Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие апотранскетолазы пекарских дрожжей с тиаминширофосфатом

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие апотранскетолазы пекарских дрожжей с тиаминширофосфатом"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В. ЛОМОНОСОВА РГ6 од

т

Кафедра биохимии Биологического факультета и отдел биохими

клетки НИИ физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского

Яо»

На правах рукописи

КОЧЕВОВА НАТАЛЬЯ ВИКТОРОВНА

УДК.577.152.2

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АПОТРАНСКЕТОЛАЗЫ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ С ТИАМИНПИРОФОСФАТОМ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2000

Работа выполнена в отделе биохимии животной клетки Института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского Государственного Университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Г.А.Кочетов

Официальные оппоненты:

доюгор биологических наук, профессор НИ.Чернов доктор химических наук, профессор А.М.Юркевич

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН

им.В. А.Энгельгардта

Защита состоится ^ декабря 2000 г. в 1530 часов на заседании

университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан { ИСШН^Я-_2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ^Иа^Ъ ~~ М.В .Медведева

Характеристика работы.

Актуальность проблемы. Транскетолаза (ТК)* на протяжении многих лет является объектом интенсивного исследования. Этот фермент катализирует один из ключевых этапов пентозофосфатного пути превращения углеводов: реакцию расщепления кетосахаров по С-С связи, соседней с кетогруппой, и последующий перенос двухуглеродного фрагмента с субстрата-донора (кетозы) на субстрат-акцептор (альдозу). Кофакторами ТК являются ионы двухвалентных металлов (Са + , Мя + и др.) и ТПФ.

На сегодняшний день наиболее полно исследованы свойства ТК пекарских дрожжей. Фермент состоит из двух идентичных субъединиц и имеет два активных центра, расположенных на границе между контактирующими поверхностями мономеров. Активные центры характеризуются одинаковой ферментативной активностью. К настоящему времени определен аминокислотный состав, первичная и вторичная структуры фермента, получена достаточно подробная информация о его кристаллической структуре, оптических свойствах и их изменениях при связывании различных лигандов. Методами химической модификации, рентгено-структурного анализа и направленного мутагенеза идентифицированы аминокислотные остатки, необходимые для связывания ТПФ и для катализа.

Несмотря на то, что достаточно хорошо изучена структура ТК и общий механизм тиаминового катализа, по существу нет данных о кинетическом механизме функционирования ТК, и в частности, при связывании ее с коферментом. Так, например, уже давно установлено, что активные центры фермента неэквивалентны по связыванию ТПФ. Однако, какова причина этой неэквивалентности, до сих пор оставалось неясным. Традиционные способы исследования не могли дать ответа на указанные вопросы.Для их решения требовалось найти новый методический подход.

Цель исследования. Целью настоящей работы являлось изучение процесса взаимодействия кофермснта с апоТК пекарских дрожжей в присутствии Са+2 и , определение значений констант его индивидуальных стадий и выяснение причины неэквивалентности активных центров фермента по связыванию ТПФ.

Научная новизна работы. Разработан новый подход к изучению процесса взаимодействия апоТК с ТПФ - метод кинетического моделирования, позволивший определить кинетические параметры индивидуальных стадий вышеуказанного процесса.

Установлена причина неэквивалентности активных центров ТК по

"■Список сокращений: ТК - транскетолаза, ТПФ - тиаминпирофос-фат, Кс-5-Ф - ксилулозо-5-фосфат, Р-5-Ф - рибозо-5-фосфат.

связыванию ТПФ.

Решен спорный вопрос о характере кооперативных взаимоотношений между ТПФ-связывающими центрами ТК в присутствии магния.

Получены прямые доказательства изменения конформации ТК на второй стадии взаимодействия кофермента с апобелком.

Методом кинетического моделирования, который был использован при исследовании процесса реконструкции холоТК дикого типа, изучено связывание ТПФ с мутантной по His 103 апотранскетолазой. Установлено, что данная мутация не изменяет общий механизм образования холофермента и ее влияние на этот процесс зависит от типа двухвалентного катиона ( Са+2 или Mg+2 ), выступающего в качестве кофактора транскетолазной реакции.

На основании полученных экспериментальных данных высказапо предположение о том, что структура активного центра ТК, сформированного в присутствии кальция, не идентична структуре активного центра, сформированного в присутствии магния.

Практическое значение работы. Результаты проведенных исследований позволили расширить наши представления о механизме образования холоТК из ano- и кофермента.

Новые методические приемы (ив частности, метод кинетического моделирования) могут быть использованы при работе с мутантными формами ТК и другими тиаминовыми ферментами.

имодействии с коферментом в зависимости от типа двухвалентного катиона ( Са+" или Ivíg+2 ), что может составить тему отдельного исследования.

Полученные результаты могут быть использованы при чтении спецкурсов по энзимологии и в лабораторной практике на кафедрах биохимии биологических факультетов.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского МГУ, а также на Втором съезде биохимического общества РАН ( Москва, 1997 ).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 печатные работы.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем работы составляет МО страниц, включая 2 таблицы и 31 рисунок.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Транскетолазу пекарских дрожжей выделяли по известному ранее методу [ Tikhomirova, Kochetov, 1990 ]. Препараты кристаллического фермента хранили в 50%-ном растворе сульфата аммония, pH 7,6. АпоТК получали, как описано ранее [ Кочетов, Изотова, 1970 ]. Перед использованием ее обессоливали на колонке с сефадексом G-50. Фермент был гомогенен согласно данным ДСН-электрофореза и имел удельную активность 16 Е/мг. Мутантная форма ТК была предоставлена нам профессором Г. Шнайдером (G. Schneider) из Каролинского института г.Стокгольма (Швеция).

Определение кониентраиии белка. В растворах гомогенной ТК концентрацию белка определяли спектрофотометрически, используя коэффициент молярной экстинкции Е1% 2зо = 14,5. Во всех остальных случаях -также спектрофотометрически, при 260 и 280 нм, с последующим расчетом по номограмме.

Определение активности ТК • спектрофотометрически по скорости окисления NADH ( либо восстановления NAD ) при 340 нм в системе с сопрягающими ферментами. В качестве субстрата использовалась смесь фосфопентоз (Kc-5-Ф и Р-5-Ф).

Смесь фосфопентоз. служившую субстратом при определении активности ТК, получали из рибозо-5-фосфата [ Кочетов, 1980 ].

Электрофорез в полиакриламидном геле. ДСН-электрофорез в 12,5% полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли [ Laemmli, 1970 ].

Определение кониентраиии ТПФ проводили спектрофотометрически по величине оптической плотности при 272,5 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 7800 М"1- см'1 .

Чистоту препарата ТПФ определяли методом тонкослойной восходящей хроматографии на пластинах "Целлюлоза F-254, Мерк" (ФРГ) в системе бутанол-вода-уксусная кислота в соотношении 5: 3: 2,

Связывание апоТК с ТПФ в присутствии различных двухвалентных катионов (Са+ или Mg+2) изучали, используя оптический метод, основанный на следующих, ранее установленных фактах.

При взаимодействии ТПФ с апоТК в спектре поглощения появляется новая полоса с максимумом при 315-320 нм, которая отсутствовала у исходных компонентов и свидетельствует об образовании каталитически активного холофермента. Интенсивность этой полосы прямо пропорциональна доле реконструированного каталитически активного холофермента. При низкой концентрации ТПФ взаимодействие апоТК с кофермен-том протекает достаточно медленно, что позволяет следить за ходом реакции в процессе инкубации апофермента с ТПФ. За ходом реконструкции холоТК следили по изменению оптической плотности при 315 нм. Измерения проводили на спектрофотометре "Aminco DW2000".

Для определения кинетических параметров индивидуальных стадий процесса взаимодействия апоТК с ТПФ использовали метод кинетического моделирования. Компьютерный анализ и математическую обработку данных осуществляли совместно с сотрудником Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино), к.б.н. В.А.Селивановым.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Взаимодействие латнвной ТК пекарских дрожжей с ТПФ.

Известно, что при связывании ТПФ с апотранскетолазой в спектре поглощения появляется новая полоса с максимумом при 315-320 нм, которая отсутствует у исходных компонентов и свидетельствует об образовании каталитически активного холофермента.

Согласно литературным данным, связывание ТПФ апотранскетолазой происходит, как минимум, в две стадии: быстрая первичная ассоциация ("первичное" связывание), обусловленная взаимодействием конечного фосфатного (или пирофосфаткого) остатка кофермента с апобелком, в результате чего образуется каталитически неактивный легко диссоциирующий комплекс ТК'ТПФ, и последующее медленное многоточечное .связывание, сопровождающееся конформационным изменением молекулы белка ( "вторичное" связывание ), которое приводипс~образовашя&-каталитически активного холофермента. Наличие конформационных изменений на второй стадии процесса взаимодействия ТПФ с апоТК было показано нами и в прямых экспериментах, в которых исследовалась корреляция между изменением оптической плотности при 220 нм. и количеством образующегося холофермента. Для одного активного центра процесс его взаимодействия с ТПФ может быть описан следующей схемой:

ТК + ТПФ <—> ТК ' ТПФ <—> ТК*-ТПФ

С учетом того,что ТК представляет собой гомодимер, содержащий два активных центра, и, следовательно, присоединяет две молекулы ТПФ, вышеприведенная схема существенно усложняется (рис.1).

Здесь Е - активный центр апоТК, Т - ТПФ, ЕТ - первичный легко диссоциирующий каталитически неактивный комплекс, ЕТ - активный холофермент по одному активному центру. Нужно отметить, что спектральными характеристиками каталитически активного холофермента (то есть поглощением при 315-320 нм ) обладает только форма ЕТ. Основываясь на данных рентгеноструктурного анализа, мы допустили, что оба центра апоТК исходно ( структурно ) эквивалентны и, следовательно, ТПФ связывается равновероятно с любым из них. В данной модели предполагается, что "первичное" связывание происходит гораздо быстрее

Рис.1. Схематическое изображение процесса взаимодействия активных центров транскетолазы с ТПФ. Обозначения см. в тексте.

конформационного перехода, и в каждый момент времени в ходе "вто-ричного"связывания равновесие между свободными активными центрами и первичными комплексами уже установилось. Это дает возможность при описании процесса использовать вместо кинетических констант первой стадии (констант скоростей) равновесные (константы диссоциации). К (1 и К с! - константы диссоциации первичного комплекса, содержащего одну или две молекулы ТПФ. К3<1 - константа диссоциации первичного комплекса, содержащего один каталитически активный центр, к. и к., -кинетические константы, соответственно, прямого и обратного конформационного перехода для разных форм фермента.

На представленной схеме показано, что взаимодействие апоТК с первой молекулой ТПФ приводит к "первичному" связыванию последней с одним из активных центров, в результате чего образуется каталитически неактивный полухолофермент, который, в свою очередь, претерпевая конформационные изменения, преобразуется в каталитически активный полухолофермент. При взаимодействии второй молекулы ТПФ с этой формой ТК, происходит "первичное" связывание кофермента со вторым активным центром с последующей его активацией, что приводит к образованию каталитически активного холофермента. Если со второй молекулой ТПФ взаимодействует неактивная полухолоТК, то в этом случае также наблюдается "первичное" связывание кофермента со вторым активным центром, с последующей активацией сначала первого, а потом и второго активного центра, что, в конечном счете, опять приводит к образованию каталитически активного холофермента.

Значения кажущихся констант диссоциации для первого и второго

активных центров ТК, имеющиеся в литературе, получены без учета двустадийности процесса и поэтому не могли быть непосредственно использованы для описания связывания ТПФ по схеме на рис.1. Тем не менее различие этих констант для первого и второго центров свидетельствовали об их неэквивалентности и, следовательно, о возможном различии между константами диссоциации первичного комплекса и (или) кинетическими константами второй стадии связывания.

В настоящей работе мы использовали кинетическую модель как для определения частных кинетических параметров обеих стадий взаимодействия апоТК с ТПФ для каждого активного центра димера, так и с целью выявить стадию, на которой реализуется взаимовлияние центров при связывании кофермента.

Как уже указывалось, при связывании ТПФ с апоТК в спектре поглощения появляется новая полоса с максимумом при 315-320 нм, что свидетельствует об образовании каталитически активного холофермента (форма ЕТ на рис.1.). Установлено, что интенсивность этой полосы прямо пропорциональна доле реконструированного каталитически активного холофермента. Используя эти факты, исследовали взаимодействие ТПФ с апоТК, регистрируя не только конечный уровень интенсивности поглощения для каждой из используемых концентраций кофермента, но

после добавления ТПФ. Регистрацию реконструкции холоТК проводили при 315 нм как в присутствии кальция, так и в присутствии магния.

1.1 Связывание кофермента с ТК в присутствии Са+2.

Вначале поставили эксперименты по титрованию апоТК малыми порциями ТПФ ( когда концентрация кофермента после одной добавки была меньше концентрации фермента в несколько раз ) . Равновесную концентрацию холоТК после каждой добавки ТПФ определяли по конечному уровню изменения оптической плотности при 315 нм. На рис.2 показана кинетика образования холоТК в присутствии кальция в серии малых последовательных добавок ТПФ. Каждая добавка ТПФ дает увеличение его концентрации на 6,6 мкМ. Этот процесс описывали теоретически, согласно представленной выше схеме (рис.1) - точками показаны экспериментальные значения, линиями - теоретические. На основании этих данных была получена зависимость равновесного содержания холоТК от общей концентрации ТПФ в среде в присутствии кальция (рис.3). Видно, что с увеличением концентрации добавленного ТПФ возрастание содержания холоТК вплоть до 50% происходит линейно, причем добавленный ТПФ связывается практически полностью. Дальнейшее увеличение общей концентрации кофермента приводит к уменьшению доли связываемого ТПФ, что является результатом меньшего сродства второго активного центра к нему. Уровня равновесия кривая титрования достигает, примерно, при 60 мкМ добавленного ТПФ.

Время реконструкции, с

Рис.2. Кинетика образования холофермента в присутствии Са+2 в серии малых последовательных добавок ТПФ (кривые 1-8). Точки получены экспериментально, линии рассчитаны для набора параметров, представленных в табл.1. АпоТК (димер), 14 мкМ; СаС12, 2 мМ.

100-,

[ТПФ], мкМ

Рис.3. Зависимость равновесного содержания холофермента в препарате ТК от общей концентрации ТПФ в среде в присутствии Са+ . Точки получены экспериментально, линия рассчитана для набора параметров, представленных в табл.1. АпоТК (димер), 14 мкМ; СаС12, 2 мМ.

Определение значений констант реконструкции холоТК в соответствии с представленной выше схемой (рис.1) требовало не только наличие равновесных данных, но и получение временных зависимостей образования холоТК при разных концентрациях ТПФ.

На рис.4 показана кинетика образования холоТК в присутствии кальция при разных концентрациях ТПФ. Этот процесс также описывали теоретически, согласно предложенной выше схеме ( точками показаны экспериментальные данные, линиями - теоретические). Удовлетворительное совпадение теоретических кривых с экспериментальными данными для большого интервала концентраций ТПФ свидетельствует о правильности подобранных параметров, которые представлены в таблице 1.

Бремя,о

Рис.4. Кинетика образования холофермента в присутствии Са+2 при избыточных концентрациях ТПФ. Точки получены экспериментально, линии рассчитаны для набора параметров, представленных в табл.1. АпоТК (димер), 4 мкМ; СаС12, 2 мМ.

Видно, что первичные константы диссоциации разных форм фермента равны между собой (1<М=К2ё=К3с1). Прямой конформацион-ный переход во втором центре протекает с той же скоростью, что и в первом (к3= к^. Скорость обратного конформационного перехода во втором центре (к.3), по сравнению с этим процессом, происходящим в первом центре (ки), увеличивается примерно в 9 раз, что и является причиной неэквивалентности активных центров ТК по связыванию кофермента. Таким образом, в присутствии кальция взаимовлияние центров ТК проявляется лишь после завершения обеих стадий связывания ТПФ в обоих активных центрах фермента.

Таблица 1. Кинетические характеристики процесса реконструкции нативной холоТК из ano- и кофермента в присутствии Са+2 и Mg+2.

Параметр Тип двухвалентного катиона

С а" Mg+¿

K'd, мкМ 300 500

КЧ мкМ 300 500

KJd, мкМ 300 500

кь с 1 0,7 0,3

к.ъ с" 0,00035 0,002

К с1 0,7 0,3

к.7, с"' 0,00035 0,002

i, -i к-), с 0,7 0,3

к.,, с"1 0,003 0,005

1.2. Связывание кофермента с ТК в присутствии Mg*2.

Для изучения процесса взаимодействия апоТК с ТПФ в присутствии магния использовали кинетическую модель и метод, рассмотренные выше применительно к экспериментам, в которых в качестве кофактора использовался кальций.

На рис.5 показана кинетика образования холоТК в серии малых последовательных добавок ТПФ в присутствии магния. Первое, что бросается в глаза при сопоставлении графиков, представленных на рис.3 и 5, это их различие по оси абсцисс, где отложено время реконструкции холофермента, выраженное в секундах. При наличии в реакционной среде кальция (рис.3) время образования холоТК исчисляется десятками секунд, в присутствии же магния (рис.5) - это сотни секунд.

На следующем рисунке (рис.6) представлена зависимость равновесного содержания холоТК от общей концентрации ТПФ в среде в присутствии кальция (1) и магния (2). Видно, что эти зависимости отличаются друг от друга. Кривая титрования, полученная при использовании магния в качестве кофактора, достигает своего равновесного уровня при концентрации добавленного ТПФ, равной, примерно, 150 мкМ, в то время как для случая с кальцием этот уровень регистрируется при 60 мкМ концентрации добавленного кофермента.

При изображении результатов, полученных в экспериментах с магнием (кр. 2 на рис.6), в двойных обратных координатах были получены кажущиеся суммарные константы диссоциации для первого и второго активных центров ТК, равные 0,86 и 2,2 мкМ соответственно. При использовании в опытах кальция константа по второму центру составляла 0,33 мкМ. Все вышесказанное свидетельствует о том, что при наличии в реакционной среде магния, ТК связывает ТПФ значительно

время, с

Рис.5. Кинетика образования холофермента в присутствии в серии малых последовательных добавок ТПФ (кривые 1-13). Каждая добавка ТПФ дает увеличение его концентрации на: 1,45 мкМ (1-8), 2,86 мкМ (9-12), 72,35 мкМ (13). Точки получены экспериментально, линии

рассчитаны для набора параметров, представленных в таол.1. АпоТК-(димер), 5,9 мкМ; К^С12, 2 мМ.

[ТПФ], НЕМ

Рис.6. Зависимость равновесного содержания холофермента в препарате ТК от общей концентрации ТПФ в среде в присутствии Са+2 (1) и (2). Точки получены экспериментально, линии рассчитаны для набора параметров, представленных в табл.1. АпоТК (димер), 14мкМ (кривая 1) или 5,9 мкМ (кривая 2); СаС12 (или МцС12), 2 мМ.

слабее, чем в присутствии кальция.

Для получения кинетических параметров индивидуальных стадий процесса реконструкции холоТК в присутствии магния была экспериментально получена кинетика связывания кофермента в большом диапозоне концентраций последнего и сравнена с теоретической (рис.7).

Удовлетворительное соответствие теоретических и экспериментальных кривых при разных концентрациях ТПФ наблюдается при наборе параметров, представленных в таблице 1. Видно, что в присутствии магния, как и в присутствии кальция, влияние первого центра на второй

Рис.7. Кинетика образования холофермента в присутствии Mg+Z при низких и высоких концентрациях ТПФ. Точки получены экспериментально, линии рассчитаны для набора параметров, представленных в табл.1. АпоТК (димер), 4,76 мкМ; МдС12, 2 мМ.

испытывает только реакция обратного конформационного перехода во втором центре (к.3>к.1). Причем ее скорость, по сравнению со скоростью этого же процесса, происходящего в первом центре, меняется в 2,5 раза, что почти совпадает с разницей в сродстве к ТПФ двух активных центров ТК (см. выше). Прямая реакция в первом центре протекает с той же скоростью, что и во втором (к,=к3). Первичные константы диссоциации для разных форм фермента равны между собой (КМ=К2с1=К3с1).

Таким образом, в присутствии магния, как и в случае с кальцием, взаимовлияние центров ТК проявляется лишь после завершения обеих стадий связывания ТПФ в обоих активных центрах фермента.

В литературе существовали две версии по вопросу о характере кооперативных взаимоотношений между активными центрами ТК по связыванию ТПФ в присутствии магния. По данным одних авторов, здесь, как и в случае с кальцием, наблюдается отрицательная кооператив-

"Т5 ' 55 1 зБ ' 5 ' Э> ' ¡5 ' ?с

Еремя, с

ность. В то же время, результаты, полученные другой группой исследователей, указывали на наличие положительной кооперативное™ между ТПФ-связываюгцими участками фермента в присутствии магния. Наши данные, проанализированные по предложенной выше схеме и представленные в таблице 1, а также значения кажущихся суммарных констант диссоциации, о которых говорилось раньше, указывают на то, что в присутствии магния, так же как и в присутствии кальция, наблюдается отрицательная кооперативность активных центров ТК по связыванию кофермента.

Ко всему прочему, из данных таблицы 1 следует, что замена кальция на магний ослабляет "первичное" связывание кофермента с апоТК - первичные константы диссоциации (K1d=K2d=K3d) возрастают почти в 2 раза. Кроме того, изменяются все параметры, характеризующие "вторичное" связывание ТПФ с апобелком (к, и к.;). Наиболее заметное изменение наблюдается в константе скорости обратного конформационного перехода в первом центре (k.,=k.2) - в результате замены кальция на магний она увеличивается примерно в 6 раз.

Все вышесказанное однозначно указывает на то, что в результате замены кальция на магний сродство обоих активных центров ТК к ТПФ понижается за счет ослабления не только "первичного", но и, в большей степени, "вторичного" связывания кофермента с апобелком. Хотя данные

ство металла с апоферментом взаимодействует пирофосфатная группа ТПФ, т.е. металл непосредственно участвует в "первичном", но не во "вторичном" связывании кофермента с апоТК. Тот факт, что замена кальция на магний влияет не только на "первичное" связывание, но и на "вторичное", возможно, объясняется следующим образом.

Согласно литературным данным, пирофосфатный остаток ТПФ обеспечивает не только прочное присоединение кофермента к апоТК (т.е. выполняет роль "якоря") , но и осуществляет правильную взаимную ориентацию ТПФ и контактирующего с ним участка белка, что, в конечном счете, приводит к образованию каталитически активного холофер-мента. Магний, выступая в качестве кофактора транскетолазной реакции, будет образовывать те же по типу связи с белком и ТПФ, что и кальций. Однако, они будут носить более слабый, неустойчивый характер, нежели связи, образованные кальцием. Это, в свою очередь, прежде всего повлияет на связывание пирофосфатной группы ТПФ - в данных условиях она будет значительно хуже выполнять свои функции "якоря" и обеспечения правильной взаимной ориентации ТПФ и контактирующего с ним участка белка, что, в конечном счете, отразится на связывании кофермента с белком в целом.

2. Взаимодействие с ТПФ мутантной по His 103 ТК.

В экспериментах использовали ТК, в которой аминокислотный остаток His 103 был заменен на аланин.

В настоящее время с достаточной долей уверенности можно говорить о том, что His 103 ТК принимает непосредственное участие в связывании субстрата-донора, взаимодействуя с его гидроксильной группой при первом атоме углерода. Согласно данным рентгенострук-турного анализа [Lindqvist et ah, 1992], His 103 не образует прямых контактов с ТПФ. В то же время, при его замене на аланин сродство кофермента к апоТК снижается примерно в 6-8 раз [Wikner et al., 1995]. При этом кристаллографические исследования мутанта не выявили никаких изменений в его структуре. Спектральные характеристики апо- и холоформ мутантной ТК ничем не отличаются от спектральных характеристик соответствующих, форм нативного белка. Следует заметить, что данные рентгеноструктурного анализа были получены с "кальциевым" холоферментом, а кинетические характеристики (в частности, Кш для ТПФ) определены лишь в системе с магнием.

Исходя из всего вышеизложенного мы исследовали связывание мутантной формы ТК с коферментом методом кинетического моделирования, который был использован при изучении процесса реконструкции холоТК дикого типа. Регистрацию образования холоформы мутанта так же, как и в случае с нативным белком, проводили при 315 нм как в присутствии кальция, так и в присутствии магния.

2.1. Связывание кофермента с мутантной ТК в присутствии Ms*2.

ю-

( ' Ш ' Ж ' зЗо ' Ш)

[ТПФ], икМ

Рис.8. Зависимость равновесного содержания холофермента в препарате нативной (1) и мутантной ТК (2) от общей концентрации ТПФ в среде в присутствии Мд42. Точки получены экспериментально, линии рассчитаны для набора параметров, представленных в табл.1 (1) и табл.2 (2). АпоТК (димер), 5,9 мкМ (кривая 1) или 6,73 мкМ (кривая 2); 2 мМ.

На рис.8 показана зависимость равновесного содержания дативной (1) и мутантной (2) холоТК от общей концентрации ТПФ в среде в присутствии магния. Видно, что эти зависимости значительно отличаются друг от друга, и что в случае мутантной ТК, кривая титрования достигает своего равновесного уровня при концентрации добавленного ТПФ, равной 350 мкМ, в то время как для нативного фермента этот уровень регистрируется при 150-200 мкМ добавленного кофермента. Все это указывает на то, что в присутствии магния в результате мутации сродство ТК к ТПФ заметно ослаблено.

Для определения кинетических параметров индивидуальных стадий процесса реконструкции мутантной холоТК в присутствии магния была получена экспериментально кинетика связывания кофермента в большом диапозоне концентраций последнего и сравнена с теоретической (рис.9). Удовлетворительное совпадение теоретических и экспериментальных кривых при разных концентрациях ТПФ свидетельствует о правильности подобранных параметров. Они приведены в таблице 2.

733. 1167 мкМ ТПФ

80 100

еремл,о

Рис.9. Кинетика образования мутантного холофермента в присутствии при избыточных концентрациях ТПФ. Точки получены экспериментально, линии рассчитаны для набора параметров, представленных в табл.2. АпоТК (димер), 6,73 мкМ; МдС12, 2 мМ.

Согласно данным, представленным в таблицах 1 и 2, значения первичных констант диссоциации (К'<1=К2<1=К3<1), определенные для мутанта в присутствии магния, несколько выше соответствующих параметров, рассчитанных в тех же условиях для фермента дикого типа,

Таблица 2. Кинетические характеристики процесса реконструкции мутантной холоТК из ano- и кофермента в присутствии Са+2 и Mg+2.

Параметр Тип двухвалентного катиона

Ca+¿ MB"

K'd, мкМ 300 600

K¿d, мкМ 300 600

K'd, мкМ 300 600

К с'1 0,7 0,12

к.„ с/ 0,00035 0,005

к7, с"1 0,7 0,12

к.„ с ' 0,00035 0,005

к„ с"' 0,7 0,12

кс"1 0,003 0,015

что говорит об ослаблении "первичного" связывания в результате мутации. Кроме того, мутация приводит к изменению всех параметров, характеризующих "вторичное" связывание ТПФ с апобелком.

Таким образом, в присутствии магния в результате замены в молекуле апоТК His 103 на аланин меняются все кинетические характеристики процесса реконструкции холоТК из апофермента и ТПФ. Это согласуется с достаточно резким, в результате мутации, изменением значения Km для ТПФ, измеренным в присутствии магния [Wikner et al., 1995].

2.2. Связывание кофермента с мутантной ТКв присутствии Са+2.

На рис.10 показана зависимость равновесного содержания мутантной холоТК от общей концентрации ТПФ в среде в присутствии кальция. Можно видеть, что эта зависимость носит такой же характер, что и аналогичная зависимость, полученная при связывании ТПФ с нативным белком (рис.3). В обоих случаях, с увеличением общей концентрации кофермента возрастание содержания холоТК вплоть до 50% происходит линейно, причем добавленный ТПФ связывается практически полностью. Дальнейшее увеличение концентрации добавленного ТПФ приводит к уменьшению доли связываемого кофермента, что является результатом меньшего сродства второго активного центра к нему. Равновесного уровня кривые титрования достигают при концентрации добавленного ТПФ, равной 60 мкМ.

Для определения индивидуальных констант процесса образования мутантного холофермента в присутствии кальция была экспериментально получена кинетика связывания кофермента в большом диапозоне концентраций последнего и сравнена с теоретической (рис.11). Наилучшее совпадение расчетных и экспериментальных кривых наблюдается при наборе параметров, приведенных в таблице 2. При сравнении данных, представленных в таблицах 1 и 2, видно, что значения всех кинетических

[ГПФ], мкМ

Рис.10. Зависимость равновесного содержания холофермента в препарате мутантной ТК от общей концентрации ТПФ в среде в присутствии Са . Точки получены экспериментально, линия рассчитана для набора параметров, представленных в табл.2. АпоТК (димер), 5,47 мкМ; СаС12,

355. 790 мкМТПФ

время, с

Рис.11. Кинетика образования мугантного холофермента при избыточных концентрациях ТПФ в присутствии Са+2. Точки получены экспериментально, линии рассчитаны для набора параметров, представленных в табл.2. АпоТК (димер), 5,47 мкМ; СаС12, 2 мМ.

параметров, характеризующих процесс реконструкции мутантной холоТК в присутствии кальция, равны значениям соответствующих

параметров, определенных в тех же условиях для нативного белка.

Таким образом, при наличии в реакционной среде кальция замена в белке His 103 на алапин не оказывает никакого влияния на взаимодействие ТПФ с апоТК, что хорошо согласуется с данными рентгеноструктур-ного анализа [Wikner et al., 1995]. Он показывает, что структура холоТК, полученная в присутствии кальция, одинаковая вне зависимости от того, использовался ли для реконструкции нативный или мутантный по His 103 апобелок.

Из всего вышеизложенного следует, что в результате замены в молекуле апоТК аминокислотного остатка His 103 на алапин общий мсхагшзм образования холоТК (изображенный на рис.1) остается неизменным. Также, как и в случае с ферментом дикого типа, причиной неэквивалентности активных центров ТК по связыванию ТПФ является различие в константах скоростей обратных реакций на второй стадии процесса взаимодействия кофермента с апобелком ( k.3>k.1 , см. таблицы 1 и 2). Изменение количественных характеристик процесса реконструкции холоТК в результате мутации наблюдается лишь в том случае, если реконструкция осуществлялась в присутствии магния, но не кальция. При этом понижается сродство ТК к ТПФ как за счет ослабления "первичного", так и "вторичного" связывания кофермента с апобелком. Одно из возможных объяснений различного, в зависимости от типа используемого при реконструкции катиона, поведения мутантной ТК, может быть следующее.

Методом рентгеноструктурного анализа было установлено [Liadqvist et al., 1992], что His 103 находится около 4'-NII2-группы пири-мидинового кольца ТПФ, но не образует никаких связей с коферментом. Однако, она взаимодействует с 4'-NH2-rpynnoft через молекулу воды, которая удерживается за счет водородных связей с остатками His 103, His 481 и с 4'-NH2-rpyrmoft ТПФ. Удаление His 103 при его замене на аланин может разрушить сеть этих водородных связей, что вызовет определенные конформационные изменения в белке, которые могут привести к ослаблению его связывания с ТПФ. В дополнение к этому, как было сказано выше, магний, выступая в качестве кофактора транскетолазной реакции, при взаимодействии ТК с ТПФ образует с ними более слабые, неустойчивые связи, чем кальций, что, в первую очередь, ухудшает связывание с белком пирофосфатной группы кофермента. Все это вместе взятое приводит к нарушению процесса взаимодействия ТПФ с ТК в целом и отражается на сродстве белка к коферменту.

Если процесс реконструкции холофермента протекает в присутствии кальция, то связи, образованные им с белком и ТПФ, в отличие от магния, будут более прочными. Поэтому незначительные изменения в структуре фермента в области связывания пиримидинового кольца ТПФ, вызванные заменой His 103 на аланин, не смогут ощутимо нарушить процесс взаимодействия кофермента с белком в целом.

В настоящее время трудно (если вообще возможно) более точно

интерпретировать факт различного влияния мутации ТК по His 103 на процесс образования холофермента в зависимости от природы двухвалентного катиона (Са+г или Mg+2). Для этого требуется ряд дополнительных данных, и прежде всего - данных рентгеноструктурного анализа. Последний сделан пока только для кристаллов нативной и мутантной холоТК, полученных в присутствии кальция.

ВЫВОДЫ.

1. С помощью кинетической модели, учитывающей кооперативное взаимодействие двух исходно идентичных активных центра апотранске-толазы, проанализирован двустадийный механизм связывания кофермен-та с каждым из них. Определены кинетические характеристики индивидуальных стадий этого процесса.

2. Установлено, что в присутствии магния, как и в присутствии кальция, имеет место отрицательная кооперативность двух активных центров по связыванию тиаминпирофосфата.

3. Показано, что причиной неэквивалентности активных центров является различная скорость обратного конформационного перехода на второй стадии процесса взаимодействия кофермента с апобелком.

4. В результате замены в молекуле апотранскетолазы аминокислотного остатка His 103 на аланин общий механизм реконструкции холофермента остается неизменным, оттник'' н ири^ут^-трии магния, но не кальция. изменяются значения констант всех индивидуальных стадий.

5. На основании полученных экспериментальных данных сделано предположение о том, что структура активного центра транскетолазы, сформированного в присутствии магния, не идентична структуре активного центра, сформированного в присутствии кальция.

6. Получены прямые доказательства изменения конформации ТК на второй стадии взаимодействия кофермента с апобелком.

Список рабог, опубликованных по теме диссертации:

1. Ковина М.В., Селиванов В.А.. Кочевова Н.В., Кочетов Г.А. (1997) "Кинетический анализ индивидуальных стадий связывания тиаминпирофосфата с активным центром транскетолазы". Тезисы стендовых сообщений Второго съезда биохимического общества РАН, Москва, часть 1, 37.

2. Kovina M.V., Selivanov V.A., Kochevova N.V., Kochetov G.A. (1997) "Kinetic mechanism of active site non-equivalence in transketolase". FEBS Lett. 418, 11-14.

3. Ковина M.B., Селиванов B.A., Кочевова H.B., Кочетов Г.А. (1998) "Исследование кооперативного связывания кофермента активными центрами транскетолазы методом кинетического моделирования". Биохимия 63, 1155-1163.