Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природа оптических изменений при взаимодействии транскетолазы с лигандами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Быкова, Ирина Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Структура транскетолазы.

1.1. Общая структура транскетолазы.

1.1.1. Сравнение структур апо- и холотранскетолазы.

1.2. Структура активного центра транскетолазы.

1.2.1. Ионы двухвалентных металлов.

1.2.2. Область связывания тиаминдифосфата

1.2.3. Взаимодействие кофакторов (тиаминдифосфата и ионов кальция) с молекулой транскетолазы.

1.2.4. Связывание тиаминдифосфата с транскетолазой и образование каталитически активного центра фермента.

1.3. Взаимодействие субстратов с активными центрами транскетолазы.

2. Механизм транскетолазной реакции.

3. Функциональная неэквивалентность активных центров транскетолазы.

3.1. Неидентичность активных центров транскетолазы по связыванию ионов металлов и тиаминдифосфата.

3.2. Неидентичность активных центров транскетолазы при химической модификации аминокислотных остатков.

4. Оптические характеристики транскетолазы.

4.1.1. Изменение оптических характеристик транскето л азы при связывании тиаминдифосфата.

4.2. Изменение оптических характеристик транскетолазы при связывании субстратов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Материалы.

2. Методы.

2.1. Выделение транскетолазы.

2.1.1. Получение иммунной колонки.

2.1.1.1. Синтез BrCN.

2.1.1.2. Активация сефарозы.v.

2.1.1.3. Получение иммунной сыворотки.

2.1.1.4. Очистка антител.

2.1.1.5. Получение иммунноаффинной колонки.

2.2. Получение субстратов транскетолазы.

2.2.1. Получение ксилулозо-5-фосфата, свободного от примеси альдегидов.

2.2.1.1. Определение концентрации ксилулозо-5-фосфата.

2.2.1.2. Определение количества примеси альдегидов в препарате ксилулозо-5-фосфата.

2.2.1.3. Получение ксилулозо-5-фосфата, свободного от примеси альдегидов.

2.3. Определение активности транскетолазы.

2.3.1. Активность транскетолазы с использованием двух субстратов.

2.3.2. Активность транскетолазы с использованием одного субстрата.

2.4. Получение препарата апотранскетолазы.

2.5. Получение холотранскетолазы из апотранскетолазы и тиаминдифостфата.

2.6. Определение концентрации белка.

2.7. Определение чистоты препарата тиаминдифосфата.

2.8. Определение концентрации тиаминдифосфата.

2.9. Исследование влияния изменения кислотности среды на спектральные характеристики холотранскетолазы.

2.10. Спектры кругового дихроизма.

2.11. Спектры поглощения.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Природа спектральных изменений при взаимодействии тиаминдифосфата с апотранскетолазой.

1.1. Спектральные характеристики тиаминдифосфата.

1.2. Влияние изменения кислотности среды на оптические характеристики тиаминдифосфата и амплитуду индуцированной полосы поглощения холотранскетолазы.

1.3. Влияние ароматических компонентов на поглощение тиаминдифосфата.

2. Исследование оптических характеристик пируватдегидрогеназы.

3. Природа спектральных изменений при взаимодействии холотранскетолазы с субстратами.

3.1. Взаимодействие транскетолазы с необратимо расщепляемыми субстратами.

3.2. Взаимодействие транскетолазы с обратимо расщепляемыми субстратами.

3.3. Причина различий спектров кругового дихроизма холотранскетолазы в присутствии необратимо и обратимо расщепляемых субстратов.

3.4. Односубстратная реакция, катализируемая транскетолазой.

3.4.1. Конечные продукты односубстратной реакции, катализируемой транскетолазой, при использовании ксилулозо-5-фосфата в качестве субстрата.

3.4.2. Характеристики односубстратной реакции, катализируемой транскетолазой.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Природа оптических изменений при взаимодействии транскетолазы с лигандами"

Транскетолаза (седогептулозо-7-фосфат: D-глицеральдегид-З-фосфат гликольальдегидтрансфераза, КФ 2.2.1.1) - фермент пентозофосфатного пути превращения углеводов. Катализирует перенос двууглеродного фрагмента, остатка гликольальдегида, с кетозы (субстрата-донора) на альдозу (субстрат-акцептор):

СН2ОН с=о

НСОН R

ТК

НОСН + НСО

НСОН

НСОН

R' R

СН2ОН с=о

НСО + НОСН

НСОН

R'

Функцию субстрата-донора выполняют ксилулозо-5-фосфат, фруктозо-6-фосфат, седогептулозо-7-фосфат, эритрулоза и др. Минимальные требования к структуре субстрата-донора - это наличие гидроксильных групп при атомах С1 и СЗ, кетогруппы при атоме С2 и транс-положение гидроксилов при атомах СЗ и С4. Трехуглеродные субстраты-доноры - гидроксипируват и диоксиацетон (рис.1 А), не имеющие асимметрических атомов углерода, представляют собою исключение. Фермент мало специфичен по отношению к длине углеродной цепочки; наличие фосфатной группы в молекуле субстрата-донора существенно повышает его сродство к ферменту [1]. Субстратами-акцепторами транскетолазы являются - рибозо-5-фосфат, эритрозо-4-фосфат, фосфоглицериновый альдегид, гликольальдегид и др.

Транскетолазная реакция обратима; однако при использовании гидроксипирувата, который подвергается декарбоксилированию, процесс становится необратимым.

ТК было открыта в 1953г. и в настоящее время обнаружена практически во всех исследованных тканях животного и растительного происхождения, а также у микроорганизмов. Локализуется в растворимой фракции клетки. Кофакторами транскетолазы являются ионы двухвалентных металлов и ТДФ (рис.1 Б).

На сегодняшний день наиболее полно исследованы свойства ТК пекарских дрожжей. Фермент состоит из двух идентичных субъединиц, не связанных между собой ковалентными связями, и имеет молекулярную массу 159±6 кДа [2-6]. Два активных центра ТК, характеризующиеся равной каталитической активностью [7,8], расположены на границе между контактирующими поверхностями субъединиц [2] . Определен аминокислотный состав, первичная [9,10] и вторичная [11] структуры фермента, выполнен его PC А [2, 12-16]. Имеется довольно подробная информация об оптических свойствах и их изменениях при связывании с ТК различных лигандов [1,17,18-26].

Взаимодействие апоТК с ТДФ (в присутствии ионов двухвалентных металлов) и образование каталитически активного холофермента сопровождается появлением как в спектре КД, так и в спектре поглощения, новой полосы, отсутствовавшей у исходных компонентов, -ИНН (индуцированной полосы поглощения) [21, 24, 27]. Амплитуда ИПП коррелирует с количеством активного холофермента и является характеристикой каталитически активного холофермента [7, 8, 27].

Взаимодействие субстратов с холоТК и их энзиматическое превращение также сопровождаются значительными спектральными изменениями в области ИПП [1, 28]. Несмотря на то, что причина указанных спектральных изменений до сих пор оставалась не известной, они широко использовались в экспериментальной практике для изучения сн2он I с=о I сн2он

Диоксиацетон

СН2ОН I с=о I но-с

II о

Гидроксипируват

СН2ОН I с=о I но-с-н I н-с-он

I ^

Ксилулозо-5-фосфат

СН2ОН I с=о I но-с-н I н-с-он I н-с-он 1 ^ ноне-О-(р)

Фруктозо-6-фосфат

H3C^n сн

Йг-г-СНз О О

3Д5 I" II

Ч 1/^СН2-СН2-0-Р -о-р

NH, он I

ОН I

ОН

Рис. 1. А - структура некоторых субстратов-доноров транскетолазы, Б - структура тиаминдифосфата. процесса взаимодействия ТДФ с апоТК [29-31] и характеристики индивидуальных стадий транскетолазной реакции [28].

Целью нашей работы было исследование природы оптических изменений, сопровождающих как связывание ТДФ с апоТК с образованием холофермента, так и последующее взаимодействие холоТК с субстратами в процессе ферментативной реакции.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Транскетолаза была первым тиаминовым ферментом, подвергнутым рентгеноструктурному анализу; сначала - с разрешением в 2,5 А [2], а затем - в 2 А [16]. К настоящему моменту выполнен РСА апо- [13] и холофермента [2, 16], различных комплексов ТК с аналогами ТДФ [14, 15], мутантных форм ТК [32-35], а также комплекса ТК с субстратом-акцептором - эритрозо-4-фосфатом [36]. Данные, полученные с помощью РСА, способствовали лучшему пониманию структуры фермента, строению его активного центра, а также дали толчок к более глубокому изучению механизма тиаминового катализа. Следует отметить, что впоследствии был выполнен РСА таких тиаминдифосфатных ферментов как дрожжевая пируватдекарбоксилаза [37, 38], пируватдекарбоксилаза Zymomonas mobilis [39], пируватоксидаза [40, 41], бензоилформиат декарбоксилаза [42], человеческая дегидрогеназа а-кетокислот [43]. Хотя общая структура этих ферментов достаточно различается, формирование активных центров, область связывания двухвалентных катионов и ТДФ, имеет большое сходство. В нашем обзоре мы подробно остановимся на рассмотрении структуры ТК пекарских дрожжей.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Быкова, Ирина Александровна

выводы.

1. Причиной индуцированной полосы поглощения при связывании тиаминдифосфата с апотранскетолазой и образовании каталитически активного холофермента является изменение оптических свойств кофермента под влиянием гидрофобного окружения активного центра фермента.

2. Кофермент в активном центре транскетолазы находится в иминоформе, стабилизированной взаимодействием с остатком фенилаланина 445.

3. Изменение спектра холотранскетолазы в области индуцированной полосы поглощения при добавлении обратимо расщепляемого субстрата обусловлено образованием диоксиэтшггиаминдифосфата, промежуточного продукта транскетолазной реакции.

4. Транскетолаза, наряду с обычной двусубстратной реакцией, способна катализировать и односубстратную, с использованием только субстрата-донора в отсутствие субстрата-акцептора.

5. Конечными продуктами односубстратной транскетолазной реакции, при использовании в качестве субстрата ксилулозо-5-фосфата, являются фосфоглицериновый альдегид и эритрулоза.

Выражаю глубокую благодарность ГЕРМАНУ АЛЕКСАНДРОВИЧУ КОЧЕТОВУ за огромную помощь в выполнении и оформлении настоящей работы.

Выражаю искреннюю признательность МАРИНЕ ВАЛЕНТИНОВНЕ КОВИНОЙ за внимание и обсуждение экспериментальных данных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В представленной работе была исследована и проанализирована природа спектральных изменений, наблюдаемых при связывании ТДФ с апоТК. Полученные экспериментальные данные позволили прийти к заключению, что причиной этих изменений является сам кофермент, изменение его оптических характеристик при встраивании в активный центр фермента, происходящих в результате стабилизации иминоформы аминопиримидинового кольца ТДФ с хиноидной структурой ароматического ядра.

Исследование кинетики спектральных изменений холоТК при ее взаимодействии с обратимо и необратимо расщепляемыми субстратами-донорами дало возможность не только выявить природу этих изменений, но и обнаружить способность ТК катализировать односубстратную реакцию с использованием только субстрата-донора, в отсутствие субстрата-акцептора.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Быкова, Ирина Александровна, Москва

1. Усманов Р.А., Кочетов Г.А. (1983) Связывание субстратов с транскетолазой пекарских дрожжей. Функция анионной группы субстрата-донора. Биохимия, 48, 550-558.

2. Lindqvist, Y., Schneider, G., Ermler, U., Sundstrom, M. (1992) Three dimensional structure of transketolase, a thiamine diphosphate dependent enzyme, at 2,5 A resolution. EMBOJ., 11, 2373-2379.

3. Schneider, G., Lindqvist, Y. (1998) Crystallography and mutagenesis of transketolase: mechanistic implications for enzymatic thiamin catalysis. Biochim. Biophys. Acta, 1385, 387-398.

4. Беляева P.X., Черняк В.Я., Магретова H.H., Кочетов Г.А. (1978) Молекулярный вес и четвертичная структура транскетолазы пекарских дрожжей. Биохимия, 43, 545-554.

5. Cavalieri, S., Neet, К.Е., Sable, H.Z. (1975) Enzymes of pentose biosynthesis. The quaternary structure and reacting form baker's yeast. Arch. Biochem. Biophys., 171, 527-532.

6. Schenk, G., Duggleby, R., Nixon, P. (1998) Properties and functions of the thiamine diphosphate dependent enzyme transketolase. Inter. J. Biochem. & Cell Biol., 30, 1297-1318.

7. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Meshalkina, L.E. (1976) The number of active sites in a molecule of transketolase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 69, 839-843.

8. Meshalkina, L.E., Kochetov, G.A. (1979) The functional identity of the active centers of transketolase. Biochim. Biophys. Acta, 571, 218223.

9. Кочетов Г.А., Кобылянская K.P., Белянова Л.П. (1973) Аминокислотный состав транскетолазы пекарских дрожжей. Биохимия, 38, 1303-1306.

10. Fletcher, Т., Kwee, I., Nakada, Т., Largman, С., Martin В. (1992)

11. DNA sequence of the yeast transketolase gene. Biochemistry, 31, 1892-1896.

12. Кочетов Г.А., Усманов P.A. (1970) Изучение транскетолазы методом дисперсии оптического вращения. Биохимия, 35, 611621.

13. Sundstrom, M., Lindqvist, Y., Schneider, G. (1992) Three-dimensional structure of apotransketolase. Flexible loops at the active site enable cofactor binding. FEBS Lett., 313,229-231.

14. Nilsson, U., Lindqvist, Y., Kluger, R., Schneider, G. (1993) Crystal structure of transketolase in complex with thiamin thiazolone diphosphate, an analogue of the reaction intermediate, at 2,3 A resolution. FEBS Lett., 326, 145-148.

15. Nikkola, M., Lindqvist, Y., Schneider, G.(1994) Refined structure of transketolase from Saccharomyces cerevisiae of 2.0 A resolution.

16. J. Mol. Biol., 238, 387-404.

17. Пустынников М.Г., Нейф X., Усманов P.А., Шелленбергер A., Кочетов Г. A. (1986) Функциональные группы тиаминпирофосфата в холотранскетолазе. Биохимия, 51, 10031016.

18. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Merzlov, V.P. (1970) Thiaminpyrophosphate induced change of the optical activity of baker's yeast transketo-lase. FEBS Lett., 9, 265-266.

19. Heinrich, C., Noack, K., Wiss, O. (1971) A circular dichroism study of transketolase from baker's yeast. Biochem. Biophys. Res. Commun., 44, 275-279.

20. Heinrich, C., Schmidt, D. (1993) Determination of the binding constant of thiamine diphosphate in transketolase from baker's yeast by circular dichroism titration. Specialia 1227-12230.

21. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Mevkh, A.T. (1973) The role of the charge transfer complex in the transketolase catalized reaction. Biochem. Biophys. Res. Commun., 54, 1619-1626.

22. Heinrich, C., Schmidt, D., Noack, K. (1974) Energetic and spectroscopic studies on the interaction between thiamine diphosphate and apotransketolase. Eur. J. Biochem., 41, 555-561.

23. Усманов P. А., Кочетов Г. A. (1978) Изучение различных конформационных состояний транскетолазы методом пертурбационной ультрофиолетовой спектрофотометрии. Биохимия, 43, 1796-1804.

24. Heinrich, С.Р., Noack, К., Wiss, О. (1972) Chemical modification of thryptophan at the binding site of thiamine pyrophosphate in transketolase from baker's yeast. Biochem. Biophys. Res. Commun., 49, 1427-1432.

25. Мешалкина Jl. E., Нейф X., Тягло M.B., Шелленбергер А., Кочетов Г.А. (1996) Ферментативное превращение гидроксиэтилтиаминпирофосфата под действием транскетолазыпекарских дрожжей. Биохимия, 61, 716-719.

26. Усманов Р.А., Кочетов Г.А. (1973) Структура белка и оптическая активность. Биохимия, 75,6-25.

27. Usmanov, R.A. and Kochetov, G.A. (1982) Interaction of baker's yeast transketolase with substrates. Biochem. Int., 5, 727-734.

28. Кочетов Г.А. (1978) Тиаминовые ферменты, Наука, Москва.

29. Kovina, M.V., Selivanov, V.A., Kochevova, N.V., Kochetov, G.A. (1997) Kinetic mechanism of active site non-equivalence in transketolase. FEBS Lett., 418, 11-14.

30. Ковина M.B., Селиванов B.A., Кочевова H.B., Кочетов Г.А. (1997) Исследование кооперативного связывания кофермента активными центрами транскетолазы методом кинетического моделирования. Биохимия, 63, 1155-1163.

31. Wikner, Ch., Meshalkina, L., Nilsson, U.,Backstrom, S., Lindqvist Y., Schneider, G. (1995) His 103 in yeast transketolase is required for substrate recognition and catalysis. Eur. J. Biochem., 233, 750-755.

32. Wikner Ch., Nilsson, U., Meshalkina, L., Udekwu, C., Lindqvist, Y., Schneider, G. (1997) Identification of catalytically important residues in yeast transketolase. Biochemistry, 36, 15643-15649.

33. Meshalkina, L., Nilsson, U., Wikner, Ch., Kostikowa, Т., Schneider, G. (1997) Examination of the thiamin diphosphate binding site in yeast transketolase by site-directed mutagenesis. Eur.J. Biochem., 244, 646652.

34. Nilsson, U., Meshalkina, L., Lindqvist, Y., Schneider, G. (1997) Examination of substrate binding in thiamine diphosphate-dependenttransketolase by protein crystallography and site-directed mutagenesis. J.Biol.Chem., 272, 1864-1869.

35. Dyda, F., Furey, W., Swaminathan, S., Sax, M., Farrenkopf, В., Jordan, F. (1993) Catalytic centers in the thiamin diphosphate enzyme pyruvate decarboxylase at 2,4 A resolution. Biochemistry, 32, 61656170.

36. Dobritzsch, D., Konig, S., Schneider, G., Lu, G. (1998) High resolution crystal structure of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis. Implications for substrates activation in pyruvate decarboxylases. J.Biol.Chem., 273, 20196-20204.

37. Muller, Y., Shulz, G. (1993) Structure of the thiamin and flavin-dependent enzyme pyruvate oxidase. Science, 259, 965-967.

38. Muller, Y. A., Schumacher, G., Rudolph, R., Schulz, G. E. (1994)The refined structures of a stabilized mutant and of wild-type pyruvate oxidase from Lactobacillus plantarum. J. Mol. Biol., 237, 315-323.

39. Hasson, M., Muscate, A., McLeish, M., Polovnikova, L., Ringe, D. (1998) The crystal structure of benzoylformate decarboxylase at 1,6 A resolution: diversity of catalytic residues in thiamin diphosphate-dependent enzymes. Biochemistry, 37, 9918-9930.

40. Evarsson, A., Chuang, J., Wynn, R., Turley, S., Chuang, D., Hoi, W. (2000) Crystal structure of human branched-chain a-ketoacid dehydrogenase and the molecular basis of multienzyme complex deficiency in maple syrup urine disease. Structure, 8, 277-291.

41. Кочетов Г.А., Усманов P.A. (1970) Изучение транскетолазы методом дисперсии оптического вращения. Биохимия, 35, 611

42. Kochetov G.A. (1988) Structural-functional relationships in baker's yeast transketolase. in: Thiamin Pyrophosphate Biochemistry (Schellenberger, A., and Schowen, R.L., eds) V.l, pp. 139-142, CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida.

43. Datta, A., Racker, E. (1961) Mechanism of action of transketolase. I. Pro-perties of the cristalline yeast enzyme. J. Biol.Chem., 236, 617624.

44. Кочетов Г.А., Филиппов П.П. (1970) Кальций кофактор транскетолазы пекарских дрожжей. Биохимия, 35,422-424.

45. Kochetov, G.A., Philippov, P.P. (1970) Calcium: cofactor of transketolase from baker's yeast. Biochem. Biophys. Res. Commun., 38, 930-933.

46. Heinrich, C., Steffen, H., Janser, P., Wiss, O. (1972) Studies on the reconstitution on of apotransketolase with thiamine pyrophosphate and analogs of the coenzyme. Eur. J. Biochem., 30, 533-541.

47. Sprenger, G., Schorken, U., Sahm, H. (1995) Transketolase A of Escherichia coli K-12. Purification and properties of the enzymes from recombinant strains. Eur. J. Biochem., 230, 525-532.

48. Muller, Y., Lindqvist, Y., Furey, W., Schulz, G., Jordan, F., Schneider, G. (1993) A thiamine diphosphate binding fold revealed by comparison of the crystal structures of transketolase, pyruvate oxidase and pyruvate decarboxylase. Structure, 1, 95-103.

49. Shin, W., Pletcher, J., Blank, G., Sax, M. (1979) Ring stacking interactions between thiamin and planar molecules as seen in the crystal structure of a thiamin picrolonate dihydrate complex. J. Am. Chem. Soc., 11, 3491-3499.

50. Shin, W., Pletcher, J., Blank, G., Sax, M. (1977). Stereochemistry of intermediates in thiamin catalysis. 2. Crystal structure of DL-2-(a-hydroxybenzyl) thiamine chloride hydrochloride trihydrate. J. Am.1. Chem.Soc., 99, 1396-1403.

51. Shellenberger, A. (1967), Structure and mechanism of action of the active center of yeast pyruvate decarboxylase. Angew. Chem., 6, 10241035.

52. Кочетов Г.A. (1986) Транскетолаза: структура и механизм действия. Биохимия, 51, 2010-2029.

53. Hawkins, С., Borges, A., Perham, R. (1989) A common structural motif in thiamin pyrophosphate-binding enzymes. FEBS Lett., 255, 7782.

54. Мешалкина Л.Е., Кочетов Г.А. (1979) Роль остатков гистидина транскетолазы пекарских дрожжей .ДАН СССР, 246, 228-231.

55. Кочетов Г.А., Кобылянская К.Р. (1970) Природа и функция аминокислотных остатков транскетолазы, существенных для проявления ее активности. Биохимия, 35, 3-11.

56. Ohlsson, I., Nordstrom, В., Branden, С. (1974) Structural and functional similarities within the coenzyme binding domains of dehydrogenases. J.Mol.Biol, 89,339-354.

57. Schellenberger, A. Sixty years of thiamine diphosphate biochemistry (1998) Biochim.Biophys.Acta, 1385, 177-186.

58. Kern, D., Kern, G., Neef ,H., Tittmann, K., Killenberg, M., Wikner, Ch., Scneider, G., Hiibner, G. (1997) How thiamine diphosphate is activated in enzymes. Science, 275, 67-70.

59. Egan, R.M., Sable, H.Z. (1981) Transketolase kinetics. The slow reconstitution of the holoenzyme is due to rate-limiting dimerization ofthe subunits. J. Biol. Chem., 256, 4877-4883.

60. Кочетов Г. А., Изотова A.E. (1973) Реконструкция холотранскетолазы из апофермента и кофермента. Биохимия, 38, 552-559.

61. Кочетов Г.А., Усманов Р. А. (1972) Взаимодействие апотранскетолазы с аналогами тиаминдифосфата. ДАН СССР, 202, 471-474.

62. Kochetov, G., Izotova, A., Meshalkina, L. (1971) Inhibition of transketolase by analogues of the coenzyme. Biochem.Biophys.Res.Commun., 43, 1198-1203

63. Singleton, C., Wang, J., Martin, P. (1996) Conserved residues are functionally distinct within transketolases of different species. Biochemistry, 35, 15865-15869.

64. Nilsson, U., Hecquet, L., Gefflaut, Т., Guerard, C., Schneider, G. (1998) Asp477 is a determinant of the enantioselectivity in yeast transketolase. FEBS Lett., 424, 49-52.

65. Jordan, F., Chen, G., Nishikowa, S., Sundoro, W. (1982) Potential roles of the aminopyrimidine ring in thiamin catalyzed reaction. Ann. N.Y. Acad. Sci., 378, 14-29.

66. Golbik, R., Schellenberger, A. (1991) Function of the aminopyrimidine part in thiamine pyrophosphate enzymes. Bioorg. Chem., 19,10-17.

67. Candy, J., Koga, J., Nixon, P., Duggleby, R. (1996) The role of residues glutamate-50 and phenylalanine-496 in Zymomonas mobilis pyruvate decarboxylase. Biochem J., 315, 745-751.

68. Killenberger-Jabs, M., Konig, S., Eberhardt, I., Hohmann, S., Hubner,

69. G. (1997) Role of Glu51 for cofactor binding and catalytic activity in pyruvate decarboxylase from yeast studied by site-directed mutagenesis. Biochemistry, 36,1900-1905.

70. Fiedler, E., Golbik, R., Schneider, G., Tittmann, K., Neef, H., Konig, S., Htibner, G. (2001) Examination of donor substarte conversion in yeast transketolase. J.Biol. Chem., 276,16051-16058.

71. Мешалкина JI.E., Кочетов Г.А. (1979) Участие двухвалентных катионов во взаимодействии тиаминпирофосфата с апотранскетолазой пекарских дрожжей. Биохимия, 248, 14821486.

72. Кочетов Г.А., Изотова А.Е. (1973) Условия отщепления тиаминпирофосфата от холотранскетолазы. Биохимия, 38, 954957.

73. Kochetov, G.A., Tikhomirova, N.K., Philippov, P.P. (1975) The binding of thiamine pyrophosphate with transketolase in equilibrium conditions. Biochem.Biophys.Res. Commun., 63, 924-930.

74. Филиппов П.П., Тихомирова H.K., Кочетов Г.А. (1978) Использование гель-фильтрации для изучения связывания лигандов с ферментами. В кн. Физико- химические методы молекулярной биологии. Изд-во МГУ, Москва, с. 57-64.

75. Kochetov, G.A., Philippov, P.P., Razjvin, A.P., Tikhomirova, N.K. (1975) Kinetics of reconstruction of holotransketolase. FEBS Lett., 53, 211-212.

76. Kuimov, A.N., Kochetov, G.A. (1996) Functional groups of transketolase. ICN, 455-477.

77. Kovina, M., Viryasov, M., Baratova, L., Kochetov, G. (1996) Localizacion of reactivity tyrosine residues of baker's yeast transketolase. FEBS Lett., 392, 293-294.

78. Ковина М.В., Куимов А.Н., Кочетов Г.А. (1993) Существенные остатки тирозина транскетолазы пекарских дрожжей. I. Определение типа и количества существенных остатков Биохимия, 58, 1330-1340.

79. Ковина М.В., Куимов А.Н., Кочетов Г.А. (1993) Существенные остатки тирозина транскетолазы пекарских дрожжей. И. Исследование функции существенных остатков тирозина. Биохимия, 58,1341-1350.

80. Kovina, M.V., and Kochetov, G.A. (1998) Cooperativity and flexibility of active sites in homodimeric transketolase. FEBS Lett., 440, 81-84.

81. Куимов A.H., Мешалкина JI.E., Кочетов Г.А. (1986) Функциональная карбоксильная группа в активном центре транскетолазы. Биохимия, 51,1908-1918.

82. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A. (1970) Charge transfer interactions in transketolase-thiamine pyrophosphate complex. Biochem. Biophys. Res Commun, 41, 1134-1140.

83. Biaglow, J. Mieyal, J., Suchy, J., and Sable, H. (1969) Coenzyme interactions. Characteristics of the molecular complexes of thiamine with indole. J.Biol.Chem., 244, 4054-4062.

84. Mieyal, J., Suchy, J., Biaglow, J. and Sable, H. (1969) Coenzyme interactions. Molecular complexes of thiamin with indole derivatives quantitive aspects. J. Biol. Chem., 244, 4063-4071.

85. Suchy, J., Mieyal, J., Bantle, G. and Sable, H. (1972) Coenzyme interactions. Properties of the pyrimidine moiety of thiamin. J. Biol. Chem., 247, 5905-5912.

86. Tikhomirova, N.K., Kochetov, G.A. (1990) Purification of transketolase from baker's yeast by an immunosorbent. Biochem. Intern22, 31-36.

87. Тихомирова H.K., Кочетов Г.A. (1991) Новый метод выделения и новая форма транскетолазы из пекарских дрожжей. Биохимия, 56, 1123-1130.

88. Кочетов Г.А. (1980) Практическое руководство по энзимологии, Высшая школа, Москва.

89. Мешалкина JI.E. (1979) Взаимодействие кофакторов с транскетолазой пекарских дрожжей, Дис., канд. биол. наук, МГУ, Москва.

90. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. (1991) Справочник биохимика, Мир, Москва, 116.

91. Островский Ю.М., Степуро И.И., Шелленбергер А., Хюбнер X. (1971) Электронные спектры тиамина и свойства молекулы витамина в гидрофобном окружении. Биохимия, 36, 1222-1227.

92. Вшивков А.А., Неудачина JI.K., Мелкозеров В.П. (1994) Синтез и исследование кислотно-основных свойств карбоксифениленаминопропионовых кислот. Программа: Университеты России. Химия, Москва, 96-105.

93. Friedemann, R., Neef, Н. (1998) Theoretical studies on the electronic and energetic properties of the aminopyrimidine part of thiamin diphosphate. Biochim. Biophys. Acta, 1385, 245-250.

94. Khailova, L., Severin, S. (1988) Functional groups of muscle pyruvate dehydrogenase. in: Thiamin Pyrophosphate Biochemistry (Schellenberger, A., and Schowen, R.L., eds) V.l, pp. 45-60, CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida.

95. Showkat, A., Shenoy, В., Eswaran, D., Andersson, L., Roche, Т., Patel, M. (1995) Identification of the tryptophan residue in the thiaminpyrophosphate binding site of mammalian pyruvate dehydrogenase. J.Biol Chem., 270,4570-4574.

96. Hopmann, R. (1980) Hydroxyl-ion-induced subunit dissociation of yeast cytoplasmic pyruvate decarboxylase. A circular dichroism study. Eur. J. Biochem., 110, 311-318.