Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние экзогенных рибонуклеаз на физиологию роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние экзогенных рибонуклеаз на физиологию роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

^ Г Ь ^ ^ Государственный комитет Российской Федерации

по высшему образованию Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина

На правах рукописи

ЛУЦКАЯ АННА ЮРЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ РИБОНУКЛЕАЗ НА ФИЗИОЛОГИЮ

РОСТА

ДРОЖЖЕЙ ЗА С СИ А КОМ УСЕБ СЕЯЕУШАЕ

03.00.07-микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидат биологических наук

Казань - 1997

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов Казанского государственного университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук, вед.н.с. Куприянова-Ашина Ф.Г.

Консультант: доктор биологических наук,

профессор, академик АН РТ Лещинская И.Б.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, академик АН РТ Зубаиров Д.М.

кандидат биологических наук, с.н.с. Давыдова М.Н.

Ведущая организация: Казанский государственный технологический университет.

Защита диссертации состоится 5 июня 1997 г. в 14 ч. на заседании диссертационного Совета К.053.29.19 при Казанском государственном университете имени В.И.Ульянова-Ленина по адресу: 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета. Автореферат разослан ".

иса^_[997 г_

Ученый секретарь

специализированного совета, к.б.н. 2__ А.Н.Аскарова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем современной микробиологии является изучение механизмов регуляции роста и размножения микроорганизмов. Интерес к факторам роста (стимуляторам) обусловлен рядом обстоятельств, таких как: проявление ростостимулирующего эффекта в супернизких дозах; многообразие зачастую непредсказуемых ответных реакции организма на популяционном и на клеточном уровне. Кроме того, имеются данные, что интенсификация процессов вторичного метаболизма приводит к обогащению клеток биологически ценными соединениями и к заметному повышению устойчивости к стрессовым факторам (Сухаревич В.И. и др.,1982; Автушенко С.С. и др., 1991; Киселева В.М. и др.,1993; Vandijck Р.,1995).

В настоящее время в качестве стимуляторов роста часто используются сложные смеси, нестабильные по составу, а следовательно, и по свойствам. В этом случае значительно усложняется выяснение механизма действия на клетку фактора роста. Поэтому особый интерес представляют гомогенные по составу биологически активные вещества, к числу которых относятся рибонуклеазы (РНКазы) микробного и животного происхождения.

К началу наших исследований продолжительное время велось определение диапазона стимулирующего действия РНКаз. Так, было изучено влияние экзогенных рибонуклеаз на размножение бактерий (Егоров С.Ю. и др., 1989) и дрожжей рода Candida (Колпаков А.И. и др.,1989; Куприянова Ф.Г. и др., 1989; 1992а;1992б; Колпаков А.И.,1993), на урожай клеток и усиление синтеза физиологически активных веществ Thrichoderma harzianum (Захарова Н.Г. и др., 1992). Было показано, что РНКаза B.intermedius способствует увеличению выхода биомассы B.bifidium ЛБА-3, Lactobacillus fermentum, В.coli, применяемых в медицине при дисбактериозах (Колпаков А.И. и др, 1996а, 19966).

Известно, что увеличение скорости роста популяции под действием внешних агентов является результатом сложного комплекса биохимических превращений в клетке (Подгорский B.C., Иванов В.И., 1975). В связи с этим является актуальным не только выявление ростостимулирующего действия РНКаз на микроорганизмы разных таксономических групп, но и исследование закономерностей взаимодействия РНКаз с живой клеткой и многообразие ответных реакций клеток с учетом таких факторов, как возрастная, трофическая структура популяции, синтез клетками циклических нуклеотидов и

протекторных соединений, а также устойчивость микроорганизмов к стрессовым воздействиям.

Целью настоящего исследования явилось выявление основных закономерностей стимулирующего действия экзогенных РНКаз на клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить влияние РНКазь; Bacillus interrnedius (биназы) и панкреатической РНКазы (РНКазы I) на размножение дрожжей в зависимости от физиологического состояния культуры.

2. Определить влияние биназы на возрастную и трофическую структуру популяции дрожжей, на биосинтез ДНК и циклического АМФ.

3. Определить возможность использования РНКазы как стимулятора роста пекарских дрожжей S. cerevisiae в производственных условиях.

4. Исследовать действие РНКаз на жизнеспособность клеток S.cerevisiae, подвергнутых стрессовым воздействиям.

Научная новизна работы. Впервые обнаружена способность экзогенных РНКаз (бнназа, РНКаза I) оказывать стимулирующее действие на рост культуры спорообразующих дрожжей S.cerevisiae. Установлено, что биназа в низких дозах при добавлении ее в начале лаг-фазы и фазу экспоненциального роста стимулирует почкование клеток. Анализ возрастной структуры популяции показал, что стимулирующий эффект обусловлен избирательным действием РНКазы на клетки стадии подготовки к почкованию и поздней стадии почкования. Впервые выявлено, что под действием РНКазы изменяется трофическая структура популяции. Стимулирование синтеза ДНК связано с сокращением Gj- фазы митотического цикла за счет уменьшения экзотрофного периода (Giex) этой фазы. Более раннее нарастание пула вторичного мессенджера -цАМФ в клетке способствует переключению с Giex на эндотрофный период Gj-фазы (Gi end)- Установлено, что РНКаза обладает антистрессовой функцией. Клетки, выращенные в присутствии РНКазы, приобретают повышенную термо-, осмо- и ксероустойчивость, что коррелирует с увеличением пула внутриклеточной трегалозы.

Проведенные исследования показали, что экзогенные РНКазы оказывают

существенное влияние на метаболизм дрожжей. Таким образом, появляется возможность

>

направленного изменения обмена веществ дрожжей, что может быть использовано в биотехнологии.

Практическая значимость работы. Разработан способ выращивания пекарских дрожжей при добавлении панкреатической РНКазы в производственные емкости, позволяющий увеличить биомассу товарных дрожжей на 5-15% (заявка на изобретение №95114100/13 (024148)). Биомасса дрожжей, полученная при внесении РНКазы, характеризуется улучшением ряда свойств, определяющих качество пекарских дрожжей таких, как подъемная сила, стойкость при хранении, повышенное содержания трегапозы.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (1994, 1995, 1996, 1997 гг.), на Международной конференции "Ribonucleases: Chemistry, Biology, Biotechnology" (Нидерланды, Гронинген,1996).

Объем и структура работы. Диссертация, изложенная на 136 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы (141 наименований, т них 53 в международных изданиях) и приложения. Работа содержит 15 таблиц и 17 рисунков.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы, подана заявка на изобретение (приоритет от 08.08.1995), 1 статья находится в печати.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовали штаммы дрожжей: Saccharomyces cerevisiae 823, применяющийся в производстве хлебопекарских дрожжей (ВНИИ пищевой биотехнологии, г.Москва); S. cerevisiae cdc-28, условно-летальный мутант по клеточному делению (Ts-ген),любезно предоставленный Вагабовым В.М. (ИБФМ, г.Пущино); Candida Utilis 424, аспорогенные дрожжи, (КХТУ, г.Казань).

Исследования проведены со следующими ферментными препаратами: внеклеточная щелочная рибонуклеаза B.intermedius\ панкреатическая РНКаза "Завод медицинских препаратов", Санкт-Петербург; очищенный в НИЛ ББФ КГУ препарат панкреатической

РНКазы. Очистку препарата РНКазы I до электрофоретически гомогенного состояния вели по методу Лебедева Ю.О. с соавт., (1981). Оценку гомогенности экзогенных РИКаз давали по результатам сканирования электрофореграммы белков в 15% ПЛАТ (Lammli U.K., 1970). Ферментативную активность РНКаз оценивали, как описано у Лещинской И.Б. и др.,( 1980).

Культуру дрожжей S.cerevisiae 823 выращивали на солодовом и мелассном суслах; S.cerevisiae CDC-28 - на среде YM-1 (Lenar.d Н. Hartweil,1967); этанолокисляющих дрожжей C.utilis - на среде с этанолом (Подгорский B.C., Иванов

B.И.,1975).

Синхронизацию роста культур S.cerevisiae 823, C.utilis осуществляли стационарно-фазовым методом ( Кулаев И.С. с соавт., 1973). Рост культуры S. cerevisiae cdc-28 синхронизировали инкубированием в свежей среде в непермиссивных условиях (37°С).

Рост культуры дрожжей контролировали с помощью автоматического анализатора оптической плотности микробной суспензии (г.Казань), а также подсчетом числа клеток в камере Горяева под микроскопом с фазово-контрастным устройством.

Количественную оценку ростовых процессов давали, как описано у Коротяева А.И.,(1973). Выход биомассы (экономический коэффициент) определяли по С.Дж. Перту (1978).

Жизнеспособные клетки в пробах определяли по числу выросших колоний на 2% сусле-агаре или окрашиванием клеток метиленовым синим. ' Жизнеспособность обезвоженных клеток определяли методом "подмолодки" дрожжей на солодовом сусле (Семихатова Е.К.1980).

Влажность, подъемную силу дрожжей, осмоусгойчивость, стойкость в процессе хранения дрожжей анализировали по действующим ГОСТам (Инструкция по микробиологическому.., 1984).

Активность зимазно-мальтазного комплекса дрожжей определялась по Новаковской

C.С., Шишацкому Ю.И. (1980). Содержание СОг в пробах определяли методом газово-адсорбционной хроматографии на хроматографе "Хром-5".

Обезвоживание дрожжей осуществляли в двух режимах: а) конвекционная сушка при 35°С б) сушка в тонком слое дрожжевой массы при 50°С (Бекер М.Е.,1981). Выявление толерантности клеток к повышенному осмотическому давлению проводили по методике Alemohammad М.М., Knowles C.J. (1974). Устойчивость клеток к повышенной температуре определяли инкубированием клеточной суспензии при 40°С.

Определение возрастной структуры популяции вели по методу Wienken А., et al. (1970), трофической структуры популяции по методу Ciriacy М., (1975) и Иванова В.Н. с соавт., (1987). В основе определения состояния экзотрофии дрожжей лежит дифференцированное окрашивание экзотрофных клеток, ассимилирующих в данный момент экзосубстраты в отличие от эндотрофных микроорганизмов, использующих в это время внутриклеточные накопленные источники углерода.

Протопласты дрожжей S.cerevisiae получали по методу Лихачева Л.И. и Горлова Ю.А. (1979). Синтез ДНК определяли изотопным методом (Шаткин В.А., 1972) Количество цАМФ в лизатах протопластов регистрировали методом Джилмана (Gilman A G., 1972).

Пул трегалозы в дрожжевых клетках выявляли антроновым методом (Lillie Sue Н., Pringle J R., 1980) и высокоэффективной жидкостной хроматографией (Vialle J., Kolonsky М.,1981).

Математическая обработка результатов проводилась с помощью программного пакета статистического анализа Statgraphics.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ РНКаз НА РАЗМНОЖЕНИЕ ДРОЖЖЕЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ КУЛЬТУРЫ

В условиях периодического культивирования дрожжей S.cerevisiae было выявлено, что действие экзогенных РНКаз (РНКазы B.intermedius, РНКазы I) определяется концентрацией вносимого фермента. Максимально стимулирующий рост клеток концентрацией биназы является - 10"5 мг/мл, а РНКазы I - 1 * 10"6 мг/мл (при количестве клеток в инокуляте - 1*107/мл).

Стимуляция роста дрожжей зависит от физиологического состояния популяции (рис. 1). Наибольшее увеличение численности популяции наблюдается при внесении биназы в

Рис. 1. Рост дрожжей Э.сегеуЫ/'ае при разном времени внесения РНКазы в среду. А - контроль (без фермента); Б,В,Г,Д . внесение фермента соответственно через О, 2, 4, 6 ч роста культуры, и - время внесения фермента.

-количество клеток в логарифмическом выражении. % - стимуляция размножения клеток (% к контролю), выраженная в абсолютных числах. V -общая скорость роста (1-Ю6 клеток/ч ). ц - удельная скорость роста (!/ч). I - IV -фазы роста культуры соответственно лаг-, экспоненциальная, замедления поста, стаиионаоная ¿азы

культуру экспоненциального роста (рис.1 Г). Внесение фермента в фазу замедления роста приводит к уменьшению прироста клеток в сравнении с контролем (рис. 1 Д).

Данные анализа возрастной структуры популяции свидетельствуют, что действие РНКазы направлено на ограниченную часть популяции дрожжей с определенным физиологическим состоянием клеток. Добавление РНКазы в начале лаг- и экспоненциальной фаз роста в Оч и 2 ч (рис.1Б и 1В) ведет к увеличению количества клеток I фазы почкования на 3-ий час от момента посева культуры .

Известно, что дрожжевые организмы 1-фазы почкования соответствуют, в основном, клеткам Я-стадии митотнческого цикла, II- и Ш- фаз почкования - клеткам вз и М+ С стадий (\V1enken Л., е! а) ,1970). Стимуляция почкования дрожжей РНКазой, по-видимому, обусловлена тем, имеющиеся в инокуляте клетки одиночные и поздних стадий почкования под действием бнназы быстрее достигают объема, близкого к значениям "критической" массы, необходимой для почкования.

Добавление РНКазы в культуру экспоненциального роста (когда в ней возрастает количество микроорганизмов поздних стадий почкования) способствует увеличению дрожжевых клеток 1-фазы почкования и одиночных клеток. Следовательно, стимулирующее действие РНКазы опосредованно через влияние ее на клетки, находящиеся не только в С)-, а частично и в вг- стадиях митотического цикла.

В экспериментах с многократным последовательным внесением биназы в активно растущую популяцию наблюдаемый нами эффект биназы был максимальным. Так, из данных рисунка 2 (кривая 1) видно, что двукратное добавление фермента (0 ч и 2 ч) стимулировало размножение клегок к началу стационарной фазы (6ч) на 40%. Последовательное добавление РНКазы в культуру через 0 ч, 2 ч и 4 ч вызывало примерно 60%-ный эффект стимуляции (рис.2, кривая 2). При этом показано, что РНКаза сорбируется на дрожжевых клетках, все возрастающее количество микроорганизмов сорбирует бнназу, а добавляемый многократно фермент действует на вновь появившиеся дочерние клетки. На основании полученных данных можно говорить, что проявление стимулирующего действия РНКазы зависит как от дозы добавляемого фермента, гак и от физиологического состояния

Время, час

Рис.2 Изменение численности популяции S.cerevlsiae в зависимости от кратности добавления бниазы в растущую культуру.

4 - время внесения фермента.

К - рост культуры в среде без фермента.

1,2,3 - внесение фермента, соответственно,

1 - двукратное (0 ч и 2 ч - 0.02 мкг/мл);

2 - трехкратное (0 ч, 2 ч и 4 ч - 0.03 мкг/мл);

3 - четырехкратное (0 ч, 2 ч, 4 ч и 6 ч - 0.04 мкг/мл);

G( G 1ex lend

G G

2ex 2end

={X>=

G,

>end

G

M0nd

Рис.3 Соотношение фаз клеточного цикла дрожжей Candida utilis и периодов экзо- и эндотрофии по Иванову В.Н., Угодчикову (1984), где ех - экзотрофный период (G, С*. cx)i end - эндотрофный период (Gj enj. Sendi g2 «nd» M end)

клеток культуры S.cerevisiae. Об этом свидетельствуют и данные, полученные в результате дополнительного четвертого внесения фермента в культуру, находящуюся в конце фазы замедления роста (рис.2, кривая 3). При этом наблюдалось уменьшение эффекта на 30% в сравнении с 3-х кратным добавлением биназы.

ВЛИЯНИЕ БИНАЗЫ НА ВОЗРАСТНУЮ И ТРОФИЧЕСКУЮ СТРУКТУРУ ПОПУЛЯЦИИ

Влияние РНКазы на продолжительность фаз клеточного цикла исследовали с помощью изотопного метода и анализа возрастной структуры популяции дрожжей S.cerevisiae cdc-28 с высоким индексом синхронизации. Было показано, что под влиянием биназы стимуляция роста клеток коррелировала с сокращением Gi- периода, а частично и О^-периода.

Учитывая, что в ходе митотнческого цикла дрожжевые организмы находятся в качественно различных состояниях экзо- и эндотрофии (рис.3), изучили влияние РНКазы на трофическую организацию митотического цикла на синхронизированной культуре C.utilis. Как видно из данных рис.4, в митотическом цикле клеток, растущих в среде с РНКазой, регистрируется сокращение продолжительности пика экзотрофных клеток как в течение Gj, так Ог-фазы. Исходя из полученных данных можно заключить, что сокращение митотического цикла связано с сокращением экзотрофных периодов Gi и, вероятно, G2.

Согласно гипотезе Иванова В Н.(1990), сокращение экзотрофного периода возможно за счет более раннего переключения экзотрофного периода на эндотрофный. Следовательно, в наших экспериментах РНКаза способствовала изменению клеточного метаболизма, а, именно, переходу G]cx => Gie„j, и, вероятно, G2ex => G2end-

Учитывая, что цАМФ играет, по-видимому, одну из основных ролей в переключении процессов экзо- и эндотрофии клетки (Birch et al.,1983; Cooper et al., 1985; Иванов В Н.,1990) было определено содержание цАМФ в течение 2-х генераций клеточного цикла дрожжей. Показано, что максимальный уровень цАМФ в клеточном цикле дрожжей, растущих в присутствии биназы, достигался раньше в сравнении с контролем, непосредственно перед началом ДНК-синтетической фазы. В дальнейшем уровень цАМФ снижался, однако появление второго пика цАМФ, который, как известно соответствует 02-стадии, в опыте также опережало контроль (рис.5).

%

min — к —*- 1

Рис.4 Влияние биназы на трофическую структуру популяции С. utilis.

К- контроль, 1 - РНКаза добавлена вместе с инокулятом. % - содержание экзотрофных (одиночных (в Gi- стадии) и II фазы почкования (в G2-стадии) клеток в опыте (G|, G2) и в контроле (G| t, G2 к), соответственно.

nukoM сАМР

min

Рис.5 Влияние биназы на пул цАМФ в клетках S.cerevisiae cdc-28. К - контроль, 1 - РНКаза добавлена вместе с инокулятом. Появление клеток второй генерации в контроле ) и в опыте (jJ ), соответственно.

Следовательно, наблюдаемая стимуляция роста дрожжей РНКазой сопровождается сокращением в]- и вг-стадий, за счет уменьшения экзотрофных периодов, а основной системой эндогенной регуляции экзо- и эндотрофии клетки является система регуляции метаболизма на основе циклических нуклеотидов, прежде всего, цАМФ.

ИСПЫТАНИЕ ДЕЙСТВИЯ РНКаз В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ

Исследования влияния РНКаз на рост культуры дрожжей в производственных условиях проводили в дрожжевом цехе Буинского завода РТ. В качестве стимулятора роста применили коммерческий препарат панкреатической РНКазы (содержит более 40% примесных белков), цена которого на 2 порядка ниже, чем биназы. Исследования, направленные на установление ростостимулирующей дозы коммерческого препарата, а также очищенного в лаборатории препарата фермента показали, что величина эффекта не зависит от наличия или отсутствия в препарате примесных белков, а сам эффект стимуляции роста обусловлен влиянием РНКазы I на культуру клеток. При этом стимулирующее действие РНКазы на клетки Э.сегеУ^/ае - 823 зависит от дозы фермента и от начальной плотности клеточной взвеси.

В технологическом процессе наращивания дрожжезой массы в каждую емкость добавляли фермент в ростостимулирующей дозе, соответствующей определенной плотности клеточной взвеси.

В первую емкость (инокулятор) вносили РНКазу одновременно с посевным материалом. К концу культивирования (16часов) дрожжей в инокуляторе в среде с РНКазой происходит увеличение количества клеток в культуре на 19% по сравненню с контролем за счет увеличения количества клеток 1-фазы почкования. Однако по величине биомассы (сырой вес) опытные и контрольные варианты практически не различаются.

Существенно, что в среде с РНКазой уменьшается экономический коэффициент, что коррелирует с описанными результатами о сокращении периода экзотрофии (рис.5) и в итоге ведет к ускорению роста культуры.

■ На основании наших данных о максимальном увеличении численности популяции при многократном введении фермента в растущую культуру (рис.2) в следующей серии

экспериментов РНКазу добавляли двукратно: 1) в инокулятор вместе с посевным материалом и 2) в посевную емкость сразу после перекачивания культуры из инокулятора.

Как видно из данных табл.1, РНКаза, внесенная в инокулятор и в посевной аппарат, увеличивала выход биомассы на 18%. Исследование наращивания биомассы в процессе всего цикла культивирования дрожжей (от инокулятора до окончания ферментации в 5 ферментерах) показало, что эффект стимуляции роста 8.се/-еУ/5/'ае, достигнутый в посевной емкости, сохранялся на уровне 15%, т.е. почти не терялся в процессе многократных переводов при отьемно-доливном методе выращивания культуры в ферментерах.

Таблица 1

Накопление биомассы дрожжей при добавлении РНКазы в производственные емкости (схемы №1, №2)

Добавление РНКазы в аппараты: Выход биомассы, кг Стимуляция, % к контролю

Опыт | Контроль

СХЕМА №1

1. Инокулятор 121,3 ± 17,1 119,9 ±10,7 101,1

2. Посевной аппарат 1611,5 ± 238,0 1367,5 ±158,2 118,0

Суммарный выход с 5 ферментеров 25880,0 ±3008,0 22500,0 ± 1276,5 115,0

СХЕМА №2

. ФЕРМЕНТЕРЫ:

№2Б 4080,0 ± 313,6 3915,5 ±467,6 104,2

№ЗА 4896,0 ± 429,0 4650,0 ± 342,8 105,3

№ЗБ 5346,0 ± 724,0 5054,2 ± 508,5 105,8

Суммарный выход с 3 ферментеров 14322,0 ± 1056,0 13627,0 ±978,0 105,1

С целью выявления стимуляции наращивания биомассы в ферментерах РНКазу добавляли лишь в 3 отборочных аппарата, из которых дрожжи сразу поступают на сепарацию, минуя предыдущие дрожженакопительные. Из данных табл.1 видно, что внесение РНКазы в каждый из трех ферментеров (№ 2Б, ЗБ и ЗА ) одновременно с посевным материалом способствовало увеличению выхода целевого продукта на 4 - 5% в сравнении с контролем. Слабое проявление эффекта РНКазы в этом случае, вероятно, связано с тем, что культура в ферментерах находится з стадии почкования лишь незначительное время, т.к. в процессе ферментации идет преимущественно рост дочерних клеток ("дозревание" дрожжей).

Таким образом, экзогенная РНКаза стимулирует почкование клеток культуры, растущей в инокуляторе. Максимально проявляется действие фермента на активно растущую культуру в посевном аппарате. Популяция дрожжей в ферментерах, которая по физиологическому состоянию близка к культуре стационарной фазы роста, мало чувствительна к действию экзогенного фермента. Поэтому в процессе производственного цикла для увеличения выхода биомассы достаточно двукратного введения фермента: в начале культивирования дрожжей в инокуляторе и посевной емкости.

Нами показано, что культивирование дрожжей в присутствии РНКазы в заводских и в лабораторных условиях увеличивает подъемную силу дрожжей. Это свойство улучшается при достижении культурой стационарной фазы роста, которая у опытных дрожжей наступает раньше (рис.1). Нами установлено, что РНКазой стимулируется лишь активность ферментов зимазного комплекса. Поэтому повышение бродильной активности дрох<жей происходит за счет сбраживания глюкозы, но не мальтозы муки.

АНТИСТРЕССОВАЯ ФУНКЦИЯ РНКаз

Изучение стойкости дрожжей при хранении показало, что этот показатель улучшается, т.е. дрожжевые организмы приобретают дополнительные защитные свойства от неблагоприятных факторов. Результаты экспериментов, в которых дрожжи целенаправленно подвергались нами различным стрессовым воздействиям, подтвердили наше предположение. Так, исследование термо-, осморезистентности дрожжей показало, что наиболее устойчивыми к воздействию неблагоприятных факторов являются клетки стационарной фазы роста, что согласуется с данными литературы (Бекер М.Е., Упит A.A., 1972). Повышение резистентности клеток в среде с РНКазой обусловлено более ранним переходом культуры в стационарную фазу роста вследствие стимуляции роста.

Исследование ксерорезистентности выявило, что дрожжи опытного варианта характеризовались как большей жизнеспособностью, так и более высокой остаточной активностью ферментов зимазно- мальтазного комплекса.

По мнению Piper (1993), в устойчивости клеток дрожжей к неблагоприятным факторам первостепенное значение имеет внутриклеточный пул трегалозы. Проведенные исследования, направленные на определение содержания трегалозы в клетках, показали, что

дрожжи, выращенные как в лабораторных, так и в заводских условиях (табл.2) характеризуются повышенным уровнем этого дисахарида, а увеличение числа жизнеспособных клеток, выращенных в присутствии РНКазы, коррелировало с повышением пула трегалозы.

Из литературы известно, что этот дисахарид изменяет физические свойства мембранных липидов (Иванов В.Н.,1987) образованием водородных связей между ОН-группами трегалозы и полярными головками фосфолипидов мембран. В результате происходит стабилизация клеточных мембран (Crowe J.H. et al., 1984). Синтез трегалозы обнаруживает обратную связь по отношению к ростовой активности мицелия, так как синтез трегалозо-6- фосфатсинтетазы регулируется вторичными метаболитами, выделяемыми в среду культивирования при замедлении роста культуры (Gounalaki, Thireos, 1994). Поэтому более раннее увеличение уровня трегалозы в клетках под действием РНКазы обусловлено опережающим вступлением культуры в стационарную фазу роста.

Следовательно, выявленная антистрессовая функция РНКазы не только коррелирует с более ранним наступлением стационарной фазы и с увеличением пула трегалозы, но. и обусловлена этими процессами. Однако нельзя пренебречь и другими изменениями в составе клеток в ответ на факторы, вызывающие стресс, описанными Феофиловой Е.П., (1992), а именно, в липндном составе мембран, актиоксидантном статусе и т.д.

Исходя из факта повышения уровня трегалозы под действием РНКазы становится понятным регистрируемое нами увеличение подъемной силы товарных дрожжей, т.к. при

Таблица 2

Влияние РНКазы I на содержание трегалозы в товарных дрожжах в зависимости от схемы внесения фермента

Внесение фермента в аппараты: Содержание трегалозы, %/сух. вес биомассы % к контролю

Контроль | Опыт

СХЕМА

Инокулятор, посевной 7,26 ±0,2 8,4 ±0,3 115,7

СХЕМА №2

Отборочные ферментеры 7,26 ±0,2 9,1 ± 0,4 125.0

внесении в тесто, дрожжи в первую очередь используют внутриклеточные субстраты, и деградация трегалозы, по данным Ноищег е! а!. (1939), начинается с первых минут культивирования. Уапс/цск е! а1. (1995) в своих экспериментах показал положительную корреляцию между содержанием трегалозы и бродильной активностью дрожжей.

Нами отмечена более высокая остаточная активность ферментов зимазно-мальтазного комплекса дрожжей, культивируемых в среде с РНКазой при их подсушивании. Это объясняется данными литературы о том, что молекулы трегалозы образуют водородные связи с частично погруженным» в мембрану белками, стабилизируя их пространственное расположение в плоскости мембраны и препятствуя их сближению и образованию дисульфидных связей при деформациях клеточных оболочек при стрессовых воздействиях, каковым является высушивание (Волков В.Я.,1994).

Таким образом, проведенные исследования показали, что экзогенные РНКазы оказывают существенное влияние на метаболизм дрожжей, н при их воздействии появляется возможность направленного изменения свойств дрожжей, что может быть использовано в биотехнологии.

ВЫВОДЫ

1. Экзогенные РНКазы микробного и животного происхождения ускоряют размножение дрожжей S.cerevisiae. Эффект РНКазы зависит от физиологического состояния популяции и от концентрации вносимого фермента.

2. Стимуляция роста культуры S.cerevisiae экзогенной РНКазой выражается в ускорении инициации синтеза ДНК и почкования клеток и коррелирует с сокращением Gi- стадии митотического цикла дрожжей.

3. Под действием РНКазы уменьшается продолжительность экзотрофного периода Gi-стадии. Этот процесс коррелирует с сокращением времени достижения максимального уровня в клетке вторичного мессенджера - цАМФ.

4. Панкреатическая РНКаза, использованная в качестве стимулятора роста дрожжей в производственных условиях, вызывает наибольший эффект при добавлении фермента в аппараты с активно растущей культурой. РНКаза улучшает потребительские свойства дрожжей, такие как подъемная сила и стойкость при хранении.

5. Экзогенные РНКазы в ростостимулирующих дозах обладают антистрессовой функцией, способствуют повышению термо-, осмо-, ксероустойчивости клеток и возрастанию пула трегалозы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куприянова-Ашина Ф.Г., Колпаков А.И., Луцкая А.Ю., Эль-Регистан Г.И., Козлова А.Н., Дужа М.В. Действие мембраноактивных физиологически активных веществ на рост культуры Saccharomyces cerevisiae//Микробиология. -1995. -Т.64, вып.5. -С.596-600.

2. Куприянова-Ашина Ф.Г., Луцкая А.Ю., Колпаков А И., Кспечева P.M., Лещинская И.Б. Влияние РНКазы Bacillus intermedius на рост культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae// Прикладная биохимия и микробиология. -1996. N 2, -С.254-259.

3. Loutskaia A.Yu., Gasheva S.V., Kolpakov A.I., Kupriyanova-Ashina F.G. The effect of exogenous RNases on Saccharomyces cerevisiae growth // 4th International Meeting

"Ribonucleases: chemistry, biology and biotechnology". Netherlands. Groningen, Juli 14-18, 1996.

4. Куприянова-Ашина Ф.Г., Луцкая А.Ю., Кепечева P.M., Колпаков А.И. Способ получения биомассы хлебопехарных дрожжей в производственных условиях. Заявка N 95114100/13 (024148) на изобретение. Приоретет от 08.08.95.

5. Луцкая А.Ю., Колпаков А.И., Кепечева P.M., Игнатьева Н.П., Куприянова-Ашина Ф.Г. Применение панкреатической РНКазы в производстве хлебопекарских дрожжей //Прикладная биохимия и микробиология. -1997 (принята к печати в 11.23.1995).

S1P10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Луцкая, Анна Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. КИНЕТИКА РОСТА И ГЕТЕРОГЕННОСТЬ МИКРОБНОЙ ПОПУЛЯЦИИ.

1.2. КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ ДРОЖЖЕЙ.

1.3. ТЕОРИЯ ТРОФИЧЕСКОЙ ОРГАНИЗАЦИИ МИТОТИЧЕСКОГО ЦИКЛА ДРОЖЖЕВОЙ КЛЕТКИ.

1.4. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ТРЕГАЛОЗЫ В КЛЕТКАХ ГРИБОВ.

1.5. СТИМУЛЯТОРЫ РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ РНКаз НА РОСТ КУЛЬТУРЫ SACCHAKOMYCES CEREVISIAE.

3.2. ИСПЫТАНИЕ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ РНКазы КАК СТИМУЛЯТОРА РОСТА ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ.

3.3. ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ РНКаз В РОСТСТИМУЛИРУЮЩИХ ДОЗАХ НА ФИЗИ0Л0Г0-БИ0ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДРОЖЖЕЙ SACCHAEOMYCES CEREVISIAE

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние экзогенных рибонуклеаз на физиологию роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем современной микробиологии является изучение регуляции роста и размножения микроорганизмов биологически активными веществами. Интерес к факторам роста (стимуляторам) обусловлен рядом обстоятельств таких как: проявление ростстимулирующего эффекта в супернизких дозах; многообразие, зачастую непредсказуемых ответных реакций организма как на популяционном так и на клеточном уровне. Кроме того, имеются данные, что интенсификация процессов вторичного метаболизма приводит к обогащению клеток биологически ценными соединениями и к заметному повышению устойчивости к стрессовым факторам (Сухаревич В.И. с со-авт.,1982; Автушенко С.С., с соавт.,1991; Киселева В.М. с со-авт, 1993; УагШЗск Р. а1, 1995).

В настоящее время в качестве стимуляторов роста часто используются сложные смеси, нестабильные по составу, а, следовательно, и по свойствам (экстракты, гидролизаты, автолизаты, отходы пищевой промышленности и сельского хозяйства). В этом случае значительно усложняется выяснение механизма действия на клетку фактора роста. Поэтому особый интерес представляют гомогенные по составу биологически активные вещества, к числу которых относятся рибонуклеазы (РНКазы) микробного и тканевого происхождения.

К началу наших исследований продолжительное время велось определение диапазона ростстимулирующего действия РНКаз. Так, в конце 80-х годов было изучено ростстимулирующее влияние экзогенных рибонуклеаз на размножение бактерий (Егоров С.Ю. и др., 1989) и дрожжей рода Candida (Колпаков А.И. и др.,1989; Куприянова Ф.Г. и др., 1989; Куприянова-Ашина Ф.Г. и др., 1992а; 19926; Колпаков А. И. ,1993), на урожай клеток и усиление синтеза физиологически активных веществ Thrichoderma tiarzianum (Захарова Н.Г. и др. 1992). Было показано, что РНКаза В. intermedins способствует увеличению выхода биомассы B.bifidium ЛБА-3, Lactobacillus fermentum, E.coli, применяемых в медицине при дисбактериозах (Колпаков и др, 1996а,19966).

Однако увеличение скорости роста популяции под действием внешних агентов является результатом сложного комплекса биохимических превращений в клетке (Подгорский B.C., Иванов В.Н.,1975). В связи с этим является актуальным не только выявление ростстимулирующего действия РНКаз на микроорганизмы разных таксономических групп, но и исследование изменения метаболизма клеток, обработанных ферментом. На сегодняшний день при наличии многочисленных данных, указывающих на фундаментальный и прикладной характер работ об ускорении роста популяции под действием экзогенных РНКаз, закономерности взаимодействия РНКаз с живой клеткой и многообразие ответных реакций популяции изучены недостаточно полно.

В связи с изложенным, представляется актуальным изучение регуляторного действия экзогенных РНКаз на клетки низших эука-риот с учетом таких факторов как возрастная, трофическая структура популяции; синтез клетками циклических нуклеотидов и протекторных соединений; а также устойчивость микроорганизмов к стрессовым воздействиям.

Нелью настоящего исследования явилось выявление основных закономерностей стимулирующего действия экзогенных РНКаз на клетки спорообразующих дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить влияние РНКазы Bacillus intermedius (биназы) и панкреатической РНКазы (РНКазы I) на размножение дрожжей в зависимости от физиологического состояния культуры.

2. Определить влияние биназы на возрастную и трофическую структуру популяции дрожжей, на биосинтез ДНК и циклического АМФ.

3. Определить возможность использования РНКазы как стимулятора роста пекарских дрожжей S.cerevisiae в производственных условиях.

4. Исследовать действие РНКаз на жизнеспособность клеток S. cerevisiae, подвергнутых стрессовым воздействиям.

Научная новизна работы. Впервые обнаружена способность экзогенных РНКаз (панкреатическая РНКаза, биназа) оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее действие на рост культуры спорообразующих дрожжей S.cerevisiae. Установлено, что биназа в низких дозах при добавлении ее в начале лаг-фазы и фазу экспоненциального роста стимулирует почкование клеток. Подобраны оптимальные условия для проявления стимулирующего эффекта РНКаз: соотношение дозы вносимого фермента и количества клеток.

Анализ возрастной структуры популяции показал, что стимулирующий эффект обусловлен избирательным действием РНКазы на клетки подготовки к почкованию и поздней стадии почкования. Впервые выявлено, что под действием РНКазы изменяется трофическая структура популяции.

Стимулирование синтеза ДНК связано с сокращением Gj- фазы митотического цикла за счет уменьшения экзотрофного периода (с1ех) этой Фазы. Более раннее нарастание пула вторичного мес-сенджера -цАМФ в клетке способствует переключению с С1ех в эндотрофный период С}-фазы (С1епа).

Установлено, что РНКаза в ростстимулирующих дозах обладает антистрессовой функцией. Клетки, выращенные в присутствии РНКазы, приобретают повышенную термо-, осмо- и ксероустойчи-вость, что коррелирует с увеличением пула внутриклеточной тре-галозы.

Проведенные исследования показали, что экзогенные РНКазы оказывают существенное влияние на метаболизм дрожжей. Таким образом, появляется возможность направленного изменения обмена веществ дрожжей, что может быть использовано в биотехнологии.

Практическая значимость работы. Нами разработан способ выращивания пекарских дрожжей при добавлении панкреатической РНКазы в производственные емкости, позволяющий увеличить биомассу товарных дрожжей на 5-15% (заявка на изобретение N 95114100/13 (024148) приоритет от 08.08.95). Биомасса дрожжей, полученная при внесении РНКазы характеризуется улучшением ряда свойств, определяющих качество пекарских дрожжей таких как подъемная сила, стойкость при хранении, повышенное содержания трегалозы. В диссертации имеется акт производственных испытаний РНКазы, подтверждающий положительный эффект действия биостимулятора.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Как известно, для одноклеточных микроорганизмов наиболее характерным проявлением роста является увеличение числа клеток популяции. Изучение событий клеточного цикла, определяющих изменение возрастных, физиологических и биохимических свойств микробной популяции, может быть одним из важнейших подходов к теоретическому пониманию закономерностей жизнедеятельности микроорганизмов. В свою очередь знание закономерностей жизнедеятельности клетки может указать новые пути управления процессами роста и развития микробной популяции, которые находят все более широкое применение в микробиологической промышленности при производстве биомассы, а также при получении ферментов и вторичных метаболитов.

В биотехнологии чаще применяют популяции вегетативно размножающихся одноклеточных микроорганизмов. С учетом изложенного остановимся на описании особенностей роста "классических", т.е. наиболее полно изученных объектов- представителей одноклеточных эукариотных микроорганизмов -дрожжей БассПаготу-сеэ сетеугзгае.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Луцкая, Анна Юрьевна

- 118 -ВЫВОДЫ

1. Экзогенные РНКазы микробного и животного происхождения ускоряют размножение дрожжей БассМгощсеБ сегеугэгае. Эффект РНКазы зависит от физиологического состояния популяции и от концентрации вносимого фермента.

2. Стимуляция роста культуры сегвугвгае экзогенной РНКазой выражается в ускорении инициации синтеза ДНК и почкования клеток и коррелирует с сокращением стадии митотичес-кого цикла дрожжей.

3. Под действием РНКазы уменьшается продолжительность экзотрофного периода -стадии. Этот процесс коррелирует с сокращением времени достижения максимального уровня в клетке вторичного мессенджера - цАМФ.

4. Панкреатическая РНКаза, использованная в качестве стимулятора роста дрожжей в производственных условиях, вызывает наибольший эффект при добавлении фермента в аппараты с активно растущей культурой. РНКаза улучшает потребительские свойства дрожжей, такие как подъемная сила и стойкость при хранении.

5. Экзогенные РНКазы в ростостимулирующих дозах обладают антистрессовой функцией, способствуют повышению термо-, осмо-, ксероустойчивости клеток и возрастанию пула трегалозы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Луцкая, Анна Юрьевна, Казань

1. Автушенко С.С., Искрицкий В.Я., Баямасов В.А., и др. Способ получения биомассы микроорганизмов.-А.С. 2017816. /Опубл. в Б.И.,1991. N40.

2. Афанасенко Г.А., Дудкин С.М., Каминир Л.Б., Голубенко И.А., Северин Е.С. Первичная структура рибонуклеазы Bacillus intermedius 7Р // Биоорг. химия. -1979. -Т.5, N 2. -С.187-202.

3. Бекер М.Е., Дамберг Б.Э., Рапопорт А.И. Анабиоз микроорганизмов. -Рига: Зинатне, 1981.- 253с.

4. Бекер М.Е., Миепиньш Т.К,, Райпулис Е.П.Биотехнология. -М.: ВО.Агропромиздат, 1990. -331с.

5. Бекер М.Е., Упит A.A. Влияние состава среды на бродильную и зимазную активности дрожжей Saccharomyces cerevisiae в процессе обезвоживания. //Микробиол. -1972. -T.XL1, вып. 5.-С. 830-833.

6. Беляева М.И., Нужина A.M., Габдуллина Г.К., СоколоР.Б. Изучение действия нуклеодеполимераз на асцитную карциному Эр-лиха в опытах In vivo. В кн.: Бактериальные нуклеодеполимеразы и их действие на опухолевый рост. -Казань: КГУ. -1969. -С.97-113.

7. Богословская 0.А., Бурлакова Е.А., Глущинина Н.Н. и др. //Журн. микроб, эпидеминологии и иммунологии. -1987. Вып. 6,- С. 22-25.- 120

8. Бородина В.М., Федорова Л.И., ЭршлерИ.А., Абидор И.Г., Зеленин A.B. Стимуляция роста дрожжей Saccharomyces се-revisiae в импульсных электрических полях // Биол. мембраны. -1992. -Т.9, N 9. -С.970-976.

9. Бужурина И.М., Панов М.А. Механизм формирования клеточного ответа на внешнее воздействие // Итоги науки и техники ВИНИТИ. М. -1986. -3. -258с.

10. И. Волков В.Я. К вопросу о физиологических механизмах устойчивости микроорганизмов к замороживанию и высушиванию//Мик-робиол. -1994. -Т.63.-С.5-16.

11. Воробьева Л.И. Техническая микробиология.- М.: Изд-во МГУ,1987. -С.83-89.

12. Габдуллина Г.К. Действие нуклеазы Serratia marcescens на клетки и рост асцитной опухоли Эрлиха : Автореф. дисс.канд. биол. наук.-Киев. -1980. 25с.

13. Джунковская И.П., Сухаревич В.И. Действие смеси синтетических Сахаров на рост и люминисценцию бактерий // Микробиология. -1987. -Т.56, N. 5. -С.774-777.

14. Дорофеев А.Г., Панников Н.С. Количественное описание роста микроорганизмов в периодической культуре в зависимости от физиологического состояния инокулята //Микробиология. -1991. -Т.60, вып.4. -С.652-660.

15. Егоров С.Ю., Куприянова Ф.Г., Колпаков А.И. Стимуляция размножения бактерий экзогенными РНКазами // Тез.докладов Межресп.совещания "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование". -Рига, 1989. -с.50.

16. Журавлев A.C., Соломко А.П. Основные принципы радиоактивности биологических образцов с помощью сцинтилляционных- 121 спектрометров. В кн.: Методы мол. биологии. -Киев: Наукова думка. -1979. -С.33-34.

17. Захарова Н.Г., Алимова Ф.К., Колпаков А.И., Лещинская И.В., Куприянова Ф.Г., Муратова С.С., Гайнутдинова Г.И. Способ обработки семян растений. -Приоритет 22.05.1989. -A.c. N 1743018. -Опубл. в Б.И. -1992, N 6.

18. Иванов В.Н. Закономерное чередование экзо- и эндотро-фии в клеточном цикле микроорганизмов- эукариот//Докл.АН УССР,- Сер. Б. -1987. -N7.-С.68-69.

19. Иванов В.Н. Эндо- и экзогенное дыхание метанолусваива-ющих дрожжей Candida boidini //Микроб, журн. -1988,- Т50, N1.-C. 42-46.

20. Иванов В.Н. Экзо- и эндотрофия клетки.- Киев: Наукова думка, 1990. -103 с.

21. Иванов В.Н., Пиндрус A.A. Цитологический метод выявления экзои эндотрофных клеток дрожжей //Микробиол. -1989.-Т.58, N3.-С.351-354.

22. Иванов В.Н., Рапопорт А. И., Пиндрус A.A. Фазоспеци-фичность повреждения и репарации клеток дрожжей при обезвоживании -регидратации и замораживании- оттаивании//Микробиол. -1987.-Т.1.-С.141-144.

23. Иванов В.Н., Седина С.А. Синхронное культивирование метанолусваивающих дрожжей Candida boidini и анализ физиологической гетерогенности популяции //Микробиол. журнал. -1984.-Т. 46, N3,- С. 43-49.

24. Иванов В.Н., Угодчиков Г.А. Клеточный цикл дрожжей.-В кн. Клеточный цикл микроорганизмов и гетерогенность их популяций // Киев: Наукова думка. -1984. -С.145-149.- 122

25. Иванова Т.А., Циоменко А.Б., Галынкин В.А. и др. Влияние лентехнина на синтез биополимеров протопластами дрожжей. -В сб.: Получение и применение регуляторов роста. Регуляторы роста микроорганизмов.Л., 1982, с.69-74.

26. Ильинская О.Н., Крылова Н.И. Действие экзогенной РНКазы на клетку низших эукариот //Прикл.биохимия и микробиология. -1993. -Т.29, вып.2. -С.105-110.

27. Инге-Вечтомов С.Г., Егорова В.Н. Генетический контроль онтогенетической изменчивости дрожжей.- В кн.:Онтогенз микроорганизмов. -М.:."Наука",1979, с.34-55.

28. Инструкция по микробиологическому и технохимическому контролю дрожжевого производства. М.: ВНИИХП, Легкая и пищевая промышленность, 1984.-190с.

29. Иткес A.B., Туницкая Л.В., Северин Е.С. Регуляция биохимической активности клетки системой вторичных мессенжеров: сАМР, 2',5'-олигоаденилата и кальция // Успехи биол. химии. -1985. -С.125-152.

30. Кагату Таки К.К. Активатор актиномицетов. Опубл. в И.С.М. 1994,N. 7. -Вып.46. -С.42.

31. Кафиани H.A., Маленков А.Г. Роль ионного гомеостаза клетки в явлениях роста и развития // Усп.совр.биол. -1976. -Т.81, N 3. -С.445-461.

32. Квасников Е.И., Щелокова И.Ф. Дрожжи.Пути развития. -Киев: Наукова думка,1991. -328с.

33. Киприянов А.И., Балабушевич И.И., Штепенко И.Г., Про-хорчук Т.И. и др. Способ выращивания биомассы кормовых дрожжей.- A.C. 1599432 AI /Опубл. в Б.И. ,1990. N 38.

34. Киселева А.И., Феофилова Е.П., Кашпарова Е.В. О сти- 123 мулирующем эффекте зеленого света на образование ß-каротина гетероталличным грибом Blakeslea trispora //Микробиология. -1993. Т. 62, Вып. 1.- С. 56-61.

35. Колпаков А.И. Влияние экзогенных рибонуклеаз на размножение дрожжей рода Candida: / Автореф.дис.канд. биол. наук. -Казань,1993. 23с.

36. Колпаков А.И., Куприянова-Ашина Ф.Г. Биохимические аспекты стимулирующего действия экзогенных РНКаз // Биол.науки. -1992а, N 2. -с.103-108.

37. Колпаков А.И., Куприянова Ф.Г. Влияние экзогенных РНКаз на размножение дрожжей Candida tropicalis // Микробиология. -19926. -Т.61, вып.6. -С.969-974.

38. Колпаков А.И., Куприянова-Ашина ■ Ф.Г., Бондаренко В.М., Егоров С.Ю. Стимулирующее действие экзогенной РНКазы на эубиотические штаммы лактобацилл, бифидобактерий и Escherichia coli// Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунологии. 1996а.N4.-С.14-18.

39. Колпаков А.И., Куприянова-Ашина Ф. Г., Горская Е.М. Изменение некоторых биологических свойств лактобацилл под влиянием экзогенной рибонуклеазы // Антибиотики и химиотерапия. -19966.-Т.41, N 10. -С.16-18.

40. Колпаков А.И., Крылова Н.И., Куприянова Ф.Г. Влияние экзогенной РНКазы на накопление биомассы и эффективность роста- 124 дрожжей рода Candida // Тез.докл. Межресп. совещания "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование". Рига, 1989. С.51.

41. Конев С.В., Аксенцев С.Л. Структурная лабильность мембран // Биохимия. -1977. -Т.42, вып. 2. -С.187-196.

42. Конев С.В. Янчевская Т.Г. Гамезо Н.В. Структурно-мембранная регуляция межклеточных контактов низкомолекулярными пептидами // Биофизика. -1991. -Т.36, N 2. -С.308-312.

43. Комолова Г.С., Грачева Н.П. Применение ультразвука для стимуляции дрожжевого роста // Изв. Сиб.отд. АН СССР, серия биол.мед.наук. -1964.- 56с.

44. Коротяев А.И. Механизмы саморегуляции бактериальных клеток.-М.: Медицина, 1973. -270с.

45. Куприянова-Ашина Ф.Г., Колпаков А.И., Егоров С.Ю. Влияние РНКазы Bacillus intermedius на размножение дрожжей Candida tropicalis // Биол.науки. -1992. N 4. -с.90-100.

46. Куриненко Б.М. Механизмы биологического действия нук-леаз //Нуклеазы бактерий. -Казань. КГУ. -1991. -с.153-222.

47. Кучеренко Н.Е., Цудзевич Б.А., Блюм Я.Б., Бабенюк Ю.Д. Биохимическая модель регуляции активности хроматина // Киев: Наук, думка. -1983. -248 с.

48. Лебедев Ю.0., Шляпников С.В. Модифицированный метод получения рибонуклеаза А из аморфных и кристаллических препа- 125 ратов рибонуклеазы//Прикл. биох. и микробиол. -1981.-Т.17, вып. 2. -С. 247-253.

49. Лещинская И.Б., Клейнер Г.И., Волкова Т.И. и др. Метод выделения и очистки щелочной рибонуклеазы Bacillus intermedia //Прикл. биохим. и микробиол. -1981. -Т.17. -С.241-246.

50. Лирова С.А., Шкоп Я.Я., Цвид Е.Е. Изменение электрокинетических свойств поверхности дрожжевой клетки в периодических режимах//Микро б. -1982. -Т.51, вып. 1.-С.12-16.

51. Лихачев Л.И., Горлов Ю.А. Методы получения и регенерации протопластов дрожжей. В кн.: Методы молекулярной биологии. Киев, Наукова думка. 1979. с.214-216.

52. Максимова Г.Н., Винаров А.Ю., Казанцев Ю.Е., Воронова Е.А., Гаврилов В.Б. Исследование действия полиббереллинового препарата и его композиций с сульфатом натрия на рост парафи-ноокисляющих дрожжей //Биотехнология 1994. Вып.3, С. 17-23

53. Маленков А.Г. Ионный гомеостаз и автономное поведение опухоли.-М.: Наука, 1976. -С.171.

54. Никифорова Т. Н., Львова Е.Б., Сухаревич В. И. и др. Изучение действия формозы на продуцент лимонной кислоты Aspergillus niger // Микробиологическая промышленность. -1983. -N. 3. -С. 18-19.

55. Новаковская С.С., Шищацкий Ю.И. Справочник по производству хлебопекарских дрожжей. -М. : Пищ. Промышленность, 1980. -219с.

56. Подгорский B.C. Гетерогенность в популяциях бактерий, дрожжей и микромицетов //Тез.конф. Биофизика микроб, популяций. -Красноярск: СО АН СССР. -1987. -С.35.

57. Подгорский B.C. Иванов В.Н. О двойном субстрат-кисло- 126 родном стимулировании роста метанол-окисляющих дрожжей//Прикл. биох. и микробиол. -1975. -Т. XI, вып.З, -С.326-330.

58. Перт С.Дж. Культивирование микроорганизмов и клеток.-М.: Мир, 1978. -235 с.

59. Печуркин Н.С. Методы изучения динамики популяций микроорганизмов.- Новосибирск: Наука, 1978. -С.45-51.

60. Печуркин Н.С., Брильков A.B., Марченкова Т.В. Популя-ционные аспекты биотехнологии //Новосибирск: Наука. -1990. -173 с.

61. Плевако Е.К. Технология дрожжей. -М.: Пиш. пром-сть, 1970. -С.270-300.

62. Работнова И.Л., Позмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов // М.: Наука. -1980. -С.196-200.

63. Решетник O.A. Разработка процессов микробиологического синтеза биостимуляторов неспецифического действия: Автореф. дисс. докт.технолог, наук. -Санкт-Петербург,-1992. 39с.

64. Северин Е.С. Избирательная регуляция клеточного метаболизма // 45 Баховское чтение. -М.: Наука. -1991. -64с.- 127

65. Семихатова Н.М. Хлебопекарские дрожжи.-М.:ПП, 1980. 154с.

66. Смирнов К.К., Смирнов С.Г., Смирнова З.Г. Лаг-фаза -фаза опережающего отражения развития бактериальной культуры.-В кн.: Физико-химические исследования патогенных энтеробактерий в процессе культивирования. -М.: Наука, 1982,.С.42-53.

67. Соболева И.С., КрицкийМ.С. Низкомолекулярные соединения нуклеотидной природы в регуляции онтогенеза грибов// Успехи микробиолог. -1987.-Т.21. -С.59-86.

68. Солдатова Н.Г., Беляева М.И. Действие нуклеазы Serratia marcescens на кишечную палочку // Некоторые подходы к изучению физиологической роли нуклеаз. -Казань. -1972. -С.53-61.

69. Страховская Л.К., Сибарова М.Н., РаскинМ.Н., Гитер-ман В.Ф., Козловская В.А., Вальчук Н.И. Способ получения стимулятора роста дрожжей // А.с.1198117 А СССР // Б.И. -1985. -N.46. -С. 211.

70. Стахорская Л.К., Гитерман В.Ф., Раскин М.И. Стимуляторы роста кормовых дрожжей из технических лигнинов // Получение и применение регуляторов роста. Регуляторы роста микроорганизмов: Сб.статей /Отв. ред. Яковлев В.И. -Л., 1982.-С.62-66.

71. Страховская М.Г., Иванова И.В., Фрайкин Г.Я. Стимулирующее влияние серотонина на рост дрожжей Candida guilliermon-dii и бактерий Streptococcus faecalis // Микробиология.-1993. -Т.62, Вып.1. -С.46-49.

72. Сухаревич В.И. Научные основы использования синтетических углеводов и продуктов окисления горючих сланцев в процессах микробиологического синтеза: Диссертация док-pa техн. наук. -Л., 1984. -378 с.

73. Сухаревич В.И., Глибин E.H., ДивоваН.П., Кутуев- 128

74. Р.X., Медведова Н.Г., Яковлев В.И., Львова Е.Б., Никифорова Т.А., Василинец И. М., Вилевдо Г.А., Аглиш И.Б., Лыкова Л.А. Способ получения биомассы.- А.С. 837065 СССР / Опубл. в Б.И, 1982, N.30. -С. 180-182.

75. Терешина В.М., Михайлова Н.В., Феофилова Е.П. Физиологическая роль трегалозы и антиоксиданта у Cunninhamella japónica привысокотемпературном стрессе//Микробиол. -1991. -Т.60, вып.5. -С.781-789.

76. Федосеев Г. К. Механизм переноса питательных веществ в клетке.- В кн.: Математическое моделирование микробиологических процессов. -Пущино, НЦБИ АН СССР. -1973. -С.30-53.

77. Феофилова Е.П. Биохимическая адаптация грибов к температурному стрессу //Микробиолог. -1994. -Т.63, Вып.5. -С.757-773.83. феофилова Е.П. Трегалоза, стресс и анабиоз//Микроби-ол. -1992. -Т.61, Вып.5.-С.741-755.

78. Циоменко А.Б., Лупашин В.В., Дмитриев В.В., Кулаев И.С. Проницаемость клеточной стенки и экспорт белков в культу-ральную жидкость у Saccharomyces cerevisiae // Микробиология. -1987. -Т.56, N 5. -С.797-803.

79. Циоменко А.Б. Секреторная система дрожжей и возможный механизм экспорта белков в окружающую среду// Сб.научн. трудов. Актуальные проблемы биохимии эукариотов и прокариотов.- 129

80. Пущино. НЦБИ ИБФМ. -1990. -С.74-90.

81. Черныш В.Г., Бочарова H.H. Влияние температуры и активной кислотности среды на метаболизм резервных углеводов и выживаемость пекарских дрожжей // Прикл. биохимия и микробиология . -1975. -Т. И, N 5. -С. 662-668.

82. Шаткин В.А. Определение содержания РНК, ДНК и белка с помощью меченых предшественников и последующего химического фракционирования. -В кн.: Методы вирусологии и мол. биологии. М.: Наука, 1972. с.190-193.

83. ШигаеваМ.Х., Ахмадуллина Н.Б., Джангалина Н.К., Мус-тафин К.Г. Стимуляция жизнедеятельности микроорганизмов и вирусов. -Алма-Ата: Каз.ССР, Наука, 1986.- 184 с.

84. Штрейблова Е. Клеточный цикл у дрожжевых организмов // Успехи микробиологии. М.: Наука. -1979. N 14. -С.181-190.

85. Якуруто Хонся К.К. Способ получения стимулятора роста Bifidobacterium. А.С.57-71476 Япония /Опубл.в И.С.М., 1993, N8, вып. 46. -С. 41

86. Ясконович Г.А., ЕлькинГ.Э. Характеристика гидрофоб-ности поверхности клйток //Микробиол. -1995. -Т.64, N9.-С.137-139.

87. Alemohammad М.М., Knowles C.S. The bacterial cell cicle //J.Gen.Mlcrob.-1974. -V.8.-P.125

88. Attfield P.V. Osmoregulation and cell composition in- 130 salt-adaptation of Saccharomyces cerevisieae. -1987.-V.225, N. 1-2. -P.259.

89. Balaban N. P., Sharipova F.R., Golubenko I.A. Physico-chemical characteristics of ribonuclease Bacillus interme-dius//Proc. of the first international meeting "Structure and chemistry of ribonucleases.-Moscow.1988.-P.349-352.

90. Barabas G., Szarbo G. Effect of penicillin on streptomycin prodaction by Streptomyces griseus // Antimicrob. Agents and Chemother. -1987. -V.11. -P.392-395.

91. Beker D., Grba S. Utjecaj uvieta uzgoja na aktivnost i postojanost stanica pekarskoga kvasca // Prehranb. tehnol. rev. -1978. KnJ 16, N 1. S. 6-9.

92. Beintema J.J., Schuller C., Iriet M. and Carsana A. Molecular evolution of the ribonuclease superfamily // Prog. Biophys. molec. Biol. -1988.- -V.51. -P. 165-192.

93. Birch D.J., Haslam J.M. Changes in ciclic AMP concentrator during diauxic growth pf Saccharomyces cerevisiae (baker's yeast) on glucose medium // Biochem. Soc. Trans.-1983.-V.11.-P.403-404

94. Beuchat L.R.//Adv.in Appl. Microbiol./Ed. D.Perlman. N. Y. : A.P. -1977. -V. 23.-P.219.

95. Blazquez M.A. & Gancedo C. Identsification of extra-genic suppressors of the cifl mutation in Saccharomyces cerevisiae //Cur Genet.-1994. V.25.-P. 89-94.

96. Broek D., Toda T., Michaeli T., Lewin L. et al. The Saccharomices cerevisiae CDC25 gene product regulates the RAS/adenilat cyclase pathway // Cell. -1987. -V.48, N 5. -P.789-799.- 131

97. Burlakova E.B., Archipova G.V., Dialyabova M.I. et al Membrane-Lipids as Information Carrier // Biophys. and Bioc-hem. Information transfer in Recognition. -N.4.: Plenum Press. -1979. -P.583-594.

98. Cabib E. Lelair L.F. Metabolism of reserve materials //J.Biol.Chem. 1968.-V.231.-P259.

99. Ciriacy M. Genetics of alcogol dehydrogenase in Sacc-haromyces cerevisiae isolation and genetics analysis of adh mutant// Mutan.Res. -1975.-V29.N. 3.-P.315-326.

100. Crowa J.H., Crowa L.M., Chaptan D. Preservation of membranes in anhydrobiotic organisms: the role of trehalose //Science.-1984.-V.223, N4637,- P.701-703.

101. Coo P. J., Jones M.V., Edgar K. & Cole M.B. TPK gene products mediate cAMP-independent thermotolerance in Saccharo-myces cerevisiae//J. Gen. Microbiol.-1992.-V.138 (Ptl2). -P.2551-2557.

102. Cooper L.A., Edwards S.W. Gadd G.M. Involvement of adenosine 3\5'-cyclic monophosphate in the yeast -mycelium translation of Aureobasidium pululans //J. Gen.Microbiol. -1985.- V.131,- N7.-P.1589-1593.

103. Costa- Carvalho V.L. A., Paner A.D., Moltoon J.R. Effects of carbon source and genetic modification of phoshoglu-comutase on trehalose metabolism in Saccharomices cerevisiae // FEMS Microbiol. Lett. -1978. -V. 4, N 4. -P.221-224.

104. Gounalaki N. & Thireos G. Yaplp, a yeast transcrpti-onal activator that mediates multidrug resistance, regulates the' metabolic stress response //EMBO J.1994.-V.13. -P.4036-4041- 132

105. Enlalia V., Laudes B.Santiago G., Francisco P.//Eu-rop.J.Biochem.-1986. -V.154, N.2.-P247.

106. Gilman A.G. Protein binding assays for cyclic nucleotides //Advances in Cycl. Nucl. Res.-New York, 1972.-V.2.-P.9-24.

107. Hottiger T., Boiler T. and Wienken A. Correlation of tregalose content and heat resistance in yeast mutants altered in the RAS/ adenilate cyclase pathway: is trehalose a thermop-rotectant? //Febs Letters. -1989. -V. 255, N 2. -P. 431-434.

108. Hottiger T., Boiler T. and Wienken A. Rapid changes of heat and deccication tolerance correlated with changes of trehalose content in Saccharomyces cerevisiae cells subjected to temperature shifts // Febs Letters. -1987. -V. 220, N 1.1. P. 113-115.

109. Kolpakov A.I. Biochemical aspects of stimulating effect of exogenic RNases // Ribonucleases: chemistry, biology, biotechnology. 3rd international meeting. Capri, May 9-13, 1993. -P.43.

110. Kolpakov A.I., Kupriyanova F.G. A role of exogeneous nucleopolymerases at the processes of the growth and survival of microbial populations// 7th International Symposium on Microbial Ecology. Brazil. Sao Paulo. 1995.

111. Konmoto T.,TukuiT., Takaku H. et al//Bifidobacteria and Microflora.-1988.-V.7.-P.61-69.

112. Kopp M., Muller H.& Holzer H. Molecular analysis of the neutral trehalase gene from Saccharomyces cerevisiae//J Biol Chem.-1993.-V. 268.-P. 4766-4774.

113. Laemmli L.K.//Nature.-1980. -V.227.-P.680.

114. Lapp D., Patterson B.W.Elbein A.D. Properties of atregalose phosphotat syntetase from Mycobacterium smegmatis activation of the enzyme by polynucleotides and other polyani-ons//J. Biol.Chem.-1971.-V.246.-P.4567-4579.

115. Lillie Sue H., Pringle Jonh R. Reserve carbohydrate metabolism in Saccharomices cerevisiae: responces to nutrient limitation // J.Bacteriol.- 1980. -V. 143, N 3 . -P 1384-1394.

116. Meyenburg H.K. Energetics of the budding cycle of Saccharomyces cerevisiae during glucose limited aerobic growth//Arch. Microbiol.- 1969,- V. 66. N.4.- P. 289-303.

117. Mitsuoka T.,Hidaka H., Eida T.//Die Nahrung.-1987.-V.31,N5-6. P.427-436.

118. Nakata K.,Hasegawa J., Okamura K. Acculation and role of trehalose in Torulaspora delbrueckii No 3110 //Sourse Bioscience Biotechnology and Biochemistry.- 1995.-V.59, N. 6.-P.986-989.

119. Paner A.D. Trehalose metabolism in yeast // In: Proc. Fourth Intern. Symp. on Yeasts. Vienna. -1974. -V.1.-P.63-64. 122. Paner A.D. Trehalose synthesis during starvation of baker's yeast // Europ. J. Appl. Microbiol. -1974. -V. 2, N 1. -P. 39.

120. Piper.P. W. Molecular events associated with acquisition of heat tolerance by the yeast Saccharomyces cerevisiae // FEMS Microbiol Rev. -1993. N 11.-P. 339-55.

121. Reed S.J., Hadwiger J.A., Lorinez A. Protein kinase activity assotiated with the product of the yeast cell divisi- 135 on cycle gene CDC 28 // Proc.Nat.Acad.Sci. -1985. -V.82, N 12. -P.4055-4059.

122. Simanis V., Nurse P. The cell cycle control gene cdc2 of fission yeast encodes a protein kinase potentially regulated by phosphorylation // Cell. -1986. -V.45, N 2. -P.261-268.

123. Singer G.A.- Среда для ускорения роста микроорганизмов. / Опубл. в И. С. М, 1993, N 9, Вып 46. С. 59.

124. Vandijck P., Colavlzza D., Smet P., Thevelein J.M. Differential importance of trehalose in stress resistance in fermenting and nonfermenting Saccharomyces cerevisiae cells // Appl.Enviromental Microb.- 1995. -V.61, N 1. P.109-115.

125. Van Laere A.J.,Franson M. Changes in tregalose content in fission yeast// Arch.Microbiol.-1989.-V153.,N1.-P.33.

126. Vialle J. and Kolosky M. Determination of betain in sugar and wine by liquit chromatography //J. Chromatog. -1981.-V. 204. -P. 429-435.

127. Wiemken A., Matile p., Moor H. Vacuolar dynamics in synchronoustly budding yeast //Arch. Microbiol., -1970, -V.70, -P.89-103.

128. Yamashita I., Fukui S. Siguficance of ribosomal ribonucleic acid synthesis for control of the Gl-period in the cell cycle of the heterobasidiomycetes yeast Rhodosporidium toruloides // Bacterid. -1980. -V. 144, N 2. -P. 722-728.

129. Yanishevsky R.M., Stein G.H. Regulation of the cell cycle in eukaryotic cells // Int.Rev.Cytol. -1981. -V.69. -P.223-259.