Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Множественные формы транскетолазы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Множественные формы транскетолазы"

РГб од

- 5 ДЕК 133'}

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.Ломоносова

Кафедра биохимии Биологического факультета и

Отдел биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ

На правах рукописи

ФИЛИППОВ МАКСИМ ЮРЬЕВИЧ

УДК 577.152.121

МНОЖЕСТВЕННЫЕ ФОРМЫ ТРАНСКЕТОЛАЗЫ (03.00.04 - Биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.Ломоносова

Кафедра биохимии Биологического факультета и

Отдел биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ

На правах рукописи

ФИЛИППОВ МАКСИМ ЮРЬЕВИЧ

УДК 577.152.121

МНОЖЕСТВЕННЫЕ ФОРШ ТРАНСКЕТОЛАЗЫ (03.00.04 - Биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа ишюлноиа в отдоло биохимии жинотноИ клетки института физико-химической биологии им. А.и.иилсхяфгкоп) Московского государственного университета

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Г.А.Кочетов

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор л.М.Гинодман доктор биологических наук, профессор Н.Н.Чернов

Ведущее учреждение: Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН.

Защита состоится " ^//¿¿^А 1994г. в "_" часов на

заседании Специализированного Совета Д. 053.05.32 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: г.Москва 119899, Ленинские горы, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 2 % Н-С'А-й^Л_ 1994г.

Ученый секретарь

Специализированного Совета ^__

кандидат биологических наук Ю.Н.Лейкин

с

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Транскетолаза относится к груше тиаминовых ферментов, катализирует взаимопревращение фосфэсаха-ров путем переноса двууглеродного фрагмента (остатка гликолевого альдегида) с кетосахаров на альдосахара. В результате ее функционирования в пентозном пути превращения углеводов образуются, в частности, рибозо-5-фосфат и восстановленный НАДФ. Этим определяется роль трзнскетолазы. в процессах синтеза нуклеиновых кислот, восстановительного синтеза жирных кислот1 и стероидов.

Фосфоглицериновый альдегид является одним из субстратов транскетолазы (а также и продуктом реакции) и в то же время -субстратом глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, ключевого фермента гликолитического пути превращения углеводов. Более того, показано непосредственное взаимодействие (с образованием достаточно стабильного комплекса) транскетолазы с глицеральдегидфосфатде-гидрогеназой (Чернов, 1971).

Таким образом осуществляется тесная взаимосвязь пентозного пути превращения углеводов и гликолиза, и возможность переключения процесса обмена углеводов с одного пути на другой.

Транскетолаза широко распространена в природе. Она обнаружена во всех исследованных органах и тканях животных и растений, а также у микроорганизмов. В настоящее время из многих источников фермент выделен в гомогенном виде.

Наиболее изученной является транскетолаза пекарских дрожжей. Известна ее олигомерная структура, в достаточной степени «

хорошо изучены функциональные группы апобелка и кофермента, структура активного центра, химизм катализируемой ею реакции. До сих пор , однако, ничего не известно относительно механизма ре-

4 I

гуляции данного фермента. Одним из возможных путей решения этой проблемы могло бы стать изучение множественных форм транскетола-зы. В литературе этому вопросу посвящено достаточно много работ. Все они проводились, в основном, на гемолизатах эритроцитов и касались идентификации (электрофоретически) белковых полос, обладающих транскетолазной активностью. Однако, для решения проблемы множественных форм, в связи с их возможным участием в процессах регуляции, необходимо не только идентифицировать множественные формы, но й выделить их в высокоочищенном состоянии и подробно изучить свойства".

Ранее, в высокоочшценных препаратах пекарских дрожжей было показано наличие двух форм фермента, разделяемых хроматографи-чески на ионообменных колонках (Чернов, 1971). Подробно, однако, они не исследовались, т.к. тогда такая задача не ставилась.

Целью настоящей работы являлась идентификация множественных форм транскетолазы в дрожжевом экстракте, их выделение и очистка до гомогенного состояния, и исследование их свойств.

Научная новизна. В результате работы в экстрактах пекарских дрожжей и ряда животных тканей были обнаружены и идентифицированы три формы транскетолазы, отличающиеся по термостабильности и обозначенные нами как А, В и С. Все три формы фермента из пекарских дрожжей были выделены в гомогенном виде и закристаллизованы; морфология их кристаллов различна. Проведено сравнительное изучение физико-химических и кинетических свойств транскетолазы А и С. В частности показано, что в транскетолазе формы С, в отличие от транскетолазы А, субъеденицы связаны между собой ди-сульфидными связями.

Практическое значение. Полученные результаты расширяют наши представления о транскетолазе с точки зрения наличия множествен-

пых ({к)[)м ({к'.рмспта. Разработан простой, быстрый и эффективный метод идентификации множественных форм транскетолазы в тканевых экстрактах, который может быть взят за основу при разработке клинического метода определения количественного соотношения форм фермента в норме и при патологии с целью диагноза различных заболеваний, Разработан метод выделения и очистки до гомогенного состояния множественных форм транскетолазы пекарских дрожжей, что являлось необходимым условием для дальнейшего изучения свойств этих форм и их отношения к проблемме регуляции данного фермента.

Апробация. Результаты работы доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки Института физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского МГУ.

Публикации. Результаты исследования изложены в 3 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит страниц машинописного текста, таблиц и рисунков. Список литературы включает источников.

Изложение полученных результатов и их обсуждение составляют содержание экспериментальной части диссертации. Обзор литературы посвящен рассмотрению вопросов, непосредственно связанных с предметом настоящего исследования.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ

Материалы. Использованные в работе nadh, /s-аланин, глицин, бариевая соль рибозо-5-фосфата - фирмы Reanal. Тиашшщрофосфат, 1,4-дитиотреитол и tris-hcl получены от фирмы мегск. Препараты mes, mops, hepes, натриевая соль фруктозо-6-фэсфата, сульфат аммония - от фирмы serva. Препараты оксипирувата, даоксиацетона, d-седогептулозо- 7-фосфата - от фирмы sigma. Фосфоцеллмоза pu -фирмы Whatman (Англия). Остальные реактивы - отечественного производства квалификации "осч".

Выделение транскетолазы. Для получения высокоочшценных препаратов дрожжевой транскетолазы использовали описанную ранее методику (Tikhomirova and Kochetov, 1990).

Определение белка. В препаратах транскетолазы содержание белка определяли спектрофотометрически, по величине " оптической плотности при 280 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм, используя величину удельной оптической плотности = 1.45.

(Heirich et al.,1972).

Хроматография на фосфоцеллюлозе. Для хроматографии на фосфоцеллюлозе рН препарата частично или высокоочищенной транскетолазы доводили до 6,0 и раствор наносили на колонку (1x1см) с фосфоцеллюлозой Pu ("Whatman", Англия), уравновешенной с 20 мМ калий=фосфатным буфером, рН 5,9. Элюцию проводили градиентом юо мМ калий= фосфатного буфера, рН 6,0-8,0, со скоростью 2-3 ил/иm при 4°.

Кристаллизация различных форм транскетолазы. Для кристаллизации использовали препараты, содержавшие не менее 85 % одной из форм; примесь двух других не превышала 15 % (по активности). В препарате, полученном хроматографией на фосфоцеллюлозе, рН дово-

7 f

дили до V., в, вносили - сульфат .аммония до: 35 %■ насыщения- и -инкубц-. ровали в течение.ночи,цЗатем концентрацию сульфата :аммония.;уве-.( личивали до 70 % насыщения, полученный осадок растворяли в малом объеме o,i М MES-KOH-буфера, рН 6,5, или HEPES-КОН-буфера, рН 7,0-7,8, с добавлением i мМ Mgso4. Удаляли нерастворившуюся часть осадка центрифугированием в течение 3 мин при 3000 g, а ферментный раствор использовали для кристаллизации. Кристаллы транскетолазы выращивали методом диффузии паров растворителя в висячей капле (Davis and segal, 1971) при 4°. Раствор для кристаллизации содержал 0,1 М mes-KOH-буфер, рН 6,5, или hepes-КОН-буфер, рН 7,0-7,8, 1-2 &-ную транскетолазу, сульфат аммония 30-40 % насыщения, i мМ Mgso4, 0,02 %-ный азид натрия.

Термоинактивация изоформ транскетолазы. Для опытов по термоинактивации рН ферментного раствора, содержавшего 10 - 10 М транскетолазу, юо мМ калий-фосфатный буфер, 2 мМ СаС12 и 0,4 мМ тиаминпирофосфат, доводили до 6,5, отбирали пробы для определения исходной активности и помещали образец в водяную баню, нагретую до 60°. Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты для определения активности транскетолазы. Аликвоты охлаждали во льду и центрифугировали для осаждения денатурированного белка в микроцентрифуге.

Определение активности транскетолазы. Определение активности транскетолазы проводили спектрофотометрически по скорости окисления nadh в результате восстановления диоксиацетонфосфата (Cooper et ai.,1958), образующегося в ходе триозофосфатизомераз-ной реакции из одного из продуктов транскетолазной реакции -3-фосфоглицеринового альдегида. Реакционная смесь, в конечном объеме 2 мл, содержала юо мМ глицил-глициновый буфер рН 7,6,

0,2 мМ nadh, 2 мг вспомогательных ферментов, 2,5 мМ caci2, 0,4 мМ тиаминшрофосфат, ю мМ смесь фосфопентоз, 0.5-5 мкг ТК. Смесь фосфопентоз, которую использовали в качестве субстрата транскетолазы, получали по методу Гублера и др. (Gubier et ai.,-

1970).

Активность транскетолазы с субстратами-донорами в присутствии феррицианида измеряли спектрофотометрически по уменьшению оптической плотности при 420 нм (Усманов и Кочетов, 1983).

Титрование сульфгидрильных групп. Титрование сульфгидриль-ных групп проводили в 4М мочевине по методу Эллмана (Eiiman, 1959). Предварительно фермент, в концентрации 2мг/мл, диализова-ли 20ч при 4°С против IOOmM калий-фосфатного буфера, рН 8,0, содержащего 4мМ р- меркаптоэтанол, затем пропускали через сефадекс G-50, уравновешенный тем же буфером, но не содержащий и- меркаптоэтанол. Обработку фермента боргидридом натрия проводили в 8М мочевине ПО методу Cavallini et al. (Cavallini et al.,1966). Прямое титрование дисульфидов дитиотреитолом проводили в 8М мочевине в присутствии 50 мМ калий-фосфатного буфера рН 8,0 по методу Iyer and Klee (Iyer and Klee, 1973), При ЭТОМ концентрация фермента составляла ЗхЮ~5М.

Определение Km и v для субстратов-доноров. При определении к и v для субстратов-доноров транскетолазы ферментативную ак-

m

тивность измеряли спектрофотометрически по реакции с феррициани-дом, используя в качестве субстрата только субстрат-донор. Состав реакционной смеси: 0,05 М трис-нсь- буфер рН 7,6; 2,5 мМ Mgci2; 0,1 М ТПФ; 1,3 мМ K3(Fe(CN)6]; 2хЮ~7М транскетолаза и субстрат-донор в интервале концентраций: фруктозо-6-фэсфат -0,75-7,5хЮ_5М; фруктоза - 0,15-1,5 М; оксипируват - 0,5-67хЮ-4 М; диоксиацетон - 0,75-25x10-2 М. Результаты обрабатывали в ко-

|>ди||.-1Т;1Х Л;1Й11,уии(![К| Цирки.

Электрофорез. Электрофорез в присутствии додецилсульфата ыа I 12.5% полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли (ьает-

111, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ Я ОБСУЖДЕНИЕ I.Идентификация множественных форм транскетолазы

При исследовании термосгабильности транскетолазы проявляет-:я гетерогенность фермента. Всего идентифицированы три формы, шличающиеся по скорости инактивации при 60°, хотя нередко та 1ли иная форма отсутствовала.

На рис. I, А показана кинетика термоинактивации очищенной транскетолазы пекарских дрожжей в полулогарифмических координатах.

Рис.1. Кинетика термоинактивации дрожжевой транскетолазы (А) и кинетический анализ изменений активности лабильной части фермента (Б).

1 о

Часть фермент;) (20% по активности), имонуоман i¡ дплыюПшсм формой С, в условиях эксперимента термостаСильна. При вычитании указанных 20 % из общей активности получается двухфазная кривая (рис. I Б, кривая i), представляющая собой результат сложения двух прямых. Эти прямые описывают инактивацию форм А и В. - Форма В является наиболее чувствительной к повышенной температуре и полностью инактивируется уже через 4 мин инкубации цри 60° (рис.1 Б, прямая 2), что позволяет в дальнейшем наблюдать инактивацию формы А (конечный прямолинейный участок кривой 1). Анализ ПОДОбНОЙ КИНеТИКИ ОПИСаН Реем И КОШЛЭНДОМ (Rey and Koshland, 1961). Величины констант скорости инактивации транскетолазы А и В указаны в табл. I.

С помощью термоинактивации наличие всех описанных форм фермента можно обнаружить не только в препаратах очищенной транскетолазы, но и в экстракте дрожжей. При этом скорость термоинактивации в обоих случаях отличается незначительно (табл. I). Следовательно, гетерогенность транскетолазы не может быть объяснена накоплением артефактных форм в процессе выделения фермента. С теш же закономерностями, что и для дрожжевой транскетолазы, происходит термоинактивация транскетолазы в экстрактах из печени крыс, свиньи, кролика (табл. I).

В табл.2 показаны соотношения форм А, В и С, определяемых па вышеописанному методу термоинактивации, в экстрактах из разных органов кролика у четырех разных животных. Вариабельность соотношения форм фермента в разных органах, и даже в одной и той же ткани (печень) разных животных, по-видимому, зависит от физиологического состояния данного организма и, возможно, имеет регуляторное значение.

. . .............." '1"Таблица' Т.

Значения констант скоростей инактивации хо'лотранс-кетолазы из различных источников при 60° (мин-1)

Источник Форма фермента*

А В

Дрожжевой экстракт 0,082 + 0, 02 0, 670 + 0,Ю

Очищенный фермент дрожжей 0,060 + 0,02 0, 510 + 0,04

Экстракт печени крыс 0, 065 + 0,02 0,420 + 0, 04

Экстракт печени свиньи 0,074 + 0,02 0, 260 + ОД 0

Экстракт печени кролика 0, 052 + 0, 02 0, 288 + 0, 04

Во всех случаях наблюдалась также термостабильная форма С

Таблииц 2.

Соотношение форм транскетолазы (по активности) в экстрактах из различных органов кролика

Орган Количество форм в данном органе, %

А В С

почки 39 26 35

печень 100 0 0

мозг 55 20 25

печень 50 25 25

сердце 0 0 100

печень 38 28 34

селезенка 88 12 0

печень 100 0 0

2.Кристаллизация множественных форм транскетолазы

Для получения множественных форм транскетолазы в индиви-

дуальном виде из большого количества партий пекарских дрожжей отбирали (используя метод термоинактивации) те из них, в которых содержание интересующей нас формы было не менее 85%.

Из разнообразных условий, испробованных для выращивания кристаллов транскетолазы, оптимальными оказались следующие: о,1 М нереб-КОН-буфер, рН 7,2-7,8, 32-36 % насыщения сульфата аммония. При использовании форм А, В и С для кристаллизации получали кристаллы трех разных морфологических типов. Форме транскетолазы, характеризующейся по термоинактивации, как форма А, соответствуют призмовидные кристаллы с постоянным соотношением длины к ширине, равным - 2 : 1, и средними размерами о,24 х 0,12 х о,об мм (рис.2). Форме фермента, характеризующейся по термоинактивации, как форма В, соответствуют игловидные кристаллы с соотноше-

Рис.2. Кристаллы транскетолазы формы А (снимки в двух проекциях).

Рис.4. Кристаллы транскетолазы формы С.

v. ...-,. 14

нием длины к ширине от 8 : i до 15 : i, и средними"размерами о,4 х 0,04 х о,05 мм (рис.3). Форме фермента, характеризующейся по термоинактивации, как форма С, соответствуют кристаллы в виде трапециевидных пластин со средними размерами 0,25 х о,15 х о,о5 мм (рис.4). Каждой форме фермента соответствовал только один морфологический тип кристалла, независимо от того, ano- или хо-лобелок был использован для кристаллизации.

З.Хроматографическое поведение транскетолазы А и С на колонке с Сефадексом g-200

На рис.5 А (кривая I) приведен профиль элюции нативной транскетолазы С с колонки, заполненной сефадексом G-200. Видно, что белок сходит одним достаточно симметричным пиком. Объем элюции соответствует, судя по калибровочному графику (рис. 5 Б), молекулярной массе 160 КДа, что характерно для димерной формы фермента. В то же время, согласно литературным данным (Беляева и др.,1978; Cavaiieri et al.,1975), при той концентрации белка, которая использовалась в описываемом эксперименте, транскетолаза должна практически полностью быть диссоциированной на субъединицы. Именно так и ведет себя транскетолаза А, профиль элюции которой показан кривой 2 на рис. 5 А; объем элюции в данном случае равен 66 мл, что соответствует молекулярной массе субъединиц транскетолазы - 80 КДа.

Картина, аналогичная той, которая изображена на рис. 5 А (кривая I), получалась и в том случае, если транскетолазу С перед гель-фильтрацией выдерживали при рН 11,2 (кривая 3 на рис. 5 А) (при этих условиях транскетолаза должна, если судить по литературным данным (Беляева и др.,1978), необратимо диссоциировать на субъединицы как при низкой, так и при высокой концентрации

1 г>

МА

Рис.5. А. Гель-фильтрация транскетолазы А и С на колонке с сефадексом G-200, рН 7,8. I - нативная транскетолаза С; 2 - на-тивная транскетолаза А; 3 - транскетолазу С перед гель-фильтрацией выдерживали при рН 11,2 без /з-меркаптоэтанола; 4 -то же, что и 3, но с р-меркаптоэтанолом. Исходная концентрация транскетолазы А - 0,024 мг/мл; транскетолазы С -0,02мг/мл (I), 0,015 мг/мл (3), 0,025 мг/мл (4). Б. Калибровочный график для определения молекулярной массы транскетолазы. Белки-маркеры: альдолаза (а), 160КДа; лактатдегидрогеназа (б), 140КДа,- гексоки-наза (в), ГООКДа,- проназа (г), 70КДа. Стрелками указаны объемы элюции транскетолазы С, соответственно (слева направо), I, 3 и 4 на рис.5А, и транскетолазы А.

формоита). если же выдоржиишжо транскетолази с при pli II ,'.1 <к:у ществляли при наличии в среде э-меркаптоэтанола, то объем элюции белка с колонки существенно увеличивался и теперь уже соответствовал молекулярной массе мономерной формы фермента (кривая 4 на рис. 5 А).

4.Хроматография транскетолазы С после ее денатурации

По сути, аналогичные вышецриведенным данные для транскетолазы С были получены и в том случае, когда эксперименты ставили в .присутствии мочевины. При этом оказалось, что если предварительную обработку транскетолазы С мочевиной и последующую гель-фильтрацию проводить в отсутствие р-меркаптоэтанола, то молекулярная масса снимаемого с колонки белка, судя по калибровочному графику (рис. 6 Б), равнялась 155 КДа (кривая I на рис. 6 А) и соответствовала димерной форме фермента. В том же случае, когда эксперимент с мочевиной ставился в присутствии /з- меркаптоэтано-ла, молекулярная масса элюируемого с колонки белка была 74 КДа (кривая 2 на рис. 6 А), что соответствует мономеру.

Таким образом, транскетолаза С, в отличие от достаточно хорошо изученной и описанной в литературе, является недиссоциирую-щей (на субъединицы) в нормальных условиях формой фермента. Распад на субъединицы имеет место только в денатурирующих условиях (при рН 11,2 или в мочевине) и обязательном наличии в среде /з-меркаптозтанола.

Приведенные данные указывали на то, что субъединицы в молекуле транскетолазы С связаны между собою дисульфидными связями. Это нашло свое подтверждение в последующих наших экспериментах по определению сульфгидрильных груш и дисульфидных связей.

10 20 30 40 МЛ

Рис.6. А. Гель-фильтрация транскетолазы С в мочевине, в отсутствие (Г) и в присутствии (2) /з-меркаптоэтанола. Исходная концентрация фермента - 0,35 мг/мл (I) и 0,40 мг/мл (2). Остальные условия см. в разделе "Материалы и методы". Б. Калибровочный график для определения молекулярной массы транскетолазы. Белки-маркеры.- миозин (а), 205 КДа; бычий сывороточный альбумин (три-мер) (б), 198 КДа,- бычий сывороточный альбумин (димер) (в), 132 КДа,- бычий сывороточный альбумин (мономер) (г), 66 КДа. Стрелками указаны объемы элюции транскетолазы С, соответственно (слева направо) I и 2 на рис. 6А.

б.Количество сульфгидрильных групп и дисульфидных связей в

?1 ! IV;. с п

¡транскетолазе А и С. !

В молекуле транскетолазы А, которая является диссоциирующей формой фермента, определяется 6 Бн-групп, что соответствует литературным данным (Кочетов и др., 1973), и три дисульфидные связи (табл. 3). В транскетолазе С определяются, в зависимости от препарата, либо 2 бн-группы, либо не определяются совсем и, соответственно, либо 5 дисульфидных связей, либо 6 (табл. 3). Для удобства изложения фермент, который содержит две зн-группы, мы обозначим, как транскетолаза С-1, а фермент, не содержащий Бн-групп, - транскетолаза С-2. При гель-фильтрации транскетолаза С-1 и транскетолаза С-2 ведут себя одинаково, т.е. не диссоциируют на субъединицы в отсутствие е-меркаптоэтанола даже в денатурирующих условиях.

Таблиир. 3

Количество сульфгидрильных и дисульфидных групп в транскетолазе С-1, С-2 и А, определенное в мочевине

Форма фермента -бн1' -бн б~б2> 3-б3>

С-1 12 2 5 5

С-2 12 0 6 6

А 12 6 - 3

11после обработки Соргидридом натрия 2'данные прямого титрования

3)по разнице эн-групп до и после обработки боргидридом натрия.

6.Определение константы Михаэлиса для тианинпирофосфата В табл. 4 приведены результаты определения Кга для тиаминш-рофосфата с разными формами транскетолазы. Видно, что формы С-1 и А характеризуются двумя значениями Кт, по существу не отличающимися от тех, которые известны из литературы. Это соответствует представлению о том, что транскетолаза имеет два активных центра с различным сродством к тиаминпирофосфату. В то же время, с транскетолазой С-2 определяется только одна Кт для тиаминпиро-фосфата, близкая по значению К^ для транскетолазы А и известной из литературы.

7.Определение Кт и V для субстратов-доноров Как следует из данных, приведенных в табл. 5, транскетолаза С-1 и транскетолаза С-2 по существу не различаются по значениям Кт, определяемым для всех исследованных субстратов-доноров. Различия (более, чем на порядок) наблюдаются лишь в значениях V при

Таблит 4

Значения кт транскетолазы С-1, С-2 и А для тиаминпирофосфата

Форма фермента «£•м 4 М

С-1 8,3x1О-8 5,0хЮ~7

С-2 2,4x10"'

А 4,8хЮ~8 4,0x1О-7

3,2хПГ8* 2,5x10 7

* - литературные данные (КосЬе^ et аг., 1975)

исиильгюи.'шии и качостио субстрата диокси;щотоп;1. При соиостлп линии с литературными данными (табл. 5) обращают на себя пними ние лишь более высокие значения Кт для фруктозы (как при использовании в экспериментах транскетолазы С-1, так и транскетолазы С-2). Что же касается значений v, то какую-либо закономерность (или тенденцию) здесь выявить трудно. Можно лишь заметить определенные различия при использовании в качестве субстратов окси-пирувата и диоксиацетона.

Таблица 5

Значения кш и v транскетолазы С-1 и С-2 для разных субстратов.

Субстрат Форма фермента Vм V, Е/мг

Фруктозо-6-фосфат С-1 С-2 8,Зх1СГ6 б.бхЮ"6^ 6,1x1О-® 0,22 0,37 о; 41*

Фруктоза С-1 С-2 3.2Х1СГ1 3,2хЮ-1ч 1,5хЮ~2 0,22 0,31 0,37*

Оксипируват С-1 С-2 2,9x1О-4 1,6хЮ~4л 2,5x10~4 0,12 0,37 0,60*

Диоксиацетон С-1 3,6x1О-2 0,06

С-2 6,7хЮ~2 2,8x10 ^ 1,20 0,25*

^-литературные данные (Усманов и Кочетов 19вз>

По морфологии кристаллов транскетолаза А не отличается от транскетолазы, выделяемой по методу Рекера и сотр. (згеге et ах., 1958) и описанной в литературе. Не отличается она и по способности диссоциировать при низкой концентрации белка в растворе (рис. 5, кривая 2), по количеству эн-групп (табл. 3), по количеству активных центров (два) и значениям Кт для тиаминпирофос-фата к этим центрам (табл. 4). Все это указывает на то, что транскетолаза А и транскетолаза, описанная в литературе - это одна и та же форма фермента.

Транскетолаза С не диссоциирует на субъединицы даже в денатурирующих условиях, если в систему не был добавлен /з-меркапто-этанол (рис. 5 и 6). В составе ее молекулы определяются две или три (в зависимости от препарата) "лишние" (по сравнению с транс-кетолазой А) дисульфидные связи и, соответственно, две или ноль вн-групп (табл. 3). В транскетолазе А их титруется щесть. Эти данные свидетельствуют о том, что субъединицы в транскетолазе С связаны дисульфидными связями.

Транскетолаза С-1, имеющая пять дисульфидных связей и две зн-группы (табл. 3), характеризуется наличием двух Кт для тиа-мишшрофосфата и в этом смысле (так же, как и по абсолютным их значениям - табл. 4) не отличается от транскетолазы А. В то же время, транскетолаза С-2 имеет шесть дисульфтщшх связей, .не имеет вн-групп и характеризуется наличием только одной Кт для тиаминпирофосфата, по значению близкой к К^ для транскетолазы А (табл. 4). Последнее указывает на одинаковое сродство тиаминпирофосфата к обоим активным центрам фермента. Нельзя, правда, исключить, что в данном случае функционирует только один активный центр, однако такая возможность нам кажется менее вероятной.

ВЫВОДЫ

1.В экстракте пекарских дрожжей и ряда животных тканей идентифицированы три формы транскетолазы, отличающиеся по термостабильности и обозначенные нами как А, В, и С.

2.Из пекарских дрожжей все три формы фермента были выделены в гомогенном ,виде и закристаллизованы; морфология их кристаллов различна.

3.Транскетолаза А по морфологии кристаллов, по отсутствию межсубъиденичных связей, по количеству сульфгвдрильных групп, по наличию двух Кт для тиаминпирофосфата и их обсолютным значениям не отличается, от транскетолазы, известной из литературы, что указывает на возможную их идентичность.

4.Транскетолаза С представляет собой новую, неизвестную ранее, форму фермента. Ее характерной особенностью (наряду с другими) является наличие в составе ее молекулы межсубъединичных дисульфидных связей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

l.Kuimov A.N., Filippov M.Yu. and Kochetov G.A. "Multiple forms of transketolase" Biochem. Internat., vol.21, No.6, pp.1081-1087 (1990).

2.А.Н.Куимов, Н.В.Конарева, М.Ю.Филиппов, А.М.Михайлов, Г.А.Кочетов "Кристаллизация трех множественных форм транскетола-зы пекарских дрожжей" Биохимия, т.58, no.ii, стр. 1820-1829 (1993) .

3.01ga N.Solovjeva, Maxim Yu.Filippov, and German A.Kochetov "Intersubunit disulphide bonds in the molecule of baker's yeast transketolase" Biochem. Mol. Biol. Internat., vol.34. No.5, pp.1049-1054 (1994).