Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазной

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизм связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазной"

003057T8G

/П

На правах рукописи

ОСПАНОВ РУСЛАН ВАИТОВИЧ

МЕХАНИЗМ СВЯЗЫВАНИЯ ТИАМИНДИФОСФATA С АНОТРАНСКЕТОЛАЗОЙ

03.00,04 -биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

003057786

Работа выполнена на факультете биоинженериа и био информатики Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова, в отделе биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова и в лаборатории ферментных систем Института биохимии им. А.Н.Баха РАН

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Г. А.Кочетов доктор химических наук, профессор Б.И.Курганов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Н.Н.Чернов доктор химических наук, профессор А.К.Гладилин

Ведущая организация: Институт экспериментальной и теоретической биофизики РАН, Пущино

Защита состоится «Ю » о-^^аЛлаЛ- 2007 г. в ¿Г час. на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литер РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « » с/О-^у ^^^-0.007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, ^Г я

кандидат биологических наук / А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Транскетолаза (ТК*, седогептулозо-7-фосфат: Д-глицеральдегид-3-фосфатгликольальдегидтрансфераза, КФ 2.2.1.1) - ключевой фермент пентозофосфатного пути превращения углеводов. Фермент катализирует перенос остатка гликольальдегида с кетозы (субстрат-донор) на альдозу (субстрат-акцептор) и является простейшим представителем группы тиаминдифосфат-зависимых ферментов. Функцию кофакторов выполняют двухвалентные катионы - Са2+, и др.

ТК из БассИаготусе.*; сегет$1аеь которая является объектом настоящего исследования, достаточно хорошо изучена. Фермент является гомодимером, имеет два структурно эквивалентных активных центра с идентичной каталитической активностью. Проведен рентгеноструктурный анализ ТК, идентифицированы функциональные группы апобелка и кофермента. Показаны существенные различия в свойствах фермента в зависимости от типа катиона, используемого в качестве кофактора. Интенсивно изучается механизм транскетолазной реакции в рамках общей проблемы тиаминового катализа. Что касается кинетического механизма функционирования ТК, механизма ее взаимодействия с ТДФ, характеристики индивидуальных стадий этого процесса, то сведения здесь достаточно ограничены.

Показано, что связывание ТДФ с апоТК происходит в две стадии: первая - быстрая и легко обратимая, приводящая к образованию неактивного промежуточного комплекса фермент-кофермент. Вторая стадия - относительно медленная, связанная с конформационными изменениями активного центра и приводящая к образованию каталитически активного холофермента. В литературе были указания на существование взаимодействий между кофермент-связывающими центрами, однако строгий анализ этих взаимодействий не проводился из-за отсутствия соответствующей теоретической модели. Данные вопросы и предстояло исследовать в диссертационной работе.

*Список сокращений: ТК - транскетолаза, ТДФ -тиаминдифосфат.

Целью настоящей работы является исследование механизма связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазой. Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Построить теоретическую модель взаимодействия димерного белка с лигандом, с учетом двухстадийного механизма его связывания.

2. Рассчитать значения равновесных и кинетических констант связывания ТДФ с апотранскетолазой.

3. Исследовать влияние субстрата на связывание ТДФ с апотранскетолазой.

4. Исследовать кооперативные взаимодействия между активными центрами транскетолазы.

Научная новизна работы

Разработана модель с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами в димерной молекуле белка. Модель включает стадию конформационного изменения субъединицы, связавшей лиганд. В рамках этой модели получены строгие математические выражения, описывающие кривые спектрофотометрического титрования апотранскетолазы тиаминдифосфатом.

Проведен теоретический анализ кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами дня модели Моно, Уаймена, Шанже и Кошланда, Немети, Филмера. Для этой цели разработан новый метод анализа кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами белка с помощью графика зависимости степени конформационных изменений белка от степени насыщения белка лигандом.

Проведен количественный анализ кооперативных взаимодействий между тиаминдифосфат-связывающими центрами в молекуле транскетолазы.

Составлены кинетические уравнения, описывающие кинетику связывания ТДФ с апоТК. Определены константы скорости для индивидуальных стадий процесса образования каталитически активного холофермента из ano- и кофермента при использовании Са2+ и Mg2+ в качестве кофактора, в отсутствие и в присутствии субстрата.

Практическая значимость

Разработанная модель для белка с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами может быть использована для анализа процесса связывания лиганда с любым аллостерическим белком, имеющим два лиганд-связывающих центра.

Предлагаемый новый метод характеристики кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами белка с помощью графика зависимости степени конформационных изменений белка от степени насыщения его лигандом может быть использован для теоретического анализа кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами для различных моделей аллостерических ферментов.

Полученные в работе результаты, заключения и выводы могут быть использованы при чтении лекций по энзимологии, биохимии и ферментативной кинетике на кафедрах биохимии биологических факультетов и медицинских институтов.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на XVII зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005), на XI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), на XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), на XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2006» (Москва, 2006), на Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 7 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах и состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 2

таблицы и 33 рисунка. Список литературы включает 91 литературный источник.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее было показано (Кочетов, Изотова, 1973), что процесс образования

холоТК происходит как минимум в две стадии (схема 1). На первой (быстрой и

легко обратимой) стадии происходит

^ к+1 взаимодействие ТДФ с апоТК, в

ТК + ТДФ ТК-ТДФ =*=^ТК*-ТДФ

к 1 результате чего образуется

Схема 1. Связывание тиаминдифосфата с промежуточный, легко диссоциирующий транскетолазой. неактивный комплекс ТК-ТДФ. Затем

осуществляется изомеризация формы ТК—ТДФ в форму ТК*-ТДФ с образованием достаточно стабильного, каталитически активного холофермента. Вторая стадия, в отличие от первой, медленная, связанная с конформационными изменениями молекулы белка.

Модель с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами. Рассмотрим теперь модель двустадийного связывания лиганда с димерным белком, когда существует взаимодействие между лиганд-связывающими центрами (схема 2). Здесь ЕЕ - исходный димер белка, содержащий два лиганд-связывающих центра; Ь - лиганд; ЕЕ и ЕЕ - димерные

формы белка, содержащие один конформационно измененный лиганд-связывающий центр (Е); ЕЕ - димерная форма белка с двумя конформационно измененными лиганд-связывающими

Схема 2. Связывание лиганда с Центрами; Ка - микроскопическая константа

взаимодействующими лиганд- дисс0цишдаи комплекса белок-лиганд; Кх и связывающими центрами

димеоного белка. Кг - равновесные константы

информационного перехода для первого лиганд-связывающего центра, связавшего лиганд, и второго центра, связавшего лиганд после того, как лиганд связался в первом центре, соответственно. Предполагается, что оба лиганд-

связывающих центра структурно идентичны и поэтому лиганд может равновероятно связаться как с «левым», так и с «правым» центром димера ЕЕ. В этом случае образуется либо форма LEE, либо форма EEL (этот переход описывается константой далее в скобках будет указана константа, характеризующая конкретную стадию), которые между собой неразличимы, кроме положения лиганда. Форма LEE или EEL затем либо связывает второй лиганд с образованием формы LEEL (КД либо в лиганд-связывающем центре, содержащем лиганд, происходит его конформационное изменение, в результате чего образуется форма LEE, или EEL, соответственно (Kj). В форме LEEL равновероятно происходит образование форм LEEL или LEEL (Ki), но для форм LEE и EEL образование форм LEEL и LEEL происходит в соответствии с положением лиганд-связывающего центра, не занятого лигандом (Ка). На последней стадии связывания лиганда происходит завершающее конформационное изменение в том центре, в котором оно еще не произошло, что приводит к образованию формы LEEL. соответственно, из форм LEEL, или LEEL (К2).

Запишем функцию для доли форм белка, связанных с лигандом (Г), через

все формы белка, содержащие лиганд:

у 2 [EEL]+2[EEL] + 2([LEEL]+2[LEEL]+[LEEL]) 2[E]0

Подставив в полученное уравнение (1) выражения для форм белка, получим:

1 . [L] 2 1 , [L]2

(1+—)•—+(1+—+-)'М"

Y __KI _К, К,-К2 Kd

Kj К, K,-K2 Kd

Теперь запишем выражение функции для доли конформационно измененных

форм белка (Z) так же, как и для (Y), но только через сумму всех

конформационно измененных форм белка:

z = 2 [EEL]+2[LEEL]+[LEEL] 2[Е]0

Так же как и для уравнения (2). подставляем выражения для форм белка:

(4)

И „ 1 . [Ь]2 1 1 +(1+— -Ка_К2 К^Кд

1

И2

к,

К, К, - К, к?

IV! 1-4 и.2

При |Ъ] оо значение Z приближается к предельному значению:

7 1 +

1 + 2 Кг + К{К2'

Нормированное значение 2 принимает вид 7

.....=-

[Ь]2 К.-К2

1

м2

(5)

(6)

К, К„ К, К! • К2 К; Построение графиков зависимостей степени насыщения белка лигандом (10) степени конформационных изменений (2) и нормированной степени конформационных изменений (¿'„ори) от концентрации лиганда Ь

В тех случаях, когда экспериментальные

данные позволяют рассчитать степень

насыщения белка лигандом и степень

конформационных изменений при

различных концентрациях лиганда, может

быть построен трехмерный график,

связывающий величины У и |Ъ].

_ , „ , Типичный график подобного типа

Рис.1. Трехмерный график

зависимости степени насыщения У представлен на рис.1. Из данного графика и нормированной степени

конформационных изменений можно построить проекцию на плоскость ДЮр„ от концентрации свободного лиганда [Ь] (К^ = 800, К1 = 0.01, Аормч Кг = 1). График рассчитан по уравнениям (2) и (6).

При К\ « 1 (например, при Кл =0,01;

рис. 2а) отклонения от прямой, проходящей под углом 45°, могут наблюдаться

только в случае кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими

-00 и зависимость.

проанализировать

эту

центрами. На графиках зависимости Zищм от У подобные отклонения проявляются в виде кривых, располагающихся выше прямой, проходящей под

Рис.2. Теоретические зависимости 2норм от 7 при следующих значениях параметра К\: а -К\ - 0,01, б - К\ = 1, е - К\ = 100. Цифры около кривых соответствуют значению параметра а (а = К2/К1). Графики рассчитаны по уравнениям (2) и (6).

углом 45°, и выражены тем сильнее, чем больше значение параметра а. Эти

отклонения соответствуют отрицательной кооперативности.

При значении константы К\ » 1 (например, при К\ = 100; рис. 2в) отклонения от прямой, проходящей под углом 45°, могут наблюдаться только в случае положительной кооперативности взаимодействия между лиганд-связывающими центрами. На графиках 2норм от Г эти отклонения проявятся в виде кривых, расположенных ниже прямой, проходящей под углом 45°, и выражены тем сильнее, чем меньше значение а (рис. 2в).

При К1 = 1 (рис. 26) отклонения от прямой, проходящей под углом 45°, могут быть связаны как с положительными, так и с отрицательными кооперативными взаимодействиями между лиганд-связывающими центрами.

Возможность практического применения разработанной нами модели мы проверили на транскетолазе. В качестве экспериментальных данных использовали результаты спектрофотометрического титрования апотранскетолазы коферментом, тиаминдифосфатом, полученных в отделе биохимии живой клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета [1, 2]. Сущность метода спектрофотометрического титрования заключается в том, что при взаимодействии ТДФ с ТК в спектре поглощения фермента появляется новая

полоса в области 300-340 нм, которая отсутствовала у исходных компонентов [З-б]. Появление этой полосы характеризует образование каталитически активного холофермента и ее интенсивность строго коррелирует с количеством кофермента, связавшегося с активными центрами транскетолазы. Специфические изменения спектра при связывании ТДФ и обнаруженные при этом закономерности давали возможность детально исследовать процесс взаимодействия кофермента с апобелком и влияние на него лигандов.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТДФ С апоТК В ПРИСУТСТВИИ Mg2+ В КАЧЕСТВЕ КОФАКТОРА Определение константы диссоциации, К<1, комплекса ТК—ТДФ (схема 1) Если попытаться определить четыре микроскопические константы при математической обработке данных спектрофотометрического титрования, а

именно Кд, 1ч, К2 и е, то можно столкнуться с тем, что достоверно определить одновременно все эти параметра из экспериментальных данных нельзя. В теоретических уравнениях присутствует произведение двух констант (К^-е), поэтому найти каждую из них одновременно не представляется возможным. Выйти из данной ситуации можно, если один из параметров будет известен. В частности, из экспериментальных данных, полученных методом остановленного потока (рис. 3), можно определить значение константы диссоциации первичного комплекса ТК-ТДФ (Ка на схеме 1).

Для этого, сначала необходимо найти зависимость начальной скорости связывания ТДФ с апоТК от концентрации кофермента. Для определения значений начальных скоростей связывания ТДФ с апотранскетолазой

Рис.3. Кинетика реконструкции холотранскетолазы в присутствии с использованием различных концентраций ТДФ: 0,15; 0,3; 1; 2 и 3 мМ (соответственно, кривые 1-5). 25 мМ глицил-глициновый буфер, рН 7,6; 2,5 мМ МвС12; 6,75 мкМ ТК [1]. На рисунке показаны начальные участки кривых, для которых были проведены касательные с целью определения начальной скорости связывания. ТДФ с апоТК.

необходимо для каждого начального участка кривой (для конкретной концентрации ТДФ) построить касательную. Данный участок будет характеризовать значение начальной скорости; это будет значение тангенса

Полученная зависимость начальной

скорости связывания (v0) от

концентрации ТДФ (рис. 4) описывается

простой гиперболической функцией:

_ Уо.„Ра[ТДФ] v°" +[ТДФ]' )

где v0>npea предельное значение v0 при [ТДФ] —» оо, a K¿ - микроскопическая константа диссоциации комплекса ТК-ТДФ.

Значение vo.npea характеризует скорость информационного перехода EEL -> ЕЁЬ.

уо,прсл = 2ei+1[E]0, (8)

где е - коэффициент молярной экстинкции комплекса ТДФ с конформационно измененным активным центром (Ё), а к¥Л - константа скорости конформационного перехода EEL EEL или LEE —»LEE. В результате математической обработки данных рис.4 мы получили следующие значения параметров Уо,пред и Kd: v0jnpw = 0,0029 ± 0.0004 ДЛ32о/сек и K¿ = 1,6 ± 0,1 мМ.

Определение равновесных констант KiuK2

Значение K<¡ было использовано нами для анализа функции насыщения ТК тиаминдифосфатом, приведенной на рис. 5 (кривая 1). Для описания зависимости А^о от концентрации кофермента мы использовали уравнения (2) и (4). В выражение для Z входит концентрация свободного ТДФ, [Т], которая связана с общей концентрацией кофермента ([Т]0бщ) следующим соотношением:

угла наклона касательной.

Рис.4. График зависимости начальной скорости (уо) взаимодействия ТДФ с апоТК от концентрации ТДФ. о -рассчитанные значения начальной скорости для соответствующей концентрации ТДФ, сплошная линия -результат математической обработки с помощью уравнения (7) для рассчитанных значений уо.

о.оз 2

[Т] = [Т]0бд- 2е[Е]оГ.

(9)

Увеличение оптической плотности (А32о) при титровании апоТК тиаминдифосфатом может быть рассчитано

так:

0,00 50 100 150 200

[ТДФЦ,,мкМ

Л32о = 2e[E]oZ.

Для выяснения

соответствия

(10)

Рис. 5. Титрование апотранскетолазы

тиаминдифосфатом в отсутствие (7) теоретического уравнения

и в присутствии (2) 2,5 мМ экспериментальным данным использовали субстрата-донора, гидроксипирувата

(50 мМ глицил-глициновый буфер, программу Scientist (MicroMath, США), в рН 7,6, 2,5 мМ MgCI2, апоТК 0,7

мг/мл [2]). Точки - результате чего мы получили К\ = 0,0006 +

С учетом полученных значений (К\, К2, К&, е), мы проанализировали кинетические данные по связыванию ТДФ с транскетолазой, представленные на рис. 6. Сначала, с помощью уравнения (8), мы определили константу скорости £ц. Она оказалась равной 1,33 ± 0,2 с-1. Затем, подставив значения и К\ в уравнение кл = к+\К\, мы определили константу скорости обратного конформационного перехода: кл = 0,0008 ± 0,0001 с-1.

Для расчета констант скорости прямого и обратного конформационного перехода (соответственно, к+2 и к.2) для второго кофермент-связывающего активного центра фермента мы использовали в соответствии со схемой 2 приводимые ниже кинетические уравнения. Сначала мы разделили все формы фермента на три пула:

экспериментальные данные, кривые рассчитаны с помощью уравнений (2), (4), (9) и (10).

0,0002, Кг = 0,0066 ± 0,0007, е = 0,00269 ± 0,00002 мкМ-1 см"1.

Определение констант скорости конформационного перехода ТК—ТДФ <-+ ТК*-ТДФ во втором активном центре ТК.

Pi = [ЕЕ]+[ТЕЕ]+[ЕЕТ]+[ТЕЕ], Р2 = [ЕЁТ]+[ТЁЕ]+[ТЕЁТ]+[ТЁЕТ], Р3 = [ТЁЁТ].

(П) (12) (13)

Сумма всех пулов равна общей концентрации активных центров ТК, [Е](). Конформационные изменения между пулами описываются следующими дифференциальными уравнениями:

dP, dP2 dP

= v . } Р -Ok Р

ф ' [ТЕЕГ] +2 2 —2 3

(14)

В этих уравнениях

УрЕп.ГцЕЕфГратУггЕщ - ДОЛИ Ф°РМ

фермента в соответствующих пулах: 2*„[Т]

m2

К]+2Кл[Г\+[Г\г'

20 ДО Ж

Время, сек

Рис. 6. Кинетика связывания ТДФ транскетолазой при использовании в качестве кофактора Mg2+ (50 мМ глицин- ^р-нщ g • глициновый буфер, рН 7,6, 6,75 мкМ (димер) d

ТК). Кинетические кривые получены при концентрациях ТДФ 150, 300, 1000, 2000 и 3000 мкМ (кривые 1-5, соответственно). На выражения вставке - кинетика связывания ТДФ транскетолазой в присутствии 1 мМ диссоциации гидроксипирувата; [ТДФ] = 150 мкМ [1]. . my- [Т]

Кривые рассчитаны с помощью уравнений Кд - 1ЕЕ1 = ...1?^ J_'[eet]1 (11)—(20). Yieeti 2ГггЕЕЧ Грйп

у - - К<

' [еег]

[Т]

■d+n

Принимая во для

(15)

(16)

(17)

(18)

внимание константы

(19)

и уравнения материального баланса, У(Щ + У[ПЕТ)+УП1,ЕТ,=1 и у^+у^,

получаем следующее выражение, характеризующее изменение поглощения во времени:

сЫ

dP,

(20)

с1/ V & &.

Мы использовали уравнения (14) и (20) для анализа кинетических кривых связывания ТДФ с ТК, приведенных на рис. 6. При этом, значение к+2 было

рассчитано для каждой кинетической кривой. Математический анализ был осуществлен с помощью программы Scientist. Среднее значение к+2 составило 0,42 ± 0,01 с-1. Теперь, зная К2 и определив h2, можно рассчитать константу скорости k2: k.2 = K2k+1 = 0,0028 ± 0,0001 с"1.

Определение констант индивидуальных стадий связывания ТДФ с апоТК в присутствии субстрата-донора Из рис. 5 (кривая 2) видно, что значительная часть начального участка кривой титрования ТК тиаминдифосфатом в присутствии гидроксипирувата представлена прямой линией, что указывает на очень высокое сродство ТДФ к участку связывания кофермента в первом активном центре: весь добавляемый кофермент полностью связывается с апобелком. По этой причине мы не смогли определить значение К\ (а также значение к.\) и во всех последующих расчетах принимали, что константа К\ имеет достаточно низкое значение (10"4). На основании данных, представленных на рис. 5 (кривая 2), использовав уравнения (2), (4), (9), (10) и приняв константу К равной ЮЛ а константу Kd равной таковой в отсутствие субстрата (1,6 мМ), мы получили г = 0,00269 + 0,00002 мкМ1 см"1 и К2 = 0,008 ± 0,001. Заметим, что те же самые значения ей К2 были получены и в том случае, если мы при расчетах использовали значения Кг < Ю"4.

При обработке экспериментальных данных, представленных на вставке рис. 6, с помощью уравнений (14)-(20) получены следующие значения кинетических констант скорости конформационных переходов во втором активном центре: k,2 = 0,037 ± 0,005 с"1 и к2 = 0,00030 ± 0,00004 с-1.

Определение равновесных и кинетических констант индивидуальных стадий связывания ТДФ с апоТК в присутствии Са2+ Анализ экспериментальных данных по связыванию ТДФ с апотранскетолазой при использовании в качестве кофактора Са2+ проводили так же, как и в присутствии Mg2+. Данные по кинетике реконструкции холоТК из апоТК и кофермента, полученные методом остановленного потока, приведены на рис. 1а, а на рис. 16 показана построенная на основании данных рис. 1а

12

зависимость начальной скорости взаимодействия ТДФ с апоТК (у0) от концентрации кофермента. В результате анализа этой зависимости с помощью уравнения (7) получили Кй = 340 ± 80 мкМ и у0>пргд = 0,0027 ± 0,0002 АА32(/с.

Врет, Ш. [ТДФ], мкМ

Рис. 7. Кинетика взаимодействия ТДФ с апотранскетолазой (25 мМ глицил-глициновый буфер, рН 7,6, 2,5 мМ СаСЬ, 6,75 мкМ (димер) апоТК). а - кинетические кривые получены при концентрациях ТДФ 75, 150, 300, 445 и 890 мкМ (кривые 1-5, соответственно). На вставке - кинетика связывания ТДФ транскетолазой в присутствии 1 мМ гидроксипирувата; концентрация ТДФ = 75 мкМ [1]. Сплошные кривые рассчитаны с помощью уравнений (11)-(20). б - зависимость начальной скорости связывания ТДФ с апоТК (уо) от исходной концентрации ТДФ. Точки получены экспериментально, кривая рассчитана с помощью уравнения (7).

Данные спектрофотометрического титрования апоТК тиаминдифосфатом представлены на рис. 8 (кривая 1). Как и в экспериментах с в присутствии субстрата (рис. 5, кривая 2), сродство кофермента к ТЕС столь велико, что первые порции добавляемого кофермента полностью связываются с первым активным центром фермента и начальный участок кривой - прямая линия. Поэтому, как и в случае с М§2+ в присутствии субстрата, определить значение равновесной константы для первого активного центра К\ (а также значение к.\) было невозможно, и мы приняли константу К\ равной 10~Л Значения остальных параметров, определенные с помощью данных, которые приведены на рис. 7 и 8 (кривая 1\ таковы: 8 = 0,00375 ± 0,00002 мкМ"1 см"1, Кг = 0,0013 ± 0,0001 (аналогичные значения для этих параметров были получены при значениях К\ < ЮЛ кг 1 = 0,8 ± 0,1 с-1, к,2 = 0,23 ± 0,05 с"1, к2 = 0,00029 ± 0,00006 с-1.

Присутствие субстрата-донора при титровании ТК тиаминдифосфатом сопровождается повышением сродства кофермента к апобелку (ср. кривые 1 и 2 на рис. 8). Поэтому ограничения, используемые при определении кинетических характеристик индивидуальных стадий процесса взаимодействия ТДФ с апоТК в отсутствие субстрата, естественно, сохраняются и в данном случае. С этими ограничениями при анализе данных, приведенных на рис. 6 и на вставке рис. 7а, были получены следующие значения исследуемых параметров: г = 0,00375 ± 0,00002 мкМ"1 см-1; К2 = 0,00061 ± 0,00004; к+2 = 0,32 ± 0,04 с"1 и к.г = 0,00019 ± 0,00002 с"1 (значение при расчетах принимали равным полученному в экспериментах без субстрата).

Итак, на первой стадии взаимодействия ТДФ с апоТК (схема 1), когда образуется промежуточный комплекс ТК---ТДФ, значение константы его диссоциации (Кс1) определяется типом катиона, используемого в качестве кофактора: в присутствии М§2+ оно равно 1,6 мМ, а в присутствии Са2+ - 0,34 мМ (табл. 1).

20 40

[ТДФЦ,, мкМ

Рис. 8. Реконструкция холоТК из апоТК и кофермента в отсутствие субстрата (У) и в присутствии 2,5

Однозначно показано, что в

мМ гидроксипирувата (2) (50 мМ присутствии М§ , как и в присутствии Са глицил-глициновый буфер, рН 7,6,

2,5 мМ СаС12, апоте 0,67 мг/мл, существует отрицательная ^оперативность

температура 25°). Точки получены между активными центрами ТК при экспериментально [2], сплошные

кривые рассчитаны с помощью связывании ТДФ, причем, во втором случае уравнений (2\ С41. (9) и (101.

она выражена в большей степени.

В присутствии субстрата-донора значение равновесной константы изомеризации в первом активном центре (К] на схеме 2) уменьшается, как минимум, в 6 раз. Значение аналогичной константы во втором активном центре, Кг, в присутствии субстрата осталось, по существу, неизменным, в противоположность опытам с Са2+, где ее значение в присутствии субстрата снижается (табл. 1).

Таблица 1. Значения равновесных и кинетических констант индивидуальных стадий связывания тиаминдифосфата транскетолазой

мМ Кх А+ь с"1 -Ььс1 Кг А+2, С1 Ь, с' е-103, мкМ"1 см"1

с М§2+ в качестве кофактора

Без субстрата 1,6 ±0,1 0,0006 ±0,0002 1,33 ±0,2 0,0008 ±0,0001 0,0066 ±0,0007 0,42 ±0,01 0,0028 ±0,0001 2,69 ±0,02

В присутствии гидрокси- пирувата 1,6 ±0,1 0,0001 - 0,008 ±0,001 0,037 ±0,005 0,00030 ±0,00004 2,69 ±0,02

с Са2+ в качестве кофактора

Без субстрата 0,34 ±0,08 0,0001 0,8 - 0,0013 ±0,0001 0,23 ±0,05 0,00029 ±0,00006 3,75 ±0,02

В присутствии гидрокси- пирувата 0,34 ±0,08 0,0001 - - 0,00061 ±0,00004 0,32 ±0,04 . 0,00019 ±0,00002 3,75 ±0,02

ВЫВОДЫ

1. Получены строгие математические выражения, описывающие кривые спектрофотометрического титрования апотранскетолазы тиаминдифосфатом в рамках схемы с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами в димерной молекуле фермента. Для характеристики кооперативных взаимодействий между тиаминдифосфат-связывающими центрами предложено использовать зависимости степени конформационных изменений белка от степени насыщения белка лигандом.

2. Зависимости степени конформационных изменений белка от степени насыщения белка лигандом использованы для теоретического анализа кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами

для различных теоретических моделей димерных аллостерических ферментов.

3. На основании данных спектрофотометрического титрования апотранскетолазы тиаминдифосфатом в равновесных условиях были рассчитаны равновесные константы связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазой в присутствии ионов Са2+ и М§2+. Проведен количественный анализ кооперативных взаимодействий между тиаминдифосфат-связывающими центрами в молекуле транскетолазы. Показано, что как в присутствии ионов Са2+, так и в присутствии ионов М§2+ наблюдается отрицательная кооперативность. В случае ионов Са2+ она выражена более отчетливо.

4. Составлены кинетические уравнения, описывающие кинетику взаимодействия ТДФ с апоТК, и на основании экспериментальных данных, полученных методом остановленного потока, рассчитаны константы скорости прямой и обратной реакций для конформационных переходов, следующих за связыванием ТДФ в каждом активном центре.

5. Показано, что субстрат-донор оказывает влияние на скорость прямого и обратного конформационного перехода неактивного промежуточного комплекса тиаминдифосфат-транскетолаза в каталитически активный комплекс, в котором фермент содержит две связанные молекулы кофермента и один из активных центров претерпел конформационный переход.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 06-04-48395.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ospanov, R., Kochetov, G., Kurganov, В. (2006) Theoretical model of interactions between ligand-binding sites in dimeric protein and its application for analysis of thiamine diphosphate binding to yeast transketolase. Biophys. Chetn. 124, 106-114.

2. Оспанов P.B., Кочетов Г.А., Курганов Б.И. (2007) Влияние субстрата-донора на кинетические характеристики индивидуальных стадий процесса взаимодействия тиаминдифосфата с транскетолазой. Биохимия, 72,100-109.

3. Есакова O.A., Ханова Е.А., Оспанов Р.В., Мешалкина Л.Е., Кочетов Г.А. «Неэквивалентность активных центров транскетолазы». Тезисы докладов XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2004», секция «Биология» (12-15 апреля 2004 года, г. Москва). М.: МГУ, биологический факультет, стр. 49

4. Оспанов Р.В., Есакова O.A., Кочетов Г.А., Курганов Б.И. «Анализ отрицательной кооперативности при связывании тиаминдифосфата димерной дрожжевой апотранскетолазой». Материалы Международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки», 2005, г. Тюмень, стр. 88-91.

5. Оспанов Р.В. «Новый подход к анализу отрицательной кооперативности при связывании тиаминдифосфата дрожжевой апотранскетолазой». XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии биотехнологии», секция «Структура и функции белков и пептидов. Биокатализ» (7-10 февраля, 2005, г. Москва, стр. 45).

6. Оспанов Р.В. «Анализ функции насыщения дрожжевой апотранскетолазы тиаминдифосфатом». Тезисы докладов XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов — 2005», секция «Биоинженерия и биоинформатика» (12-15 апреля 2005 года, г. Москва). Том 2 - М.: Изд-во МГУ, 2005, стр. 30

7. Оспанов Р.В. «Исследование кинетического механизма взаимодействия кофермента с транскетолазой». Тезисы докладов XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», секции «Биоинженерия и биоинформатика» (12-15 апреля 2006 года, г. Москва). Том 4 - М.: Изд-во МГУ, 2006, стр. 57.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Esakova, О.А., Meshalkina, L.E., Golbik, R., Braner, J., Hubner G., Kochetov, G.A. Which stage of the process of apotransketolase interaction with thiamine diphosphate is affected by the regulatory activity of the donor substrate, IUBMB Life (in press).

2. Esakova, O.A., Meshalkina, L.E., Golbik, R., Hubner, G., Kochetov, G.A. (2004) Donor substrate regulation of transketolase. Eur. J. Biochem. 271 41894194.

3. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Mevkh, A.T. (1973) The role of the charge transfer complex in the transketolase catalyzed reaction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 54,1619-1626.

4. Усманов P.A., Кочетов Г.A. (1978) Изучение различных конформационных состояний транскетолазы методом пертурбационной ультрафиолетовой спектрофотометрии. Биохимия 43,1796-1804.

5. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Meshalkina, L.E. (1976) The number of active sites in a molecule of transketolase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 839843.

6. Мешалкина Л.Е., Кочетов Г.А. (1979) Участие двухвалентных катионов во взаимодействии тиаминдифосфата с апотранскетолазой пекарских дрожжей. ДАН СССР 248,1482-1486.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от01.12.99 г. Подписано к печати 05.02.2007 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 047. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Оспанов, Руслан Ваитович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Кофакторы транскетолазы.

2. Взаимодействие тиаминдифосфата с апотранскетолазой.

2.1 Двустадийный процесс взаимодействия тиаминдифосфата с апотранскетолазой.

2.2 Изменение спектральных характеристик транскетолазы в результате ее взаимодействия с коферментом.

2.3 Кинетическая модель связывания кофермента с апотранскетолазой.

2.4 Неэквивалентность активных центров в димере транскетолазы при связывании кофермента.

2.5 Влияние субстратов на реконструкцию холотранскетолазы и ее стабильность.

3. Связывание субстратов с транскетолазой и их каталитические превращения.

3.1 Изменение спектра холотранскетолазы в результате связывания и превращения субстратов.

3.2 Двусубстратная транскетолазная реакция.

3.3 Неэквивалентность активных центров транскетолазы по отношению к субстрату-донору.

3.4 Односубстратная транскетолазная реакция.

1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИГАНД-СВЯЗЫВАЮЩИХ ЦЕНТРОВ В ДИМЕРНОМ БЕЛКЕ.

1.1. Модель с эквивалентными и невзаимодействующими лиганд-связывающими центрами.

1.1.1. Описание схемы двустадийного связывания тиаминдифосфата с транскетолазой.

1.1.2. Вывод теоретических уравнений.

1.2. Модель с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами.

1.2.1. Описание схемы.

1.2.2. Вывод теоретических уравнений.

1.2.3. Исследование модели с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами.

1.2.3.1. Построение графиков зависимостей степени насыщения белка лигандом (Г), степени конформационных изменений (Z) и нормированной степени конформационных изменений (Z„opM) от концентрации лиганда, L.

1.2.3.2. Построение трехмерного графика, связывающего степень насыщения белка лигандом (У), нормированную степень конформационных изменений (ZHopM) и концентрацию лиганда, L.

1.2.3.3. Построение и анализ графиков зависимости нормированной степени конформационных изменений (ZHopM) от степени насыщения белка лигандом (У).

1.3. Исследование кооперативных взаимодействий для теоретических моделей.

1.3.1. Модель Моно, Уаймена и Шанжё.

1.3.1.1. Описание модели.

1.3.1.2. Сопоставление модели Моно, Уаймена, Шанже и разработанной нами модели с взаимодействующими лигандсвязывающими центрами.

1.3.2. Модель Кошланда, Немети и Филмера.

1.3.2.1. Описание модели.

1.3.2.2. Сопоставление модели Кошланда, Немети, Филмера и разработанной нами модели с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами.

2. ВОЗМОЖНОСТЬ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТЕОРЕТИЧЕСКИХ РАЗРАБОТОК НА ПРИМЕРЕ ТРАНСКЕТОЛАЗЫ.

2.1. Выбор модели для изучения взаимодействия тиаминдифосфата с апотранскетолазой.

2.1.1. Сравнение графиков остаточной разности.

2.1.2. Коэффициент смешанной корреляции, как критерий выбора модели.

2.2. Расчет равновесных и кинетических констант при связывании тиаминдифосфата с апотранскетолазой в присутствии ионов Mg2*.

2.2.1. Построение зависимости начальной скорости связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазой от концентрации тиаминдифосфата и определение параметров Уо,Пред и К&.

2.2.2. Определение равновесных констант К\ и Кг.

2.2.3. Определение констант скорости к+и к.\, к+2 и к.2.

2.2.4. Построение графика зависимости нормированной степени конформационных изменений (Z) от степени насыщения белка лигандом (У) для экспериментальных данных.

2.2.5. Связывание тиаминдифосфата с транскетолазой в присутствии субстрата-донора.

2.3. Расчет равновесных и кинетических констант при связывании тиаминдифосфата с апотранскетолазой в присутствии ионов

Са2+.

2.3.1. Определение параметров vo,npw и К&.

2.3.2. Определение равновесных и кинетических констант.

2.3.3. Построение графика зависимости нормированной степени конформационных изменений (ZHOpM) от степени насыщения белка лигандом (У) для экспериментальных данных.

2.3.4. Связывание тиаминдифосфата с транскетолазой в присутствии субстрата-донора.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизм связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазной"

Транскетолаза (ТК, седогептулозо-7-фосфат: D-глицеральдегид-3-фосфатгликольальдегидтрансфераза, КФ 2.2.1.1) является ключевым ферментом неокислительной ветви пентозофосфатного пути превращения углеводов. Катализирует перенос дигидроксиэтильного остатка (остатка гликольальдегида) с кетозы на альдозу [1-3]:

СН2ОН СН2ОН с=0 НСО ТК нсо С=0

I + | « | + I носн R1 R носн неон неон

R R'

R и R' могут быть представлены различными группами. Фермент характеризуется достаточно широкой субстратной специфичностью [4]. Функцию субстрата-донора гликольальдегидного остатка могут выполнять Б-седогептулозо-7-фосфат, D-фруктозо-б-фосфат, D-ксилулозо-5-фосфат, Б-октулозо-8-фосфат, L-эритрулоза и гидроксипируват. За исключением последнего, у всех известных субстратов-доноров гидроксильные группы при Сз и С4 находятся в транс-положении. В случае гидроксипирувата одним из продуктов реакции является СО2, ввиду чего транскетолазная реакция становится необратимой:

СН2ОН

СН2ОН с=о с=0 + НСО

ТК носн

- со2 + соон R R

Фосфорилированные субстраты имеют значительно более высокое сродство к ТК по сравнению с теми, у которых фосфатная группа отсутствует [4].

Кофакторами ТК являются тиаминдифосфат (ТДФ) и ионы обнаружена в 1953 г. [5, 6]. В настоящее время наличие ее показано практически во всех исследованных тканях животного и растительного происхождения, а также у микроорганизмов. Фермент локализуется, преимущественно, в растворимой фракции клетки. Что касается объекта нашего исследования, ТК Saccharomyces cerevisiae, то к настоящему времени определен ее аминокислотный состав и пространственная структура [7-9]. Методами химической модификации [10-13], рентгеноструктурного анализа [9, 14-18] и направленного мутагенеза [19-23] идентифицированы аминокислотные остатки, необходимые для связывания ТДФ, субстратов и осуществления катализа. Имеется достаточно подробная информация, касающаяся оптических свойств фермента и их изменений при взаимодействии с транскетолазой различных лигандов [4, 24-35]. Показано различное влияние двухвалентных катионов на связывание тиаминдифосфата с транскетолазой [36-41]. двухвалентных металлов, такие как Са2+ и Mg2+. Транскетолаза была

Молекула ТК состоит из двух идентичных субъединиц и содержит два активных центра, образованных на границе между контактирующими поверхностями этих субъединиц. Молекулярная масса ТК составляет 148 кДа [14,42]. Активные центры характеризуются одинаковой каталитической активностью. Каталитически активной единицей ТК является димер [43-45].

Транскетолаза пекарских дрожжей - первый тиаминдифосфат-зависимый фермент, для которого в 1992 г. был сделан рентгеноструктурный анализ [14]. Помимо апо- и холофермента, к настоящему времени, с помощью рентгеноструктурного анализа, проанализированы комплексы ТК с различными аналогами ТДФ [17, 18], с дигидроксиэтилтиаминдифосфатом - интермедиатом транскетолазной реакции [46], и комплекс холоТК с субстратом-акцептором (эритрозо-4-фосфатом) [23]. Данные рентгеноструктурного анализа позволили охарактеризовать структуру активного центра фермента и дали толчок к более глубокому изучению механизма тиаминового катализа. В настоящее время сделан рентгеноструктурный анализ и других тиаминдифосфат-зависимых ферментов, таких как пируватдекарбоксилаза дрожжей [47, 48] и Zimomonas mobilis [49], пируватоксидаза [50, 51], бензоилформиатдекарбоксилаза [52], человеческая дегидрогеназа а-кетокислот [53]. Общие структуры этих тиаминдифосфат-зависимых ферментов достаточно сильно различаются, однако область связывания кофакторов (двухвалентных катионов и ТДФ) имеет значительное сходство.

Что касается механизма функционирования ТК, понимая под этим процесс взаимодействия ТК с кофакторами, взаимодействие с субстратами, их каталитические превращения, характеристика индивидуальных стадий реакции, катализируемой ТК, до последнего времени был исследован недостаточно.

Задачей данного исследования являлась разработка теоретической модели взаимодействия лигандов с димерным белком, с учетом существования кинетически значимых стадий конформационных изменений лиганд-связывающих центров, и использование этой модели для характеристики взаимодействия кофермента, тиаминдифосфата, с транскетолазой.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Оспанов, Руслан Ваитович

4. ВЫВОДЫ

1. Получены строгие математические выражения, описывающие кривые спектрофотометрического титрования апотранскетолазы тиаминдифосфатом в рамках схемы с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами в димерной молекуле фермента. Для характеристики кооперативных взаимодействий между тиаминдифосфат-связывающими центрами предложено использовать зависимости степени конформационных изменений белка от степени насыщения белка лигандом.

2. Зависимости степени конформационных изменений белка от степени насыщения белка лигандом использованы для теоретического анализа кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами для различных теоретических моделей димерных аллостерических ферментов.

3. На основании данных спектрофотометрического титрования апотранскетолазы тиаминдифосфатом в равновесных условиях были рассчитаны равновесные константы связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазой в присутствии ионов Са и Mg2+. Проведен количественный анализ кооперативных взаимодействий между тиаминдифосфат-связывающими центрами в молекуле транскетолазы. Показано, что как в присутствии ионов Са2+, так и в присутствии ионов Mg2+ наблюдается отрицательная кооперативность. В случае ионов Са2+ она выражена более отчетливо.

4. Составлены кинетические уравнения, описывающие кинетику взаимодействия ТДФ с апоТК, и на основании экспериментальных данных, полученных методом остановленного потока, рассчитаны константы скорости прямой и обратной реакций для конформационных переходов, следующих за связыванием ТДФ в каждом активном центре.

5. Показано, что субстрат-донор оказывает влияние на скорость прямого и обратного конформационного перехода неактивного промежуточного комплекса тиаминдифосфат-транскетолаза в каталитически активный комплекс, в котором фермент содержит две связанные молекулы кофермента и один из активных центров претерпел конформационный переход.

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для анализа функции насыщения апотранскетолазы коферментом была использована схема, включающая стадии связывания тиаминдифосфата с каждым из двух активных центров и их последующие конформационные изменения. Для характеристики кооперативных взаимодействий между тиаминдифосфат-связывающими центрами транскетолазы предложено использовать графики зависимости нормированной степени конформационных изменений (ZHOpM) от степени насыщения белка лигандом (У)- Получены строгие математические выражения, описывающие кривые спектрофотометрического титрования апотранскетолазы тиаминдифосфатом, и проанализирован характер кооперативных взаимодействий между активными центрами в димерной молекуле фермента.

Следует подчеркнуть, что в настоящей работе графики зависимости нормированной степени конформационных изменений от степени насыщения белка лигандом впервые систематически использованы для количественной характеристики кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами в олигомерной молекуле фермента.

Использование разработанных нами моделей для обработки экспериментальных данных позволило подтвердить известный ранее факт отрицательной кооперативности активных центров транскетолазы

Л I по связыванию ТДФ в присутствии Са , дать количественную характеристику отрицательной кооперативности, а также однозначно решить вопрос о существовании отрицательной кооперативности в присутствии Mg . Об этом свидетельствовало характерное положение кривой зависимости нормированной доли конформационно измененного фермента от доли фермента, связанного с лигандом (рис. 28), аналогично тому, как это было в экспериментах с ионами кальция (рис. 336). На это же указывали и значения констант скорости для индивидуальных стадий процесса взаимодействия транскетолазы с коферментом: более низкое значение константы скорости прямого конформационного перехода во втором активном центре (к+2 на схеме 6) по сравнению с первым (k+i) и обратное соотношение значений констант скорости для обратного конформационного перехода (к.2 и к.ь соответственно). В результате этого значение константы изомеризации для второго активного центра (К2) увеличивается, по сравнению с первым (Ki), примерно на порядок (Табл. 2).

На первой стадии взаимодействие ТДФ с транскетолазой (схема 3), когда образуется легко диссоциирующий промежуточный комплекс ТК—ТДФ, значение константы его диссоциации (Kd) определяется типом катиона, используемого в качестве кофактора: в присутствии Mg оно равно 1600 мкМ, а в присутствии Са - 340 мкМ (табл. 2).

Субстрат-донор не влияет на первичное связывание ТДФ, приводящее к образованию комплекса ТК—ТДФ, но оказывает, в присутствии Mg2+, влияние на значение константы скорости как прямого, так и обратного конформационного перехода во втором активном центре (соответственно, к+2 и к2 на схеме 6). Однако, так как влияние субстрата-донора выражено, примерно, в равной степени, значение константы изомеризации (К2) при этом, по существу, не меняется. В то же время, константа изомеризации в первом активном центре (Ki) изменяется в присутствии субстрата - ее значение снижается, как минимум, в шесть раз (табл. 2).

При использовании ионов кальция в качестве кофактора, субстрат-донор так же, как и в опытах, поставленных в присутствии ионов магния, оказывает влияние на скорость как прямого, так и обратного конформационного перехода во втором активном центре, однако в разной степени, в результате чего происходит снижение значения константы изомеризации, К2 (табл. 2).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Оспанов, Руслан Ваитович, Москва

1. Кочетов Г.А. (1978) Тиаминовые ферменты. "Наука ", Москва.

2. Kochetov, G.A. (1982) Transketolase from yeast, rat liver and pig liver. M. EnzymoL, 90,209-223.

3. Racker, E. (1961) Transketolase. Enzymes., 5, 397-406.

4. Усманов P.A., Кочетов Г.А. (1983) Связывание субстратов с транскетолазой пекарских дрожжей. Функция анионной группы субстрата-донора. Биохимия, 48, 550-558.

5. Racker, Е., De la Haba, G., Leder, J.G. (1953) Thiamine pyrophosphate, a coenzyme of transketolase. J. Am.chem. Soc., 75, 1010-1011.

6. Horecker, B.L., Smyrniotis, P.Z. (1953) The coenzyme function of thiamine pyrophosphate in pentose phosphate metabolism. J. Am. Chem. Sec., 75,1009-1010.

7. Кочетов Г. А., Кобылянская K.P., Белянова Jl.П. (1973) Аминокислотный состав транскетолазы пекарских дрожжей. Биохимия, 38, 1303-1306.

8. Fletcher, Т., Kwee, I., Nakada, Т., Largman, С., Martin В. (1992) DNA sequence of the yeast transketolase gene. Biochemistry, 31,1892-1896.

9. Nikkola, M., Lindqvist, Y., Schneider, G. (1994) Refined structure of transketolase from Saccharomyces cerevisae of 2.0 A resolution. J. Mol. Biol., 238, 387-404.

10. Кочетов Г.А., Кобылянская K.P. (1970) Природа и функция аминокислотных остатков транскетолазы, существенных дляпроявления ее активности. Биохимия, 35,3-11.

11. Мешалкина JI.E., Кочетов Г.А. (1979) Функциональные остатки аргинина в транскетолазе пекарских дрожжей. ДАН СССР, 245, 1259-1261.

12. Мешалкина JI.E., Кочетов Г.А. (1979) Роль остатков гистидина транскетолазы пекарских дрожжей. ДАН СССР, 246,228-231.

13. Кочетов Г.А. (1986) Транскетолаза: структура и механизм действия. Биохимия, 51, 2010-2029.

14. Lindqvist Y., Schneider G., Ermler V., Sundstrom M. (1992) Three-dimensional structure of transketolase, a thiamine diphosphate dependent enzyme, at 2.5 A resolution. EMBOJ., 11,2373-2379.

15. Sundstrom, M., Lindqvist, Y., Schneider, G. (1992) Three-dimensional structure of apotransketolase. Flexible loops at the active site enable cofactor binding. FEBS Lett., 313,229-231.

16. Nilsson, U., Lindqvist, Y., Kluger, R., Schneider, G. (1993) Crystal structure of transketolase in complex with thiamin thiazolonediphosphate, an analogue of the reaction intermediate, at 2,3 A resolution. FEBS Lett., 326, 145-148.

17. Wikner, Ch., Meshalkina, L., Nilsson, U.,Backstrom, S., Lindqvist Y., Schneider, G. (1995) His 103 in yeast transketolase is required for substrate recognition and catalysis. Eur. J. Biochem., 233, 750-755.

18. Wikner Ch., Nilsson, U., Meshalkina, L., Udekwu, C., Lindqvist, Y., Schneider, G. (1997) Identification of catalytically important residues in yeast transketolase. Biochemistry, 36, 15643-15649.

19. Meshalkina, L., Nilsson, U., Wikner, Ch., Kostikowa, Т., Schneider, G. (1997) Examination of the thiamin diphosphate binding site in yeast transketolase by site-directed mutagenesis. Eur. J. Biochem., 244, 646652.

20. Nilsson, U., Meshalkina, L., Lindqvist, Y., Schneider, G. (1997) Examination of substrate binding in thiamine diphosphate-dependent transketolase by protein crystallography and site-directed mutagenesis. J. Biol Chem., 272,1864-1869.

21. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Merzlov, V.P. (1970) Thiamin pyrophosphate induced change of the optical activity of baker's yeast transketolase. FEBSLett., 9,265-266.

22. Heinrich, C., Noack, K., Wiss, O. (1971) A circular dichroism study of transketolase from baker's yeast. Biochem. Biophys. Res. Commun., 44, 275-279.

23. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Mevkh, A.T. (1973) The role of the charge transfer complex in the transketolase catalized reaction. Biochem. Biophys. Res. Commun., 54, 1619-1626.

24. Heinrich, C.P., Noack, K., Wiss, 0. (1972) Chemical modification of thryptophan at the binding site of thiamine pyrophosphate in transketolase from baker's yeast. Biochem. Biophys. Res. Commun., 49, 1427-1432.

25. Heinrich, C., Schmidt, D., Noack, K. (1974) Energetic and spectroscopic studies on the interaction between thiamine diphosphate and apotransketolase. Eur. J. Biochem., 41, 555-561.

26. Усманов P.А., Кочетов Г.A. (1978) Изучение различных конформационных состояний транскетолазы методом пертурбационной ультрафиолетовой спектрофотометрии. Биохимия, 43,1796-1804.

27. Heinrich, С., Schmidt, D. (1993) Determination of the binding constant of thiamine diphosphate in transketolase from baker's yeast by circular dichroism titration. Experientia, 29, 1227-1230.

28. Пустынников М.Г., Нейф X., Усманов P.A., Шелленбергер А., Кочетов Г.А. (1986) Функциональные группы тиаминпирофосфата в холотранскетолазе. Биохимия, 51, 1003-1016.

29. Мешалкина JI. Е., Нейф X., Тягло М.В., Шелленбергер А., Кочетов Г. А. (1996) Ферментативное превращение гидроксиэтилтиаминпирофосфата под действием транскетолазы пекарских дрожжей. Биохимия, 61, 716-719.

30. Ковина М.В., Быкова И.А., Мешалкина Л.Е., Кочетов Г.А. (2003) Индуцированная полоса поглощения холотранскетолазы и ее интерпретация. Биохимия, 68, 247-251.

31. Kovina M.V., Bykova I.A., Solovjeva O.N., Meshalkina L.E., Kochetov G.A. (2002) The origin of the absorption band induced through the interaction between apotransketolase and thiamin diphosphate. Biochem. Biophys. Res. Commun., 294, 155-160.

32. Kochetov G.A., Philippov P.P., Razjivin A.P., Tikhomirova N.K. (1975) Kinetics of reconstruction of holotransketolase. FEBS Lett., 53, 211-212.

33. Egan R.M., Sable H.Z. (1981) Transketolase kinetics. The slow reconstitution of the holoenzyme is due to rate-limiting dimerization of the subunits. J. Biol. Chem., 256,4877-4883.

34. Kovina, M.V., Selivanov, V.A., Kochevova, N.V., Kochetov, G.A. (1997) Kinetic mechanism of active site non-equivalence in transketolase. FEBS Lett., 418, 11-14.

35. Ковина M.B., Селиванов В.А., Кочевова H.B., Кочетов Г.А. (1997) Исследование кооперативного связывания кофермента активными центрами транскетолазы методом кинетического моделирования. Биохимия, 63,1155-1163.

36. Selivanov, V.A., Kovina, M.V., Kochevova, N.V., Meshalkina, L.E., Kochetov, G.A. (2003) Studies of thiamin diphosphate binding to theyeast apotransketolase. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 26,33-40.

37. Selivanov, V.A., Kovina, M.V., Kochevova, N.V., Meshalkina, L.E., Kochetov, G.A. (2004) Kinetic study of the HI 03A mutant yeast transketolase. FEBSLett., 567,270-274.

38. Schneider G., Lindqvist Y. (1998) Crystallography and mutagenesis of transketolase: mechanistic implications for enzymatic thiamin catalysis. Biochim. Biophys. Acta, 1385, 387-398.

39. Cavalieri, S., Neet, K.E., Sable, H.Z. (1975) Enzymes of pentose biosynthesis. The quaternary structure and reacting form baker's yeast transketolase. Arch. Biochem. Biophys., 171, 527-532.

40. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Meshalkina, L.E. (1976) The number of active sites in a molecule of transketolase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 69, 839-843.

41. Meshalkina, L.E., Kochetov, G.A. (1979) The functional identity of the active centers of transketolase. Biochim. Biophys. Acta., 571,218-223.

42. Dyda, F., Furey, W., Swaminathan, S., Sax, M., Farrenkopf, В., Jordan, F. (1993) Catalytic centers in the thiamin diphosphate enzyme pyruvate decarboxylase at 2,4 A resolution. Biochemistry, 32, 6165-6170.

43. Dobritzsch, D., Konig, S., Schneider, G., Lu, G. (1998) High resolution crystal structure of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis. Implications for substrates activation in pyruvate decarboxylases. J. Biol. Chem., 273,20196-20204.

44. Muller, Y., Shulz, G. (1993) Structure of the thiamin and flavin-dependent enzyme pyruvate oxidase. Science, 259, 965-967.

45. Muller, Y. A., Schumacher, G., Rudolph, R., Schulz, G. E. (1994) The refined structures of a stabilized mutant and of wild-type pyruvate oxidase from Lactobacillus plantarum. J. Mol. Biol., 237, 315-323.

46. Hasson, M., Muscate, A., McLeish, M., Polovnikova, L., Ringe, D. (1998) The crystal structure of benzoylformate decarboxylase at 1,6 A resolution: diversity of catalytic residues in thiamin diphosphate-dependent enzymes. Biochemistry, 37,9918-9930.

47. Evarsson, A., Chuang, J., Wynn, R., Turley, S., Chuang, D., Hoi, W. (2000) Crystal structure of human branched-chain a-ketoacid dehydrogenase and the molecular basis of multienzyme complex deficiency in maple syrup urine disease. Structure, 8, 277-291.

48. Кочетов Г.А., Филиппов П.П. (1970) Кальций кофактор транскетолазы пекарских дрожжей. Биохимия, 35,422-424.

49. Кочетов Г.А., Филиппов П.П. (1970) Влияние двухвалентных металлов на положение оптимума рН транскетолазной реакции. ДАН СССР, 191,234-236.

50. Kochetov, G.A., Philippov, P.P. (1970) Calcium: cofactor of transketolase from baker's yeast. Biochem. Biophys. Res. Commun., 38, 930-933.

51. Heinrich, C., Steffen, H., Janser, P., Wiss, O. (1972) Studies on the reconstitution of apotransketolase with thiamine pyrophosphate and analogs of the coenzyme. Eur. J. Biochem., 30, 533-541.

52. Sprenger, G., Schorken, U., Sahm, H. (1995) Transketolase of Escherichia coli K-12. Purification and properties of the enzymes from recombinant strains. Eur. J. Biochem., 230, 525-532.

53. Schellenberger, A. (1998) Sixty years of thiamine diphosphate biochemistry. Biochim. Biophys. Acta,, 1385, 177-186.

54. Fiedler, E., Golbik, R., Schneider, G., Tittmann, K., Neef, H., Konig, S., Hiibner, G. (2001) Examination of donor substrate conversion in yeast transketolase. J. Biol. Chem., 276,16051-16058.

55. Kochetov, G., Izotova, A. Meshalkina, L. (1971) Inhibition of transketolase by analogues of the coenzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun., 43,1198-1203.

56. Кочетов Г.А., Изотова A.E. (1973) Ингибиторы транскетолазы. Биохимия, 38,954-957.

57. Кочетов Г.А., Изотова А.Е. (1973) Реконструкция холотранскетолазы из апофермента и кофермента. Биохимия, 38, 552-559.

58. Esakova, О.А., Meshalkina, L.E., Golbik, R., Hiibner, G., Kochetov, G.A. (2004) Donor substrate regulation of transketolase. Eur. J. Biochem., 271,4189-4194.

59. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A. (1970) Charge transfer interactions in transketolase-thiamine pyrophosphate complex. Biochem. Biophys. Res. Commun., 41, 1134-1140.

60. Golbik, R., Neef, H., Hiibner, G., Konig, S., Seliger, В., Meshalkina, L., Kochetov, G., Schellenberger, A. (1991) Function of the aminopyrimidine part in thiamine pyrophosphate enzymes. Bioorg. Chem., 19,10-17.

61. Shellenberger, A. (1982) The amino group and steric factors in thiamin catalysis. Ann. NY Acad. Sci., 378, 51-62.

62. Kovina, M.V., De Kok, A., Sevostyanova, I.A., Khailova, L.S., Belkina, N.N., Kochetov, G.A. (2004) The molecular origin of the thiamin diphosphate-induced spectral bands of ThDP-dependent enzymes. Proteins: Struct. Fund. Bioinformat., 56,338-345.

63. Kochetov, G.A., Sevostyanova, I.A. (2005) Binding of the coenzyme and formation of the transketolase active center. IUBMB Life, 57, 491497.

64. Сидорова H.H., Усманов P.A., Куимов A.H., Кочетов Г.А. (1996) Обмен кофермента холотранскетолазы со средой. Биохимия, 61, 880-886.

65. Usmanov, R., Sidorova, N., Kochetov, G. (1996) Interaction of dihydroxyethylthiamine pyrophosphate with transketolase. Biochem. Mol. Biol. Intern., 38, 307-314.

66. Есакова O.A., Ханова E.A., Мешалкина Л.Е., Голбик Р., Хюбнер Г., Кочетов Г.А. (2005) Влияние субстратов транскетолазы на реконструкцию холофермента и его стабильность. Биохимия., 70, 933-940.

67. Кочетов Г.А. (1986) Транскетолаза: структура и механизм действия. Биохимия, 51,2010-2029.

68. Кочетов Г.А., Быкова И.А. (2002) Оптические характеристики транскетолазы, их интерпретация и практическое использование. Вопр. биол. мед. и фармац. химии, №1, 20-23.

69. Севастьянова И.А., Кочетов Г.А. (2004) Оптические характеристики тиамина в модельных системах и в составе холофермента. Биохимия, 69,1187-1195.

70. Селиванов В.А., Мешалкина Л.Е., Ковина М.В., Кочетов Г.А. (1997) Определение констант первичного связывания субстратов с транскетолазой пекарских дрожжей методом кинетического моделирования. Биохимия, 62, 499-507.

71. Соловьева О.Н, Мешалкина JI.E., Ковина М.В., Селиванов В.А., Быкова И.А., Кочетов Г.А. (2000) Конкурентное по отношению к субстрату-донору ингибирование транскетолазы субстратом-акцептором. Биохимия, 65,1421-1424.

72. Cavalieri, R.L., Sable, H.Z. (1972) Kinetic study of transketolase from baker's yeast. Feder. Proc., 31, 846.

73. Ковина М.В., Куимов А.Н., Кочетов Г.А. (1993) Существенные остатки тирозина транскетолазы пекарских дрожжей. И. Исследование функции существенных остатков тирозина. Биохимия, 58,1341-1350.

74. Kovina, M.V., Kochetov, G.A. (1998) Cooperativity and flexibility of active sites in homodimeric transketolase. FEBS Lett., 440, 81-84.

75. Куимов A.H., Мешалкина Jl.E., Кочетов Г.А. (1986) Функциональная карбоксильная группа в активном центре транскетолазы. Биохимия, 51,1908-1918.

76. Кочетов Г.А. (2001) Функциональная подвижность молекулы транскетолазы. Биохимия, 66,1335-1345.

77. Datta, A.G., Racker, Е. (1961) Mechanism of action of transketolase. II. The substrate-enzyme intermediate. J. Biol. Chem., 236, 624-628.

78. Bykova, I.A., Solovjeva, O.N., Meshalkina, L.E., Kovina, M.V., Kochetov, G.A. (2001) One-substrate transketolase-catalyzed reaction. Biochem. Biophys. Res. Commun., 280, 845-847.

79. Соловьева O.H., Быкова И.А., Мешалкина Л.Е., Ковина М.В., Кочетов Г.А. (2001) Расщепление кетосубстратов под действием транскетолазы и природа образующихся продуктов. Биохимия, 66, 1144-1149.

80. Monod, J., Wyman, J., Changeux, J. P. (1965) On the nature of allosteric transition: A plausible model. J. Mol. Biol., 12, 88-118

81. Koshland, D.E., Nemety, G., Filmer, D. (1966), Comparison of experimental binding data and theoretical models in proteins containing subunits. Biochemistry, 5,365-385.

82. Мешалкина Л.Е., Кочетов Г.А. (1979) Участие двухвалентных катионов во взаимодействии тиаминдифосфата с апотранскетолазой пекарских дрожжей. ДАН СССР, 248, 14821486.

83. Esakova, О.А., Meshalkina, L.E., Golbik, R., Htibner, G., Kochetov, G.A., Which stage of the process of apotransketolase interaction with thiamine diphosphate is affected by the regulatory activity of the donor substrate. IUBMB Life (in press).

84. Есакова O.A. (2005) Изменение свойств транскетолазы в результате ее взаимодействия с кофакторами и субстратами. Дис., канд. биол. наук, МГУ, Москва.