват никак не повлиял на сродство апоТК к ТДФ. Только в присутствии бромпирувата наблюдалось значительное повышение сродства апоТК к ТДФ, в то же время неэквивалентности между активными центрами фермента, которая всегда выявлялась в присутствии типичных субстратов-доноров ТК, обнаружено не было.

На примере галогенпроизводных пирувата, удалось выяснить одну из функций р-гидроксильной группы ДОЭТДФ. По-видимому, эта группа играет важную роль для проявления неэквивалентности между активными центрами по отношению к коферменту в присутствии типичных субстратов-доноров (ГП, ДОА, К-5-Ф). Замена этой группы на галоген, показала, что хотя и остается возможным увеличение сродства апоТК к коферменту, однако неэквивалентность в присутствии атипичного субстрата-донора не выявляется.

3. Влияние кофакторов ТК на ее конформацию и стабильность.

Свойства ТК во многом зависят от того, какой двухвалентный катион используется в качестве кофактора. Это давало основание полагать, что конформации холоТК, реконструированной из апоТК и ТДФ в присутствии или не идентичны. Для проверки такого предположения мы

использовали ряд методов, первым из которых, был метод КД в дальнем УФ. На рис. 13 приведены спектры КД апоТК в присутствии Са2Ь, спектр 1, и Mg2+, спектр 2. Видно, что тип катиона определяет положение максимума полосы поглощения в спектре КД: в присутствии он находится при 222 нм, в

ствии Са2+ - сдвинут в коротковолновую область. Так как спектры КД в аА'103

Рис. 13 Спектры КД апоТК в присутствии 2,5 мМ СаСЬ (/) и 2,5 мМ Г^СЬ (2).

При добавлении ТДФ к апоТК не наблюдалось каких-либо серьезных изменений в спектре КД; как в присутствии Са2+, так и в присутствии Можно думать, что ионы двухвалентных металлов, влияя, в частности, на вторичную структуру апоТК, «подготавливают» активный центр фермента к последующему встраиванию в него ТДФ.

Исследование методом ДСК не выявило различий в стабильности апоТК

в присутствии Са2+, или М§2+ (кривые 1 и 2 на рис.14), в то время, как

последующее добавление ТДФ в обоих случаях оказало существенное влияние

на профиль термограммы фермента. Причем, в присутствии М§2+ профиль

термограммы сдвинулся в более теплую область менее чем на 4°С (ср. кривые

„2+

1 и 3 на рис.14), а в присутствии Са - более, чем на 6°С (ср. кривые 2 и 4 на рис.14).

62 64 66 68

Т. "С

Рис. 14. Термограмма ТК в 50 мМ глицил-глициновом буфере, рН 7,6.

Таким образом, как в присутствии так и в присутствии

кофермент повышает стабильность апоТК, хотя и в разной степени: холоТК, реконструированная в присутствии обладает большей стабильностью,

чем реконструированная в присутствии

Такое заключение получило подтверждение в опытах с использованием метода триптофановой флуоресценции в присутствии увеличивающихся концентраций мочевины. Были исследованы структурные изменения белковой молекулы, наступающие в результате разворачивания пептидной цепи под действием мочевины, что сопровождается изменением степени доступности хромофорных групп триптофана растворителю. В результате наблюдается

батохромный сдвиг эмиссии, что служит качественным указанием на

конформационные изменения молекулы белка. Разворачивание молекулы „2+

холоТК в присутствии Са наблюдалось при концентрации мочевины более

,2+

7,0 М, а в присутствии - более 5,0 М; это указывало на большую

2+

стабильность холоТК, реконструированной в присутствии Са, чем в

присутствии

.2+

Рис. 15. Кинетика термоденатурации апоТК (А) при t = 49°С и холоТК (Б) при г = 57°С в присутствии 2,5 мМ СаС12 (7) или 2,5 мМ MgCl2 (2).

Другим методом, который позволил оценить влияние типа катиона на стабильность ТК, был метод тепловой денатурации при постоянной температуре. На рис. 15А приведены кривые денатурации апоТК при г = 49°С в присутствии Са2+ (кривая 1) и М§2+ (кривая 2). Аналогичная картина

наблюдалась и при тепловой денатурации холоТК при г

57°С,

предварительно реконструированной в присутствии или

(соответственно, кривые 2 и 1 на рис. 15Б). Видно, что в присутствии Са фермент более стабилен, чем в присутствии Причем, в случае

холофермента, различие в стабильности было выражено в большей степени, чем в экспериментах с апоТК (ср. рис. 15 А и Б).

23

ВЫВОДЫ

1. Субстрат-донор повышает сродство тиаминдифосфата к апотранскетолазе. Причиной этого является образование, в результате расщепления субстрата-донора, интермедиата транскетолазной реакции дигидроксиэтилтиаминдифосфата.

2. При наличии в среде магния, исходно эквивалентные, по связыванию кофермента, активные центры транскетолазы, в присутствии субстрата-донора становятся неэквивалентными.

3. В результате каталитического превращения необратимо расщепляемого субстрата-донора интермедиат транскетолазной реакции образуется в двух активных центрах фермента, а в результате превращения обратимо расщепляемого - только в одном.

4. Субстрат-донор стабилизирует холотранскетолазу, вне зависимости от того, какой катион или был использован при ее реконструкции.

5. Конформация холотранскетолазы, реконструированной в присутствии или Mg2+, различна. Конформационная стабильность фермента в присутствии Са2+ выше, чем в присутствии Mg2+-

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях

1. Olga Esakova, Ludmilla Meshalkina, Ralph Golbik, Gerhard Hubner, German Kochetov (2004) "Donor substrate regulation of transketolase" Eur. J. Biochem. 271,4189-4194.

2. O.A. Есакова, Е.А. Ханова, Л.Е. Мешалкина, Р. Голбик, Г. Хюбнер, Г.А. Кочетов (2004) "Влияние субстратов транскетолазы на реконструкцию холофермента и его стабильность" Биохимия (принята к публикации).

3. Olga A. Esakova, Ludmilla E. Meshalkina, German A. Kochetov (2004) "Effects of transketolase cofactors on Its conformation and stability" Life Sciences {acceptedfor publication).

4. Esakova O.A., Meshalkina L.E., Solovjeva O.N., Kochetov G.A. (2002) "Mechanism of substrate regulation of holotransketolase reconstruction".

International conference Biocatalysis-2002: fundamentals & applications, Moscow, p. 82.

5. Есакова О.А., Мешалкина Л.Е., Соловьева О.Н., Кочетов Г.А. (2002) "Механизм регуляции транскетолазы субстратом". III съезд биохимического общества РАН, С.-Петербург, стр. 580.

6. Есакова О.А., Ханова Е.А., Мешалкина Л.Е., Кочетов Г.А (2003) "Роль субстратов транскетолазы в формировании и стабилизации холофермента" Международная конференция "Инженерная этимология " посвященная 80-летию со дня рождения чл.-кор. АН СССР профессора И.В.Березина, стр. 75.

7 . Есакова О.А., Ханова Е.А., Останов Р.В., Мешалкина Л.Е., Кочетов Г.А (2004) "Неэквивалентность активных центров транскетолазы" 11-ая Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов -2004 ", стр. 49.

Подписано в печать 25.04.2005 Объем 1.75 печ.л. Тираж 75 экз. Заказ № 74 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992, г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

f

г.

о 7 Ш ■ í

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Есакова, Ольга Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 Структура транскетолазы.

1.1 Сравнение структур апо-и холотранскетолазы.

1.2 Структура активного центра транскетолазы.

1.2.1 Связывание двухвалентных катионов.

1.2.2 Структура кофермент-связывающего участка активного центра транскетолазы.

1.2.3 Протонный канал.

1.2.4 Субстратный канал.

1.2.5 Интермедиат транскетолазной реакции.

2 Механизм транскетолазной реакции.

3 Взаимодействие кофермента с апотранскетолазой.

4 Участие двухвалентных катионов в связывании тиаминдифосфата апотранскетолазой

5 Функциональная неэквивалентность активных центров транскетолазы.

5.1 Неэквивалентность по связыванию кофермента.

5.2 Неидентичность активных центров при химической модификации аминокислотных остатков.

6 Оптические свойства транскетолазы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1 Материалы.

2 Методы.

2.1 Выделение транскетолазы.

2.2 Определение концентрации транскетолазы.

2.3 Определение концентрации тиаминдифосфата и его аналогов

2.4 Определение активности транскетолазы.

2.4.1 С использованием глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы

V в качестве вспомогательного фермента.

2.4.2 По скорости окисления а-карбанионного интермедиата в присутствии феррицианида.

2.5 Определение концентрации ксилулозо-5-фосфата.

2.6 Определение концентрации рибозо-5-фосфата.

2.7 Определение IQ для тиаминдифосфата.

2.8 Исследование кинетики диссоциации тиаминдифосфата из активных центров холотранскетолазы.

2.9 Разностные спектры поглощения транскетолазы.

2.10 Спектрофотометрическое титрование. г , 2.11 Расчет Kd для тиаминдифосфата по результатам к спектрофотометрического титрования.

2.12 Stopped flow кинетика связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазой.

2.13 Спектры кругового дихроизма.

2.14 Триптофановая флуоресценция.

2.15 Дифференциальная сканирующая калориметрия.

2.16 Кинетика термоденатурации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1 Влияние субстратов на реконструкцию холотранскетолазы из апо- и кофермента.

1.1 Разностные спектры поглощения холотранскетолазы.

1.2 Влияние субстрата-донора на реконструкцию холотранскетолазы в присутствии Са2+.

1.3 Влияние субстрата-донора на реконструкцию холотранскетолазы в присутствии Mg2+.

1.3.1 Влияние необратимо расщепляемого субстрата-донора на реконструкцию холотранскетолазы в присутствии Mg2+.

1.3.2 Влияние обратимо расщепляемых субстратов-доноров на реконструкцию холотранскетолазы в присутствии Mg

1.4 Реконструкция холотранскетолазы в присутствии Mg2+ и субстрата-акцептора.

1.5 Взаимодействие апотранскетолазы с неактивным аналогом тиаминдифосфата-Ш'-пиридил-тиаминдифосфатом.

1.6 Исследование влияния субстрата-донора на постадийное взаимодействие апотранскетолазы с тиаминдифосфатом.

1.6.1 Влияние субстрата-донора на процесс ассоциации тиаминдифосфата с активными центрами транскетолазы в присутствии Са2+.

1.6.2 Влияние субстрата-донора на процесс ассоциации

Ч тиаминдифосфата с активными центрами транскетолазы в присутствии Mg2+.

1.6.3 Влияние субстратов-доноров на кинетику диссоциации тиаминдифосфата из активных центров холотранскетолазы.

2 Атипичные субстраты-доноры транскетолазы.

3 Влияние кофакторов транскетолазы на ее конформацию и стабильность.

3.1 Влияние двухвалентных катионов на спектры кругового дихроизма транскетолазы в дальнем ультрафиолете.

3.2 Влияние кофакторов транскетолазы на ее стабильность.

3.3 Исследование стабильности холоТК, в зависимости от типа катиона в ее составе (Са или Mg ), методом триптофановой флуоресценции в присутствии мочевины.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменение свойств транскетолазы в результате ее взаимодействия с кофакторами и субстратами"

Транскетолаза (седогептулозо-7-фосфат: D-глицеральдегид-З-фосфат гликольальдегидтрансфераза, КФ 2.2.1.1), это тиаминдифосфат-зависимый фермент, который на протяжении последних лет является объектом интенсивного изучения. ТК катализирует одну из ключевых реакций пентозофосфатного пути превращения углеводов: реакцию расщепления кетосахаров (субстратов-доноров) по С-С связи, соседней с кетогруппой, и последующий перенос двууглеродного фрагмента на альдозу (субстрат-акцептор).

СН2ОН СН2ОН

I I с=о оо

I тк I носн + нсо 4 „ нсо + носн

II II неон неон неон неон

II II

R R' R R'

Функцию субстрата-донора выполняют кетозы, у которых гидроксильные группы при СЗ и С4 атомах находятся в трансположении: ксилулозо-5-фосфат, фруктозо-6-фосфат, седогептулозо-7-фосфат, эритрулоза и др. Трехуглеродные субстраты-доноры -гидрокси пиру ват и дигидроксиацетон, не имеющие асимметрических атомов углерода, представляют собою исключение. Субстратами-акцепторами транскетолазы являются - рибозо-5-фосфат, эритрозо-4-фосфат, фосфоглицериновый альдегид, гликольальдегид и др. Фермент мало специфичен по отношению к длине углеродной цепочки, однако наличие фосфатной группы в молекуле субстрата существенно повышает его сродство к ферменту [1]. Транскетолазная реакция обратима, за исключением случая, когда в качестве субстрата-донора выступает гидрокси пиру ват, который подвергается декарбоксилированию и процесс становится необратимым.

Кофакторами ТК являются ионы двухвалентных металлов и ТДФ. На сегодняшний день наиболее полно исследованы свойства транскетолазы пекарских дрожжей. Фермент состоит из двух идентичных субъединиц и имеет два активных центра, расположенных на границе между контактирующими поверхностями мономеров. Молекулярная масса фермента составляет 148,4 кДа [2-5]. Активные центры характеризуются одинаковой ферментативной активностью [68].

Определен аминокислотный состав и пространственная структура ТК [9-11]. Методами химической модификации [12-18], рентгеноструктурного анализа [2, 19-23] и направленного мутагенеза [24-28] идентифицированы аминокислотные остатки, необходимые для связывания ТДФ, субстратов и собственно катализа. Имеется довольно подробная информация об оптических свойствах фермента и их изменениях при связывании с транскетолазой различных лигандов [1, 29-40]. Показано различное влияние ионов двухвалентных металлов на взаимодействие апотранскетолазы с тиаминдифосфатом. В присутствии ионов кальция фермент характеризуется отрицательной кооперативностью и высоким сродством к тиаминдифосфату [41-46]. В присутствии ионов магния неэквивалентность активных центров отсутствует, или слабо выражена; при этом понижается и общее сродство фермента к ТДФ [41, 42, 45, 46].

При добавлении к холоТК субстрата-донора (рис. 1А) 1 происходит образование промежуточного, достаточно стабильного, в отсутствие субстрата-акцептора, продукта транскетолазной реакции -а-карбаниона ДОЭТДФ (рис 1Б). К настоящему времени сделан рентгеноструктурный анализ комплекса ТК с ДОЭТДФ [47]. Согласно этим данным, ДОЭТДФ образует дополнительные, по сравнению с ТДФ, связи с аминокислотными остатками в активном центре фермента и имеет, поэтому, более высокое сродство к апобелку, чем кофермент [42,48,49].

ТК была первым ТДФ-зависимым ферментом, для которого в 1992 г. был сделан РСА. Естественно поэтому, что все последующие годы основное внимание было обращено на изучение структуры данного фермента: аминокислотных остатков, участвующих в связывании кофакторов и субстратов, функциональных групп, целостность которых необходима для катализа, структуры активного центра, и совсем мало внимания уделялось вопросам функционирования ТК (в широком смысле этого слова), понимая под этим, в частности, изменение конформации (функциональная подвижность) молекулы фермента в результате его взаимодействия с кофакторами и субстратами. В связи с этим, нашей задачей было исследование влияния кофакторов (ТДФ и двухвалентных катионов) на конформацию и стабильность ТК, а также влияния субстратов и природы двухвалентных катионов на взаимодействие кофермента с апоТК и образование каталитически активного холофермента.

СН2ОН

СН2ОН сн2он с=о з! сн2он с=о с=о но-с но-с-н

II

Дигидроксиацетон О н-с-он

Гидроксипируват

Ксилулозо-5-фосфат

О О II II

H3C>^Nx4NH2 сн2—О—Р—О—Р — ОН

GC-OH он он I

СН2ОН

Рис. 1. А - структура некоторых субстратов-доноров транскетолазы;

Б - структура а-карбаниона дигдироксиэтил-тиаминдифосфата

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Транскстолаза была открыта в 1953 г. Обнаружена она практически во всех исследованных тканях животного и растительного происхождения, а также у микроорганизмов. Фермент локализуется, преимущественно, в растворимой фракции клетки. В качестве кофакторов выступают ионы двухвалентных металлов (Са2+, Mg2+ и др.) и ТДФ.

Транскетолаза - первый тиаминдифосфат-зависимый фермент, для которого был сделан рентгеноструктурный анализ [2, 20, 23]. Помимо апо- и холофермента, к настоящему времени с помощью рентгеноструктурного анализа проанализированы комплексы ТК с различными аналогами ТДФ [21, 22], с диоксиэтилтиаминдифосфатом - интермедиатом транскетолазной реакции [47] и комплекс холоТК с субстратом-акцептором (эритрозо-4-фосфат) [28]. Данные рентгеноструктурного анализа охарактеризовали структуру активного центра фермента, а также дали толчок к более глубокому изучению механизма тиаминового катализа. В настоящее время сделан рентгеноструктурный анализ и других тиаминдифосфат-зависимых ферментов, таких как дрожжевая ПДК [50, 51], ПДК Zimomonas mobilis [52], пируватоксидаза [53, 54], бензоилформиат декарбоксилаза [55], человеческая дегидрогеназа а-кетокислот [56]. Общая структура этих тиаминдифосфат-зависимых ферментов достаточно сильно различается, однако область связывания двухвалентных катионов и ТДФ имеет значителыюе сходство.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Есакова, Ольга Александровна

выводы

1. Субстрат-донор повышает сродство тиаминдифосфата к апотранскетолазе. Причиной этого является образование, в результате расщепления субстрата, интермедиата транскетолазной реакции - дигидроксиэтилтиаминдифосфата, имеющего более высокое сродство к ферменту, чем сам кофермент.

2. При наличии в среде ионов магния, исходно эквивалентные, по связыванию кофермента, активные центры транскетолазы, в присутствии субстрата-донора становятся неэквивалентными.

3. В результате каталитического превращения необратимо расщепляемого субстрата-донора, интермедиат транскетолазной реакции образуется в двух активных центрах фермента, а в результате превращения обратимо расщепляемого - только в одном из них.

4. Субстрат-донор стабилизируют холотранскетолазу, вне зависимости от того, какой катион (С а или Mg ) был использован при ее реконструкции.

5. Конформация транскетолазы, в присутствии Са , отличается от конформации фермента в присутствии Mg2+. Конформационная стабильность транскетолазы в присутствии Са2+ выше, чем в присутствии Mg2+.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, субстрат-донор повышает сродство апотранскетолазы к тиаминдифосфату, как в присутствии ионов кальция, так и в присутствии ионов магния. Во втором случае, в отсутствие субстрата, сродство обоих активных центров к коферменту одинаково. Необратимо расщепляемый субстрат-донор — гидроксипируват, в присутствии ионов магния, повышает сродство тиаминдифосфата к транскетолазе, в разной степени по отношению к первому и второму активным центрам. Отсюда следует, что исходно эквивалентные по связыванию тиаминдифосфата активные центры транскетолазы становятся неэквивалентными при реконструкции холофермента, осуществляемого в присутствии субстрата-донора. Обратимо расщепляемые субстраты-доноры повышают сродство тиаминдифосфата к апотранскетолазе только в одном из активных центров, что также приводит в результате к появлению неэквивалентности активных центров по связыванию кофермента.

Повышение сродства тиаминдифосфата к транскетолазе в присутствии субстратов-доноров и появление кооперативности активных центров при наличие в среде ионов магния, может быть одним из возможных механизмов регуляции фермента субстратом.

На основании того, что субстраты-доноры повышают сродство тиаминдифосфата к апотранскетолазе, а субстраты-акцепторы такой способностью не обладают, было сделано предположение, что в основе механизма влияния субстрата-донора на сродство активных центров фермента к тиаминдифосфату лежит образование, в результате первого акта катализа, интермедиата транскетолазной реакции — дигидроксиэтилтиаминдифосфата. Эта гипотеза нашла подтверждение в опытах с неактивным аналогом кофермента — Ш'-пиридил-тиаминдифосфатом, комплекс которого с ферментом каталитической активностью не обладает и интермедиат транскетолазной реакции по этой причине образовываться не может. Действительно, было показано что гидроксипируват (субстрат-до нор) не влияет на сродство неактивного аналога к ферменту.

Принимая во внимание двустадийный механизм взаимодействия тиаминдифосфата с апотранскетолазой, мы детально исследовали влияние субстрата-донора на каждую из его стадий. Образование неактивного и легкодиссоциирующего комплекса фермента с тиаминдифосфатом (ТК'ТДФ на схеме 1) не зависит от присутствия субстратов, также, как и последующая стадия медленного конформационного перехода в каталитически активный холофермент (ТК*-ТДФ на схеме 1). Субстрат-донор, как в присутствии ионов кальция, так и в присутствии ионов магния, влияет на процесс, связанный с обратным конформационным переходом из каталитически активной формы транскетолазы в неактивный комплекс фермента с тиаминдифосфатом. Показано, что в присутствии субстрата-донора скорость диссоциации кофермента из активных центров холотранскетолазы значительно снижена, по сравнению с опытами в которых субстрат добавлен не был. Кинетика диссоциации тиаминдифосфата в присутствии субстрата-донора не зависит от типа катиона в составе холотранскетолазы.

Помимо обычных кетоз в качестве субстрата-донора транскетолазной реакции могут выступать галогенированные по третьему атому углерода производные пирувата. Свойства этих субстратов сильно зависят от того, какой галоген введен в молекулу пирувата. Галогенированные субстраты не индуцируют неэквивалентность активных центров транскетолазы по связыванию тиаминдифосфата в присутствии ионов магния, однако в случае бромпирувата наблюдается увеличение сродства тиаминдифосфата к ферменту.

Различные свойства холотранскетолазы, реконструированной в присутствии ионов магния или кальция, объясняются различной конформацией реконструированного холофермента. Показано, что при встраивании катиона в молекулу апотранскетолазы происходит изменение ее вторичной структуры. Последующее добавление кофермента не сказывается серьезным образом на вторичной структуре фермента, однако существенного его стабилизирует.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Есакова, Ольга Александровна, Москва

1. Schneider G., Lindqvist Y. (1998) Crystallography and mutagenesis of transketolase: mechanistic implications for enzymatic thiamin catalysis. Biochim. Biophys. Acta 1385, 387-398.

2. Sundstrom M., Lindqvist Y., Schneider G., Hellman U., Ronne H., (1993) Yeast TKL1 gene encodes a transketolase that is required for efficient glycolysis and biosynthesis of aromatic amino acids. J. Biol Chem. 268, 24346-24352.

3. Schenk, G., Duggleby, R., Nixon, P. (1998) Properties and functions of the thiamine diphosphate dependent enzyme transketolase. Inter. J. Biochem.& Cell Biol. 30, 1297-1318.

4. Cavalieri, S., Neet, K.E., Sable, H.Z. (1975) Enzymes of pentose biosynthesis. The quaternary structure and reacting form baker's yeast. Arch. Biochem. Biophys. 171, 527-532.

5. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Meshalkina, L.E. (1976) The number of active sites in a molecule of transketolase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 839-843.

6. Meshalkina, L.E., Kochetov, G.A. (1979) The functional identity of the active centers of transketolase. Biochim. Biophys. Acta. 571, 218-223.

7. Кочетов Г.А., Кобылянская K.P., Белянова JI.П. (1973) Аминокислотный состав транскетолазы пекарских дрожжей. Биохимия 38, 1303-1306.

8. Fletcher, Т., Kwee, I., Nakada, Т., Largman, С., Martin В. (1992) DNA sequence of the yeast transketolase gene. Biochemistry 31, 1892-1896.

9. Кочетов Г.А., Усманов P.A. (1970) Изучение транскетолазы методом дисперсии оптического вращения. Биохимия 35, 611621.

10. Кочетов Г.А. (1986) Транскетолаза: структура и механизм действия. Биохимия 51, 2010-2029.

11. Кочетов Г.А., Кобылянская К.Р. (1970) Природа и функция аминокислотных остатков транскетолазы, существенных для проявления ее активности. Биохимия 35, 3-11.

12. Мешалкина JI.E., Кочетов Г.А. (1979) Роль остатков гистидина транскетолазы пекарских дрожжей. ДЛЯ СССР 246, 228-231.

13. Мешалкина Л.Е., Кочетов Г.А. (1979) Функциональные остатки аргинина в ТК пекарских дрожжей. ДАН СССР 245, 1259-1261.

14. Riordan J.F. (1973) Functional arginyl residues in carboxypeptidase A. Modification with butanedione. Biochemistry 12, 3915-3923.

15. Borders C.L., Riordan J.F. (1975) An essential arginyl residue at the nucleotide binding site of creatine kinase. Biochemistry 14, 46994704.

16. Borders C.L., Wilson B.A. (1976) Phosphoglycerate mutase has essential arginyl residues. Biochem. Biophys. Res. Commun. 73, 978-984.

17. Sundstrom, M., Lindqvist, Y., Schneider, G. (1992) Three-dimensional structure of apotransketolase. Flexible loops at the active site enable cofactor binding. FEBS Lett. 313, 229-231.

18. Nilsson, U., Lindqvist, Y., Kluger, R., Schneider, G. (1993) Ciystal structure of transketolase in complex with thiamin thiazolone diphosphate, an analogue of the reaction intermediate, at 2,3 A resolution. FEBS Lett. 326, 145-148.

19. Nikkola, M., Lindqvist, Y., Schneider, G.( 1994) Refined structure of transketolase from Saccharomyces cerevisiae of 2.0 A resolution. J. Mol. Biol. 238, 387-404.

20. Wikner, Ch., Meshalkina, L., Nilsson, U.,Backstrom, S., Lindqvist Y., Schneider, G. (1995) His 103 in yeast transketolase is required for substrate recognition and catalysis. Eur. J. Biochem. 233, 750755.

21. Wikner Ch., Nilsson, U., Meshalkina, L., Udekwu, C., Lindqvist, Y., Schneider, G. (1997) Identification of catalytically important residues in yeast transketolase. Biochemistry 36, 15643-15649.

22. Meshalkina, L., Nilsson, U., Wikner, Ch., Kostikowa, Т., Schneider, G. (1997) Examination of the thiamin diphosphate binding site in yeast transketolase by site-directed mutagenesis. Eur. J. Biochem. 244, 646-652.

23. Nilsson, U., Meshalkina, L., Lindqvist, Y., Schneider, G. (1997) Examination of substrate binding in thiamine diphosphate-dependent transketolase by protein crystallography and site-directed mutagenesis./. Biol. Chem. 272, 1864-1869.

24. Пустынников М.Г., Нейф X., Усманов P.A., Шелленбергер А., Кочетов Г. А. (1986) Функциональные группы тиаминпирофосфата в холотранскетолазе. Биохимия 51, 10031016.

25. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Merzlov, V.P. (1970) Thiamin pyrophosphate induced change of the optical activity of baker's yeast transketolase. FEBS Lett. 9, 265-266.

26. Heinrich, C., Noack, K., Wiss, 0.(1971) A circular dichroism study of transketolase from baker's yeast. Biochem. Biophys. Res. Commun. 44, 275-279.

27. Heinrich, C., Schmidt, D. (1993) Determination of the binding constant of thiamine diphosphate in transketolase from baker's yeast by circular dichroism titration. Specialia 1227-12230.

28. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Mevkh, A.T. (1973) The role of the charge transfer complex in the transketolase catalized reaction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 54, 1619-1626.

29. Heinrich, C., Schmidt, D., Noack, K. (1974) Energetic and spectroscopic studies on the interaction between thiamine diphosphate and apotransketolase. Eur. J. Biochem. 41, 555-561.

30. Усманов P.А., Кочетов Г.A. (1978) Изучение различных конформационных состояний транскетолазы методом пертурбационной ультрафиолетовой спектрофотометрии. Биохимия 43, 1796-1804.

31. Heinrich, С.Р., Noack, К., Wiss, О. (1972) Chemical modification of thryptophan at the binding site of thiamine pyrophosphate intransketolase from baker's yeast. Biochem. Biophys. Res. Commun. 49, 1427-1432.

32. Мешалкина JI. E., Нейф X., Тягло M.B., Шелленбергер А., Кочетов Г. А. (1996) Ферментативное превращение гидроксиэтилтиаминпирофосфата под действием транскетолазы пекарских дрожжей. Биохимия 61, 716-719.

33. Ковина М.В., Быкова И.А., Мешалкина Л.Е., Кочетов Г.А. (2003) Индуцированная полоса поглощения холотранскетолазы и ее интерпритация. Биохимия 68,247-51.

34. Kovina M.V., Bykova I.A., Solovjeva O.N., Meshalkina L.E., Kochetov G.A. (2002) The origin of the absorption band induced through the interaction between apotransketolase and thiamin diphosphate. Biochem. Biophys. Res. Commun. 294, 155-160.

35. Kochetov G.A., Philippov P.P., Razjivin A.P., Tikhomirova N.K. (1975) Kinetics of reconstruction of holotransketolase. FEBS Lett. 53,211-212.

36. Egan R.M., Sable H.Z. (1981) Transketolase kinetics. The slow reconstitution of the holoenzyme is due to rate-limiting dimerization of the subunits. J. Biol. Chem. 256, 4877-4883.

37. Kovina, M.V., Selivanov, V.A., Kochevova, N.V., Kochetov, G.A. (1997) Kinetic mechanism of active site non-equivalence in transketolase. FEBS Lett. 418, 11-14.

38. Ковина M.B., Селиванов B.A., Кочевова H.B., Кочетов Г.А. (1997) Исследование кооперативного связывания кофермента активными центрами транскетолазы методом кинетического моделирования. Биохимия 63, 1155-1163.

39. Selivanov, V.A., Kovina, M.V., Kochevova, N.V., Meshalkina, L.E., Kochetov, G.A. (2003) Studies of thiamin diphosphate binding to the yeast apotransketolase. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 26, 33-40.

40. Selivanov, V.A., Kovina, M.V., Kochevova, N.V., Meshalkina, L.E., Kochetov, G.A. (2004) Kinetic study of the HI03A mutant yeast transketolase. FEBS Lett. 567, 270-274.

41. Usmanov, R., Sidorova, N., Kochetov, G. (1996) Interaction of dihydroxyethylthiamine pyrophosphate with transketolase. Biochem. Mol. Biol. Intern. 38, 307-314.

42. Сидорова H.H., Усманов P.А., Куимов A.H., Кочетов Г.А. (1996) Обмен кофермента холотранскетолазы со средой. Биохимия 61, 880-886.

43. Dyda, F., Furey, W., Swaminathan, S., Sax, M., Farrenkopf, В., Jordan, F. (1993) Catalytic centers in the thiamin diphosphate enzyme pyruvate decarboxylase at 2,4 A resolution. Biochemistry 32, 6165-6170.

44. Dobritzsch, D., Konig, S., Schneider, G., Lu, G. (1998) High resolution crystal structure of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis. Implications for substrates activation in pyruvate decarboxylases. J. Biol. Chem. 273, 20196-20204.

45. Muller, Y., Shulz, G. (1993) Structure of the thiamin and flavin-dependent enzyme pyruvate oxidase. Science 259, 965-967.

46. Muller, Y. A., Schumacher, G., Rudolph, R., Schulz, G. E. (1994) The refined structures of a stabilized mutant and of wild-type pyruvate oxidase from Lactobacillus plantarum. J. Mol. Biol. 237, 315-323.

47. Hasson, M., Muscate, A., McLeish, M., Polovnikova, L., Ringe, D.1998) The crystal structure of benzoyl formate decarboxylase at 1,6 A resolution: diversity of catalytic residues in thiamin diphosphate-dependent enzymes. Biochemistry 37, 9918-9930.

48. Evarsson, A., Chuang, J., Wynn, R., Turley, S., Chuang, D., Hoi, W. (2000) Crystal structure of human branched-chain a-ketoacid dehydrogenase and the molecular basis of multienzyme complex deficiency in maple syrup urine disease. Structure 8, 277-291.

49. Kochetov G.A. (1988) Structural-functional relationships in baker's yeast transketolase. in: Thiamin Pyrophosphate Biochemistry (Schellenberger, A., andSchowen, R.L., eds) V.l,pp. 139-142, CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida.

50. Heinrich, С., Steffen, H., Janser, P., Wiss, O. (1972) Studies on the reconstitution of apotransketolase with thiamine pyrophosphate and analogs of the coenzyme. Eur. J. Biochem. 30, 533-541.

51. Sprenger, G., Schorken, U., Sahm, H. (1995) Transketolase A of Escherichia coli K-12. Purification and properties of the enzymes from recombinant strains. Eur. J. Biochem. 230, 525-532.

52. Shin, W., Pletcher, J., Blank, G., Sax, M. (1979) Ring stacking interactions between thiamin and planar molecules as seen in the crystal structure of a thiamin picrolonate dihydrate complex. J. Am. Chem.Soc. 11,3491-3499.

53. Shin, W., Pletcher, J., Blank, G., Sax, M. (1977) Stereochemistry of intermediates in thiamin catalysis. 2. Crystal structure of DL-2-(a-hydroxybenzyl) thiamine chloride hydrochloride trihydrate. J. Am. Chem.Soc. 99, 1396-1403.

54. Shellenberger, A. (1967) Structure and mechanism of action of the active center of yeast pyruvate decarboxylase. Angew. Chem. 6, 1024-1035.

55. Кочетов Г.А. (1986) Транскетолаза: структура и механизм действия. Биохимия 51, 2010-2029.

56. Усманов Р.А., Нейф X., Пустынников М.Г., Шелленбергер А., Кочетов Г.А. (1985) Исследование коферментной функции 2-нор и 4-нор тиаминдифосфата в транскетолазной реакции. ДАН СССР 282, 479-486.

57. Muller, Y., Lindqvist, Y., Furey, W., Schulz, G., Jordan, F., Schneider, G. (1993) A thiamine diphosphate binding fold revealed by comparison of the crystal structures of transketolase, pyruvate oxidase and pyruvate decarboxylase. Structure 1, 95-103.

58. Schellenberger, A. (1998) Sixty years of thiamine diphosphate biochemistry. Biochim. Biophys. Acta, 1385, 177-186.

59. Kern, D., Kern, G., Neef ,H., Tittmann, K., Killenberg, M., Wikner, Ch., Scneider, G., Hiibner, G. (1997) How thiamine diphosphate is activated in enzymes. Science 275, 67-70.

60. Frank R.A., Titman C.M., Pratap J.V., Luisi B.F., Perham R.N. (2004) A molecular switch and proton wire synchronize the active sites in thiamine enzymes. Science 306, 872-876.

61. Tittmann K., Golbik R., Uhlemann K., Khailova L., Schneider G., Patel M., Jordan F., Chipman D.M., Duggleby R.G., Hiibner G. (2003) NMR analysis of covalent intermediates in thiamin diphosphate enzymes. Biochemistry 42, 7885-7891.

62. Singleton, С., Wang, J., Martin, P. (1996) Conserved residues are functionally distinct within transketolases of different species. Biochemistry 35, 15865-15869.

63. Jordan, F., Chen, G., Nishikowa, S., Sundoro, W. (1982) Potential roles of the aminopyrimidine ring in thiamin catalyzed reaction. Ann. N.Y. Acad. Sci., 378, 14-29.

64. Golbik, R., Neef, H., Hiibner, G., Konig, S., Seliger, В., Meshalkina, L., Kochetov, G., Schellenberger, A. (1991) Function of the aminopyrimidine part in thiamine pyrophosphate enzymes. Bioorg. Chem. 19, 10-17.

65. Fiedler, E., Golbik, R., Schneider, G., Tittmann, K., Neef, H., Konig, S., Hiibner, G. (2001) Examination of donor substrate conversion in yeast transketolase. J. Biol. Chem. 276, 16051-16058.

66. Кочетов Г.А., Изотова A.E. (1973) Условия отщепления тиаминпирофосфата от холотранскетолазы. Биохимия 38, 954957.

67. Booth, С., Nixon, Р. (1993) Reconstitution of holotransketolase is by tiamin-diphosphate magnesium complex. Eur. J. Biochem. 218, 261-265.

68. Usmanov, R., Sidorova, N., Kochetov, G. (1996) Interaction of dihydroxyethylthiamine pyrophosphate with transketolase. Biochem. Mol. Biol. Intern. 38, 307-314.

69. Datta, A., Racker, E. (1961) Mechanism of action of transketolase. I. Properties of the crystalline yeast enzyme. J. Biol. Chem. 263, 617624.

70. Мешалкина JI.E., Кочетов Г.А. (1979) Участие двухвалентных катионов во взаимодействии тиаминдифосфата с апотранскетолазой пекарских дрожжей. ДАН СССР 248, 14821486.

71. Кочетов Г.А., Филиппов П.П. (1970) Кальций кофактор транскетолазы пекарских дрожжей. Биохимия 35, 422-424.

72. Kochetov, G.A., Philippov, P.P. (1970) Calcium: cofactor of transketolase from baker's yeast. Biochem. Biophys. Res. Commun. 38, 930-933.

73. Hamada M., Hiraoka Т., Koike K., Ogasahara K., Kanzaki Т., Koike H. (1976) Properties and subunit structure of pig heart pyruvate dehydrogenase. J. Biochem. 79, 1273-1278.

74. Kochetov G.A., Tikhomirova N.K., Philippov P.P. (1975) The binding of thiamine pyrophospate with transketolase in equilibrium conditions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 63, 924-930.

75. Kuimov, A.N., Meshalkina, L.E., Kochetov, G.A. (1985) An investigation of the carboxyl group function in the active center of transketolase. Biochem. Int. 11, 913-920.

76. Kovina, M., Viryasov, M., Baratova, L.,. (1996) Localizacion of reactivity tyrosine residues of baker's yeast transketolase. FEBS Lett., 392, 293-294.

77. Ковина M.B., Куимов A.H., Кочетов Г.А. (1993) Существенные остатки тирозина транскетолазы пекарских дрожжей. I. Определение типа и количества существенных остатков тирозина. Биохимия 58,1330-1340.ч.

78. Ковина М.В., Куимов А.Н., Кочетов Г.А. (1993) Существенные остатки тирозина транскетолазы пекарских дрожжей. II. Исследование функции существенных остатков тирозина. Биохимия 58, 1341-1350.

79. Kovina, M.V., Kochetov, G.A. (1998) Cooperativity and flexibility of active sites in homodimeric transketolase. FEBS Lett., 440, 81-84.

80. Куимов A.H., Мешалкина JI.E., Кочетов Г.А. (1986) Функциональная карбоксильная группа в активном центре транскетолазы. Биохимия 51, 1908-1918.

81. Rippa, М., Bellini, Т., Signorirn, М., Dallocchio, F. (1979) The stabilization by a coenzyme analog of a conformational change induced by substrate in 6-phosphogluconate dehydrogenase. Arch. Biochem. Biophys., 196, 619-623.

82. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A. (1970) Charge transfer interactions in transketolase-thiamine pyrophosphate complex. Biochem. Biophys. Res. Commun. 41, 1134-1140.

83. Мешалкина Л.Е. Неопубликованные данные.

84. Gubler, C.J., Jonson, L.R., Wittorf, J.H. (1970) Yeast transketolase-assay of thiamine diphosphate. Methods in Enzymology 18, 120-123.

85. Tikhomirova, N.K., Kochetov, G.A. (1990) Purification of transketolase from baker's yeast by an immunosorbent. Biochem. Intern., 22, 31-36.

86. Тихомирова H.K., Кочетов Г.A. (1991) Новый метод выделения и новая форма транскетолазы из пекарских дрожжей. Биохимия 56, 1123-1130.

87. Соловьева О.Н. (2002) Выделение и свойства нековалентного комплекса транскетолазы с РНК. Биохимия 67, 804-809.

88. Скоупс Р. (1985) Методы очистки белков, изд-во «Мир», Москва.

89. Северин С.Е. (1989) Практикум по биохимии, изд-во МГУ, Москва, 119-121.

90. Кочетов Г.А. (1980) Практическое руководство по энзимологии, Высшая школа, Москва.

91. Bykova, I.A., Solovjeva, O.N., Meshalkina, L.E., Kovina, M.V., Kochetov, G.A. (2001) One-substrate transketolase-catalyzed reaction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 282, 845-847.

92. Dixon, M. (1972) The determination of Km and K,. Biochem. J. 129, 197-202.

93. Кочетов Г.А., Изотова A.E. (1973) Ингибиторы транскетолазы. Биохимия 38, 954-957.

94. Мешалкина JI.E., Голбик P., Усманов P.А., Нейф X., Шелленбергер А., Кочетов Г. A. (1989) Исследование коферментной функции 4^-диметил-, N1'- и N3'-пиридилтиаминдифосфата в транскетолазной реакции. ДАН СССР, 307, 486-490.

95. Мешалкина JI.E., Хюбнер Г., Шелленбергер А., Кочетов Г.А. (1992) Новый метод определения активности транскетолазы и характеристика начальной скорости транскетолазной реакции. Биохимия, 57, 285-290.

96. Greenfield, N.J. (1996) Methods to estimate the conformation of proteins and polypeptides from circular dichroism data. Analyt. Biochem. 235, 1-10.

97. Tanford, C. (1968) Protein denaturation. Adv. Protein Chem. 23, 121-282.

98. Tanford, C. (1970) Protein denaturation. C. Theoretical models for the mechanism of denaturation. Adv. Protein Chem. 24, 91-95.

99. Tanford, C., De, P.K. (1961) The unfolding of beta-lactoglobulin at pH 3 by urea, formamide and other organic substances. J. Biol. Chem. 236, 1711-1715.