Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферментные системы биотрансформации активных форм витамина В1 (структура, свойства, регуляция)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ферментные системы биотрансформации активных форм витамина В1 (структура, свойства, регуляция)"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

РГБ. ОД

: ? оев тб

УДК 577.15:577.164.11

ЧЕРНИКЕВИЧ Иван Петрович

ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ ЕИ01РАНСФ0РМАЦИИ АКТИВНЫХ ФОРМ ВИТАМИНА (структура, свойства, регуляция)

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ .

диссертации на соискание учёной степени доктора химических наук

с

МИНСК - 1996 г.

Работа выполнена в лаборатории прикладной анзимологяи и биотехнологии Инсгктута биохимия Академии наук Беларуси

. Научные консультанты: академик АН Беларуси,

доктор медицинских наух, профессор ЮСТРОВСКИЯ Р.И.1

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

МЕТЕЛИЦА Д.И.

Оппонирующая организация:И>!ститут питания АМН Российской

Федерации

Защита состоится т29тСреораЛЯ 1996 года в 10 пас. на заседании совета по защите диссертаций Д 006.22.01 в Институте биоорганической химик Академии наук Беларуси по адресу: 220141, г. Кинск, Академгородок, ул. Жодинская, 5/2.

С диссертацией ыокно ознакомиться в библиотеке Института биоорганнчоской химии Академии наук Беларуси.

Авторефэрат разослан " /3 ■ Я И 5а рр 1996 г.

Учёный секретарь

совета по защите диссертаций,

доктор биологических паук ТРЕБУХИНА. Р.В.

доктор биологических наук, профессор ЗАЛАШКО М.В.

доктор биологических паук, профессор

ГОРБАЧ З.В.

кандидат химических наук

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Основными механизмами реализации биологической активности витамина Bj (тиамина) в живых организмах считаются коферментные, регуляторные и нейротропные функции его фосфорилированных производных - ТДФ и ТТФ /Binewanger- ,1974; Cooper, Pincue ,1979/. Его дефицит в рационе приводит к серьёзным нарушениям со стороны нервной, сердечно-сосудистой и мышечной систем. В целях профилактики заболеваний в странах с передовыми технологиями применяется обогощение тиамином пищевых продуктов (очищенная мука, макаронные изделия) /ноаа ,1988/. При сложившейся в республике ситуации значительная часть населения переходит от |>а-ционального к углеводному типу питания, что способствует развитии Bj-недостаточности. Положение усугубляется приобретающим всё большие масштабы потреблением алкоголя, наркотических средств, ведущих к прогрессирующему снижения всасывания, ассимиляции и фосфори-лирования витамина /Островский,1989/.

Проблема витаминизации населения остро обозначилась после аварии на Чернобыльской АЭС. Её решение требует персональной оценки обеспеченности человека тиамином, разработки методик адекватного отражения его содержания в клетке, идентификации, очистки и изучения ферментных систем, ответственных за трансформации витамина до фосфорилированных активных фэрм. Такая постановка вопросов связана прежде всего с обнаружившейся инактивацией ферментов обмена тиамина при ряде патологических отклонений, воздействии неблагоприятных факторов внешней среды /Спиричев, Барашнев,1977/.

Биосинтез ТДО, как коферментной формы, катализируется Т-кинч.-зой. В литературе отсутствуют сведения о пространственной оргагн-зации молекулы Т-кинаэы, её внутримолекулярной подвижности, взаимосвязи между структурой и возможностью регуляторного контроля активности глобулы при её конформационных перестройках. Нет или очень мало данных относительно физико-химических свойств и функ^ч-оналышх групп ферлента, геометрии строения его активного центрп; Современные методы кинетической спектроскопии, белковой химии позволяют решать перечисленные задачи. '

Принятые сокращения: АДГ - алкогольдегидрогеназа; ПАЛГ - подм-1криламид!шй г оль; ПАЛФ - пиридоксаль-б^-фосфат; ПДК - пируватдо-¡сарбоксилаза; ТДФ - тианш!днфосфат; ТТФ - тиамннтрифосфат; Т-кит-эа - тнамишшназа (КФ 2.7.6.2); ТДФ-киназа - тиаминдифосфаткинарп (КФ 2.7.4.15); ТТ^аза - тиаминтрифосфатаза (КФ 3.6.1.28); ТИС -^-толуидишл-б-пафталинсульфонат; - неорганический фосфат.

Биотрансформацкя тиамина до ТТФ осуществляется ТДФ-киназой. На сегодня ограничено количество работ, касающихся распространения локализации и свойств этого фермента, а результаты и выводы ряда авторов /Ruenwongsa, Cooper, 1977; Cooper et ol., 198?., 1983/ о синтезе ТГФ только из специфического субстрата - связанного с белком ТДФ - остаются спорными. Такая ситуация но позволяет сформула ровать чёткие представления о процессе фосфорилкрования ТДФ, что отрицательно сказывается на наших познаниях обмена тиамина в целой, ограничивая возможности направленного использования препаратов витамина и его производных в лечебных целях.

Точная биохимическая функция ТТФ остается неясной. Имеющиеся экспериментальные данные позволяют говорить о вероятном участии ТТФ в энергетическом обеспечении нервного импульса, поскольку показано, что процессы нервной активности сопровождаются его дефос-форилированием /Itokawa. Cooper ,1970,1972/. Одним из подходов к выяснению функциональной роли трифосфорного эфира является изучение ферментов гидролиза - ТТФ-аэ, специфически катализирующих расщепление макроэргической связи между /Э - и ¿"-атомами фосфора. Понимание распределения этих ферментов, физиологических условии, необходимых для проявления их максимальной активации, и условий, приводящих к ингибированип, могут существенным образом способствовать решению этого вопроса.

Принципиален и методический аспект оценки статуса тиамина. Не применяются в настоящее время как неадекватные способы к нтро-ля обеспеченности тиамином по концентрации гшро виноградной кислоты и экскреции её с мочой, нагрузочные пробы витамииои. Подвергаются обоснованной критике используемые в этих целях показатели, получаемые при регистрации ТДФ-эффекта и скоростей ВДФ-зависимых реакций /ВоскобоеЕ 1983/, обуславливая необходимость разработки н внедрения в практику медицины метода реальной оценки статуса тиамина у широких слоев населения.

Работа выполнялась в рамках научно-исследовательских тем 01860022833 "Фосфорнлированные и нефосфорилнрованиые производные витамина Bj в регуляции обмена веществ", 01900062425 "Внтаминэа-висимые реакции, их интеграция и регуляция в основных метаболических процессах" в соответствии с решением Всесоюзной - 2.28.4 . "Биохимия животных и человека" и республиканских - "Молекулярные основы структурообразования и функций биополимеров", "Фундамен- ' тальные исследования для медицины" комплексных программ.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования за-

ключалась б идентификации, очистке и изучении ферментных систем синтеза и деградации активных форм витамина В^, оценке значимости индивидуальных ферментов в функционировании организма. В соответствии с поставленной целью определены следующие задачи:

- разработать методику получения аналитически чистого, стабильного препарата трифосфорного эфира тиамина - субстрата ТТФ-аз-ной реакции;

- предложить микрометод определения ТДФ, включающий: выделение и стабилизацию комплекса агсоПДК и АДГ, изучение оптимальных условий связывания микроколичеств кофермента с апоформой ПДК, создание модельной системы оценки концентрации ТДФ» Адаптировать метод для измерения активностей Т-кинаэы и ТТФ-азы;

- исследовать распределение Т-киназы и ТТФ-азы в органах и тканях, субклеточную локализацию ферментов;

- показать реальность использования экзогенного, не связанного с белком ТДФ, в процессе фосфорилирования ТДФ-кинаэой. Оценить содержание тиаминфосфатов в гомогенатах клеток в условиях, максимально препятствующих фосфоролизу;

- получить гомогенные препараты Т-киназы, ТДФ-киназы и ТТФ-аэм;

- изучить субстратную специфичность, ыолекулярно-кинетические параметры, структуру и внутримолекулярную подвижность, вероятнее пути регуляции активности ^зрменгов, природу взаимодействия с субстратами, кофакторами и эффекторами, формальные механизмы реакций;

- в сравнительном аспекте изучить физико-химические и кинетические свойства Т-кинази пивнкх дрожжей и мозга;

- определить особенности, закономерности и направленность формирования потока тиаминфосфатов в условиях ¡^-авитаминоза и в процессе его коррекции.

Научная новизна. На синтезированных аффинных сорбентах, содержащих в качестве лиганда ТДФ, впервые до гомогенного состояния осуществлена очистка препаративных количеств Т-киназы, позволившая изучить её структурную организацию и физико-химические свойства. Показано, что о клетках дрожжей энзим представлен ассоциируи-[це-диссоциирующей сис змой олигомеров, на состояние равновесия которых влияют условия среды, концентрации тиамина, субстратов де-гидрогеназ с'-кетокислот, дикарбоновых кислот цикла Кребса. Индуцируемые лигандаыд изменения носят временной характер и являются регуллторним (Диктором скорости образования фосфатов витамина. Предложена модель организации активного центра Т-киназы, где важная роль во взаимодействии тиамина и АТФ отводится двухвалентным кати-

онам, вызывающим локальные перестройки молекулы фермента. Проведен сравнительный анализ кинетики и свойств белка пивных дрожжей 'и мозга быка.

Впервые в индивидуальном состоянии получен препарат ТДФ-кина-зы, катализирующий биосинтез трифосфорного эфира тиамина. Установлено, что белок из пивных дрожжей синтезирует ТТФ из свободного, не связанного с гипотетическим белком-носителем ТДФ, и не требует для активации процесса присутствия глюкозы. Охарактеризованы молекулярно-кинегические параметры, структура, субстратная специфичность, механизм действия фермента. Найдено, что аналогично Т-киназе ТДФ-киназа дрожжей представлена множественным!« формами и олигомерной структурой, подверженной аллостерическому воздействию субстратов и ионов металлов. Определён молекулярный вес субьеди-ниц, условия обуславливающие их ассоциативно-диссоциативное взаимодействие. Показана возможность регуляции активности ТДФ-кинази ЛТФ, тиамином и его аналогами.

Приведены новые данные о количественном содержании ди- и трифосфорного эфиров тиамина в клетках и культуральной жидкости пивных дрожжей и гепатоцитах крыс. Доказано, что принципиальная схема реакции синтеза ТТФ в дрожжах аналогична таковой в тканях млекопитающих.

Впервые предложена методика выделения электрофоретически гомо-ген эй ТТФ-азы, энзима гидролиза ТТФ. Установлено, что фермент из мозга быка состоит из одной полипептидной цепи и обладает абсолютной специфичностью к трифосфорному эфиру. Изучены его кинетические свойства, механизм действия, возможные пути регуляции и клетке, взаимодействие с субстратом. Впервые сформулировано представление о растворимой ТТФ-азе как периферическом мембранном белко и универсальной роли ТТФ ч транспорте ионов.

Доказано наличие двух взаимопревращащихся кинетических форд ТТФ-азы, характеризующихся различными активностями, сродством к субстрату и энергиями активации. Выяснено, что связывание с ферментом осуществляется за счет фосфорнокислого остатка ТТФ, а взаимодействие тиаминовой части молекулы с каталитическим участком активного центра приводит к правильной ориентации и гидролизу субстрата.. Важная роль в процессе катализа принадлежит аминогруппе пнримидинового кольца, гидрофобнь контактам и четвертичному азоту тиазола. Установлены вероятные пути регуляции скорости гидролиза 1'ГФ аденозинтрифосфатом и свободными ионами

Впервые исследована активность ферментов синтеза и деградации

активных форм тиамина в норме, Bj-гкповктаминозных состояниях и рассмотрена роль каждой белковой молекулы в формировании внутри-, клеточного пула витамина. Определены закономерности изменения и направленность потока тиаминфосфатов в условиях нарушения адаптационных и гомеостатических возможностей организма.

Научная и практическая значимость. Полученные сведения важны о расшифровке механизмов реализации биологической функции витамина Bj. Они впервые позволяют оценить процесс фосфорилирования тиамина в микроорганизмах и тканях животных в целом, связать воедино данные о структуре, динамике, физико-химических (в частности кинетических и спектрально-люминесцентных) свойствах фермен- ' тов с их каталитической активностью, выявить общие черты и особенности организации ферментных систем синтеза фосфатов Bp показать их роль и отличия от ферментов гидролиза. Обнаруженные закономерности влияния субстратов, кофакторов и эффекторов на внутримолекулярную динамику киназ свидетельствуют о принципиальном значении локальной подвижности белковых структур в реакциях ферментативного катализа, указывают на возможные пути регуляции его в системах жизнедеятельности организма, проясняют конкретные ме-ха)шзмы функционирования белков. Понимание этих процессов создаёт реальные предпосылки управления системами бногранеформации витамина путем оптимизации ф :торов, определяпдих гомеостаз этого соединения в клетке, а также углеводный и энергетический обмены.

К практическим выходам работы относятся: метод определения микроколичеств ТДФ, пригодный для широкого использования в клинике и лабораторной практике при биохимической диагностике Bj-недо-статочности и оценке статуса организма; методы иэмэреиия активнэ-стей ТДФ-киназы и ТТФ-азы - в случае выяснения поведения макромолекул при сердечно-сосудистых и неврологических отклонениях у людей, моделирования заболеваний у экспериментальных животных. Способы очистки тиаминкиназ, в совокупности с выявленными оптимальными условиями функционирования in vitro , могут быть применены при разработке биотехнологических процессов получения минорных по концентрациям тиам.; [ди- и трифосфатов. Идентификация реакцлон-новпособных участков фосфорилированных форм тиамина позволяет ви-сти синтез ак-чшгах аналогов с заранее предполагаемыми свойствами;

Экономическая значимость. Способ получения и стабилизации комплекса АДГ и апоПДК, защищенный авторским даёт возможность создать коммерческие наборы реагентов оценки обеспеченности населения тиамином до и после коррекции В|-птггаминоэныс

'состояний лекарственными препаратами. Высокоочищенные устойчивые формы Т-киназы и ТДФ-киназы желательно использовать в медицинской практике для проведения ферментной терапии у больных с ослабленными процессами фосфорилирования Битамина, например, при расстройствах нервной и сердечной деятельности, сахарном диабете, некоторых ацндотических состояниях. Защищенный авторским свидетельство« метод синтеза ТТФ найдет применение в фармации при получении препарата пролонгированного действия, направленного на лечение заболеваний, связанных с нарушением обмена и функций ТДФ-зависимых ферментов.

Основные положения, выносимые на защиту;

1. Методы получения аналитически чистого устойчивого препара та ТТФ; оценки обеспеченности организма тиамином по концентрации общего или свободного *ЩФ; определения индивидуальных скоростей реакций биотрансформации В^ выделения и очистки Т-киназы, ТДФ-килаэы и ТТФ-азы до гомогенного состояния.

2. Концепция синтеза трифосфорного эфира тиамина ТДФ-киназой микроорганизмов и животных с использованием свободного, не связанного с белком, ТДФ.

3. Обоснование специфичности гидролиза трифосфорного эфира витамина ТТФ-азой головного мозга и универсальной роли ТТФ в транспорте ионов. Периферическая мембранная локализация Т-киназы и Л'Ф-азы мозга.

4. Молекулярно-кинетические свойства, специфичность, ст/укту-ра и динамика ферментов биотрансформации тиамина. Влияние внешней среды (растворителя, рН, температуры), ионов металлов, субстратов и эффекторов на кинетические, спектроскопические характеристики и каталитическую активность макромолекул. Модель структурной организации) активного ?нтра Т-кинаэы.

5.»Роль индивидуальных ферментов синтеза и деградации активных форм витамина в формировании внутриклеточного пула тиаминфос-фатов в процессе развития В^-недостаточности и её коррекции.

• Личный вклад соискателя. В диссертации изложены результаты, полученные соискателем лично и под его руководством сотрудниками лаборатории прикладной знзимологии и биотехнологии Института -Э.А.Гриценко, А.Ф.Макарчиковьм, В.С.Лучко, Т.А.Лучко. Исследования структуры и внутримолекулярной динамики Т-киназы выполнены совместно с сотрудниками кафедры общей и теоретической физики Гродненского государственного университета им. Я.Купалы.

Вклад соискателя в совместных публикациях заключался в опреде-

лении направления и постановке конкретных задач исследования, разработке методик эксперимента и расчетных моделей, непосредственном участии в выполнении измерений, проведении анализа, обоб-' щении и трактовке полученных результатов.

. Апробация основных результатов работы проведена на 1У и У Всесоюзных биохимических сгездах (Ленинград,1979; Киев,1986), Всесоюзной конференции "Теоретические и практические аспекты изучения питания человека" (Москва,1980), У1 конференции биохимиков Прибалтийских республик, Белорусской ССР и Ленинграда (Рига,1981), У1 Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР (Таллин,1981), I Всесоюзной конференции "Аффинная хроматография" (Вильнюс, 1982), Симпозиуме "Биохимия, фармакология и медицинское применение производных витаминов" (Иркутск,1983), II Всесоюзной конференции по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии (Харьков,1984), УП Международной конференции по молекулярной и клеточной регуляции ферментативной активности (ГДР, Халле,1986), III и 1У Всесоюзных конференциях "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Пущино,1986; Ташкент,1988), I Всесоюзной конференции "Проблемы микробного синтеза витаминов н их производных" (Ташкент, 1990), XX конференции ФЕБО (Венгрия, Болотон,1990), 1У Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Англия, йорк,1991), I Международно конгрессе "Витамины и биофакторы в жизни науки" (Япония, Кобе,1991), 1У Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение" (Москва,1992), 1У Международной конференции по использованию лазерной спектроскопии в жизни науки (Финляндия, Ювескуле,1992), ХХХХ1У Питсбургской конференции (США, Георгия,1993), I съезде белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Ыинск,1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 59 работ, в том числе 2 совместные монографии, 24 статьи; получено 3 авторских свидетельства СССР.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, оСщей характеристики работы, семи глав (5 глав - собственно исследования), эг точения, выводов к библиографии (389 источника , в том числе 93 отечественных и 296 инострашгых авторов). Работа изложена на 310 страницах ыалшюписного текста, включая ill страницу списка литературы. Текст диссертации иллюстрирован 47 таблицами и 102 рисунками, обшим объёмом 81 страница.

МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использованы пивные дрожжи Sacchnrnmynen cnrlnbfirgirr-

eis , крысы-самцы линии Вистар, свежий говяжий мозг.

Активности Т-киназы и ТТФ-азы определяли по наработке ТДФ (см.ниже). Учитывая несостоятельность изложенного ранее /üuenwon-gea, Cooper ,1977/ метода оценки активности ТДФ-кинаэы, для измерения скорости синтеза ТТФ нами разработан и применялся способ, основанный на количественной регистрации этого продукта. Инкубационная смесь объёмом I мл содержала I'IQ"^ Ы трис-HCI буфера pH 9,0, 5'Ю-4 Ы АТФ, 5'КГ3 Ы MgS04, 5Ч0"4 Ы ТДФ и 0,01-2,0 мг (в зависимости от чистоты препарата) фермента. Реакцию вели I ч при 37°, контрольная проба включала денатурированный белок. После разделения ингредиентов /Гриценко с соавт.,1991/ концентрацию ГГФ регистрировали радиометрическим или флуориметрическим /Елисеева, 1953; Leveille ,1972/ методами.

Молекулярную массу натив'ных белков или продуктов диссоциации их в мочевине находили гельфильтрацией через сефадекс G-200 /Andrews, Folley ,1964/, в додецилсульфате - электрофорезом в 10$ ПААГ /Laemmly ,1970/. Десенсибилизированные формы кинаэ получали путем физического воздействия - нагреванием или однократным замораживанием-размораживанием раствора. Концентрацию белка фиксировали по Брэдфорду /Bradford ,1976/ и спектрофотометрически Дауне, 1957/.

Аминокислотный состав гидролизатов определяли на автоанализа-то^е ААА-Т339 M (Чехословакия) / Moore, stein ,1958/. Содержание триптофана оценивали отдельно /Goodwin, Morton ,1946/. Гидр";из выполняли в вакуумированных ампулах с б M HCl при 110° в течение 18, 22, 48 и 72 и. Изоэлектрическую точку (pi) рассчитывали по аминокислотному составу и методом изоэлектрофокусирования /Ригетти, 1986/. Собственную величину pH нахйдили посредством диализа белка против бидистиллир ванной воды с измерением pH в диализате.

Изменения динамики киназ при взаимодействии с субстратами, кофакторами или эффекторами регистрировали после 20 мин преинкуба-ции компонентов в среде определения. Концентрацию компонетов, зонда или метки, связавшихся с белком, определяли гельфильтрацией на колонке с сефадексом G-50 /Керридж, Типтон,1974/. Число мест связывание и значения кажущихся констант связывания рассчитывали по Скэтчарду /scatchard ,1949/. Присоединение ПАЛФ к молекуле Т-киназы проводили по известному мето/ч/ / Chang, Hammes ,1989/.

Спектры флуоресценции фиксировали на люминесцентной установке ОДЛ-2 (Л0М0, СССР). Количество образца подбирали таким образом, чтобы его поглощение при длине волны возбуждения не превышало

•0,05 0Е, Квантовый выход (В) определяли относительно водного ра-, створа триптофана /Бурштейн,1976/. Положение спектров собственной флуоресценции белка и его комплексов с меткой находили по величине отношения интенсивностей флуоресценции ^315^350 ^^ W /*370 и COOTBeTCTDeHHO ^370^^430* КОТОРЫ0 относятся к коротко- и длинноволновым краям спектров. Эффективность переноса энергии с остатков триптофана на ПЛЛФ оценивали из отношения ^(х/^ЗЗО' Р0-гистрируомого вблизи максимумов спектров флуоресценции донора и акцептора.

Измерения длительности флуоресценции осуществляли на импульсном флуориметре /Гачхо с соавт.,1987/. Анализ кривых затухания» с учетом длительности возбуждающего имцульса и функции отклика системы регистрации (обращение сверток),проводили при помощи специальной программы, реализующей метод Пауэлла /Башарин с соавт., 1990/. Функцию затухания флуоресценции r(t) представляли в виде ' суммы 1 экспонент / O'Connor, Phillipe ,1984/.

Для расчета скорости ферментативных реакций применяли стационарные участки кинетических кривых. При графическом анализе данных, требующем построения прямнх линий, рассчитывались уравнения линейной регрессии с использованием метода наименьших квадратов.

Тиаминовый дефицит вызывали у крыс-самцов (160-180 г) ежедневным введением в течение £ zyt окситиамина в дозо 40 мг на кг массы. Для коррекции Bj-авитаминозиого состояния три группы витамин-дефицитных животных получали тиамин (20 мг на кг), таурин (650 иг) или смесь тиамина с таурином d вышеназванных концентрациях.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Синтез, очистка и стабилизация ТТФ. Синтез ТТФ осуществляли из тиамина, ортофосфорной кислоты и фосфорного ангидрида. 11,25 г 98* ортофосфорной кислоты, обезвоженной при 125° в вакууме в течение 6 ч, и 8,75 г фосфорного ангидрида нагревали до однородной массы при 60°, после чего добавляли при интенсивном перемешивании 5 г тиоминхлорида-гидрохлорида. Смесь выдерживали при этой температуре 90 мин, охлаждали до 0°, медленно приливали к 0,5 л безводного ацетона и оставляли при 0° на 24 ч. В осадке получали 13,6 г фосфорилировшшого тиамина,

Остаточнь концентрации свободной и солеобразующей фосфорной кислоты удаляли на колонке с сефедексом G--I0, разделение фосфатов Bj проводили в виде их внутренних солей "бет?.::;:ойого" типа xpows-тографией на ДЕАЕ-сефадексе А-25 при pH 7,4. Эфиры тиамина элюиро-вялн линейным градиентом UCI от 0,1 до 0,4 М, ТТФ вымывался 3-м

пиком 0,22-0,25 11 хлористым литием. Полная очистка ТТФ достигалась на ЗР-сефадексе С-25 при рН 3,8. Трифосфорный эфир не сорбировался в этих условиях и вымывался буфером основным пиком.

Очищенный препарат ТТФ не содержит примеси фосфорной кислоты, других фосфатов тиамина, однако в водном растворе недостаточно устойчив, гидролизуясь на 1,6-2,0$ в течение 3 мес хранения при 0°. Для стабилизации молекулы элюируемые с эР-сефадекса фракции основного пика упаривали до 4-6 мл, охлаждали (0°) и при интенсивном перемешивании в среде газообразного азота добавляли по каплям 20$ Ы0Н до нейтральной реакции. Литиевую соль трифосфорного э({ира трижды переосаждали иэ смеси абсолютных этанола и ацетона (1:10). Полученный препарат литиевой соли хроматографически однороден и в системе н-пропанол-вода-0,1 М фосфатный буфер рН 5,0 (3:1:1) его подвижность составляет 0,22. Температура плавления кристаллов 201? формула соединения, исходя из элементного анализа, С^Н^и^О^оРз* '1/2 З^О. Соотношение числа атомов II литиевой соли к числу модой ТТФ соответствует 2.

Изучение условий реакции этерификацки тиамина позволило найти оптимальные параметры наработки ТТФ, доведя его выход до 28,6$ а методами ионообменной хроматографии соединение выделено в аналитически чистом состоянии с конечным выходом 5,1/5.

Получение ферментного препарата для количественного определения ТДФ. Существенным недостатком ферментативного определения ТД®, основанного на рекомбинации его как кофактора с апоПДК и последующим проведении сопряжённой реакции с избытком пирувата, в присутствии АДГ /\nirioh , 1970/, является необходимость независимой очистки двух ферментов - ПДК и АДГ, при низкой устойчивости холо-и особенно апоПДК;, В случав оценки с-атуса тиамина по концентрации ТДФ в крови или моче недостаточной оказывается и чувствительность метода. Исхода из этого, одним иэ этапов нашей работы было получение очищенного комплекса апоПДК и АДГ, его стабилизация и разработка методологии определения микроколичеств ТДФ.

Для выделения и очистки комплекса 400 г сухих дрожжей смешивали с 1750 мл водного раствора, содержащего 67 мл глицерина, 0,67 г ЭДТА, 13,2 г На2НР0^, 2,8 г (нН^^О^ Олесь интенсивно перемешивали 10 мин, охлаждали до 0-2°, обрабатывали ультразвуком при 20 кГц а течение 20 мин и центрифугировали 30 мин при 4000} , а затем I ч при 105000ч. Экстракт фракционироьали ацетоном между 35-41% на-сыщег :я, осадок отделяли, растворяли в 400 мл 20 ыМ трис-НС1 буфера рН 7,3, с 1мМ ЭДТА и 5 мМ цистеин-гидрохлоридом, после чего фрак-

ционировали сульфатом аммония при насыщении 45-56%. Заключительную очистку проводили адсорбционной хроматографией на гидрокси-апатите в 0,12 М Иа-фосфатном буфере рН 6,8, содержащем 20 мМ Мв2+, I мМ ЭДТА, 0,5 мМ ТДФ к 5 мМ цистеин-гидрохлорида. В результате очистки удельная активность ПДК возрастала в 36, а АДГ -в 17,5 раз; соотношение активностей в комплексе составляло 1:0,15, что исключало лимитирование сопряженной реакции АДГ.

Апоформу ПДК (удаление ТДФ) получали хроматографией на колонке с молселектом (¡-25 при рН 9,0. Стабилизацию комплекса апоформы с АДГ осуществляли глицерином или (Щф^ЭО^ в присутствии ионов

В первом случае рН элюируемого с колонки апофермента сникали 50 мМ Иа-фосфатным буфером до 6,8, а затем вносили глицерин и 0,5 Ы МвЗО^ до конечной концентрации компонентов 30$ и 20 мМ, соответственно. Во втором - к белковому элюату приливали равный объём 5,4 М (ИН4>2304 в 0,1 М Яа-фосфатном буфере рН 6,8, с 0,04 М МвЗО^, после чего белок лиофилизировали при температуре - 35° и давлении 0,05 Па. В ЗС$ глицерине с реактивация апоПДК с низкими концентрациями ТДФ оставалась высокой 1,0-1,5 нед. Лиофилизи-рованный комплекс стабилен в течение года и использовался для разработки методик определения микроколичеств ТДФ, активностей Т-ки-назы и ТТФ-азы.

Ферментативный микрометод количественного определения ТДФ. При исследовании оптимальных условий рекомбинации микроколичесто ТДФ с апоПДК установлено, что максимальное связывание осуществляется в среде следующего состава: 20 мМ Н&-фосфптный буфер рН 6,8, 2-5 мМ и 70-150 мкг очищенного белка комплекса. Рекомбинацию необходимо вести 2 ч при температуре 18-25°. Указанные закономерности положены в основу разработки модельной системы количественной детекции ТДФ в биологическом материале.

Для определения микроколичеств ТДФ 0,1-0,2 мл аликвоты прокипяченных экстрактов тканей или крови рекоибинируют 2 ч с 0,1 мл раствора ферментного комплекса, разбавленного до необходимой коч-центрацип 20 м.М На-^фатным буфером рН 6,8 и 0,1 мл 50 мМ М^ЗО^. Общий объем смеси доводится исходным буфером до 0,8 мл. По истечении рекомбинации в каждую пробу вносят по 2 мл 0,15 Ц Па-цитратчо-го буфера рН и 0,1 мл 0,2 Ы пирувата На. Реакцию запускают внесением 0,1 мл 0,5 мМ НАДН, измеряя изменение оптической плотчо-сти раствора первые 5-10 мин при 340 км. По величина отклонения оптической плотности находят соответствующую ей точку на калибровочной кривой, построенной с известными концентрациями ТДФ. В ие-

следуемом интервале концентраций кофермента линейность сопряженного процесса сохраняется в пределах 1-200 пмоль ТДФ, точность измерения составляет 2,18%, чувствительность метода на порядок превышает чувствительность метода - прототипа /Ullrich ,1970/,

Методы измерения активностей ТТФ-азы и Т-киназы по наработке ТДФ. Использовавшийся ранее метод определения активности ТТФ-азы ПО Ф[{ /tfashitani, Cooper ,1972; Penttinen ,1981/ характеризуется низкими чувствительностью и специфичностью. Нами предложен способ оценки активности фермента по второму продукту - ТДФ. Инкубационная смесь объемом I мл включала 0,05-1* 10"^ Ii ТГФ, I'IO"2 М MgS04, 2*10"^ Ы трис-HCI буфера pH 8,7 и 0,1 мл экстракта ткани. Реакцию вели 10-30 мин при 37° и останавливали 0,2 мл 20$ ТХУ, которую затем удаляли экстракцией 9-ю объемами водонасыщенного эфира. После освобождения от ТХУ смесь разбавляли 3 мл 5*10"^ U Ка-фэсфа-тного буфера pH 6,8, центрифугировали и отсюда отбирали по 0,1 мл для рекомбинации образовавшегося ТДФ с апоПДК дрожжей. Начальную скорость сопряженной ПДК-АДГ реакции фиксировали как описано выше

Помимо высокой чувствительности (10 пмоль; по Фн - 10 нмоль /Penttinen. ,1981/) метод специф1чен, что находит отражение в стехиометрии реакции: в случае экстрактов тканей гидролиз I моль ТТ4 приводит к образованию 0,74-0,87 моль ТДФ и 1,46-2,05 моль Ф,(.

Для определения скорости Т-киназной реакции инкубационная см>.сь в I мл содержала 2'10"Э М АТФ, 2* Ю-5 U тиамина, 2'10"3 Ы трис-HCI буфера pH 8,6, I'I0~2 М WgS04 и 10-20 мкг фермента Инку бацию вели I ч, реакцию останавливали кипячением, а из разбавленной 0,05 М фосфатным буфером pH 6,8 в 3-5 раз смеси отбирали соот ветствувщие аликвоты для количественного измерения ТДФ.

Молекулярно-кинетические параметры и регуляция Т-киназы мозга и пивных дрожжей. Очистка дрожжевого белка. Известные методы выделения Т-киназы,/Арцукевич с соавт.,1977; Воскобоев с соавт., 1975; Haada ,1969; Mitsuda ot al.,I975/ приводят к её низкому выходу. Для получения препаративных количеств белка и изучения ого свойств были синтезированы новые аффинные сорбенты, не имеющие ка-тионного заряда в месте присоединения вставки к носителю и различающиеся степенью гидрофобности: имидазол, тиамин или ТДФ-Е-4-азо-бенэоил-е-аминокапроилгидразидосефароза, ТДФ-Н-4-азобензоил-е.-гли-цилглицингидразидосефароза. Наиоолее эффективное связывание Т-киназы происходило на сорбентах с ТДФ в качестве лиганда при pH 7,2 в присутствии I мМ Mg2+, количественная десорбция наблюдалась в области значений водородного показателя 8,9, при котором образует-

ся тиоловая форма тиамина. Гидрофобные и электростатические взаимодействия существенно не влияли на связывание фермента. Результаты очистки отражены в таблице.

Таблица

Очистка тиаминкиназы из пивных дрожжей

:Общее : Активность : Сте-:коли- :оощая,гудельная»; пень Стадия очистки :чество:нмольт:нмоль-ч~т; очист-гбелка,: *ч : "мг : ки _: мр :_: белка :_

Препарат фермента после

фракционирования (KH4)2S04 69 512 8 - 100

/Воскобоев с соавт.,1975/

Хроматография на ТДФ-Л-4-

аэобензоил-е-глицилглицин- 0,98 456 464 58 89

гидразидосефпроэе

2. Множественные формы Т-киназы. Электрофорез Т-киназы в однородном 7% ПААГ при рН 8,9 показал, что при концентрации белка 60-100 мкг на эимограммах обнаруживается одна полоса. По мере снижения концентрации до 15-20 мкг прокрашиваемая зона раздваивается и на эимограммах появляются две разной интенсивности полосы со слабым просветом между ними. ппи нейтральных рН (7,2-7,4) преинкуби-рованнып в течение 30 мин белок детектируется всегда одной полосой независимо от концентрации наносимого фермента. Ионообменная хроматография и гельфильтрация высокоочищенного препарата подтверждают структурную гетерогенность Т-киназы,элкшруемой, в зависимости от рН, одним или двумя ассиметричными пиками, причем удельная активность в центре пиков была значительно ниже, чем по краям. Электрофорез в градиенте концентрации ПАЛГ от 3,5 до 155? при рН 8,9 выявил вместо двух спаренных наличие шести хорошо расфракционировэ.н-ных полос с Rf 0,17; 0,20; 0,28; 0,30; 0,38; 0,41. По подвижноеги полосы разделялись на три группы (I-III), по две полосы в каждой, из них быстромигрирувщие анодные (III) оказались более интенсивными по сравнению с катанными (I) и особенно промежуточными (II). Молекулярные массы множественных форм фермента равны 182000,172000; 135000, 129000; 100000, 92000 Да. При детекции Т-киназы в дисках геля активность фермента обнаруживается во всех без исключения группах, однако скорость биосинтеза ТДФ в группах II, III была 1о-лее высокой.

Электрофорез белка в градиенте концентрации ПЛЛГ при рН 7,2 выявил только две основные формы Т-киняяы с массой 100000 и 92000

Вы|од,

Да, две минорные формы с массой 135000 и 129000 и две соответствующие группам зоны ферментативной активности. Предварительная инкубация белка с 2$ формальдегидом, используемым для "сшивания" четвертичной структуры, исключила равновесный переход отдельных форм при изменении рН. Полученные данные показывали, что в очищенной по разработанной нами методике Т-кинаэе отсутствуют электрофо-ретически проявляющиеся примеси балластных белков и что в зависимости от рН среды фермент может быть представлен различными олиго-мерными формами, находящимися в динамическом равновесии. Равновесие между формами устанавливается не мгновенно, а со скоростью, сравнимой или меньшей скорости ферментативного процесса.

Положение равновесия, помимо рН, определяется концентрациями Т-киназы, тиамина, интермедиатов узловых ТДФ-зависимых реакций (пирувата, фосфоенолпирувата), дикарбоновых кислот цикла Кребса, ионов двухвалентных металлов. При концентрации белка 0,1-0,2 мг/ /мл, низкой ионной силе (0,005-0,01 М) и температуре 37° электро-форетически регистрируются преимущественно низкомолекулярные формы фермента с Нг 100000, 92000 и 49000, 46000 Да. При 0-4° и концентрации белка 4-5 мг/мл преобладают олигомеры с массами 1820и0, 172000 и 135000, 129000. Тиамин влияет на олигомерное состояние молекулы Т-киназы путем изменения равновесия ассоциация диссоциация в сторону диссоциации. Что касается который в малых концентрациях активирует, а в больших угнетает ферментативную активность, то полученные результаты показывают, что ионы * чд-сорбируясь на участке, расположенном в зоне контакта субъедшшц или поблизости от нее, и облегчая связывание полипептидных цепей посредством временного мостика между ними, в малых концентрациях способствуют образованию промежуточных форм (II, III), тогда как высокие концентраци, приводят к еще большей агрегации и снижению Т-киназной активности. На это указывает отсутствие глубоких изменений пространственной конфигурации обработанного фермента при его. химической модификации эН-агентами.

Пируват, подобно Ид , характеризуется двойным разнонаправленным действием в близких к физиологическим концентрациях (0,1-0,5 мЫ) ингибируя, а в более высоких - активируя биосинтез ТДФ. Цитрат снижает каталитическую активность, причем кривая зависимости Уд от [I] представляет выраженную Э-о^разную функцию. Активные центгч фермента и участки связывания цитрата и пирувата пространственно разделены. с/-кетоглутарат не влияет на скорость реакции. Выявленные закономерности функционирования Т-киназы не являются

артефактом очистки белка, а детерминированы и определяются сК'.обей-ностями четвертичной структуры.

3. Физико-химические параметры фермента. По аминокислотой^/ составу Т-киназа дрожжей отличается от рассчитанного "среднего белка" /Полторак, Чухрай,1971/ и содержит 18,62 и 17,15$ кислотных и основных остатков. Для белка характерна повышенная концентрация аминокислот, способствующих о^-спирализации белковой глобулы, при одновременно высоком количестве остатков, связывающих полипептидные цепи (цистеин) или осуществляющих их резкий поворот (пролин). Число гидрофильных остатков преобладает над гидрофобными (соответственно 55,62 и 44,38$), причем из аминокислот с неполярными й-груп-пами наиболее распространены аминокислоты средней и низкой гидро-фобности (лейцин, аланин, валин), небольшие углеводородные радикалы которых не могут препятствовать контакту белка с полярной водной фазой, содержащей металл, АТФ и тиамин. Значение изоэлектриче-ской точки Т-киназы равно 6,21, изоионной - 6,28.

Максимум спектра собственной флуоресценции фермента 328 нм, полуширина - 53 нм, квантовый выход - 0,14. Тирозин вносит крайне малый вклад в флуоресценцию. Излучение преимущественно образовано триптофанилами класса I, локализованными в интерьере белковой молекулы в гидрофобном окружении. Они недоступны отрицательно заряженным ионам I", мало доступя. положительно заряженным ионам Со+ и доступны нейтральным молекулам акриламида. Па основании анализа спектральной зависимости кинетики затухания флуоресценции выделено три хромофорные группы, имеющие различное положение максимумов спектров оЛд» 330, Л ^ 325,^? = 320 нм) и длительности (соответственно X ¡= б, 10^0,46; "Г2= 2,76*0,30, 1,Ю±0,П не).

Гетерогенность триптофанилов обусловливает спектральные зависимости поляризации, длительности и батохромный сдвиг спектра.. Увили-чение концентрации Т-киназы в растворе сопутствует повышению степени поляризации. Поскольку положение спектра и квантовый выход при этом не меняются, причиной отмеченных выше изменений является уне-личение ассоциации белковых молекул. Устойчивость олигомеров записи? от температуры. К; тковременное нагревание раствора ферменте! (0,9 иг/т) до 50° в течение 30 с, а затем быстрое охлаждение приводит к сниже- ш степени поляризации с 19 до 115?. Измерения, выполненные через 30 мин после охлаждения,указывали на обратимость диссоциации, подтверждал представление о равновесной системе множественных форм Т-кинаэы.

4. Влияние субстратов, кофакторов и эФЕекторов на структуру н

динамику Т-киназы, Для выяснения механизмов регуляции скорости биосинтеза ТДФ было изучено влияние наиболее значимых метаболитов, включая субстраты и ионы двухвалентных металлов, на параметры собственной флуоресценции фермента. Проведенные исследования показали, что связывание тиамина с Т-киназой сопровождается уменьшением интенсивности и незначительным длинноволновым сдвигом спектра её триптофановой флуоресценции. Заметных изменений степени поляризации при этом не наблюдается. Качественно такие же отклонения параметров флуоресценции имели место при замене тиамина на его фосфаты. Взаимодействие фермента с АТФ приводит к принципиально иным спектральным изменениям флуоресценции, характеризующейся коротковолновым смещением спектра излучения триптофанилов. Это объясняется тем, что тиамин и АТФ связываются в различных пространственно разобщенных участках, при этом фосфатные группировки не играют решающей роли в связывании, т.е. взаимодействие тиамина и его фосфорных эфм-ров с Т-киназой осуществляется через пиримндиновый, а АТФ - через адениновый циклы, в результате чего происходят локальные конформа-ционные изменения в молекуле фермента.

Основной метаболит гликолиза - пируват, присоединяется по двум разным центрам Т-киназы с константами связывания 0,41* и 1,43* •КГ3 М. Взаимодействие с пируватом сопровождается тушением триптофановой флуоресценции и изменением положения её максимума, причем смешение спектра имеет двухфазный характер, меняющийся в зависимости от концентрации лиганда: при низких концентрациях пирува"! (до 0,6 мЫ) прослеживается длинноволновой сдвиг спектра, который при повышении концентрации сменяется коротковолновым. Исследования с зондом (ТНС) н меткой (ПАЛФ), а также активности фермента показали, что один из центров связывания пирувата ингибирующий (относительно гидрофобный), а второй активирующий (гидрофильный). Последний находится в непосредственной близости с центром связывания тиамина и обеспечивает взаимодействие карбонильной группы пирувата с четвертичным азотом витамина, облегчал отщепление продукта - ТДФ от молекулы киназн. .

Ионы двухвалентных металлов фиксируют подвижные полярные боковые группы аминокислот, ограничивающие доступ субстратам и эффекторам к активному центру. В итоге создается геометрия, оптимальная для протекания ферментативной реакции •< её аллостерической регуляции. Кроме того, катионы металлов абсолютно нужны для связывания АТФ с молекулой Т-киназы. Из совокупности полученных результатов предложена модель организации активного центра фермента.

Рисунок. Модель расположения субстратов, пирувата и ионов металла в активном центре тиаминкиназы

5. Локализация и свойства Т-киназы мозга. По основным физико-химическим и кинетическим параметрам Т-киназа из мозга быка существенно но отличается от Т-киназы пивных дрожжей: имеет оптимум рН 8,6-8,8, молекулярную массу 53800*2700, является металл-зависимой и активируется субстратом - тиамином. К в для свободных ионов магния составляет 0,4'10"^ 11, Кп для тиамина и комплекса Ы 0,72'10"^ и 0,83'Ю-^ И, время полуперехода белка из одного олиго-мерного состояния в другое ~ 9,2 мин. Вместе с тем, ассоциация Т-киназы с гидрофобными учаслсаыи мембран свидетельствует о более сложной регуляции синтеза ТДЗ в клетках мозга, по сравнению с дрожжами, где отмечена цнтозольнал локализация фермента.

Выделение, очистка и характеристика ХЛФ-киназн. I. Детекция биосинтеза ТТФ. Ограниченность сведений о ТДФ-киназе предопределилась устоявшимся мнением, что субстратом реакции синтеза, ТТФ может быть только ТДФ, прочно связанный с белком неустановленной природы, и в этой связи очистка кинази представлялась невозможной /nuenuong;-ва, Cooper ,1977/. Для выяснения правомочности предложенного варианта ферментативного процесса в качестве субстрата нами использовался * С-ТДФ, продуцируемый после инъекции тиаминдефнцитным жгво-тним меченого витамина. В ходе экспериментов было установлено, что з случае применения v. -ченого нативиого супернатанта печени в среде инкубации всегда выявляется положительная корреляция между количеством С-ТТ'5 в опытной и контрольной пробах, которая отсутствует, если субстратом реакции является высоленный белок супориатанта, содержащий всю ^С-связаиную метку, т.е. образование ТТФ происходит из свободного, не связанного с белком ТДФ, присутствующего о

гиалоплазме гепатоцитов, а реакция синтеза ТТФ осуществлялась по схеме: 2+

тдф + т ——_ тг$ + адф.

Е

Фосфорилирование ТДФ в дрожжах не отличается от такового в тканях млекопитающих. К аналогичному выводу параллельно с нами пришла группа зарубежных исследователей / ЗсЬг1Дуог ог а1. ,1978/.

2. Получение высокоочищенного фермента, его структурная организация и физико-химические свойства. Проведенные исследования показали, что удельная активность ТДФ-кинаэы в пивных дрожжах в 39 раз превышает активность в печени животных и равна 0,046 толь ТТФ'Лмг"1. Подготовку биомассы дрожжей и экстракцию белка для очистки осуществляли в условиях,описанных для Т-киназы /Воскобоев с соавт.,1975/. Полученный после центрифугирования экстракта су-пернатант (I ч при I05000ц) сначала подвергали тепловой обработке (52°), а затем двойному фракционированию сульфатом аммония, собирая фракции последовательно между 40-70 и 50-60» насыщения. (иН^^зО^ удаляли на колонке с сефадексом (¡1-25, элюат белка подкисляли до рН 4,8, выдерживали при этом рН в течение I ч, после чего хроматографировали на ЭР-сефадексе С-50, уравновешенном 0,05 И ци-тратным буфером рН 4,8. Заключительную очистку осуществляли гель-фильтрацией на сефадексе С-200 при рН 8,0 и рехроматогра^ией на РА^-сефадексе А-25 при рН 9,05.

Высокоочкщенный белок имел удельную активность около 95 шоль ТТФ'ч~*'мг~*, в 2000 раз превышающую активность в экстракте, с выходом 19%. Препарат не проявлял фосфатазных активностей и не содержал примеси Т-киназы. Электрофорез нативной ТДФ-киназы в ПЛАГ обнаружил её гетерогенность, однако с юсобностью к синтезу ТТФ обладали все без исключения белковые зоны, свидетельствуя о функциональной гомогенности выделенного фермента. Повторная хроматография белка при рН 9,3 способствовала фракционированию его на отдельные субформы с массами 190000-130000, 130000-84000 и 78000-53000 Да, из которых наиболее высокую активность имели агрегаты с Мг 190000-130000. Концентрирование или разбавление растворов групп фермента меняло общую картину электрофореграмм, указывая на протекание обратимых процессов ассоциации-диссоциации множественных форм.

При гельфильтрации высокооч? -¡енного препарата на сефадексе 0-200 ТДФ-кинпза элшровалась двумя ассинетричнкми пиками с ТТФ-сшпезирующей активностью во всех белковых фракциях. Молекулярная масса белка первого пика была равна 162000*8000, второго - 81000±

^4000 Да. Под действием додецилсульфата На фермент диссоциировал до мономеров с Мг 14000 и 12500. Учитывая, что основными компонентами ТДФ-киназы являлись олигомеры с Мг 162000, проявляющие максимальную каталитическую активность, можно полагать, что оптимальная форта белка имеет 12 неидентичных субъединиц, а причина гетерогенности вызвана особенностями четвертичной структуры молекулы, характеризующейся подвижными полипептидньми цепями. К аналогичному выводу приводит исследование рН-зависимости. Для очищенной ТДФ-киназы свойственны дча оптимума рН: 6,5-7,5 и 8,5-9,5. Однако, иолк для свежепыделенних форм с Мг 190000-130000 скорость синтеза ТТФ при рП 8,5-9,5 выше, чем при 6,5-7,5, то для форм с Мг 84000-78000 и 53000 наблюдается обратная зависимость. Сравнение данных после 7 сут хранения препарата показало перераспределение оптимумов с тенденцией их уравнивания. Время полуперехода белка из одного олиго-мерного состояния в другое невысоко, сравнимо со скоростью синтеза ТТФ и составляет 3,7 мин.

ТДФ-киназа обладает собственной триптофаковой флуоресценцией с максимумом при 344 нм. Анализ параметров флуоресценции предполагает наличие рыхлой, диссоциирующей молекулярной структуры белка, подверженной воздействию субстратов, близких к ним по строению аналогов, катионов двухвалентных металлов. По общему аминокислотному составу фермент из дрожжей имеет сходство с Т-киназой из одноименного источника.

3. Кинетические характеристики ТДФ-киназы. Сложная структурная организация белка находит отражение в характере кинетических зависимостей, не подчиняющихся закономерностям классической кинетики Михаэлиса-Ментен. Это проявляется в атипкчности кривых изменения удельной активности ТД5-киназы от её содержания в растворе, концентрации субстратов (ТДФ, 1&'АТФ), эффекторов (МеМп2+, Со2+) или ингибиторов (ДТФ, тиамин, окситиамин).

Исследование насмценил ТДФ-киназы тиаминдифосфатом, при различных фиксированных концентрациях белка, показало, что полученные кривые обнаруживают выраженный Э-образный характер. Ст. лень З-об-раоности уменьшается по мере увеличения концентрации фермента, а при разбавлении раствора рассматриваемая Функция заметно усложнялась. Значения пц для концентраций ТДФ-киназы 0,15; 1,0; 2,5 и 3,5 иг/мл при расчете из логарифмических координат составили соответственно 5,14; 3,27; 1,88; 1,66 и при помощи разностного метода -2,92; 1,55; 1,76 и 1,53. Сходство коэффициентов, найденных различ-ними методами, при высоких концентрациях фермента и их несовпаде- ■

ние по мере разбавления раствора подтверждает невыполнимость исходного уравнения Хилла при низких концентрациях ТДФ-киназы и достаточную объективность оценки г^ при М0—■-со.

Вышеизложенное свидетельс*вует о положительной кинетической кооперативности по ТДФ и предполагает наличие более чем одного центра связывания в молекуле ЭДФ-кинаэы. Вместе с тем, несовместимость кривых при преобразовании экспериментальной зависимости от [а]0 в зависимость lg -»0 от 1к [Е]0 позволяет утверждать, что нооперативность по ТДФ для фермента только частично зависит от смещения равновесия между однгомерными формами, причем вклад его в общую кинетическую кооперативность по субстрату уменьшается с увеличением концентрации белка.

Десенсибилизация приближает сигмоидную кривую насыщения субстратом к классической гиперболе. Данные, полученные при десенсибилизации ТДФ-кинази, указывают на аллостерическув природу кинетической кооперативности по ТДФ, подтверждая наличие для последнего неравнозначных пространственно разделенных участков связывания. Сходная, как для ТДФ, картина кинетических зависимостей прослеживается для Ые'АТФ, свободных ионов М^* и АТФ. Максимальная активация фермента наблюдается при 10-20-кратном избытке двухвалентных катионов.

4. Механизм взаимодействия субстратов с ферментом. ТДФ-кииаза имеет широкую субстратную специфичность. Донорами фосфатной группировки являлись АТФ, УГФ, ГТФ, ИТФ и ЦГФ, Для выяснения природы связи нуклеозидтрнфосфота с молекулой фермента белок инкубировали в присутствии Ые + с меченым по фосфору в X-положении АТФ. При прямом контакте субстрата с белком образования ковалентного или ке-сткосвязанного промежуточного соединения ТДФ-киназа - фосфат в условиях незавершенного каталитического акта не происходят.

Учитывая, что в комплексообразоваши участвуют силы молекулярного взаимодействия разных типов, характерн л для данного белка, непосредственную оценку связывания субстратов и самого механизма синтеза ТГФ осуществляли методом равновесного диализа. Состоял!!о равновесия, к которому пргаодит система фермент-АТФ без кофактора

характеризуется нулевым градиентом концентрации ^С-АТФ, указывая на отсутствие какой-либо её протеидизации. Внесение вероятно в силу координирования или хелатироваютя иона металла, способствует связывание Ые'^С-АТФ. ¡Соыплексообразо ванне со вторым субстратом, ТДФ, происходит при наличии и в отсутствие кофактора или АТФ, прячем I моль фермента связывает одинаковое, примерно ра-

внов 3, число молей Mg'AT$ и ТДФ. Значения констант равновесия для субстратов составили 1,5*10"^ и 3,9*10"^ Ы соответственно, т.е. взаимодействие обоих субстратов с ТДФ-киназой не затруднено и, следовательно, присоединение Mg'AT$ и ТДФ неупорядоченно. В данном случае реакция протекает по схеме, где все возможные двойные фермент-субстратные комплексы образуются быстро и обратимо, а единственной медленной стадией является взаимное превращение двух тройных комплексов.

ТТФ-аза "i мозга быка. I. Очистка, распределение и субклеточная локализация фермента. I кг мозга гомогенизировали в 2 л 25 мМ трис-HCI буфера рН 7,5,. с 0,2 мМ ЭДТА и 0,15 Л KCI, центрифугировали I ч при 5000, , высокомолекулярные компоненты осаждали ЗС$ (NH^JgSO^, а белки супернатанта сорбировали на колонке с тойопер-лом Hw -60, уравновешенной сульфатом аммония 30£ насыщения. Элюи-руемые линейным градиентом (Шф^зО^ фракции ТТФ-азы подвергали гельфильтрации на сефодексе G-75, ионообменной хроматографии на ДЕЛЕ-тойоперле 650 М при рН 7,4; минорные концентрации примесных белков удаляли на голубой сефарозе. На завещающем этапе фермент имел удельную активность 10,8 мкмоль ТДФ'о мг~*, его выход составлял 5,3%, степень очисткя - 68000 раз. Препарат ТТФ-азы был гомогенен в ПААГ, не содержал сопутствующих фосфатазных активностей и проявлял абсолютную специфичность к ТТФ. Молекулярная масса на-тивного фермента оценена в 33500 Да, денатурированный белок мигрировал одной полосой с подвижностью соответствующей массе 33900,

Гидролиз ТТФ с различной скоростью протекал во всех ксследо-ванннх нами органах и тканях быка. Высокая активность ТТФ-азы и достаточно равномерное распределение ТТФ дают основание предполс?-, жить универсальную роль этого соединения в клетках разных типов-*, не только в нервной системе /schoffenicia, Mar0ineanu,I985/, свяч' занную с контролем проницаемости мембран для ионов Иа+.

В растзорииой франции локализовано около 85% ТТФ-азной.аятив,-иостн. Сопоставляя существование цитозольной, абсолютно спецкфцч- о ной к субстрату 'ГГФ-аэи, с мембранной локализацией /iJa.judar Cooper, 1981/ и возможными мембранными функциями ТТФ разумно, однако,,, допустить, что данный фермент является периферическим м§мбр£ннш белком, accaLVtupat33.nm.7j с мембранами лабильными связяэд. .Подтверждением тому служат обнаруженные нами выраженные гидрофобные, свойства фзрлента и результаты гистохимических исследований ».показав-пи« наличие ТТФ-расщепляющей активности в области плазматической.; мембраны и синапсов.

2. Кинетические исследования ТТФ-азы. Зависимость начальной скорости гидролазной реакции от концентрации ТТФ описывается двухфазной кривой с промежуточным плато. Трансформация в двойных обратных координатах приводит к линеаризации обеих её ветвей, при атом на графике наблюдается выраженный перелом. Такой характер кривой насыщения удается объяснить основываясь на представлении о двух кинетически различимых изофэрмах ТТФ-азы, равновесие между которыми определяется концентрацией субстрата: при малых концентрациях ТТФ преобладает форма с большей аффинностью к субстрату (Кю 43 мкМ; ^макс 9,9 мкмоло'с""*'мг_*), повышение концентрации индуцирует обратимый переход белка в более активную форму с низким сродством (Кш 298 мкМ; умакс 19»3 мкмоль'с~*'мг ).

На обоснованность выдвинутого предположения указывает характер температурной зависимости скорости гидролиза ТТФ, где в координатах Аррениуса отчётливо виден перелом в точке, соответствующей физиологической температуре тела животного. Численные значения энергий активации, рассчитанные для двух изомерных форм ТТФ-азы, составляют 85,278 и 47,179 кДж/моль, температурные коэффициенты - 3,32 и 1,75 соответственно.

Об аллостерической природе ТТФ-азы свидетельствуют результаты опытов со структурным аналогом ТТФ - окситиаминтрифосфатом (ОТГФ). При низких концентрациях ОТТФ или ТТФ фермент практически полностью представлен формой с высоким сродством к истинному субстрату, гидролизует его и не расщепляет аналог. С повышением концентрации ОТТФ последний, взаимодействуя помимо активного со вторил«, аллостерическим центром белковой молекулы, индуцирует изменение конфорлации её и переход в более активное состояние, что сопровождается снижением специфичности ТТФ-азы и гидролизом ОТТФ. При концентрациях аналога или ТТФ порядка 0,2 ыМ фермент преимущественно находится во второй форме, а Эд ^ для ОТТФ (0,3-0,4 мМ) практически совпадает со значением Кш. для ТГФ (0,298 мМ).

Очищенный фермент проявляет абсолютную зависимость от ионов двухвалентных металлов, среди которых наиболее высокая активирующая способность свойственна для катионов М^*. Ионы металлов выполняют бифункциональную роль: в составе субстратного комплекса металл'ТТЗг и в качестве активаторов ТТФ-азы. Активация свободными катионами носит сложный характер и является функцией концентрации ТТФ, что может быть следствием конформационного перехода белка по мере увеличения концентрации субстрата,

3. Регуляция активности фермента. Нуклеозидфосфаты ингибируют

белок по частично смешанному типу, причем эффективность ингибитора главным образом определяется количеством фосфатных остатков в его молекуле. Из этого следует, что фосфптсодержащий фрагмент вносит основной вклад в связывание и определяет прочность связи комплекса ингибитор-ТТФ-аза. Для выяснения, какие компоненты ингибитора препятствуют связыванию субстрата, а какие его превращению, изучалось влияние на активность фермента аденозина и Фн. Как оказалось, аденозин (и тиамин) ингибируют реакцию по неконкурентному типу, а Фи и 1К>[( - по конкурентному. Полученные результа.ы показывали, что фосфатные группы ингибитора и субстрата взаимодействуют с субстрат-связывающим участком активного центра гидролазы, в то время как правильная ориентация тиамнновой части ТТФ необходима для его каталитического расщепления. К1 для АТФ (1,6 мМ) лежит в области физиологической концентрации макроэрга в мозге и позволяет говорить о возможной регуляции им активности ТТФ-азы.

Второй путь регуляции скорости гидролиза обусловлен аллостери-ческим воздействием '170, индуцирующим переход ТТФ-азы из одной активной конформации в другую. Хотя общая концентрация ТТ5 в мозге составляет около 0,04-0,07 мкМ / 1эУт ,1979; Ве«еп<1огГГ

е* а1. ,1985/, учитывая его локализацию в области плазматической мембраны и исходя из простых математических расчетов объёмов сфер и цилиндров, соответствующих диаметрам тел и аксонов нервных клеток, реально можно показать существование локальной концентрации ТТФ на три порядка выше установленной, т.е. в пределах 50-100 мкМ, что приходится на диапазон концентраций, в котором осуществляется переход между изоформпми ТТФ-азы.

Ещё один механизм регуляции активности фермента, по-видимому, связан с активацией свободными ионами концентрация которых

в клетке не превышает 0,4 мМ /Риг1сЬ, Ргогаш ,1^72/. Рассчитанная нами Кя. для 1^=1,3 При таком соотношении величин, когда С'^слоб] !Слт' реакция приближается к первому порядку и любые незначительные изменения концентрации ионов металла будут вести к сравнительно большим изменениям скорости реакции.

4. Взаимодействие ТТФ-азы с субстратом. рК аминокислотного остатка в связывающем участке активного центра ТТФ-азы имеет значение 9,2, что может соответствовать константе ионизации с-аминогруппы лизина /Диксон, Уэбб,1982/, Находясь преимущественно в про-тонированной ферме при рН < 9,2, данная группа способна легко взаимодействовать с отрицательным фосфатным радикалом ТТФ посредством электростатического притяжения, что, вероятно, служит первым

этапом образования фермент-субстратного комплекса. Сравнение К1 для нуклеоэидфосфатов говорит о наличии не менее двух остатков лизина в активном центре ТТФ-азы.

Использование аналогов тиамина и ТТФ показало, что существенная роль в связывании с каталитическим участком принадлежит аминогруппе пиримидинового кольца молекулы субстрата и гидрофобным силам, тогда как взаимодействие четвертичного азота тиазола с соответствующей группой активного центра приводит к непосредственному гидролизу терминального фосфатного остатка ТТФ.

рК аминокислотных ост^.'ков активного центра, 'состояние ионизации которых важно для гидролиза, равны 7,8 и 9,8 и могут соответствовать (/-аминогруппе и гидроксилу тирозина. Снижение активности ТТФ-азы, наблюдающееся при сдвиге рН от оптимума реакции (8,78,8) в кислую сторону, в таком случае объясняется протонированием вышеназванной аминогруппы, в результате чего приобретенный ею положительный заряд будет в значительной мере препятствовать образованию водородной связи между одной из близлежащих карбонильных групп пептидной связи и -Ш^ группой пиримидина молекулы ТТФ. Одновременно это приводит к ослаблению гидрофобных взаимодействий, следствием чего является нарушение правильной фиксации субстрата. Снижение активности в сильно щелочной области - результат ионизации -ОН группы тирозина. Находясь при рН ниже 6,8 преимущественно в -ОН форме, вышеуказанная группа несёт частичный положительный заряд, силы отталкивания между которым и положительно заряженным атомом азота тиазола, очевидно, способствуют окончательной деформации субстрата и разрыву связи между ^ - и ^ -атомами фосфора.

Ферменты биотрансформации активных форм тиамина в условиях В|-гиповитаминоза. Направленность потока фосфатов тиамина реально оценить из соотношения активностей ферментов синтеза и распада этих соединений. Сопоставление активностей Т- и ТДФ-киназ в крови, тканях мозга, печени и сердца свидетельствует,- что изменения скорости образования ТТФ, в разные сроки гиповитаминоза, всегда гораздо более значительны по сравнению с изменениями скорости синтеза ТДФ и начинают выявляться в первые сутки тиаминовоП недостаточности. Активность Т-кинаэы в течение нескольких суток остаётся на уровне контрольных величин и лишь с началом деструктивных изменений в тканях, к 5-м суткам, достоверно снижается.

Специфика функционирования ферментов фосфэрилирования тиамина определяется структурной организацией обеих кииаэ. Характеризуясь наличием медленнодиссоциирующих олигомерных форм ^=13,3 мин) с

25 -

высоким сродством к тиамину (КпИЗ' Ю~°М), Т-кинаэа в условиях гиповитаминоза способна достаточно длнтельноэ время при низких концентрациях витамина поддерживать минимальный, необходимый для нормальной работы ТДФ-зависимых ферментов, уровень ТДФ, тогда как незначительные, наблюдаемые к З-б ч, отклонения содержания дифосфор-ного эфира, как субстрата ТДФ-киназы, уже приводят к сравнительно большим изменениям скорости 5=3,7 мим; Кт. для ТДФ М)

ТДФ-киназной реакции. Это проявляется а первоначальном, к 6-12 ч, снижении концентрации ТТФ, нейротропной формы тиамина, и только к 5-м суткам - белковосвяэанного ТДФ. Активность ТДФ- и ТТФ-аз при В^-гиповитоминозо практически не изменяется.

Контролируя содержание ТДФ и ТТФ в клетке и оказывая регулятор-ное воздействие на активность ТДФ-зависимых белковых систем, ферменты фосфорилиропания тиамина сами испытывают при этом влияние субстратов и продуктов катализируемых системами реакций. Наиболее отчётливо связь процессов прослеживается между Т-киназой и пируватде-гидрогеназным комплексом, реализуясь на уровне концентрационных соотношений пирувата и ТДФ. Для с^-кетоглутарптдегидрогеназного комплекса отмеченная зависимость не так важна," хотя и в этом случае синтез коформента остаётся под контролем дикарбоновых кислот, объединённых с е/-кетоглутаратом в единый метаболический путь.

ВЫВОДЫ

1. Впервые в гомогенном состоянии получены ферменты синтеза активных форм витамина В^: АТФ-тиаминдифосфатфосфотрансфераза (ТДФ-киняла) и ц препаративных количествах АТФ-тиаминдифосфотр:..1-оДертла (Т-киназа), В, клетках пивных дрожжей и мозге быка оба белка продстаплемы ассоцнируоде-диссоциирущиыи системами олигомеров с различными каталитическими свойствами. Скорость перехода между олигомерамк низка, сравнима со скоростью каталитического акта и зависит от рИ, температуры, ионной силы буферного раствора, конце-,, нтрНГции ферлентов, тиамина, двухвалентных катионов, а также пиру- . вата, фосфоеполпирувата, дикарбоновых кислот цикла Кребса.

2. Активный центр Т-кинаэы представляет гидрофобную полость,

в которой тизшн и АТФ сорбируются пиримидиновым и аденнновнм цик- . л"ми, а дифосф-чтиый радикал субстрата-донора направлен в сторону субстрата-акцептора. Пируват тлеет два центра связывания: ингиби-. рующий (относительно гидрофобный) и активирующий (гидрофильный), . расположенный вблизи места локализации тиамина и облегчающий отщеп-,. ление продукта - ТДФ. Ионы двухвалентных металлов определяют, опти-■ мольную геометрию сорбции субстратов и эффекторов в активном цен-

тре Т-киназы.

3. Реакция синтеза трифосфорного эфира тиамина осуществляется ТДФ-киназой и не требует для своего протекания присутствия глюкозы. Перенос фосфатного радикала ферментом печени и дрожжей происходит на свободный, а не на белковосвязанный ТДФ.

4. Из мозга быка впервые выделена однородная, растворимая тиаминтрифосфат-фосфогидролаза (ТГФ-аза) и обоснована её периферическая мембранная локализация. Фермент не обладает четвертичной структурой, металл-зав ':им и отличается абсод;тной специфичностью к субстрату. Обнаружены две кинетически различимые изо-форыы белка, равновесие между которыми устанавливается в милли-секундном интервале и определяется концентрациями субстрата. Другие вероятные механизмы регуляции гидролиза ТТФ включают инги-бирование фермента АТФ и .»ктивацию свободными ионами магния.

5. Связывание ТТФ с каталитическим участком активного центра ТТФ-азы осуществляется за счёт фосфорнокислого радикала. Правильная ориентация молекулы субстрата и её гидролиз происходит

в результате контакта тиаминового компонента. Ведущая роль в этом процессе принадлежит аминогруппе пиримидинового кольца и гидрофобным силам. Ответственным за расщепление субстрата является четвертичный азот тиаэола.

6. При дефиците тиамина основную роль в восстановлении содержания активных форм витамина Bj играют ферменты синтеза: Т-киназа и ТДФ-киназа. Ферменты гидролиза - тиаминди- и трифосфа-таза - активируются с момента наработки избытка свободных тиа-минфосфатов. Наиболее ранним диагностическим тестом развития В^-недостаточности является уровень ТТФ или свободного ТДФ.

7. Из пивных дрожжей выделен и стабилизирован ферментный комплекс алкогольдегидрогеназы и апопируватдекарбоксилазы для количественной детекции ТДФ. С использованием комплекса предложен оптимизированный метод ферментативного определения микроколичеств ТДФ, обладающий абсолютной специфичностью и позволяющий фиксировать концентрации кофермента от I до 40 пмоль. Метод адаптирован для измерения активностей Т-киназы и ГГФ-азы, скрининга населения на обеспеченность тиамином.

8. Впервые предложен метод получения аналитически чистого трифосфорного эфира тиамина. Препарат стабилизирован в виде ди-лигиевой соли и может быть рекомендован для испытаний как лекарственное средство при заболеваниях, вызванных нарушениями обмена и функций витамина Bj.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях и авторских свидетельствах:

1. Воскобоев А.И., Черникевич И.П., Арцукевич И.Ы. Аллостери-ческая регуляция тиаминпирофосфокиназы метаболитами дегидрогеназ «¡¿-кетокислог// Тез.докл. 1У Всес.биохим.съезда. - Ленинград, 1979,-Т.З. - С. 47-48.

2. Выделение и очистка биополимеров методом аффинной хроматографии. У. Аффинная хроматография пируватдекарбоксилазы из Пивных дрожжей/ Б.А.Клпщицкий, В.Ф.Позднев, В.Х.Митина, А.И.Воскобоев, И.П.Черникег ч// Биоорган.химия. - 1980. - Т.б, № 10. -C.I572-I579.

3. Воскобоев А.И., Черникевич И.П. Синтез и применение биоспецифических адсорбентов для выделения и очистки тиаминдифосфат-зависш.шх ферментов// Теоретические и практические аспекты изучения питания человека. Тез.докл.Всес.конф.- Москва, 1980, - С.216.

4. Лучко B.C., Воскобоев А.И., Черникевич И.П. Высокоочщен-ная ТД^-кнназа из пивных дрожжей// Тез.докл.У1 кснф.биохимиков прибалтийских республик, Белорусской ССР и Ленинграда. - Рига, 1981. - С. 266.

5. Черникевич И.П., Воскобоев А.И., Клящицкий Б.А. Выделение и очистка биополимеров методом аффинной хроматографа. УН. Очистка дрожжевой тиаминпирофосфокиназы хроматографией на аффинных адсорбентах// Риоорган.химия. - 1981. - Т.7, Jf 2. - С. 209-216.

6. Vopkoboyev A.I., Artaukevich 1.И., Chornikevich I.P. Regulation of Thiamins Pyrophosphokinaoe by Metaboliten of Thiamine Fyrophoiiptmtij-Dopondcnt Enzyme Syatema// Regulation in Metabolism ond nioenprgotico. Abstracts 6-th Joint Symposium of tho Biochemical Societies of the GDR and USSR. _ Tallin, 1981. - P. 90.

7. Очисткч биополимеров участвующих в обмене тиамина методом а^фшной хроматографии/ А.И.Воскобоев, И.П.Чегчикевич, В.А.Аверин, В.А.Клящицкий// Афишная хроматография. Тез.доклЛ Всес.конф. -Вильнюс, 1982. - С. 82-83.

8. Черникевич И.П. Регуляторт;е свойства дрожжевой тиаминпирофосфокиназы// Биохимия, фармакология и медицинское применение производных: витаминов н других предшественников коферментов. Тез. докл.конф. - Иркутск, 1983. - С. 145.

9. Биосинтез, протеидизация и механизм транспорта тиаминпиро-фосфата/ А.И.Воскобоев, И.М.Арцукевич» И.П.Черникевич, Э.А.Гриценко, В.А.Аверин// Биохимия, фармакология и медицинское применение производимых витаминов и других предшественников коферментоз. Тез. докл.конф. - Иркутск, 1983. - С. 39.

> 10. Лучко B.C., Воскобоев Л.И., Черникевич И.П. Определение активности, частичная очистка и характеристика тиаминдифосфатки-наэы из пивных дрожжей// Прикл.биохим.и микробиол. - 1983.- Т. 19, » 5. - С. 644-648.

11. Лучко B.C., Черникевич И.П. Первичная характеристика ферментных систем фосфорилирования витамина Bj// Молодёжь и научно-технический прогресс. Тез.докл.конф. - Гродно, 1983. - С.104-105.

12. Черникевич И.П. Кинетическое поведение тиаминпирофосфо-киназы из пивных дрожжей в присутствии окси- и пиритиамина// Антивитамины в регуляции обмена веществ (эксперимент, клиника). Тез.докл.конф. - Гродно, 1983. - С. 88.

13. Очистка и некоторые свойства АТФ:тиаминдифэсфатфосфотранс-феразы из пивных дрожжей/ И.П.Черникевич, В.С.Лучко, А.И.Воскобоев, Ю.Ы.Островский// Биохимия.- 1984. - Т. 49, » 6. - С.899-907.

14. Лучко B.C., Черникевич И.П., Воскобоев А.И. Влияние низких температур на кинетику и четвертичную структуру ферментов, фосфорилирующих тиамин и тиаминдифосфат// Тез.докл.II Всес.конф. по теоретическим и прикладный вопросам криобиологии. - Харьков, 1984. - С. 50-51.

15. Изучение физико-химических свойств ТДФ-гашазы из пивных дрожжей/ И.П.Черникевич, В.С.Лучко, А.И.Воскобоев, Ю.И.Островский // Докл.АН БССР. - 1984. - Т. 28, № 10. - С. 939-942.

16. Черникевич И.П., Лучко B.C., Воскобоев А.И. Четвертичная структура и аллостерические свойства АТФгтианиндифосфатфосфотранс-феразы SaccharomycGB oorlsbergonoio // Биохимия. - 1985. - Т. 50, ft I. - С. 63-68.

17. Лучко B.C., Черникевич И.П., Воскобоев А.И. Взаимодействие субстратов с ЛТФ:тиаминдифосфатфосфотрансфераэой дрожжей Saoo-Ьагошусов carlobergeneio // Изв. АН БССР, сер.биол.наук. - 1985. -JT« 3. - С. 61-64.

18. 'Voskoboyev A.I., Chornifcovich I.Т. Tdentification of Thiamine Diphoophato-Binding Proteins from ¡Rat Liver Supernatant// Acto Vitnrainol. Enzyraol. - 19S5. - V. 7, II 1-2. - P. 115-122.

19..Воскобоев А.И., Черникевич И.П. Биосинтез тнаминтрифосфа-та и идентификация тиаминдифосфатсвязывапцих белков гиалоплазмы печени крыс// Биохимия. - 1985. - Т. 50, № 9. - С. I42I-I427.

20. Лучко B.C., Черникевич И.П., Воскобоев А.И. Гетерогенность ТДФ-киназы из пивных дрожяей// Прикл.биохим. и микробиол. -1986. - Т. 22, * I. - С. 12-21.

21. Ферменты биосинтеза, транспорт, депонирование и регуляция

уровня фосфорных эфиров тиамина в клетке/ А.И.Воскобоев, И.П.Чер— никевнч, В.С.Лучко, Э.А.Гриценко, В.А.Аверин// Тез.докл.У Всес. биохим.съезда. - Киев, 1986. - Т.2. - С. 183-184.

22. Черникевич И.П., Лучко B.C., Воскобоев А.И. Металл-нукле-отиднал специфичность АТФ:тиаминдифосфатфосфотрансферазы из пивных дрожжей// Биохимия.- 1986,- T.5I, № 10. - С. 1595-1599.

23. Voalcoboyev Л.1., Chernlkevich Х.Р., Luchko V.S. The Quaternary Structure of Thiamine Phosphate Bioayntheaia Enzymes and its Hole in the Catalytic Activity Manifestation// Abati^cts 7-th International Meeting of Molecular and Cellular Regulation of Enzyme Activity. - Halle, 1986. - P. 212.

24. Черникевич II.П., Воскобоев А.И., Гриценко Э.А. Структура, свойства и применение ферментов синтеза фосфорных эфиров тиамина// Биосинтез ферментов микроорганизмами. Тез.докл.III Всес. конф. - Пущино, 1986. - С. 77.

25. Воскобоев Л.И., Черникевич И.П. Депонирование и протеиди-зация ТДФ при моделировании различных форм тиаминовой недостаточности// Ларин Ф.С., Мойсеенок А.Г., Воскобоев А.И. и др. Метаболические эффекты недостаточности функционал.."ло связанных В-витами-нов, - Минск:Наука и техника, 1987. - Гл. I. - С. 7-35.

26. УоякоЪоуеу А.Х., Chernlkevich I.P., Luchko V.S. Studies

on thiamine diphosphate kinase (EC 2.7-4.15) from brewer'a yeast: . Purification and вето properties// Biomad. Biochim. Acta, - 1987.

- V. 46, И 1. - P. 3-4 3-

27. Воскобоев А.И., Черникевич И.П. Биосинтез, деградация и транспорт фосфорных эфиров тиамина. - Минск:Паука и техника, 1987.

- 201 с.

28. Черникевич И.П., Воскобоев А.И., Островский Ю.М. Множественные формы АТФ:тиаюшпирофосфотрансферазы из пивных дрожжей// Биохимия. - I960. - Т. 53, № 10. - С. 1728-1737.

29. Фотофизическке процессы и внутримолекулярная подвижность тиаминкиназы из пивных дрожжей/ А.А.Маскевич, С.Л.Наскевич, Л.Н. Кивач, If.П.Черникевич, А.Л.Василец// Биосинтез фермента микроорганизмами. Тез.докл.1У Всес.конф. - Ташкент, 1988. - С. I09-II0.

30. Сравнительная характеристика ферментов синтеза фосфатов тиамина из пивных дрожжей/ И.П.Черникевич, Э.А.Гриценко, А.Ф.Ма-карчиков, А.И.Воскобоев// Биосинтез ферментов микроорганизмам!!. Тез.докл.1У Всес.конф. - Ташкент, 1988. - С. 162-163.

31. Физико-химические характеристики тиаминкиназы дрожжей Sacchnromyces carlahergenais / И.П.Черникевич, Э.А.Гриценко, Л.Н.

.ивач, С.А.Маскевич, А.А.Ыаскевич// Биосинтез ферментов микроорганизмами. Тез.докл.1У Всес.конф. - Ташкент, 1988. -С. 279-280. » 32. Физико-химические свойства тиаминкиназы дрожжей Saccharo-jpycGS carlabergensie / И.П.Черникевич, А.А.Маскевич, А.В.Наумов, С.А.Маскевич, Л.Н.Кивач, А.И.Воскобоев// Укр.биохим.журнал. -1989. - Т. 61, # 5. - С. 34-42.

33. Черникевич И.П., Гриценко Э.А. Эксггресс-метод получения и стабилизации пируватдекарбоксилаэы из пивных дрожжей// Изв.АН БССР, сер.биол.наук. - 1989. - #> 5. - С. 59-64.

34. Синтез, очистка и стабилизация тиаыинтрифосфата/ И.П.Черникевич, Э.А.Гриценко, Т.А.Лучко, С.В.Забродская// Докл. АН БССР.

- 1990. - Т. 34, * 3. - С. 274-278.

35. Черникевич И.П., Ыакарчиков А.Ф., Лучко Т.А. Определение тиаминтрифосфатазной активности по концентрации тиаминдифосфата// Изв.АН БССР, сер.биол.наук. - 1990. - * 4. - С. 65-63,

36. Черникевич И,П., Воскобоев А.И, Ферментный комплекс апо-пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы для количественной детекции тиаминдифосфата в биологических объектах// Проблемы микробного синтеза витаминов и их производных. Тез.докл.I Всес.конф.

- Ташкент, 1990. - С. 43-45.

37. Черникевич И.П., Опарин Д.А., Забродская C.B. Новые производные витамина Bj и их биологическая активность// Проблемы микробного синтеза витаминов и их производных. Тез.докл.I Всес. конф. - Ташкент, 1990. - С. 47-49.

38. Исследование структуры и динамики тиаминкиназы дрожжей Soccharomycoa cnrlobergensio при взаимодействии с тиамином и ал-лостерическими эффекторами/ А.А.Наскевич, И.П.Черникевич, С.А. Маскевич, Л.Н.Кивач// Проблемы микробного синтеза витаминов и их производных. Тез.докл.I Всес.конф. - Ташкент, 1990. - С. 24-26.

39. Флуоресцентные исследования внутримолекулярной подвижности тиаминкиназы из пивных дрожжей/ A.A.Нас евич, И.П.Черникевич, С.А.Маскевич, Л.Н.Кивач, Г.А.Гачко// Ж.физ.химии. - 1990. -Т. 64, № 8. - С. 2162-2168.

40. Study on structure end dynamice of thiamine kinane from brewer*в yeast by means of oteody-otate and tine-reoolved fluo-rimetry/ I.P. Chernikevich, G.A. Gachko, L.N. Kivach, A.A. Maoke-vich, S.A. Uankevlch// AbstrootB 20-tb Meeting of the FEBS. - Budapest, 1990. - P. 216.

41. Ферментативный ыикрометод количественного определения тиаминдифосфата в биологических жидкостях/ И.П.Черникевич, Э.А.

Гриценко, А.Ф.Макарчиков, А.И.Воскобоев// Прикл.биохим. и микро- , биол. - 1991. - Т. 27, № 5. - С. 762-771.

42. Fluorescence investigation of thiamine kinase properties during interactions with subatrates, metal ions and alloaterlc effectors / Л.А. Maskevich, I.P. Chernikevich, G.A. Cachko, L.If. Ki-vaoh, I.L. Korotaeva// Abstracts 5-th Conference on the Spectros-copy of Biological Molecules. - York, 1991. - P. 253-254.

43. Makarchikov A.F., Chernikevich I.P. Studies on Thiamine Triphosphata-o (EC 3.6.1.28) from Bovine Brain: Puriflcatlon and Proportion// Vltnraina and Biofactoro in Life Science. Abotracta 1-et International Congresn. - Kobe, 1991. - P. 23.

44. Влияние субстратов, кофакторов и эффекторов на структуру и динамику тиаминкиназы из пивных дрожжей/ И.П.Черникевич, А.А. Маскевич, Г.А.Гачко, И.Б.Заводник, Л.Н.Кивач, С.А.Маскевич, И.Л. Коротаева// Биоорган.химия. - 1992. - Т. 18, № 4. - С. 509-530.

45. Роль структуры и динамики тиаминкиназы из пивных дрожжей в регуляции метаболизма витамина Bj: флуоресцентные исследования/ А.А.Маскевич, И.П.Черникевич, С.А.Маскевич, Л.Н.Кивач// Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его' аппаратурное обеспечение. Тез.докл.1У Всес,совещания. - Москва, 1992. - С. 15.

46. Makarchikov A.?., Chernikevich I.P. Purification and characterisation of thiamine triphosphatase from bovine brain// Bio-ahim. Biophys. Acta. - 1992. - V. 1117, И 3. - V. 326-332.

47. Study of pyruvate decarboxylase and thiamine kinase from Ьгепег" e yeaat by SERS/ S.A. Maskevich, I.P. Chernikevich, G.A. Gachko, Ь.Н. Kivacli, N.D. Strekal// Laser Spectroscopy of Biomoleculea. - 1992. - SPIE V. 1921. - P. 315-321.

48. Study of pyruvate decarboxylase and thiamine kinase from brewer's yeast by SERS/ S.A. tlaakevlch, I.P. Cuernikevlch, G.A. Gachko, Ь.Н. Kivach, H.E. Strekal// Atotracta 4-th International Conference on Laser Applications in Life Sciences. - JyvflskylM, 1992. - P. 161.

49. 0б;*ен витамина Bj в условиях авитаминоза и его коррекция тиамином п таурином/ И.П.Черникевич, И.М.Лисицкал, Э.А.Гриценко, Т.А.Лучно// Тез.докл.межд.конф. - Гродно, 1993. - С. 83-84.

50. Распространение трифосфорного эфира тиамина, локализация и активность тиаминтрифосфатазы в органах и тканях быка/ А.Ф.Макарчиков, И.П.Черникевич, Э.А.Гриценко, Т.А.Лучко// Изв.АН Беларуси, сер.биол.наук. - 1993. - № 3. - С. 43-48.

51. Application of fluorescence and SER spectroscopy to con-

trol functional atete oí thiamine kinaee/ A.A. tlaekevlch, I.P. Chernikevich, S.A. Maskevich, H.D. Strekal// Exposition on Anely-tlcal Chemistry and Applied Spectroacopy. Abstracta 44-th Pitte-burgh Conferenoe. - Georgia, 1993. - 267.

52. En»ymy tiarainowe Jako wkatnikl atanu metabolicínego w no-rmle i patologii/ I. Chernikievich, S. Oatrowcowa, I. Llalckaja, E. Gricanko, A. Uakarcslko«// Abatracts 1 Krajowy Kongrea Zywnoao, Zywienie a Zdrowie. - Warazawa, 1994. - P. 18.

53. Binding and hydrolyeia oí thiamine trlphoaphate ester by bovina brain thlanlne triph aphataae/ I. Chernikev ch, A. Makar-chikov, S. Zabrodskaya, D. Oparin// Abatracts Aktualtia Medíiagu Apykaitoa Klauaimal. - Vilniua, 1994. - P. 49-50.

54. Черникевич И.П., Гриценко Э.А., Лучко T.A. Особенности обмена витамина Bj при голодании// Актуальные вопросы общей и корабельной токсикологии. Тез.докл.конф. - Санкт-Петербург, 1994. -С. 177.

55. Ыаскевич А.А., Черникевич И.П. Проявление ассоциации тиа-минкинаэы в спектрально-кинетических характеристиках флуоресценции// Тез.докл.I съезда белорусского общества фотобиологов и биофизиков. - Минск, 1994. - С. 120.

56. Черникевич И.П. Мембрано-ассоциированнал тиаминкиназа

из мозга быка: распределение и некоторые свойства// Изв.АН Беларуси, сер.биол.наук. - 1995. - № I. - С. 12-17.

57. А.с. I541255 СССР, МНИ CI2 9/88. Способ получения пиру-ватдекарбоксилазы из пивных дрожжей/ И.П.Черникевич, Э.А.Гриценко, В.В.Бауы (СССР). - » 4362905/31-13; Заявлено 12.01.88; Опубликовано 07.02.90, Еюл. » 5. - 128 с.

' 58. А.с. 1594179 СССР, Ш01 С07 9/09. Способ получетш тиамин-трифосфата/ И.П.Черникевич, Э.А.Гриценко, Т.А.Лучко, С.В.Заброд-ская (СССР). - Р 4478060/31-04; Заявлено 26.08.88; Опубликовано

23.09.90, Бол. К 35. - 132 с.

£0. А.с. 1620483 СССР, Ш1 CI2 9/02. Способ получения ферментного препарата для количественного определения тиаминдифосфата в биологических объектах/ И.П.Черюпсович, Э.А.Гриценко, А.Ф.Ыакар-чиков (СССР). - # 4433062/13; Заявлено 30.05.88; Опубликовано

15.01.91, Бол. »2.-65 с.

С- е «v > л ^

Р Э 3 ю и э

Чэрн1кев1ч 1ван ПятровЫ

{ЕРМЕНТШЯ С1СТЭШ Б1ЯТР АНСФАРМАЩI ЛКШУШХ ФОРЫ В1ТАШНЛ (структура, уласц!васц1, рэгуляцыя) Ав1там1ноз, г!дрол!з, динам1ка, мозг, п!уныя дрожджы, рэгуляцыя, уласц!васц1, сЫтэз, структура, тыпмЫ, ферменты Праведзены даследаванк1 ферментау с!нтззу (тыям!нк1наза, КФ 2. 7.6.2; тыям(ндэ1фасф>атктаза, КФ 2.7.4.15) ! дэградацьп 'гыям!нтры-фасфатаза, К. 3.6.1.28) актыуных форм в!там!на В^ з п!уных дражджэй 1 мозгу быка. 1х мота - !дэнтыф!нация, ачьстка { вывучэнне бялковых с(стэмаУ, высвятленне рол! Падыв¡дуальных фермента^ у функцыянаван-н! аргаш'зму. Падчас ачыстк1 выкарысто?вал1 приемы аффшнай храма-таграф11 ( храматаграф!I на афарбаваных сарбентах, анал!з ажыццяУ-лпл! з выкарыстаннем метадау стациянарнай к!нзтык1, рзг^струючы Удлельную актыунасць I флюарзсцэнцыю, апрацоувапчы даныя на ЭВМ. Вы-мярзнн! выгонная! на слектрафатометры Спекорд М 40, люм1несцзнтным спектрометры СДЛ-2 1 а?таматызаваним ¡мпульсным спектрафлюарыметры з субнанасекундным распазнаваннем у часе. 1гперщьжв у гамагенным стане билI выдзелены тыям!ндз1фасфатк!наза I тыям!нтрыфасфатаза, атры-мана у прэпаратыУнай колькасц1 тыям!нк!наза. Выявлена, што у клетках дражджэй I но згу ферменты сштэзу прадстаулены асацы!руюча-ды-сацы1руючым! с1стэмам1 ал^гамераУ, стан раУнаваг! для каторых выз-начаецца мпфаякруяэннем, канцзнтрацыям! тыям!ну, субстрата? дзг!д-рагеназ о^-кетак1слот I дыкарбонавых к!слот цыклу Крзбса. Выюг!ка-ныя л!ганд1м1 змены мапць часовы характар I з'яуляюцца рзгулквчым фактаром хуткасц! Утппрзння фасфата? в ¡ташна. Тылм!нтрыфасфатаза - одналанцуговн бялок, чулл!вы да уздзеяння трифосфарнага эф1ру ты-ям!на, АТФ, ¡енау двухвалентных метала?. Нязме: дасць хуткасц! тыя-м!нзалежных рэакцыЙ у клетцы кантралюецца тыям1'нк1назай. 1ндыв!ду-пльныя прзпараты тнямшк{назы I тыямшдз1фасфатк1назы могуць быць ужыты у бЬчгохналог!! I медицине. Метал вызначэннл ьикраколькасц! тнпм1ндз(фасфату рэкамендуецца викарыстаць падчас б1пх! ччнай ды-лгностык! ¡^-недястапсовасц!.

РЕЗЮМЕ Черникевич Иван Петрович ФЕРМЕНТШЕ СИСТЕМЫ ШОТРАНСФОРШЩИИ АКТИВНЫХ ФОРЫ ВИТАМИНА В^ (структура, свойства, регуляция)

Авитаминоз, гидролиз, динамика, мозг, пивные дрожжи, регуляция, свойства, синтез, структура, тиамин, ферменты

Проведены исследования ферментов синтеза (тиаминкиназа, КФ 2. 7.6.2; тиаминдифосфаткиназа, КФ 2.7.4.15) и деградации (тиаминтри-фосфатаза, КФ 3.6.1.28) акт.мных форы витамина BJ пивных дрожжей и мозга быка. Их цель - идентификация, очистка и изучение белковых систем,, выяснение роли индивидуальных ферментов в функционировании организма. При очистке макромолекул использовались приёмы аффинной хроматографии и хроматографии на окрашенных сорбентах, анализ осуществляли методами стационарной кинетики по удельной активности и флуоресценции, с выводом данных на ЭВМ. Измерения выполнены на спектрофотометре Спекорд М 40, люминесцентном спектрометре СДД-2 и автоматизированном импульсном спектрофлуориметре с субнано-секундным временным разрешением. В ходе исследований впервые в гомогенном состоянии выделены тиаминдифосфаткиназа, тиамлнтрифосфатаза, получены препаративные количества тиаминкиназы. Показано,, что в клетках дрожжей и мозга ферменты синтеза представлены ассоциирующе-дис-социирующими системами олигомеров, положение равновесия между которыми определяется микроокружениеы, концентрациями тиамина, субстратов дегидрогеназ с/-кетокислот, дикарбоновых кислот цикла Кребса. Индуцируемые лигандами изменения носят временной характер и являются регуляторным фактором скорости образования фосфатов витамина. Тиаминтрнфосфагаза - одноцепочечшй белок, подверженный воздействию трифосфорного эфира тиамина, АТФ, ионов двухвалентных металлов. Постоянство скорости тиаыинзависталх реакций в клетке контролируется тиаминннназоИ. Индивидуальные препараты тиагинкиназы и тиаминдифос-фаткинаэы могут быть применены й биотехнологии и медицине. Метод определзния мнкроколичеств тиаминдифосфата рекомендуется при биохимической диагностике В ^недостаточности.

S tJ H H A R y

Chernikevich Ivan Petrovlch EHZYlffl SYSTEMS OP BIOTRAHSFOOTA.TIOH OF VXTJOffH B., ACTIVE FORJ4S (structure, properties, regulation)

Vitamin deficiency, hydrolysis, dynamics, brain, brewer's yeast, regulation, properties, synthesis, structure, thiamine, enzymes

Research has been carried out on enzymes of synthesis (thiamine kinase, EC 2.7.6.2; thiamine diphosphate kinase, EC 2.7.4.15) and degradation (thiamine triphosphatase, EC 3.6.1.28) of active forms of vitamin B1 from brevier's yeast and bovine brain. The aim of these atudiea was Identification, purification and investigation of the protein systems aa well as elucidation of the role of individual enzymes in functioning of the body. Affinity chromatography and chromatography on coloured sorbenta were used in purifying macromoleculea, whereas the analy3ia was carried out in terms of specific activity and fluorescence using the methods of steady-state kinetics. The data were processed w-th a computer. The measurements were made with a Specord Jl 40 speotrophotometer, an SDL-2 luminescent spectrometer with subnannsecond resolution. During the studiea thiamine diphosphate kinase and thiamine triphosphatase were ioolatod for the firot time and preparative amounts of thiamine kinase were obtained. It has been shown that synthetic ensymea in yeast and brain cells are presented by asaociating-iHs-soclating oligomer ayatema and the equilibrium state between them is governed by the microaurroundinga aa well as the concentrations of thicmine, substrates of o^fcato acid dehydrogenases and di-carbonic ncids of the Kreba cycle. The llgand induced changes are temporary and played the role of a regulatory factor of the rate of the formation of thiamine phosphates. Thiamine trlphosphatane is a single chain protein susceptible to the effects of thiamine triphosphate eater, ATP, divalent metal ion3. The constancy of cellular thiaralne-dependent reactions rate la controlled by thiamine kinase. Individual preparations of thiamine kinase and thiamine diphosphate kinase can be applied in biotechnology and medicine. The method for determination of thiamine diphosphate micro-amounts is recommended in biochemical diagnosis of thiamine deficiency.