Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конформационные превращения фермент-субстратных комплексов в процессах, катализируемых 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазами из E. coli и человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Конформационные превращения фермент-субстратных комплексов в процессах, катализируемых 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазами из E. coli и человека"

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВ НИКИТА АЛЕКСАНДРОВИЧ

КОНФОРМАЦИОННЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНЫХ КОМПЛЕКСОВ В ПРОЦЕССАХ, КАТАЛИЗИРУЕМЫХ 8-ОКСОГУАНИН-ДНК-ГЛ ИКОЗИ ЛАЗ А Ml I ИЗ Е coli И ЧЕЛОВЕКА

03 00 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск, 2007

003058087

Работа выполнена в Новосибирском государственном университете и Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель д х н Федорова Ольга Семеновна

Официальные оппоненты д б н , доцент Бунева Валентина Николаевна

д х н , профессор Малыгин Эрнст Георгиевич

Ведущая организация Институт биоорганической химии

им М М Шемякина и Ю А Овчинникова

Защита состоится « 2007 г в (О1' часов

на заседании диссертационного совета Д 003 045 01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090, Новосибирск-90, пр Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Автореферат разослан « 2-Я- » 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета Д X н

Федорова О С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы В процессе функционирования клеточная ДНК подвергается воздействию различных факторов, приводящих к ее повреждениям Одними из наиболее агрессивных факторов окружающей среды являются активные формы кислорода, которые индуцируют окислительные повреждения ДНК Наиболее распространенным продуктом модификации пуриновых оснований является 7,8-дигидро-8-оксогуанин (8-оксогуанин, oxoG) Наличие oxoG в ДНК вызывает мутации G/C —> Т/А вследствие способности oxoG образовывать пару Хугстеновского типа с аденином 8-Оксогуанин эффективно удаляется из ДНК с помощью ферментов репарации 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз

Несмотря на большой интерес к изучению механизмов удаления 8-оксогуанина из ДНК многие аспекты остаются невыясненными Неясен вопрос о том, каким образом ДНК-гликозилазы узнают модифицированное основание среди огромного числа неповрежденных азотистых оснований, каков детальный кинетический механизм процесса репарации и какую роль в узнавании и превращении субстрата играют конформационные изменения в ферментах и ДНК

Цель настоящей работы состояла в том, чтобы установить роль конформационной динамики ферментов и ДНК-субстратов в протекании ферментативных реакций с участием 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз из Е coli (Fpg) и человека (hOggl) и изучить предстационарную кинетику этих процессов Задачи настоящего исследования состояли в следующем

• методом «остановленной струи» с регистрацией изменений интенсивности флуоресценции остатков Тгр в ферментах и 2-аминопурина в ДНК обнаружить конформационные переходы в молекулах ферментов и ДНК-субстратов,

• при протекании процессов в условиях «одного оборота фермента» изучить детальные кинетические механизмы,

• с использованием постадийного усложнения структуры ДНК-субстрата определить молекулярную природу отдельных стадий,

• выяснить природу стадий, обеспечивающих высокую специфичность узнавания ферментами поврежденного участка в молекуле ДНК

Научная новизна и практическая ценность работы Представленная работа является первым комплексным кинетическим исследованием механизмов действия 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Fpg из Е coli и hOggl человека Полученные данные позволили установить кинетические схемы ферментативных процессов, рассчитать константы скорости и константы равновесия всех стадий, входящих в эти схемы, определить молекулярную природу отдельных стадий взаимодействия ферментов Fpg и hOggl с ДНК-субстратами, установить стадии, которые вносят наибольший вклад в специфичность узнавания ферментами ДНК-субстратов

Проведенное исследование позволяет глубже понять механизмы удаления окислительных повреждений из ДНК и установить роль конформационных превращений ферментов репарации и ДНК в протекании этих процессов

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ Результаты работы были представлены на международных конференциях «Targeting RNA artificial ribonucleases, conformational traps and RNA interference», Новосибирск, 2003, 6th International meeting recognition studies nucleic acids, Шеффилд, Великобритания, 2004, «Chemical and biological problems of proteomics», Новосибирск, 2004, «International conference on chemical biology», Новосибирск, 2005, «Физико-химическая биология», Новосибирск, 2006 и школе-конференции «Transient kinetics methods applied to biological macromolecules», Кентербери, Великобритания, 2006

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы Работа изложена на 178 страницах, содержит 90 рисунков, 32 схемы и 28 таблиц Библиография включает 249 литературных источников

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Выбор модельных ДНК-субстратов и подхода исследования

Ферменты Fpg и hOggl принадлежат к разным структурным классам 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз, однако выполняют одинаковые клеточные функции, удаляя из ДНК остатки 8-оксогуанина и другие окисленные азотистые основания

Эти ДНК-гликозилазы катализируют разрыв N-гликозидной связи с образованием свободного

модифицированного основания, а затем -фосфодиэфирной связи со стороны 3'-атома углерода остатка 2'-дезоксирибозы путем Р-элиминирования, образуя в ДНК одноцепочечный разрыв Кроме того, фермент Fpg способен осуществить вторую реакцию Р-элиминирования фосфата со стороны 5'-атома углерода, что приводит к удалению остатка 2'-дезоксирибозы На Рис 1 схематически представлены каталитические стадии, осуществляемые ферментами Fpg и hOggl

В процессе выполнения работы в литературе появились данные о структуре этих ферментов в свободном состоянии и в комплексе с ДНК (Gilboa Я et al, 2002, Brimer SD et al, 2000) Установлено, что взаимодействие ферментов с ДНК-субстратами приводит к конформационным изменениям как в молекуле белка (например, встраивание в двойную спираль ДНК аминокислотных остатков Met-73, Arg-108 и Phe-110 в случае Fpg или Asn-149, Tyr-203, Arg-204 и Arg-154 в случае hOggl), так и в молекуле субстрата (изгибание рибозо-фосфатного остова, 2

з iiiiiiiiiiiii

5

N гликозилазная реакция

реакция элиминирования

HIHIIHIIII ГТТТТГГТТТТГТП ,111» 1.1

-f*

/ ,

J

» \ ^

+ ч^с-Р—О + О Р

^ /

ЬОдд1 _Ррд ^---

Рис I Схематическое представление каталитических стадий процесса взаимодействия ферментов Ррз и с дуплексом ДНК,

несушим поврежденное основание

а

выворачивание поврежденного основания в активный центр фермента) Такие изменения структуры взаимодействующих молекул приводят к образованию специфических контактов, результатом которых является высокоэффективное узнавание и связывание поврежденных участков ДНК

Поскольку изменение структуры взаимодействующих молекул происходит в миллисекундном диапазоне времени, для изучения этих изменений использовали метод остановленной струи Наблюдение за конформационными изменениями ферментов и ДНК осуществляли по изменению интенсивности флуоресценции триптофана (Тгр) и 2-аминопурина (2-аРи), соответственно

Для исследования различных стадий ферментативного процесса использовали подход постадийного усложнения субстрата (Таблица 1)

В качестве специфических субстратов Таблица 1 Последовательности

олигонуклеотидов. входящих в ЛНК-субстпаты

были использованы дуплексы, содержащие в одной из цепей остаток 8-оксогуанина (охов-субстрат) либо остаток 5,6-дигидроурацила (с!Ни-субстрат) Кроме того, были использованы дуплексы, содержащие апурин/апиримидиновый сайт (АР-субстрат), который является

промежуточным продуктом реакции, либо нереакционноспособный аналог АР-сайта, содержащий вместо 2'-дезоксирибозы остаток 2-оксиметил-З-

окси-тетрагидрофурана (Р-лиганд) Дуплекс, несущий такой остаток, имеет все особенности АР-субстрата, но не способен расщепляться под действием фермента, поскольку не содержит в Г-положении гидроксильную группу В качестве неспецифического субстрата использовали дуплекс олигонуклеотидов, не содержащих модифицированных нуклеозидов На Рис 2 изображена структура использованных модифицированных нуклеозидов

Сокращенное название Последовательности олигонуклеотидов

охой а(стстс(охооссттсс)

охоО-аРи с)(СТСТС(охоСХ2-аРи)СТТСС)

аРи-охоС (1(СТСТ(2-аРи)(охоО)ССТТСС)

ани скстстс(ани)ссттсс)

АР а(стстс(АР)ссттсс)

АР-аРи <)(СТСТС(АР)(2-аРи)СТТСС)

И <1(СТСТСРССТТСС)

Р-аРи а(СТСТСР(2-аРи)СТТСС)

в а(стстссссттсс)

О-аРи <1(СТСТСО(2-аРи)СТТСС)

С а(ООААОССОАОАО)

ссо ¿(ОСААСССОАСАО

осс а(СОААСОССАОАО)

Рис 2 Структура модифицированных нуклеозидов использованных в работе

Переход от неспецифического дуплекса ДНК (О-лиганд, наиболее простые взаимодействия) к специфическому охов- и (1Ни-субстрату (полный ферментативный цикл реакций) приводит к дополнительным взаимодействиям между реагирующими молекулами и, как следствие этого, к дополнительным конформационным изменениям, как в молекуле фермента, так и в молекуле субстрата Этот подход позволил соотнести конформационные изменения в белке с конкрентыми взаимодействиями с определенными группами в субстрате в процессе его узнавания и расщепления В то же время использование флуоресцирующих аналогов субстратов, содержащих остаток 2-аРи, позволило выделить конформационные изменения ДНК-субстратов при взаимодействии с ферментами Fpg и Известно, что интенсивность флуоресценции 2-аРи

очень сильно зависит от внешнего окружения, например, при образовании стэкинга между соседними основаниями или формировании дуплекса происходит резкое уменьшение интенсивности флуоресценции остатков 2-аРи Кроме того, в работе был использован мутантный фермент Рр§ Р110\У, несущий замену фенилаланина РЬс-110 на остаток флуоресцирующей аминокислоты — триптофана Согласно рентгеноструктурным данным РЬе-110 участвует в процессе связывания субстрата и, следовательно, его замена на остаток триптофана позволила получить информацию о начальных стадиях фермент-субстратного взаимодействия

Анализ кинетических

Р = ^ [Е] + ^[ЕЭ,] + £,[Е82] + ....+ УЕ5„] + Рфон (1) кривых проводили согласно

уравнению (1), в соответствии с _ *1[5][Е] + ,2[Е8]2. №, + МВ5], (2) -тоРЫМ общаЯ ™сивность

Л флуоресценции г была равна

-И- = /ЦЕв],, + АЧ1+1)[Е8](1+1) - (*, + А,+1)[Е8], (3) сУмме произведений

01 коэффициентов удельной

флуоресценции / на '1[Е51п =УЕ5]п1-(4„ + ^,)[Е8]п (4) концентрации соответствующих

Л

<ФЧ _

А

форм фермента и фоновой (5) флуоресценции Концентрации различных форм фермента Ео= И+ описывались системой

8„ = [5] + [Р] + ±[Н5]. (7) соответствующих

дифференциальных уравнений и

уравнений материального баланса (2)-(7)

С помощью программы ОупаГи осуществляли численное интегрирование системы дифференциальных уравнений и подгоняли константы скорости и коэффициенты удельной флуоресценции всех форм фермента Как правило, кинетические кривые разбивали на несколько временных диапазонов таким образом, что каждый следующий диапазон полностью включал предыдущий, например от 2 мс до 1, 10, 100 с и так далее Это давало возможность постепенно усложнять модель взаимодействия фермента с субстратом Начальный диапазон 4

кривых, как правило, отражал стадии связывания и давал возможность определить их константы скорости При обработке следующего временного диапазона ранее использованный механизм усложняли, добавляя еще одну или несколько равновесных или неравновесных стадий

2 Взаимодействие фермента Fpg с ДНК

Молекулярно-кинетическая модель взаимодействия фермента Fpg с ДНК-субстратами была установлена на основе анализа данных, полученных при регистрации конформационных изменений фермента и ДНК, происходящих в процессе взаимодействия, и рентгеноструктурных данных, появившихся в литературе в ходе выполнения исследования

На Рис 3 представлены кинетические кривые, характеризующие конформационные изменения фермента Fpg (А) или его мутантной формы Fpg (Б) при взаимодействии с различными ДНК-субстратами, а также конформационные изменения ДНК (В) Взаимодействие Fpg с неспецифическим лигандом - дуплексом олигонуклеотидов, не содержащим модифицированных нуклеотидов (С/С), приводило к образованию неспецифического комплекса Из Рис ЗА (кривая С/С) видно, что при образовании неспецифического комплекса в течение 3 мс, изменяется структура фермента, эти изменения приводят также к «разрыхлению» дуплекса ДНК, что характеризуется возрастанием интенсивности флуоресценции 2-аРи в течение 5 мс (Рис ЗВ, С-аРи/ССС) После этого происходят более медленные процессы подстройки конформации фермента, которые были зарегистрированы при использовании мутанта Рр§ Эти

изменения интенсивности флуоресценции (т'|Д ~ 50 мс, т^д ~ 10 с), по-видимому, связаны с конформационными изменениями молекулы фермента в области РЬе-110

/ >»ÄXOG-aPti/CCü^

А Б В

Рис 3 Экспериментальные и теоретические кинетические кривые характеризующие конформационные изменения Fpg (А), Fpg FU0W (Б) и ДНК-субстратов (В) при их взаимодействии

Кинетические кривые изменения интенсивности флуоресценции Тгр при взаимодействии Fpg и Fpg Fl 10W с F/C-лигандом имеют более сложный профиль и характеризуют процесс первичного связывания и дальнейшую перестройку конформации фермента (Рис ЗА и Б, кривая F/C) Можно выделить четыре области изменения интенсивности флуоресценции Тгр Первая из них (2-20 мс),

характеризуется падением интенсивности флуоресценции, вторая (40-100 мс) -ростом, третья (0,1-3 с) и четвертая (5-70 с) - повторным падением Кинетическая схема, удовлетворяющая этим данным, содержит четыре равновесных стадии (Схема 1)

Схема 1 Е + Б (ЕР), (Е102 (ЕР)3 =5: (ЕР)„

Как видно из Рис ЗВ (кривая Р-аРи/ССв) на временах менее 2,0 с для флуоресцирующего аналога лиганда происходит падение интенсивности флуоресценции 2-аРи, которое соответствует одностадийной схеме и связано с встраиванием в дуплекс аминокислотных остатков фермента Согласно рентгеноструктурным данным (СйЬоа Я еЛ Ы, 2002) это остатки МеЬ73, Аг§-108 и РЬе-110 Видно, что однофазному изменению интенсивности флуоресценции 2-аРи в области 30 мс-3 с соответствует двухфазное изменение интенсивности флуоресценции Тгр То есть встраивание трех аминокислотных остатков происходит не одновременно и приводит к двухфазному изменению интенсивности флуоресценции Тгр По-видимому, лишь в комплексе (Е«Р)3 происходит полное встраивание аминокислот в дуплекс Последней четвертой стадией (образование комплекса (Е«Р)4), незначительно влияющей на интенсивность флуоресценции Тгр, по-видимому, является подстройка активного центра фермента

При взаимодействии Fpg с АР-субстратом начальные участки кинетических кривых, характеризующие стадии связывания, имели одинаковые особенности для Р-лиганда и АР-субстрата (Рис 3) Это говорило о том, что происходящие на этих стадиях процессы имеют одинаковую природу Однако в случае АР-субстрата после образования каталитически-активного комплекса происходят две реакции р-элиминирования, ведущие к образованию комплекса Гр§*продукт, и последующая стадия диссоциации этого комплекса Эти дополнительные стадии приводят к появлению на кинетических кривых фазы роста интенсивности флуоресценции Тгр и 2-аРи На кинетических кривых видно, что две химические стадии процесса характеризуются одной стадией роста интенсивности флуоресценции

Минимальная кинетическая схема (Схема 2), описывающая полученные кинетические кривые, включает четыре равновесия, отвечающие образованию каталитически-активного комплекса, необратимую стадию химических реакции и дальнейшую диссоциацию комплекса фермент-продукт

Схема 2 Е + (ЕАР),^=г (ЕАР)2^=5: (ЕАР)3^=г: (ЕАР)4-Е + Р)

Процессы, протекающие на стадиях связывания АР-субстрата, имеют природу, аналогичную установленным ранее для Р-лиганда Образование каталитически-активного комплекса (Е АР)4 приводит далее к осуществлению химических стадий ферментативного процесса и стадии диссоциации комплекса фермент»продукт

Данные, полученные для в- и Р-лигандов и АР-субстрата, послужили основой для анализа наиболее сложного процесса взаимодействия фермента со 6

специфическим охов-субстратом Основное отличие охов-субстрата состоит в том, что к стадиям связывания, уже описанным выше, добавляется процесс узнавания остатка охов и его взаимодействие с активным центром фермента

Сравнение кинетических кривых для АР- и охов-субстрата, представленных на Рис ЗА, показывает, что в случае охоО-субстрата в диапазоне времени 0,1-2,0 с, действительно регистрируется дополнительная стадия, отсутствующая для взаимодействия с АР-субстратом

Математический анализ экспериментальных данных позволяет установить кинетическую схему процесса (Схема 3), которая содержит пять равновесных стадий, характеризующих связывание охов/С-субстрата Молекулярные превращения, происходящие на этих стадиях, по-видимому, аналогичны описанным ранее для АР/С-субстрата, а дополнительная стадия характеризует выворачивание поврежденного основания из спирали ДНК в карман активного центра фермента Следует отметить, что лимитирующей стадией ферментативного процесса является Ы-гликозилазная реакция, поскольку добавление этой стадии приводит к уменьшению константы скорости химической стадии в 5 раз 0,2 с'1 и 0,04 с"1 для АР/С- и охов/С-субстратов, соответственно (Таблица 2) Схема 3

Е + СЮ (Е СЮ),-Д—» (Е СЮ)2 - (Е ОО),^—- (Е ОС)4 (Е СЮ)5 -- (Е Р -у - - Е + Р)

Из Рис 3 (А и Б) видно, что участок 0,1-50 с, который характеризует выворачивание охов и встраивание трех аминокислот в дуплекс ДНК с образованием каталитически-активного комплекса, отличается для кривых, полученных для Рр§ дикого типа и мутанта Математический анализ, проведенный в соответствии со Схемой 3, показал, что визуальные изменения на этом участке вызваны замедлением процесса, происходящего ранее на второй стадии и обусловленными конформациоиными изменениями в области остатка РЬе-110 (см Таблицу 2) Константа равновесия этой стадии К2 равна 104 и 0,4, соответственно для Fpg дикого типа и мутанта Замедление этого конформационного перехода является следствием мутации Р110\¥

При взаимодействии с сНШ-субстратом, как и в случае охоО-субстрата, кинетические кривые характеризуются многофазным изменением интенсивности флуоресценции остатков Тгр Однако существенным отличием этих кривых от описанных ранее является сдвиг минимума в область 3 с (30 с для охов-субстрата) Сравнение кривых, представленных на Рис ЗА показывает, что стадии связывания АР/С- и <ЛШ/С-субстратов происходят за одинаковое время (в течение 3 с) Можно, поэтому, заключить, что стадия выворачивания остатка сШи из дуплекса ДНК в активный центр фермента протекает быстрее, чем в случае охоО-субстрата Анализ кинетических кривых проводили по Схеме 3 Как и следовало ожидать, замена одного типа повреждения (охов) другим (¿Ни) привела к изменению констант скорости стадий, которые включают взаимодействие фермента с этими основаниями (Таблица 2) Так, например, видно, что втора«

стадия связывания («разрыхление» дуплекса, взаимодействие Phe-110 с поврежденным основанием, взаимодействие Arg-108 с основанием, расположенным напротив повреждения) значительно отличается для oxoG/C- (К2 = 104) и dHU/C-субстратов (К2 = 0,34) В то же время третья стадия взаимодействия (выворачивание поврежденного основания в активный центр фермента) происходит легче, поскольку константа равновесия АГ3 (k3/k 3) равна 4 для dHU/C- и 0,15 для oxoG/C-субстратов, соответственно

В каталитически-активном комплексе основания, расположенные с 3'- и 5'-стороны от oxoG, взаимодействуют с разными аминокислотными остатками фермента С З'-стороны встраиваются остатки Met-73 и Phe-110, в то время как с 5'-стороной взаимодействует остаток Arg-108 Поэтому в экспериментах с флуоресцирующим аналогом oxoG-субстрата были использованы два дуплекса, несущие остаток 2-аРи с 3'- или 5'-стороны от oxoG (oxoG-aPu/CCG и aPu-oxoG/GCC, соответственно) Полученные кинетические кривые (Рис ЗВ) позволили установить, что первоначальное изменение структуры ДНК происходит после образования неспецифического комплекса и характеризует дестабилизацию дуплекса, как и в случае неспецифической ДНК Вторая зарегистрированная стадия, проходящая в течение 0,1-5,0 с, относится к встраиванию аминокислот в дуплекс и формированию каталитически-активного комплекса Важным отличием кинетических кривых в этой области является небольшая задержка фазы уменьшения интенсивности флуоресценции для aPu-oxoG/GCC-субстрата Такой сдвиг свидетельствует о том, что аминокислотные остатки фермента встраиваются в дуплекс ДНК неодновременно То есть, остаток Arg-108, взаимодействующий с основанием, расположенным с 5'-стороны от повреждения, встраивается в дуплекс в последнюю очередь

Таблица 2 Константы скорости характеризующие конформационные изменения фермента в

процессе взаимодействия Fpg и Грд Fl 10W с ДНК-субстратами

Константы FpgFllOW Fpg

oxoG/C oxoG/C dHU/C АР/С F/C

к, М'хс1 (340 ±10)*106 (320 ± 15)* 10' (234 ±4)* 10" (800 ±30)*106 (150 ±20)* 10'

к, с' 700 ± 25 890 ± 25 1270 ±20 250 ±20 270 ± 15

*2,с' 27,7 ± 1 4 250 ± 18 46 5 ± 1,1 36 ±3 6 0 ± 0,2

к2, с1 63 ±2 2,4 ± 0 4 136 ±5 65 ±8 0 02 ± 0 005

к, с' 22 ±1 6 7 ± 0,8 35,7 ±2,7 10,0 ±0,5 10,0 ±0,6

i-,, с' 28 ± 1 46 ± 0 6 9 2 ± 0,4 40 ±4 0,6 ±0,1

к, с1 4,5 ±0 1 9 1 ± 0,6 8 9 ± 0 5 И 0 ± 0 8 0 04 ± 0 007

¿4, с1 1,9 ±0,1 2,4 ± 0,2 0 58 ±0,06 1 0±0,1 0 01 ±0,001

к, с1 0 20 ±0,01 0 20 ±0 01 0 16 ±0 02 0 20 ±0,01

К с1 0,02 ± 0 002 0,03 ± 0 007 0 11 ±0 02

h с' 0,021 ±0 004 0,04 ± 0 006 0 078 ± 0 007

Кр, м (3,6±0,6)х10^ (2,0 ± 0,3)* 10"6 (2,5 ± 0 3)*10_6 (1,8 ± 0 3)* Ю-6

Скорость ферментативной реакции была измерена в экспериментах с 32Р-меченным oxoG-субстратом и анализом продуктов методом электрофореза в ПААГ Константа скорости кк„, полученная таким методом, оказалась равной 0,029 ± 0,005 с'1 Кроме того, константа диссоциации комплекса фермент*продукт была определена методом флуоресцентного титрования и оказалась равной (5,3 ±

0,4)х10 М Таким образом, полученные значения констант хорошо согласуются с величинами, определенными методом остановленной струи (Таблица 2)

Проведен детальный кинетический анализ процесса взаимодействия с субстратами, содержащими различные некомплементарные основания напротив охов в соседней цепи двойной спирали Для каждого из таких субстратов были зарегистрированы зависимости интенсивности флуоресценции Тгр от времени

На Рис 4 представлены кинетические кривые, характеризующие конформационные изменения фермента Fpg при взаимодействии с охоО/Ы-субстратами (А), и накопление продуктов реакции (Б), полученное методом гельэлектрофореза

0 01 01

А Б

Рис 4 Кинетические кривые, полученные при взаимодействии 2 0 мкМ Fpg с 10 мкМ охоО/М-субстратами (А) и зависимость концентрации продукта реакции от времени (Б)

Кинетические кривые описывали Схемой 3, предложенной для охоО/С-субстрата Константы скорости и равновесия, полученные при расчете, приведены в Таблице 3 Из полученных данных следует, что образование комплекса (Е»00)2 является ключевой стадией в дискриминации охоСЗ/Ы-субстратов Константа равновесия К2 равна 104 для охоО/С-субстрата и 0,3-1,5 для других трех субстратов Как было показано ранее, образование комплекса (Е'СЮ)2 происходит при конформационных изменениях в области остатка РЬе-110 и приводит к «разрыхлению» двойной спирали В то же время, из рентгеноструктурных данных известно,

что остаток Arg-108 способен образовывать водородные связи с основанием, расположенным напротив oxoG

Следовательно, можно сделать вывод, что на стадии образования комплекса (E*OG)2 происходит не только

Таблица 3 Константы скорости, характеризующие процесс

Константы oxoG/C oxoG/T oxoG/G oxoG/A

к, М'хс' (320 ± 15)х10' (442 ± 10)х106 (450 ± 20)х 106 (320 ± 14)х 10ó

к,, с1 890 ± 25 1240 ±30 922 ± 20 868 ±22

С 250 ± 18 24,3 ± 0,3 95 5 ±2,2 92,7 ± 6,9

к 2, с 1 2 4 ± 0,4 85,3 ± 1 4 119± 11 62,9 ± 5,3

к, с' 6 7 ±0 8 17Д ±0 2 9 6 ± 0 3 9 4 ± 0 3

к, с 1 46 ±0 6 10 4 ± 0,1 13 ±0,7 12 5 ± 1 0

к, с ' 9,1 ±0,6 10,9 ±04 11,6 ± 0,3 6,9 ± 0,2

L, с ' 2,4 ± 0,2 0 96 ± 0,03 1,30 ±0,03 2,32 ± 0,08

líj с 1 0 20 ±0,01 0 17 ±001 0,24 ± 0,02 0,17 ±0,01

к 5, с 1 0,03 ± 0,007 0 020 ± 0,002 0,030 ± 0,002 0,015 ±0,002

к„ с1 0,04 ±0,006 0,026 ± 0,002 0,038 ± 0,002 0,031 ±0,002

кт, с 1 - 0,022 ± 0,004 0,023 ± 0,005 0 022 ± 0,005

узнавание поврежденного основания (взаимодействие с Phe-110), но и основания, расположенного напротив повреждения (взаимодействие с Arg-108)

Таким образом, полученные данные дополнили модель взаимодействия Fpg с oxoG-субстратом Было показано, что фермент дискриминирует oxoG/N-субстраты на стадии, предшествующей выворачиванию oxoG из дуплекса Кроме того, установлен ряд специфичности фермента Fpg к исследованным субстратам (oxoG/C > oxoG/T > oxoG/G = oxoG/A)

Можно сделать заключение, что образование каталитически-активного комплекса фермента Fpg со специфическим ДНК-субстратом проходит через пять стадий Первичное неспецифическое связывание приводит к формированию столкновительного комплекса с ДНК Образование второго комплекса играет ключевую роль в процессе распознавания поврежденного участка ДНК Показано, что на этой стадии происходят конформационные изменения в области Phe-110 В том случае, когда в сайге связывания фермента находится специфический субстрат, происходит третья стадия процесса - выворачивание поврежденного основания Эта стадия приводит к формированию полости в дуплексе ДНК Четвертая стадия характеризует процесс встраивания аминокислотных остатков фермента в образовавшуюся в ДНК полость После этого происходит подстройка конформации активного центра фермента и осуществление каталитических стадий процесса Скорость-лимитирующей стадией для Fpg является N-гликозилазная реакция Завершает ферментативный цикл равновесная стадия диссоциации комплекса фермент-продукт

Для предложенного механизма ферментативной реакции определены константы скорости прямых и обратных реакций элементарных стадий взаимодействия и константа диссоциации комплекса фермента с продуктом реакции

3 Взаимодействие фермента hOggl с ДНК

Конформационные изменения hOggl в процессе связывания G/C- и F/C-

лигандов, а также АР/С-субстрата характеризовались слабым изменением

интенсивности флуоресценции Тгр Однако были зарегистрированы изменения интенсивности флуоресценции 2-аРи, что свидетельствовало о конформационных переходах в ДНК

При взаимодействии hOggl с G-aPu/CCG-лигандом происходит неспецифическое связывание дуплекса ДНК Этот процесс, как видно из

кинетических кривых (Рис 5А), заканчивается за 0,02 с и сопровождается ростом интенсивности флуоресценции 2-аРи Возрастание интенсивности флуоресценции свидетельствует об ослаблении комплементарных взаимодействий в первичном неспецифическом комплексе ДНК с ферментом

Кинетические кривые для F-aPu/CCG-лиганда характеризуются падением интенсивности флуоресценции 2-аРи в течение 5 с, что свидетельствует о переходе 2-аРи в гидрофобные условия (Рис 5А) Этот процесс характеризует заполнение

10

бреши в дуплексе ДНК аминокислотными остатками Согласно данным

рентгеноструктурного анализа (Вгипег Б Э е/ а1, 2000) это остатки Аэп-149, Туг-203, А^-154 и А^-204

При взаимодействии фермента с АР-субстратом было зарегистрировано двухфазное изменение интенсивности флуоресценции 2-аРи Уменьшение интенсивности на начальном участке (до 10 с) было отнесено к стадии образования каталитически-активного комплекса В свою очередь диссоциация комплекса фермент-продукт приводила к росту интенсивности флуоресценции в диапазоне времени 10-1000 с (Рис 5А)

Время с

Время с

А Б

Рис 5 Экспериментальные и теоретические кинетические кривые характеризующие конформационные изменения ДНК-субстратов (А) и hOggl (Б) при их взаимодействии

Взаимодействие ЬС^1 с охоО-аРи/ССО-субстратом включает дополнительные стадии в процессе образования каталитически активного комплекса (Рис 5А) Образование первичного неспецифического комплекса приводит к частичному плавлению в области контакта, как и в случае с О-аРи/ССв-лигандом Однако интенсивность флуоресценции 2-аРи возрастает значительно больше, что свидетельствует о том, что в этот момент происходит «выворачивание» остатка охов в активный центр фермента, которое приводит к появлению бреши в дуплексе ДНК Последующее заполнение этой полости аминокислотными остатками hOggl приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции 2-аРи, как и в случае с АР-сайтом Однако этот процесс имеет, как минимум, два переходных состояния и протекает в 5-10 раз медленнее, заканчиваясь за 50-100 с

Кроме того, для охов-субстратов (охов-аРи/ССО и охов/С), в отличие от описанных выше в- и Р-лигандов и АР-субстрата, удалось зарегистрировать изменения интенсивности флуоресценции Тгр (Рис 5Б) Из полученных кинетических кривых видно, что на стадиях неспецифического связывания фермента с субстратом и выворачивания остатка охов (10-20 мс) не происходит изменений интенсивности флуоресценции Тгр Однако на участке кривых до 1 с происходит резкое падение интенсивности флуоресценции Тгр, отражающее связывание субстрата Эта часть кривой хорошо описывалась тремя равновесными стадиями (Схема 4) Далее на отрезке времени ~ 1-1000 с происходит двухфазный

рост интенсивности флуоресценции, характеризующий образование комплекса с продуктом и его диссоциацию Путем разделения продуктов реакции электрофорезом в ПААГ было показано, что реакции вырезания поврежденного основания и последующего разрыва фосфодиэфирной связи протекают со скоростями, значительно отличающимися друг от друга (Рис 6) Эти каталитические стадии представлены двумя последовательными неравновесными реакциями в кинетической схеме Скорость-лимитирующей стадией для является реакция р-элиминирования

Схема 4 Е + ОО 5=ег(Е00),5=г:(Е00)2 5=5:(Е0а)3-«-ЕАР-»(ЕР-=—»- Е + Р)

Полученные данные показывают, что все стадии образования каталитического комплекса со специфическим охов-субстратом проходят в течение 10 с Последующие химические стадии и диссоциация комплекса фермент*продукт приводят к возрастанию интенсивности флуоресценции как 2-аРи (переход в гидрофильные условия), так и Тгр (возвращение исходной конформации белка)

А Б

Рис 6 Зависимость концентрации продуктов Ы-гликозилазной реакции (А) и реакции р-элиминирования (Б) от времени при взаимодействии фермента с охов-аРи/ССО-субстратом

Константы скорости химических стадий ферментативного процесса (гликозилазной, к„шак и реакции Р-элиминирования, к,ТАМ,), полученные в прямом эксперименте по разделению продуктов реакции в ПААГ, хорошо согласуются с величинами этих констант, рассчитанными по флуоресцентным кинетическим кривым (Таблица 4)

Была исследована

специфичность фермента по

отношению к охоО/Ы-субстратам Примеры флуоресцентных

кинетических кривых, полученных при взаимодействии ЬС^1 с охоС/М-субстратами, приведены на Рис 7 Видно, что флуоресцентные кинетические кривые отличаются друг от друга,

12

Таблица 4 Константы скорости, характеризующие процесс

Константы охов/С охоО-аРи/СССТгр охоС-аРи/ССС22 ■р"

к\, М 'хс ' (260 ± 10)х106 (200 ± 50)х106 (125 ± 10)х10б

4, с ' 130 ± 1 230 ±90 120 ± 10

к2 с ' 133±02 2 5 ±04 1,4 ±0 1

к7 с' 1,16 ±0,02 0 59 ± 0 07 1,5 ±0,1

с' 0 012 ± 0 001 0,035 ±0,010 0 10 ± 0 01

к,, с' 0 07 ± 0,01 0,019 ± 0 003 0 013 ± 0,002

к, с1 0 06 ±0 02 0 040 ±0,001 0 029 ±0 001

<и,™ с' 0 08 ±0 02 0,03 ±0,01

с 1 0 0064 ± 0 0007 0 0065 ± 0 000110 0036 ± 0 0002

*:„„„ с 1 0 0010 ±0 0004 0,006 ±0,001

КР М (0 7 ± 0,1)* Ю-6 (3 3 ± 0 4)*10 61(7 0 ± 1,1)х 10"6

как по форме, так и по глубине изменения интенсивности флуоресценции Тгр Было отмечено, что глубина минимума уменьшается в ряду охов/С > охов/Т > охов/А > охоО/О Эксперименты по прямому наблюдению за накоплением продуктов реакции с использованием 32Р-меченных субстратов показали, что эффективность Ы-гликозилазной реакции и реакции Р-элиминирования также уменьшалась в этом ряду охов/С - охов/Т > охов/А > охов/О, и хорошо согласуется с данными, полученными по изменению интенсивности флуоресценции

А Б В

Рис 7 Кинетические кривые, полученные при взаимодействии 2,0 мкМ с 2,0 мкМ охоО/М-

субстратами (А) и зависимость концентрации продуктов Ы-гликозилазной реакции (Б) и реакции (3-элиминирования (В) от времени

Наблюдаемые изменения интенсивности флуоресценции описывали Схемой 4 По полученным константам скорости элементарных стадий (Таблица 5) были определены стадии, на которых происходит отличие одного субстрата от другого Неспецифическое связывание протекает с одинаковыми константами скоростей прямой и обратной реакции, соответственно, для всех субстратов Константа равновесия этой стадии равна в среднем (1,3±0,7)*106 М"1 Вторая стадия взаимодействия, которая была отнесена к процессу заполнения бреши в дуплексе, резко отличает охов/С субстрат от всех остальных Константа скорости прямой реакции к2 для охов/С субстрата примерно в два раза больше, чем для других субстратов В то же время прослеживается четкая корреляция между специфичностью фермента и константой скорости обратной реакции второй стадии к.2 Последняя стадия связывания субстрата менее выгодна для пары охоО/С, константа равновесия этой стадии увеличивается в ряду охов/С (К3 = 0,2) —> охоО/Т (К} = 0,9) —» охой/А (К3 = 1,3) —»охоО/О (К} = 3,8) Несмотря на это общая константа связывания Ксв„ уменьшается в ряду специфичности фермента С > Т > А > в Константа скорости Ы-гликозилазной реакции незначительно изменяется для разных субстратов и ее среднее значение равно 0,052 ± 0,017 с"1 Среднее значение константы скорости реакции Р-элиминирования равно 0,0084 ± 0,0016 с"1 Константа диссоциации комплексов с продуктами реакции, содержащими Т, би А напротив охоО, также говорит о менее прочном связывании с ними Полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза человека имеет повышенное сродство к охов/С-субстрату Стадии дискриминации субстрата по основанию, расположенному напротив охов, происходят после

13

выворачивания поврежденного основания, при этом процесс заполнения образовавшейся бреши является ключевой стадией дискриминации

Таблица 5 Константы скорости, характеризующие процесс взаимодействия ЬОеи I __с охов/Ы-субстратам и__

Константы oxoG/C oxoG/T oxoG/A oxoG/G

к, М 'хс 1 (260 ± 10)*106 (270±5)*106 (220±2)х10ъ (170±4)хЮ6

с1 130 ± 1 140 ±2 170 ±4 300 ± 33

*2,с' 13 3 ± 0 2 5 5 ± 0 1 6 4 ±0 1 60±0 1

к7 с1 1 16 ±0 02 2 14 ± 0 01 9 71 ±003 18 5 ± 2 0

к,, с' 0012 ±0 001 0 041 ±0 005 0 058 ±0 001 0 057 ±0 003

к з с 1 0 07 ±001 0 047 ± 0 002 0 043 ± 0 002 0 015 ±0 002

*4,с' 0 06 ± 0 02 0 030 ± 0 002 0 050 ±0 001 0 070 ± 0 008

к, с' 0 0064 ± 0 0007 0 0079 ± 0 0006 0 0094 ± 0 0003 0 0099 ± 0 0005

(0 7±0 lJxIO-4 (2 4 ± 0 DxlO"6 (4 0 ± 0 2)х 10"6 (93±10)х10-4

К,<„ М-1 29x10' 1 1x10' 34x10' 1 4х Ю6

В процессе реакции ß-элиминирования основание oxoG может выступать как акцептор атома водорода, связанного с 2'-атомом углерода остатка рибозы, ускоряя скорость этой стадии ферментативного процесса (Fromme JC et al, 2003) Для проверки этого утверждения мы изучили взаимодействие фермента с АР- и oxoG-субстратами при добавлении в реакционную смесь водорастворимого аналога 8-оксогуанина — 8-бромгуанина (BrG)

В присутствии BrG скорость ферментативной реакции с АР-субстратом увеличивалась (Рис 8А) Кроме того, нами было показано, что скорость реакции с oxoG-субстратом также увеличивается (Рис 8Б) Было изучено влияние BrG на предстационарные характеристики процесса взаимодействия фермента hOggl с ДНК-субстратами Из Рис 8В видно, что кинетические кривые имеют такой же профиль, как и кривые, полученные в отсутствие BrG Однако, согласно данным, представленным на Рис 8А и Б, конечным продуктом реакции в присутствии BrG является дуплекс, содержащий разрыв фосфодиэфирной связи в месте повреждения В отсутствие же BrG на этих временах наблюдали образование лишь 10 % такого продукта

А Б В

Рис 8 Зависимость концентрации продуктов реакции роли минирования от времени при взаимодействии 1,0 мкМ ЬС^1 с 1 0 мкМ АР/С- (А) и охов/С-субстратами (Б) в присутствии или в отсутствие ВЮ (В) Сравнение флуоресцентных кинетических кривых характеризующих конформационные переходы ДНК (индекс 2-аРи) и белка (индекс Тгр) при взаимодействии с АР- и охов-субстратами в присутствии

или в отсутствие 8-бромгуанина (индекс ВКл) [ЬОвд1] = 2,0 мкМ, р2""*'] = 1,0 мкМ или (5Тф] = 2,0 мкМ

Кинетический анализ экспериментальных данных показал, что в присутствии BrG константа скорости реакции ß-элиминирования увеличивается в 8 раз в случае AP-субстрата Для oxoG-субстрата две необратимые стадии в Схеме 4, характеризующие N-гликозилазную реакцию и реакцию ß-элиминирования преобразуются в одну стадию с эффективной константой скорости, как минимум в 2 раза превышающей величину константы скорости реакции ß-элиминирования в отсутствие BrG

Подводя итог можно сказать, что при взаимодействии фермента hOggl с ДНК-субстратами BrG связывается в активном центре фермента и выступает как донор-акцептор атома водорода, связанного с Ы9-атомом В случае взаимодействия с oxoG-субстратом активный центр фермента занят остатком oxoG Однако в этом случае можно предположить, что после того, как произойдет реакция ß-элиминирования, остаток oxoG может покидать активный центр фермента Тогда, если в растворе присутствует BrG, то это приведет к более эффективному сдвигу равновесия в сторону комплекса, содержащего в активном центре фермента BrG, что приведет к ускорению ферментативной реакции

Таким образом, для фермента hOggl было зарегистрировано три стадии связывания oxoG-субстрата Образование неспецифического комплекса приводило к «разрыхлению» двойной спирали субстрата и быстрому выворачиванию поврежденного основания в активный центр фермента Вторая и третья стадии процесса связывания субстрата отражают последовательное встраивание аминокислот в полость дуплекса образующегося после выворачивания из цепи остатка oxoG Показано, что дискриминация субстратов по основанию, расположенному напротив повреждения, происходит на второй стадии процесса В то же время третья стадия приводит к формированию каталитически-активного комплекса, в котором последовательно происходят химические стадии ферментативного процесса Завершает ферментативный цикл равновесная стадия диссоциации комплекса фермент'продукт

ВЫВОДЫ

1 Впервые по регистрации флуоресценции остатков Тгр в белках и 2-аРи в ДНК методом остановленной струи исследована предстационарная кинетика ферментативных реакций с участием 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Fpg из Е coli и hOggl человека Установлено, что в ходе каталитического цикла происходят множественные конформационные изменения обоих ферментов и ДНК-субстратов Такие изменения приводят к взаимной адаптации структур взаимодействующих молекул, формированию каталитически-активных состояний ферментов и способствуют превращению субстрата в продукт

2 Предложены кинетические схемы взаимодействия ферментов Fpg и hOggl с ДНК-субстратами и определены константы скорости и равновесия для всех стадий, входящих в эти схемы

3 С использованием подхода, основанного на последовательном усложнении строения ДНК-субстрата, определена молекулярная природа конформационных изменений молекул ферментов и ДНК-субстратов, происходящих в процессе их взаимодействия

4 Установлено, что дискриминация ферментом Fpg различных типов повреждений ДНК (8-оксогуанин и 5,6-дигидроурацил) происходят на второй и третьей стадиях процесса узнавания субстрата, дискриминация ферментами Fpg и hOggl различных азотистых оснований, расположенных в комплементарной цепи напротив повреждения, происходит на второй стадии связывания субстратов

5 Показано, что скорость превращения АР- и oxoG-субстратов ферментом hOggl в присутствии 8-бромгуанина увеличивается в 8 и 2 раза, соответственно Полученные данные подтверждают, что 8-оксогуанин, образующийся при взаимодействии hOggl с oxoG-субстратом в ходе первой каталитической стадии - гидролизе N-гликозидной связи, выполняет роль кофактора второй каталитической стадии - реакции р-элиминирования

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах-

1 Koval V V , Kuznetsov N А, Zharkov D О , Ishchenko А А , Douglas К Т , Nevinsky G А, Fedorova О S Pre-steady-state kinetics shows differences in processing of various DNA lesions by Escherichia coll formamidopyrirmdine-DNA glycosylase Nucleic Acids Res 2004 V 32 P 926-935

2 Kuznetsov N A , Koval V V , Zharkov D О , Nevinsky G A , Douglas К T, Fedorova О S Kinetics of substrate recognition and cleavage by human 8-oxoguanine-DNA glycosylase Nucleic Acids Res 2005 V 33 P 3919-3931

3 Кузнецов H A , Тимофеева H A , Федорова О С Взаимодействие ферментов hOggl и Apel в процессе репарации окислительных повреждений ДНК Вестник НГУ 2006 Т 4 С 71-76

4 Kuznetsov N А , Koval V V , Nevinsky G А , Douglas К Т , Zharkov D О , Fedorova О S Kinetic conformational analysis of human 8-oxoguamne-DNA glycosilase J Biol Chem 2007 V 282 P 1029-1038

5 Kuznetsov N A , Koval V V , Zharkov D О , Vorobiev Y N , Nevinsky G A , Douglas К T, Fedorova О S Kinetic basis of lesion specificity and opposite-base specificity of Escherichia coli formamidopyrirmdine-DNA glycosylase Biochemistry 2007 V 46 P 424-435

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Кузнецов, Никита Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ б

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Кинетические исследования механизмов ферментативных реакций в 9 предстационарных условиях

1.1. ДНК- и РНК-полимеразы

1.1.1. ДНК-полимераза I Escherichia coli (фрагмент Кленова)

1.1.2. РНК-полимераза бактериофага Т

1.1.3. ДНК-полимеразы бактериофагов RB69 и Т

1.1.4. ДНК-пол имераза /?

1.2. ДНК-лигаза бактериофага Т

1.3. ДНК-метилтрансферазы

1.3.1. ДНК-метилтрансфераза Dam бактериофага Т

1.3.2. ДНК-метилтрансфераза EcoRI

1.4. ДНК-гликозилазы

1.4.1. Урацил-ДНК-гликозилаза

1.4.2. Аденин-ДНК-гликозилаза

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конформационные превращения фермент-субстратных комплексов в процессах, катализируемых 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазами из E. coli и человека"

Клеточная ДНК постоянно подвергается воздействию экзогенных и эндогенных агентов, которые являются причиной различных модификаций в геноме. Эти повреждения ДНК обладают цитотоксическим либо мутагенным эффектом и, как следствие, вызывают гибель или перерождение клеток. В ходе эволюции образовалась специализированная система защиты клетки от повреждений - система репарации ДНК. Системы репарации присутствуют во всех живых организмах от бактерий до человека и являются высоко консервативными [1-3]. Ферменты репарации ДНК играют важную роль в обеспечении функций ДНК и жизни клетки. С каждым днем увеличивается число примеров, иллюстрирующих важность репарации ДНК в предотвращении различных заболеваний [4-8]. Поэтому изучение этих ферментов в последнее время вызывает особый интерес. Знания о механизмах и особенностях действия ферментов репарации могут приблизить человечество к решению проблем раннего старения и лечения болезней, связанных с высоким уровнем генерации мутаций в геноме.

Многие поврежденные основания лишь незначительно отличаются по структуре от нормальных оснований и практически не нарушают строения двойной спирали ДНК. Тем не менее, ферменты репарации находят повреждения среди миллионов ^модифицированных оснований. Одним из часто встречающихся повреждений азотистых оснований ДНК является 8-оксогуанин. Остаток 8-оксогуанина отличается от немодифицированного гуанина только двумя дополнительными атомами: атомом кислорода при С-8 и атомом водорода при N-7. Данное повреждение удаляется из ДНК 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазами. Эти ферменты обладают двумя типами каталитической активности: N-гликозилазной и АР-лиазной. Несмотря на большой интерес к выяснению природы высокой специфичности 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз, многие аспекты этой проблемы до сих пор оставались неизученными. В качестве одной из гипотез, объясняющих высокую специфичность данных ферментов к 8-оксогуанину, было предположение о том, что ферменты претерпевают ряд конформациопных изменений, которые способствуют образованию специфических взаимодействий с ДНК-субстратом. Такие изменения структуры фермента и ДНК-субстрата могут, в принципе, протекать как через последовательность стадий с образованием множества промежуточных состояний фермент-субстратного комплекса, так и через «согласованный» механизм с одновременным перемещением в пространстве отдельных групп и атомов фермента и субстрата для достижения каталитически компетентного состояния [9,10].

К началу выполнения настоящей работы была известна лишь структура формамидопиримидин-ДНК-гликозилазы (Fpg) из Thermus thermopholus в свободном состоянии [11] и отсутствовали данные о том, какие изменения претерпевают 8-оксогуапин-ДНК-гликозилазы при образовании фермент-субстратных комплексов. Не было также данных об изменениях конформаций ферментов в ходе протекания каталитических стадий. Кинетические исследования процессов репарации ДНК, были проведены преимущественно в стационарных условиях, не позволяющих регистрировать быстропротекающие стадии узнавания ферментами специфических сайтов в цепи ДНК. Кроме того, анализ данных проводился на основе классической двухстадийной кинетической схемы Михаэлиса-Ментен [12-14], не учитывающей возможности образования множества промежуточных фермент-субстратных комплексов.

Цель настоящей работы состояла в том, чтобы установить роль конформационной динамики ферментов и ДНК-субстратов в протекании ферментативных реакций с участием 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз из Е. coli (Fpg) и человека (hOggl) и изучить предстационарную кинетику этих процессов. Задачи настоящего исследования состояли в следующем:

• методом «остановленной струи» с регистрацией изменений интенсивности флуоресценции остатков Тгр в ферментах и 2-аминопурина в ДНК обнаружить конформационные переходы в молекулах ферментов и ДНК-субстратов;

• при протекаиии процессов в условиях «одного оборота фермента» изучить детальные кинетические механизмы;

• с использованием постадийного усложнения структуры ДНК-субстрата определить молекулярную природу отдельных стадий;

• выяснить природу стадий, обеспечивающих высокую специфичность узнавания ферментами поврежденного участка в молекуле ДНК. Конформационные переходы в ходе каталитических циклов регистрировались по изменению интенсивности флуоресценции остатков триптофана (Тгр) в ферментах и вводимых в ДНК остатков 2-аминопурина (2-аРи) в условиях «одного оборота фермента» [15, 16]. Поскольку узнавание субстратов и их превращение протекало в миллисекунд ном и секундном диапазонах, то в работе использовали метод остановленной струи («stopped-flow»). Для выяснения механизма узнавания поврежденного основания в ДНК был использован способ постадийного усложнения структуры ДНК-субстратов. Переход от неспецифического лиганда (наиболее простые взаимодействия) к специфическим субстратам (полный цикл ферментативных реакций), содержащим остаток 8-оксогуанина или образующийся из него в ходе ферментативной реакции в качестве интермедиата апурин/апиримидиновый сайт, позволил установить последовательность конформационных переходов в реагирующих молекулах и понять их природу. Чтобы выяснить, на какой из стадий ферментативного процесса происходит отбор специфического субстрата, то есть, как происходит узнавание поврежденного участка среди множества неповрежденных нуклеотидов, в работе исследовано поведение мутантной формы фермента Fpg F110W, содержащей замену остатка Phe-110, принимающего участие в узнавании субстрата, на флуоресцирующий остаток Тф. Кроме того, были исследованы субстраты, содержащие напротив остатка 8-оксогуанина в соседней цепи некомплементарные нуклеотиды A, G и Т.

Полученные в работе данные о кииетическом механизме и динамике конформационных превращений ферментов Fpg и hOggl при взаимодействии с ДНК-субстратами были подтверждены данными рентгеноструктурного аиализа и ЯМР-спектроскопии [17-19], появившимися в ходе выполнения исследования в последние годы. Сопоставление конформационных изменений ферментов и ДНК-субстратов с данными о структурах свободных ферментов, их комплексов с субстратами и интермедиатами позволило построить молекулярпо-кинетические модели процессов взаимодействия ферментов Fpg и hOggl с ДНК-субстратами. Полученные модели позволили связать конформационные переходы взаимодействующих молекул с элементарными актами ферментативных процессов. Предложены детальные кинетические модели взаимодействия ферментов и ДНК-субстратов и определены константы скорости отдельных стадий, входящих в эти модели. Установлены стадии ферментативных процессов, которые вносят наибольший вклад в обеспечение специфичности ферментов к ДНК-субстратам. Для фермента hOggl подтверждено и кинетически охарактеризовано участие продукта первой каталитической стадии (свободного основания oxoG) в качестве кофактора на последующей стадии - реакции p-элимипирования - приводящей к разрыву рибозофосфатного остова.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Кинстичсские исследования механизмов ферментативных реакций в предетационарных условиях

Способность белков и ДНК существовать в различных конформациях - это уникальная особенность макромолекул. Ферментативные процессы с их участием сопровождаются конформационными перестройками [20]. Стадии связывания субстратов и каталитические стадии приводят к превращению субстратов в продукты и сопровождаются изменениями конформаций фермент-субстратных комплексов. То есть, существует прямая связь между конформациопной динамикой и функциональной активностью ферментов [21-24].

Тем не менее, в настоящее время динамика конформационных изменений ферментов и ее связь с каталитическими функциями остается слабо изученной областью [25-27]. Действительно, понимание механизмов ферментативных реакций в основном базируется на статических структурных данных, получаемых из рентгеноструктурного анализа и ЯМР-спектроскопии, а также на данных стационарной ферментативной кинетики и анализа строения интермедиатов и продуктов превращения субстратов [28-30]. Несомненно, эти данные вносят большой вклад в понимание природы ферментативного катализа. Однако, основываясь лишь на перечисленных методах, невозможно построить детальную молекулярно-кинетическую модель ферментативного процесса.

Изучение ферментативных реакций в стационарных условиях приводит к потере значительной части информации о механизме процесса и промежуточных формах фермента [31, 32]. Параметры стационарной кинетики А^кат и км являются сложными функциями констант скорости всех индивидуальных реакций, протекающих в ходе ферментативного процесса [33]. В Таблице 1 приведены примеры нескольких механизмов реакции и представлены зависимости kK3J и Км от констант скорости отдельных стадий. Видно, что усложнение механизма реакции приводит к значительному усложнению выражений для ккп и Км, что, в свою очередь, не позволяет определить константы скорости индивидуальных стадий.

К кг E + ES-»-Е + Р ккат ~ кг v к2 + кл Км к, к | kj Е + S -j—Е S ЕР-- Е + Р *. к2 к ~ ^ кат к2 + к2 + къ кгкъ + кАк2 + клкъ м Цк2 + к2 + *3)

ЕР-»- Е + Р кл к.2 к3 1 — к2ктк^ кат (к2 + к2)(кА + къ) + к2къ + кгк4 к^к2(к^ К}) к^к^) + к2к^к4 м К ((к2 + к2)(кА + кг) + к2к3 + к3к4)

Детальные кинетические исследования должны включать определение всех кинетических параметров реакции взаимодействия фермента и субстрата. Прямое определение констант скорости элементарных стадий реакции может вытекать из анализа предстационарпой кинетики реакции.

Общий случай реакции превращения субстрата в продукт с участием произвольного числа п промежуточных комплексов может быть описан Схемой 1.

Схема 1 кх к2 къ кп кп+] К\ Кг Кг К где Е - фермент, S - субстрат, (E*S)n - различные фермент-субстратные комплексы, Р - продукт реакции, здесь и далее k/k.j - константы скорости, характеризующие i-тую стадию реакции.

Кинетику этого процесса описывает система дифференциальных уравнений (1)-(6). Решение этой системы уравнений позволяет получить зависимость концентрации участников реакции от времени и начальных концентраций взаимодействующих веществ. Константы скорости элементарных стадий реакции находят с помощью методов линейной или нелинейной регрессии.

В том случае, когда прямое решение системы уравнений невозможно, применяют методы численного интегрирования дифференциальных уравнений [34]. d[ES], *,[S][E] + A:.2[ES]2 - (*, + ЛДО], (1) d[ES]| i+i)[ES](i+D - (K + ^,+i)[ES]i (2) d[ES]

4)

E0 = [E]+ IflES]. n

S0 = [S] + [P] + Z[ES]i

1Г-Л»[ES]» (6)

При избытке одного из реагентов данную систему уравнений можно проинтегрировать. Например, в случае So » Ео, можно считать концентрацию субстрата постоянной и заменить бимолекулярный нелинейный член &i[E][S] на псевдомономолекулярный &i[E][S]o, линейно зависящий только от одной переменной концентрации. При этом получается система n +1 линейных дифференциальных уравнений, которая легко решается стандартным способом путем нахождения корней характеристического уравнения степени п, собственные значения которого позволяют рассчитать значения всех констант скорости [34]. Поскольку процесс протекает в условиях множественного оборота фермента, то после протекания реакции в предстационарном режиме по истечении времени t » т (т - характеристическое время самой медленной стадии), реакция переходит в стационарный режим.

В условиях одного оборота фермента (Ео > So) необходимо решать систему дифференциальных уравнений (1)-(6) без дополнительных упрощений, то есть численно. Однако в этом случае удается зарегистрировать все фермент-субстратные комплексы и интермедиаты реакции и охарактеризовать все стадии ферментативного процесса.

Таким образом, методы предстационарной кинетики позволяют детально проанализировать механизм ферментативной реакции. Хотя этот подход более сложен технически и при его использовании требуется трудоемкий математический анализ кинетических кривых, изучение ферментативных реакций в предстационарных условиях позволяет в значительной степени углубить знания о механизмах действия ферментов [35,36].

При изучении биологических объектов используются такие методы предстационарной кинетики, как метод прерывания реакции («quench-flow») и метод остановленной струи («stopped-flow»), которые могут быть использованы для большого круга ферментов и позволяют минимизировать объемы и количество реагирующих веществ. В основе обоих методов лежит быстрое, в течение < 1 мс, смешивание взаимодействующих веществ и остановка потока реакционной смеси. Прерывание реакции в методе «quench-flow» происходит либо при быстром замораживании/нагревании реакционной смеси, либо при смешивании с веществами, блокирующими протекание реакции. Анализ состава реакционной смеси на различных временах от начала реакции в интервале времени порядка 1-1000 мс дает возможность построить кинетические зависимости для интермедиатов и конечных продуктов. В методе остановленной струи изменение концентрации веществ в ходе химической реакции регистрируется, как правило, оптическими методами, например, по изменению оптического поглощения или интенсивности флуоресценции раствора.

Хорошо известно, что триптофан (Тгр) является наиболее интенсивно флуоресцирующей аминокислотой [15], и примерно 90% всей флуоресценции белков обычно обусловлено его присутствием. Максимумы испускания флуоресценции белков зависят от локального окружения остатков Тгр в молекуле полипептида. Например, сдвиг в коротковолновую область интерпретируют, как результат экранирования триптофановых остатков от водной фазы. В то же время процесс денатурации приводит к длинноволновому сдвигу в спектре испускания флуоресценции и, приблизительно, к одной и той же величине максимума в спектре испускания всех белков. Свойства Тгр позволяют использовать его как высокочувствительный флуоресцентный маркер конформационных изменений в молекулах белков [37-39]. Однако необходимо иметь в виду, что большинство белков содержит несколько остатков Тгр, находящихся в различном окружении, поэтому спектральные свойства каждого из них могут различаться.

Флуоресцентные свойства макромолекул часто не позволяют получать из эксперимента желаемую информацию. В таком случае используют флуорофоры, которые хотя и являются посторонними по отношению к исследуемой системе, но имеют лучшие спектральные свойства. Например, при исследовании ферментативных реакций с участием нуклеиновых кислот используют аналоги нуклеотидов, которые флуоресцируют и при этом сохраняют способность к образованию водородных связей с ^модифицированными нуклеотидами. Конформационные переходы в молекуле ДНК, как правило, регистрируют по изменению интенсивности флуоресценции 2-аминопурина (2-аРи). Остаток 2-аРи является одним из самых привлекательных флуоресцирующих аналогов азотистых оснований. В паре 2-аРи/Т происходит образование двух водородных связей, как и в случае с аденином, в то же время в паре 2-аРи/С возможно образование как одной, так и двух водородных связей [40, 41]. Таким образом, встраивание остатка 2-аРи напротив оснований С и Т приводит к минимальным нарушениям структуры ДНК. Известно, что интенсивность флуоресценции 2-аРи очень сильно зависит от внешнего окружения. Например, при наличии стэкинг-взаимодействия между соседними основаниями, а также при образовании двухспиральных структур ДНК происходит резкое уменьшение интенсивности флуоресценции остатков 2-аРи [42]. Чувствительность характеристик флуоресценции 2-аРи к конформационным изменениям, происходящим в двойной спирали ДНК, способствует использованию именно этого маркера при исследовании взаимодействий ферментов с ДНК. 2-Аминопурин применяли для изучения кинетических характеристик различных ферментов, взаимодействующих с ДНК, например фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I [43], ДНК-полимеразы Р и X [37, 44], РНК-полимеразы бактериофага Т7 [45], ДНК-полимеразы бактериофагов Т4 и RB69 [46, 47], ДНК-метилтрансфераз [48], ДНК-гликозилаз [39] и других ферментов.

В настоящем обзоре рассмотрены результаты кинетических исследований ферментов, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами в предстационарных условиях. Выбор конкретных ферментов, вошедших в обзор литературы, основывался на нескольких факторах: (1) это ферменты, взаимодействующие с нуклеиновыми кислотами; (2) для этих ферментов или их ближайших гомологов известны кристаллические структуры в свободном состоянии и/или в комплексе с субстратом. Несмотря на огромное количество работ посвященных ферментам, взаимодействующим с ДНК, наличие перечисленных ограничений приводит к конечному числу рассматриваемых примеров. В обзоре представлены некоторые ДНК- и РНК-полимеразы, рассмотрены также представители ДНК-лигаз, ДНКметилтрансфераз и ДНК-гликозилаз. Особое внимание направлено па связь структуры взаимодействующих молекул и конформационных изменений с кинетическим механизмом реакции и на выяснение роли отдельных элементарных стадий в протекании ферментативного процесса.

Способность удваивать геном является необходимым условием жизни всех организмов. Считается, что самые первые ферменты обладали полимеразной активностью. Основной задачей полимераз является безошибочное копирование полной последовательности генома с целью сохранить всю закодированную в нем информацию. Полимеразы передвигаются вдоль ДНК и одновременно осуществляют синтез дочерней цепи. Эти ферменты могут иметь различные размеры, клеточные функции, точность синтеза и чувствительность к аналогам нуклеотидов. Однако их объединяет общая особенность - реакция переноса нуклеотида на З'-конец праймера, в которой участвуют двухвалентные ионы металла и несколько групп консервативных аминокислотных остатков (Рис. 1).

Сравнение аминокислотной последовательности [49], а также анализ кристаллических структур ДНК-полимераз [50] позволяет разделить их на пять семейств. В настоящее время известны кристаллические структуры представителей четырех семейств. Наиболее изученным из них является семейство ДНК-полимеразы I (pol I) или А-семейство, которое включает фрагменты Клепова ДНК-полимеразы I Escherichia coli и Bacillus stearothermophilus, ДНК-полимеразу I Thermus aquaticus и РНК- и ДНК-полимеразы фага Т7 [51-53]. Второе семейство ДНК-зависимых ДНК

1.1. ДНК- и РНК-полимсразы

Рис. 1. Общая структура активного центра полимераз. Номера аминокислотных остатков соответствуют ДНК-полимеразе I Escherichia coli.

Здесь и далее рисунки представлены в том виде, в каком они приведены в оригинальных работах. полимераз называется pol а или В-семейство. Все эукариотические репликационные ДНК-полимеразы и полимеразы фагов Т4 и RB69 принадлежат этому семейству [54, 55]. Обратные транскриптазы, РНК-зависимые РНК-полимеразы и теломеразы имеют ряд общих структурных элементов и объединены в единое семейство RT. В то же время, структура ДНК-полимеразы р не имеет структурного подобия ни с одним из выше перечисленных семейств [56]. На основании сравнения аминокислотной последовательности бактериальные ДНК-полимеразы III также выделены в отдельное семейство [49].

Анализ известных кристаллических структур ДНК-полимераз выявил общие элементы архитектуры этих ферментов независимо от их принадлежности к разным семействам [57]. Общую форму ДНК-полимераз сравнивают со строением правой руки и выделяют такие элементы как большой палец (thumb), ладонь (palm) и пальцы (fingers). Главная функция домена «palm» - это каталитическая реакция полимеризации, домен «fingers» участвует в связывании нуклеозид-трифосфата (dNTP) и одноцепочечного участка ДНК в месте образования новой комплементарной пары. Домен «thumb» участвует в связывании ДНК и продвижении фермента после очередного акта катализа вдоль ДНК. Среди всех ДНК-полимераз «ра1т»-домен наиболее консервативен, в то время как «fingers»- и «ШитЬ»-домены различны во всех четырех семействах, для которых установлены кристаллические структуры (Рис. 2) [58]. Структура домена «palm» всех известных полимераз состоит из 4-6 ^-складчатых слоев и двух а-спиралей. Пространственное расположение этих элементов имеет одинаковые особенности для всех семейств за исключением семейства полимеразы р. Домен «thumb» состоит в основном из а-спиралей, однако структурные особенности этого домена значительно отличаются в различных семействах. Наибольшие различия в последовательностях аминокислот и структуре полимераз относятся к домену «fingers». Вторичная структура этого домена в трех из четырех семейств, для которых установлена кристаллическая структура, представлена а-спиралями различной длины и пространственной укладки относительно друг друга (Рис 2А, В, Г). Однако в случае семейства RT «fingers»-домен состоит как из антипараллельных Р-складчатых слоев, так и а-спиралей (Рис. 2Б). комплексов ДНК-пол и мераз из разных семейств: (А) семейство pal I, (Б) семейство RT, (В) семейство pol а, (Г) семейство pol р [57].

Рис. 2. Кристаллические структуры двойных

Несмотря на структурные различия, описанные выше, все полимеразы имеют общие особенности синтеза ДНК, заключающиеся в однотипном связывании ДНК, нуклеозид-трифосфатов и ионов металла, необходимых для катализа (Рис. I). Кроме того, все полимеразы имеют общее строение активного центра и изгибают молекулу ДНК примерно на 90 Сравнение структуры двойных (фермент*ДНК) и тройных комплексов (фермент-ДНК'сПМТР) показало, что полимеразы претерпевают значительные структурные изменения при связывании н у клеозид-три фосфата [52, 54, 59-61]. Такие конформационные изменения могут отвечать за специфичность/ошибочность полимеразы в процессе синтеза ДНК. Однако недавние исследования показали, что возможным фактором ошибочности некоторых ДНК-полимераз является химическая стадия процесса |62,63].

Исследования конформационных изменений ДНК-полимераз и их субстратов в процессе их взаимодействия и катализа дают возможность ответить на многие вопросы, связанные с ферментативной специфичностью и активностью этих ферментов. I fa основе кристаллических структур Д1 IK-полимераз и их комплексов, а также кинетических исследований, проведенных методами быстрой кинетики, были соотнесены конформационные изменения с различными стадиями ферментативного акта и установлена молекулярная модель полимеризационного цикла [37,43, 46].

Ниже более подробно рассмотрены структурно-динамические аспекты функционирования различных полимераз,

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кузнецов, Никита Александрович

выводы

1. Впервые по регистрации флуоресценции остатков Тгр в белках и 2-аРи в ДНК методом остановленной струи исследована предстационарная кинетика ферментативных реакций с участием 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Fpg из Е. coli и hOggl человека. Установлено, что в ходе каталитического цикла происходят множественные конформационные изменения обоих ферментов и ДНК-субстратов. Такие изменения приводят к взаимной адаптации структур взаимодействующих молекул, формированию каталитически-активных состояний ферментов и способствуют превращению субстрата в продукт.

2. Предложены кинетические схемы взаимодействия ферментов Fpg и hOggl с ДНК-субстратами и определены константы скорости и равновесия для всех стадий, входящих в эти схемы.

3. С использованием подхода, основанного на последовательном усложнении строения ДНК-субстрата, определена молекулярная природа конформационных изменений молекул ферментов и ДНК-субстратов, происходящих в процессе их взаимодействия.

4. Установлено, что дискриминация ферментом Fpg различных типов повреждений ДНК (8-оксогуанин и 5,6-дигидроурацил) происходят на второй и третьей стадиях процесса узнавания субстрата; дискриминация ферментами Fpg и hOggl различных азотистых оснований, расположенных в комплементарной цепи напротив повреждения, происходит на второй стадии связывания субстратов.

5. Показано, что скорость превращения АР- и охоО-субстратов ферментом hOggl в присутствии 8-бромгуанина увеличивается в 8 и 2 раза, соответственно. Полученные данные подтверждают, что 8-оксогуанип, образующийся при взаимодействии hOggl с oxoG-субстратом в ходе первой каталитической стадии - гидролизе N-гликозидной связи, выполняет роль кофактора второй каталитической стадии - реакции р-элиминирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа является первым комплексным кинетическим исследованием механизма действия 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Fpg Е. coli и hOggl человека. Ферменты Fpg и hOggl принадлежат разным структурным классам ДНК-гликозилаз, однако выполняют одинаковые клеточные функции, удаляя из ДНК окисленные азотистые основания. В настоящее время установлена структура этих ферментов и химический механизм их действия. Известно, что взаимодействие ферментов с ДНК-субстратами приводит к копформационным изменениям как в молекуле белка, так и в молекуле субстрата. Считается, что такие изменения структур взаимодействующих молекул приводят к образованию специфических невалентных контактов (водородные связи, стэкипг и др.), в результате этого реализуется высокоэффективное узнавание и связывание поврежденных участков ДНК.

Впервые исследована динамика конформационных превращений в молекулах ферментов и ДНК-субстратов, что имеет фундаментальное значение для исследования процесса взаимодействия этих ферментов с ДНК. Поскольку изменение структуры взаимодействующих молекул происходят в миллисекундном диапазоне времени, в работе использовали метод остановленной струи. Для наблюдения за конформационными изменениями ферментов и ДНК регистрировали интенсивность флуоресценции Тгр и 2-аРи, соответственно. В работе использовали метод усложнения структуры ДНК-субстратов, который позволил выделить конформационные изменения, характеризующие определенные взаимодействия между ферментом и субстратом. Использование мутантной формы Fpg F110W дало возможность установить конформационные изменения фермента, связанные с движением этого аминокислотного остатка. Для определения специфичности ферментов использовали ДНК-субстраты, содержащие различные типы поврежденных оснований, а также различные азотистые основания напротив повреждения. Кроме того, в работе были определены кинетические характеристики процесса взаимодействия hOggl с ДНК-субстратами в присутствии BrG.

Взаимодействие ферментов Fpg и hOggl с ДНК, не содержащей модифицированных оснований, приводило к образованию неспецифических комплексов. В обоих случаях при образовании этих комплексов происходит «разрыхление» ДНК. Однако процессы, вызывающие это «разрыхление» имеют разную природу. В случае с Fpg этот процесс, по-видимому, связан с интеркаляцией аминокислотного остатка Phe-110, в то же время в комплексе с hOggl возможно выворачивание ^модифицированного основания в «предкаталитический» центр фермента. Кинетические исследования обоих ферментов свидетельствуют о том, что скорость образования неспецифического комплекса фермент*ДНК близка к диффузионно-контролируемому пределу.

Взаимодействие ферментов с F-лигандом приводит к формированию каталитически-активного комплекса. Этот процесс был зарегистрирован по интенсивности флуоресценции Тгр для Fpg. Несмотря на то, что hOggl содержит 10 остатков Тгр (Fpg содержит 5 Тгр) при его взаимодействии с F-лигандом интенсивность флуоресценции Тгр изменялась незначительно. Однако проведенные эксперименты позволили зарегистрировать процесс встраивания аминокислотных остатков ферментов в полость F-лиганда.

При взаимодействии ферментов с АР-субстратом, кроме стадий связывания аналогичных F-лиганду, были зарегистрированы химические стадии ферментативного процесса и диссоциация комплекса фермент»продукт. Эти исследования кинетики конформационных изменений при взаимодействии ферментов с G- и F-лигандами и АР-субстратом послужили основой для анализа наиболее сложного процесса взаимодействия с oxoG-субстратом.

При взаимодействии ферментов с oxoG-субстратом было показано, что для фермента Fpg можно зарегистрировать пять стадий образования каталитически-активного комплекса. Первичное неспецифическое связывание приводит к формированию «столкновителыюго комплекса» с ДНК, в котором происходит узнавание специфического сайта и образование второго комплекса. Именно вторая стадия ответственна за узнавание. Основываясь на рентгеноструктурных данных можно предположить, что на этой стадии происходят конформационные изменения в области Phe-110. Эти изменения играют ключевую роль в процессе распознавания поврежденного участка ДНК и имеют важное значение при узнавании типа повреждения. Эксперименты с мутантом F110W позволяют заключить, что остаток Arg-108, расположенный недалеко от Phe-110, также участвует в этой стадии процесса и взаимодействует с основанием, расположенным напротив повреждения. Эти две аминокислоты осуществляют дискриминацию различных ДНК-субстратов. В том случае, когда в сайте связывания фермента находится специфический субстрат, происходит третья стадия процесса - выворачивание поврежденного основания. Эта стадия приводит к формированию полости в дуплексе ДНК.

Четвертая стадия характеризует процесс встраивания аминокислотных остатков Phe-110, Met-73 и Arg-108 в образовавшуюся в ДНК полость. После этого, на пятой стадии, происходит подстройка конформации активного центра фермента и осуществление каталитических стадий процесса.

В то же время, для фермента hOggl было зарегистрировано три стадии связывания oxoG-субстрата. Образование неспецифического комплекса приводит к «разрыхлению» двойной спирали субстрата и быстрому выворачиванию поврежденного основания в активный центр фермента. Вторая и третья стадии процесса связывания субстрата отражают последовательное встраивание аминокислот (по данным рентгеноструктурного анализа Asn-149, Tyr-203, Arg-154 и Arg-204) в полость дуплекса. Показано, что дискриминация субстратов по основанию, расположенному напротив повреждения, происходит на второй стадии процесса. В то же время третья стадия приводит к формированию каталитически-активного комплекса.

Для обоих ферментов показано, что после образования каталитически-активного комплекса последовательно происходят химические стадии ферментативного процесса. При этом, в соответствии с литературными данными было показано, что скорость-лимитирующей стадией для Fpg является N-гликозилазная реакция, а для hOggl - реакция P-элиминирования. Завершает ферментативный цикл равновесная стадия диссоциации комплекса фермент'продукт.

Таким образом, в результате работы установлена последовательность элементарных актов взаимодействия 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Fpg Е. coli и hOggl человека с ДНК-субстратами и изучена конформационная динамика ферментов и ДНК. Предложены кинетические схемы, позволяющие описать наблюдаемые изменения флуоресценции Тгр и 2-аРи, и определены константы скорости стадий, входящих в эти схемы. Кроме того, в прямых экспериментах по разделению продуктов реакции электрофорезом в ПААГ определены константы скорости химических стадий и показано, что они хорошо согласуются с величинами этих констант, полученных методом остановленной струи. По результатам флуоресцентного титрования определены константы диссоциации комплексов фермент'продукт. Полученные в работе данные указывают на то, что механизм ферментативного процесса в случае обоих ферментов соответствует модели индуцированного соответствия Кошланда.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Кузнецов, Никита Александрович, Новосибирск

1. Friedberg Е.С., Walker G.C., Siede W. DNA repair and mutagenesis. ASM Press. Washington. DC. 1995.

2. Gros L„ Saparbaev M.K., Laval J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 2002. V. 21. P. 8905-8925.

3. AravindL., Walker D.R., Koonin E.V. Conserved domains in DNA repair proteins and evolution of repair systems. Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 1223-1242.

4. Cooke M.S., Evans M.D., Dizdaroglu M., Lunec J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 2003. V. 17. P. 1195-1214.

5. Evans M.D., Dizdaroglu M., Cooke M.S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutat. Res. 2004. V. 567. P. 1-61.

6. Gupta P.K., Sirover M.A. Regulation of DNA repair in serum-stimulated xeroderma pigmentosum cells. J. Cell. Biol. 1984. V. 99. P. 1275-1281.

7. Lu. R., Nash H.M., Verdine G.L. A mammalian DNA repair enzyme that excises oxidatively damaged guanines maps to a locus frequently lost in lung cancer. Curr. Biol. 1997. V. 7. P. 397-407.

8. Audebert M., Charbonnier J.B., Boiteux S„ Radicella J.P. Mitochondrial targeting of human 8-oxoguanine DNA glycosylase hOGGl is impaired by a somatic mutation found in kidney cancer. DNA Repair. 2002. V. 1. P. 497-505.

9. Benkovic S.J., Hammes-Schiffer S. A perspective on enzyme catalysis. Science. 2003. V. 301. P. 1196-1202.

10. Bruice T.C. A view at the millennium: the efficiency of enzymatic catalysis. Acc. Chem. Res. 2002. V. 35. P. 139-148.

11. Tchou J., Bodepudi V., Shibutani S., Antoshechkin I., Miller J., Grollman A.P., Johnson F. Substrate specificity of Fpg protein recognition and cleavage of oxidatevely damaged DNA. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 15318-15324.

12. Rosenquist T.A., Zharkov D.O., Grollman A.P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997. V. 94. P. 7429-7434.

13. Zharkov D.O., Rosenquisti Т.A., Gerchman S.E., Grollman A.P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 28607-28617.

14. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир. 1986. С. 2228 и 345-365.

15. Royer С.A. Probing protein folding and conformational transitions with fluorescence. Chem. Rev. 2006. V. 106. P. 1769-1784.

16. DavidS.S. DNA search and rescue. Nature. 2005. V. 434. P. 569-570.

17. Amara P., Serre L„ Castaing В., Thomas A. Insights into the DNA repair process by the formamidopyrimidine-DNA glycosylase investigated by molecular dynamics. Protein Sci. 2004. V. 13. P. 2009-2021.

18. Hammes G.G. Multiple conformational changes in enzyme catalysis. Biochemistry. 2002. V.41.P. 8221-8228.

19. Boehr D.D., Dyson H.J., Wright P.E. An NMR perspective on enzyme dynamics. Chem. Rev. 2006. V. 106. P. 3055-3079.

20. Olsson M.H.M., Parson W.W., Warshel A. Dynamical contributions to enzyme catalysis: critical test of a popular hypothesis. Chem. Rev. 2006. V. 106. P. 17371756.

21. Giraldo J., Roche D., Rovira X., Serra J. The catalytic power of enzymes: conformational selection or transition state stabilization? FEBS Lett. 2006. V. 580. P. 2170-2177.

22. Aganval P.К Role of protein dynamics in reaction rate enhancement by enzymes. J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 15248-15256.

23. Eisenmesser E.Z., Millet O., Labeikovsky W., Korzhnev D.M., Wolf-Watz M„ Bosco D.A., Skalicky J.J., Kay L.E., Kern D. Intrinsic dynamics of an enzyme underlies catalysis. Nature. 2005. V. 438. P. 117-121.

24. Eisenmesser E.Z., Bosco D.A., Akke M., Kern D. Enzyme dynamics during catalysis. Science. 2002. V. 295. P. 1520-1523.273031,32,33,34,35.