Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нуклеопротеиновые комплексы дрожжей

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Нуклеопротеиновые комплексы дрожжей"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ

АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

СИНИЦКАЯ Наталья Сергеевна

НУКЛЕОПРОТЕИНОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ ДРОЖЖЕЙ: ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 2000 г.

Работа выполнена на кафедре микробиологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии

Научные руководители -доктор химических наук ШАТАЕВА Лариса Константиновна кандидат биологических наук ПОТЕХИНА Татьяна Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор ГУТАЛОВА Татьяна Витальевна доктор химических наук, профессор ГИНАК Анатолий Иосифович

Ведущая организация - Государственный Научно-Исследовательский Институт особо чистых биопрепаратов .

Защита состоится » 2000 г.

в {Я часовминут на заседании диссертационного совета К 084.63.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197376, г.Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии.

Автореферат разослан « » 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Н.В.КИРИЛЛОВА

Актуальность темы. В настоящее время в качестве лечебных и профилактических препаратов все шире используют различного рода экстракты из тканей и органов млекопитающих, содержащие биорегуляторы белковой природы. Однако, хорошо известно, что такие препараты нестабильны и нуждаются в защите как от ферментативного гидролиза в физиологических условиях организма, так и от внешних неблагоприятных воздействий, разрушающих препараты при хранении. Одним из способов стабилизации структуры и защиты биорегуляторов от действия эндогенных протеиназ является их комплексообразование с полимерными носителями. Выделение ядерных белков непосредственно в комплексе с нуклеиновыми кислотами, как естественными носителями белков хроматина, позволяет не только сократить их потери на стадиях выделения и очистки, но и расширяет спектр использования ядерных белков для различных медико-биологических целей, в том числе для тонкой коррекции стрессовых состояний организма или отдельных его функций.

С другой стороны, до последнего времени в качестве сырья для получения препаратов белков-биорегуляторов использовали органы и ткани крупного рогатого скота. Поиск и расширение сырьевых источников для получения новых препаратов является актуальной задачей биотехнологии. Изучение микроорганизмов, в частности дрожжей, в качестве источника для получения регуляторных пептидов и их комплексов с природными носителями представляется перспективным направлением, так как

промышленная технология их выращивания хорошо освоена и легко масштабируется.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы состояла в получении комплексов нуклеиновых кислот с ядерными белками (НПК) из клеток пекарских дрожжей 8асскаготусеа сеге\п$\ае, исследовании их компонентного состава и биологической активности. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

разработать и оптимизировать метод выделения НПК из культуры пекарских дрожжей БассЫготусев сегечпягае ; определить состав полученных препаратов НПК и их устойчивость по отношению к ферментативному гидролизу; выделить компоненты НПК и сравнить биологическую активность комплексного препарата НПК и отдельных его фракций.

Научная новизна работы. До начала настоящей работы дрожжев; биомассу традиционно использовали как сырье для получения белки витаминных концентратов и для выделения нуклеиновых кислот и АТ В представляемой работе впервые:

1. Разработан и оптимизирован метод выделен нуклеопротеиновых комплексов (НПК) дрожжей, вклгочающ стадию фракционирования НПК по молекулярной массе пут микрофильтрации на трек-мембранных модулях

2. Методами гель-хроматографии, вискозиметра электрофорезом в ПААГ, ионообменой хроматографи полученный препарат НПК дрожжей охарактеризован отношении компонентного состава и молекулярных масс бел и нуклеиновых кислот.

3. Доказана устойчивость высокомолекулярной фракции НПК I по отношению к ферментативному расщеплению РНК-азой.

4. С помощью ионообменной хроматографии при различш соотношениях белок : нуклеиновая кислота изучена прочное связывания этих компонентов в комплексе и рассчитан константы диссоциации НПК (I); показано, что связывай белка с нуклеиновой кислотой носит кооперативный характер

5. Исследована биологическая активность НПК (I) по отношени к культуре дрожжей, подверженных действию УФ-облучеш или перекиси водорода; показано, что НПК (I) усилива размножение клеток, угнетенное действием мутагеннь факторов.

6. Исследована митогенная активность НПК (I) и о компонентов. Показано, что высокоочшденный беле проявляет низкую митогенную активность, тогда как комплексе с РНК его активность значительно увеличивается.

Практическая ценность работы. Полученные результаты г выделению и характеристике НПК дрожжей увеличивают спею возможных сырьевых источников для получения биорегуляторов позволяют сделать технологию их получения более простой экономичной. Кроме того, НПК могут быть использованы для разработк новых пищевых биологически активных добавок и лечебных препарата в том числе пролонгированного действия.

Работа выполнена в соответствии с тематическим планом НИ института по теме «Микробиологический синтез и исследование

биологически активных веществ», программы по разработке новых БАВ и технологий получения БАВ, как основы для производства лекарственных препаратов и биологически активных пищевых добавок.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на международной конференции «Фармация в XXI веке: инновации и традиции» (С-Петербург, апрель 1999), на научном семинаре Российского Химического общества им. Д.И.Менделеева по хроматографии (С-Петербург, март 2000), на юбилейной нучно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы биотехнологии и медицины» (С-Петербург, апрель 2000).

Публикации. По теме работы имеется 8 публикаций.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения, выводов и библиографии. Работа изложена на 132 страницах, содержит 13 таблиц, 21рисунок. Библиография включает 230 источников. Из них 129 на иностранных языках.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

НПК получали из клеток пекарских, дрожжей ЪассИаготусек сегеывюе производства ОАО "Комбинат пищевых продуктов" (ГОСТ 171-81). Перед выделением НПК дрожжи отмывали от низкомолекулярных примесей, остатков питательной среды и бактериальных клеток. Клетки дрожжей разрушали трехкратным замораживанием - оттаиванием. Экстракцию целевых компонентов проводили 1% раствором карбоната натрия при интенсивном перемешивании и прогревании до (80±1)°С в течение 20 минут и дальнейшей суточной выдержкой на холоду. Соотношение суспензия : содовый раствор равнялось 1 : 14 по объему. Экстракт отделяли центрифугированием и проводили фракционирование экстракта по молекулярным массам НПК на микрофильтрационных модулях плоского типа марки ПФМ ("Плазмофильтр", Россия) с лавсановыми трековыми мембранами в качестве фильтрующего материала. Конструкция и геометрические параметры модуля представлены на рисунке 1. Процесс фракционирования НПК вели с многократным прокачиванием экстракта через модуль до десятикратного концентрирования по объему. Скорость подачи экстракта - 3,0 л/час. Полученный концентрат подкисляли 30% уксусной кислотой до рН 4,5 и выдерживали на холоду.

Рисунок 1. Внешний вид и габаритные размеры модуля ПФМ. 1,2,3 - штуцера для подачи исходного раствора, выхода концентрата выхода фильтрата (соответственно), 4 - камера концентрата, 5 - каме] фильтрата, 6 -трековые мембраны, 7 - проклеивающий материал.

Сформировавшийся осадок НПК отделяли центрифугированием замораживали.

Для расчета значений молекулярной массы НПК в экстраи фильтрате и концентрате использовали частную формулу уравнен] Марка-Куна-Хаувинка для нуклеиновых кислот [Бреслер С.Е.]:

[г|]=1,05 • 10"7М1,32 (1),

где М - молекулярная масса компонента, Да;

[т]] - характеристическая вязкость, дл-г'1, полученн; экстраполяцией графика зависимости приведенной вязкости раствор« Ппривел к С—>0. Определение относительной вязкости проводили методе последовательных разведений растворов, используя вискозиме Оствальда с капилляром 0,73 мм при 20°С. Измеряли время истечет термостатированных в течение 20 минут исследуемых растворов.

Для гель-хроматографии в работе использовали Сефадекс G-l( ("Pharmacia") (Детерман Г., 1970). Суммарную концентраци нуклеиновых кислот в растворах определяли спектрофотометрически nj 260 нм, концентрацию белков измеряли по методу Лоури (Lowry О.Н. е

il., 1951), концентрацию РНК - орциновым методом (Справочник 5иохимика.... 1991).

Ферментативный гидролиз НПК проводили РНК-азой при соотношении фермент-субстрат 1 : 10 по сухому весу. Гидролиз вели при 37°С в течение 4 часов в буферном растворе при рН 8.2. Дня оценки глубины гидролиза смесь после гидролиза фракционировали на той же шлонке с Сефадексом G-100, что и исходный препарат НПК.

Электрофорез НПК проводили в 7,5% полиакриламидном геле кТ1ААГ). В качестве свидетелей использовали набор белков фирмы 'Serva" (Австрия) с разными молекулярными массами (Gel electrophoresis Dfproteins..., 1981).

Определение Сахаров, входящих в состав НПК вели после кислотного гидролиза методом хроматографии на бумаге Filtrak (FN-11) в системе н-бутанол-вода-этанол-аммиак (40 : 49 : 10 : 1)- (Захарова, Косенко, 1982).

Разделение НПК на отдельные компоненты вели на карбоксильном катеоните КМТ (сополимер метакриловой кислоты и гексагидро-1, 3, 5-триакрилоилтриазина) и сильноосновном анионите ВП-1Ап. Сорбцию НПК ( рН 8,5) проводили на Н-форме карбоксильного катионита КМТ. Анионит ВП-1Ап использовали в ОН-форме. В качестве элюентов использовали: КМТ- 0,1 М фосфатный буфер (рН 8,2), ВП-1Ап-5% уксусную кислоту.

Биологическую активность НПК и составляющих его компонентов оценивали по их влиянию на выживаемость клеток дрожжей S. cerevisiae с повреждениями НК, индуцированными действием УФ-лучей или перекиси водорода, а также по активации Т-лимфоцитов человека.

Облучение дрожжей S. cerevisiae проводили, расположив открытые чашки Петри с суспензией 10б клеток/мл непосредственно под лампой БУВ-15. Клетки облучали в течение 2 мин. Доза облучения - 32,2 Дж/(м2-мин). В параллельном эксперименте перекись водорода смешивали с суспензией клеток дрожжей до получения в растворе концентрации 0,1% Н202 и 106 клеток/мл и выдерживали при комнатной температуре 30 минут. После облучения и действия перекиси водорода дрожжевую суспензию помещали в жидкую среду Сабуро (Семенов С.М., 1990) и культивировали при 24°С (в случпе УФ-облучения - в темной комнате для предотвращения фотореактивации).

Митогенную активность НПК определяли в реакции торможения миграции лейкоцитов (Лабораторные методы..., 1987).

Результаты подвергали статистической обработке в соответствии с ГОСТ 11.004-74.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1 Разработка и оптимизация метода выделения НПК из клетоí дрожжей ЗассЬаготусеь сегть'ше.

В основу предложенного нами метода выделения НПК из клето] дрожжей положен технологический прием, позволяющий в условия) мягкой водно-солевой экстракции сохранить структурные элемента хроматина, в которых эндогенные белки-регуляторы находятся ] комплексах с нуклеиновыми кислотами.

Для экстракции НПК из клеток дрожжей, предварительна разрушенных трехкратным замораживанием-оттаиванием использовал] слабоосновной буфер - 1 % по весу раствор натриевой соли угольно] кислоты, способствующей диссоциации гистонов и растворении нуклеопротеиновых компонентов хроматина [Беглов Д.Б., 1991].

Таблица 1. Влияние состава буферного раствора на растворимость НПК

Раствор* Оптическая плотность раствора Н11К. Ь ■■.

Х-260 им л=280 нм

№ 1 1.00 1.00

№2 1.20 1.00

№3 0.59 0.50

№4 0.61 0.45

- состав использованных растворов: № 1 -0.17МКа2С03 . № 2 - 0.17 М №2СОэ + 0.10 М 1лСЪ № 3 - 0.17 М Кта2С03 + 0.10 М СН3СООШ4 № 4 - 0.10 М 1л(Х+ 0.10 М СНЗСООЫКЦ ** - значение оптической плотности растворов выражено в долях от оптической плотности НПК в растворе № 1.

В тоже время известно, что есть определенная связь между солевым микроокружением и конформационными переходами в НК (Manning G.S., 1978). В таблице 1 приведены результаты влияния солевых растворов различного состава на растворимость препаратов НПК. Видно, что ионы лития способствуют более полному переходу НК в раствор, в то время как катионы аммония снижают растворимость НПК.

Учитывая способность ионов металлов влиять на растворимость НК, исследовали возможность увеличения выхода НПК на стадии содовой экстракции. Для этого при экстрагировании в 1 % раствор карбоната натрия добавляли в одном случае хлористый литий до получения 0.05 M раствора, а в другом - хлористый магний и кальций до 0.025 M и 0.02 M растворов соответственно. Затем проводили выделение НПК, определяли для них выход и содержание НК и белков. Полученные результаты представлены в таблице 2, а на рисунке 2 - выходные гель-хроматографические кривые полученных препаратов.

Таблтца 2. Сравнительные характеристики компонентного состава препаратов НПК, полученных с использованием различных солей.

:: Экстрагент нк, ; мас;;% Белок, . мае % ЗОЛЬНОСТЬ.; ВЫХОД:; ; л, %

::::: мае %. ::

1 Na2C03, ст. 20 46 9.2 3.5

2 Na2C03 +LiCl 24 4 39.4 3.5

3 Na2C03+CbCl+MgCl2 8 12 40.2 1.3

Оказалось, что добавление в экстрагент солей кальция и магния снижает количество НК в НПК. Вероятно это связано со стабилизацией в растворе эндогенных гидролаз дрожжей ионами Ca2' и Mg2+ и сопровождается увеличением их активности (Шевченко H.A., 1992). В таких препаратах преобладает низкомолекулярная фракция (Vnp от 80 до 100 мл), содержащая отдельные нуклеотиды и аминокислоты, как результат энзиматического гидролиза (рисунок 2а). Напротив, использование экстракции с добавлением хлорида лития повышает суммарное содержание НК в препаратах (таблица 2, рисунок 26), что

а)

б)

в)

1.6

1.2 -

0.8—.

0.4-

260 нм 280 нм

ч 2

Л к

\

Г |-

40

г 0.2

0.1

0.2

•о о

0.3

0.2

0.1

80 120 160 Уэ, мл

Рисунок 2. Гель-хроматография НПК, полученных с использованш различных экстрагирующих растворов. Содовая экстракция добавлением СаСЬ2+М§СЬг (а). Содовая экстракция с добавлением УС (б). Содовая экстракция (в).

хорошо согласуется с проведенными исследованиями растворимости НПК в различных буферных растворах. В этом случае наблюдали снижение общего количества белков в НПК. Кроме того, добавление солей в растворы для экстракции значительно повышает зольность конечных препаратов. Исходя из полученных результатов, заключили, что оптимальным методом является первоначально использованная содовая экстракция.

С физической точки зрения переход НК с белками из биомассы дрожжей в щелочной раствор может быть рассмотрен, как экстракция в коллоидной суспензии. Важным фактором, ускоряющим выщелачивание является температура процесса. С повышением температуры увеличивается движущая сила экстракции Дс, снижается вязкость раствора и, как следствие - возрастает значение эффективного коэффициента диффузии растворимых компонентов. Кроме того, прогревание при 85-90°С приводит к денатурации гидролитических ферментов клеток и более полному сохранению НК (Крылов И.А. и др., 1996). Основываясь на известных литературных данных, подобрали температуру экстракции ^=80°С для денатурации гидролитических ферментов - протеиназ и РНК-аз и соответствующую максимально возможному содержанию НПК в экстракте. Экстракт прогревали при заданной температуре в течение 20 минут- и медленно охлаждали до комнатной температуры.

Следует отметить, что степень разрушения клеток также оказывает значительное влияние на скорость выщелачивания, так как позволяет сократить путь вещества из более глубоких слоев к поверхности. В случае выделения НПК разрушение клеток механической дезинтеграцией приводило к потере нативной структуры НК. Поэтому, для более полного высвобождения высокомолекулярных компонентов экстракт переносили в холодную камеру (£=+4°С) и увеличивали время экстракции. На рисунке 3 приведена зависимость величины оптической плотности экстракта от времени проведения экстракции. Полученная кривая является типичной изотермой экстракции с насыщением, когда достигается равновесие между концентрациями раствореных НК и НК, находящихся в клетках. Ведение длительного процесса экстракции с насыщением является малоэффективным, так как при приближении к состоянию насыщения падает движущая сила процесса и выщелачивание замедляется. Для предохранения целевых НПК от ферментативного гидролиза ограничивали время экстракции одними сутками.

Е

t,сут.

Рисунок 3. Влияние времени проведения содовой экстракции : высвобождение НК из клеток дрожжей, г - продолжительное экстракции, Е - оптическая плотность экстракта.

п., мл/мг

Рисунок 4. Зависимость приведенной вязкости экстракта (1), концентрата (3) и фильтрата (2.) от содержания в них НК. п - приведенная вязкость, НК - концентрация нуклеиновых кислот.

30 кДа

120 кДа

67 кДа

17.8 кДа 12.3 кДа

Рисунок 5. Электрофорез НГЖ в ПААГ. (а) нативный электрофорез НПК. (б) электрофорез в присутствии мочевины и додецилсульфата натрия: 1 -НПК, 2 - маркерные белки.

1

Содовый экстракт был охарактеризован как вязкий коллоидный раствор и содержал макромолекулы НПК различной величины и формы. Опираясь на известный факт гидродинамической ориентации жесткоцепных линейных полимеров в потоке (Цветков В.Н., 1986), в работе впервые использовали метод мембранной микрофильтрации для фракционирования по молекулярным массам и концентрирования НПК, Полученные результаты свидетельствуют, что при микрофильтрации происходило фракционирование НК в растворе по размеру ш продольных осей: характеристическая вязкость концентрата после микрофильтрации превышает как вязкость исходного экстракта, так I фильтрата (рис. 4). Используя значения характеристической вязкости I выражении (1) рассчитали средневязкостные молекулярные массы дл5 НК в экстракте, фильтрате и концентрате, которые составили 750 кДа 201 кДа и 1430 кДа соответственно. Таким образом, была показанг целесообразность использования тангенциальной микрофильтрации н; стадии очистки при извлечении НПК из содового экстракта.

Затем НПК выделяли из концентрата путем осаждения 30 °/ уксусной кислотой в изоточке (рН 5.5-6.0). Было показано, чтх дальнейшая обработка НПК ацетоном ведет к излишнему обезвоживании препаратов и снижению их растворимости. Поэтому, осадки хранили ] замороженном состоянии (остаточная влажность 70 %).

2.2 Исследование компонентного состава НПК дрожжей

Суммарный препарат НПК дрожжей, полученный п предложенной схеме в своем составе в среднем содержал 46 % белков, 2 % НК (табл.2). Балластные примеси составляли соли Са, Ка : углеводные компоненты клеточных стенок дрожжей. Общее содержали углеводных примесей в препарате незначительно (не более 2 %) и н оказывало существенного влияния на дальнейшее фракционирование определение биологической активности НПК.

Исследование белковых компонентов НПК вели методо: электрофореза в поли-акриламидном геле (ПААГ). В случае гел! электрофореза НПК в среде детергентов, то есть в условиях полно диссоциации комплекса, мажорный белковый компонент проявляете одной зоной, с молекулярной массой 30 кДа (рис. 56). Молекулярнз масса выделенных белков превышает известные значения для гистонс дрожжей (11-15 кДа), и поэтому признаку они могут быть отнесены к

негистоновым белкам хроматина (НГБ). В тоже время известно, что низкомолекулярные белки и пептиды до 40 кДа невидоспецифичны. К ним относится небольшое количество полифункциональных белков таких как убикитин, убикитино-подобные белки, некоторые белковые факторы активации транскрипции (K.v.Hold, 1987). Было сделано предположение, что выделенные нами белки НГПС дрожжей относятся к регуляторным ядерным пептидам и носят универсальный характер.

На электрофореграмме нативных НГПС видно несколько полос белков (рис. 5а), что свидетельствует о неоднородности препарата НПК, в состав которого кроме белков (30 кДа) входят ДНК, РНК и их фрагменты, различной величины и состава.

Методом гель-хроматографии было показано, что препарат НПК в своем составе содержит три фракции: высокомолекулярную (I), со средней молекулярной массой (II) и низкомолекулярную фракцию (III) (рис.6а). Присутствие белков, как и НК было отмечено во всех выделенных фракциях, но лишь первый пик (I), выходящий при гель-хроматографии с объемом задержки колонки, содержал целевой высокомолекулярный комплекс НК с белками (Мм > 150 кДа). Соотношение белок:нуклеиновые кислоты в комплексе - 2.6:1. Средний пик содержал белок. Низкомолекулярная фракция с молекулярной массой 1 кДа содержала аминокислоты и мономерные звенья нуклеотидов, как следствие неспецифического ферментативного гидролиза и механических повреждений хроматина на стадии содовой экстракции и дегистонизации.

I пик, содержащий высокомолекулярную фракцию - НПК (I) был выбран для исследования устойчивости и прочности. В работах Кабанова В.А. с соавторами было показано, что интерполимерные комплексы между НК и белка.\ш устойчивы по отношению к гидролитическим ферментам. Действительно, после обработки суммарного препарата НПК панкреатической РНК-азой, наблюдали почти полное сохранение высокомолекулярной фракции НПК (I), в то время как фракция, содержащая олигонуклеотиды (П) подвергалась глубокому ферментативному гидролизу (рис.66). Очевидно, что нуклеазы не разрушали участки НК, связанные в интерполимерный комплекс с белками, увеличивая высоту (III) пика. Ферментативному гидролизу подвергались лишь свободные, незащищенные от действия РНК-аз участки олигомеров НК. Полученные данные могут служить доказательством нативности выделенных нами препаратов НПК, которая

Е

Упр, мл

Рисунок 6. Гель-хроматография НПК до (а) и после (б) ферментативно; гидролиза РНК-азой.

»беспечивает им устойчивость по отношению к гидролитическим ферментам ЖКТ.

Препарат НПК (I) был стабилен в условиях проведения жспериментов и не диссоциировал на белки и НК. Исследование 5заимодействия НК с белками в НПК (I) вели по спектральным сарактеристикам. Изменение спектров оптической плотности растворов Ж связано с переходами двухцепочечных НК в денатурированные >дноцепочечные структуры (Зенгер В., 1987; Tinoco I., 1960). В зезультате тепловой обработки происходит расплетание двухцепочечной :пирали НК, сопровождающееся увеличением оптической плотности эаствора по сравнению с оптической плотностью нативных НПК (I) 'гиперхромный эффект). Это свидетельствует о том, что в составе НПК [I) белки находятся в прочном комплексе с НК.

Дтя полной диссоциации НПК (I) и изучения особенностей его организации использовали высокопроницаемые пористые катеонит КМТ я анионит ВП-1Ап. На катеоните КМТ происходила сорбция и обратимая десорбция комплекса РНК-ДНК-белок, то есть не достигалось разделение на отдельные компоненты. При использовании же сильноосновного анионита ВП-1Ап на стадии десорбции был получен единичный симметричный белковый пик (рис. 7а). В этом случае сильноосновные аминогруппы анионита конкурентно сорбировали белки комплекса, что свидетельствует о более сильной по сравнению с группами НК связи белков с ионитом. Наблюдаемый интервал рН элюции от 4 до 5.5 свидетельствует о слабокислом характере выделенных белков.

Для расчета коэффициентов диссоциации НПК (I) использовали результаты исчерпывающей по белку сорбции НПК (I) на анионите ВП-1Ап. В первых 3-4 циклах сорбции из комплекса удалялась половина суммарного количества содержащихся в нем белков. В тоже время, вязкость конечного раствора возрастала десятикратно по отношению к исходному препарату, что соответствовало декомпактизации комплекса НК-белок и высвобождению НК. Этот процесс схематично может быть описан следующим образом:

НПК (раствор) <=> НК (раствор) + белок (сорбент)

Cö, мг/мл

] . 60

1.20

0.00

0 . 4 0 -J

0.00

pH Сб, мг/ мл

-8 Í.60-

Vnp

б)

—, I ,-1 I---1-1 J----.-1

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 CÖ, м:р/мл

Рисунок 8. Исчерпывающая по белку сорбция НПК на ВП-1 Ап (а). Зависимость константы Диссоциации НПК (Кдис) от концентрации в нем Белков (Сб)(б).

При этом константа диссоциации НГТК имеет вид:

_ [НК] [белок]

[нпк]

где [НК], [белок], [НПК] - концентрации НК, белка и НПК

соответственно.

На основании полученных данных были рассчитаны значения констант диссоциации НПК (I) и построен график зависимости Кднс от концентрации белка в НПК (I) (рис.7б). Вид полученной зависимости свидетельствует о кооперативном характере взаимодействия НК с белками в НПК (I). То есть, присоединение к комплексу каждой последующей молекулы белка протекает легче, чем предыдущей.

Таким образом, препарат НПК (I) включал в себя комплексы НК-белок переменного состава, в которых полиэлектролиты-носители ДНК и РНК связаны с эффекторной частью комплекса, представленной единичным слабо кислым белковым мажорным компонентом с молекулярной массой 30 кДа.

2.3 Исследование биологической активности НПК дрожжей

В работе впервые исследовали репарационную активность регуляторных белков, стабилизированных нуклеиновыми кислотами на культуре дрожжей, поврежденных УФ-светом и перекисью водорода. НПК добавляли к культуре клеток сразу после воздействия мутагенов. При этом наблюдали существенные изменения в динамике роста популяции по сравнению с угнетенными облучением или окислением клетками (рис.8). В сверх малых концентрациях (<27 мкг НПК / мл клеточной суспензии или 10'13 М) НПК усиливали размножения клеток в популяции, что свидетельствовало о нормализации обмена и общего уровня клеточного гомеостаза [Burke D.J. 1991]. Наблюдаемая концентрационная зависимость являются характерной особенностью действия пептидных регуляторных веществ [Сазанов Л.А. 1992]. Ни отдельные компоненты комплекса, ни модельный комплекс РНК с убикитином подобных эффектов не проявляли. Это позволяет предположить, что активация метаболизма у пораженных дрожжей является следствием действия НПК и не связана с утилизацией компонентов комплекса в качестве питательных факторов.

К, час"1

Ъд С К, час-1

0.4-

контроль

перикись 0.2

1 ' 1 1 ' 1 1 1

-2.0 -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 Ъд С

Рисунок 8. Зависимость константы скорости роста БассЬаготусе сегеушае (К) от концентрации НПК в растворе (С, мкг/мл). (а) - поел УФ-облучения, (б) - после действия перекиси водорода.

Принимая во внимание высокую эволюционную консервативность и универсальность регуляторных ядерных белков, исследовали действие НПК и его компонентов, выделенных на ионитах (КМТ и ВП-1Ап) на клетки крови человека лимфоциты (табл.3).

Таблица 3. Активность РНК и нуклеопротеиновых комплексов в реакции торможения миграции лейкоцитов.

Препарат мм,; Концентрация, мг/мл Удельная активность,

Белок рнк: ДНК: УЕ/ мг белка

РНК 200 - 0.01 - 2.0

РНК 200 - 0.06 - 10.0

Ядерный белок 30 0.10 - - 3.8

НПК(1) 1400 0.018 0.01 0.002 41.6

НПК-КМТ-1 600 0.012 - 0.004 43.3

НПК-КМТ-2 310. 0.01 0.005 - 28.0

Убикитин 8.5 0.01 - - 51.0

Конка навалин 27 0.01 - - 58.0

Препараты НПК проявляли выраженною митогенную активность. Причем, РНК в тех концентрациях, в которых она присутствует в исследуемых комплексах (до 0.01 мг/мл), проявляла малое активирующее воздействие на лейкоциты. Наибольшая митогенная активность соответствовала НПК, включающему большее количество ДНК, препарат толученный на КМТ (НПК-КМТ-1). Ядерный белок, выделенный *йа шионите ВП-1Ап проявлял низкую удельную активность. Вероятно, эелки в свободном состоянии подвержены интенсивному протеолизу или тагибированию компонентами плазмы крови, тогда как в связанном с НК состоянии они защищены от подобных воздействий.

Процессы репарации НК и особенно митохондриальной ДНК шеют большое значение для коррекции функций поврежденных или

стареющих тканей [Jazwinski S.M. 1990, Bohr V.A. 1999]. Природ

НПК могут стать основой для создания новых лечебных

профилактических препаратов, устойчивых к действию гидролитичес

ферментов желудочно-кишечного тракта.

ВЫВОДЫ

1. Разработан воспроизводимый метод выделения устойчш комплексов нуклеиновых кислот (НК) с ядерными белками (НПК культуры пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

2. Методом гель-хроматографии проведена оценка молекулярных м НПК, входящих в состав полученного суммарного препарг Вискозиметрически определена молекулярная ма высокомолекулярной фракции препарата - НПК (I), кото соответствует 1430 кДа. Соотношение белок:НК в комплексе - 2. (по весу). Установлено, что НПК (I) устойчивы по отношении гидролизу панкреатической РНК-азой.

3. Методом УФ-спектрофоггометрии обнаружен гиперхромный эфф при термической денатурации НПК, что свидетельствует о том, 1 НК в составе НПК (I) находятся в нтивном комплексе с НК.

4. Впервые методом ионообменной хроматографии провед« выделение белкового компонента из препарата НПК и оцеш константа диссоциации НПК (I). Концентрационная ависимо константы диссоциации свидетельствует о кооперативном харакл связывания НК с белковыми молекулами.

5. Методом электрофореза в ПААГ охарактеризована молекуляр! масса мажорного белкового компонента, входящего в состав НГ она составляет 30 кДа.

6. Впервые по кривым доза-эффект определен диапал антистрессорной активности НПК по отношению к клеткам дрож» Saccharomyces cerevisiae, подверженных воздействию УФ-облучен или перекиси водорода. Оптимальный положительный эффе наблюдался при концентрациях НПК 1-7 мкг/мл.

7. Показана митогенная активности НПК в реакции торможен миграции лейкоцитов. Показано, что очищенный белок компле* проявляет низкую удельную активность, тогда как активность Ш (I) сравнима с действием стандартных митогенов - конканавалина убикитина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Микрофильтрадия вязких жидкостей на трекмембранных модулях. Молодая фармация. СПб, 1998,-Вып. №1.- С. 14-19.

I. Минерально-полимерные пористые сорбенты для хроматографии нуклеиновых кислот. - В сб. «Всероссийский симпозиум по теории и практике хроматографии и электрофореза» М, 1998, стр. 72 (соавт. Чернова И.А., Шатаева Л.К.)

3. Фракционирование макромолекул при микрофильтрации вязких растворов. Журн. прикл. Химии. 1999, Т. 72, № 1, стр. 152-156. (соавт. Шатаева Л.К., Ряднова И.Ю., Потехина Т.С., Зеликсон Б.М.)

1. Нуклеопротеиновые комплексы дрожжей как основа для создания биологически активных пищевых добавок. - В сб. «Фармация в XXI веке: инновации и традиции» СПб, 1999, стр. 34-35 (соавт. Шатаева Л.К., Потехина Т.С.).

5. Комплексы нуклеиновых кислот с ядерными белками-регуляторами (НПК), выделенные из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae. - В сб. «Вестник Российского Государственного Медицинского Университета» М, 2000, стр. 180

5. Иммуномодулирующая активность нуклеопролеиновых комплексов (НПК) дрожжей Saccharomyces cerevisiae. - В сб. «Материалы VI итоговой открытой научно-практической конференции студентов и молодых ученых» Киров, 2000, Ч. 1, стр.60.

7. Получение комплекса нуклеиновых кислот с ядерными белками из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae. - В сб. «Фундаментальные и прикладные проблемы биотехнологии и медицины» СПб, 2000, стр. 50-51 (соавт. Шатаева Л.К.).

8. Хроматографическое разделение нуклеопротеиновых комплексов дрожжей. Труды 8-й Региональной научно-технической конференции «Проблемы химии и химической технологии» Воронеж, 2000, стр.257-260 (соавт. Шатаева Л.К.).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Синицкая, Наталья Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика и структурно-функциональная организация хроматина дрожжей Басскаготусея сегеУ1Я1ае.

1.2. Регуляция активности хроматина БасскаготусеБ сеге\18гае.

1.3. Биологическая активность ядерных белков-регуляторов.

1.4. Получение ядерных негистоновых белков дрожжей.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Метод получения НПК.

2.2.2. Метод фракционирования НПК при микрофильтрации.

2.2.3. Вискозиметрия.

2.2.4. Метод определения белка по Лоури.!.

2.2.5. Орциновый метод определения РНК.

2.2.6. Гель-хроматография.

2.2.7. Ферментативный гидролиз.

2.2.8. Бумажная хроматография.

2.2.9. Метод гель-электрофореза.

2.2.10. Ионообменная хроматография.

2.2.11. Приготовление буферных растворов.

2.2.12. Комплексообразование.

2.2.13. Реакция торможения миграции лейкоцитов.

2.2.14. Определение антистрессорной активности НПК.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Разработка метода выделения НПК из дрожжей

Басскаготусез сегеУ131ае.

3.3.1. Выбор экстрагента и термодинамических условий экстракции.

3.3.2. Фракционирование экстракта мембранной микрофильтрацией.

3.3.3. Осаждение НПК.

3.2. Исследование компонентного состава НПК дрожжей.

3.2.1. Изучение углеводного состава НПК.

3.2.2. Исследование белковых компонентов НПК.

3.2.3. Гель-хроматография НПК.

3.3. Изучение особенностей организации НПК дрожжей.

3.3.1. Фракционирование НПК на ионитах.

3.3.2. Исследование взаимодействия нуклеиновых кислот с белками по спектральным характеристикам.

3.4. Исследование биологической активности НПК дрожжей.

3.4.1. Исследование антистрессорного действия НПК.

3.4.2. Изучение митогенной ативности НПК.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нуклеопротеиновые комплексы дрожжей"

Актуальность проблемы. Традиционно применяемые в медицине биологически активные вещества (белки, ферменты, антибиотики и витамины) очень часто входят в состав лекарственных препаратов только в виде высо-коочищенных индивидуальных веществ. Однако, хорошо известно, что такие БАВ нестабильны и нуждаются в защите как от ферментативного гидролиза в физиологических условиях организма, так и от внешних неблагоприятных воздействий, разрушающих препараты при хранении.

Задача сохранения биологической активности в последнее время становиться особенно актуальной при получении и использовании в качестве лечебных и профилактических препаратов различного рода биорегуляторов белковой природы, таких как ядерные низкомолекулярные белки и пептиды. Биорегуляторной функцией обладают негистоновые белки хроматина (НГБ), унивесальные для всех эукариотических организмов. Эти белки контролируют и поддерживают на необходимом уровне процессы пролифера-;ни и дифференцировки в клетке. К ним относятся кейлоны (Мм 21-46 кДа), цитокины (Мм 10-27 кДа) и низкомолекулярные пептиды цитомедины (Мм 2-10 кДа). К настоящему времени наиболее изученными являются цитомедины и среди них негормональные и гормоноподобные факторы тимуса, обладающие имуномодулирующей активностью, и миелопептиды, выделенные из костного мозга. Остальные регуляторные белки изучены мало, а их использование затруднено вследствие высокой нестабильности. Например, использовать келоны, как регуляторы пролиферации на практике оказалось невозможным, так как сразу после введения они почти полностью разрушались з кровяном русле ферментативными системами организма.

В тоже время, хорошо известно, что для доставки в клетки не менее лабильного наследуемого материала в генной инженерии и генотерапии используют комплексы нуклеиновых кислот с полимерами-носителями различного характера, в том числе с белками. Комплексообразование с носителями обеспечивает стабилизацию их структуры и защищает препараты от действия эндогенных нуклеаз. Следует отметить, что нуклеиновые кислоты сами по себе являются естественными полиэлектролитами-носителями белков хроматина. Поэтому, выделение таких естественных комплексов нуклеиновых кислот с биорегуляторами белковой природы, позволяет не только сократить потери на стадиях выделения и очистки, но и расширяет спектр использования ядерных белков для различных медико-биологических целей, в том числе для тонкой коррекции стрессовых состояний организма или отдельных его функций.

С другой стороны, до последнего времени в качестве сырья для получения препаратов белков-биорегуляторов использовали органы и ткани крупного рогатого скота. Поиск и расширение сырьевых источников для получения новых препаратов является актуальной задачей биотехнологии. Изучение микроорганизмов, в частности дрожжей, в качестве источника для получения регуляторных пептидов и их комплексов с природными носителями представляется перспективным направлением, так как промышленная технология их выращивания хорошо освоена и легко масштабируется.

Цель данной работы состояла в получении комплексов нуклеиновых кислот с ядерными белками (НПК) из клеток пекарских дрожжей БассЪаго-тусеБ сегеугБгае, исследовании их компонентного состава и биологической активности. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: Во-первых, техническая задача разработки и оптимизации метода выделения нуклеопротеиновых комплексов дрожжей. Во-вторых, проблема фракционирования, определения компонентного состава и биологической активности комплексов нуклеиновых кислот с ядерными белками, препарата с высокой вязкостью и фазовой неустойчивостью.

Научная новизна работы. До начала настоящей работы дрожжевую биомассу традиционно использовали как сырье для получения белково-витаминных концентратов и для выделения нуклеиновых кислот и АТФ. В представляемой работе впервые был разработан и оптимизирован метод выделения нуклеопротеиновых комплексов (НПК) дрожжей, включающий стадию фракционирования и концентрирования НПК по молекулярной массе путем микрофильтрации на трек-мембранных модулях.

Впервые методами гель-хроматографии, вискозиметрии, электрофорезом в ПААГ, ионообменой хроматографией полученный препарат НПК дрожжей охарактеризован в отношении компонентного состава и молекулярных масс белка и нуклеиновых кислот. Доказана устойчивость высокомолекулярной фракции НПК (I) по отношению к ферментативному "расщеплению РНК-азой.

Впервые с помощью ионообменной хроматографии при различных соотношениях белок : нуклеиновая кислота изучена прочность связывания этих компонентов в комплексе и рассчитаны константы диссоциации НПК (I); показано, что связывание белка с нуклеиновой кислотой носит кооперативный характер.

Впервые исследована биологическая активность НПК (I) по отношению к культуре дрожжей, подверженных действию УФ-облучения или перекиси водорода; показано, что НПК (I) усиливает размножение клеток, угнетенное действием мутагенных факторов.

Впервые исследована митогенная активность НПК (I) и его компонентов. Показано, что высокоочищенный белок проявляет низкую митогенную активность, тогда как в комплексе с РНК его активность значительно увеличивается.

Практическая ценность работы. Полученные результаты по выделению и характеристике НПК дрожжей увеличивают спектр возможных сырьевых источников для получения биорегуляторов и позволяют сделать технологию их получения более простой и экономичной. Кроме того, НПК могут быть использованы для разработки новых пищевых биологически активных добавок и лечебных препаратов, в том числе пролонгированного действия, перспективных для восстановления жизненно важных функций организма, ослабленных токсическими или радиационными воздействиями.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Синицкая, Наталья Сергеевна

выводы

1. Разработан воспроизводимый метод выделения устойчивых комплексов нуклеиновых кислот (НК) с ядерными белками (НГЖ) из культуры пекарских дрожжей БассИаготусез сеге\>Ыае.

2. Методом гель-хроматографии проведена оценка молекулярных масс НПК, входящих в состав полученного суммарного препарата. Вискозиметрически определена молекулярная масса высокомолекулярной фракции- препарата - НПК (I), которая соответствует 1430 кДа. Соотношение белок:НК в комплексе - 2.6:1 (по весу). Установлено, что НПК(1)устойчивы по отношению к гидролизу панкреатической РНК-азой.

3. Методом УФ-спектрофотометрии обнаружен гиперхромный эффект при термической денатурации НПК, что свидетельствует о том, что НК в составе НПК (I) находятся в нативной форме.

4. Впервые методом ионообменной хроматографии проведено выделение белкового компонента из препарата НПК и оценена константа диссоциации НПК (I). Концентрационная зависимость константы диссоциации свидетельствует о кооперативном характере связывания НК с белковыми молекулами.

5. Методом электрофореза в ПААГ охарактеризована молекулярная масса мажорного белкового компонента, входящего в состав НПК; она составляет 30 кДа.

6. Впервые по кривым доза-эффект определен диапазон антистрессорной активности НПК по отношению к клеткам дрожжей Засскаготусея сегеу{51ае, подверженных воздействию УФ-облучения или перекиси водорода. Оптимальный положительный эффект наблюдался при концентрациях НПК 1-7 мкг/мл.

7. Показана митогенная активность НПК в реакции торможения миграции лейкоцитов. Показано, что очищенный белок комплекса проявляет низкую удельную активность, тогда как активность НПК (I) сравнима с действием стандартных митогенов - конканавалина и убикитина. мо

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Синицкая, Наталья Сергеевна, Санкт-Петербург

1. Абакунин Д.Н., Замулаева И.А., Поверский A.M. Гистоны вызывают гибель тимоцитов in vitro. Гистонсвязывающие иммуноглобулины уменьшают их цитотоксичные свойства/ТВиохимия. - 1999. - Т. 64, № 6. - С. 830-835.

2. Альтман С. Ферментативное расщепление РНК посредством РНК. Из "Ферментативная активность РНК: Нобелевские лекции"/Под ред. Г.Цех. М.: Знание, 1991. - 29 с.

3. Анисимов В.Н. Современные представления о природе старения//Успехи совр. биол. 2000. - Т. 120, № 2. - С. 146-164.

4. Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х. Применение пептидных препаратов эпифиза в онкологии: двадцатилетний опыт исследований эпиталамина/ЛЗопр. онкологии. 1993. - Т. 39, № 4-6. - С. 131-142.

5. Ашмарин И.П., Каменская М.А. Нейропептиды в синоптической передаче//Итоги науки и техники.- 1988.- Т.34, №1. С. 1-184.1.l

6. Бакаев B.B. Роль отдельных фракций гистонов и негистоновых белков в структурно-функциональной организации хроматина: Автореф. дис. докт. биол. наук. М., 1983. - 44 с.

7. Барай В.Н., Кухарская Т.Н., Зинченко А.И. Получение высокоочищен-ной РНК из дрожжей с помощью ионов Са2+//Прикладн. биохим. и микробиология. 1995.-Т. 31, № 5.-С. 494-497.

8. Беглов Д.Б. Структура и динамика комплексов ДНК с растворителем: Автореф. дис. канд. физ.-мат. наук.-М., 1991.-21 с.

9. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. М.: Медицина, 1990.-528 с.

10. Босток К., Саммор Э. Хромосома эукариотической клетки/Под ред. А.Ф.Захарова. М.: Мир, 1981.-450 с.

11. Бреслер С.Е. Введение в молекулярную биологию. M.-JL: Наука, 1966. -514с.

12. Брок Т. Мембранная фильтрация. М.: Мир, 1987. - 462 с.

13. Броунштейн Б.И., Железняк A.C. Физико-химические основы жидкостной экстракции. Изд-во: Химия, 1966. - 154 с.

14. Василенко A.M., Захарова JI.A. Цитокины в сочетании регуляции боли и иммунитетаУ/Успехи совр. биологии. 2000. - Т. 120, № 2. - С. 174-189.

15. Воробьев В.И. Наднуклеосомная организация хроматина. В книге "Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии": сб. науч. трудов.- JI.: Наука, 1986.-253 с.

16. Гавин И.М. Влияние ионной силы раствора на структуру минимальных нуклеосом: Автореф. дис. канд. биол. наук.-М., 1992.-20 с.

17. Галзитская O.B. Теоретическое моделирование самоорганизации гете-рополимерных глобул: белок и РНК: Автореф. дис. канд. биол. наук.- Пущино: Институт белка РАН, 1995. 16 с.

18. Гинейтис А. Белки хроматина. Вильнюс: Мокслас, 1988. - 144 с.

19. Голуб Е.И., Дворкин Г.А., Назаренко В.Г. Об оценке жесткости молекул ДНК в растворе//Биохимия. 1963. - Т. 28, № 6. - С. 1048-1056.

20. Детерман Г. Гель-хроматография. М.: Мир, 1970. - 252 с.

21. Егорова В.Т. Исследование стабильности ДНК и ее комплексообразова-ния с остаточными примесными белками: Автореф. дис. канд. биол. наук. Ереван, 1991. - 18 с.

22. Елинов Н.П. Химия микробных полисахаридов. М.: Высшая школа,1984.-256 с.

23. Ерохина Л.И., Алиханян С.И. Влияние эффекта фотореактивации на мутационный процесс у продуцентов стрептомицина Streptomyces griseus (Actynomyces globisporus streptomycini)//Докл. AH.CCCP. 1956. - № 3. -С. 703-705.

24. П. де Жен Идеи скейлинга в физике полимеров. М.: Мир, 1982. -368 с.

25. Заец В.Н. Влияние мочевины и ионной силы раствора на структуру минимальных нуклеосом: Автореф. дис. канд. биол. наук. Киев, 1989.- 16 с.

26. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука, 1984. - 144 с.

27. Земсков В.М., Лидак М.Ю., Земсков А.М. и др. Низкомолекулярная РНК: получение, гидролиз и применение в медицине. Рига: Зинатне,1985.- 191 с.

28. Зенгер В. Нуклеиновые кислоты. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М.: Мир, 1987. - 584 с.

29. Иванов Г.С. Исследование нуклеосомного уровня организации хроматина из клеток, различающихся по характеру дифференцировки: Авто-реф. дис. канд. биол. наук. СПб, 1996. - 24 с.

30. Инге-Вечтомов С.Г., Карпова Т.С. Частная генетика дрожжей-сахаромицетов. СПб: СПб университет, 1993. - с. 150.

31. Ионообменные материалы для процессов гидрометаллургии, очистки сточных води водоподготовки. Справочник М.: ВНИИХТ, 1983. — 207 с.

32. Карпов А.М., Ляпин В.А., Свитцов A.A. Состояние и перспективы мембранной техники в микробиологической, пищевой и медицинской про-мышленности//Биотехнология. 1989. - Т. 5, № 3. - С. 260-276.

33. Касаткин А .Г. Основные процессы и аппараты химической технологии. -М.: Химия, 1971.-784 с.

34. Кейлоны. Значение и роль в нормальных и патологических процессах: , Материалы I совещания. Москва, 1980. - с.

35. Кожемякин А.Л., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Участие циклазной системы в молекулярных механизмах регуляции дифференцировки имму-нокомпетентных клеток//Биохимия.- 1984. Т. 49, №4. - С. 658-666.

36. Кокотов Ю.В., Золотарев П.П., Елькин Г.Э. Теоретические основы ионного обмена. Л.: Химия, 1986. - 213 с.

37. Крылов И.А., Волкова Н.В., Ву Тхи Фыонг Ань и др. Кинетика экстракции полинуклеотидов из клеток дрожжей и метанутилизирующих бак-терий//Биотехнология. 1996. - № 7. - С. 52-58.

38. Кузнецова H.H., Геиендер K.M., Самсонов Г.В. и др. Авторское свидетельство СССР № 322332//Бюл. изобр. 1971. - № 36. - С. 52.

39. Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Цитомедины и их роль в регуляции физиологических функций//Успехи совр. биол. 1995. - Т. 115, №3.-С. 353-367.

40. Кураков В.В., Свитцов A.A. Тезисы докладов IV Всесоюзной конференции по мембранным методам разделения смесей (IV ВКММ). М.: НИИТЭХИМ, 1987.-Т. 5.-С. 16.

41. Куций М.П., Кузнецова Е.А., Газлев А.И. Участие протеаз в апопто-зе//Биохимия. 1999. - Т. 64, № 2. - С. 149-163.

42. Кучеренко Н.Е., Цудзевич Б.А., Блюм Я.Б., Бабенюк Ю.Д. Биохимическая модель регуляции активности хроматина. Киев: Наукова Думка, 1983.-245 с.

43. Лабораторные методы исследования в клинике/Под ред. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987.

44. Меленевский А.Т. Чижова Е.Б., Папукова К.П. Сорбция белков лизоци-ма и цитохрома С на карбоксильном катионите КМДМ-6-5// Журн. физ.химии. 1999,-Т.73, №11.-С. 2068-2071.

45. Меленевский А.Т., Чижова Е.Б., Папукова К.П. Многокомпонентная сорбция белковых систем лизоцим цитохром С и рибонуклеаза - ци-тохром С на карбоксильном катионите КМДМ-6-5//Журн. физ.химии. -2000. - Т.74, №8. - С. 1454-1457.

46. Методы селекции продуцентов антибиотиков и ферментов. Л.: Медицина, 1978.- 160 с.

47. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Кожемякин А.Л. и др. Влияние полипептидного фактора тимуса на синтез циклических нуклеотидов иммуно-компетентных клеток//Вопросы мед. химии. 1982. - Т. 28, №4. - С. 114-118.

48. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. -М.: Наука, 1971. 410 с.

49. Мчедлишвили Б.В., Флеров Р.И. Ядерные мембраны//Ж. Всесоюз. Хим. Общества. 1987. - № 1. - С. 641-647.

50. Надеж ;ин ГО.С., Шатаева JI.K., Кузнецова H.H. и др. Исследование структуры специальных сорбентов методом малоуглового рентгеновского рассеяния//Высокомолекулярные соединения сер. А. 1975. - Т. 17.-С. 448-451.

51. Начинкин О.И. Полимерные микрофильтры. М.: Химия, 1985. - 216 с.

52. Новаковская С.С., Шишацкий Ю.И. Производство хлебопекарных дрожжей: Справочник. -М.: Агропромиздат, 1990. 335 с.

53. Нуклеиновые кислоты/Под ред. И.Б.Збарского. М.: Мир, 1966. - 416 с.

54. Нуклеиновые кислоты. Химия и биология/Под ред. Э.Чаргаффа и Дж.Девидсона. М.: Иностранная литература, 1957. - 550 с.

55. Нуклеиновые кислоты/Под ред. Э.Чаргаффа и Дж.Девидсона. М.: Иностранная литература, 1962. - 456 с.

56. Остерман JLA. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. - 286 с.

57. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.-536 с.

58. Петров Р.В., Михайлова A.A., Фонина Л.А. Эндогенные иммуномодуля-торные пептиды (миелопептиды): структура, функция, механизм дейст-вия//Биоорганическая химия. 1999. - Т. 25, № 11. - С. 811-815.

59. Петров С.В., Зенкевич В.Б., Кадышев М.К. и др. Ультрафильтрационная аппаратура//Биотехнология. 1989. - № 1. - С. 65.

60. Плевалко Е.А. Технология дрожжей. М.: Пищевая промышленность, 1970.-300 с.

61. Повреждения и репарация ДНК: Сб. статей. Пущино: НЦБИ АН СССР, 1980.-204 с.

62. Рамм Е.И., Иванов Г.С., Воробьев В.И. Исследование структурной организации хроматина из различных источников//Биохимия. 1993. - Т. 58, № 10.-С. 1604-1615.

63. Романов Ю.А., Кетлинский С.А., Антохин А.И., Окулов В.Б. Кейлонная регуляция деления клеток. М.: Медицина, 1984. - 207 с.

64. Ромачевская Г.М., Зверева JI.H. Некоторые биологические и химические свойства кейлоноподобных протеогликанов. В сб. "Кейлоны. Значение и роль в норме и патологических процессах" М.: 2-й Гос. Мед. Ин-т, 1981.-С. 104.

65. Ряднова И.Ю., Шатаева JI.K., Хавинсон В.Х. Трансспецифические нук-леопротеиновые комплексы//Вопросы мед. химии. 2000. - Т. 46, № 1. -С. 62-71.

66. Самсонов Г.В. Сорбция и хроматография антибиотиков. M.-JL: Изд. АН СССР, 1960.

67. Сандер Ю.К. Технология и оборудование галеновых производств. M.-JL: Гос. изд-во мед. лит-ры, 1956. - 185 с.

68. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. М.: Агропромиздат, 1990. - 240 с.

69. Современная технология фильтрации в фармацевтической промышленности и в процессах ферментации: Технические предписания/Фирма "Палл" (Германия). Драйх, 1989. - 134 с.

70. Справочник биохимика: Пер. с англ. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К.-М.: Мир, 1991.-544 с.

71. Структура и генетическое значение белков хроматина эукариот. В сборнике: Биология гистонов/Под ред. Г.Д.Бердышева. Киев: Наукова Думка, 1985.- 116 с.

72. Структурно-функциональные аспекты репликации и репарации ДНК: Материалы симпозиума "Молекулярные механизмы репликации. Репарации и рекомбинации в норме и при действии облучения у эукариот", 30 марта 2 апреля 1983 года. - Пущино, 1983. - 192 с.

73. Тищенко Г.А., Потехина Т.С., Елинкова М. и др. Сорбционная иммобилизация белков на синтетических полиамфолитах//Прикл. биохим. и микробиол. 1991. - Т. 27, № 5. - С. 695-700.

74. Трахт Н.И., Гроздова И.Г., Гнучев Н.В. Эволюционные аспекты биологического действия циклических нуклеотидов. В кн. "Сборка предбио-логических и биологических структур". М.: Наука, 1982. - С. 285-295.

75. Трофимова С.В., Хавинсон В.Х. Применение пептидных биорегуляторов в офтальмологии//Вестник офтальмол. 1999. - Т. 115, № 5. - С. 42-45.

76. Фердман Д.Л. Биохимия. М.: Высшая школа, 1966. - 644 с.

77. Федорова Т.А., Терещенко О.Я., Мазурик В.К. Нуклеиновые кислоты и белки в организме при лучевом поражении. М.: Медицина, 1974. -408 с.

78. Хавинсон В.Х. Влияние препарата, выделенного из сердца на биоэнергетику кардиомиоцитов в условии гипоксии и ишемии//Патол., физиол. и эксперим. терапия. 1992. - № 2. С. 20-24.

79. Хавинсон В.Х., Жуков В.В. Пептиды тимуса и механизмы иммунорегу-ляции//Успехи совр. биологии. 1992. - Т. 112, № 4. - С. 554-570.

80. Хавинсон В.Х., Кожемякин А.Л., Морозов В.Г. и др. Влияние тималина на биохимические и иммунологические показатели дифференцировки и функциональной активности лимфоцитов//Вопросы мед. химии. 1990. -Т. 36, №3.-С. 41-43.

81. Хавинсон В.Х., Морозов В./З.Тималин и его иммунобиологическая активность. Иммунобиология гормонов тимуса. Киев: Здоровье, 1989. -С. 125-142.

82. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., Малинин В.В. Регуляция препаратом эпифиза антиоксидантной системы при старении//Цитология. 1999. -Т. 49,№9.-С. 790-791.

83. Хавинсон В.Х., Морозов В. Г., Супиев Т.К. и др. Влияние полипептидного фактора тимуса на дифференцировку и функциональную активность Т- и В-лимфоцитов//Изв. АН Каз.ССР. Сер. биол. 1983. - № 1. -С. 78-82.

84. Хавинсон В.Х., Прокопенко Н.П., Тигранян Р.А. и др. Характеристика кислотного экстракта эпифиза и его фракций//Вопросы мед. химии. -1989.-Т. 35, №4.-С. 79-81.

85. Харенко О.В., Изумрудов В.А., Зезин А.Б. и др. Процессы ассоциации-диссоциации в растворах нестехиометричных полиэлектролитных ком-плексов//Высокомолекулярные соединения. 1980. - № 1. - С. 218-223.

86. Храпулов Н.С., Драган А.И., Бердышев Г.Д. Структура и функции хроматина. Киев: Выща школа, 1987.

87. Хроматин и нуклеосомы. В сборнике "Итоги науки и техники. Молекулярная биология" М., 1988. - Т. 26. - С. 27.

88. Хроматография на бумаге /Под. ред. И.М. Хайса, X. Мауеха. М.: Иностранная литература, 1962. - С. 725.

89. Цапюк Е.А., Медведев М.И., Брок М.Т. Ультрафильтрация дезинтеграта хлебопекарных дрожжей//Биотехнология. 1993. - Т. 5, № 5. - С. 165.

90. Цветков В.Н. Жесткоцепные полимерные молекулы. Л.: Наука, 1986. -380 с.

91. Чернохвостов В.В., Стальмагнук В.Я., Разин C.B. Состав, строение и различные свойства комплексов ДНК с белками, расположенных вучастках крепления петель ДНК к ядерному скелету//Мол. биология. -1986. -Т. 20, №6. -С. 1579-1588.

92. Шаблина С.А. Текстуальный и статистический анализ регуляторных последовательностей ДНК и РНК: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1994.-23 с.

93. Шатаева JI.K., Кузнецова Н.Н., Елькин Г.Э. Карбоксильные катиониты в биологии. JL: Наука, 1979. - 286 с.

94. Шатаева JI.K., Ряднова И.Ю. Потехина Т.С. и др. Фракционирование макромолекул при микрофильтрации вязких растворов//Ж. прикл. химии. 1999.-Т. 72, № 1.-С. 152-156.

95. Шатаева JI.K., Ряднова И.Ю., Хавинсон В.Х. Интерполимерные комплексы дезоксирибонуклеиновой кислоты с белком//ЖПХ. 1999. - Т. 72, №6.-С. 982-985.

96. Яковлев Г.М., Хавинсон В.Х., Серый С.В. и др. Биохимические и иммунологические показатели в реабилитационном периоде у пострадавших в результате аварии атомной подводной лодки "Комсомо-лец7/Военно-мед. журнал. 1991. № 9. - С. 28-33.

97. Ahn S.H., Acurio A., Kron S.J. Regulation of G2/M progression by the STE mitogen-activated protein kinase pathway in budding yeast filamentous growth//Mol. Biol. Cell. 1999.-Vol. 10, N 10.-P. 3301-3316.

98. Akada R., Murakane Т., Nishizawa Y. DNA extraction method for screening yeast clones by PCR//Biothechniques. 2000. - Vol. 28, N 4. - P. 672-674.

99. Allain F.H., Yen Y.M., Masse J.F. et al. Solution structure of the HMG protein NHP6A and its interaction with DNA reveals the structural determinants for non-sequence-specific binding//EMBO J. 1999. - Vol. 18, N 9. - P. 2563-2579.

100. Atienza J.M., Suh M., Xenarios I. et al. Human ERK1 induces filamentous growth and cell wall remodeling pathway in cerevisiaellJ. Biol. Chem. -2000. Vol. 275, N 27. - P. 20638-20646.

101. Audhya T., Scheid M.P., Goldstein G. Contrasting biological activities of thymopoietin and splenin, two closely related polypeptide products of thymus and spleen// Proc. Nation. Acad. Sci. USA. 1984. - Vol. 81. - P. 28472849.

102. Baarends W.M., Hoogerbrugge J.M., Roest H.P et al. Histone ubiquitination and chromatin remodeling in mouse spermatogenesis//Dev. Biol. 1999. -Vol. 207, N2.-P. 322-333.

103. Baarends W.M., Roest H.P., Grootegued J.A. The ubiquitin system in game-togenesis//Mol. Cell. Endocrinol. 1999. - Vol. 151, N 1 -2. - P. 5-16.

104. Basha S.Y., Paladively P. Two simple non-enzymatic procedures to isolate high molecular weight DNA from fungi//Current Science. 1995. - Vol. 68, N6.-P. 587-588.

105. Bastians H., Topper L.M., Gorbsky G. et al. Cell cycle-regulated proteolysis of mitotic target proteins//Mol. Biol. Cell. 1999. - Vol. 10, N 11. - P. 39273941.

106. Beaudenon S.L., Huacani M.R., Wang G. et al. Rsp5 ubiquitin-protein ligase mediates DNA demage-induced degradation of the large subunit of RNA polymerase II in S. cerevisiae/Mol Cell. Biol. 1999. - Vol. 19, N 10. - P. 6972-6979.

107. Bitter G.A., Tsai M.M., Putzke A.P. et al. Intergenic complementation mutants of cyclin-dependent kinase//Mol. Gen. 2000. - Vol. 263, N 2. - P. 222-231.

108. Blazsek I., Gaol D. Endogenous thymic factors regulating cell prolifiration and analysis of their mechanism of action//Cell. Tissue. Kinet. 1978. - Vol. 11,N3.-P. 265-277.

109. Bloomfield V.A. DNA condensation by multivalent cations//Biopolymers, Nucleic Acid Sciences. 1997. - Vol. 44, N 3. - P. 269-282.

110. Bohr V.A., Anson R.M. Mitochondrial DNA repair pathway//! Bioenergetics and Biomembrans. 1999. - V. 31, N 4. - P. 391-398.

111. Brandt W.F., van Holt C.//Eur. J. Biochem. 1982. - Vol. 121. - P. 501-510.

112. Broack J.R., Pringle J.R., Jones E.V. The molecular and cellular biology of the yeast Saccharomyces. Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1991. -350 p.

113. Broomfield S., Chow B.L., Xiao W. MMS2, encoding a ubiquitin-conjugating-enzyme-like protein, is a member of the yeast error-free postreplication repair pathway// Proc. Nation. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95,N 10.-P. 5678-5683.

114. Browen J.C., Hunt R.C. Lectins//Int. Rev. Cytology. Vol. 52. - P. 277.

115. Burke D.J., Church D. Protein synthesis requirements for nuclear division, cytokinesis and cell separation in Saccharomyces cerevisiae//Mo\. and Cell. Biol. 1991. - V. 11, N 7. - P. 3691-3698.

116. Cameron Ewen D., Sved S., Solyom L. et al. Effects of ribonucleic acid on memory defect in the aged//Amer. J. Psychiat. 1963. - Vol. 120. - P. 320325.

117. Cenciarelli C., Chiaur D.S., Guardavacearo D. et al. Identification of femily of human F-box proteins//Curr. Biol. 1999. - Vol. 9, N 20. - P. 1177-1179.

118. Chen K.C., Csikazz-Nagy A., Gyorffy B. et al. Kinetic analysis of a molecular model of the budding yeast cell cycle//Mol. Biol. Cell. 2000. - Vol. 11, N 1.-P. 369-391.

119. Choe J., Kolodrubertz D., Grunstein M.//Proc. Nation. Acad. Sci. USA. -1982. Vol. 79. - P. 1484-1487.

120. Choi Y.J., Kim S.K., Lee K.S. et al. Saccharomyces cerevisiae Ste5 is important for induction and substrate specificity of Fus3 MAP kinase in thepheromone signaling pathway//Mol. Cells. 2000. - Vol. 10, N 3. - P. -301-308.

121. Concanavalin A as a tool/Ed. by Bittigs H. and Schnebli H.P. London: J. Wilegand Sons., 1976.

122. Craig K.L., Tyers M. The F-box: a new motif for ubiquitin dependent proteolysis in cell cycle regulation and signal transduction//Prog. Biophys. Mol. Biol. 1999. - Vol. 72, N 3. - P. 299-328.

123. Cytrynska M., Wojda I., Frajnt M. et al. PKA from Saccharomyces cere-visiae can be activated by cyclic AMP and cyclic GMP//Can. J. Microbiol. -1999.-Vol. 45, N l.-P. 31-37.

124. Detre K., Finch S. //Science. 1958. - Vol. 128, N 3325. - P. 656.

125. Dimova D., Nackerdien Z., Furgeson S. et al. A role for transcriptional repressors in targeting the yeast Swi/Snf complex//Mol. Cells. 1999. - Vol. 4, N l.-P.-75-83.

126. Dube P., de Costanze A., Konopka J.B. Interaction between transmembrane domains five and six of the alpha-factor receptor//J. Biol. Chem. 2000. -Vol.

127. Dynlacht B.D. Regulation of transcription by protein, that control the cell cy-cle//Nature. 1997. -Vol. 389.-P. 149-152.

128. Eckstein H., Flugge B. Guanosine 3'-5'-cyclic monophosphat-dependent particulate protein kinase activity from yeast (Saccharomyces cerevisiae)IIZ. Naturforsch. 1999. - Vol. 54, N 1-2. - P. 84-93.

129. Feng Y., Davis N.G. Feed back phosphorylation of the yeast cc-factor receptor requires activation of the downstream signaling pathway from G protein through mitogen-activated protein kinase//Mol. Cell. Biol. 2000. - Vol. 20, N2.-P. 563-574.

130. Fleishmann J., Howard D.H. The DNA content of nongerminative variants of Candida albicans/fNucWic Acids Reseach. 1988. - Vol. 16, N 2. - P. 765.

131. Fraser A, Jemes C. Fermenting debate: do yeast undergo apoptosis//Trends in Cell. Biol. 1998. - Vol. 8. - P.

132. Furukawa K, Mizushima N, Noda T. et al. A protein cojugation system in yeast with homology to biosynthetic enzyme reacrion of procaryotes//J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275, N 11. - P. 7462-7465.

133. Gailit J. Identification of proteins whose synthesis in S. cerevisiae is induces by DNA damage and heat shock//Int. J. Radiate Biol. 1990. - V. 57, N 5. -P. 981-992.

134. Gel electrophoresis of proteins: a practical approach/Ed. by B.D.Hames, D. Rickwood. London: IRL Press, 198l.P. 205.

135. Geneitis A.A., Suchilim S.P, Shonbhag V.P. Dissotiation and isolation of chromatin proteins in salt solution by an aquaeus two-phase system//Anal. Biochem.- 1984.-V. 139.-P. 400-403.

136. Glassner B J," Mortimer R.K. Synergestic interactions between RAD5, RAD16 and RAD54, three parbially homologous yeast DNA repair genes each in a different repair pathway//Radiat. Res. 1994. - V. 139, N 1. - P. 24-33.

137. Goldstein G. Immune regulation by characterized polypeptides//UCLA Symp. Mol. and Cell. Biol. New Ser. 1987. - V. 41.-P. 51.

138. Goodall G.J, Horecker B.L. Immune regulation by characterized polypep-tides//UCLA Symp. Mol. and Cell. Biol. New Ser. 1987. - V. 41. - P. 283.

139. Griffioen G, Anghileri P, Imre E. et al. Nutritional control of nucleocyto-plasmic localization of cAMP-dependent protein kinase catalytic and regulatory subunits in Saccharomyces cerevisiae!/J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275, N2.-P. 1449-1456.

140. Gross A., Winograd S., Marbach I. et al. The N-terminal half of Cdc25 is essential for processing glucose signaling in Saccharomyces cere-visiaeimochemistry. 1999. - Vol. 38, N 40. - P. 13252-13262.

141. Grossberger R., Gieffers C., Zachariae W. et al. Characterization of the Docl/APCIO subunit of the yeast and the human anaphase-promoting complex//! Biol. Chem.~ 1999.-Vol. 274, N20.-P. 14500-14507.

142. Guthrie C., Fink G. Methods in enzymology.Y. 194. Guide to yeast genetics and molecular biology. Academic press Inc., 1991.

143. Haggren W., Kolodrubertz D. The The Saccharomyces cerevisiae Acp2 gene encodes an essential HMGl-like protein//Mol. Cell. Biol. 1998. - Vol. 8, N3.-P. 1282-1289.

144. Hanion S., Brudno S., Wu T.T., Wolf B. Structural transitions of deoxyribonucleic acid in aqueous electrolyte solutions. I. Reference spectra of conformation limits//Biochemistry. 1975. -V. 14, N 8. - P. 1648-1660.

145. Harvey K.F., Kumar S. Nedd4-like proteins: an emerging family of ubiquitin-protein ligases implicated in diverse cellular functions//Trends Cell. Biol. -1999. Vol. 9, N 5. - P. 166-169.

146. He S., Arscott P.G., Bloomfield V.A. Condensation of DNA by multivalent cations: Experimental studies of condensation kinetics//Biopolymers, Nucleic Acid Sciences. 2000. - Vol. 53, N4.-P. 329-341.

147. Hochstrasser M., Johnson P.R., Arendt C.S. et al. The Saccharomyces cerevisiae ubiquitin-proteasome system//Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei. 1999. - Vol. 354, N 1389. - P. 1513-1522.

148. Hopkins T.R. Physical and chemical cell disruption for the recovery of intracellular proteins//Bioprocess Technol. 1991. - Vol. 12. - P. 57-83.

149. Hollaender A., Emmons C. Wavelength dependence of mutation production the ultraviolet with special emphasis on fiingi//Gold. Spr. Harb. Symp., Quant. Biol. 1941. - V. 9. -P. 179-186.

150. Iwanejko L., Smith K.N., Loeillet S. et al. Disruption and functional analysis of six ORFs chromosome XV: YOL 117w, YOL 115w (TRF4), YOL 114c, YOL 112w (MSB4), YOL 111c and YOL 072w//Yeast. -1999. Vol. 15, N 14.-P. 1529-1539.

151. Ink B., Zbrnig M., Baum B. et al. Human bak induces cell death in Shizosac-charomyces pomhe with morfological changes similar to those with apoptosis in mammalian cells//Mol. and Cell. Biol. 1997. - Vol. 17, N 5. -P. 2468-2474.

152. Janion C. Mutageneza, naprawa i ekspresia DNA//Nauka, informacija, biznes.- 1993.-V. 1,N2.-P. 16.

153. Jaspersen S.L., Charles J.F., Tinker Kulberg R.L. et al. A late mitotic regulatory network controlling cyclin "destruction in Saccharomyces cere-visiae/Mol Biol. Cell. 1998. - Vol. 9,N 10. - P. 2803-2817.

154. Johnson E.S., Biobel G. Cell cycle-regulated attachment of the ubiquitin-related protein SUMO to the yeast septins//J. Cell. Biol. 1999. - Vol. 147, N 5.-P. 981-994.

155. Karp G. Cell biology. -N.Y.: McCraw-Hill Inc., 1979. 846 p.

156. Kaye F.J., Modi S., Ivanovskay I. et al. A family of ubiquitin-like proteins bind the ATP-ase domain of Hsp70-like Stch//FEBS Lett. 2000. - Vol. 467, N2-3.-P. 348-355.

157. Klug A. Gene regulatory proteins and their interaction with DNA: the double helix. Perspective and prospective at forby years//Annals of the New York Academy of Sciences.- 1995. -V. 758.-P. 143-160.

158. Koch C.S., Nathmyth K. Cell cycle regulated transcription in yeast//Curr. Opin. Cell. Biol. 1994. - N 6. - P. 451-459.

159. Koch C., Scheiffer S., Ammerer G. et al. Switching transcrption on and off during the yeast cell cycle: CLn/Cdc 28 kinases activate bound transcription factor SBF (Swi4/Swi6) dt sart//Genes. Rev. 1996.-Vol. 10. - P. 129-141.

160. Kodadek T. Mechanistic parallels between DNA replication, recombination and transcription//Trends Biochem. Sci. 1998. - Vol. 23. - P. 79-83.

161. Ladomery M. Multifunctional proteins suggest connection between transcriptional and posttranscriptional processes//Bio Essays. 1997. - Vol. 19. -P. 903-909.

162. Laudry J., Sutton A., Tafrov S.T. et al. The silleneing protein SIR2 and its homologs are NAD-dependent protein-deacetylases// Proc. Nation. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97, N 11. - P. 5807-5811.

163. Liao H.H., Thorher J. Adenosine 3'-5'-phosphate phosphodiesterase and pheromone response in the yeast Saccharomyces cerevisiae//J. Bacteriol. -1981.-Vol. 148,N3.-P. 919-925.

164. Loeb J.D., Sepulveda-Becerra M., Hazan I. et al. A G1 cyclin is necessary for maintenance of filamentous growth in Candida albicans//Mol. Cell. Biol. 1999.-Vol. 19, N6.-P. 4019-4027.

165. Londesborough J., Nuutinen M. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase in S. cerevisiae!/FEBS Lett. 1987. - Vol. 219, N 1. - P. 249-253.

166. Lord P.L., Wheals A.E. Variability in individual cell cycles of Saccharomyces cerevisiae//. Cell. Sci. 1981. - Vol. 50, N 2. - P. 361-376.

167. Lorenz M., Hillisch A., Payet D. et al. DNA binding induced by high mobility group proteins studied by fluorescence resonance energy trans-fer//Biochemistry. -1999. Vol. 38, N 37. - P. 12150-12158.

168. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent//J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193, N 1. - P. 265-275.

169. Manning G.S. The molecular theory of polyelectrolyte solution with applications of the electrolitic properties of polynucleotides//Quaterly reviews of biophysics. 1978.-V. 11, N2.-P. 176-246.

170. Mao Y., Sun M., Desai S.D. et al. SUMO-1 conjugation to topoisomerase I, a possible repair response to topoisomerase-mediated DNA demage//Proc. Nation. Acad. Sei. USA. 2000. - Vol. 97, N 8. - P. 4046-4051.

171. Mathias N., Steussy C.N., Goebl M.G. An essential domain within Cdc34p and Cdc53p in the Saccharomyces cerevisiaelll. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273, N7.-P. 4040-4045.

172. Mcintosh E.M. MCB elements and the regulation of DNA replication in yeast//Curr. Genet. 1993. - VOL 24.-P. 185-192.

173. Mechanisms, that helps the yeast cell cycle clock tick: G2 cyclins transcriptionally activate. G2 cyclins and repress Gi cyclins//Cell. 1993. - Vol. 74. -P. 993-1007.

174. Misra V.K., Draper D.E. On the role of magnessium ions in DNA stabil-ity//Biopolymers, Nucleic Acid Sciences. 1998. - Vol. 48, N 2-3. - P. 113-136.

175. Modeo F., Fröhlich E., Ligr M. et al. Oxygen stress: A regulator of apoptosis in yeast//J. Cell. Biol. 1999. - Vol. 145, N 4. - P.

176. Muller F.M., Wernvvr K.E., Kasai M. et al. Rapid extraction of genomic DNA from medically important yeast and filamentous fungi by high-speed cell disruption//J. Clin. Microbiol. 1998. - V01. 36, N 6. - P. 1625-1629.

177. Nakajima-Shimada J., Sakaguchi S., Tsuji F.I. et al. Ca~ signal is generated only once in the mating pheromone response pathway in Saccharomyces cer-evisiaei/Ce 11. Struct. Funct. 2000. - Vol. 25, N2.-P. 125-131.

178. Nakamura T., Fujita K., Eguchi Y. et al. Proteins of calcium-dependent regulatory proteins from fungi and yeast//J. Biochem (Tokyo). 1984. - Vol. 95, N 6. - P. 1551-1557.

179. Norbeck J., Blomberg A. The level of cAMP-dependent kinase A activity affects osmotolerance and osmo-instigated gene expression changes in Sac-charomyces cerevisiaelfYeast. 2000. - Vol. 16, N 2. - P. 121-137.

180. Nucleic acid metal interactions. Ed. Spiro T.G. - N.Y., 1980. - V. 1. -256 p.

181. Nurse P. Felix Hoppe-Seyler Lecture 1999". Cyclin-dependent kinases and regulation of the fission yeast cell cycle//Biol. Chem. 1999. - Vol. 380, N 7-8.-P. 729-733.

182. Ohya Y., Une I., Ishikawa T. et al. Purification and biochemical properties of calmodulin from Saccharomyces cerevisiae/fEur. J. Biochem. 1987. - Vol. 168,N 1.-P. 13-19.

183. Okuhara K., Ohta K., Seo H. et al. A DNA unwinding factor involved in DNA replication in cell-free extracts of Xenopus eggs//Curr. Biol. 1999. -Vol. 9,N7.-P. 341-350.

184. Olson K.A., Nelson C., Tai G. et al. Two regulators of Stel2p inhibit pheromone-responsive transcription by separate mechanisms//Mol. Cell. Biol. 2000. - Vol. 20, N 12. - P. 4199-4209.

185. Oxford dictionary of biochemistry and molecular biology. Oxford: Oxford Univ. Press., 1997.-669 p.

186. Pan X., Heitman J. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudo-hyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiaeHMol. Cell. Biol. 1999. -Vol. 19, N7.-P. 4874-4887.

187. Pardenne M., Pleau J.M., Caleuda A. et al. Immune regulation by characterized polypeptides//UCLA Symp. Mol. and Cell. Biol. New Ser. 1987. -V. 41.-P. 259.

188. Patt L.W., Gleisner J.N., Barrantes D.M. et al. Low molecular weight inhibitors of lymphocyte transformation/VPharmacology. 1981. - Vol. 23, N 3. -P. 117-127.

189. Patton E.E., Willems A.R., Sa D. et al. Cdc 53 is a scaffold protein for multiple Cdc34/Skpl/F-box protein complexes that regulate cell division and me-thinine biosynthesis in yeast//Genes Dev. 1998. - Vol. 12, N 5. - P. 692-705.

190. Rizzo R.J. Basic chromosomal proteins in low eucariotes: Relevance of the evolution and functional of histones//J. Mol. Edv. 1976. - Vol. 8. - P. 79-94.

191. Saffran W.A., Grunberg R.B. Single strand and double strand DNA demage-induces recombination in yeast. Dependence on nucleotide excision repaire and recombination//Nucl. Acids Res. 1994. - V. 22, N 14. - P. 2823-2829.

192. Salghetti S.E., Muratani M., Wijnen H. et al. Functional overlap of sequences that activate transcription and signal ubiquitin-mediated proteolysis// Proc. Nation. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97, N 7. - P 3118-3123.

193. Schwarz S.E., Matuschewski K., Liakopoulos D. et al. The ubiquitin-like proteins.Smt 3p and SUMO-1 are conjugated by the UBC9 E2 enzyme// Proc. Nation. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95, N. 2. - P. 560-564.

194. Sharon N., Lis H. Lectins: cell-agglutinating and sugar-specific pro-teins//Science. —1972.-Vol. 177.-P. 949.

195. Shintani T., Mizushima N., Ogawa Y. et al. ApglOp, a novel protein-conjugating enzyme essential for autophagy in yeast//EMBO J. 1999. -Vol. 18, N 19.-P. 5234-5241.

196. Sloper Mould K.E., Eyre H.J., Wang X.W. et al. Characterization and chromosomal localization of USPS, a novel human ubiquitin-specific protease//J. Biol. Chem. 1999". - Vol. 274, N 38. - P. 26878-26884.

197. Sullier S., Jay P., Pautat F. et al. Diversification pattern of the HMG and SOX family members during evolution//J. Mol. Evol. 1999. - Vol. 48, N 5. -P. 517-527.

198. Sumoy L., Carion L., Escarceller M. et al. HMG 20A and HMG 20B map to human chromosomes 15p24 and 19p 13.3 and constitute a distinct . Of

199. HMG-box genes with ubiquitous expression//Cytogenet. Cell. Genet. 2000. -Vol. 88, N 1-2.-P. 62-67.

200. Suzuki T., Ichiyama A., Saitoh H. et al. A new 30 kDa ubiquitin-related SUMO-1 hydrolase from bovine brain//J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274, N 44.-P. 31131-31134.

201. Swaminathan S., Amerik A.Y., Hochstrasser M. The Doa4 deubiquitinating enzyme is required for ubiquitin homeostasis in yeast//Mol. Biol. Cell. -1999. Vol. 10, N 8. - P. 2583-2594

202. Tanaka K. Molecular biology of the proteasome//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. - Vol. 247, N 3. - P. 537-541.

203. Tang L., Li J., Kotz D.S. et al. Determining the DNA binding angle induced by non-specific high-mobility group-1 (HMG-1) proteins: a novel method//Biochemistry. 2000. - Vol. 39, N 11. - P. 3052-3060.

204. Thomson T.M., Kholid H., Lozano J.J. et al. Role of UEV-1A, a homologue of the tumor supressor protein TSG 101, in protection from DNA de-mage//FEBS Lett. 1998. - Vol. 423, N l.-P. 49-52.

205. Tinoco I. Hypochromism in polynucleotides//.!. Amer. Chem. Soc. 1960. - V. 82, N 18. -P. 4785-4790.

206. Toda T., Ochotorena I., Kominami K. Two distinct ubiquitin-proteolysis pathways in the lission yeast cell cycle//Philos Trans R. Soc. Lond. B. Biol. Sci.- 1999.-Vol. 354, N 1389.-P. 1551-1557.

207. Van Dam L., Nardenskiold L. Interactions of polyamines with the DNA oc-tamers d(m5CG)4 and d(GGAATTCC): A 'H-NMR investiga-tion//Biopolymers. —1999. V. 49, N l.-P. 41-53.

208. Wang A.H., Bertos N.R., Pelletier N. et al. HDAC4, a human histone daece-tylase related to yeast HDA1, is transcriptional corepressor//Mol. Cell. Biol. 1999.-Vol. 19, N 11. -P. 7816-7827.

209. Wilkinson Keith D., Audnya Tapan K. Stimulatin of ATP-dependent proteolysis requires ubiquitin with the COOH-terminal sequence Arg-Gly-Gly//J. Biol. Chem. -. Vol. 256, N 17. - P. 9235-9241.

210. Wolf B., Hanlon S. Structural transitions of deoxyribonucleic acid in aqueous electrolyte solutions. II. The role of hydration//Biochemistry. 1975. - V. 14,N8.-P. 1661-1670.

211. Yamashita Y.M., Nakaseko Y., Kumada K. et al. Fission yeast APS/cyclosome subunits, Cut20/Apc4 and Cut23/Apc8 in regulating metaphase progression and cellular stress responses//Genes Cells. 1999. - Vol. 4, N8.-P. 445-463.

212. Yashiroda H., Kaida D., Tohe A. et al. The PY-motif of Bu/1 protein is as-sential for growth of Saccharomyces cerevisiae under various stress condi-tions//Gene. 1998. - Vol. 225, N 1-2. - P. 39-46.

213. Yu Z.K., Gervais J.L., Zhang H. Human CUL-1 associated with the SKP1/SKP2 complex and regulates p21 (CIP1/WAF1) and cyclin D proteins// Proc. Nation. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95, N 19. - P. 11324-11329.

214. Yuasa K., Michibata H., Omori K. et al. A novel interaction of cGMP-dependent protein kinase I with troponin T//J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274, N52.-P. 37429-37434.

215. Yuasa K., Omori K., Yanaka N. Binding and phosphorylation of a novel male germ cell-specific cGMP-dependent protein kinase anchoring protein by cGMP-dependent protein kinase I alpha//J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275, N7.-P. 4897-4905.

216. Zachariae W., Schwab M., Nasmyth K. et al. Control of cyclin ubiquitination by CDK-regulated binding of Hctl to the anaphase promoting com-plex//Sience. 1998. -Vol. 282, N 5394.-P. 1721-1724.

217. Zatz J.Oliver., Samuels C., Skotnicki A.B. et al. Thymosin increases production of T-cell growth factor by normal human peripheral blood lymphocytes// Proc. Nation. Acad. Sei. USA. 1984. - Vol. 81. - P. 2882-2885.

218. Zelenaya-Troitskaya O., Newman S.M., Okamoto K. et al. Functions of the high-mobility group of protein, Abf2p, in mitochondrial DNA segregation, recombination and copy number in Saccharomyces cerevisiaellGenetics. -1998.-Vol. 148, N4.-P. 1763-1776.

219. Zuki J. Mechanizmy naprawy DNA u drozdzy//Nauka, informacija, biznes. -1993,-V. 1, N 2. -P. 16.I