РНК из пекарских дрожжей: выделение, фракционирование, биологическая активность

Ямковая, Татьяна Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
РНК из пекарских дрожжей: выделение, фракционирование, биологическая активность
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "РНК из пекарских дрожжей: выделение, фракционирование, биологическая активность"

На правах рукописи

Ямковая Татьяна Витальевна

РНК ИЗ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ: ВЫДЕЛЕНИЕ, ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2007

003068600

Работа выполнена на кафедре химии Новосибирского государственного педагогического университета

Научный руководитель

доктор биологических наук,

профессор Загребельный Станислав Николаевич

Официальные оппоненты

д.б.н. Трошкова Галина Павловна

д.б.н. Офицеров Вячеслав Иванович

Ведущая организация

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится «18» мая 2007 г. в 9.00 часов на заседании специализированного совета Д 208.020.01. при ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора Минздравсоцразвития РФ по адресу: 630559, Кольцово Новосибирской области (тел.: (8-383) 336-74-28)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Автореферат разослан « 12 » апреля 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.020.01, д.х.н., профессор

Малыгин Э.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дрожжевая РНК представляет собой смесь полирибонуклеотидов разных молекулярных масс. Высокополимерная составляющая дрожжевой РНК биологически наиболее активна и является, например, специфическим стимулятором биосинтеза белка в кроветворных и иммунокомпетентных органах крыс - селезенке, почках, тимусе и костном мозге (Панин Л.Е., Харьковский A.B., 1995). Этот препарат с фирменным названием Полирнбонат в последнее время используется в ветеринарии (Соколов В.Д. и др., 1992; Ноздрин Г.А., Донченко A.C., 1997). Биологические испытания показали, что он является иммуномодулятором и адьювантом (Ред. Масычева В.И. Сб. науч. трудов сотр. НИКТИ БАВ, 1996). Завершены доклинические и 1-я фаза клинических испытаний Полирибоната в качестве адъювантного средства. Проведены также его клинические испытания на больных хронической лейкопенией (Масычева В.И. и др., 1997). Полученные результаты свидетельствуют о выраженном иммуномодулирующем и лейкостимулирующем эффекте. К сожалению, метод получения Полирибоната в открытой печати не опубликован. Поэтому в качестве прототипа в настоящей работе мы использовать его не могли. Натриевая соль низкополимерной дрожжевой РНК (Нуклеинат натрия) давно применяется в медицине при лечении широкого круга заболеваний: от вирусных инфекций до расстройств памяти (см. напр. Ершов Ф.И., 1998). тРНК используется в научных исследованиях. Мономеры РНК в виде нуклеозидов и 5'-мононуклеотидов имеют самостоятельное значение и могут служить исходными соединениями для синтеза олигонуклеотидов, нуклеозид-5' -трифосфатов и ряда лекарственных препаратов (Земсков В.М. и др., 1985).

Несмотря на большой интерес к высокополимерной дрожжевой РНК, в России она в промышленных масштабах не производится. За рубежом промышленно пригодной технологии также нет.

Цель работы - создать методическую базу для организации на ее основе безотходного производства чистой биологически активной высокополимерной дрожжевой РНК на основе использования доступных реагентов и оборудования путем оптимизации отдельных процедур получения и фракционирования экстрактов дрожжевой биомассы.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние на процесс лизиса клеток дрожжей различных ПАВ, концентрации наиболее эффективного ПАВ, температуры, времени и присутствия ингибитора рибонуклеаз (ЭДТА). Оптимизировать условия лизиса.

2. Разработать новые способы выделения суммарной РНК из пекарских дрожжей и получения ее фракций различной степени полимерности, в том числе высокополимерной. Исследовать возможность замены высокоскоростного центрифугирования на простое отстаивание.

3. Разработать экономичный способ получения нуклеозидов и 5'-мононуклеотидов путем гидролиза некондиционных партий и отходов производства дрожжевой РНК иммобилизованными ферментами нуклеинового обмена из ядов змей.

4. Провести оценку биологической активности суммарной и высокополимерной дрожжевой РНК в экспериментах /и vivo

Научная новизна полученных результатов. Детально изучены условия лизиса клеток дрожжей и оптимизированы методы извлечения РНК из лизата. На основе этих исследований предложены три новых способа выделения высокополимерной РНК из дрожжей. Лизис биомассы проводили разработанным нами методом: 2,5%-ным раствором ДЦС-Na при 100°С в течение >40 мин.

Впервые при выделении высокополимерной РЖ вместо центрифугирования в качестве основного приема фракционирования лизатов предложено использовать отстаивание, которое можно проводить как на холоду (0-4°С), так и при комнатной температуре. Скорость отстаивания можно регулировать изменением состава дисперсионной среды.

Впервые для высаливания высокополимерной РНК из осветленного лизата был применен 3 М NaCl. Из оставшейся фракции выделена низкополимерная РНК осаждением соляной кислотой.

Разработан принципиально новый метод дробного осаждения РНК этанолом, с помощью которого из суммарной РНК выделена высокополимерная и тРНК-подобная фракции.

Физико-химические свойства высокополимерной РНК превосходят таковые, получаемые по традиционным процедурам, особенно это касается близкого к нулевому прироста КРФ.

Фосфодиэстеразы из ядов кобры и гюрзы иммобилизованы на CNBr-активированной сефарозе 4В с выходом 80-90%. Показана

возможность длительной эксплуатации колонок с иммобилизованными ферментами (по крайней мере, в течение двух месяцев).

Исследована биологическая активность трех препаратов РНК из пекарских дрожжей: суммарной РНК и высокополимерной РНК с разными распределениями по молекулярным массам. Впервые показано, что препараты РНК различной степени полимерности и чистоты действуют на разные органы и ткани крыс, стимулируя избирательно в них биосинтез белка.

Научно-практическое значение работы. Проведенные исследования позволяют значительно упростить технологию выделения и фракционирования дрожжевой РНК. Особенно это касается нового метода дробного осаждения РНК этанолом и нового способа выделения двух фракций РНК: высоко- и низкополимерной путем простого отстаивания. Замена центрифугирования на быстрое отстаивание при комнатной температуре позволяет не только упростить технологический процесс, но и снизить затраты на электроэнергию и оборудование.

Обнаруженное в работе избирательное воздействие препаратов дрожжевой РНК различной степени полимерности и чистоты на разные органы и ткани лабораторных животных после дальнейшего исследования может послужить основой для создания новых лекарственных средств.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эффективный лизис клеток пекарских дрожжей достигается при обработке 2.5%-ным раствором ДДС-Ыа при 100°С в течение >40 мин.

2. Выделение высокополимерной РНК из лизата пекарских дрожжей может быть осуществлено в течение <4 сут методом седиментации при I g и комнатной температуре.

3. Суммарная и высокополимерная дрожжевая РНК могут быть осаждены из осветленного лизата пекарских дрожжей 3 М ЫаС1.

4. Дробное осаждение 36%-ным этанолом позволяет осуществлять фракционирование суммарной РНК пекарских дрожжей по молекулярной массе.

5. Иммобилизация фосфодиэстераз из ядов кобры и гюрзы на СИВг-активированной сефарозе 4В может быть осуществлена с выходом по активности 80-90%.

6. Препараты дрожжевой РНК различной степени полимерности и чистоты действуют на разные органы и ткани крыс. Высокополимерная РНК с молекулярным распределением 250-700

нуклеотидов избирательно стимулирует биосинтез белка в клетках

красного костного мозга.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на XLIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2005), на Второй научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологию) (Анапа, 2005), на IX Дальневосточной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2005) и на 4-ом съезде «Союза биотехнологов России» (Пущино, 2006).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, включая 30 рисунков и 5 таблиц, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (197 наименований).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы

В работе были использованы прессованные (содержание воды -70%) и сухие пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae (Новосибирский дрожжевой завод), контрольный образец высокополимерной РНК с молекулярным распределением 100-500 нуклеотидов и суммарная дрожжевая РНК, выделенная по методу Крестфилда и соавт. (1955), полученные из НИКТЙ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор» (г.Бердск), яды кобры (Naja naja oxiana) и порзы (Vípera lebetina) из Кара-Калинского серпентария (Туркмения); 96%-ный этанол (Куйбышевский спиртовый завод, Новосибирская область), ДДС-Na хроматографически чистый Научно-производственной фирмы «ДИА-ФАРМ» (г. Белгород), Nonidet Р-40 фирмы "Fluka", Fairy-plus фирмы "Procter and Gamble", NaCl ГОСТ Р 51574-2000 ФГУП комбината «СИБСОЛЬ» (г.Усолье-Сибирское, Иркутская обл.). Для приготовления растворов использовали дистиллированную воду.

2. Экспериментальные животные

Исследования были проведены на крысах (самцах) линии Вистар, массой 180-250 грамм, полученных из вивария СО РАМН (г.Новосибирск). Животные содержались на стандартном рационе ad libitum.

3. Результаты исследований

3.1. Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей

Первым этапом процедуры выделения РНК является ее экстракция из клеток дрожжей. Для этой цели мы применили детергентный лизис с помощью экологически безопасных поверхностно-активных веществ (ПАВ). Были использованы: традиционный анионный детергент ДДС-Na, предложенный Крестфилдом и соавт. (1955), неионный детергент, разработанный специально для лизиса дрожжей Nonidet Р-40, а также новое моющее средство Fairy-plus, включающее в себя в качестве основных действующих веществ смесь детергентов этих двух классов. Faiiy-plus специально разработано для эмульгирования липидов, а именно они являются основными компонентами всех биологических мембран, в том числе и клеточных мембран дрожжей. К началу нашей работы кроме Fairy-plus других средств с аналогичными свойствами в промышленных масштабах не выпускалось. Как видно из данных по кинетике экстракции дрожжевой РЖ этими ПАВ (рис. 1), препарат Fairy-plus оказался менее эффективным по сравнению с ДДС-Na и NP-40, которые лизируют дрожжи практически с одинаковой скоростью. На рис.2 представлены спектры экстрактов РНК, полученных при использовании различных ПАВ. Видно, что применение препарата NP-40 сопряжено с интенсивным вымыванием из клеток дрожжей большого количества балластного белка (кривая 2 на рис. 2 имеет максимум поглощения при 275 нм). В случае использования ДДС-Na (рис. 2, кривая 3) максимум поглощения (265 нм) очень близок к максимуму поглощения очищенной РНК (260 нм, рис. 2, кривая 1). Спектр поглощения материала, экстрагируемого Fairy-plus (рис. 2, кривая 4) имеет вообще не нуклеотидный характер. В связи с этим в дальнейшей работе для лизиса клеток дрожжей был использован ДДС-Na. Данное ПАВ применяли и Крестфилд с соавт. Однако, как видно из рис. 3, РЖ, выделенная по их методу, сильнее деградирована, что выражается в большей размытости пиков на хроматограмме а. Мы считаем это следствием относительно мягких условий при лизисе. По Крестфилду и соавт. температура экстракции РНК 83-94°С, время экстракции 3 мин. Деградации высокополимерной фракции выделяемой РЖ нам удалось избежать, проводя лизис дрожжей в более жестких условиях, а именно, в кипящей воде (100°С) в течение длительного времени (>40 мин). В этих условиях денатурирует большая часть эндогенных и примесных рибонуклеаз, а также осуществляется надежная стерилизация экстракта. При этом соответствующая кинетическая кривая экстракции РНК (рис. 1,1) выходит на плато.

Решающей стадией в процессе очистки выделенной нами РНК является осаждение ее 3 М №С1. Варьирование концентрации соли от 1 до 3 М показало, что при использовании 1 М ШС1 целевой продукт оказался темно-серым, плохо растворимым в воде, с содержанием кислоторастворимой фракции (КРФ) 6,5%; при осаждении РНК 2 и 3 М №С1 содержание в ней КРФ снижалось более чем в 3 раза.

Рис. 1. Кинетика экстракции РНК из пекарских дрожжей: 1,3- ДДС-Na, 2 - NP-40, 4 - Fairy-plus. Концентрация ПАВ: 7-2,5 вес. %, 2,3-5 вес. %, 4-5 об. %; температура: 1 - 94-100°С, 2-4- 20°С.

Рис. 2. Спектры поглощения: /- экстрагированной ДДС-Na и очищенной РНК,

2 -материала, экстрагированного NP40,

3 - материала, экстрагированного ДДС-Na,

4 - материала, экстрагированного Fairy-plus.

0254

1,5 т

0,5 ■

1)254 1

О 15 30 45 60

0 15 30 45 60

мл

Рис. 3. Гель-фильтрация суммарной дрожжевой РНК на сефарозе 4В: а - выделенная по методу Крестфилда и соавт. (1955), б - нашим методом.

Учитывая, что 2 М №С1 осаждает только высокополимерную РНК (Ред. Збарский И.Б., Дебов С.С. Химия и биохимия нуклеиновых кислот, 1968), в дальнейшем для осаждения суммарной РНК мы использовали 3 М №С1. Осадки отделяли центрифугированием.

Из 4 кг прессованных дрожжей выход суммарной РНК составил ~37 г со следующими характеристиками: цвет - светло-кремовый, растворимость в воде - хорошая, оптическая плотность при 260 нм и концентрации раствора РНК 1 мг/мл - 20,2 ОЕ, содержание КРФ -2,02%, содержание белка - 1,8 %.

Далее мы попытались, применив метод дробного осаждения, выделить из суммарной дрожжевой РНК суммарную тРНК. Для этого были испытаны разные концентрации этанола - 48, 36 и 24%. Осаждение 48%-ным и 24%-ным этанолом оказалось неудачным. Осаждение 36%-ным этанолом дало искомый результат. В осадок выпала фракция РНК, по длине цепи и молекулярно-массовому распределению идентичная суммарной дрожжевой тРНК. Далее она была очищена гель-фильтрацией на сефарозе 4В. В супернатанте осталась чистая высокополимерная РНК.

3.2. Выделение фракций РНК различной степени полимерности из пекарских дрожжей

Выбрав ПАВ для экстракции РНК (см. раздел 3.1), мы предприняли попытку определить его оптимальную концентрацию. Для этого добавляли ДДС-Иа к суспензии дрожжей в количестве от 0,5 до 5%. В отдельных экспериментах лизис проводили в присутствии ЭДТА. Кроме того, варьировали температуру (25 и 100°С). В контрольном эксперименте кипятили дрожжи 40 мин в дистиллированной воде. Полученные результаты приводят к выводу о том, что лизис дрожжей с использованием ДДС-Ма следует проводить при его концентрации равной 2,5%. Добавлять ЭДТА и снижать температуру нецелесообразно. Особого внимания заслуживает ничтожный прирост КРФ (0,5% за 19 сут инкубации при 0-4°С) в дрожжевом экстракте полученном с помощью 2,5%-ного ДДС-Ма. Далее мы определили прирост КРФ в этом экстракте при комнатной температуре (25°С). В течение первых сут инкубации он был нулевым. За вторые сут КРФ выросла всего на 0,3%.

Следующей процедурой, требующей оптимизации, была очистка перешедшей в раствор РНК от фрагментов разрушенных клеток дрожжей. Мы решили эту задачу, применив простейший случай седиментации - отстаивание под действием силы тяготения (1 g).

Длительное отстаивание лизата (21 сут) при 0-4°С легло в основу нашего первого варианта выделения высокополимерной РНК из пекарских дрожжей.

Второй вариант легко понять, обратившись к формуле Стокса: и = ёО2(р-р0)/18ч

где: и - скорость движения частиц диаметром (Б) в жидкой среде, . р - плотность частиц дисперсной фазы, р0 - плотность дисперсионной среды, 17 - вязкость среды, g - ускорение силы тяжести.

Рассмотрение этой формулы приводит к следующим выводам: чтобы увеличить скорость движения, необходимо либо повысить различие в плотностях дисперсной фазы и дисперсионной среды, либо понизить вязкость последней, либо, наконец, увеличить силу, действующую на частицы дисперсной фазы. Большинство исследователей прибегает к третьему варианту, а именно, к увеличению силы, действующей на частицы, помещая систему в поле других сил, например, в центробежное поле центрифуги. Однако, решив в настоящей работе создать технологию, не зависящую от наличия «тяжелого» и относительно дорогого оборудования, каковым являются

промышленные центрифуги, мы попытались выяснить возможность варьирования других параметров процесса седиментации. Остались первые два варианта, которые, на наш взгляд, могли быть реализованы путем подбора состава дисперсионной среды и/или понижением ее вязкости путем увеличения температуры процесса. Мы апробировали оба, а именно, разбавляли лизат пекарских дрожжей водой (с целью уменьшения плотности дисперсионной среды) и проводили отстаивание не при 0-4, а при 20°С (с целью уменьшения ее вязкости).

Как видно из рис. 46, разбавление лизата пекарских дрожжей водой в 1,5 раза приводит к резкому увеличению скорости отстаивания по сравнению с контролем - неразбавленным лизатом (рис. 4а). Разбавление в 2 раза (рис. 4в) еще несколько увеличивает скорость процесса, повышая одновременно на 11% выход осветленного экстракта. Максимальное разбавление лизата, вошедшее в окончательную методику, составило 2,25 раза. Дальнейшее увеличение степени разбавления не сказывалось на результатах.

Данные, представленные на рис. 5 вполне предсказуемы: увеличение температуры поставленного на отстаивание лизата с 0-4 (кривая в) до 20°С (кривая г) приводит к значительному увеличению скорости оседания фрагментов клеток дрожжей на дно сосуда. При температуре выше 20°С эффект еще значительнее. Поэтому в препаративном варианте мы ставили отстаиваться горячий лизат, и в процессе седиментации он остывал до комнатной температуры.

Быстрое отстаивание лизата (~1 сут при комнатной температуре) легло в основу нашего второго варианта выделения высокополимерной РНК из пекарских дрожжей. Следует напомнить, что решающим фактором в становлении этой методики был нулевой прирост КРФ в условиях эксперимента (см. выше). Что касается высаливания РНК из экстракта 3 М №С1 и промывки осадка этанолом, то в таких «жестких» дисперсионных средах деградации целевого продукта можно было не опасаться.

За 2,5 месяца (вариант 1) и 4 сут (вариант 2) мы получали из 0.5 кг прессованных и 30 г сухих дрожжей 3,6-4,0 и 0,3-0,35 г чистой высокополимерной РНК соответственно со следующими характеристиками: цвет - белый, растворимость в воде - хорошая, оптическая плотность при 260 нм и концентрации раствора РНК 1 мг/мл - 20,96-21,05 ОЕ, содержание КРФ - 1,97-2,15%; спектральные отношения: О230 /О260 - 0,43-0,52, О250/О26() - 0,89-0,92, О280/О2бо - 0,480,54; ДНК и белка не обнаружено. Для сравнения, согласно ТУ 9291002-44040845-2004 для Полирибоната сорта А: оптическая плотность

при 260 им 1 мг вещества растворенного в 1 мл воды > 16 ОЕ, содержание КРФ <3%; спектральные отношения: О230 / О26о - данных нет, Б25о / О260 - 0,86-0,95, Б280 / О260 - 0,44-0.50.

Рис. 4. Кинетика отстаивания лизата пекарских дрожжей: а - условия базовые, б - разбавление водой в 1,5 раза,

в - разбавление водой в 2 раза.

(По оси ординат -доля супернатанта в % от общего объема суспензии; температура 0-4°С).

Рис. 5. Кинетика отстаивания лизата пекарских дрожжей: в - температура 0-4°С, г - температура 20°С. (По оси ординат - доля супернатанта в % от общего объема суспензии; разбавление водой в 2 раза).

Таким образом, полученный нами препарат высокополимерной РНК не уступает по чистоте Полирибонату и даже несколько превосходит его.

На рис. 6 а - в приведены хроматограммы выделенных нами препаратов суммарной и высокополимерной РНК. Видно, что основные пики на трех хроматограммах практически совпадают. Однако препараты высокополимерной РНК не содержат элюирующейся во внешнем объеме примеси (см. фр. 5 на рис. 6 а и б). Представляет интерес природа фракции 5 (см. рис. 6 в). Этот материал не является примесной ДНК: прямое определение методом Дише дало отрицательный результат. Теоретически можно предположить, что фракция 5 состоит из агрегатов высокополимерной РНК. Мы наблюдали их образование при большой нагрузке на колонку с сефарозой 4В. Однако при обычной нагрузке в случае высокополимерной РНК пика в районе фракции 5 нет (см. рис. 6а и б). Остается предположить, что фракция 5 на рис. 6в - это ассоциаты РНК с полисахаридами или белками. Их спектральные отношения: Б2зо / Огво - 1ДЗ, Б25о / Г>2бо -0,92, Б28о /1^260 - 0,62. Для сравнения спектральные отношения фракции 11 (см. рис. 6в): Б230 / Ъ260 - 0,43, В250 / О2б0 - 0,89, Б280 / О260 - 0,43. Завышенные отношения О230 / О260 и О280 / В260 в случае фракции 5 свидетельствуют как в пользу полисахаридов, так и в пользу белков. В любом случае высокополимерная РНК, выделенная нами без центрифугирования, чище полученной ранее (см. раздел 3.1) с использованием центрифуги суммарной РНК.

Из супернатанта после высаливания высокополимерной РНК 3 М №С1 может быть выделена при понижении рН и низкополимерная. Средняя длина ее молекул ~ 60 нуклеотидов. Выход низкополимерной РНК из 30 г сухих дрожжей - 125-150 мг.

Электрофорез выделенных нами препаратов РНК в 1%-ном агарозном геле в неденатурирующих условиях позволил оценить их длину в сравнении с контрольным образцом и маркерами (см. рис. 7). Видно, что суммарная РНК (см. раздел 3.1) и высокополимерная РНК, выделенная по варианту 2, имеют распределение по молекулярным массам от 250 до 700 нуклеотидов. Высокополимерная РНК, выделенная по варианту 1, имеет длину 150-500 нуклеотидов, близкую к длине контрольного образца высокополимерной РНК, полученного из НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор» (100-500 нуклеотидов).

номер фракции Номер фракции

Номер фракции

Рис. 6. Гель-фильтрация дрожжевой РНК на сефарозе 4В: а - высокополимерная РНК, выделенная по варианту 1, 6 - высокополимерная РНК, выделенная по варианту 2, в - суммарная РНК,

г - контрольный образец высокополимерной РНК. (Объем одной фракции - 3 мл).

Рис. 7. Электрофорез нуклеиновых кислот в )%-ном агарозном геле в н еден ату р и ру го щ и х условиях (окрашивание бромистым этидием):

1 - 100 Ьр маркер ДНК,

2 - суммарная РНК (см.раздел 3.1),

3 - высокополимерная РНК, выделенная по варианту I,

4 - высокополимерная РНК, выделенная по варианту 2,

5 - контрольный образец высокополимерной РНК.

Резюмируя результаты настоящего раздела, разработанную нами схему выделения из пекарских дрожжей двух фракций РНК: высоко- и низкополимерной - можно представить так:

1 - лизис дрожжей кипячением их водной суспензии в течение >40 мин в присутствии 2,5% -ного ДДС-Иа,

2 - удаление дрожжевого шлама отстаиванием горячего лизата при 20-25"С в течение ~ 1 сут с последующей декантацией экстракта РНК,

3 - высаливание высокополимерной РНК из экстракта 3 М №С) с последующей промывкой осадка несколькими порциями 3 М №С1 и этанола (вместо центрифугирований простое отстаивание при 20-25'С),

4 - экстракция чистой шсокополимерной РНК из осадка дистиллированной водой,

5 - выделение низкополимерной РНК из отходов 3 М МаС1 осаждением соляной кислотой.

3.3. Иммобилизация и некоторые свойства иммобилизованных ферментов нуклеинового обмена из ядов змей

Для ковалентной иммобилизации ферментов известен целый ряд сорбентов. В настоящей работе мы добились успеха, использовав СЫВг-актнвированную сефарозу 4В. Иммобилизацию фосфодиэстераз из ядов кобры и гюрзы проводили при разных значениях рН. Для защиты

активных центров ферментов в процессе иммобилизации в некоторые иммобилизационные буферы добавляли субстрат - (ри)5, а для предотвращения их термической инактивации - альбумин. Иммобилизуемая на СКВг-активированной сефарозе 4В фосфодиэстераза из яда кобры сохраняет свою активность в широком диапазоне рН. Лучше всего проводить ее иммобилизацию при рН 7,5 в отсутствие (ри)5 и альбумина. Тестирование иммобилизованных фосфодиэстераз по расщеплению пентарибоуридилата показало, что фермент из яда кобры гидролизует (ри)5 минимум на порядок быстрее, чем аналогичный фермент из яда гюрзы. В процессе иммобилизации фосфодиэстеразы из яда кобры иммобилизовывалась также примесная 5'-нуклеотидаза, которая работала эффективнее фосфодиэстеразы, поскольку количество образованных из (ри)5 нуклеозидов во всех случаях превышало количество нуклеотидов.

Кривые сохранения активности при комнатной температуре пришитых ковалентно к водонерастворимой матрице ферментов свидетельствуют о возможности эксплуатации иммобилизованных фосфодиэстераз из ядов кобры и гюрзы и 5'-нуклеотидазы из яда кобры, по крайней мере, в течение двух месяцев. Разработанный метод позволяет получать иммобилизованные ферменты нуклеинового обмена из ядов змей с высоким сохранением исходной активности (80-90%). Такие ферменты перспективны для создания биореакторов проточного типа и организации на их основе промышленных технологий получения рибонуклеозидов и рибонуклеотидов из отходов производства и некондиционных партий высокополимерной дрожжевой РНК.

3.4. Биологическая активность РНК из пекарских дрожжей

Дрожжевая РНК представляет собой смесь полирибонуклеотидов разных молекулярных масс и включает в себя мРНК, рРНК, тРНК, а также ряд минорных компонентов и, вероятно, фрагменты перечисленных соединений разной длины. Отсюда резонно предположить, что действующее начало препаратов из дрожжевой РНК может быть разным при разных заболеваниях. После того, как РНК из пекарских дрожжей была разделена нами на 5 фракций: высокополимерную РНК, низкополимерную РНК, тРНК-подобную, олигорибонуклеотиды и ассоциаты РНК с полисахаридами и белками (см. разделы 3.1 и 3.2) - у нас появилась возможность проверить эту гипотезу.

Как видно из таблицы 1, препарат высокополимерной РНК с молекулярным распределением 250-700 нуклеотидов, выделенный по

варианту 2 без центрифугирования (см. раздел 3.2), избирательно стимулирует биосинтез белка в клетках красного костного мозга При этом синтезируется много белка, по молекулярной массе идентичного гемоглобину (см. рис. 8),

Препарат суммарной РНК с молекулярным распределением основного пика 250-700 нуклеотидов, выделенный с использованием центрифуга (см раздел 3.1), действует более широко. Он стимулирует биосинтез белка в печени, почках, легких, надпочечниках и селезенке (см. табл. 2). Спектр положительного влияния контрольного образца высокополимерной РНК с молекулярным распределением 100-500 нуклеотидов ограничен печенью и почками (см. табл. 2) Приведенные на рис. 6 результаты хроматографического анализа использованных образцов РНК объясняют обнаруженные закономерности. Как видно из хроматограммы 66 препарат высокополимерной РНК с молекулярным распределением 250-700 нуклеотидов достаточно однороден и, скорее всего, пик I является его действующим началом. В случае суммарной РНК (хром а то грамм а бе) пиков два и действующим началом является, вероятно, не столько сама РНК с молекулярным распределением 250-700 нуклеотидов (пик I), сколько примесь ее ас с опиатов с полисахаридами и белками ( пик 2 в

3 4 5

Да

97000 66200

45000 !

31000

21500 14400

Рис. 8. Электрофорез растворимых белков из красного костного мозга крыс в 10%-ном пол иакр ил ам и дном теле в присутствии ДДС

1 - набор белков,

2 - контроль (крысе вводили физ. раствор),

3 - опыт (высокополимерную РНК, зыделенную по варианту 2),

4 - опыт (суммарную РНК),

5 - гемоглобин крупного рогатого скота.

Таблица 1. Изменение скорости биосинтеза белка в органах и тканях крыс после введения высокополимерной РНК с молекулярным распределением 250-700 нуклеотидов.

Органы и ткани Включение 14С-лейцина в белок (имп/мин на 1 мг белка),количество 14С-лейцина на крысу-1.8МВк М±Бм ,п=5

контроль в/п РНК с мол.распределением 250-700 н.

печень 164.5 ± 10.5 141.0 ±6.2

почки 241.5 ±8.4 203.0 ±8.1

легкие 168.8 ±9.6 111.5 ± 10.8

сердце 121.4 ±5.7 102.5 ±5.1

тимус 142.5 ±9.1 117.0 ±16.1

надпочечники 240.1 ± 8.6 208.8 ±8.3

селезенка 194.5 ± 6.8 139.5 ±6.4

красный костный мозг 198.0 ±5.6 234.6 ±7.1*

Таблица 2. Изменение скорости биосинтеза белка в органах и тканях крыс после введения суммарной РНК и высокополимерной РНК с молекулярным распределением 100-500 нуклеотидов.

Органы и ткани Включение 14С-лейцина в белок (имп/мин на 1 мг белка), количество 14С-лейцина на крысу - 2.5 МВк, М±Бм ,п=5

контроль суммарная РНК в/п РНК с мол. распределением 100-500 н.

печень 206.4 ± 8.5 249.7 ± 6.4* 224.0 ±5.2*

почки 348.8 ± 10.3 403.2 ± 12.6* 399.6 ± 10.9*

легкие 190.6 ±8.7 229.2 ± 8.7* 173.3 ±7.1

сердце 117.3 ±4.8 107.0 ±4.7 112.3 ±3.8

тимус 248.8 ± 7.6 258.4 ± 12.6 253.0 ±9.4

надпочечники 345.3 ± 9.7 430.9 ± 13.6* 325.0 ±7.8

селезенка 291.2 ±8.3 337.4 ±8.6* 279.0 ±6.5

красный костный мозг 373.8 ±7.4 379.0 ±9.4 358.4 ±9.8

* - Достоверные отличия по отношению к контролю р < 0.05

районе фракции 5). Хроматограмма контрольного образца высокополимерной РНК с молекулярным распределением 100-500 нуклеотидов (см. рис. 6г) свидетельствует о том, что данный препарат, а также его фракция 5, сильно деградированы. Пик в районе фракции 5 имеет место в любой РНК выделенной с помощью высокоскоростного центрифугирования, в том числе и по методу Крестфилда и соавт. (см. рис. За). В РЖ, выделенной без центрифугирования, пика в районе фракции 5 нет (см. рис. 6а и б).

Упомянутый выше пик в районе фракции 5 требует интерпретации своего поведения. По нашим наблюдениям, при высокоскоростном центрифугировании на холоду суспензий, содержащих 3 М №С1 или этанол, крупные хлопья высокополимерной РНК и мелкие частицы фракции 5 соосаждаются; под действием же силы тяготения осаждаются только крупные хлопья, мелкие частицы остаются во взвешенном состоянии и попадают вместе с супернатантом, содержащим 3 М №С1 или этанол, в отходы. Этот материал может быть выделен из супернатанта центрифугированием и подвергнут дальнейшему изучению.

Полученные результаты показывают перспективность дальнейших более тщательных исследований биологических свойств препаратов различных фракций экзогенной РНК. В перспективе такие исследования могут привести к выделению новых минорных молекул РНК с новыми биологическими функциями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для выделения высокополимерной РНК в препаративных коммерческих целях до сих пор используется метод Крестфилда и соавт., опубликованный в 1955 г. Поэтому в настоящей работе он был выбран в качестве прототипа. В результате проведенных нами исследований была создана методическая база для организации на ее основе безотходного производства высокополимерной дрожжевой РНК с рекордными характеристиками. Мы рассчитываем, что простота предложенной технологии позволит относительно легко довести ее масштабы до малотоннажного уровня. На рис. 9 приведены технологические схемы, поясняющие наши достижения.

Как видно из рисунка, главным отличием метода ( б ) от метода ( а ) является длительное кипячение суспензии дрожжей с ДДС-Иа на стадии лизиса. Эта модификация позволяет инактивировать большую часть эндо- и экзогенных рибонуклеаз и получить в результате более

Рис. 9. Технологические схемы выделения высокополимерной РНК

дрожжей: а - методом Крестфилда и соавт.,

б и в - нашими методами (б - с использованием центрифуги (см. раздел 3.1), в - методом отстаивания (см. раздел 3.2)).

высокомолекулярный целевой продукт не деградирующий при хранении. Кроме того, в методе (б) для осаждения и промывки РНК вместо этанола используется более удобный в работе 3 М ИаС1. На заключительных же стадиях переосаждения и дробного фракционирования в методе (б) этанола используется мало.

Что касается метода (в), то он включает в себя все преимущества метода (б), но отличается от методов (а) и (б) по двум позициям. А именно, все процедуры по методу (в) проводятся не при 0-4°С, как в случае методов (а) и (б), а при комнатной температуре. Эта модификация существенно снижает энергозатраты на поддержание пониженных температур. Кроме того, в методе (в) не используются центрифуги, что существенно упрощает и удешевляет аппаратное оформление процесса и дополнительно снижает затраты энергии.

Подводя итоги настоящего исследования, следует отметить, что в результате целенаправленной оптимизации нами были разработаны достаточно простые способы выделения из пекарских дрожжей биологически активной суммарной и высокополимерной РНК. Попутно были получены: низкополимерная РНК, тРНК-подобная фракция, олигорибонуклеотиды и ассоциаты РНК с полисахаридами и белками. Дешевизна и доступность исходного сырья, а также экологическая чистота использованных реактивов (ДДС-Ма, №С1, этанол и дистиллированная вода) позволяют надеяться, что разработанные нами методы будут положены в основу промышленной технологии получения суммарной и высокополимерной дрожжевой РНК и продуктов из нее. Некондиционные партии и отходы РНК могут быть утилизированы путем гидролиза их до нуклеозидов и 5'-мононуклеотидов с помощью иммобилизованных нами фосфодиэстераз из ядов кобры и гюрзы и 5'-нуклеотидазы из яда кобры.

Полученная предлагаемыми способами дрожжевая РНК обладает биологической активностью. При этом препараты суммарной РНК и высокополимерной РНК с разными распределениями по молекулярным массам действуют на разные клетки - мишени. Специфичность биологического действия разных препаратов РНК является существенно новым результатом и заслуживает последующего подробного изучения.

выводы

1. На основе оптимизации отдельных стадий процесса выделения РНК создана методическая база для организации безотходного производства высокополимерной РНК из пекарских дрожжей путем лизиса биомассы с помощью ДДС-Na посредством ее продолжительной (>40 мин) обработки при 100°С в растворе 2,5%-ного детергента с последующим разделением двух фаз методом быстрого отстаивания при комнатной температуре, осаждением целевого продукта из верхней фазы 3 М NaCl и промывки осадка этанолом.

2. Длительная обработка суспензии дрожжей ДДС-Na при повышенной температуре приводит к полной инактивации рибонуклеаз, что подтверждается низким содержанием кислоторастворимой фракции в продукте и практическим отсутствием прироста этой фракции при длительном его хранении.

3. Разработанный комплекс процедур позволяет получать препараты дрожжевой РНК различного качества: суммарную РНК, высокополимерную РНК, низкополимерную РНК и фракцию РНК, близкую по размерам к тРНК.

4. Разработан способ иммобилизации фосфодиэстераз из ядов кобры и порзы с выходом 80-90% и операционной стабильностью >2 мес на CNBr-активированной сефарозе 4В.

5. Исследована in vivo биологическая активность суммарной РНК и высокополимерной РНК с разными распределениями по молекулярным массам. Препараты различной степени полимерности и чистоты действуют на разные органы и ткани крыс, увеличивая в них скорость биосинтеза белка. На сигнал суммарной РНК откликаются печень, почки, легкие, надпочечники и селезенка. Высокополимерная РНК с молекулярным распределением 100-500 нуклеотидов стимулирует печень и почки. Высокополимерная РНК с молекулярным распределением 250-700 нуклеотидов избирательно активирует клетки красного костного мозга.

Список публикаций по теме диссертации

1. Ямковая Т.В. Иммобилизация и некоторые свойства иммобилизованных ферментов нуклеинового обмена из яда змей. // Аспирантский сборник НГПУ. - Новосибирск: 2004. - ч. 1. - С.54-60.

2. Ямковая Т.В. Выделение суммарной РНК и ее компонентов из пекарских дрожжей. // Аспирантский сборник НГПУ. - Новосибирск, 2004,- ч.З.-С. 183-200.

3. Ямковая Т.В. Биологическая активность РНК из пекарских дрожжей. // Аспирантский сборник НГПУ. - Новосибирск, 2005. - ч. 1. - С.270-275.

4. Ямковая Т.В. Выделение суммарной РЖ и ее компонентов из пекарских дрожжей. // Материалы ХЫП международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Химия. - Новосибирск: НГУ, 2005. - С.44-45.

5. Ямковая Т.В. РНК из пекарских дрожжей. // Доклад на 2-й научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии». - Анапа, 2005. - С. 23.

6. Ямковая Т.В., Хомов В.В., Загребельный С.Н., Ямковой В.И. Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей. // Прикладная биохимия и микробиология. - «Наука», 2006. - Т.42. - №1. - С.93-97.

7. Ямковая Т.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Биологическая активность разных препаратов РНК из пекарских дрожжей. // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск, 2006. - №3(121). -С.117-121.

Лицензия JIP 020059 от 24.03.97 Гигиенический сертификат № 54.нк.05.953.п.000149.12.02 от 27 декабря 2002 г.

Подписано в печать 26.03.2007 г. Формат бумаги 60x84/16. Печать RISO. Усл. п.л. 1,З.Уч.-изд.л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ № 8.

Педуниверситет, Новосибирск, 126, Вилюйская, 28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ямковая, Татьяна Витальевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура и функции дрожжевой РНК

1.2. Выделение РНК из пекарских дрожжей

1.3. Гидролиз дрожжевой РНК

1.4. Использование мономеров дрожжевой РНК для синтеза лекарственных препаратов

1.4.1. Аденозин

1.4.2. Инозин.

1.4.3. Гуанозин.

1.4.4. Цитидин.

1.4.5. Уридин.

1.5. Биологическая активность дрожжевой РНК.

1.5.1. Иммуномодуляция

1.5.2. Стимуляция метаболизма

1.5.3. Детоксикация

1.5.4. Стимуляция репарации, роста и размножения клеток

1.5.5. Токсичность

1.6. Клиническое применение дрожжевой РНК

1.7. Биологическая активность и клиническое применение высокополимерной дрожжевой РНК.

1.8. Резюме

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Экспериментальные животные

2.2. Материалы

2.3. Аналитические методы

2.4. Препаративные методы

2.4.1. Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей

2.4.2. Выделение высокополимерной РНК из пекарских дрожжей (йариант 1).,,,.

2.4.3. Выделение высоко- и низкополимерной РНК из пекарских дрожжей (вариант 2).

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей

3.2. Выделение фракций РНК различной степени полимерности из пекарских дрожжей

3.3. Иммобилизация и некоторые свойства иммобилизованных ферментов нуклеинового обмена из ядов змей

3.4. Биологическая активность РНК из пекарских дрожжей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "РНК из пекарских дрожжей: выделение, фракционирование, биологическая активность"

Натриевая соль низкополимерной дрожжевой РЖ (нуклеинат натрия) давно применяется в медицине при лечении широкого круга заболеваний: от вирусных инфекций до расстройств памяти (Брехман И.И., 1976; Лазарева Д.Н., Алехин Е.К., 1985; Земсков В.М. и др., 1985; Земсков A.M., Земсков В.М., 1991; Крылов И.А. и др., 1992; Ершов Ф.И., 1998). тРНК используется в научных исследованиях. Мономеры РНК в виде нуклеозидов и 5Ч-I мононуклеотидов имеют самостоятельное значение и могут служить исходными соединениями для синтеза олигонуклеотидов, нуклеозид-5ч-трифосфатов и ряда лекарственных препаратов (Земсков В.М. и др., 1985).

Несмотря на большой интерес к дрожжевой РНК, описанные в литературе способы выделения ее высокополимерной фракции недостаточно эффективны и требуют совершенствования. Классический способ выделения РНК фенольной экстракцией (Holley R.W., 1963; Филиппович Ю.Б. и др., 1982) в препаративных масштабах неприменим из-за проблем с утилизацией отходов Экстракция додецилсульфатом натрия (ДДС-Na) в условиях, предложенных Крестфилдом и соавт. (Crestfield A.M. et al., 1955), приводит к получению препаратов, разрушающихся при \ продолжительном хранении, вероятно, из-за неполной инактивации рибонуклеаз. Добавки ингибиторов рибонуклеаз не решают проблему и удорожают процесс.

Задачи исследования:

3. Разработать экономичный способ получения нуклеозидов и мононуклеотидов путем гидролиза некондиционных партии и отходов производства дрожжевой РНК иммобилизованными ферментами нуклеинового обмена из ядов змей.

4. Провести оценку биологической активности суммарной и высокополимерной дрожжевой РНК в экспериментах in vivo.

Научная новизна полученных результатов.

Детально изучены условия лизиса клеток дрожжей и оптимизированы методы извлечения РНК из лизата. На основе этих исследований предложены три новых способа выделения высокополимерной РНК из дрожжей. Лизис биомассы проводили разработанным нами методом: 2,5%-ным раствором ДДС-Na при 100°С в течение > 40 мин.

Впервые при выделении высокополимерной РНК вместо центрифугирования в качестве основного приема фракционирования лизатов предложено использовать отстаивание, которое можно проводить как на холоду (0-4°С), так и при комнатной температуре. Скорость

I отстаивания можно регулировать изменением состава дисперсионной среды.

Фосфодиэстеразы из ядов кобры и гюрзы иммобилизованы на CNBr-активированной сефарозе 4В с выходом 80-90%. Показана возможность длительной эксплуатации колонок с иммобилизованными ферментами (по крайней мере, в течение двух месяцев).

Исследована биологическая активность трех препаратов РНК из пекарских дрожжей: суммарной РНК и высокополимерной РНК с разными распределениями по молекулярным массам. Впервые показано, что препараты РНК различной стспепи полимерности и чистоты действуют на разные органы и ткани крыс, стимулируя избирательно в них биосинтез белка. I

С Обнаруженное в работе избирательное воздействие препаратов дрожжевой РНК различной степени полимерности и чистоты на разные органы и ткани лабораторных животных после дальнейшего исследования может послужить основой для создания новых лекарственных средств.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эффективный лизис клеток пекарских дрожжей достигается при обработке 2.5%-ным раствором ДДС-Na при 100°С в течение > 40 I мин.

2. Выделение высокополимерной РНК из лизата пекарских дрожжей может быть осуществлено в течение < 4 сут методом седиментации при 1 g и комнатной температуре.

3. Суммарная и высокополимерная дрожжевая РНК могут быть осаждены из осветленного лизата пекарских дрожжей 3 М NaCl.

5. Иммобилизация (Ьос&одиэстепаз из ялов кобпы и гюрзы на CNBr

А А X 1 1 активированной сефарозе 4В может быть осуществлена с выходом по активности 80-90%.

6. Препараты дрожжевой РНК различной степени полимерности и чистоты действуют на разные органы и ткани крыс. Высокополимерная РНК с молекулярным распределением 250-700 нуклеотидов избирательно стимулирует биосинтез белка в клетках красного костного мозга.

Апробация результатов исследования. Основные положения диссертации доложены на XLIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2005), на Второй научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Анапа, 2005), на IX Дальневосточной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2005) и на 4-ом съезде «Союза биотехнологов России» (Пущино, 2006). По теме диссертации имеется 7 печатных работ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Ямковая, Татьяна Витальевна

выводы

1. На основе оптимизации отдельных стадий процесса выделения РНК создана методическая база для организации безотходного производства высокополимерной РНК из пекарских дрожжей путем лизиса биомассы с помощью ДДС-Na посредством ее продолжительной (> 40 мин) обработки при 100°С в растворе 2,5%-ного детергента с последующим разделением двух фаз методом быстрого отстаивания при комнатной температуре, осаждением целевого продукта из верхней фазы 3 М NaCl и промывки осадка этанолом.

4. Разработан способ иммобилизации фосфодиэстераз из ядов кобры и гюрзы с выходом 80-90% и операционной стабильностью > 2 мес на CNBr-активированной сефарозе 4В.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для выделения высокополимерной РНК в препаративных коммерческих целях до сих пор используется метод Крестфилда и соавт., опубликованный в 1955 г. Поэтому в настоящей работе он был выбран в качестве прототипа. В результате проведенных нами исследований была ^ создана методическая база для организации на ее основе безотходного производства высокополимерной дрожжевой РНК с рекордными характеристиками. Мы рассчитываем, что простота предложенной технологии позволит относительно легко довести ее масштабы до малотоннажного уровня. На рис. 30 приведены технологические схемы, поясняющие наши достижения.

Как видно из рисунка, главным отличием метода (б) от метода (а) является длительное кипячение суспензии дрожжей с ДДС-Na на стадии лизиса. Эта модификация позволяет инактивировать большую часть эндо- и экзогенных рибонуклеаз и получить в результате более высокомолекулярный целевой продукт не деградирующий при хранении. Кроме того, в методе (б) для осаждения и промывки РНК вместо этанола используется более удобный в работе 3 М NaCl. На заключительных же стадиях переосаждения и дробного фракционирования в методе (б) этанола используется мало.

Что касается метода (в), то он включает в себя все преимущества метода (б), но отличается от методов (а) и (б) по двум позициям. А именно, f все процедуры по методу (в) проводятся не при 0-4°С, как в случае методов а) и (б), а при комнатной температуре. Эта модификация существенно снижает энергозатраты на поддержание пониженных температур. Кроме того, в методе (в) не используются центрифуги, что существенно упрощает

Рис. 30. Технологические схемы выделения высокополимерной РНК дрожжей: а - методом Крестфилда и соавт., б и в - нашими методами (б - с использованием центрифуги (см. раздел 2.4.1), в - методом отстаивания (см. раздел 2.4.3)). и удешевляет аппаратное оформление процесса и дополнительно снижает затраты энергии.

Подводя итоги настоящего исследования, следует отметить, что в результате целенаправленной оптимизации нами были разработаны достаточно простые способы выделения из пекарских дрожжей биологич^ки активной г.уммяпнпй и иысокополименной РНК. Попутно j "1 1 «/ были получены: низкополимерная РНК, тРНК-подобная фракция, олигорибонуклеотиды и ассоциаты РНК с полисахаридами и белками. Дешевизна и доступность исходного сырья, а также экологическая чистота использованных реактивов (ДДС-Na, NaCl, этанол и дистиллированная вода) позволяют надеяться, что разработанные нами методы будут положены в основу промышленной технологии получения суммарной и высокополимерной дрожжевой РНК и продуктов из нее. Некондиционные партии и отходы РНК могут быть утилизированы путем гидролиза их до нуклеозидов и 5"-мононуклеотидов с помощью иммобилизованных нами фосфодиэстераз из ядов кобры и гюрзы и 5'-нуклеотидазы из яда кобры.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ямковая, Татьяна Витальевна, Новосибирск

1. Авакумов В.М., Кузнецова Л.В., Кругликова Р.П. Фармакологические и лечебные свойства (ЬосЛалена // Хим.-Ааомап. жупн. 1980. - Т. 14. - № 2.11' л 1 • * ±-С. 117-120.

2. Аликин Ю.С., Клименко В.П., Щелкунов И.С., Щелкунова Т.И. Препараты РНК потенциальные противоинфекционные средства в рыбоводстве // Сб. науч. трудов сотр. ИМБТ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». -Бердск, 2006.-С. 169-191.

3. Аликин Ю.С., Кашперова Т.А., Белявская В.А., Юшков Ю.Г., Чимитов В.Д., Понюхов В.А. Применения пробиотиков и иммуномодуляторов для профилактики вирусных заболеваний птиц // Сб. науч. трудов сотр. ИМБТ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Бердск, 2006. - С. 192-236.

4. Алтунина В.К., Василенко С.К., Коржов В.А., Сандахчиев Л.С. Выделение и характеристика растворимой РНК из пивных дрожжей // Биохимия. 1964. - Т. 29. - Вып. 1. - С. 53-57.

5. Амиров Н.Ш., Кольцов П.А., Трубицина И.Е., Шабанова М.Е., Аронов Л.С. Энкад в лечении язвенной болезни // Тезисы докладов на 1 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство». М, 1992. - С. 436.

6. Айсберга С.Э., Ирген A.M., Брод И.И. Способ получения рибонуклеозид-5ч-трифосфатов или сахарофосфатов // А.с. 522190 (СССР). -1976.-Б.И. №27.-С. 76.

7. Арион В.Я., Бекман Э.М., Баранова О.А. Средство «Риботим», обладающее иммунотропным действием и способ его получения // Патент РФ 95122136.-Опубл. 10.11.1997.

8. Арион В.Я., Слугин И.В. Биопрепарат для устранения и профилактики вторичного иммунодефицита и способ его получения // Патент РФ 2128999. -Опубл. 20.04.1999.

9. Барай В.Н., Кухарская Т. А., Зинченко А.И. Получение высокоочищенной РНК из дрожжей с помощью ионов кальция // Прикладная биохимия и микробиология. 1995. - Т. 31. - № 5. - С. 494-497.

10. Барай В.Н., Кухарская Т.А., Зинченко А.И. Химико-ферментативный гидролиз РНК до нуклеозидов // Прикладная биохимия и микробиология. -1997.-Т. 33.-№3.-С. 314-316.

11. Барай В.Н., Логачева И.А., Цвигун И.В., Зинченко А.И., Трухачева Т.В., Монастырева Н.В., Шкуматов В.М., Михайлопуло И.А. Получение рибонуклеиновой кислоты из клеток дрожжей // А.с. № SU 1708845 А1. -Опубл. 30.01.92.-Бюл.№ 4.

12. Баронинь И.Б., Иргена A.M., Ниедра И.Ю., Страздыня Р.Э. Способ получения рибонуклеиновой кислоты // А.с. 215429 (СССР). Опубл. 03.04. 1968. - Б.И. -№ 13.-С. 66.

13. Брехман И.И. Человек и биологически активные вещества. JL: Наука, 1976. - 29с.

14. Бринкманис Р.А., Иргена A.M., Рубенис О.С., Лиепиня В.А. Способ ' получения биологически активных веществ // А.с. 465417 (СССР). 1975.1. Б.И.№ 12.-С. 55.

15. Брод И.И., Гайлума М.А., Мовшович С.М. Способ получения нуклеозидов. // А.с. 393277 (СССР). 1973. - Б.И. № 33. - С. 91.

16. Боол И.И. Лулзика Р.А. Микстайс У.Я. Способ получения аттенозинх . . , „ . . J Г 15ч-трифосфата. // А.с. 72290 (СССР). 1980. - Б.И. № 11. - С. 83.

17. Будовский Э.И., Грачев М.А. Метод выделения транспортной РНК из пекарских дрожжей // Вопр. мед. химии. 1964. - Т. 10. - Вып. 4. - С. 431f433.

18. Вишневская З.А., Райт В.К., Ямковой В.И. Методические рекомендации к практическим работам по биохимии. Новосибирск: НГУ, 1995. - 44с.

19. Врацких J1.B., Гаева JI.B., Комарова Н.И., Ямковой В.И. Полинуклеотидкиназа бактериофага Т4. I. Тестирование, иммобилизация // Биотехнология. 1991. - № 4. - С. 50-53.

20. Грибанов О.Г., Перевозчикова Н.А., Гусев А.А. Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот // Патент РФ 96124403. Опубл. 20.02.1999.

21. Григорьева Э.В., Рыкова В.И. Взаимодействие специфических ядерных протеогликанов с олигорибонуклеотидами // Доклады Академии наук. 1997. - Т. 356. - №5. - С. 693-695.

22. Гунин В.А., Крылов И.А., Манаков М.Н., Мельниченко Е.Г. Способ получения рибонуклеиновой кислоты и очищенного дрожжевого экстракта //Патент№92001860/13. Опубл. 07.10.1996.

23. Досон Р., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. - С. 464-465. (Dawson R, Elliott D, Elliott W, Jones K. Data for biochemical research. Clarendon Press, Oxford. 1986).

24. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты. M.: Медицина, 1998. - С. 147151.

25. Жолобак Н.М., Карпов А.В., Рыбалко C.JL, Антоненко С.В., Барбашева Е.В. Сравнительная характеристика цитотоксичности интерферон-индуцирующего комплекса дрожжевая РНК-тилорон // Антибиотики и химиотерапия. Киев, 1999. - Т. 44. - Вып. 4. - С. 21-24.

26. Земсков A.M. Детоксицирующий эффект РНК. // Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1980в. - № 3. - С. 80-83.

27. Земсков A.M. Индукция препаратами РНК повторного иммунологического ответа // Иммунология. 1980а. - № 1. - С. 71-74.

28. Земсков A.M. Некоторые механизмы действия адъювантов // Иммунология. 1982. - № 1. - С. 6-12.

29. Земсков A.M. Стимуляция первичного и вторичного иммунных ответов дрожжевой NaPHK // Микробиологический журнал. 19806. - Т. 2. -№ 2. - С. 219-225.

30. Земсков A.M., Земсков В.М. Острый шигеллез: роль нуклеиновых кислот и в инфекции и иммунитете (новая концепция). Воронеж: Изд. ВГУ, 1991.-136с.

31. Земсков A.M., Земсков В.М., Петров А.В., Никитин А.В. К механизму стимуляции иммуногенеза нуклеинатом натрия // Иммунология. 1981. -№1. - С. 52-55.

32. Земсков В.М. Адъювантные действия нуклеиновых кислот и бактериальных эндотоксинов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1972а. - № 3. - С. 16-23.

33. Земсков В.М. Влияние дрожжевой РНК на исход экспериментальной инфекции у мышей // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1969, - № 8, - С, 84-87.

34. Земсков В.М. Натрия нуклеинат как иммуномодулятор // Тезисы докладов на 1 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство». М: 1992. С. 96.

35. Земсков В.М. О роли нуклеиновых кислот в инфекции и иммунитете // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 19706. - № 12. - С. 65-69.

36. Земсков В.М. Повышение антиинфекционной резистентности у мышей при помощи гетерологичной РНК // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1970а. - № 2. - С. 33-37.

37. Земсков В.М. Повышение неспецифической устойчивости животных к стафилококку официальными препаратами РНК // Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1975. - № 3. - С. 122-126.

38. Земсков В.М. Усиление противоинфекционной резистентности организма препаратами нуклеиновых кислот // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 19726. - № 4. - С. 71-74.

39. Земсков В.М., Барсуков А.А., Безносенко С.А., Писклова Э. Активирование спонтанной миграции лейкоцитов нуклеинатом натрия // Иммунология. -1981. № 3. - С. 51-55.

40. Земсков В.М., Лидак М.Ю., Земсков A.M., Микстайс У.Я. // Низкомолекулярная РНК: получение, гидролиз и применение в медицине. -Рига: Зинатне, 1985. 191с.

41. Зидермане А.А., Кравченко И.М. Влияние циклоцитидина на экспериментальные опухоли и лейкозы // Экспериментальная и клиническая фармакотерапия. Рига: Зинатне, 19806. - Вып. 9. - С. 5-8.

42. Зидермане А.А., Кравченко И.М. Изучение противолейкозного и противоопухолевого действия тиогуанина в эксперименте Экспепиментальная и клиническая Лапмакотешпия. Рига: Зинатне. 1980а.1 АЛА '- Вып. 9. С. 36-39.

43. Идельсон Л.И., Коротеева Г.П., Клиновицкая Л.П. Применение аденозин-5'-монофосфата при острой перемежающейся порфирии и свинцовой интоксикации. // Клин. Медицина. 1973. - № 1. - С. 50-94.

44. Карабун П.М., Ефимов А.С. Применение рибонуклеиновой кислоты в комплексном лечении больных сахарным диабетом // Врачебное дело. -1975,-№4.-С. 11-15.

45. Комарова Н.И., Медяникова Л.В., Троцкий Н.Ф., Яцухина И.Я., Ямковой В.И. Выделение нуклеаз из яда среднеазиатской кобры Naja naja oxiana // Биотехнология. 1992. - № 3. - С. 35-38.

46. Кочетков Н.К., Будовский Э.И., Свердлов Е.Д., Симукова Н.А., Турчинский М.Ф., Шибаев В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот. -М.: Химия, 1970.-720с.

47. Крылов И.А. Микробные полинуклеотиды для синтеза лекарственных средств // Тезисы докладов на всерос. науч. конф. «Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств». СПб, 1996. - С. 18-19.

48. Крылов И.А., Красноштанова А.А., Рукинова Т.А. Разработка основ технологии переработки отходов мясоперерабатывающей и пищевой промышленности // Окружающая среда для нас и будущих поколений. -Самара, 2000. - С. 52-53.

49. Крылов И.А., Маркина Н.С., Красноштанова А.А., Гунин В.А., Манаков М.Н. Выбор оптимальной схемы получения дрожжевой РНК в условиях современных биохимзаводов БВК и лизина // Биотехнология. -1992.-№2. -С. 81-83.

50. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К. Стимуляторы иммунитета. М.: Медицина, 1985. - С. 71-79.

51. Лактионов П.П., Тамкович С.Н., Симонов П.А., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Способ выделения рибонуклеиновых кислот // Патент РФ 2232810. -Опубл. 20.07.2004.

52. Липфорд Г.Б., Бауэр Ш., Вагнер X. Иммуностимулирующие G, U -содержащие олигорибонуклеотиды // Патент РФ 2004132209. Опубл. 10.06.2005.

53. Майчук Ю.Ф., Поздняков В.И., Галегов Г.А., Бикбулатов P.M. Противовирусная активность 5-бромуридина в эксперименте и его терапевтическая эффективность при герпесвирусной инфекции глаз // Вопр. Вирусологии. 1973. - № 4. - С. 408-411.

54. Малета Ю.С., Тарасов В.В. Математические методы статистического анализа в биологии и медицине. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1981. - 176с.

55. Масычева В.И., Лосева М.И., Садовская О.Б., Улыбина В.А. Полирибонат в терапии хронических лейкопений // 4 Рос. Нац. Конгр. «Человек и лекарство». М., 1997. - С. 274

56. Минченко А.Г. Козыпипкий В.Г. Изменение биосинтеза РНК и ультраструктуры клеток печени под влиянием рибонуклеината натрия // Фармакология и токсикология. 1978. - № 4. - С. 454-458.

57. Мирзабеков А.Д., Векстерн Т.В., Баев А.А. Олигонуклеотиды рибонуклеазного гидролизата суммарной транспортной РНК пекарских дрожжей // Биохимия. 1965. - Т. 30. - Вып. 4. - С. 825-835.

58. Николаева Л.Ф., Лысенко Л.Т., Макарова Г.Е. Влияние инозина на течение инфаркта миокарда // Клин. Медицина. 1975. - № 7. - С. 50-56.

59. Николин В.П. Усиление иммунитета к сингенной опухоли мышей в результате воздействия на ее препаратом гетерологичной РНК // Новосибирск: Изв. Сиб. Отд. АН СССР, 1972. № 10. - Вып. 2. - С. 143-146.

60. Ноздрин Г.А., Аликин Ю.С., Подгорный В.Ф. Повышение неспецифической резистентности и профилактика иммунодефицитовмолодняка крупного рогатого скота с помощью полирибоната // Сб. науч. трудов сотр. ИМБТ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Бердск, 2006. - С.250-267.

61. Ноздрнн Г.А., Донченко А.С. Пути повышения естественной резистентности новорожденных телят // Актуальные вопросы ветеринарии. -Новосибирск, 1997. С. 4-5.

62. Панин Л.Е Хяпьков^ий А.В Специфический стимулятоп биосинтеза белка в кроветворных и иммунекомпетентных органах // Патент РФ 2045270. Опубл. 10.10.95. - Б.И. № 28.

63. Панин Л.Е., Харьковский А.В. Влияние стимуляторов мононуклеарной фагоцитирующей системы на биосинтез белка в органах и тканях крыс // Эксперим. и клин, фармакол. 1997. - Т.60. - №2. - С.49-52.

64. Петерсоне И.О., Блюгер Н.А., Григалинович Г.А., Клингман Л.Е., Берзиня Д.А., Лукашенко А.П. Токсикологическое изучение циклоцитидина // Экспериментальная и клиническая фармакотерапия. Рига: Зинатне, 1980. -Вып. 9.-С. 31-35.

65. Преображенская М.Н. Поиск противоопухолевых препаратов среди аналогов компонентов нуклеиновых кислот // Журн. Всесоюз. Хим. о-ва им. Д.И.Менделеева. 1973. - Т. 18. - № 6. - С. 643-656.

66. Пуховская Н.М., Долгих A.M., Верета Л.А. Способ получения препаратов суммарной РНК // Патент РФ 2048519. Опубл. 20.11.1995.

67. Райт В.К., Халимская Л.М., Ямковой В.И. Методики выделения ферментов. Новосибирск: НГУ, 1986. - С. 15-18.

68. Ред. Збарский И.Б., Дебов С.С. Химия и биохимия нуклеиновых кислот. Л.: Медицина, 1968. - С. 92

69. Ред. Масычева В.И. Сб. науч. трудов сотр. НИКТИ БАВ, 1996.

70. Реутова Е.А. Морфологические исследования влияния полирибоната на органы гомеостатического обеспечения // Автореф. дис. на соиск. учен, степ. канд. вет. наук: 16.00.02 Новосиб. гос. аграр. ун-т. - Новосибирск, 2001.-20 с.

71. Рослякова Е.Ю., Сысоева Г.М., Фадина В.А., Аликин Ю.С. Некоторые биологические эгЬгЬекты ппожжевых РНК // Сб. няуч -rnvnoR готп ИМБТ11 ' 1 - - —1- — -г - — —

72. ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Бердск, 2006. - С.148-168.

73. Рыкова В.И., Любинский О.А., Скобельцина Л.М. Характеристика РНК, связанной с протеогликанами в печени крыс // Отчетная сессия ИЦИГ СО РАН, труды 1999. Новосибирск, 2000. - С. 59-63.

74. Семенишин Е.М., Троцкий В.И., Брод И.И., Рубенис О.С. Исследование кинетики и математическое описание процесса экстрагирования рибонуклеиновых кислот // Химическая технология. -1991.-Вып. 2.-С. 77-79.

75. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. М.: «Мир», 1998. - Т.1. - С. 52.

76. Синицын А.П., Клибанов A.M., Клесов А.А., Мартинек К. Зависимость стабильности иммобилизованной глюкоамилазы от способа иммобилизации // Прикладная биохимия и микробиология. 1978. - Т. 14. -Вып. 2. - С. 236-242.

77. Соколов В.Д., Андреева Н.Л., Соколов А.В. Иммуностимуляторы в ветеринарии // Ветеринария. 1992. - №7-8. - С. 49-50.

78. Страйер Л. Биохимия. Том.З. М: Мир, 1985. - С. 47-48.

79. Трухачева Т.В., Губина Л.П., Ермоленко Т.М., Дидоренко А.И., Петров П.Т., Царенков В.М. Иммуномодулирующие препараты на основенуклеиновых кислот тпатшгшонные и новые технологии // 2-й1 ' ' '

80. Международный съезд «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». СПб: Изд-во Регион. Фонд «Адапт», 19986. С. 166-168.

81. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. М.: Просвещение, 1982. С. 157-184.

82. Фролова Л.Ю., Киселев Л.Л. Биохимия. 1963. - № 28. - 722с.

83. Фукс Б.Б., Константинова И.В. Цитохимия иммуногенеза в ординарных и экстремальных условиях. М., 1973. - 340с.

84. Фукс Б.Б., Шерешевская С.Ф., Левина Ф.Г., Шабанова И.Е. О специфическом лечебном эффекте рибонуклеотидов при тапеторетинальных дистрофиях // Вести. АМН СССР. 1971. - № 7. - С. 63-68.

85. Фукс Б.Б., Шерешевская С.Ф., Попова Л.М., Шнапер А.Л. Заместительный лечебный эффект рибонуклеотидов при некоторых болезнях // Бюл эксперим. биологии и медицины. 1969. - № 9. - С. 23-26.

86. Фукуми М. Лечебное средство для цереброспинальных растройств // Патент № 62-129219. Опубл. 06.11.1987.

87. Хаги Х.Б., Мейрен Д.В., Гилев А.П. Биохимические и биофармацевтические исследования циклоцитидина // Экспериментальная и клиническая фармакотерапия. Рига: Зинатне, 1980. - Вып. 9. - С. 24-30.

88. Чучаев В.М. Бахвалов О.В. Хмельнипкий А.Г. Мензопова НИ., Сандахчиев Л.С. Выделение транспортной РНК из дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология. 1967. - Т. 3. - Вып. 3. - С. 336-340.

89. Шахова Т.В., Майорова Г.И., Нестеренко Е.А., Орлова Т.В. Получение и выделение ферментного комплекса 5'-экзонуклеазы и щелочной фосфатазы Actinomyces coelicolor II Биотехнология. 1988. - Т.4. - № 4. - С. 501-505.

90. Шахова Т.В., Хомякова Г.И., Фридман Т.Ф. Способ получения нуклеозидов // А.с. (СССР). 1982. - Б.И. № 28. - С. 121.

91. Шкиль Н.Н., Шкиль Н.А., Аликин Ю.С. Применение РНК содержащих иммуностимуляторов для лечения микоплазмоза молодняка крупного рогатого скота // Сб. науч. трудов сотр. ИМБТ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Бердск, 2006. - С.237-168-249.

92. Щербакова Э.Г., Земсков В.М., Соболев В.Р. и др. Гистологическое изучение перитонеальных макрофагов, активированных нуклеинатом натрия //Антибиотики. -1981,- № 3. С. 119-121.

93. Ямковой В.И. Практикум по биохимии. Новосибирск: НГПУ, 2002а. -Ч. 1.-С. 111-116.

94. Ямковой В.И. Практикум по биохимии. Новосибирск: НГПУ, 20026. -Ч. 1. -С. 117-122.

95. Ямковой В.И. Курс лекций по биохимии. Ч. 1. Биомолекулы. -Новосибирск: НГПУ, 2001. 77с.

96. Янчевский В.К., Вовнянко Е.К., Головченко В.Н. Дрожжевой белок -значительный резерв повышения ресурсов пищевого белка // Тезисыдокладов на всесоюзной конф. «Достижения биотехнологии -агропромышленному комплексу». Черновцы, 1991а. - Т. 1. - С. 130-131.

97. Янчевский В.К, Вовнянко Е.К., Головченко В.Н., Соломко Г., Мицик В. Безотходная технология // Пищевая и перерабатывающая промышленность. 1993. - Вып. 9. - С. 4.

98. Янчевский В.К., Вовнянко Е.К., Маринчепко Л.В., Антонюк В.П, Применение мембранной техники в технологии комплексной переработки дрожжей сахаромицетов // Тезисы докладов на 2-ой Респ. конф. - Киев, 19916. - С. 113.

99. Ambrus J.L., Ambrus С.М., Odake К. et. al. Clinical and experimental studies on adenine, various nucleosides and their analogs in hematology // Annu. N.Y. Acad. Sci. 1975. - V. 255. - P. 435-467.

100. Beluhan S., Marie V. Problems of nucleic acid content reduction in yeasts and preparation of mononucleotides // Prehramb. Tehnol. i Biotehnol. Rev. -1992.-N. 30.-P. 25-30.

101. Benaiges M.D., Lopez-Santin J., Sola C. Production of 5'-ribonucleotides by enzymatic hydrolysis of RNA // Enzyme Microb. Technol. 1990. - V. 12.-N. 2. - P. 86-89.

102. Bloch A. Biphasis inhibition of growth by combinations of 6-mercaptopurine riboside (MPR) and guanosine (GR) // Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 1970. - V. 11. - P. 9-13.

103. Cambi J.D., Rogers P.L. Multistage continuous cultivation of Candide utilis on splent sulphite liquor // J. Fermentation Technol. 1976. - V.54. - N. 6. -P. 437-449.

104. Chia L.L., McLaughlin C.S. The half-life of mRNA in Saccharomyces cerevisiae // Mol.Gen. Genet. 1979. - V. 170. - P. 137-144.

105. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // J. Anal. Biochem. -1987.-V. 162.-N. l.-P. 156-159.

106. Crestfield A.M., Smith K.C., Allen F.W. The preparation and characterization of ribonucleic acids from yeast // J. Biol. Chem. 1955. - V. 216. -N. l.-P. 185-193.

107. Diaz-Ruiz J.R., Kaper J.M. Isolation of viral double-stranded RNAs using LiCl fractionation procedure // Prep. Biochem. 1978. - V. 8. - P. 1-17.

108. Dimroth K., Witzel H., Hulsen W., Mirbach H. Uber die hidrolysc von ribonucleinsauren in gegenwart von metallhydroxyden // Liebigs Ann. Chem. 1959.-Bd. 620. -H. 1.-S.94.

109. Dobbeling U., Boni R., Haffner A., Dummer R., Burg G. Method for simultaneous RNA and DNA isolation from biopsy material, culture cells, plants and bacteria // BioTecniques. 1997. - V. 22. - N. 1. - P. 88-90.

110. Domdey H., Apostol В., Lin R.J., Newman A., Brody E., Abelson J. Lariat structures are in vivo intermediates in yeast pre-mRNA splising // Cell. 1984. -V. 39.-N.3.-P. 611-621.

111. Elion G.B., Furman P.A., Fuge J.A. Selectivity of action of an antiherpetic agent 9-(2-hydroxyethoxymethyl)guanine // Proc. Nat. Acad. Sci. 1977. -V. 74. -P. 5716-5720.

112. Enesco N.E. Fate of 14C-RNA infected into mice // Experimental Cell Res. 1966. - V. 42.-N.3.-P.640.

113. Etaix E., Orgel L.E. Phosphorylation of nucleotides in aqueous solution using trimetaphosphate: formation of nucleoside triphosphates // J. Carbohydr. Nucleotides, Nucleosides. 1978. - V. 5. - N. 2. - P. 91-110.

114. Feinberg В., McLaughlin C.S. Isolation of yeast mRNA and in vitro translation in a yeast cell-free system // In: Yeast: A Practical Approach (I. Campbell and J.H. Duffus, eds.), Oxford: IRL Press, 1988. P. 147-161.

115. Franklin R.M. Purification and properties of the replicative intermediate of the RNA bacteriophage R17 // Proc. Natl. Acad. Sci. 1966. - V. 55. - P. 15041511.

116. Fujimoto Y. Ribonucleosides // Japan 76-40,079, 01 Nov 1976. C.A. -1977. - V. 86. - N. 21. - P. 498. - 155901.u.

117. Galand P., Ledoux L. Uptake of exogenous ribonucleic acid by ascitis tumor cells. 2. Relations between RNA uptake and the cellular metabolism // Experientia, Cell Res. 1966. - V. 43. - N. 2. - P. 391-397.

118. Gasior E„ Herrera F., Sadnik I., McLaughlin C.S., Moldave K. The preparation and characterization of a cell-free system from Saccharomyces cerevisiae that translates natural messenger ribonucleic acid // J. Biol. Chem. -1979. V. 254. - P. 3965-3969.

119. Greenfield I.L. Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids using surfactant and proteases // US Patent 7,001,724. 21.02.2006.

120. Grigorieva E.V., Rykova V.I. Nuclear proteoglycans of mouse liver cells: specific interaction with G-rich oligonucleotides // Protein Sci. 1995. - V. 4. -Suppl. l.-P. 106.

121. Hayes D.H. The hydrolysis of ribonucleic acid with aqueous formamide // J. Chem. Soc. 1960. - N. 3. - P. 1184-1187.

122. Holland M. J., Hager G.L., Rutter W.J. Characterization of purified poly(adenylic acid)-containing messenger RNA from Saccharomyces cerevisiae II Biochemistry. 1977. - V. 16. - P. 8-16.

123. Holley R.W. Large-scale preparation of yeast "Soluble" ribonucleic acid I I Biochem.and Biophys. Research Com. 1963. - V. 10. - N. 2. - P. 186-188.

124. Hrynink W. Cytarabine for herpes virus infections // J. Amer. Med. Assoc. -1972.-V. 219.-P. 715-718.

125. Hudspeth M.E.S., Schumard D.S., Tatti K.M., Grossman L.I. Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield // J. Biochim. Biophys. Acta. 1980. - V. 610. - N. 2. - P. 221-228.

126. Juel-Jensen B.E. Herpes simplex and zoster // Brit. Med. J. 1973. - V. 1. -P. 406-410.

127. Juel-Jensen B.E. Severe generalized primary herpes treated with cytarabine // Brit. Med. J. 1970. - V. 2. - P. 154-157.

128. Kanai F., Sato S., Imamura S., Hisada Y. Extraction of yeast ribonucleic acid // Japan, Kokai 76-73,192, 24 Jun 1976. C.A. - 1976. - V. 85. - N. 22. - P. 383. - 157973x.

129. Kandel J. Isolation and detection of double-strander RNA from fungi // Methods Enzymol. 1979. - V. 60. - P. 549-554.

130. Kirby K.S. A new method for the isolation of ribonucleic acids from mammalian tissues // Biochem. J. 1956. - V. 64. - N. 3. - P.405.

131. Kirby K.S. Isolation and characterization of ribosomal ribonucleic acid // Biochem. J. 1965. - V. 96. - P. 266-269.

132. Koch H., Friesen J.D. Individual messenger RNA half lives in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Gen. Genet. 1979. - V. 170. - P. 129-135.

133. Kormanec J., Farkasovsky M. Isolation of total RNA from yeast and bacteria and detection of rRNA in Northern Blots // BioTechniques. 1994. - V. 17. - N. 5. - P. 839-842.

134. Krayevsky A.A., Watanabe K.A. Modified nucleotides as anti-AIDS drugs: current status and perspective M: Bioinform, 1993. - 210 p.

135. Kreutzfeldt C., Witt W. Structural biochemistry. Ribonucleic acids // In: Biotechnology handbook. 4. Saccharomyces (Tuite M.F., Oliver S.G., eds.), N.Y.: Plenum Press, 1991. P. 254-277.

136. Laemmli I J.K. // Nature, 1970.- - V. 227. - P. 680-685.

137. Lessor R.A., Leonard N.J. Synthesis of 2v-deoxynucleosides by deoxygenation of ribonucleosides // J. Org. Chem. 1981. - V. 46. - P. 4300-4301.

138. Littlewood R., Shaffer В., Davies J. Mutants of Saccharomyces cerevisiae with reduced levels of ribonuclease activity // Genetics. 1971. - V. 68. - P. 39.

139. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. - P. 265-275.

140. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, 1982.

141. Manna F., Massardo D.R., Del Giudice L., Alifano P., Wolf K. A simple and inexpensive method for RNA extraction from yeasts // Trends Genet. 1996.- V. 12.-N. 9.-P. 337.

142. Mans R.J., Novelli G.D. Measurement of incorporation of radioactive aminoacid into protein by filter-paper disc method // J. Arch. Biochem. Biophys. -1961.-V. 94.-P. 48-53.

143. McEntee C.M., Hudson A.P. Preparation of RNA from unspheroplasted yeast cells (Saccharomyces cerevisiae) // Anal. Biochem. 1989. - V. 176. - N. 2.- P. 303-306.

144. McLaughlin C.S., Warner J.R., Edmonds M., Nakazato H., Vaughan M.H. Polyadenylic acid sequences in yeast messenger RNA // J.Biol.Chem. 1973. - V. 248.-P. 1466-1471.

145. Mitchell D.J., Bevan E.A. ds-RNA killer systems in yeast // In: Yeast Biotechnology (Berry D.R., Russell I., Stewart G.G., eds.), London: Allen and Unwin, 1987.-P. 104-155.

146. Monier R., Stephenson M.L., Zamechnik P.C. The preparation and some properties of a low molecular weight ribonucleic acid from baker's yeast // J.лIOAn \r /14 D 1 9

147. D1W Willi 11. UH-'plljo. nviu. 1 y\J\J. — T . . 1 . 1 IJ.

148. Nakao Y. Microbial production of nucleic acid end substances. Tokyo: Kodansha, 1976. - P. 87-103.

149. Nobumitsu Y., Tadao N., Masashi N., Saburo S. Nucleosides. // Japan 6616,369, 1966.-C.A.- 1967. V. 66. - N. 1. - P. 313. - 2734q.

150. Noguchi S., Shimura G. 5'-Ribonucleotide. // Japan, Kokai 77-18,892, 12 Feb 1977. C.A. - 1977. - V. 87. -N. 1. - P. 180. - 2035k.

151. Ojaniemi H., Evengard В., Lee D.R., Unger E.R., Vernon S.D. Impact of RNA extraction from limited samples on microarray results // BioTechniques. -2003,-V. 35.-N. 5.-P. 968-973.

152. Oliver S.G., McCready S.J., Holm C., Sutherland P., McLaughlin C.S., Cox B.S. Biochemical and physiological studies of the yeast virus-like particle // J. Bacteriol. 1977. - V. 130. - P. 1303-1309.

153. Petracek J., Dostalek P., Susek M. Zpusob vyroby technickeho preparatu RNA z pivovarskych kwasnic // Patent N 275820. Publ. 20.12.1991.

154. Raies A., Lawrence F., Robert-Gero M., Loche M., Cramer R. Effect of 54-deoxy-54-S-isobutyl adenosine on polyoma virus replication // FEBS Letters, 1976.-V. 72.-N. l.-P. 48-52.

155. Robins M.J., Wilson J.S. Smooth and efficient deoxygenation of secondary alcohols. A general procedure for the conversion of ribonucleosides to 2V-deoxynucleosides //J. Amer. Chem. Soc. 1971. - V. 103. - P. 932-933.

156. Robins R.K. Nucleosides and nucleotides: past, present, future // Annu. N. Y. Acad. Sci. 1975. - V. 255. - P. 597-610.

157. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, 1989. - V. 2.-P. 13.45 - 13.53.

158. Schmitt M.E., Brown T.A., Trumpower B.L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae II Nucleic Acids Res. -1990. V. 18. - N 10. - P 3091-3092.

159. Scott J.H., Schekman R. Lyticase; endoglucanase and protease activities that act together in yeast cell lysis // J. Bacteriol. 1980. - V. 142. - P. 414-420.

160. Sherman M.F., Fink G.R., Hicks J.B. Methods in Yeast Genetics. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, 1983.

161. Sogin S.J., Saunders C.A. Fluctuation in polyadenylate size and content in exponential- and stationary-phase cells of Saccharomyces cerevisiae II J. bacterial. 1980. - V. 144. - P. 74-81.

162. Sowa T. Microbial Production of nucleic acid end substances. Tokyo: Kodansha, 1976. - P. 112-114.

163. Sripati C.E., Groner Y., Warner J.R. Methylated blocked 5'-termini of yeast mRNA // J.Biol.Chem. 1976. - V. 251. - P. 2898-2904.

164. Sripati C.E., Warner J.R. Isolation, characterization and translation of mRNA from yeast // Methods Cell Biol. 1978. - V. 20. - P. 61-81.

165. Sved S.C. The metabolism of exogenous ribonucleic acids injected into mice // Canad. J. Biochem. 1965. - V. 43. - N. 7. - P. 949.

166. Szybalski W. X-Ray sensitization by halopyrimidines // Cancer Chemotherapy Rep. -1974. V. 58. - P. 539-557.

167. Tuite M.F., Oliver S.G. RNA preparation // In: Biotechnology handbook. 4. Saccharomyces (Tuite M.F., Oliver S.G., eds.), N.Y.: Plenum Press, 1991. P. 290-319.

168. Umbreit J.N. A small RNA is associated with dermatan sulfate proteoglycan // Anticancer Res. 1996a. - V. 16. - N. 4. - P. 1899-1914.

169. Umbreit J.N. Proteoglycans and glycosaminoglycans during maturation of the mouse mammary gland I I Anticancer Res. 1996b. - V. 16. - N. 5. - P. 30133029.

170. Verwoerd T.C., Dekker B.V.V., Hoekema A. A small-scale procedure for the rapid isolation of plant RNAs // J. Nucleic Acids Res. 1989. - V. 17. - N. 6.1. Г» ЛТ/'Л1. Г. /.JUi,

171. Wang Т., Zhang N., Du L. Isolation of RNA of high quality and yield from Ginkgo biloba leaves // Biotechnology Letters. 2005. - V. 27. - N. 9. - P. 629633.

172. Welsh J.D., Leibowitz M.J., Wickner R.B. Virion dependent RNA polymerase from Saccharomyces cerevisiae // Nucl. Acids Res. 1980. - V. 8. - P. 2349-2359.

173. Whitley R.J., Tucker B.C., Kinkel A.W. et. al. Pharmacology, tolerance and antiviral activity of vidarabine monophosphate in humans // Antimicrobial Agents, Chemotherapy. 1980. - V. 18. - N. 5. - P. 709-715.

174. Yatani K., Nakayama K., Honda H. Adenosine 5"-triphosphate // Japan 70-f 01,268, 16 Jan 1979. C.A. - 1970. - V. 72. - N. 21. - P. 446. - 111787t.

Информация о работе

Ямковая, Татьяна Витальевна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

РНК из пекарских дрожжей: выделение, фракционирование, биологическая активность - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы