Связывание субстратов с транскетолазой Saccharomyces Cerevisiae и их каталитические превращения

Юршев, Владимир Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Связывание субстратов с транскетолазой Saccharomyces Cerevisiae и их каталитические превращения
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Связывание субстратов с транскетолазой Saccharomyces Cerevisiae и их каталитические превращения"

0046

Юршев Владимир Александрович

СВЯЗЫВАНИЕ СУБСТРАТОВ С ТРАНСКЕТОЛАЗОЙ ЗАССНАЫОМУСЕв СЕИЕУШАЕ И ИХ КАТАЛИТИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ

Специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 9 ПЕН 2010

Москва-2010

004616289

Работа выполнена в отделе биохимии животной клетки Института физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Кочетов Герман Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Топунов Алексей Федорович

кандидат биологических наук, Куликов Евгений Евгеньевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО Воронежский государственный

на заседании диссертационного совета Д 212.154.17 при Московском педагогическом государственном университете по адресу 129164, Москва, у) Кибальчича, д. 6, корп. 4, биолого-химический факультет, ауд. 205.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МПГУ по адресу: 19992, Москва, ул. М. Пироговская, д.1.

университет

Защита диссертации состоится <<

» ¿Г 2010 г. в

часов

Автореферат разослан

2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Н. В. Холмогорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Транскетолаза (ТК) катализирует расщепление С-С связи субстрата донора (кетозы) и перенос образовавшегося двууглеродного фрагмента, остатка гликольальдегида, на субстрат-акцептор, функцию которого выполняют различного рода альдегиды. Фермент обладает широкой специфичностью, как по отношению к субстрату-донору, так и по отношению к субстрату-акцептору. Наряду с двусубстратной, трансферазной реакцией, ТК способна катализировать и односубстратную реакцию, с использованием только субстрата-донора, в отсутствие субстрата-акцептора. Продуктом реакции в этом случае является эритрулоза, которая образуется в результате конденсации двух остатков гликольальдегида, образовавшихся в результате расщепления двух молекул субстрата-донора.

Транскетолазная реакция необратима только в том случае, когда в качестве субстрата-донора используется гидроксипируват.

Кофакторами ТК являются ТДФ и ионы двухвалентных металлов. В нативном холоферменте обнаружен только Са2+ в количестве 2 г • атом на моль белка. Другие двухвалентные катионы с успехом способны его заменить, причем на общей активности фермента это, по существу, не сказывается. В то же время, сравнительные исследования, проведенные с использованием в качестве кофактора Са2+ и Mg2+, показали, что природа катиона существенно влияет на конформационные характеристики ТК.

Транскетолаза является простейшим представителем тиаминдифосфат-зависимых ферментов, состоит из двух идентичных субъединиц, имеет два активных центра. Транскетолаза из Saccharomyces cerevisiae была первым тиаминдифосфат-зависимым ферментом, для которого был сделан РСА, определена пространственная структура ano- и холофермента, идентифицированы функциональные группы кофермента и апобелка,

\ ■

3 \

подтверждены данные о наличии в ферменте ионов кальция, по одному на активный центр.

Цель исследования

Целью настоящей диссертационной работы было исследование взаимодействия холотранскетолазы с физиологическими субстратами, ксилулозо-5-фосфатом и рибозо-5-фосфатом, и их каталитических превращений в отсутствие и в присутствии извне добавленных катионов -Са2+ и М82+.

Задачи исследования

1. Выявить влияние ионов двухвалентных металлов на кинетические характеристики фермента.

2. Определить неэквивалентность активных центров для транскетолазы.

3. Исследовать влияние ингибитора феррицианида на активные центры транскетолазы.

Научная новизна работы

Впервые показано, что для проявления каталитической активности холотранскетолазы достаточно наличия только структурированных в её составе ионов кальция.

Установлено, что извне добавленный Са2+ повышает общую активность холотранскетолазы, в равной степени выраженную по отношению к каждому из двух активных центров.

На основе данных проведен количественный анализ процесса взаимодействия с транскетолазой как субстрата-донора (ксилулозо-5-фосфата), так и субстрата-акцептора (рибозо-5-фосфата). Определены соответствующие значения Кт и Ушах.

активности. В присутствии свободного, извне добавленного Са2+, выявляется их неэквивалентность - индуцируется отрицательная кооперативность при связывании обоих субстратов и положительная кооперативность - при их каталитическом превращении. В присутствии же Mg2+, вместо ионов кальция, неэквивалентность активных центров не проявляется.

Выявлена неэквивалентность активных центров холотранскетолазы по их восприимчивости к ингибирующему действию искусственных акцепторов электронов.

Теоретическое и практическое значение работы

Теоретическое значение работы состоит в формировании новых фундаментальных представлений о механизме функционирования и регуляции транскетолазы. Под механизмом функционирования, в данном случае, следует понимать процессы взаимодействия фермента с кофакторами, связывания субстратов и их каталитические превращения, характеристики индивидуальных стадий этих процессов, что открывает новые возможности в исследовании тиаминдифосфат-зависимых ферментов.

Практическое значение работы: предлагаемые методы получения транскетолазы с одним функционирующим активным центром могут служить основой при разработке аналогичных методов, применительно к другим ферментам.

Результаты работы, касающиеся влияния двухвалентных катионов на кинетические характеристики транскетолазы, могут быть использованы при изучении других тиаминдифосфат-зависимых ферментов.

Представленные в работе результаты, заключения и выводы могут быть использованы при чтении лекций по энзимологии и биохимии, а также в лабораторной практике на кафедрах биохимии биологических факультетов и медицинских институтов.

Научные положения, выносимые на защиту

1. Наличие двух структурированных в составе молекулы холоТК атомов кальция оказывается достаточным для проявления каталитической активности фермента.

2. Ионы двухвалентных металлов влияют на общую активность холотранскетолазы.

3. Неэквивалентность активных центров транскетолазы определяется только в присутствии свободного, извне добавленного Са2+, в отличие от ионов магния, которые не способны индуцировать неэквивалентность.

4. Восприимчивость активных центров транскетолазы, сформированных при участии разных таутомерных форм тиаминдифосфата, неодинакова к воздействию феррицианида.

Апробация результатов исследований

Результаты исследований были неоднократно представлены и обсуждены на семинарах отдела биохимии животной клетки НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского и на совместном заседании отдела биохимии животной клетки и факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ имени М. В. Ломоносова, а также на конференциях молодых ученых "Ломоносов 2006" (Москва, 2006) и "Ломоносов 2008" (Москва, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 4 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, посвященных обзору литературы, описанию материалов и методов исследования, изложению результатов и их обсуждений, а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 33 рисунками и содержит 4 таблицы. Библиографический указатель включает в себя 84 источника: 22

отечественных и 62 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Транскетолазу пекарских дрожжей выделяли по ранее известному методу [Tikhomirova N.K., Kochetov G.A., 1990], с некоторыми изменениями [Соловьева О.Н., 2002]. Препараты кристаллического фермента хранили в растворе сульфата аммония 50% насыщения, pH 7,6, при 4°С. Фермент был гомогенен, согласно данным электрофореза в ПААГ с ДЗ-Na. Перед использованием раствор ТК обессоливали на колонке с сефадексом G-50.

Определение концентрации белка. Содержание белка в растворах гомогенной ТК определяли по величине оптической плотности при 280 нм,

используя коэффициент молярной экстинкции А ^ = 14,5.

Количественное определение тиаминдифосфата и окситиаминдифосфата. Концентрацию ТДФ и его аналога, оксиТДФ, определяли спектрофотометрически по величине оптической плотности, используя значения коэффициента молярной экстинкции, £ = 7500 М-1 см'1 при X = 272,5 нм - для ТДФ и е = 8600 М"'см"' при X = 272 нм - для аналога.

Определение концентрации ксилулозо-5-фосфата и рибозо-5-фосфата. Концентрацию ксилулозо-5-фосфата определяли спектрофотометрически по количеству NADH, образующегося в результате окисления 3-фосфоглицеринового альдегида, продукта расщепления К5Ф, под действием транскетолазы. В качестве субстрата-акцептора использовали Р5Ф и глицеральдегидфосфатдегидрогеназу, в качестве вспомогательного фермента. Концентрацию рибозо-5-фосфата определяли аналогичным образом, используя субстрат-донор К5Ф.

Определение активности транскетолазы. 1) Скорость реакции измеряли спектрофотометрически, по изменению оптической плотности при 340 нм, обусловленному восстановлением NAD+, за счет окисления глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназой ФГА - продукта транскетолазной реакции. 2) в системе с искусственным акцептором электронов (феррицианидом). Эта

реакция основана на окислении феррицианидом карбанионного интермедиата транскетолазной реакции, образующегося в результате расщепления субстрата-донора.

Получение полухолотранскетолазы 1. Полухолотранскетолаза 1, это фермент, в котором функционирует только один из двух активных центров, тот, который имеет более высокое сродство к тиаминдифосфату. В присутствии Са2+ активные центры транскетолазы имеют неодинаковое сродство к тиаминдифосфату. Сродство кофермента к одному из них (условно - первый активный центр) достаточно высокое (Kd = 3,2 • 10"8) и, примерно, на порядок превышает сродство тиаминдифосфата к другому активному центру (условно - второй активный центр). При добавлении к апотранскетолазе (3,3-13,5 мкМ) эквимолярной концентрации тиаминдифосфата, он полностью связывается с первым активным центров и не отщепляется от него в процессе проведения экспериментов.

Реконструкцию полухолотранскетолазы 1 из ano- и кофермента проводили в 50 мМ глицил-глициновом буфере, рП 7,6 в присутствии 2,5 мМ СаСЬ в течение 30 минут при 25°С. Концентрация апотранскетолазы и тиаминдифосфата, соответственно, 3,3 мкМ и 3,3 мкМ. При постановке экспериментов с полухолотранскетолазой 1 по определению Km для субстратов, тиаминдифосфат в среду не добавляли.

Получение полухолотранскетолазы 2. Полухолотранскетолаза 2, это фермент, в котором функционирует только один активный центр, тот который имеет более низкое, по сравнению с другим активным центром, сродство к коферменту. Для ее получения сначала необходимо заблокировать первый активный центр, имеющий более высокое сродство к тиаминдифосфату, с помощью неактивного аналога кофермента - окситиаминдифосфата; сродство его к активным центрам фермента в несколько раз выше, чем нативного кофермента. Затем к транскетолазе с заблокированным первым активным центром добавляют тиаминдифосфат в концентрации, которая достаточна для его связывания со вторым активным центром, но недостаточна для

вытеснения окситиаминдифосфата из первого активного центра.

Получение полухолотранскетолазы 2 проводили в 50 мм глицил-глициновом буфере, рН 7,6 в присутствии ионов Са2+. Апотранскетолазу в концентрации 3,3 мкМ инкубировали 30 мин при 25°С с 3,3 мкМ окситиаминдифосфатом, после чего добавляли тиаминдифосфат до конечной концентрации 100 мкМ.

Определение Km для субстратов транскетолазы. Значения Km для К5Ф и Р5Ф определяли на основании фиттинга зависимости скорости транскетолазной реакции от концентрации субстрата, при этом использовали соответствующее уравнение:

+ Km2 / [S] + Km 1 • Km2/[S]2

где V - максимальная скорость реакции, S - субстрат, Km - константа Михаэлиса.

Результат экспериментов, в которых использовались полухолоТК 1 и полухолоТК 2 (ферменты с одним функционирующим активным центром), а также холоТК, реконструированная в присутствии ионов Mg2+ - по уравнению Михаэлиса-Ментен:

Статистическая обработка результатов

Полученный в работе цифровой материал обработан статистически с использованием пакетов прикладных программ «Origin (OriginLab, USA)» и «EXCEL».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние Са2+ на активность холотранскетолазы

В качестве ферментного препарата в данном случае использовали холотранскетолазу, т. е. фермент, в составе молекулы которого содержался Са2+ в количестве 2 г • атом на моль белка. Это, так называемый, структурированный кальций, необходимый, в частности, для связывания ТДФ с апобслком. Исследовали, таким образом, влияние на активность ТК свободного Са2+. Естественно, все свободные двухвалентные катионы из реакционной среды были предварительно удалены.

График 1 на рис. Г характеризует активность холоТК в отсутствие извне добавленного Са2+. В его присутствии результаты представлены графиком 2. Из приведенных экспериментальных данных следует, что для связывания субстратов (по крайней мере субстрата-донора) и каталитической активности фермента не требуется добавление Са2+ дополнительно к тому, который содержится в составе холофермента. Извне добавленный Са2+ лишь несколько повышает активность фермента. Заметим, что это повышение при добавлении Са2+, не обусловлено увеличением количества холоТК за счет дополнительного его образования в результате связывания ТДФ с апоТК, который мог бы образоваться в результате возможного расщепления холоТК, используемой в эксперименте. Специальные исследования показали, что холоТК стабильна в течение всего времени эксперимента и отщепление от нее ТДФ не происходит.

Влияние Са2+ на активность полухолоТК

Следующая серия экспериментов была поставлена с целью выявления вопроса о том, в равной или разной степени оказывает активирующее влияние Са2+ на активные центры фермента. Для этого аналогичные с холоТК

' Здесь, и во всех последующих случаях, приводится один из однозначных экспериментов.

0,385 -1

0,370 -

25 30

Время,сек

I - в отсутствие Са'

,2+

2 - в присутствии Са'

Рис. I. Влияние ионов кальция на активность холотранскетолазы.

опыты были поставлены с формами фермента, в которых функционирует только один из двух активных центров. ПолухолоТЮ, фермент, в котором функционирует только тот активный центр, который имеет более высокое, по сравнению с другим активным центром, сродство к ТДФ. ПолухолоТК2 -фермент, в котором функционирует активный центр с более низким сродством к коферменту. Результаты такого рода экспериментов, представлены, соответственно, на рис. 2 и 3. Хорошо видно, что они, по существу, не отличаются от рис. 1, где представлены данные для холоТК.

Таким образом, извне добавленный кальций в равной степени влияет на активность того и другого активного центра, повышая ее, примерно, наполовину. Соответствующий цифровой материал представлен в табл. 1.

Отсутствие необходимости Са2+ для связывания субстрата-донора, К5Ф, с транскетолазой^то-следует из представленных экспериментов, еще не означает отсутствие его необходимости для связывания субстрата-акцептора, Р5Ф, и возможное его влияние на количественные характеристики

Время, сек

1 - в отсутствие Са2+ 2 - в присутствии Са2'

Рис. 2. Влияние ионов кальция на активность полухолотранскетолазы 1.

10 15 20 25

Время, сек

1 - в отсутствие Са2+ 2 - в присутствии Са2'

Рис. 3. Влияние ионов кальция на активность полухолотранскетолазы 2.

Таблица 1

Активность транскетолазы в присутствии и в отсутствие Са2+

Удельная активность, Е/мг

ТРАНСКЕТОЛАЗА -Са2+, Е/мг +Са2+, Е/мг

ХОЛОФЕРМЕНТ 0,52 ±0,01 0,86 ± 0,02

ПОЛУХОЛОФЕРМЕНТ1 0,25 ±0,01 0,39 ± 0,03

ПОЛУХОЛОФЕРМЕНТ 2 0,25 ± 0,01 0,38 ±0,01

взаимодействия субстратов с ферментом.

Влияние Са2+ на связывание и превращение субстрата-донора. ксилулозо-5-ФосФата

Активность транскетолазы в данной серии экспериментов определяли в двусубстратной реакции по скорости образования ИАОН с использованием в качестве субстратов К5Ф и Р5Ф, а в качестве вспомогательного фермента -глицеральдегидфосфатдегидрогеназы.

Зависимость активности холоТК от концентрации К5Ф в отсутствие извне добавленного кальция показана на рис. 4. Зависимость эта гиперболическая - экспериментальные точки хорошо укладываются на кривую, полученную путем фиттинга экспериментальных данных по уравнению Михаэлиса-Ментен (2).

Это означает, что активные центры эквивалентны по связыванию ксилулозо-5-фосфата. В присутствии извне добавленного Са2+ картина резко меняется. Теперь уже зависимость активности ТК от концентрации К5Ф не описывается в рамках кинетики Михаэлиса-Ментен; экспериментальные точки хорошо укладываются на кривую, полученную путем фитинга по

0,03 0,025

0,015 0.01 0,00!

Рис. 4. Влияние концентрации ксилулозо-5-фосфата на активность холотранскетолазы в отсутствие извне добавленного Са2+ при постоянной концентрации рибозо-5-фосфата, 1500 мкМ. Точки - экспериментальные данные, кривая - результат фиттинга по уравнению Михаэлиса - Ментен (2).

уравнению (!) для двух неэквивалентных активных центров (рис. 5).

Как следует из данных табл. 2, добавление Са2' в среду сопровождается повышением (более, чем в три раза) сродства К5Ф к одному из активных центров (условно - первый активный центр) и почти на порядок -понижением сродства к другому активному центру (условно - второй активный центр). Параллельно с изменением сродства К5Ф к активным центрам изменяется, в присутствие Са2+, их каталитическая активность.

Снижается, примерно, в три раза для первого активного центра и повышается, хотя и не столь существенно - для второго.

Результаты полученные в присутствие Са2+ с полухолоТК 1 (в которой функционирует только один активный центр - с более высоким сродством к ТДФ) и с полухолоТК 2 (функционирует только активный центр - с более низким сродством к коферменту), вполне ожидаемы. Ожидаемы в том смысле, что определяется только одно значение Кт для К5Ф (более высокое в первом случае) и одинаковые значения максимальной скорости реакции (табл. 2).

0,0< 0.04

5 3

Я 0.03 0.02 О, 01

Рис. 5. Влияние концентрации ксилулозо-5-фосфата на активность холотранскетолазы в присутствии Са2+ и постоянной концентрации рибозо-5-фосфата, 1500 мкМ. Точки - экспериментальные данные, кривая - результат фиттинга по уравнению для двух неэквивалентных активных центров (1).

Таблица 2

Значения Кт для ксилулозо-5-фосфата и V активных центров транскетолазы

Форма фермента Варьируемый субстрат* Извне добавленный Са2+ Kml, мкМ Кт2, мкМ VI, Е/мг V2, Е/мг

ХолоТК К5Ф - 75±9 34±2

ХолоТК К5Ф + 21±6 574±300 10±4 39±9

ПолухолоТК 1 К5Ф + 115±7 13±0,4

ПолухолоТК 2 К5Ф + 38±3 11±0,4

Концентрация ксилулозо-5-фосфата была в диапазоне 0,005 - 0,8 мМ, а концентрация рибозо-5-фосфата - постоянной и равнялась 1,5 мМ.

л—"" *

_—1_I-1-1_I_I- '

О 100 200 300 -»00 500 600 700 ГКЗФ1ыи>Л

Таким образом, приведенные выше экспериментальные данные свидетельствуют о том, что Са2+ индуцирует появление отрицательной кооперативности при связывание субстрата-донора, К5Ф, с холоТК и положительную кооперативность - при его каталитическом превращении.

Влияние Ся1+ на связывание и превращение субстрата-акцептора, рибозо-5-Фос(Ьата

Влияние концентрации Р5Ф на каталитическую активность ТК в отсутствие извне добавленного Са2+ показано на рис. 6. Как и в случае К5Ф (рис. 4), экспериментальные точки хорошо укладываются на график, полученный путем фиттинга по уравнению Михаэлиса-Ментен, что говорит об эквивалентности активных центров фермента по связыванию Р5Ф; одинакова и их каталитическая активность (табл. 3).

Добавление в реакционную среду Са2+ (рис. 7) приводит к резкому, более, чем на порядок, снижению значению Кт для Р5Ф по отношению к первому активному центру и не столь существенному, но тоже значительному, повышению Кт по отношению ко второму активному центру (табл. 3). В том же направлении, хотя и не столь кардинально, меняются каталитические свойства активных центров. Активность первого из них снижается, а активность второго повышается (табл. 3).

Кинетические характеристики полухолоТК 1 и полухолоТК 2 в присутствие Са2+ примерно одинаковы, как по их сродству к Р5Ф, так и по каталитической активности (табл. 3).

Результаты, полученные с Р5Ф, по существу не отличаются от результатов, полученных с К5Ф (ср. данные табл. 2 и 3). Здесь также имеет место индуцирование кальцием отрицательной кооперативности при связывании субстрата и положительной кооперативности - при его каталитическом превращении.

0,016 0,014 0,012 I о, 03

IS °-oos 0.006 0,004 0,002

Рис. 6. Влияние концентрации рибозо-5-фосфата на активность холотранскетолазы в отсутствие извне добавленного Са2+ при постоянной концентрации ксилулозо-5-фосфата, 900 мкМ. Точки - экспериментальные данные, кривая - результат фиттинга по уравнению Михаэлиса - Ментен (2).

0,04

0.035

0.03

S 0.025 3

Я 0.02

•S

0,015 0.01 0.005 О

Рис. 7. Влияние концентрации рибозо-5-фосфата на активность холотранскетолазы в присутствии Са2+ и постоянной концентрации ксилулозо-5-фосфата, 900 мкМ. Точки - экспериментальные данные, кривая -результат фиттинга по уравнению для двух неэквивалентных активных центров (1).

100 200 300

[Р5Ф1.ыкМ

300 400 ГР5Ф1,мкМ

Таблица 3

Значения Km для рибозо-5-фосфата и V активных центров транскетолазы

Форма фермента Варьируемый субстрат* Извне добавленный Са2+ Кш1, мкМ Кт2, мкМ VI, Е/мг V2, Е/мг

ХолоТК Р5Ф - 159±17 31±3

ХолоТК Р5Ф + 14±10 595±300 4±2 44±10

ПолухолоТК 1 Р5Ф + 120±20 16±1,2

ПолухолоТК 2 Р5Ф + 82±8 13±0,5

Концентрация рибозо-5-фосфата была в пределах 0,005 - 0,9 мМ, а концентрация ксилулозо-5-фосфата - постоянной и равнялась 0,9.

Следует отметить, что общая активность ТК в присутствии извне добавленного Са2+ выше по сравнению с той, которая наблюдается в его отсутствии. Это подтверждают наши данные, полученные при определении активности ТК в односубстратной транскетолазной реакции с использованием только одного субстрата, субстрата-донора, в отсутствие субстрата-акцептора, и феррицианида - в качестве искусственного акцептора электронов (см. данные табл. 1).

Кинетические характеристики ТК при использовании Ме2+в качестве кофактора

Несмотря на то, что в нативной холоТК из пекарских дрожжей определен только Са2+, другие двухвалентные катионы, с тем или иным успехом, могут выполнять функцию кофактора в реакции, катализируемой этим ферментом. Ни в одном из других тиаминдифосфат-зависимых ферментов содержание

двухвалентных катионов не определялось, кроме, разве, ТК из эритроцитов человека, в молекуле которой качественно определили М§2+; наличие других Ме2+ не определяли по причине отсутствия у авторов достаточных количеств фермента. Тем не менее, во всех исследованиях, проводимых с тиаминдифосфат-зависимыми ферментами, в качестве кофактора используется Поэтому было интересно и важно, в сравнительном плане, посмотреть, как влияет замена Са2+ на Mg2+ на кинетические характеристики ТК. Тем более, если учесть, что концентрация М§2+ в клетке достаточно высокая.

Связывание субстрата-донора. ксилулозо-5-фосфата. с транскетолазой и его каталитические превращения в присутствии Ме2+

Влияние концентрации К5Ф, при постоянной концентрации Р5Ф, на каталитическую активность ТК иллюстрирует рис. 8. Кривая на этом рисунке есть результат фиттинга экспериментальных данных по уравнению (2). Экспериментальные точки хорошо укладываются на полученную кривую; соответствующие значения Кш и V приведены в табл. 4. Отсюда следует, что в присутствии М§2+ активные центры эквивалентны как по связыванию К5Ф, так и по каталитической активности, в противоположность тому, что имело место в тех экспериментах, когда вместо М§2+ использовали Са2+ (табл. 2).

Кинетические характеристики связывания с ТК и превращения субстрата-акцептора, рибозо-5-фосфата, в присутствии Ме2+

На рис. 9 показана зависимость активности ТК от концентрации Р5Ф при постоянной концентрации К5Ф. Экспериментальные точки хорошо ложатся на кривую, полученную путем фиттинга по уравнению Михаэлиса-Ментен, что указывает на одинаковое сродство активных центров к Р5Ф; неразличимы они и по каталитической активности (табл. 4). Обращает на себя внимание

0.04

I 0.05

0.02 0,01 0

0 100 200 300 400 500 600 700 [К5Ф].икМ

Рис. 8. Влияние концентрации ксилулозо-5-фосфата на активность холотранскетолазы в присутствии Концентрация рибозо-5-фосфата

(постоянная) 1500 мкМ. Точки - экспериментальные данные, кривая получена путем фиттинга по уравнению (2).

0.06

0,05

| 0,04

^ 0,03

0,02

0.01 О

/ /

V f

_I_I_I_I_I_I-1_I_

О 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 [Р5Ф],шМ

Рис. 9. Влияние концентрации рибозо-5-фосфата на активность холотранскетолазы в присутствии Mg2+. Концентрация ксилулозо-5-фосфата (постоянная) 900 мкМ. Точки - экспериментальные данные, кривая получена путем фиттинга по уравнению (2).

Таблица 4

Кинетические параметры транскетолазной реакции при использовании Мц2^ в

качестве кофактора

Варьируемый субстрат Km, мкМ V, Е/мг

Ксилулозо-5-фосфат* 71±5 38±1

Рибозо-5-фосфат** 402±80 35±2,3

Концентрация ксилулозо-5-фосфата была в пределах 0,005 - 0,9 мМ, а концентрация рибозо-5-фосфата - постоянной и равнялась 1,5 мМ.

Концентрация рибозо-5-фосфата была в пределах 0,005 - 1,7 мМ, а концентрация ксилулозо-5-фосфата - постоянной и равнялась 0,9 мМ.

резкое различие в сродстве к ТК ксилулозо-5-фосфата и рибозо-5-фосфата (табл. 4), в то время как в присутствии Са2+ оно, по существу, одинаково (ср. табл. 2 и 3).

Неэквивалентность активных центров ТК по отношению к ингибирующему действию феррицианида

Феррицианид используется в качестве искусственного акцептора электронов при определении активности транскетолазы в односубстратной транскетолазной реакции. При этом, транскетолазная реакция идет с постоянной скоростью не более 30 секунд, после чего фермент постепенно начинает инактивироваться. Кристеном и сотрудниками [Christen, Р., Cogoli-greuter, М., Healy, M.J., Lubin, D., 1976] было показано, что преинкубация холоТК с феррицианидом приводит через 5 минут к ее инактивации на 50%,

после чего активность фермента достаточное длительное время сохраняется на этом уровне. Так как ТК имеет два активных центра, нельзя было исключить, что восприимчивость активных центров к феррицианиду неодинакова и один из них легко подвергается воздействию искусственного акцептора электронов и полностью инактивируется за 5 минут, а второй, при этом, полностью сохраняет свою каталитическую активность, что свидетельствовало бы о неэквивалентности активных центров, по отношению к воздействию окислителя. Мы проверили это предположение и результаты приведены на рис. 10.

Полухолотранскетолаза 1, у которой функционирует только один активный центр, с более высоким, по сравнению с другим центром, сродством к коферменту, уже через пять минут преинкубации полностью теряет свою каталитическую активность (график 2 на рис. 10). В то же время, фермент, у которого функционирует активный центр с более низким сродством к коферменту, активность не изменяется в течение всего времени наблюдения (график 3 на рис. 10). Холотранскетолаза с двумя функционирующими активными центрами инактивируется за первые пять минут преинкубации, примерно, наполовину. Дальнейшая преинкубация никак не сказывается на ее активности (график 1 на рис. 10).

Следовательно, феррицианид инактивирует только один из двух активных центров ТК (с более высоким сродством к тиаминдифосфату), не оказывая влияние на другой. Этим и объясняется тот факт, что холофермент инактивируется только наполовину.

Природа ингибирующего действия феррицианида на транскетолазу в настоящее время не известна. Ясно лишь, что ингибирование имеет место только при наличии полностью сформированного активного центра с встроенным в него коферментом (апотранскетолаза не ингибируется феррицианидом - график 4 на рис. 10).

время, мин

Рис. 10. Влияние ферицианида на активность транскетолазы.

1, 2 и 3 - соответственно, холотранскетолаза, полухолотранскетолаза 1 и

полухолотранскетолаза 2. 4 - апофермент.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы получения форм транскетолазы только с одним функционирующим активным центром: соответственно холотранскетолаза 1 и холотранскетолаза 2.

2. Активные центры холотранскетолазы, содержащие в своем составе структурированные ионы кальция, не различаются по каталитической активности и имеют одинаковое сродство к субстратам.

3. В присутствии свободных ионов кальция активные центры становятся неэквивалентными: индуцируется отрицательная кооперативность при связывании как ксилулозо-5-фосфата, субстрата-донора, так и рибозо-5-фосфата, субстрата-акцептора, и положительная кооперативность при их каталитическом превращении; кроме того - повышается общая активность фермента.

4. Ионы магния, в противоположность ионам кальция, не способны индуцировать неэквивалентность активных центров транскетолазы.

5. Структурно идентичные активные центры транскетолазы не являются функционально идентичными.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Севостьянова И.А., Селиванов В.А., Юршев В.А., Соловьева О.Н., Забродская С.В., Кочетов Г.А. Кооперативность связывания субстратов с транскетолазой Saccharomyces cerevisiae // Биохимия. -2009. - Т. 74. - № 7. - С. 972-976 (0,43 п. л., доля авторского участия 69 %).

2. Юршев В.А., Севостьянова И.А., Соловьева О.Н., Кочетов Г.А. Ингибирование транскетолазы феррицианидом // Биохимия. - 2010. -Т. 75. - № 8. - С. 1120-1123 (0,29 п. л., доля авторского участия 82 %).

3. Vladimir A. Yurshev, Irina A. Sevostyanova, Olga N. Solovjeva, Svetlana V. Zabrodskaya, German A. Kochetov. Nonequivalence of transketolase active centers with respect to acceptor substrate binding // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2007. - V. 361. - № 4. - P. 1044-1047 (0,48 п. л., доля авторского участия 65 %).

4. Irina A. Sevostyanova, Vladimir A. Yurshev, Olga N. Solovjeva, Svetlana V. Zabrodskaya, German A. Kochetov. Effect of bivalent cations on the interaction of transketolase with its donor substrate // Proteins. - 2008. - V. 71. - № 2. - P. 541-545 (0,49 п. л., доля авторского участия 70 %).

5. Юршев В.А. Неэквивалентность активных центров транскетолазы по связыванию субстрата-акцептора // 12-ая Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006». - Москва. -2006.-С. 261 (0,04п. л.).

6. Юршев В.А. Влияние Са2+ на активность транскетолазы // 14-ая Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008»,- Москва. - 2008. - С. 31 (0,05 п. л.).

Подп. к печ. 17.11.2010 Объем 1,5 пл. 3аказ№123 Тир 100 экз.

Типография МПГУ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юршев, Владимир Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие свойства транскетолазы.

1.2. Структура транскетолазы.

1.3. Сравнение структур ano- и холотранскетолазы.

1.4. Кофакторы транскетолазы.

1.4.1. Взаимодействие апотранскетолазы с коферментом.

1.5. Структура субстратного канала.

1.5.1. Интермедиат транс кето л азной реакции -дигидроксиэтилтиаминдифосфат.

1.6. Механизм транскетолазной реакции.

1.7. Оптические характеристики транскетолазы.

1.7.1. Изменение оптических характеристик транскетолазы при связывании субстратов. sy i 04

1.8. Влияние двухвалентных катионов, Са и Mg , на конформацию и стабильность транскетолазы.

1.9. Функциональная неэквивалентность активных центров транскетолазы.

1.9.1. Неидентичность активных центров при химической модификации аминокислотных остатков.

1.9.2. Неэквивалентность активных центров по связыванию кофермента.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Связывание субстратов с транскетолазой Saccharomyces Cerevisiae и их каталитические превращения"

Актуальность проблемы. Транскетолаза (ТК) катализирует расщепление С-С связи субстрата донора (кетозы) и перенос образовавшегося двууглеродного фрагмента, остатка гликольальдегида, на субстрат-акцептор, функцию которого выполняют различного рода альдегиды. Фермент обладает широкой специфичностью, как по отношению к субстрату-донору, так и по отношению к субстрату-акцептору. Наряду с двусубстратной, трансферазной реакцией, ТК способна катализировать и односубстратную реакцию, с использованием только субстрата-донора, в отсутствие субстрата-акцептора. Продуктом реакции в этом случае является эритрулоза, которая образуется в результате конденсации двух остатков гликольальдегида, образовавшихся в результате расщепления двух молекул субстрата-донора.

Кофакторами ТК являются ТДФ и ионы двухвалентных металлов. В нативном холоферменте обнаружен только Са2+ в количестве 2 г • атом на моль белка. Другие двухвалентные катионы с успехом способны его заменить, причем на общей активности фермента это, по существу, не сказывается. В то же время, сравнительные исследования, проведенные с использованием в качестве кофактора Са и Mg , показали, что природа катиона существенно влияет на конформационные характеристики ТК.

Цель исследования. Целью настоящей диссертационной работы было исследование взаимодействия холотранскетолазы с физиологическими субстратами, ксилулозо-5-фосфатом и рибозо-5-фосфатом, и их каталитических превращений в отсутствие и в присутствии извне

24* 24* добавленных катионов - Са и М^ .

Задачи исследования.

1. Выявить влияние ионов двухвалентных металлов на кинетические характеристики фермента.

2. Определить неэквивалентность активных центров для транскетолазы.

3. Исследовать влияние ингибитора феррицианида на активные центры транскетолазы.

Научная новизна работы. Впервые показано, что для проявления каталитической активности холотранскетолазы достаточно наличия только структурированных в её составе ионов кальция.

24*

Установлено, что извне добавленный Са повышает общую активность холотранскетолазы, в равной степени выраженную по отношению к каждому из двух активных центров.

Показано, что исходно, в отсутствие свободных двухвалентных катионов, активные центры холотранскетолазы эквивалентны как по отношению их сродства к обоим субстратам, так и по их каталитической активности. В присутствии свободного, извне добавленного Са , выявляется их неэквивалентность — индуцируется отрицательная кооперативность при связывании обоих субстратов и положительная кооперативность - при их каталитическом превращении. В присутствии же М§2+, вместо ионов кальция, неэквивалентность активных центров не проявляется.

Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение работы состоит в формировании новых фундаментальных представлений о механизме функционирования и регуляции транскетолазы. Под механизмом функционирования, в данном случае, следует понимать процессы взаимодействия фермента с кофакторами, связывания субстратов и их каталитические превращения, характеристики индивидуальных стадий этих процессов, что открывает новые возможности в исследовании тиаминдифосфат-зависимых ферментов.

Научные положения, выносимые на защиту.

Наличие двух структурированных в составе молекулы холоТК атомов кальция оказывается достаточным для проявления каталитической активности фермента.

2. Ионы двухвалентных металлов влияют на общую активность холотранскетолазы.

3. Неэквивалентность активных центров транскетолазы определяется только в присутствии свободного, извне добавленного Са , в отличие от ионов магния, которые не способны индуцировать неэквивалентность.

Апробация результатов исследований. Результаты исследований были неоднократно представлены и обсуждены на семинарах отдела биохимии животной клетки НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского и на совместном заседании отдела биохимии животной клетки и факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ имени М. В Ломоносова, а также на конференциях молодых ученых "Ломоносов 2006" (Москва, 2006) и "Ломоносов 2008" (Москва, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 4 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, посвященных обзору литературы, описанию материалов и методов исследования, изложению результатов и их обсуждений, а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 33 рисунками и содержит 4 таблицы. Библиографический указатель включает в себя 84 источника: 22 отечественных и 62 иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Юршев, Владимир Александрович

выводы

1. Разработаны методы получения форм транскетолазы только с одним функционирующим активным центром: соответственно полухолотранскетолаза 1 и полухолотранскетолаза 2.

3. В присутствии свободных ионов кальция активные центры становятся неэквивалентными: индуцируется отрицательная кооперативность при связывании как ксилулозо-5-фосфата, субстрата-донора, так и рибозо-5-фосфата, субстрата-акцептора, и положительная кооперативность при их каталитическом превращении; кроме того — повышается общая активность фермента.

5. Структурно идентичные активные центры транскетолазы не являются функционально идентичными.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Двухвалентные катионы, в том числе и кальций, который обнаружен в нативном холоферменте, являются кофакторами транскетолазы. Другими словами, при определении активности всегда добавляют в среду двухвалентные катионы и ТДФ. Оказалось, что если в качестве ферментного препарата использовать холоТК, то добавление двухвалентных катионов не требуется. Активность определяется и в их отсутствие, хотя и несколько пониженная (рис. 19 и табл. 2, 3). Естественно при этом, что до добавления Са свободные двухвалентные катионы были удалены из реакционной среды.

Таким образом, наличие двух структурированных в составе молекулы холоТК атомов кальция оказывается достаточным для проявления каталитической активности фермента. При этом, сродство двух активных центров и к субстрату-донору, К5Ф, и к субстрату-акцептору, Р5Ф, определяется одинаковым. Не различаются они и по величине каталитической активности. Картина резко меняется, когда в реакционную среду добавляют ионы кальция (табл. 2 и 3). Активные центры становятся неэквивалентными: повышается сродство обоих субстратов к одному из них и понижается - к другому. В противоположном направлении меняется каталитическая активность активных центров: тот, который в присутствии Са2+ приобретает более высокое сродство к субстратам, становится менее активным и наоборот. Обращает на себя внимание одинаковая направленность изменений, в присутствии Са , кинетических параметров для обоих субстратов и идентичность, или малое различие их цифровых значений (табл. 2 и 3). Этого, по-видимому, следовало ожидать, так как субстраты близки по структуре, имеют общий субстратный канал и общую субстратную площадку на ферменте.

Кинетические характеристики полухолоТК 1 и полухолоТК 2, ферментов, в которых функционирует только один из двух активных центров, по существу не различаются между собой. Это справедливо, как для К5Ф, так и для Р5Ф, что означает, принимая во внимание данные,

Л | полученные с холоТК в отсутствие Са (табл. 2 и 3), что исходно эквивалентные активные центры ТК становятся неэквивалентными под влиянием извне добавленного Са2+: индуцируется отрицательная кооперативность при связывании субстратов и положительная кооперативность - при их каталитическом превращении.

1 О г

В отличии от Са , кинетические характеристики, полученные с М^ , не отличаются от кинетических характеристик, полученных в отсутствие извне добавленных катионов, если только не считать некоторого повышения значения Кш для Р5Ф (ср. табл. 3 и 4). То есть, М§2+ не способен, в отличие

Гу I от Са , индуцировать неэквивалентность активных центров ни при связывании субстратов, ни при их каталитическом превращении.

По существу, подобная картина наблюдалась и ранее при изучении п I взаимодействия ТДФ с апоТК. В присутствии Са активные центры проявляли явно выраженную отрицательную кооперативность - значение

Кт для одного из активных центров примерно на порядок превышало

2+ значение Кш для другого активного центра. В присутствии же М^ неэквивалентность активных центров или не выявлялась или если и выявлялась, то в очень слабой степени. И только в присутствии субстрата-донора (но не субстрата-акцептора) наличие отрицательной кооперативно сти обнаруживалось в явной степени [ЕБакоуа, О.А., МезЬа1кта, Ь. Е., Оо1Ык, К, НйЬпег, в., КосЬе1:оу, О.А., 2004; Есакова, О.А., Ханова, Е.А., Мешалкина, Л.Е., Голбик, Р., Хюбнер, Г., Кочетов, Г.А., 2005].

Инактивация транскетолазы под действием феррицианида обусловлена, по всей видимости, нарушением целостности тиаминдифосфата. Активные центры транскетолазы работают одновременно, но в противофазе, то есть, когда в одном из них кетоза расщепляется (первая стадия транскетолазной реакции), в другом она образуется (вторая стадия транскетолазной реакции - конденсация остатка гликольальдегида с субстратом-акцептором) [Ковина М.В., Куимов А.Н., Кочетов Г.А., 19936; Kovina, M.V., and Kochetov, G.A., 1998]. Исходно, по-видимому, тиаминдифосфат в одном из активных центров находится, в аминоформе, а в другом - в иминоформе [Kovina M.V., De Kok, A., Sevostyanova, I.A., Khailova, L.S., Belkina, N. V., Kochetov, G.A., 2004]. В процессе катализа осуществляется взаимопереход этих двух таутомерных форм кофермента [Schellenberger, А., 1998]. Нельзя исключить, что восприимчивость активных центров транскетолазы, сформированных при участии разных таутомерных форм тиаминдифосфата, неодинакова к воздействию феррицианида. Это и могло бы быть объяснением инактивации одного из них и стабильности - другого.

Так или иначе, полученные результаты являются еще одним доказательством функциональной неэквивалентности активных центров транскетолазы.

Согласно данным РСА, субъединицы димерной молекулы транскетолазы и ее активные центры не различаются между собой. Однако, структурная идентичность (или отсутствие различий) еще не говорит об их (активных центров) функциональной идентичности. Свидетельством чему являются результаты, полученные в процессе проведения настоящей диссертационной работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юршев, Владимир Александрович, Москва

1. Есакова O.A. Изменение свойств транскетолазы в результате ее взаимодействия с кофакторами и субстратами. Дис. . канд. биол. наук: 03.00.04 М.: МГУ. - 2005. - 140 с.

2. Есакова, O.A., Ханова, Е.А., Мешалкина, Л.Е., Голбик, Р., Хюбнер, Г., Кочетов, Г.А. Влияние субстратов транскетолазы на реконструкцию холофермента и его стабильность // Биохимия. 2005. — Т. 70. - С. 933940.

3. Ковина М.В., Куимов А.Н., Кочетов Г.А. Существенные остатки тирозина транскетолазы пекарских дрожжей. I. Определение типа и количества существенных остатков // Биохимия. 1993а. - Т. 58. - С. 1330-1340.

4. Ковина М.В., Куимов А.Н., Кочетов Г.А. Существенные остатки тирозина транскетолазы пекарских дрожжей. II. Исследование функции существенных остатков тирозина И Биохимия. 19936. — Т. 58. - С. 1341— 1350.

5. Ковина М.В., Селиванов В.А., Кочевова Н.В., Кочетов Г.А. Исследование кооперативного связывания кофермента активными центрами транскетолазы методом кинетического моделирования // Биохимия. -1997.-Т. 63.-С. 1155-1163.

6. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа, 1980.-272 с.

7. Кочетов Г.А. Транскетолаза: структура и механизм действия // Биохимия. 1986. - Т. 51. - С. 2010-2029.

8. Кочетов Г.А., Изотова А.Е. Реконструкция холотранскетолазы из апофермента и кофермента // Биохимия. 1973а. - Т. 38. - С. 552-559.

9. Кочетов Г.А., Изотова А.Е. Условия отщепления тиаминпирофосфата от холотранскетолазы // Биохимия. 19736. — Т. 38. — С. 954-957.

10. Кочетов Г.А., Кобылянская K.P., Белянова Л.П. Аминокислотный состав транскетолазы пекарских дрожжей // Биохимия. 1973. — Т. 38. — С. 1303-1306.

11. Кочетов Г.А., Усманов P.A. Изучение транскетолазы методом дисперсии оптического вращения // Биохимия. — 1970. Т. 35. - С. 611-621.

12. Кочетов Г.А., Филиппов • П.П. Влияние двухвалентных металлов на положение оптимума pH транскетолазной реакции // ДАН СССР. -1970а.-Т. 191.-С. 234-236.

13. Кочетов Г.А., Филиппов П.П. Кальций кофактор транскетолазы пекарских дрожжей // Биохимия. -19706. — Т. 35. - С. 422-424.

14. Куимов А.Н., Мешалкина JI.E., Кочетов Г.А. Функциональная карбоксильная группа в активном центре транскетолазы // Биохимия. -1993.-Т. 51.-С. 1908-1918.

15. Мешалкина JI.E., Кочетов Г.А. Роль остатков гистидина транскетолазы пекарских дрожжей // ДАН СССР. 1979. - Т. 246. - С. 228-231.

16. Мешалкина JI.E., Кочетов Г.А. Участие двухвалентных катионов во взаимодействии тиаминпирофосфата с апотранскетолазой пекарских дрожжей // ДАН СССР. 1979. - Т. 248. - С. 1482-1486.

17. Пустынников М.Г., Нейф X., Усманов P.A., Шелленбергер А., Кочетов Г.А. Функциональные группы тиаминпирофосфата в холотранскетолазе //Биохимия. 1986.-Т. 51.-С. 1003-1016.

18. Соловьева О.Н. Выделение и свойства нековалентного комплекса транскетолазы с РНК // Биохимия. 2002. - Т. 67. - С. 804-809.

19. Страйер Л. Биохимия. М.: Мир, 1985. - Т. 2. - 402 с.

20. Усманов Р.А., Кочетов Г.А. Связывание субстратов с транскетолазой пекарских дрожжей. Функция анионной группы субстрата-донора // Биохимия. 1983.-Т. 48.-С. 550-558.

21. Филиппов П.П., Тихомирова Н.К., Кочетов Г.А. Использование гель-фильтрации для изучения связывания лигандов с ферментами // В кн. Физико-химические методы молекулярной биологии. М.: Изд-во МГУ, 1978.-С. 57-64.

22. Cavalieri, S., Neet, K.E., Sable, H.Z. Enzymes of pentose biosynthesis. The quaternary structure and reacting form of transketolase from baker's yeast // Arch. Biochem. Biophys. 1975. -V. 171. - P. 527-532.

23. Christen, P., Cogoli-greuter, M., Healy, M.J., Lubin, D. Specific irreversible inhibition of enzymes concomitant to the oxidation of carbanionic enzyme substrate intermediates by hexacyanoferrate (III) // Eur. J. Biochem. — 1976. -V. 63.-P. 223-231.

24. Christen, P., Gasser. A. Production of glycolate by oxidation of the 1, 2-dihydroxyethyl-thiamin-diphosphate of transketolase with hexacyanoferrate (III) or H202 // Eur. J. Biochem. 1980. - V. 107. - P. 73-77.

25. Datta, A., Racker, E. Mechanism of action of transketolase. I. Properties of the cristalline yeast enzyme // J. Biol.Chem. 1961a. - V. 236. - P. 617-624.

26. Datta, A.G., Racker, E. Mechanism of action of transketolase. II. The substrate-enzyme // J. Biol.Chem. 19616. - V. 236. - P. 624-628.

27. Dobritzsch, D., Konig, S., Schneider, G., Lu, G. High resolution crystal structure of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis. Implications for substrates activation in pyruvate decarboxylases // J. Biol. Chem. 1998.- V. 273. P. 20196-20204.

28. Dyda, F., Furey, W., Swaminathan, S., Sax, M., Farrenkopf, B., Jordan, F. Catalytic centers in the thiamin diphosphate enzyme pyruvate decarboxylase at 2,4 Ä resolution // Biochemistry. 1993. - V. 32. - P. 6165-6170.

29. Egan, R.M., Sable, H.Z. Transketolase kinetics. The slow reconstitution of the holoenzyme is due to rate-limiting dimerization of the subunits // J. Biol. Chem. 1981. - V. 256. - P. 4877-4883.

30. Esakova, O.A., Meshalkina, L. E., Golbik, R., Hübner, G., Kochetov, G.A. Donor substrate regulation of transketolase // Eur. J. Biochem. 2004. - V. 271.-P. 4189-4194.

31. Esakova., O.A., Meshalkina, L.E., Kochetov, G.A. Effects of transketolase cofactors on its conformation and stability // Life Sei. 2005. - V. 78. - P. 813.

32. Fiedler, E., Golbik, R., Schneider, G., Tittmann, K., Neef, H., König, S., Hübner, G. Examination of donor substarte conversion in yeast transketolase //J.Biol. Chem. -2001.-V. 276.-P. 16051-16058.

33. Fletcher, T., Kwee, I., Nakada, T., Largman, C., Martin B. DNA sequence of the yeast transketolase gene // Biochemistry. 1992. - V. 31. - P. 1892-1896.

34. Frank R.A., Titman C.M., Pratap J.V., Luisi B.F., Perham R.N. A molecular switch and proton wire synchronize the active sites in thiamine enzymes //

35. Science. 2004. - V. 306. - P. 872-876.

36. Golbik, R., Neef, H., Hubner, G., Konig, S., Seliger, B., Meshalkina, L., Kochetov, G., Schellenberger, A. Function of the aminopyrimidine part in thiamine pyrophosphate enzymes // Bioorg. Chem. 1991. - V. 19. - P. 10— 17.

37. Heinrich, C. P., Steffen, H., Janser, P., Wiss, O. Studies on the reconstitution on of apotransketolase with thiamine pyrophosphate and analogs of the coenzyme // Eur. J. Biochem. 1972. - V. 30. - P. 533-541.

38. Heinrich, C.P., Noack, K., Wiss, O. Chemical modification of thryptophan at the binding site of thiamine pyrophosphate in transketolase from baker's yeast //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. - V. 49. - P. 1427-1432.

39. Jordan, F., Chen, G., Nishikowa, S., Sundoro, W. Potential roles of the aminopyrimidine ring in thiamin catalyzed reaction // Ann. N.Y. Acad. Sci. -1982.-V. 378.-P. 14-29.

40. Jung, E.N., Takeuchi, T., Nishino, K., Itokawa, Y. Studies on the nature of thiamine pyrophosphate binding and dependency on bivalent cations of transketolase from human erythrocytes // Int. J. Biochem. 1988. - V. 20. -P. 1255-1259.

41. Kern, D., Kern, G., Neef, H., Tittmann, K., Killenberg, M., Wikner, Ch., Scneider, G., Hubner, G. How thiamine diphosphate is activated in enzymes // Science. 1997. - V. 275. - P. 67-70.

42. Kochetov G.A., Philippov P.P., Razjivin A.P., Tikhomirova N.K. Kinetics of reconstruction of holotransketolase // FEBS Lett. 1975. - V. 53. - P. 211212.

43. Kochetov G.A., Tikhomirova N.K., Philippov P.P. The binding of thiaminepyrophospate with transketolase in equilibrium conditions // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. - V. 63. - P. 924-930.

44. Kochetov, G.A., Philippov, P.P. Calcium: cofactor of transketolase from baker's yeast // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1970. - V. 38. - P. 930933.

45. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A. Charge transfer interactions in transketolase-thiamine pyrophosphate complex // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1970.-V. 41.-P. 1134-1140.

46. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Merzlov, V.P. Thiamin pyrophosphate induced change of the optical activity of baker's yeast transketolase // FEBS Lett. 1970. - V. 9. - P. 265-266.

47. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Meshalkina, L.E. The number of active sites in a molecule of transketolase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. -V. 69.-P. 839-843.

48. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Mevkh, A.T. The role of the charge transfer complex in the transketolase catalized reaction // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973.-V. 54.-P. 1619-1626.

49. Kovina M.V., Bykova I.A., Solovjeva O.N., Meshalkina L.E., Kochetov G.A. The origin of the absorption band induced through the interaction between apotransketolase and thiamin diphosphate // Biochem. Biophys. Res. Commun.-2002.-V. 294.-P. 155-160.

50. Kovina M.V., De Kok, A., Sevostyanova, I.A., Khailova, L.S., Belkina, N. V., Kochetov, G.A. Structure, Function, and Bioinformatics // Proteins. 2004. -V. 56.-P. 338-345.

51. Kovina, M.V., and Kochetov, G.A. Cooperativity and flexibility of active sites*in homodimeric transketolase // FEBS Lett. 1998. - V. 440. - P. 81-84.

52. Kovina, M.V., Selivanov, V.A., Kochevova, N.V., Kochetov, G.A. Kinetic mechanism of active site non-equivalence in transketolase // FEBS Lett. -1997.-V. 418.-P. 11-14.

53. Lindqvist Y., Schneider G., Ermler V., Sundstrom M. Three-dimensional structure of transketolase, a thiamine diphosphate dependent enzyme, at 2.5 A resolution//EMBO J. 1992. - V. 11. - P. 2373-2379.

54. Meshalkina, L., Nilsson, U., Wikner, Ch., Kostikowa, T., Schneider, G. Examination of the thiamin diphosphate binding site in yeast transketolase by site-directed mutagenesis // Eur. J. Biochem. 1997. - V. 244. - P. 644-652.

55. Meshalkina, L.E., Kochetov, G.A. The functional identity of the active centers of transketolase // Biochim. Biophys. Acta. 1979. - V. 571. - P. 218-223.

56. Muller, Y. A., Schumacher, G., Rudolph, R., Schulz, G. E. The refined structures of a stabilized mutant and of wild-type pyruvate oxidase from Lactobacillus plantarum // J. Mol. Biol. 1994. - V. 237. - P. 315-323.

57. Muller, Y., Shulz, G. Structure of the thiamin and flavin-dependent enzyme pyruvate oxidase // Science. 1993. - V. 259. - P. 965-967.

58. Nikkola, M., Lindqvist, Y., Schneider, G. Refined structure of transketolase from Saccharomyces cerevisiae of 2.0 A resolution // J. Mol. Biol. 1994. — V. 238.-P. 387-404.

59. Nilsson, U., Lindqvist, Y., Kluger, R., Schneider, G. Crystal structure of transketolase in complex with thiamin thiazolone diphosphate, an analogue of the reaction intermediate, at 2,3 A resolution // FEBS Lett. 1993. - V. 326. -P. 145-148.

60. Nilsson, U., Meshalkina, L., Lindqvist, Y., Schneider, G. Examination of substrate binding in thiamine diphosphate-dependent transketolase by protein crystallography and site-directed mutagenesis // J.Biol.Chem. -1997. V. 272.-P. 1864-1869.

61. Schellenberger, A. Sixty years of thiamine diphosphate biochemistry // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V. 1385. - P. 177-186.

62. Schellenberger, A. Structure and mechanism of action of the active center of yeast pyruvate decarboxylase // Angew. Chem. 1967. - V. 6. - P. 10241035.

63. Schenk, G., Duggleby, R., Nixon, P. Properties and functions of the thiamine diphosphate dependent enzyme transketolase // Inter. J. Biochem. & Cell Biol. 1998. - V. 30.-P. 1297-1318.

64. Schneider G., Lindqvist Y. Crystallography and mutagenesis of transketolase: mechanistic implications for enzymatic thiamin catalysis // Biochim. Biophys. Acta.- 1998,-V. 1385.-P. 387-398.

65. Selivanov, V.A., Kovina, M.V., Kochevova, N.V., Meshalkina, L.E., Kochetov, • G.A. Kinetic study of the HI03A mutant yeast transketolase // FEBS Lett 2004. - V. 567. - P. 270-274.

66. Selivanov, V.A., Kovina, M.V., Kochevova, N.V., Meshalkina, L.E., Kochetov, G.A. Studies of thiamin diphosphate binding to the yeastapotransketolase // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2003. - V. 26.-P. 33-40.

67. Shin, W., Pletcher, J., Blank, G., Sax, M. Stereochemistry of intermediates in thiamin catalysis. 2. Crystal structure of DL-2-(oc-hydroxybenzyl) thiamine chloride hydrochloride trihydrate // J. Am. Chem.Soc. 1977. - V. 99. - P. 1396-1403.

68. Singleton, C., Wang, J., Martin, P. Conserved residues are functionally distinct within transketolases of different species // Biochemistry. 1996. -V. 35.-P. 15865-15869.

69. Sundstrom, M., Lindqvist, Y., Schneider, G. Three-dimensional structure of apotransketolase. Flexible loops at the active site enable cofactor binding // FEBS Lett. 1992. - V. 313. - P. 229-231.

70. Tittmann K., Golbik R., Uhlemann K., Khailova L., Schneider G., Patel M., Jordan F., Chipman D.M., Duggleby R.G., Hubner G. NMR analysis of covalent intermediates in thiamin diphosphate enzymes // Biochemistry. -2003. V. 42. - P. 7885-7891.

71. Usmanov R., Sidorova N., Kochetov G. Interaction of dihydroxyethylthiamine pyrophosphate with transketolase // Biochem. Mol. Biol. Intern. 1996. - V. 38.-P. 307-314.

72. Usmanov, R.A., and Kochetov, G.A. Interaction of baker's yeast transketolase with substrates // Biochem. Int. 1982. - V. 5. - P. 727-734.

73. Wikner Ch., Nilsson, U., Meshalkina, L., Udekwu, C., Lindqvist, Y., Schneider, G. Identification of catalytically important residues in yeast transketolase // Biochemistry. 1997. - V. 36. - P. 15643-15649.

74. Wikner, Ch., Meshalkina, L., Nilsson, U., Backstrom, S., Lindqvist Y., Schneider, G. His 103 in yeast transketolase is required for substrate recognition and catalysis // Eur. J. Biochem. 1995. - V. 233. — P. 750-755.

Информация о работе

Юршев, Владимир Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Связывание субстратов с транскетолазой Saccharomyces Cerevisiae и их каталитические превращения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы