Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие апотранскетолазы пекарских дрожжей с тиаминпирофосфатом

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кочевова, Наталья Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Реконструкция холотранскетолазы из ano- и кофермента.10

1. Двустадийность процесса взаимодействия кофермента с апотранскетолазой.10

2. Функциональные группы ano- и кофермента, участвующие в реконструкции холотранскетолазы.20

2.1. Функциональные группы апотранскетолазы.20

2.1.1 .Остатки гистидина.20

2.1.2,Остатки триптофана.22

2.1.3. Карбоксильные группы.

2.2. Функциональные группы тиаминпирофосфата.25

2.2.1. 4'-NH2-rpynna пиримидинового кольца.

2.2.2. Пирофосфатная группа.

2.2.3. Метальные группы.26

3. Комплекс с переносом заряда в молекуле транскетолазы.27

4. Количество активных центров, их каталитическая эффективность.34

5. Участие двухвалентных катионов в связывании тиаминпирофосфата апотранскетолазой.37

6. Неэквивалентность активных центров транскетолазы по связыванию кофермента.43

7. Структура кофермент-связывающего участка транскетолазы.44

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. МАТЕРИАЛЫ.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.46

2.1. Выделение транскетолазы из пекарских дрожжей.46

2.1.1. Приготовление иммуносорбента.46

2.1.2. Выделение и очистка транскетолазы.48

2.1.3. Определение активности транскетолазы.50

2.1.4. Определение белка.

2.2. Получение субстратов транскетолазы.51

2.2.1. Выделение рибозофосфатизомеразы и рибулозофосфат-3-эпимеразы из селезенки быка.52

2.2.2. Получение рибозо-5-фосфата.53

2.2.3. Получение бариевой соли смеси фосфопентоз.

2.3. Определение чистоты препарата тиаминпирофосфата.

2.4. Определение концентрации тиаминпирофосфата.

2.5. Постановка экспериментов и обработка получаемых результатов.55

2.5.1. Постановка экспериментов.55

2.5.2. Обработка результатов.57

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.62

3.1. Взаимодействие нативной транскетолазы пекарских дрожжей с тиаминпирофосфатом.62

3.1.1. Связывание кофермента с транскетолазой в присутствии кальция.63

3.1.2. Связывание кофермента с транскетолазой в присутствии магния.73

3.2. Взаимодействие мутантной по His 103 транскетолазы с тиаминпирофосфатом.80

3.2.1. Связывание кофермента с мутантной апотранскетолазой в присутствии кальция.80

3.2.2. Связывание кофермента с мутантной апотранскетолазой в присутствии магния.85

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.91

4.1. Механизм реконструкции холотранскетолазы.91

4.2. Взаимодействие нативной транскетолазы пекарских дрожжей с тиаминпирофосфатом.92

4.3. Взаимодействие тиаминпирофосфата с мутантной по His 103 транскетолазой.96

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие апотранскетолазы пекарских дрожжей с тиаминпирофосфатом"

Транскетолаза ( седогептулозо-7-фосфат: Э-глицеральдегид-3-фосфат гликольальдегидтрансфераза, КФ 2.2.1.1) - фермент пентозо-фосфатного пути превращения углеводов. Катализирует расщепление кетозы (субстрат-донор) по С-С связи, соседней с кетогруппой, и последующий перенос двууглеродного фрагмента ( остатка гликолевого альдегида) на альдозу (субстрат-акцептор).

СН2ОН СН2ОН

I I

С=0 Н-С=0 —>Н-С=0 С =о

1111

НО-С - Н + Н-С-ОН <— Н-С-ОН + ОН-С-Н

I I I I

Н-С-ОН Я] Я Н-С-ОН

I I Я

Субстратами-донорами являются кетозы, у которых имеется гид-роксильная группа при первом атоме углерода, а гидроксильные группы при 3-м и 4-м асимметрических атомах углерода находятся в трансположении. Исключение составляют трёхуглеродные кетозы - ГП и ДОА, не имеющие асимметрического атома углерода ( рис. 1,6 ). Фермент мало специфичен по отношению к длине углеродной цепочки; наличие фосфатной группы в молекуле субстрата-донора существенно повышает его сродство к ферменту [1 ]. Субстратами-донорами в транскетолазной реакции являются ксилулозо-5-фосфат, фруктозо-6-фосфат, эритрулозо-4-фосфат, Б-ксилулоза, О-фруктоза, Ь-эритрулоза и др. В качестве субстрата-акцептора могут функционировать О-гли-церальдегид-3-фосфат, 0-рибозо-5-фосфат, 0-эритрозо-4-фосфат, гли-кольальдегид и др. Транскетолазная реакция обратима, за исключением того случая, когда роль субстрата-донора выполняет ГП. сн2 он СН20Н

I I с=о с=о

I I

СНгОН но-с

II О

СШОН СНгОН

I I с=о с=о

I I но-с*-н но-сг-н

I I н-сг-он н-сг-он дол (?>о-снон н-с'-он гп (р>о-снон

К-5-Ф ф-б-ф

Рис.1. а - Тиаминпирофосфат. б - Некоторые субстраты-доноры транскетолазной реакции. Звездочкой обозначены асимметрические атомы углерода.

ТК была открыта в 1953 г. и в настоящее время обнаружена практически во всех исследованных тканях животного и растительного происхождения, а также у микроорганизмов. Локализуется преимущественно в растворимой фракции клетки. Кофакторами ТК являются ионы двухвалентных металлов (Са+2, и др.) и ТПФ ( рис.1 ,а).

На сегодняшний день наиболее полно исследованы свойства ТК пекарских дрожжей. Фермент имеет молекулярную массу, равную 159±6 кДа, и состоит из двух идентичных субъединиц, не связанных между собой ковалентными связями [ 2-5 ]. Два его активных центра [6,7 ] расположены на границе между контактирующими поверхностями субъединиц [ 2 ]. Активные центры характеризуются одинаковой ферментативной активностью [ 7 ]. К настоящему времени получена достаточно подробная информация о кристаллической структуре фермента [ 2,8-13 ], его оптических свойствах и их изменениях при связывании различных лигандов [1, 14, 15-20 ], о константах диссоциации кофермента [ 14 ], Кт для субстратов [ 1, 14 ] и Л^шах с различными субстратами [ 1, 14 ]. Определен аминокислотный состав и первичная структура фермента [ 21 ], охарактеризована также его вторичная структура [22].

Полагают, что в состав активного центра ТК входит остаток триптофана, участвующий в связывании ТПФ с белком, возможно, путём взаимодействия с тиазолиевым кольцом кофермента [23, 24, 25 ]. Методом фотоинактивации, а позже и рентгеноструктурным анализом, показано наличие остатка (или нескольких остатков ) гистидина в активном центре ТК [ 2, 23, 26 ]. Предполагается, что этот остаток тоже принимает участие в связывании кофермента апотранскетолазой. Получены данные, свидетельствующие о наличии карбоксильных групп в активном центре ТК, вероятно, необходимых для связывания кофакторов - ТПФ и двухвалентного катиона [ 2, 23, 27 ]. Методом химической модификации установлено присутствие в активном центре фермента остатков аргинина [ 23, 28 ] и тирозина [ 29, 30 ]. Считается, что они нужны для связывания субстратов-доноров.

Несмотря на то, что достаточно хорошо изучена структура ТК и общий механизм тиаминового катализа, по существу нет данных о кинетическом механизме функционирования ТК.

Целью настоящей работы было изучение кинетического механизма процесса взаимодействия кофермента с апоТК пекарских дрожжей в присутсвии различных двухвалентных катионов, определение кинетических характеристик индивидуальных стадий этого процесса.

Обзор литературы

Реконструкция холотранскетолазы из ano- и кофермента.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кочевова, Наталья Викторовна

5. Выводы

1. С помощью кинетической модели, учитывающей кооперативное взаимодействие двух исходно идентичных активных центров апотран-скетолазы, проанализирован двухстадийный механизм связывания ко-фермента с каждым из них. Определены кинетические характеристики индивидуальных стадий этого процесса.

2. Установлено, что в присутствии ионов магния, как и в присутсвии ионов кальция, имеет место отрицательная кооперативность двух активных центров по связыванию тиаминпирофосфата.

3. Показано, что причиной неэквивалентности активных центров является различная скорость обратного конформационного перехода на второй стадии процесса взаимодействия кофермента с апобелком.

4. В результате замены в молекуле апотранскетолазы аминокислотного остатка His 103 на аланин общий механизм реконструкции холофер-мента остаётся неизменным, однако в присутствии магния, но не кальция, изменяются значения констант всех индивидуальных стадий.

5. На основании полученных экспериментальных данных сделано предположение о том, что структура активного центра транскетолазы, сформированного в присутствии магния, не идентична структуре активного центра, сформированного в присутствии кальция.

6. Получены прямые доказательства изменения конформации транскетолазы на второй стадии взаимодействия кофермента с апобелком.

ПРИНОШУ ГЛУБОКУЮ ПРИЗНАТЕЛЬНОСТЬ ГЕРМАНУ

АЛЕКСАНДРОВИЧУ КОЧЕТОВУ ЗА ПОДДЕРЖКУ, ПОСТОЯННОЕ ВНИМАНИЕ К НАСТОЯЩЕЙ РАБОТЕ И ПОМОЩЬ В ОБСУЖДЕНИИ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. ОГРОМНАЯ БЛАГОДАРНОСТЬ ВСЕМ СОТРУДНИКАМ НАШЕЙ

ЛАБОРАТОРИИ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кочевова, Наталья Викторовна, Москва

1. Усманов Р.А., Кочетов Г.А. ( 1983 ) "Связывание субстратов с тран-скетолазой пекарских дрожжей. Функция анионной группы субстрата-донора ". Биохимия 48, 550-558.

2. Lindqvist Y., Schneider G., Ermler U., Sundstrom M. (1992) " Three dimensional structure of transketolase, a thiamine diphosphate dependent enzyme, at 2,5 A resolution ".EMBO J. 11, 2373-2379.

3. Schneider G., Lindqvist Y. (1998 ) "Crystallography and mutagenesis of transketolase : mechanistic implications for enzymatic thiamin catalysis", Biochem. Biophys. Acta 1385, 387-398

4. Беляева P.X., Черняк В.Я., Магретова H.H., Кочетов Г.А. (1978) "Молекулярный вес и четвертичная структура транскетолазы пекарских дрожжей." Биохимия 43, 545-554.

5. Cavalieri S., Neet К.Е., Sable H.Z. (1975) "Enzymes of pentose biosynthesis. The quaternary structure and reacting form baker's yeast ". Arch. Biochem. Biophys. 171, 527-532.

6. Kochetov G.A., Usmanov R.A., Meshalkina L.E. ( 1976 ) " The number of active sites in a molecule of transketolase Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 839-843.

7. Meshalkina L.E., Kochetov G.A. ( 1979 ) " The functional identity of the active centers of transketolase ". Biochim. Biophys. Acta 571, 218-223.

8. Muller Y., Lindqvist Y., Furrey W., Schule G., Jordan F., Schneider G. (1993) "A thiamin diphosphate binding fold revealed by comparison of the crystal structures of transketolase, pyruvate oxydase and pyruvate decarboxylase ". Structure 1, 95-103

9. Sundstrom M., Lindqvist Y., Schneider G. (1992 ) " Three-dimensional structure of apotransketolase. Flexible loops at the active site enable cofactor binding ". FEBS Lett. 313, 229-231.

10. Nilsson U., Lindqvist Y., Kluger R., Schneider. G. (1993) "Crystal structure of transketolase in complex with thiamin thiazolone diphosphate, an analogue of the reaction intermediate, at 2,3 A resolution ". FEBS Lett. 326, 145-148.

11. Nikkola M., Lindqvist Y., Schneider G.(1994) "Refined structure of transketolase from Saccharhmyces cerevisiae of 2.0 A resolution". J. Mol. Biol. 238, 387-404.

12. Пустынников М.Г., Нейф X., Усманов P.A., Шелленбергер А., Кочетов Г.А. (1986) " Функциональные группы тиаминпирофосфата в хо-лотранскетолазе ". Биохимия 51, 1003-1016.

13. Kochetov G.A., Usmanov R.A., Merzlov V.P. (1970) "Thiaminepyro-phosphate induced change of the optical activity of baker's yeast transketolase". FEBS Lett. 9, 265-266.

14. Heinrich C., Noack K., Wiss O. (1971) "A circular dichroism study of transketolase from baker's yeast ". Biochem. Biophys. Res. Commun. 44, 275-279

15. Heinrich C., Schmidt D. (1993) "Determination of the binding constant of thiamine diphosphate in transketolase from baker's yeast by circular dichroism titration ". Specialia 1227.

16. Kochetov G.A., Usmanov R.A., Mevsh A.T. (1973) " The role of the charge transfer complex in the transketolase catalized reaction ". Biochem. Biophys. Res. Commun. 54, 1619-1626.

17. Heinrich C., Schmidt D., Noack K. (1974) "Energetic and spectroscopic studies on the interaction between thiamine diphosphate and apotransketolase". Eur. J. Biochem. 41, 555-561.

18. Усманов P.A., Кочетов Г.А. ( 1978 ) " Изучение различных конфор-мационных состояний транскетолазы методом пертурбационной уль-трофиолетовой спектрофотометрин ". Биохимия 43, 1796-1804.

19. Кочетов Г.А., Усманов Р.А. ( 1970 ) "Изучение транскетолазы методом дисперсии оптического вращения". Биохимия 35, 611-621.

20. Кочетов Г.А., Кобылянская К.Р., Белянова Л.П. ( 1973 ) "Аминокислотный состав транскетолазы пекарских дрожжей ". Биохимия 38, 1303-1306.

21. Кочетов Г.А. ( 1986 ) " Транскетолаза: структура и механизм действия ". Биохимия 51, 2010-2029.

22. Кочетов Г.А., Усманов Р.А. ( 1972 ) "Взаимодействие апотранске-толазы с аналогами ТПФ ". ДАН СССР 202, 471-474.

23. Heinrich С., Noack К., Wiss О. (1972) "Chemical modification of thryptophan at the binding site of thiamine-pyrophosphate in transketolase from baker's yeast ". Biochem. Biophys. Res. Commun. 49, 1427-1432.

24. Мешалкина Л.Е., Кочетов Г.А. ( 1979 ) " Роль остатков гистидина транскетолазы пекарских дрожжей ". ДАН СССР 246, 228-231.

25. Куимов А.Н., Мешалкина Л.Е., Кочетов Г.А. (1986) "Функциональная карбоксильная группа в активном центре транскетолазы ". Биохимия 51, 1908-1918.

26. Усманов Р.А., Кочетов Г.А. (1983 ) "Функция остатка аргинина активного центра транскетолазы пекарских дрожжей ". Биохимия 48, 772-781.

27. Ковина М.В., Куимов А.Н., Кочетов Г.А. (1993) " Существенные остатки тирозина транскетолазы пекарских дрожжей. I. Определение типа и количества существенных остатков ". Биохимия 58, 1330-1340.

28. Ковина М.В., Куимов А.Н., Кочетов Г.А. (1993) " Существенные остатки тирозина транскетолазы пекарских дрожжей. П.Исследование функции существенных остатков тирозина ". Биохимия 58, 1341-1350.

29. Кочетов Г.А., Изотова А.Е. (1973) "Реконструкция холотранскето-лазы из апофермента и кофермента". Биохимия 38, 552-560.

30. Kochetov G.A., Philippov P.P., Razjvin A.P., Tikhomirova N.K. (1975) "Kinetics of reconstruction of holotransketolase" FEBS Lett. 53, 211-212.

31. Egan R.M., Sable H.Z. (1981) "Transketolase kinetics. The slow reconstitution of the holoenzyme is due to rate-limiting dimerization of the subunits

32. J. Biol. Chem. 256, 4877-4883.

33. Heinrich C., Steffen H., Janser P., Wiss O. (1972) "Studies on the reconstitution on of apotransketolase with thiamine pyrophosphate and analogs of the coenzyme ". Eur. J. Biochem. 30, 533-541.

34. Morey A., Juni E. (1968) "Studies on the nature of the binding of thiamine pyrophosphate to enzymes ". J. Biol. Chem. 243, 3009-3019.

35. Booth C., Nixon P. (1993) "Reconstitution of holotransketolase is by thiamin-diphosphate magnesium complex ". Eur. J. Biochem. 261-265.

36. Usmanov R., Sidorova N., Kochetov G. (1996) "Interaction of dihy-droxyethylthiamine pyrophosphate with transketolase ". Biochem. Mol. Biol. Intern. 38 307-314.

37. Сидорова H.H., Усманов P.A., Куимов A.H., Кочетов Г.А. (1996) " Обмен кофермента между холотранскетолазой и средой ". Биохимия 61, 635-639.

38. Кочетов Г.А., Кобылянская К.Р. (1970) "Природа и функция аминокислотных остатков транскетолазы, существенных для проявления ее активности". Биохимия 35, 3-11.

39. Kochetov G.A., Izotova А.Е., Meshalkina L.E. (1971) "Ingibition of transketolase by analogues of the coenzyme ". Biochem. Biophys. Res. Commun. 43, 1198-1203.

40. Kuimov A.N., Meshalkina L.E., Kochetov G.A. (1985) "An investigation of the carboxil group function in the active center of transketolase". Biochem. Internat. 6, 913-920.

41. Meshalkina L.E., Kuimov A.N., Kabakov A.E., Tsorina O.N., Kochetov G.A. (1984) "The carboxyl group in the active center of transketolase ". Biochem. Internat. 9, 9-16.

42. James J.-L., Martin P., Singleton C. (1997) "Aspartate 155 of human transketolase is essential for thiamine diphosphate magnesium binding, and cofactor binding is reguired for dimer formation ". Biochem. Biophys. Acta 1341, 165-172.

43. Кочетов Г.А., Изотова A.E. (1973) "Условия отщепления тиамин-пирофосфата от холотранскетолазы". Биохимия 38, 954-957.

44. Усманов Р.А., Нейф X., Пустынников М.Г., Шелленбергер А., Кочетов Г.А. (1985) "Исследование коферментной функции 2'-нор и 4-нор тиаминпирофосфата в транскетолазной реакции". ДАН СССР 282, 479-486.

45. Jordan F., Chen G., Nishikawa S., Wu B.S. (1982) "Potential roles of aminopirimidine ring in thiamine catalyzed reaction ". Ann. N.Y. Acad. Sci. 378, 14-29.

46. Biaglow J.E., Micyal J.J., Suchy J., Sable H. (1969) "Coenzyme Interactions. П1. Characteristics of molecular complex of thiamine with Indole derivates ". J. Biol. Chem. 244, 4054-4062.

47. Kochetov G.A., Usmanov R.A. (1970) "Charge transfer interaction in transketolase-thiamine pyrophosphate complex". Biochem. Biophys. Res. Commun. 41, 1134-1140.

48. Analyt. Biochem. 88, 296-301.

49. Datta A., Racker E. (1961) "Mechanism of action of transketolase. I. Properties of the cristalline yeast enzyme ". J. Biol.Chem. 236, 617-624.

50. Кочетов Г.А., Филиппов П.П. (1970) "Кальций кофактор транс-кетолазы пекарских дрожжей ". Биохимия 35, 422-424.

51. Kochetov G.A., Philippov P.P. (1970) "Calcium: cofactor of transketolase from baker's yeast ". Biochem. Biophys. Res. Commun. 38, 930-933.

52. Sprenger G., Schorken U., Sprenger G., Sahm H. (1995) "Transketolase A of Escherichia coli K-12. Purification and properties of the enzymes from recombinant strains ". Eur. J. Biochem. 230, 525-532.

53. Kochetov G.A., Tikhomirova N.K., Philippov P.P. (1975) "The binding of thiamine pyrophosphate with transketolase in equilibrium conditions ". Biochem. Biophys. Res. Commun. 63, 924-930

54. Tikhomirova N.K., Kochetov G.A. (1990) "Purification of transketolase from baker's yeast by an immunosorbent ". Biochem. Intern. 22, 31-36.

55. Тихомирова H.K., Кочетов Г.А. (1991) "Новый метод выделения и новая форма транскетолазы из пекарских дрожжей Биохимия 56, 1123-1130.

56. Кочетов Г.А. (1980) Практическое руководство по энзимологии. "Высшая школа ", М.

57. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. (1991) Справочник биохимика. "Мир", М, 116.

58. Самарский А.А., Гулин А.В. (1989) Численные методы. "Наука", М., 430.

59. Calahan D.A. (1967) Proc. IDEE 55, 2016-2017.

60. Wikner G., Meshalkina L., Nilsson U., Bakstrom S., Lindqvist Y., Schneider G. (1995) "His 103 in yeast transketolase is required for substrate recognition and catalysis Eur. J. Biochem. 233, 750-755.