Узнавание ДНК урацил-ДНК-гликозилазой из плаценты человека

Василенко, Наталья Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Узнавание ДНК урацил-ДНК-гликозилазой из плаценты человека
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Узнавание ДНК урацил-ДНК-гликозилазой из плаценты человека"

На правах рукописи

?~з (■.

13;•:

Василенко Наталья Леонидовна

Узнавание ДНК урацнл-ДНК-глнкозилазой из плаценты человека

03.00.04.- Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2000

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Невинский Г.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Хомов В.В. кандидат биологических наук Ходырева С.Н.

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится « » ^сс^и^ 2000 г. в 3 часов на заседании диссертационного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН

Автореферат разослан « ^ » 2000 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор химических наук Фёдорова О.С.

ъ ш.тги.^о

£$01. В41М-Х*! о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Структурная целостность ДНК постоянно подвергается действию множества экзогенных и эндогенных агентов. Для того, чтобы им противостоять, клетки имеют ряд защитных механизмов, которые действуют на различных уровнях, предотвращая и/или исправляя повреждения. Однако молекулярные механизмы узнавания и удаления поврежденных оснований из ДНК ферментами репарации до конца не ясны.

Одним из ключевых и самых универсальных путей репарации таких точечных повреждений в ДНК, как модификация оснований, является эксцизион-ная репарация. В эксцизионной репарации оснований основную роль играют ДНК-Ы-гликозилазы. В связи с этим представляется чрезвычайно важным детальное изучение молекулярных механизмов узнавания и исправления повреждений такими ферментами. Впервые этот механизм был обнаружен на примере остатков урацила, возникающих в ДНК в результате спонтанного дезаминирования цитози-на или при ошибочном включении урацила при синтезе ДНК. Этот процесс осуществляется с помощью урацил-ДНК-гликозилазы (УДГ), гидролизующей N -гликозидную связь между урацилом и сахарофосфатным остовом ДНК. УДГ относится к монофункциональным гликозилазам, не обладающим апурин/апиримидин - лиазной активностью и является высококонсервативным ферментом.

Рентгеноструктурный анализ (РСА) УДГ человека, вируса простого герпеса и Е.соИ выявил некоторые принципы узнавания «неправильных» оснований в ДНК. Тем не менее, молекулярные механизмы узнавания и удаления поврежденных оснований из ДНК до конца не выяснены. Изучение взаимодействий УДГ с ДНК является актуальным и необходимо для более глубокого понимания механизмов действия ферментов репарации.

Цель работы. Целью данной работы было изучение закономерностей взаимодействия УДГ с ДНК. Для этого представлялось целесообразным:

1) исследование активности УДГ по отношению к одноцепочечным (оц) и двуце-почечным (дц) олигонуклеотидам (ОМ);

2) изучение влияния расположения и окружения модифицированных нуклеотид-ных (нд) звеньев в ОИ различного состава и их комплексов на активность УДГ;

3) исследование влияния модификаций сЮ-звена на эффективность комплексооб-разования и скорость катализируемой УДГ реакции;

4)изучение специфических и неспецифических взаимодействий УДГ с ДНК на количественном уровне с помощью анализа ингибирования исследуемого фермента ON различного состава и длины;

5)оценка относительного вклада специфических и неспецифических взаимодействий УДГ с ДНК в обеспечение специфичности действия фермента.

Научная новизна и практическая ценность работы. Работа представляет собой первое, проведенное на количественном уровне систематическое исследование механизмов узнавания УДГ ДНК, дезоксирибоолигонуклеотидов и их производных, содержащих дезоксиурацил (dU) или его аналоги в различных положениях цепи. Впервые проведен детальный кинетический и термодинамический анализ закономерностей взаимодействия УДГ с ДНК; определены величины K¡ (AG0), характеризующие эффективность комплексообразования УДГ с ON различного состава и длины. Опубликованные в 1995 г. результаты РСА УДГ позволили сопоставить, а также интерпретировать данные РСА в свете термодинамического и кинетического анализов действия фермента.

Публикации и апробации работы. По материалам диссертации опубликовано 7 статей. Результаты работы были доложены на 9 Международных конференциях: French-Russian Symposium on Regulation of Gene Expression, Novosibirsk, Russia, 1995; 3d IUBMB Conference on Molecular Recognition, Singapore, 1995; 4th New England Biolabs Workshop on Biological DNA Modification, Igls, Austria, 1997; XIII French-Russian Symposium, Montpellier - lie des Embiez, 1997; Recombination: mechanism and biological consequences, Avignon, France, 1995; Международная конференция «Современные концепции эволюционной генетики», Новосибирск, 1997; The 3d International Engelhardt Conference on molecular biology, Moscow, 1997; 1th International conference on bioinformatics of genome regulation and structure, Novosibirsk., Russia, 1998; 2d International conference on bioinformatics of genome regulation and structure, Novosibirsk, Russia, 2000.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 118 страницах, содержит 24 рисунка и 10 таблиц. Библиография включает 244 литературных источника

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В Лаборатории ферментов репарации НИБХ СО РАН был разработан новый подход анализа закономерностей белково-нуклеиновых взаимодействий. Было показано, что взаимодействие ферментов с нуклеиновыми кислотами (НК) на молекулярном уровне может быть успешно проанализировано с помощью постадийного упрощения или усложнения структуры протяженного лиганда. При этом постадийное усложнение структуры лиганда проводили в соответствии со схемой: ортофосфат или мононуклеотид (как минимальный лиганд фермента) —> оц неспецифические r0M0-d(pN)„ оц неспецифические гетеро- d(pN)„ —► оц специфические гетеро- d(pN)„ —> дц неспецифические гомо- d(pN)„ —» дц специфические гетеро- d(pN)„ —> специфические протяженные ДНК. Эффективность комплексообразования фермента с НК-лигандами в зависимости от их структуры и длины в случае УДГ оценивали с помощью метода ингибиторного анализа.

УДГ из плаценты человека была первым ферментом репарации, исследованным с помощью этого метода. К моменту начала исследований (1992 г.) дан-

ные РСА и особенности механизма действия УДГ еше были не известны. По существу, наши исследования позволили получить первые количественные оценки эффективности взаимодействия этого фермента с ПК. Результаты РСЛ комплексов УДГ с ДНК и ОМ позволили сопоставить данные двух методов, а также интерпретировать их на основе данных об относительном вкладе специфических и неспецифических контактов в сродство ДНК и описать узнавание ДНК ферментом с помощью термодинамической модели, а также установить факторы, обеспечивающие специфичность действия фермента.

/. Разработка метода тестирования активности УДГ

Усовершенствована методика выделения УДГ из плаценты человека. В качестве наиболее доступного субстрата УДГ была выбрана ДНК, содержащая остатки [3Н]сШ. Инкубация [3Н]сШ-ДНК с УДГ приводила к накоплению кислото-растворимого [3Н]урацила и убыли тритиевой метки в ислотонерастворимой фракции ДНК. Скорость выщепления оснований [3Н]сШ зависела от концентрации [3Н]<Ш-ДНК (рис. 1). В дальнейшем об активности фермента судили по уменьшению количества тритиевой метки в кислотонерастворимом осадке за единицу времени.

1.Я 1с |ДНК1,м. А*У«л

количества

з.

Рис. 1. Зависимость кислоторастворимой 3Н-метки, появляющейся в результате реакции, катализируемой УДГ, от концентрации [3Н]ДНК.

•.г

Условия проведения реакции, катализируемой УДГ, были оптимизированы так, чтобы начальные скорости были максимальными. Все эксперименты проведены в условиях протекания реакции псевдопервого порядка, концентрации УДГ соответствовали линейному участку зависимости начальной скорости реакции от концентрации фермента. Величина Км для [3Н]сШ-ДНК оценена близкой 0,3 ед. А26(/мл.

Эксперименты по выявлению типа ингибирования показали, что использованные оц и дц модельные (Ж ингибировали реакцию, катализируемую УДГ, по конкурентному типу. В качестве примера на рис. 2 приведены данные для с1(рА)10. Сродство оц и дц (Ж к УДГ достаточно низкое. В связи с этим определение величин К; в классическом варианте требовало больших количеств ОМ. Учитывая это, были использованы более экономичные эксперименты по определению концентраций (Ж, при которых достигается ингибирование реакции, катализируемой УДГ, на 50% Ом). Величины 150 определяли при концентрации субстрата, соответствующей 2КМ. Как следует из формулы, описывающей конкурентное ингибирование, и как показано в экспериментах с использованием ряда оц и дц СМ , в этих условиях 150 = ЗК;. Далее величину 150 использовали в качестве характеристики сродства УДГ к оц и дц ОЫ с учетом найденной поправки.

Рис. 2. Зависимость начальной скорости реакции накопления [3Н]урацила в кисло-торастворимой фракции, катализируемой УДГ, от концентрации d(pA)io при различных концентрациях [3Н]сШ-ДНК в координатах 1/V от I (а) и S/V от I (б). Кривые 1, 2, 3 соответствуют следующим концентрациям ДНК: 0,2, 0,3 и 0,45 ед. А260/мл.

2. Минимальный лиганд активного центра УДГ

Для определения минимального лиганда УДГ были оценены величины 150 для сЮТР, рибозы-5'-фосфата, дезоксирибозы-5'-фосфата и ортофосфата. Как видно из табл.1, величины 150 , характеризующие сродство УДГ к сШМР, зависят от основания. Сродство любого <ШМР, как и одного звена оц ДНК (см. ниже) примерно в 5-50 раз выше, чем остальных звеньев ОМ, взаимодействующих с УДГ. То есть, одно из звеньев любого ОЫ образует дополнительные контакты с одним из подцентров УДГ, предназначенных для узнавания ДНК. Исходя из данных табл. 1 следует, что одним из минимальных лигандов активного центра УДГ является ортофосфат. В пользу того, что специфическим участком УДГ, взаимодействующим с минимальными лигандами, является ее активный центр, свидетельствует то, что при переходе от неспецифических с!КМР к сШМР сродство лиганда возрастает примерно на порядок.

Как будет показано ниже, в пределах белковой глобулы УДГ расположено 10 звеньев или нуклеотидных пар оц и дц ДНК, соответственно. Поэтому для определения расположения активного центра УДГ были проведены эксперименты по выщеплению урацила из 5'-[32Р]с1(ри)1(1 и его дуплекса с с1(рА)10: показано, что УДГ выщепляет урацил преимущественно из 5' - концевых звеньев субстратов, при этом интенсивность расщепления зависит от положения сШ и уменьшается в порядке 2>3>1 (рис.3). Следовательно, активный центр УДГ расположен на расстоянии 2-х нуклеотидных звеньев от 5' -конца связанного с ферментом деканук-леотидного лигацда.

Таблица 1. Величины 15П рибо- и дезоксирибоолигонуклеотидов.

Ли га нл 15,), мкМ Лигянд 1?(Н мкМ Лиганд 150» мкМ

Рибоза-5' -фосфат 105000 Дезоксирибоза-5'фосфат 95000 кн2ро4 50000

АМР* 56000 имр* 100000 СМР* 148000

(рА)4 13000 (ри)3 20000 (рС)4 20000

(РА)« 4500 (ри>4 16000 (рС)й 6300

(рА)7 1000 ' (рЦ)в 3200 (рС)7 4000

(рА)9 770 (рЦ)я 1000 (рС),о 800

(рА),, 560 (ри)„ 270

(рА)|з 350

(рА)|6 350

адмр* 10000 dUMP* 5500 dCMP* 13500

с!(рА)2 6500 ¿(ри)4 1300 й(рС), 2500

<3(рА)4 2000 ¿(ри>6 450 <1(рС)я 2000

с!(рА)6 500 ¿(ри)8 200 ¿(рС)7 1500

¿(рА)я 100 й(ри)1П 100 й(рС)9 630

й(рА),п 30 с1(ри)12 50 <1(рО,2 400

£)(рА)]2 35 ^рЦ)м 45

(1(рА)|4 35

б(рА)„ 35

ТМР* 45000

с1(рТ)2 26000 а(рТ)8 1400 ¿(рТ),4 260

сЗ(рТ)4 8700 ВДю 250 <КрТ>16 240

с!(рТ)6 3200 <КрТЬ 250

Примечание: Экспериментальные величины 150 для сШМР и КМР в пределах ошибки эксперимента (20-40%) не отличаются от величин, полученных экстраполяцией логарифмических кривых к п=1.

12 3 4

Рис. 3. Электрофоретический анализ продуктов гидро-• лиза5'-[32Р]ё(ри)ю (2) и его дуплекса с (3(рА)ю (3) при

— инкубации субстратов с УДГ.1 - сКри)ю, 4 - с1(ри)„

~ различной длины. Цифры справа соответствуют длине

— _ контрольных (Ж.

3. Взаимодействие УДГ с одноиепочечными дезокси- и рибоолигонуклеотидалт На следующем этапе усложнения структуры лиганда были оценены величины 150 для оц d(pN)„. Как видно из рис. 4 и 5, все зависимости —Igl50 от п являются линейными при п < 10. Это указывает на аддитивность величин свободных энергий, характеризующих взаимодействие отдельных звеньев оц ON с УДГ. Отсутствие увеличения сродства ON к ферменту при п > 10 свидетельствует в пользу того, что ДНК-узнающий центр УДГ взаимодействует только с десятью звеньями НК. Девять из десяти нуклеотидных звеньев каждого из исследованных roMoON образуют с УДГ слабые контакты, характеризуемые величиной Kd, обратной величине фактора f (Kd=l/f), который легко оценить из наклонов соответствующих кривых. При этом фактор / характеризует увеличение сродства различных ON при их удлинении на одно звено.

5 10 15

Рис. 4. Зависимость величин — от числа мононуклеотидных звеньев (п) в составе (1(р.М)п: 1 - с!(рА)п, 2- й(рА)„х <1(рТ)„, 3 - <3(рТ)„, 4,5 -d(pC)n и с1[(рЯ)прТ], соответственно.

Рис. 5. Зависимость величин -lgl50 от числа мононуклеотидных звеньев (п) в составе d(PN)„:l - d(pU)n, 2 - (pU)„, 3 -

(pA)n,4- (pC)n-

Сродство одного из звеньев в составе гомос1(р^„ примерно в 10-50 раз выше, чем остальных. Из данных табл. 1 следует, что основной вклад в сродство УДГ к этому звену вносит межнуклеозидная фосфатная группа ОМ, эффективность взаимодействия которой с ферментом сопоставима с таковой для ортофос-фата. При этом относительные вклады структурных элементов в суммарное сродство одного звена в случае разных б(рМ)„ несколько различаются, что может быть следствием структурных особенностей сахаро-фосфатного остова рибо- и дезок-сирибо-ОЫ (см. ниже). В то же время, эти вклады почти близки к аддитивным.

Учитывая линейность ^-кривых, взаимодействие УДГ с неспецифическими оц (3(р^п различной длины можно описать схемой, приведенной на рис. 6. Согласно этой схеме, при связывании ферментом ON длиной не менее 2 звеньев существует несколько термодинамически эквивалентных вариантов образования комплексов. При достижении п = 10 возможно образование только одного термодинамически выгодного комплекса.

□-Активный центр

2* 3456789 10

□ □ О П

1"] м и и

рЫрЫ pNpN

Рис. 6. Схема взаимодействия 10 под-центров УДГ, включая активный центр

рЫрЫрК (вторая позиция), с (3(рЫ)п (Ж различ-

рЫрЫрК

нои длины.

и так далее для более длинных ОМ.

В целом, величину К| для любого гомоСЖ длиной до 10 звеньев можно получить путем перемножения величины К; для минимального лиганда на величины К, (1/1) для каждого из мононуклеотидных звеньев согласно геометрической прогрессии:

К; КрРОл = К, [ОЧМР)] •[ВД]"-' =К| ДОМР)] .[мг1,

где 1<п< 10, К,[(^МР)] - константа, характеризующая сродство УДГ к минимальному лиганду (рибо- или дезоксирибонуклеозид-5'-фосфату), К^(п) = 1//- К; для любого другого нуклеотидного звена протяженного лиганда (при 1<п<10 эти значения равны); п - число нуклеотидных звеньев в составе лиганда,/- фактор увеличения сродства при возрастании длины лиганда на одно звено.

Как видно из данных рис. 5 и табл. 1, 2, рибоСЖ одной и той же длины имеют одинаковое или близкое сродство к ферменту, не зависящее от нуклеотидного состава. Наклоны кривых (значения фактора/) для пар (рА)„ и с1(рА)л, (рЧ)п и с!(ри)„, с1(рТ)п, (рС)„ и с1(рС)п имеют лишь небольшие различия.

Сродство рибоОИ в среднем на один порядок ниже, чем соответствующих дезоксирибоСЖ той же длины, но это определяется различием сродства активного центра УДГ к одному из звеньев этих лигандов. Близкие значения наклонов кривых для соответствующих пар рибо- и дезоксирибоСЖ позволяют предположить, что сахарные остатки различных ОМ, скорее всего не вносят заметного вклада в слабые взаимодействия УДГ с 9 из 10 отдельных нуклеотидных звеньев, а возрастание сродства при удлинении этих ОМ происходит, в основном, за счет взаимодействия фермента с одинаковыми основаниями и однотипными для этих лигандов фосфатными группами.

4. Гидрофобные и/или ван-дер-Ваальсовы взаимодействия

Изменение сродства ON к УДГ в 1,34 - 1,90 раза (табл. 1) при их удлинении на одно звено соответствует изменению свободной энергии Гиббса (ДС3) на -0,18 - 0,40 ккал/моль, что существенно меньше, чем при образовании сильных электростатических контактов (-1...-2 ккал/моль) или водородных связей (-1...-5 ккал/моль) между ферментами и лигандами и сравнимо с соответствующими величинами для слабых гидрофобных, ван-дер-Ваальсовых, ион-дипольных и ди-поль-дипольных взаимодействий.

Следует подчеркнуть, что сродство УДГ к различным гомос!(рК)п возрастает в том же порядке, что и относительная гидрофобность оснований: С < Т< в <А. Однако при этом отсутствует строгая зависимость между величинами АС и отно-

сительной гидрофобностью этих оснований (см ниже). Отсутствие строгой корреляции свидетельствует о том, что УДГ образует не только гидрофобные и/или ван-дер-Ваальсовы контакты основаниями ОЫ, но и дополнительные контакты другого типа.

5. Электростатические взаимодействия и вклад сахаросЬосфатного остова в образование контактов между субстратом и УДГ

Кроме оснований ферменты могут взаимодействовать с сахарофосфат-ным остовом ДНК-лигандов. Чтобы выявить вклад структурных единиц сахаро-фосфатного остова в образование слабых аддитивных контактов ОЫ с УДГ, нами использованы олигомеры, лишенные всех оснований кроме одного: с1[(рЯ)„(рТ)], где И - химически стабильный аналог АП-сайта - (211,33) -2-оксиметилтетрагидрофуранол-3.

На рис. 4 приведена зависимость сродства УДГ к различным (1[(рК)п(рТ)], Видно, что угол наклона кривой для с![(р11)„(рТ)] немного меньше, чем для с1(рС)„, содержащего наименее гидрофобное основание. Таким образом очевидно, что основной вклад во взаимодействие УДГ с <3(рС)п вносят

слабые аддитивные контакты фермента с сахарофосфатным остовом ОМ. Дополнительные аргументы в пользу образования слабых электростатических контактов получены при анализе сродства УДГ к ОМ с этилированными межнуклеозидными фосфатными группами: величина 150 для с1[Тр(Ес)] 14 была оценена близкой к 1 мМ, в то время как величина 150 для сКр'Г)^ равна 0,25 мМ. Более того, 21-членный олигонуклеопеотид (ОИР), содержащий остатки урацила и в составе которого сахарофосфатный остов заменен на незаряженную пептидную цепь Н-(Ьу5иа1)2(С1уиа,)7Ьу5иа1Ьу5-ОН, содержащую нуклеоаминокислотные остатки Ь-3-(урацил-1)апанин (Щ:

? „ о о н п

^-С^ й II / II но

ингибировап реакцию, катализируемую УДГ, с эффективностью сопоставимой с таковой для с![Тр(Е0])4. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что отрицательные заряды обоих атомов кислорода, связанных с атомом фосфора, вносят вклад в слабые электростатические взаимодействия УДГ с межнуклеозидными фосфатными группами ОЫ. Этот вывод полностью согласуется с данными РСА УДГ об исключительно большом числе положительно заряженных остатков аминокислот в ДНК-узнающем центре фермента.

К = Н или (СН2)4КН2

• •

6. Совокупность слабых взаимодействий

Полученные данные свидетельствуют о том, что УДГ узнает неспецифические оц ДНК исключительно за счет аддитивности большого числа слабых контактов фермента с основаниями и межнуклеозидными фосфатными группами 10 нуклеотидных звеньев ДНК. В табл. 2 представлены величины 15() и значения факторов 5 для исследованных гомоСЖ.

Поскольку структуры сахарофосфатных остовов с1(рМ)„ и с)[(рЯ)„(рТ)] могут существенно отличаться, угол наклона кривой для (ЩрК)„(рТ)] может лишь приближенно отражать слабые электростатические взаимодействия УДГ с фосфатными группами ё(рМ)п; электростатический фактор е в случае (1[(р11)п(рТ)] оценен равным 1,56 (рис. 4). Для более точной оценки вклада сахарофосфатного остова в сродство немодифицированных (Ж к УДГ была построена зависимость -^ / от относительной гидрофобности оснований, определенной по задержке нуклеозидов на обращенно-фазовом сорбенте (изократическая элюция) (рис. 7). Экстраполяция зависимости к нулевому времени задержки, соответствующему выходу с сорбента отрицательно заряженного ортофосфата, дает величину (фактор е) равную 1,35. Поскольку вклад структурных элементов сахарофосфатного остова и оснований СЖ в сродство к ферменту является аддитивным, то коэффициент возрастания сродства УДГ за счет гидрофобных взаимодействий с одним из оснований (фактор Л) может быть оценен как Л =// е: фактор Л равен 1,01, 1,22 и 1,33 для с1(рС)„, с1(рТ)„ и <1(рА)п, соответственно. Как видно из рис. 4, а также значений факторов Л и с, вклад гидрофобных взаимодействий увеличивается при росте относительной гидрофобности оснований и становится сравнимым с электростатическими в случае с1(рА)п, содержащего наиболее гидрофобные основания.

-'в г

0,3 0,2 0,1

Рис. 7. Зависимость -1^ от времени удержания нуклеозидов при

изократической элюции на обращенно-фазовом сорбенте.

200 400 600 800 V, «кл

В конечном итоге, взаимодействие УДГ с каждым из нуклеотидных звеньев оц (Ж является суперпозицией слабых электростатических и гидрофобных и/или ван-дер-Ваальсовых взаимодействий с отдельными структурными элементами и может быть описано с помощью убывающей геометрической прогрессии:

Ю = К; ((№МР) • (1/е'1Л1)= К, (Р|) • (1/1,35)"-' •(1/Ь)п"1,

где К1 (с!КМР) и К; (Р,) - константы ингибирования для минимальных лигандов комплексов.

Таблица 2. Величины 15(, олигонуклеотидов и их дуплексов

Лиганд 15„ (КМР), 15о(рИ)4, Г

иМ мМ мМ

(рА)п 56,00 13,00 0,67 1,70

(рАЭЛрЩ, 17,70 0,50 1,63

(рА)„-с!(ри)п - 3,15 0,32 1,54

<КрА)„ 10,00 2,00 0,03 1,80

с!(рА)п.с1(рТ)п - 0,63 0,06 1,50

с1(рТ)п 45,00 8,70 0,25 1,65

с!(рТ)„ЧрА)п - 1,78 0,06 1,84

сКрЮ. 5,50 1,30 0,10 1,56

с)(ри)„-с1(рА)п - 1,74 0,04 1,83

(рЦ). 100,00 16,00 0,29 1,87

(ри)п-с1(рА)п - 6,30 0,25 1,46

<КрС)„ 13,50 4,00 0,56 1,47

(РС)„ 148,00 20,00 0,80 1,69

с![(рЯ)прТ] 50,00* 12,00 0,93 1,56

7. Взагшодействие УДГ с неспецифическими ДНК-дуплексами

Как показано выше, оц ОМ эффективно взаимодействуют с УДГ. Однако основным природным субстратом УДГ в живых клетках является дц сШ-ДНК, хотя нельзя исключить, что в определенных условиях в живой клетке фермент выполняет функцию репарации оц участков ДНК.

На следующем этапе усложнения структуры лиганда было исследовано влияние второй цепи на сродство оц ДНК к УДГ. Величины 150, наиболее важные для понимания закономерностей взаимодействия УДГ с дуплексами, суммированы в табл. 3 и представлены в виде ^-зависимостей на рис. 4, 8 и 9. Эти данные свидетельствуют о том, что вторая цепь не вносит существенного вклада в сродство относительно коротких дц ON длиной до 15-20 звеньев. Это полностью согласуется с данными РСА о том, что фрагмент ДНК, находящийся в комплексе с ферментом полностью расплавлен и каждая из цепей взаимодействует с ферментом независимым образом. Более того, наиболее важные контакты УДГ образует только с одной из цепей дуплекса, содержащей сШ-звено. Вторая цепь протяженной ДНК, по-видимому, в основном удерживается в комплексе с ферментом за

счет слабых взаимодействий с одной из «стенок» ДНК-связывающего канала и комплементарных взаимодействий между цепями вне белковой глобулы фермента. Эта цепь, как будет показано ниже, скорее всего, необходима для формирования оптимальной конформации субстрата.

10 15

Рис. 8. Зависимость величин от числа мононуклеотидных звеньев (п) в дуплексах (Ж: 1 -(рА)„хс1(рГ)п, 2 - (рА)„хс1(ри)Г|1 3 -(рА)„х(ри)п.

Рис. 9. Зависимость величин от числа мононуклеотидных звеньев (п) в дуплексах ОМ: 1 -<3(рА)„х<1(ри)п, 2 - сКрА)„хс1(рТ)п, 3 - <1(рА)пх(ри)п.

Следует подчеркнуть, что добавление комплементарной цепи приводит к небольшому изменению сродства УДГ к дц по сравнению с оц (Ж, однако эти изменения в обоих случаях описываются с помощью одного и того же алгоритма, приведенного выше; величины f для дуплексов приведены в табл. 2.

Дуплекс Ьо, Дуплекс 150,

мкМ мкМ

(рА)4*(ри)4 17700 (1(рА)4*с1(рТ)4 630

(РА)6*(Ри)6 5600 с!(рА)6*<1(рТ)6 140

(рА)я*(ри)я 1780 с1(рА)9*сКрТ)9 220

(рА)10*(ри)ш 500 с1(рА)ш*с1(рТ)1о 56

(рА)„*(ри)„ 320 Й(рА),2*с1(рТ)|2 60

ё(рА),4*с1(рТ),4 60

сКРА)й*(ри)6 800 с!(рА)6*с1(ри)6 450

с!(рА)9*(ри)9 315 ё(рА)8*с1(ри)8 100

сКрА),о*(ри)и) 250 <1(рА)ю*с1(ри)10 40

сКрА)„*(ри)и 250 с1(рА)12*с1(ри)12 32

сКрТ)4*(рА)4 1780 с!(рА),4*с1(ри),4 32

с!(рТ)6*(рА)6 560 (рА)4*с1(ри)4 3150

с1(рТ)9*(рА)9 80 (рА)6*<1(ри)(; 1000

с'(рТ)п*(рА)п 30 (рА)ю*с1(ри)10 315

(3(РТ)|5ПрА),5 30 (рА),6*сЗСри)16 180

Примечание: Среднее отклонение в определении величин 150 составляло 20-40%, приведены усредненные данные 3-4 измерений.

& Взаимодействие УДГ с РНК-дуплексами

Известно, что УДГ не выщепляет остатки урацила из РНК. Однако это не означает, что УДГ не способна взаимодействовать с рибоОЫ и их дуплексами. На рис. 5 в качестве примера приведены ^-зависимости величин 15» от п для некоторых рибоОИ (табл. 1). Как было показано выше, различия во взаимодействии рибо- и дезоксирибо-оц ОМ с УДГ сводится к уменьшению на порядок эффективности взаимодействия урацил-связывающего центра фермента с одним из звеньев рибоОЫ. Близкая ситуация имеет место в случае взаимодействия УДГ с РНК-РНК и РНК-ДНК дуплексами. При переходе от ДНК-ДНК комплексов к РНК-РНК или смешанным ДНК-РНК комплексам сродство понижается в 5-12 раз (табл. 3). Таким образом, комплексообразование УДГ с лигандами не может обеспечить высокоэффективной дискриминации ферментом оц или дц ОМ рибо- и дезоксирибо-рядов. Принимая во внимание то, что основное сродство УДГ к ДНК обусловлено слабыми аддитивными взаимодействиями фермента со структурными элементами лиганда, очевидно, что фермент может связывать с высоким сродством не только нуклеиновые кислоты, но и другие лиганды, несущие положительные заряды и гидрофобные остатки, например нуклеопептиды (см. выше).

Отмеченные выше различия во взаимодействии УДГ с дуплексами могут объясняться различиями в структуре комплексов ДНК-ДНК, ДНК-РНК, РНК-РНК. Вероятно, УДГ взаимодействует с большей эффективностью с дуплексами, находящимися в растворе в В-форме. Согласно литературным данным, дуплекс (рА)„*с1(рТ)„ является единственным РНК-ДНК дуплексом, который может находиться в В-форме [^¡ттегтапп, 1981]. Сродство именно этого дуплекса близко к сродству дезоксирибо-дц ОМ. Сродство других смешанных дуплексов заметно меньше (см. табл. 3).

9. Вклад <Ш в сродство к ферменту

Мы оценили вклад нативных оснований и <Ш-звеньев в комплексообразование фермента с сШ-ДНК. сШМР и ¿(рЩ, имели примерно в 10 раз большее сродство к УДГ, чем другие сШМР и ОМ любой длины. Введение сШ - звена в различные дц ОМ увеличивало их сродство к УДГ примерно в 9 - 20 раз по сравнению с лигандами, не содержащими сШ (табл. 4). Повышение сродства специфических с1и-ОМ в некоторой степени зависело от последовательности ОМ и типа основания, стоящего напротив <Ш-звена, во второй цепи. В случае некомплементарных пар и-С и и-О сродство дуплексов было выше, чем контрольного дуплекса £1(рА)]5-с1(рТ)15, не содержащего сШ-звена примерно в 11 - 16 раз, а для дуплекса с и-Т парой - только в 4 раза.

Более того, узнавание УДГ частично некомплементарных комплексов, не содержащих сШ-звено, происходило с большей эффективностью. Величины 150 для дуплексов сКрА)15-с1(рТ)7(рС)(рТ)7 и (рА)15-с1(рТ)7(рС)(рТ)7 оказались соответственно примерно в 2,5 и 5,4 раза ниже, чем для ¿(рА),5-с1(рТ)|5. Это указывает в пользу того, что УДГ способна с определенной эффективностью узнавать некомплементарные пары, не содержащие сШ-оснований. Было показано, что разница в узнавании ферментом некомплементарных пар сШ-с1С, <Ш-сЮ, сШ-сГГ с одной стороны и с1А-с!С, (ЗА-сЮ в случае использованных нами модельных дуплексов, не превышает 2 - 8 раз.

Таблица 4. Величины 15о оц ON, содержащих одно «мутированное» основание и их дуплексов

Лиганд I50; мМ Дуплекс I50, мМ

d(pT)4(pU)(pT), 1,00 d(pT)4(pU)(pT)5-d(pA)10 0,006

d(pA)4(pU)(pA)5 1,50 d(pA)4(pU)(pA)5-d(pT)in 0,003

d(pT)7(pC)(pT)7 1,30 d(pT)7(pC)(pT)7-d(pA)|5 0,025

d(pT)7(pG)(pT)7 1,60 d(pT)7(pG)(pT)7-d(pA),5 0,012

d(pA)7(pU)(pA)7 0,08 d (p A)7(pU) (p A)7-d(pT) 15 0,025

d(pT)7(pC)(pT)7-d(pA)7(pU)(pA)7 0,004

d(pT)7(pG)(pT)7-d(pA)7(pU)(pA)7 0,006

Следует особо подчеркнуть, что сродство исследованных модельных дуплексов практически не отличалось от такового для dU-ДНК.

Рассмотренные выше данные по взаимодействию УДГ с dU-ДНК можно обобщить с помощью термодинамической модели узнавания ДНК ферментом, приведенной на рис. 10. Эта модель демонстрирует оцененный нами относительный вклад специфических и неспецифических контактов в эффективность взаимо-

Рис. 10. Термодинамическая модель взаимодействия УДГ с дцДНК, содержащей dU в одной из цепей. *р -слабые электростатические контакты межнуклеозидных фосфатных групп, А - слабые гидрофобные и/или ван-дер-Ваальсовы контакты фермента с основаниями, d(pR)- неспецифические контакты сахарофосфатного остатка dU с ферментом, U - специфические контакты dU с ферментом. Приведен диапазон изменения величин dU-звена в зависимости от нуклеотидной последовательности IAG° (U) =-1,4-1,8 ккал/моль субстрата. SäG° (р9*)=-1,4-1,8 ккал/моль ZAG° (А,) = -1,9 ккал/моль lAG°d(pR) = -2,3 ккал/моль

Данные РСА комплексов ферментов с ДНК обычно приводят к обнаружению ряда специфических контактов типа псевдо-уотсон-криковских водородных связей. Например, в случае УДГ обнаружено пять водородных связей (рис.10). При интерпретации этих данных исследователи чаще всего приходят к

действия фермента с ДНК.

MCJ01 _ Asn (47 "■о'1

tx %% *?1 *1 П ft %% 0

рТ рТ рт pTpT рТ рТрТ рТ pi 12 3 45 678 9 10

рТ рТ рТ

выводу о том, что такие специфические взаимодействия обеспечивают как высокое сродство, так и специфичность действия ферментов. Тем не менее, как показано выше, УДГ имеет высокое сродство к неспецифическим оц и дц d(pN)n. Более того, на стадии комплексообразования фермент слабо дискриминирует рибо- и дезоксирибо- ON и их дуплексы. Слабые аддитивные взаимодействия фермента с 10 нуклеотидными звеньями любых НК обеспечивают около 5-6 порядков сродства. В то же время вклад специфических контактов УДГ с dU-звеном в общее сродство ДНК, по существу, не превышает одного порядка. Таким образом очевидно, что стадия комплексообразования УДГ с ДНК не может обеспечить наблюдаемой в экспериментах in vivo специфичности (около пяти порядков) действия фермента.

В работах, проведенных в нашей лаборатории параллельно с данным исследованием, было показано, что стадия комплексообразования не может обеспечить специфичности действия ни одного из сиквенс-специфических ферментов репарации, топоизомеризации, рестрикции и интеграции. Тем не менее известно, что все эти ферменты, включая УДГ, являются специфическими, и катализируют реакции только в случае специфических ДНК. Таким образом, встает вопрос о том, за счет чего достигается специфичность действия ферментов?

Ю.Скорость реакции и специфичность действия УДГ

Согласно сложившимся представлениям, катализируемые ферментами реакции протекают как минимум в три стадии: KdO) Kd(2) kcal

Е +■ НК <-> Е • НК Е • НК* —»Е + продукт

После образования первичного комплекса Е*НК, на второй стадии оба компонента претерпевают конформационные изменения. Третьей стадией является непосредственно катализ реакции, характеризуемый константой скорости реакции (кса1), которая, как показано нами, и является основным фактором обеспечения специфичности действия ферментов.

Как известно из литературных данных и показано нами, при переходе от неспецифических к специфическим дуплексам скорость реакции, катализируемой УДГ, уменьшается примерно на 4-5 порядков. Интересно, что даже минимальные модификации основания или сахарного остатка в звене dU гетеро-ON значительно замедляют скорость выщепления остатка урацила или даже останавливают реакцию. При этом сродство ON, содержащих модифицированные звенья, сопоставимо с таковым для контрольных dU-содержащих ON (табл. 5).

Введение в субстрат по З'-положению сахарного остатка атома фтора приводит к появлению участка, находящегося в А-конформации (80% 2'-фторнуклеозидов находятся в З'-эндо-конформации). Такой конформационный мотив узнается УДГ примерно на порядок хуже по сравнению с контролем, а выщепления урацила практически не происходит.

Сродство 2'-амино-2'-дезоксирибоурацила к УДГ выше, чем сродство контрольного ON. При этом достоверное выщепление урацила отсутствует. ON, содержащий 2'-амино-2'-дезоксирибоурацил, может быть рекомендован в качестве негидролизуемого аналога субстрата для РСА комплекса УДГ-ДНК.

ига

пи

_0_, Г) Чга „

Iхи

Цга

кн,

2'-фтор-2'-дезоксирибоу ранил Г-амино-Г-дезоксирибаурацил

ига

1 -(Р-0-3'-дезокСири6о-трео-пеятофурзноМ!л)ураадл 1-([}-0-2'-дезоксирибо-трео-пентофуранозил)урацил

Таблица 5. Взаимодействие УДГ с оц ОЫ, содержащими модифицированное сШ-звено.

Субстрат Ьо» % выщепления урацила

мМ из субстрата под дейст-

вием УДГ за 40 мин

(ЗССиССААТТ 1,60 95

(ЗССГСОААТГ 1,50 0

(1ССЬг5иССААТГ 4 0

ёАССТАССиССТССТ 0,20 96

dACCTACCTGGTGGT 0,14 0

<исстАссп5шстсат 0,08 13

сЮССААССШССТСТ 0,15 84

сЮССААССТСССТСТ 0,13 -

сЮССААССхиСОСТСТ 0,90 6

сЮССААССШСССТСТ 1,80 1

(ЮССААССССССТСТ 0,06 0

сЮССААССПТОССТСТ 1,70 0

Примечание.О - отсутствие реакции, прочерк - эксперименты по выщеплению урацила не проводились

Согласно данным, полученным в случае большого числа различных ферментов, включая УДГ, вторая стадия реакции, на которой происходит адаптация ДНК до оптимальной конформации, является основной стадией, определяющей скорость каталитического процесса. Она существенно зависит от того, насколько эффективно может произойти «подгонка» структуры НК до оптимальной для фермента конформации.

Как указано выше, на начальном этапе взаимной адаптации ДНК и УДГ, фермент «плавит» ДНК, а затем очень сильно изменяет конформацию сахарофос-фатного остова обеих цепей ДНК и «выворачивает» остаток урацила из ДНК наружу. Уменьшение скорости выщепления урацила при переходе от оц к дц ОЫ, а затем к субстрату со "шпилькой" (табл. 6) свидетельствует о том, что легкость

плавления дц ДНК является важным фактором, определяющим скорость удаления урацила.

Таблица 6. Взаимодействие УДГ с одноцепочечным, двуцепочечным и содержащим «шпилечную» структуру олигонуклеотидами

N Субстрат V« (относительная)%

1 5' -йСС А АССиСССТСТр 230

2 5'- ОССААССиОСЗСТСТр рСО<ЗТТ<ЮАССС;АСАСА(А)зТО 100

3 5'- (ХХААССиШСТСТр рОТ^/дч рСО6ТТСОАСС<ЗА6А—СА ] 50

Примечание: Уп для субстрата с номером 2 принята за 100%.

В контексте рассмотренных данных представляется интересным анализ особенностей адаптации оц и дц НК при связывании с УДГ. Как было показано выше, оц гомос1(рЫ)„ обладают более высоким сродством к ферменту, чем соответствующие им дуплексы. В то же время сродство оц гомоОГ^, содержащих одно инородное звено типа с1[(рТ)„(ри)(рТ)т] или с1[(рА)„(ри)(рА)т] примерно в 4-50 раз ниже, чем сродство соответствующих им гомоОМ. Кроме того, эффективность комплексообразования таких (Ж практически не зависит от типа инородного основания. Так, олиготимидилаты, содержащие вместо сШ, с1С или <Ю - основания, имели практически такое же сродство, как и с1[(рТ)п(ри)(рТ)т] (табл. 4). Однако при переходе от гомо- к гетеросИКЖ и от оц лигандов к их дуплексам, содержащим сШ-звено, подобное аномальное взаимодействие с ферментом исчезало. Введение сШ-звена в одну из цепей дуплекса, как отмечалось выше, повышает сродство в 7 - 20 раз по сравнению с контрольными лигандами. Следовательно, эффективность взаимной адаптации УДГ и ДНК зависит от первичной структуры оц ДНК. Отсутствие рассмотренных аномалий в случае дуплексов свидетельствует о том, что активную роль в формировании наиболее оптимальной конформации субстрата УДГ может играть вторая комплементарная цепь.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что факторы отбора субстратов ферментом, в основном, работают на стадии «подгонки» структуры субстрата до оптимальной конформации и непосредственно стадии катализа, а не при образовании специфического комплекса УДГ с ДНК, как это принято считать и следует из работ по РСА УДГ. Этот вывод, как показано другими сотрудниками нашей лаборатории, справедлив в случае всех исследованных ферментов репликации, репарации, топоизомеризации, рестрикции и интеграции.

Известно, что ферменты комплементарны не самому субстрату, а его переходному состоянию, реализуемому в процессе каталитического превращения субстрата. Принимая это во внимание можно было бы предположить, что проведенные нами оценки величин, характеризующих сродство различных ДНК- и РНК-лигандов к УДГ, не учитывают возможного повышения эффективности их комплексообразования с ферментом на стадии формирования переходного ком-

плекса. Однако эффективность отбора УДГ правильных субстратов за счет стадии комплексообразования (примерно 1 порядок) и последующих стадий изменения конформации ДНК и непосредственно катализа (3-4 порядка) дает в итоге около 4 - 5 порядков специфичности, что хорошо согласуется с наблюдаемой специфичностью действия фермента в клетках человека. Таким образом, очевидно, что основой специфичности функционирования УДГ является не стадия комплексообразования, а следующие за ней стадии, определяющие, в конечном итоге, относительную величину константы скорости (кса1) реакции в зависимости от структуры субстрата.

Выводы

1. Впервые проведен детальный кинетический и термодинамический анализ закономерностей взаимодействия УДГ с ДНК. Показано, что фермент взаимодействует с 10 звеньями ДНК. Минимальным лигандом активного центра фермента является с1ИМР, основной вклад в сродство которого вносит его фосфатная группа. Увеличение длины неспецифических одноцепочечных и двухцепочечных олигонуклео-тидов на одно звено при п < 10 приводит к возрастанию их сродства к ферменту в 1,34 - 1,93 раза за счет слабых аддитивных электростатических и гидрофобных и/или ван-дер-Ваапьсовых взаимодействий фермента с отдельными структурными элементами олигонуклеотидов. Причем, основной вклад вносят слабые электростатические контакты УДГ с межнуклеозидными фосфатными группами ДНК.

2. С помощью аналогов субстратов исследовано влияние структурных и конфор-мационных параметров и стабильности субстрата на эффективность комплексообразования лигандов с УДГ. Показано, что модификации основания или сахарного остатка сШ-звена в составе гетероолигонуклеотидов приводят к значительному замедлению скорости выщепления урацила из субстрата или даже к отсутствию реакции. При этом сродство модифицированных лигандов сопоставимо со сродством контрольных олигонуклеотидов.

3. Оценено изменение термодинамических и кинетических параметров при переходе от неспецифических к специфическим одноцепочечным и двухцепочечным олигонуклеотидам. Показано, что эффективность образования специфических контактов УДГ с сШ-звеном не превышает одного порядка сродства. Основой специфичности действия УДГ является не стадия комплексообразования, а следующие за ней стадия изменения конформации субстрата и стадия катализа. Взаимодействие УДГ с ДНК впервые описано с помощью термодинамической модели.

Основные результаты работы опубликованы в работах:

1. Василенко Н.Л., Булычев Н.В., Горн В.В., Левина А.С., Невинский Г.А. Узнавание урацила в составе ДНК урацил-ДНК-гликозилазой из плаценты человека. // Молекуляр. биология. 1994. Т. 28. С. 679-690.

2. Невинский Г.А., Романникова И.В., Василенко H.JI., Булычев Н.В., Колочева Т.И., Петрусева И.О., Жарков Д.О., Иванов К.А., Белоглазова Н.Г., Ищенко А.А. Разработка методов синтеза моно-, олиго- и полинуклеотидов, содержащих мутированные основания. //Химия. М.: Московский университет. 1994. С. 155-165.

3. Виноградова (Василенко) H.JL, Ямковой В.И., Цветков И.В., Невинский Г.А. Взаимодействие урацил-ДНК-гликозилазы из плаценты человека с одноцепочеч-ными дезокси- и рибоолигонуклеотидами и их комплексами. // Молекуляр. биология. 1996. Т. 30. С. 209-219.

4. Kubareva Е.А., Volkov Е.М., Vinogradova (Vasilenko) N.L., Kanevsky I.A., Oretskaya T.S., Kuznetsova S.A., Brevnov M.G., Gromova E.S., Nevinsky G.A., Shabarova Z.A. Modified substrates as probes for studying uracil-DNA glycosylase. // Gene. 1995. V. 157. P. 167-171.

5. Виноградова (Василенко) Н.Л., Булычев H.B., Максакова Г.А., Джонсон Ф., Невинский Г.А. Урацил-ДНК-гликозилаза: интерпретация результатов рентгено-структурного анализа в свете данных кинетического и термодинамического изучения фермента. // Молекуляр. биология. 1998. Т. 32. С. 489-499.

6. Kubareva Е.А. Vasilenko N.L., Vorobjeva O.V., Volkov Е.М., Oretskaya T.S., Kor-shunova G.A., Nevinsky G.A. Role of DNA definite structural elements in interaction with repair enzyme uracil-DNA glycosylase. // Biochem. and Mol. Biol. Internat. 1998. V. 46. P. 597-606.

7. Nevinsky G.A., Vinogradova (Vasilenko) N.L., Bugreev D.V., Ishenko A.A., Vasyutina E.L., UlL .yanova E.P., Zakharova O.D., Kolocheva T.I. The basic principles of DNA recognition by sequence dependent and independent enzymes. // Proceedings of the 1th International conference on bioinformatics of genome regulation and structure. 1998. V. 2. P. 384-387.

Подписано к печати

Формат бумаги 60x84, 1/16 печ.л. Тираж 100 экз

Заказ №

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Василенко, Наталья Леонидовна

Список принятых сокращений

Введение

I. Обзор литературы

1.1. Механизмы репарации ДНК

1.1.1. Прямая репарация

1.1.2. Пострепликативная темновая репарация

1.1.3. Эксцизионная репарация 10 1.1.3.1. Эксцизионная репарация оснований

1.2. Общая характеристика ДНК N-гликозилаз

1.2.1. ДНК-гликозилазы, обладающие АП-нуклеазной активностью

1.2.1.1. Эндонуклеаза III E.coli

1.2.1.2. Тимингликоль-ДНК-гликозилаза

1.2.1.3. Формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза

1.2.1.4. Гликозилаза пиримидиновых димеров

1.2.1.5. Гликозилазы неправильно спаренных оснований

1.2.2. ДНК-гликозилазы, не обладающие АП-нуклеазной активностью 19 1.2.2.1. Гипоксантин-ДНК-гликозилаза 20 1.2.2.2.3-метиладенин-ДНК-гликозилаза 20 1.2.2.3.7-метилгуанин-ДНК-гликозилаза

1.2.2.4. 0-2-метилтимин-ДНК-гликозилаза

1.2.2.5. Оксиметилурацил-ДНК-гликозилаза

1.2.2.6. Оксиметилцитозин-ДНК-гликозилаза

1.2.2.7. Гликозилаза, исключающая из ДНК остатки мочевины

1.3. Урацил-ДНК-гликозилаза

1.3.1. Накопление урацила в ДНК

1.3.1.1. Спонтанное и химическое дезаминирование цитозина

1.3.1.2. Образование урацила из аналогов азотистых оснований

1.3.1.3. Ферментативное дезаминирование цитозина

1.3.1.4. Ошибочный синтез ДНК

1.3.2. Физические свойства УДГ

1.3.3. Аминокислотный состав и вторичная структура

1.3.4. Клеточная локализация и формы фермента

1.3.5. Регуляция активности в ходе клеточного цикла

1.3.6. Структура гена УДГ

1.3.7. Субстратная специфичность

1.3.8. Специфичность действия УДГ

1.3.9. Механизмы катализа

1.3.9.1. Механизм катализа для УДГ из HS V

1.3.9.2. Механизм катализа для человеческой УДГ

1.3.9.2.1. Роль His-268 в катализе реакции

1.3.9.2.2. Роль Asp-145 в катализе реакции

1.3.9.3. Механизмы катализа для УДГ из E.coli

1.3.10. Специфический ингибитор УДГ из бактериофага Bacillus 44 subtiles pBs

1.3.11. Создание мутантов с новыми субстратными свойствами

II. Экспериментальная часть

2.1. Реактивы и материалы

2.1.1. Реактивы

2.1.2. Олигонуклеотиды

2.1.3. Ферменты 50 2.2. Методы

2.2.1. Очистка олигонуклеотидов

2.2.2. Определение коэффициента молярного поглощения для 51 олигонуклеотидов ряда d(pU)n

2.2.3. Получение ДНК-сефарозы

2.2.4. Выделение УДГ из плаценты человека

2.2.5. Препаративный синтез [ HJdU-ДИК.

2.2.6. Условия проведения реакции, катализируемой УДГ

2.2.7. Определение кинетических параметров реакции гидролиза 54 N-гликозидной связи

2.2.8. Введение [32Р]-метки по 5'-положению олигонуклеотида

2.2.9. Анализ продуктов гидролиза олигонуклеотидов

III. Результаты и обсуждение

3.1. Разработка метода тестирования УДГ

3.2. Определение типа ингибирования

3.3. Минимальный лиганд активного центра

3.4. Взаимодействие УДГ с одноцепочечными дезокси - и 68 рибоолигонуклеотидами

3.5. Взаимодействие УДГ с ДНК-дуплексами

3.6. Взаимодействие УДГ с РНК-дупл ексами

3.7. Гидрофобные и/или ван-дер-ваальсовы взаимодействия

3.8. Электростатические взаимодействия и вклад сахарофосфатного 78 остова в оразование контактов между субстратом и УДГ

3.9. Совокупность слабых взаимодействий 81 ЗЛО. Расположение активного центра УДГ

3.11. Вклад сШ в сродство к ферменту

3.12. Специфичность действия УДГ

3.13. Факторы отбора субстратов 93 IV. Выводы 97 Список литературы

Принятые сокращения

АК - аминокислота

АП - апурин/апиримидин

БСА - бычий сывороточный альбумин

АА - акриламид

БисАА - И^'-метиленбисакриламид

Ш - дезоксиуридин сШ-ДНК - ДНК, содержащая урацил сОМТР - дезоксирибонуклеозид 5'- трифосфат

ЫМР - дезоксирибонуклеозид 5'- монофосфат

АО0 - стандартная энергия Гиббса

Км - константа Михаэлиса

Кс) - константа диссоциации

К[ - константа ингибирования кДа - килодальтон

М.м. - молекулярная масса

НК - нуклеиновая кислота

8-охоС-ДНК-гликозилаза - 8-оксогуанин-ДНК гликозилаза (Ж - олигонуклеотид оц, дц - одноцепочечный и двухцепочечный, соответственно

РМ8Б - фенилметилсульфонилфторид

ПААГ - полиакриламидный гель

РСА, РС-анализ - рентгеноструктурный анализ трис - 2-амино-2-оксиметил-1,3 пропандиол

ТХУ - трихлоруксусная кислота

БББ - додецилсульфат натрия

УДГ - урацил-ДНК-гликозилаза

ФАП - 7,8 - формамидопиримидин

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение Диссертация по биологии, на тему "Узнавание ДНК урацил-ДНК-гликозилазой из плаценты человека"

Структурная целостность ДНК постоянно подвергается действию большого числа экзогенных и эндогенных агентов. Для того, чтобы им противостоять, клетки имеют ряд защитных механизмов, которые действуют на различных уровнях, предотвращая или исправляя повреждения. Дефекты в репарационных процессах приводят к возникновению множества болезней и ускоряют процесс старения. Репарация ДНК тесно связана со множеством биологических процессов, включая транскрипцию генов и регуляцию клеточного цикла. Однако молекулярные механизмы узнавания и удаления поврежденных оснований из ДНК ферментами репарации до конца не ясны.

Одним из ключевых и самых универсальных путей репарации таких точечных повреждений в ДНК, как модификация оснований, является эксцизионная репарация. Впервые этот механизм был показан на примере остатков урацила, возникающих в ДНК в результате спонтанного дезаминирования цитозина или при ошибочном включении урацила при синтезе ДНК. Этот процесс осуществляется с помощью урацил-ДНК-гликозилазы (УДГ), гидролизующей N -гликозидную связь между урацилом и сахарофосфатным остовом ДНК [1].

УДГ, как и все известные ДНК-гликозилазы, является небольшим по молекулярной массе мономерным магний-независимым белком, не требующим кофакторов для своей работы и относится к монофункциональным гликозилазам, не обладающим АП-лиазной активностью [1,2].

УДГ обнаружена во всех исследованных про- и эукариотических организмах, а также в семействах рох и herpes вирусов и является высококонсервативным ферментом. Так, УДГ из вируса простого герпеса I имеет 39% гомологии с человеческим ферментом и 49% гомологии с ферментом из E.coli [2-4].

Недавно проведенный рентгеноструктурный анализ УДГ человека, вируса простого герпеса и E.coli с аналогами субстратов выявили основные принципы узнавания «неправильных» оснований в ДНК. Полученные данные позволили предложить ряд возможных механизмов реакции удаления урацила из ДНК. Обнаружены псевдо-уотсон-криковские связи УДГ с урацилом. Именно эти специфические взаимодействия, как полагают, и лежат в основе как высокоэффективного комплексообразования УДГ с ДНК, так и специфичности действия фермента [3-5].

Несмотря на то, что УДГ является наиболее изученным ферментом репарации, данные исследований в большинстве своем носят качественный характер. Тем не менее, молекулярные механизмы узнавания и удаления поврежденных оснований из ДНК до конца не выяснены.

Ранее в ЛФР НИБХ СО РАН на примере ряда НК-зависимых ферментов было показано, что комплексообразование с НК не может обеспечить высокого сродства протяженного лиганда: обычно вклад специфических взаимодействий обеспечивает не более двух-трех порядков сродства НК к ферменту. На основании анализа совокупности литературных и собственных данных была сформулирована концепция об особо важной роли слабых аддитивных взаимодействий для узнавания и превращения протяженных молекул НК [6].

Изучение взаимодействий УДГ с ДНК является актуальным и необходимым для более глубокого понимания механизмов узнавания ферментом поврежденного звена.

Целью данной работы было изучение закономерностей взаимодействия УДГ с ДНК. Для этого представлялось целесообразным:

1) исследование активности УДГ по отношению к одноцепочечным и двуцепочечным олигонуклеотидам;

2) изучение влияния расположения и окружения модифицированных нуклеотидных звеньев в олигонуклеотидах различного состава и их комплексов на активность УДГ;

3) исследование влияния модификаций сШ-звена на эффективность комплексообразования и скорость реакции, катализируемой УДГ;

4) изучение специфических и неспецифических взаимодействий УДГ с ДНК на количественном уровне с помощью анализа ингибирования исследуемого фермента олигонуклеотидами различного состава и длины;

5) оценка относительного вклада специфических и неспецифических взаимодействий УДГ с ДНК в обеспечение специфичности действия фермента.

I. Литературный обзор

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Василенко, Наталья Леонидовна

Выводы

1. Впервые проведен детальный кинетический и термодинамический анализ закономерностей взаимодействия УДГ с ДНК. Показано, что фермент взаимодействует с 10 звеньями ДНК. Минимальным лигандом активного центра фермента является сВДМР, основной вклад в сродство которого вносит его фосфатная группа. Увеличение длины н.еспецифических одноцепочечных и двухцепочечных олигонуклеотидов на одно звено при п < 10 приводит к возрастанию их сродства к ферменту в 1,34 - 1,93 раза за счет слабых аддитивных электростатических и гидрофобных и/или ван-дер-Ваальсовых взаимодействий фермента с отдельными структурными элементами олигонуклеотидов. Причем, основной вклад вносят слабые электростатические контакты УДГ с межнуклеозидными фосфатными группами ДНК.

2. С помощью аналогов субстратов исследовано влияние структурных и конформационных параметров и стабильности субстрата на эффективность комплексообразования лигандов с УДГ. Показано, что модификации основания или сахарного остатка сЮ-звена в составе гетероолигонуклеотидов приводят к значительному замедлению скорости выщепления урацила из субстрата или даже к отсутствию реакции. При этом сродство модифицированных лигандов сопоставимо со сродством контрольных олигонуклеотидов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Василенко, Наталья Леонидовна, Новосибирск

1. Lindahl Т. An N-glycosidase from Esherichia coli that releases free uracil from DNA containing cytosine residues.// Proc. Natl. Acad.Sci.USA. 1974. V.71. P.3649-3654.

2. Krokan H.E., Standal R., Bharati S., Otterllei M., Haug Т., Slupphaug G., Skoren F. Uracil in DNA and the family of conserved uracil-DNA-glycosylases.//In the Base Excision Repair of DNA Damage. Landes Bioscience. 1997. P.7-30.

3. Sawa R., McAuley-Hecht K., Brown Т., Pearl L. The structural basis specific base-excision repair by uracil-DNA glycosylase.// Nature. 1995. V.373. P.487-493.

4. Mol C.D., Arvai A.S., Slupphaug G., Kalvi В., Alseth H., Krokan H.E., Tainer J.A. Crystal structure and mutational analysis of human Uracil-DNA glycosylase: structural basis for specificity and catalysis.// Cell. 1995. V.80. P.869-878

5. Невинский Г.А. Важная роль слабых взаимодействий при узнавании ферментами протяженных молекул ДНК и РНК.//Молекуляр. биология. 1995. Т.29. С. 16-37.

6. Keiner A.J. Effect of visible light on the recovery of Streptomyces griseus Candida from ultraviolet irradiation injury .//Proc. Natl. Acad.Sci.USA. 1949. V.35. P.73-79.

7. Dulbecco R. Reactivation of ultraviolet inactivated bacteriophage by visible light.// Nature. 1949. V.163. P.949-950.

8. Жестяников В.Д. Репарация ДНК и ее биологическое значение. JI.: 1979.С.9-25.

9. Rupert C.S. Enzymatic photoreactivation: overview.// In: Molecular mechanisms forthe repair of DNA. N.Y.,London. Part A. P.73-78.

10. Pegg A.E. Enzymatic removal of 06-methylguanine from DNA by mammalian cell extracts.//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978. V.84. P.166-173.

11. Jeggo P., Defais M., Samson L., Schendel P. An adaptive response of E.coli to low levels of alkylating agent.// In: DNA synthesis/ Ed. by J.Molineaux, M.Kohyama. -N.Y., London. 1978. P.1011-1024.

12. Tano K., Bhattacharyya D., Foote R.S., Mural R.J., Mitro S. Site-directed mutation of the E. coli ada gene: effects of substitution of methyl acceptor cysteine 321 by histidine in ada protein.//!. Bacteriol. 1989. V.171. P. 1535-1540.

13. Livneh Z., Sperling J. DNA base-insertion enzymes (insertases).// In: The Enzymes. 3rd ed. Nucleic. Acids. Part A. P, D.N.Y.:Academic. Boyer, ed., P.549

14. Deutsch W.A., Linn S. DNA binding activity from cultured human fibroblasts that is specific for partially depurinated DNA and that inserts purines into apurinic sites.// Proc. Natl. Acad. Sei USA. 1979. V.76. P. 141-147.

15. Deutsch W.A., Linn S. Further characterization of a depurinated DNA purine base insertion activity from cultured human fibroblastsV/J. Biol. Chem. 1979. V.254. P.12099-12106.

16. Livneh Z., Elad D., Sperling J. Enzymatic insertion of purine bases into depurinated DNA in vitro.//Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1979. V.76. P.1089-1098.

17. Lehmann A.R. Postreplication repair of DNA in UV-irradiated mammalian cells.// J. Mol .Biol. 1972. Y.66. P.319-337.

18. Fujiwara Y. Postreplication repair of UV-damage to DNA, DNA-chain elongation and effects of metabolic inhibitors in mouse L cells.// Biophys. J. 1975. V.15. P.403-416.

19. Higgins N.P., Kato K., Strauss B. A model for replication repair in mammalian cells.// J. Mol. Biol. 1976. V.101. P.417-425.

20. Friedberg E.C., King J.J. Endonucleolytic cleavage of UV-irradiated DNA controlled by the V+ -gene in phage T4.//Biochim. and Biophys. Res. Commun. 1969. V.37. P.646-655.

21. McMillan S., Edenberg H., Radany E.H., Friedberg R.C., Friedberg E.C. The den V gene of bacteriophage T4 codes both pyrimidine dimer DNA glycosylase and AP -endonuclease activities.//!.Virol. 1981. V.40. P.211-223.

22. Nakabeppu Y., Sekiguchi U. Physical association of pyrimidine dimer DNA glycosylase and apurinic/apyrimidinic DNA endonuclease essential for repair of UV-damaged DNA.//Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1981. V.78. P.2742-2746.

23. Friedberg E.C. DNA repair//S.-F, W.H.Freeman. 1985. P.433-435.

24. Krokan H.E., Standal R., Sluppaugh G. DNA glycosylases in the base excision repair of DNA.// Biochem J. 1997. V.325. P.l-16.

25. Jirincy J., Ubasawa A., Wood S. The role of glycosylases in mismatch repair. The use of 7-deazapurines as repair resistant lesions in oligonucleotide-directed mutagenesis.//Nucleosides and Nucleotides. 1985. V.4. P.205-207.

26. Thayer M.M., Ahern H., Xing D., Cunningham R.P., Tainer J.A. A novel DNA binding motifs in the DNA repair enzyme endonuclease III crystal structure.// EMBO J. 1995. V.14. P.4108-4120.

27. Labahn J., Scharer O.D., Long A., Ezaznikpay K., Verdine G.L., Ellenberger D. Structural basis for the repair of alkylation-damaged DNA.// Cell. 1996. V.86. P.321-329.

28. Yamagata Y., Kato M., Odawara K., Tokuno Y., Nakeshima Y., Matsushima N., Yasumura K., Tomita K., Ikara K., Fuji Y et al. Three-dimensional structure of DNA-repair enzyme 3-methyladenine DNA glycosylase II from E. coli.//Cell. 1996. V.86. P.311-319.

29. Seeberg E., Eide L., Bjoras M. The base excision repair pathway.//Trends Biochem. Sci. 1995. V.20.P.391-397.

30. Kuo C.F., McRee D.E., Fisher C.L., Ohandley S.F., Cunningham R.P., Tainer J.A. Atomic structure of the DNA repair 4Fe-4S. enzyme endonuclease III.//Science. 1992. V.258. P.434-440.

31. McCullough A.K., Dodson M.L., Shrarer O.D., lloyd R.S. The role of base flipping in damage recognition and catalysis by T4 endonuclease V.//J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.27210-27217.

32. Radman M. An endonuclease from E.Coli that introduce single polynucleotide chain scission in UV-irradiated DNA.// J.BioI.Chem. 1981. V.197. P.195-201.

33. Gates F.T., Linn S. Endonuclease from E.Coli that acts specifically upon duplex DNA damaged by UV-light, osmium tetroxide, acid or X-ray.//J. Biol. Chem. 1977. V.252. P.2802-2807.

34. Demple B., Linn S. DNA-N-glycosylases and UV-repair.// Nature. 1980. V.287. P.203-208.

35. Klimasauskas S., Kumar S., Roberts R.J., Cheng X. Hhal methyltransferase flips its target base out of the DNA helix.//Cell. 1994. V.76. P.357-369.

36. Breimer L.H. Enzymatic excision from y-irradiated polydeoxyribonucleotides of adenine residues whose imidazole rings have been ruptured.// Nucleic.Acids Res? 1984. V.12. P.6359-6367.

37. Lee K., McCray W.H., Doetsch P.W. Thymine-glycol-DNA glycosylase/AP-endonuclease of CEM-Cl lymphoblasts: a human analog of E. coli endonuclease III.// Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1987. V.149. P.93-101.

38. Breimer L.H., and Lindahl T. DNA glycosylase activities for thimine residues damaged by ring saturation, fragmentation, or ring contration are functions of endonuclease III in Escherichia coli.//J.Biol.Chem. 1984. V.259. P.5543-5548.

39. Kow Y.W.,. Wallace S.S. Mechanism of action of Escherichia coli endonuclease III// Biochemistry. 1987. V.26. P.8200-8206.

40. Teebor GW. Repair mechanisms: Impact on Human Diseases and Cancer. (Vos J.M.H. ed), //R. G. Landes Co. Austin. TX 1995. P.99-124

41. Mol CD, Kuo CF, Thayer MM, Cunningham RP, Tainer JA. Structure and function of the multifunctional DNA-repair enzyme exonuclease III. //Nature. 1995. Y.374 P.381-386.

42. Lloyd RS, Hounten BY. Repair mechanisms: Impact on Human Diseases and Cancer. (Vos J.M.H. ed).//R. G. Landes Co., Austin, TX, Lloyd RS, Hounten BV.1995. P.25-66

43. Boiteux S. Properties and biological functions of the NTH and FPG proteins of Escherichia coli: two DNA glycosylases that repair oxidative damage in DNA.//J. Photochem. Photobiol. 1993. V.19. P. 87-96.

44. Chetsanga C.J., Lindahl T. Release of 7-methylgyanine residues whose imidazole rings have been opened from damaged DNA by a DNA glycosylase from E.Coli.//Nucleic.Acids Res. 1979. V.6. P.3673-3684.

45. Chetsanga C.J., Lozon M., Makaroff C., Savage L. Purification and characterization of E.Coli formamidopyrimidine-DNA glycosylase that excises damaged 7-methylguanine from deoxyribonucleic acid.//Biochem.J. 1981. V.20. P.5201-5207.

46. Bessho T, Tano K, Kasai H, Ohtsuka E, Nishimura S. Evidence for two DNA repair enzymes for 8-hydroxyguanine (7,8-dihydro-8-oxoguanine) in human cells.//J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.19416-19421.

47. Tchou J, Kasai H, Shibutani S, Chung MH, Laval J, Grollman AP, Nishimura S. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity.//Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. V.88. P.4690-4694.

48. Boiteux S, O'Connor TR, Lederer F, Gouyette A, Laval J. Homogeneous Escherichia coli FPG protein. A DNA glycosylase which excises imidazole ring-opened purines and nicks DNA at apurinic/apyrimidinic sites.//J. Biol. Chem. 1990. V.265. P.3916-3922.

49. Tchou J, Bodepudi V, Shibutani S, Antoshechkin I, Miller J, Grollman AP, Johnson F. Substrate specificity of Fpg protein. Recognition and cleavage of oxidatively damaged DNA.//J. Biol. Chem. 1994. V.269. P.l5318-15324.

50. O'Connor TR, Graves RJ, de Murcia G, Castaing B, Laval J. Fpg protein of Escherichia coli is a zinc finger protein whose cysteine residues have a structural and/or functional role.//J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.9063-9070.

51. Bailly V, Verly WG, O'Connor T, Laval J. Mechanism of DNA strand nicking at apurinic/apyrimidinic sites by Escherichia coli formamidopyrimidineJDNA glycosylase.//Biochem. J. 1989. V.262. P. 581-589.

52. Bhagwat M, Gerlt JA. 3'- and 5'-strand cleavage reactions catalyzed by the Fpg protein from Escherichia coli occur via successive beta- and delta-elimination mechanisms, respectively.//Biochemistry. 1996. V.35. P.659-665.

53. Ищенко A.A., Булычев H.B., Максакова Г.А., Джонсон Ф., Невинский Г.А. Узнавание и превращение одно- и двухцепочечных олигонуклеотидных субстратов 8-оксогуанин ДНК-гликозилазой из Е. соН.//Биохимия. 1997. Т.62. С.240-248.

54. Ищенко A.A., Булычев Н.В., Максакова Г.А., Джонсон Ф., Невинский Г.А. Взаимодействие 8-оксогуанин-ДНК гликозилазы из Escherichia coli с одноцепочечными дезоксиолигонуклеотидами и их комплексами.//Молекуляр.биология. 1998. Т.32. С.549-558.

55. Warner H.R., Christensen L.M., Persson M.-L. Evidence that the UV endonuclease activity induced by bacteriophage T4 contains both pyrimidine dimer-DNA glycosylase and AP-endonuclase activity in the molecule.//J. Virol. 1981. V.40. P.204-210.

56. Tomilin N.V., Paveltchuk E.B., Mosevitskaya T.V. Substrate specificity of the UV-endonuclease from M. luteus. Endonucleolitic cleavage of depurinated DNA.//Eur.J. Biochem. 1976. V.69. P.265-272.

57. Grossman L., Riazuddin S., Haseltine W.A., Lindan C.P. Nucleotide excision repair of damaged DNA.// Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1978. V.43. P.947-955.

58. Haseltine W.A., Gordon L.K., Lindan C.P.,Gratstrom R., Shaper N.L., Grossman L. Cleavage of pyrimidine dimers in specific DNA sequences by a pyrimidine dimer DNA glycosylase of M. luteus.//Nature. 1980. V.285. P.634-641.

59. Smith CA, Taylor JS. Preparation and characterization of a set of deoxyoligonucleotide 49-mers containing site-specific cis-syn, trans-syn-I, (6-4), and Dewar photoproducts of thymidylyl(3'->5')-thymidine.//J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.11143-11151.

60. Liuzzi M., Weinfeld M., Paterum M.C. Selective inhibition by methxyamine of the apurinic/apyrimidinic activity associated with pyrimidine dimer DNA glycosylase from M. luteus and bacteriophage T4.// Biochemistry. 1987. V.26. P.3315-3321.

61. Seawell P.C., Smith C.A., Ganesan A.K. Den V gene of bacteriophage T4 determines a DNA glycosylase specific for pyrimidine dimers in DNA.// J.Virol. 1980. V.35. P.790-797.

62. Ishida M, Kanamori Y, Hori N, Inaoka T, Ohtsuka E. In vitro and in vivo activities of T4 endonuclease V mutants altered in the C-terminal aromatic region.//Biochemistry. 1990. V.29. P. 3817-3821.

63. Latham KA, Carmical JR, Lloyd RS. Mutation of tryptophan 128 in T4 endonuclease V does not affect glycosylase or abasic site lyase activity .//Biochemistry. 1994. V.33. P. 9024-9031.

64. Nakabeppu Y., Yamashita K., Sekiguchi M. Purification and characterization of normal and mutant forms of T4 endonuclease V //J.Biol.Chem.1982. V.257. P.2556-2562

65. Morikawa K, Matsumoto O, Tsujimoto M, Katayanagi K, Ariyoshi M, Doi T, Ikehara M, Inaoka T, Ohtsuka E. X-ray structure of T4 endonuclease V: an excision repair enzyme specific for a pyrimidine dimer.//Science. 1992. V.256. P.523-526.

66. Lee BJ, Sakashita H, Ohkubo T, Ikehara M, Doi T, Morikawa K, Kyogoku Y, Osafune T, Iwai S, Ohtsuka E. Nuclear magnetic resonance study of the interaction of T4 endonuclease V with DNA.// Biochemistry. 1994. V.33. P.57-64.

67. Dodson ML, Schrock RD 3d, Lloyd RS. Evidence for an imino intermediate in the T4 endonuclease V reaction.//Biochemistry. 1993. V.32. P.8284-8290.

68. Hori N, Doi T, Karaki Y, Kikuchi M, Ikehara M, Ohtsuka E. Participation of glutamic acid 23 of T4 endonuclease V in the beta-elimination reaction of an abasic site in a synthetic duplex DNA.// Nucleic Acids Res. 1992. V.20. P.4761-4764.

69. Fuxreiter M., Warshel A., Osman R. Role of active site residues in the glycosylase step of T4 endonuclease V. Computer simulation studies on ionization states.//Biochemistry. 1999. V.38. P.9577-9589.

70. Томилин H.B. Генетическая стабильность клетки. JI.: 1983. С.15-25.

71. Brown Т.С., Jirincny М. A specific mismatch repair event protects mammalian cells from loss of 5-methylcytosine.// Cell. 1987. V.50. P.945-950.

72. Michaels M.L., Pham L., Nghiem Y., Cruz C., Miller J.M. Myt Y, an adenine glycosylase active on G-A mispairs has homology to endonuclease III.// Nucleic Acids.Res. 1990. V.18. P.3841-3845.

73. Yeh Y.-C., Chang D.-Y., Masin J., Lu A.-l. Two nicking enzyme systems specific for mismatch -containing DNA in nuclear extracts from human cells.// J.Biol.Chem. 1991. V.266. P.6480-6484.

74. Wiebauer K., Jiricny J. Mismatch-specific thymine DNA glycosylase and DNA polymerase p mediate the correction of G-T mispairs in nuclear extracts from human cells.// Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 1990. V.87. P.5842-5845.

75. Au K.G., Clark S., Miller J.M., Modrich P. E.Coli mut Y encodes an adenine glycosylase active on G-A mispairs.//Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1989. V.86. P.8877-8881.

76. Karran P., Lindahl T. Enzymatic excision of free hypoxanthine from polydeoxynucleotides and DNA containing deoxyinosine monophosphate residues.//J.Biol.Chem. 1978. V.253. P.5877-5879.

77. Karran P., Lindahl T. Hypoxantine in deoxyribonucleic acid: generaton by heat-induced hydrolysis of adenine residues and release in free from calf thymus.// Biochemistry. 1980. V. 19. P.6005-6011.

78. Lindahl Т., New class of enzyme acting on damaged DNA.// Nature. 1976. V.259. P.64-74.

79. Laval J. Two enzymes are required for strand incision in repair of alkylated DNA.// Nature. 1977. V.269. P.829-832.

80. Brent T. Partial purification and characterization of human 3-methyladenine DNA glycosylase.// Biochemistry. 1979. V.18. P. 911-916.

81. Ishiwata K., Oikawa A. Action of human DNA glycosylase on uracil-containing DNA, methylated DNA and their reconstituted chromatin//Biochem. et Biophys. Acta. 1979. V.563. P.375.

82. Goldweith D.A., Thomas L.K., Yang C.-H. Two 3-methyladenine DNA glycosylase and 7-methylguanine DNA glycosylase from E. coli. // J. Supramol. Struct. Cell. Biochem. 1981. Suppl.5. P.211.

83. Gallagher P.E., Brent T.P. Human 3-methyl-adenine-DNA glycosylase: demonstration of a stimulatory factor.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981. V.101. P.956-962.

84. Singer B., Brent T.P. Human lymphoblasts contain DNA glycosylase activity excising N-3 and N-7 methyl and ethyl purines but not O6- alkylguanines or 1-alkyladenines.// Proc. Natl.Acad. Sci.USA. 1981. V.78. P.856-860.

85. Cathcart R., Goldwait D.A. Enzymatic excision of 3-methyladenine and 7-methylguanine by a rat liver nuclear fraction.// Biochemistry. 1981. V.20. P.273-280.

86. Laval J., Pierre J., Laval F. Release of 7-methylguanine residues from alkylated DNA by extracts of M.Luteus and E.Coli.// Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 1981. V.78. P.852-855.

87. Margison P.G., Pegg A.E. Enzymatic release of 7-methylguanine by a rodent liver extracts.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V.78. P.861-865.

88. Ahmed Z., Laval J. Enzymatic repair of O-alkylated thymidine residues in DNA: involvement of 04-methylthymine-DNA methyltransferase and 02-methyIthymine-DNA glycosylase.//Biochem. Biophys. Res. Common. 1984. V.120, P. 1-8.

89. Boorstein R.J., Levy D.D., Teebor G.W. 5-hydroxymethyluracil-DNA glycosylase activity may be a differentiated mammalian function.//Mutat.Res.DNA Repair Repts, 1987. V. 183. P.257-263.

90. Hollstein M.C., Brooks P., Linn S., Ames B.N. Hydroxymethyluracil DNA glycosylase in mammalian cells.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V.81. P.4003-4007.

91. Cannon S.V.,Cummings A., Teebor G.W. 5-hydroxymethylcytosine- DNA glycosylase activity in mammalian tissue.//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. V.151. P.1173-1179.

92. Breimer L., Lindahl T. A DNA glycosylase from E.Coli that releases free urea from a polydeoxyribonucleotide containing fragments of base residues.//Nucleic Acids Res., 1980. Y.8. P.6199-6211.

93. Shapiro R., Klein R.S. The deamination of cytidine and cytosine by acidic buffer solution. Mutagenic implications.//Biochemistry. 1966. V.5. P. 2358-2363.

94. Shapiro R. Damage to DNA caused by hydrolysis. // In: Chromosome damage and repair. 1981. E. Seeberg and K.Kleppe, eds. P.3-10. N.Y. Plenum.

95. Lindahl T., Vyberg B. Heat-induced deamination of cytosine residues in DNA.// Biochemistry. 1974. V.13.P. 3405-3409.

96. Beletskii A., Bhagwat A.S. Transcription-induced mutations: increase in C to T mutations in the nontranscribed strand during transcription in E. Coli.// Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1996. V.93. P.13919-13924.

97. Frederico L.A., Kunkel T.A., Shaw B.R. A sensitive genetic assay for detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy.//Biochemistry. 1990. V.29. P.2532-2537.

98. Shuster H. The reaction of nitrous acid with deoxyribonucleic acid. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1960. V.2. P.320-329.

99. Hayatsu H. Bisulfite modification of nucleic acids and their constituents. Prog. Nucleic Acids Res. 1976. V.16. P.75-88.

100. Lindahl T. DNA glycosylases, endonucleases for apurinic/apyrimidinic sites and base excision repair.// Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 1979. V.22. P. 135-145.

101. Shapiro R., Dubelman S., Feinberg A.M., Grain P.F., Closkey J.A.M. Isolation and identification of cross-linked nucleosides from nitrous acid treated deoxyribonucleic acid.// J. Amer. Chem. Soc. 1977. V.99. P.302-311.

102. Ullman J.S., McCarthy B.J. Alkali deamination of cytosine residues in DNA.// Biochim. Biophis. Acta. 1973. V.294. P.396-404.

103. Lion M.B. Search for mechanism for the increased sensitivity of 5-bromuracil-substituted DNA to ultraviolet light.// Biochim. Biophys. Acta. 1968. V. 155. P. 505512.

104. Tate P.H., Bird A.P. Effects of DNA methylation on DNA-binding proteins and gene expression//Curr.Opin. Genet.Dev. 1993. V.3. P.226-231.

105. Shen J-C, Rideout W.M., Jones P.A. High frequency mutagenesis by a DNA methyltransferase.//Cell. 1992. V.71. P.1073-1080.

106. Bandaru B., Gopal J., Bhagwat A.S. Overproduction of DNA cytosine methyltransferase causes methylation and C-T mutations at non-canonical sites.//J. Biol. Chem. 1996. V.271. P.7851-7859.

107. Geider K. DNA synthesis in nucleotide-permeable Esherichia coli cells. The effects of nucleotide analogues on DNA synthesis.// Eur. J. Biochem. 1972. V. 27. P. 554 -560.

108. Tye B.-K., Chien J., Lehman J.R., Duncan B.K., Warner H.R. Uracil incorporation: a source of pulse-labeled DNA fragments in the replication of the E.Coli.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V.75. P. 233 243.

109. Tamnoi F., Okazaki T. Uracil incorporation into nascent DNA of thymine-requiring mutant of B.Subtiles.// Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1978. V.75. P. 2195-2203.

110. Warner H.R., Duncan B.K. In vivo synthesis and properties of uracil-containing DNA.//Nature. 1978. V.272. P. 32-35.

111. Kornberg A. DNA replication. // 1980. S.-Francisco: Freeman .

112. Goulian M., Bleile B., Tseng B.Y. Methotrexate-induced misincorporation of uracil into DNA.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V.77. P.1956-1965.

113. Goulian M., Bleile B., Tseng B.Y The effect of methotrexate on levels of dUTP in animal cells.// J. Biol. Chem. V.255. P.10630-10639.

114. Myers C.E., Young R.C., Chabener A. Biochemical determinants of 5-fluouracil response in vivo. The role of deoxyuridylate pool expansion.//J.Clin.Invest. 1975. V.56.

115. Takahashi J., Marmur J. Replacement of thymidylic acid by deoxyuridilic acid in the deoxyribonucleic acid of a transducting phage for Bacillus subtiles.// Nature. 1963. V.197. P. 794-800.

116. Tomita F., Takahashi J. A novel enzyme dCTP-deaminase found in Bacillus subtiles infected with phage pBSl.//J.Virology. 1969. V. 15. P. 1073-1080.

117. Cone R., Duncan J., Hamilton J., Friedberg E.C. Partial purification and characterization of uracil-DNA -glycosylase from B.subtiles // Biochemistry. 1977. V.16. P.3194-3201.

118. Warner H. Partial purification and characterizaton of uracil-DNA glycosylase from wheat germ.// J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P.1603-1609.

119. Guyer R.B., Nonnemarker J.M., Deering R.A. Uracil-DNA glycosylase activity from Dictiostelium discoideum.// Biochim. Biophysics. Acta. 1986. V. 868. P. 262-264.

120. Crosby B.L., Prakash H.D., Hinkle D., Hinkle D.C. Purification and characterization of a uracil-DNA-glycosylase from the yeast Saccharomyces cerevisiae.// Nucleic Acids Res. 1981. V.9. P.5797-5809.

121. Caradonna S., Worrad D., Lirette R. Isolation of herpes simplex virus cDNA encoding the DNA repair enzyme uracil-DNA glycosylase.//J.Virol. 1987. V.61. P.3040-3047.

122. Focher F., Verri A., Spadari S. et al. Herpes simplex virus type I uracil-DNA glycosylase: isolation and selective inhibition by novel uracil derivatives.//Biochem. J. 1993. V.292. P.883-889.

123. Koilis A., Cowan D.A., Pearl L.H., Savva R. Uracil-DNA glycosylase activities in hyperthermophilic microorganisms.//FEMS Microbiol. Lett. 1996. V.143. P.267-271.

124. Sandigursky M., Franklin W.A. Thermostable uracil-DNA glycosylase from Thermotoga maritima a member of a novel class of DNA repair enzymes.//Curr. Biol. 1999. V.9(10). P.531-534.

125. Domena J.D., Timmer R.T., Dicharry S.A., Mosbaugh D.W. Purification and properties of mitochondrial uracil-DNA glycosylase from rat liver.// Biochemistry. 1988. V.27. P.6742-6751.

126. Borle M.-T.,Campagnary F., Creissen D.M. Properties of purified UDG from calf thymus. An in vitro study using synthetic DNA-like substrate.// J. Biol. Chem. 1982. V.257. P. 1208-1216.

127. Borle M.-T., Clerici L., Campagnary F. Isolation and characterizaton of UDG from calf thymus.//J. Biol. Chem. 1979. V.254 P.6387-6395.

128. Kuhnlein U., Lee B., Linn S. Human uracil-DNA N-glycosylase: studies in normal and repair defective cultured fibroblasts.//Nucleic Acids Res. 1978. V.5. P.l 17-126.

129. Myrnes B., Wittwer C.U. Purification of the human 06-methylguanine-DNA methyltransferase and uracil-DNA N-glycosylase, latter to apparent homogenety.// Eur. J.Biochem. 1988. V.173. P.383-387.

130. Krokan H., Wittwer C.U. UDG from Hela cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs.// Nucleic Acids Res. 1981. V.9. P.2599-2613.

131. Sirover M.A. Induction of the DNA repair enzyme UDG in stimulated human lymphocytes.// Cancer Res. 1979. V.39. P.2090-2095.

132. Andeson C.T., Friedberg E.C. The presence of nuclear and mitochondrial UDG in extracts of human KB cells.//Nucleic Acids Res. 1980. V.8. P.875-888.

133. Caradonna S.J., Cheng Y.-C. Uracil-DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients.//J. Biol. Chem. 1980. V.255. P.2293-2300.

134. Кузьмин И.А., Голубовская B.M., Апреликова O.M. Очистка и некоторые свойства урацил-ДНК-гликозилаза из плаценты человека.//Биохимия. 1988. Т.53. С.1002-1008.

135. Xiao G., Tordova М., Jagadeesh J., Drohat A.C., Stivers J.T., Gilliland G.L. Crystal structure of E.coli uracil DNA glycosylase and its complexes with uracil and glycerol: structure and glycosylase mechanism revisited.//Proteins. 1999. V.35. P.13-24.

136. Sluppaugh G., Markussen F.-H., Olsen L.C., Aasland R., Aarsaether N., Barke O., Krokan .E., Helland D.E. Nuclear and mitochondrial forms of human UDG are encoded by the same gene.// Nucleic Acids Res. 1993. V.21. P.2579-2584.

137. Domena J.D., Mosbaugh D.W Purification of nuclear and mitochondrial uracil-DNA-glycosylase from rat liver. Identification of two distinct subcellular forms.//Biochemistry. 1985. V.24. P.7320-7328.

138. Gupta P.K., Sirover M.A. Stimulation of the nuclear uracil-DNA-glycosylase in proliferating human fibroblasts.// Cancer Res. 1981. V.41. P.3133-3136.

139. Mosbaugh D.W. Enzymology of uracil-DNA repair in mammalian cells.//Rev. Biochem. Toxicology. 1988. V.9. P.69-130.

140. Muller-Weeks S., Mastran B., Caradonna S. The nuclear isoform of the highly human uracil-DNA glycosylase is an Mr 36,000 phosphoprotein.//J. Biol. Chem. 1998. V.273. P.21909-21917.

141. Seal G., Sirover M.A. Physical association of the human base-excision repair enzyme uracil-DNA glycosylase with 70 kDa catalytic subunit of DNA polymerase a.// Proc. Natl. Acad. Sci USA.1986. V.83. P.7608-7612.

142. Meyer-Siegler K., Mauro D.J., Seal G., Wuzzer J., de Riel J.K., Sirover M.A. A human nuclear uracil-DNA-glycosylase is the 37 kDa subunit of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.//Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1991. V.88. P.8460-8464.

143. Vollberg T.M., Lee K.A., Sirover M.A. Positive correlation between the extent of Cell proliferation and the regulation of base excision repair.// Cancer Res. 1984. V.44. P .2377-2381.

144. Cool B.L., Sirover M.A. Immunocytochemical localization of the base excision repair enzyme uracil-DNA-glycosylase in quiescent and proliferating normal human cells.// Cancer Res. 1989. V.49. P.3029-3036.

145. Gupta P.K., Sirover M.A. Sequential stimulation of DNA repair and DNA replication in normal human cells.// Mutat. Res. 1980. V.42. P.470-475.

146. Nagelhus T.A., Slupphaug G., Lindmo T., Krokan H.E. Cell cycle regulation and subcellular localization of the major human uracil-DNA glycosylase.// Exp. Cell Res. 1995. V.220. P.292-297.

147. Slupphaug G., Olsen L.C., Aasland R. et.al. Cell cycle regulation and in vitro hybrid arrest analysis of the major human uracil-DNA glycosylase.//Nucleic Acids Res. 1991. V.19. P.5131-5137.

148. Haug T„ Skorpen F., Aas Pa., Malm V., Skjelberd C., Krokan H.E. Regulation of expression of nuclear and mitochondrial forms of human uracil-DNA glycosylase.//Nucleic Acids Res. 1998. V.26. P. 1449-1457.

149. Yamamoto Y., Fujiwara Y. Culture-age effect on uracil-DNA glycosylase activity in normal human skin fibroblasts.//J.Virol. 1987. V.42. P.470-475.

150. Myrnes B., Giercksky K.-E., Krokan H. Interindividual variation in the activity of 06-methylguanine methyltransferase and uracil-DNA glycosylase in human organs.//Carcinogenesis. 1983. V.4. P.1565-1568.

151. Krokan H., Haugen A., Myrnes B. et al. Repair of premutagenic DNA lesions in fetal tissues: evidence for low levels of 06-methylguanine methyltransferase anduracil-DNA glycosylase activity in some tissues.//Carcinogenesis. 1983. V.4. P. 15591564.

152. Weng Y., Sirover M.A. Developmental regulation of the base excision repair enzyme uracil-DNA glycosylase in the rat.// Mut. Res. 1993. V.293. P.133-141.

153. Dudley B., Hammond A., Deutsch W.A. The presence of uracil-DNA glycosylase in insects is dependent upon developmental complexity.// J. Biol. Chem. 1992. V.267. P.11964-11967.

154. Svendsen P.C., Yee H.A., Winkfein R.J., van de Sande J.H. The mouse uracil-DNA glycosylase gene: isolation of CND and genomic clons and mapping UNG to mouse chromosome 5.// Gene. 1997. V.189. P.175-181.

155. Worrad D.M., Caradonna S. Identification of the coding sequence for herpes simplex virus uracil-DNA glycosylase.// J.Virol. 1988. V.12. P.4774-4777.

156. Percival K.J., Klein M.B., Burgers P.M.J. Molecular cloning and primary structure of the uracil-DNA glycosylase gene from Saccharomyces cerevisiae.// J. Biol. Chem. 1989. V.264. P.2593-2598.

157. Wittwer C.U., Bauw G., Krokan H.E. Purification and determination of the NH2-terminal amino acid sequence of uracil-DNA glycosylase from human placenta.// Biochemistry. 1989. V.28. P.780-784.

158. Haug T., SkorpenF., Kvaloy K., Eftedal J., Lund H., Krokan H.E. Human uracil-DNA glycosylase gene: sequence organization, methylation pattern and mapping to chromosome 12q23-q24.1.//Genomics. 1996. V.36. P.408-416.

159. Olsen L.C., Aasland R., Wittwer C.U., Krokan H.E., Helland D.E. Molecular cloning of human uracil-DNA glycosylase, a highly conserved DNA repair enzyme.// EMBO J. 1989. V.8. P.3121-3125.

160. Haug T., Skorpen F., Lund H. et al. Structure of the gene for human uracil-DNA glycosylase and analysis of promoter function.// FEBS Lett. 1994. V.353. P. 180-184.

161. Moon Y.W., Park W.S., Vortemeyer A.O., Weil R.J., Lee Y.S., Winters T.A., Zhuang Z., Fuller B.G. Mutation of the uracil-DNA glycosylase gene detected in glioblastoma.//Mutat. Res. 1998. V.421. P.191-196.

162. Tomilin N.V., Aprelikova O.N. Uracil-DNA glycosylases and DNA uracil repair.//Int. Rev. Cytol. 1989. V.l 14. P. 125-179.

163. Varshney U., van Sande J.H. Specificities and kinetics of uracil-excision from uracil containing DNA oligomers by E. coli uracil-DNA-glycosylase.// Biochemistry. 1991. V.30. P.4055-4061.

164. Mauro D.J., Riel J.K., Tallard R.J., Sirover M.A. Mechanisms of excision of 5-fluorouracil by uracil-DNA glycosylase in normal human cells.// Mol. Pharmacology. 1993. V.43. P.854-857.

165. Hatahet Z., Kow Y.W., Purmal A.P., Cunningham R.P., Wallase S.S. New substrate for old enzymes.// J. Biol. Chem. 1994. V.269. P. 18814-18820.

166. Dizdaroglu M., Karakaya A., Jaruga P. et al. Novel activities of human uracil-DNA glycosylase for cytosine-derived products of oxidative DNA damages.//Nucleic Acids Res. 1996. V.24. P.418-422.

167. Zastawny T.H., Doetsch P.W., Dizdaroglu M. A novel activity of E.coli uracil-DNA glycosylase. Excision of isodialuric acid (5,6-dihidrouracil), a major product of oxidative DNA damage, from DNA.//FEBS Lett. 1995. V.364. P.255-258.

168. Saparbaev M., Laval J. 3,N4-ethenocytosine, a highly mutagenic adduct, is a primary substrate for E.coli double-stranded uracil-DNA glycosylase and human mismatch-specific thymine-DNA glycosylase.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V.95. P.8508-8513.

169. Higley M., Lloyd R.S. Processivity of uracil-DNA glycosylase.// Mutat.Res. 1993. V.294. P.109-116.

170. Benett S.E., Sanderson R.J., Mosbaugh D.W. Processivity of E.coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration.//Biochemistry. 1995. V.34. P.6109-6119.

171. Slupphaug G., Eftedal I., Kavli B. et al. Properties of a recombinant human uracil-DNA glycosylase from UNG-gene and evidence that the UNG-gene encodes the major uracil-DNA glycosylase.//Biochemistry. 1995. V.34. P.128-138.

172. Purmal A.A., Lampman G.W., Pourmal E.I. et al. Uracil-DNA glycosylase distributively interacts with duplex polynucleotides containing repeating units of either TGGCCAAGCU or TGGCCAAGCTTGGCCAAGCU.//J. Biol. Chem. 1994. V.269. P.22046-22053.

173. Verri A., Mazzarello P., Spadari S., Focher F. Uracil-DNA-glycosylase preferentially excises mispaired uracil.// Biochem. J. 1992. V.287. P. 1007-1010.

174. Nilsen H., Yazadankhah S.P., Eftedal J., Krokan H.E. Sequence specificity for removal of uracil from U-A pairs and U-G mismatches by uracil-DNA glycosylase from E.Coli and correlation with mutational hotspots.//FEBS Lett. 1995. V.362. P.205-209.

175. Eftedal J., Guddal P.H., Sluppaugh G., Volden G., Krokan H.E. Consensus sequence for good and poor removal of uracil from double stranded DNA by uracil-DNA-glycosylase.// Nucleic Acids Res. 1993. V.21. P.2095-2101.

176. Duncan B.K. Uracil-DNA glycosylase.// In The Enzyme (3rd Edition) 1981. Acad. Press, XIV. part A. P.575.

177. Parikh S.S., Mol C.D., Slupphaug G., Krokan H.E., Tainer J.A. Base excision repair initiation revealed by crystal structures and binding kinetikcs of human uracil-DNA glycosylase with DNA.//EMBO J. 1998. V.17. P.5214-5226.

178. Kumar N. V., Varshney U. Inefficient excision of uracil from loop regions of DNA oligomers by E. coli uracil-DNA-glycosylase.// Nucleic Acids Res. 1994. V.22. P.3737-3744.

179. Kumar N.V., Varshney U. Contrasting effects of single stranded DNA binding protein on the activity of uracil-DNA glycosylase from E. coli towards different DNA substrate.//Nucleic Acids Res. 1997. V.25, P.2336-2343.

180. Viswamitra M.A., Seshadri T.P. An uncommon nucleotide conformation shown by molecular structure of deoxyuridine-5'-phosphate and nucleic acid stereochemistry .//Nature. 1975. V.258. P.542-544.

181. Lee S.-H.,Tinoco J. Conformation studies of trinucleoside diphosphates.//Biophysical Chemistry. 1980. V.ll. P.283-294.

182. Slupphaug G., Mol C.D., Kavli B., Arvai A.S., Krokan H.E., Tainer J.A. A nucleotide-flipping mechanism from the structure of human uracil-DNA glycosylase bound to DNA.//Nature. 1996. V.384. P.87-92.

183. Stivers J.T., Pankiewicz K.W., Watanabe K.A. Kinetic mechanism of damage site recognition and uracil flipping by E.coli uracil-DNA glycosylase.//Biochemistry. 1999. V.38. P.952-963.

184. Luo N., Mehler E., Osman R. Specifisity and catalysis of uracil-DNA glycosylase. A molecular Dynamics Study of reactant and product complexes with DNA.//Biochemistry. 1999. V.38. P.9209-9220.

185. Shroyer M.J.N., Benett S.E., Putham C.D., Tainer J.A., Mosbaugh D.W. Mutation of an Active Site Residue in E.coli uracil-DNA glycosylase: Effect of DNA binding, uracil inhibition and catalysis.//Biochemistry. 1999. V.38. P.4834-4845.

186. Drohat A.C., Jagadeesh J., Ferguson E., Stivers J.T. Role of electrophilic and general base catalysis in the mechanism of E.coli uracil-DNA glycosylase.//Biochemistry. 1999. V.38. P.l 1866-11875.

187. Karran P., Cone R., Friedberg E.C. Specificity of the bacteriophage pBS2 induced inhibitor of uracil-DNA glycosylase.// Biochemistry. 1981. V.20. P.6092-6096.

188. Wang Z., Mosbaugh D.W. Uracil-DNA glycosylase inhibitor gene of bacteriofage pBS2 encodes a binding protein specific for uracil-DNA glycosylase.// J. Biol. Chem. 1989. V.264. P.1163-1171.

189. Bennett S.E., Mosbaugh D.W. Characterizaton of the E. coli uracil-DNA-glycosylase:inhibitor protein complex.// J .Biol. Chem. 1992, V.267. P.22512-22521.

190. Benett S.E., Schimmerlik M.I., Mosbaugh D.W. Kinetics of the uracil-DNA glycosylase/inhibitor protein association. Ung interaction with Ugi, nucleic acids, and uracil compounds.//! Biol. Chem. 1993. V.268. P.26879-26885.

191. Balasubramanian S., Beger R.D., Benett S.E. et al. Secondary structure of uracil-DNA glycosylase inhibitor protein. //J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.296-303.

192. Mol C.D., Arvai A.S., Sanderson R.J., Slupphaug G., Kalvi B., Krokan H.E., Mosbaugh D.W., Tainer J.A. Crystal structure of human uracil-DNA glycosylase in complex with protein inhibitor: protein mimicry of DNA.// Cell. 1995. V.82. P.701-708.

193. Savva R., Pearl L.H., Nucleotide mimicry in the crystal structure of the uracil-DNA glycosylase inhibitor protein complex.//Nature Struct. Biol. 1995. V.2. P.752-757.

194. Sanderson R.J., Mosbaugh D.W. Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity .//J. Biol. Chem. 1996. V.271. P.29170-29181.

195. Wang Z., Mosbaugh D.W Uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriofage pBS 2: cloning and effects of expression of the inhibitor gene in E. coli.// J. Bacteriol. 1988 V.170. P.1082-1091.

196. Gallinari P., Jirincy J. A new class of uracil-DNA glycosylases related to human thymine-DNA glycosylase.//Nature. 1996. V.383. P.735-738.

197. Kavli В., Slupphaug G., Mol C.D., Arvai A.S., Petersen S.B., Tainer J.A., Krokan H.E. Excision of cytosine and thymine from DNA by mutants of human uracil-DNA glycosylase.// EMBO J. 1996. V.15. P.3442-3447.

198. Горн В.В., Зарытова В.Ф., Потемкин Г.А., Средин Ю.Г., Полищук А.С. Синтез 5'- фосфорилированных олигодезоксирибонуклеотидов фосфотриэфирным твердофазным методом в ручном и автоматическом вариантах.//Биоорган. химия. 1986. Т.12. С.1054-1062.

199. Koziolkiewicz М., Wilk A. Oligodeoxyribonucleotide phosphotriesters.//Methods in molecular biology, protocols for oligonucleotides and analogs. Synthesis and properties. Edit. Agrawal S., Humana press, Totowa, New Jersey. 1993. V.20. P.207-224.

200. Мудраковская A.B., Ямковой В.И. Препаративное получение гомоолигорибонуклеотидов, терминированных 5 '-фосфатом.//Ферменты микроорганизмов и деградация биополимеров: М., ВНИИСЭТИ. 1990.С.199-206.

201. Takeshita М.,Chang C.-N.,Johnson F., Will S., Grollman A.P Oligonucleotides containing synthetic abasic sites. Model substrates for DNA polymerases and apurin/apyrimidin endonucleases.//J. Biol. Chem. 1987.V.262. P. 10171 -10179.

202. Shabarova Z.A. Chemical development in the design of oligonucleotide probes for binding to DNA and RNA.// Biochimie. 1988. V.70. P.1323-1334.

203. Кузнецова C.A., Ивановская М.Г., Шабарова З.А. Химические реакции в двуцепочечных нуклеиновых кислотах. IX. Введение замещенной пирофосфатной связи в структуру ДНК.//Биоорган. Химия. 1990. Т. 16. С.219-225.

204. Handbook of biochemistry and molecular biology (3rd Edition). Nucleic Acids. V.l. (Eds.G.D. Fastman) 1975. CRG Press. Cleveland.

205. Karran P., Lindahl Т. Hypoxanthine in deoxyribonucleic acid: generation by heat-induced hydrolysis of adenine residues and release in free form by a deoxyribonucleic acid glycosylase from calf thymus.//Biochemistry. 1980. V.19. P.6005-6011.

206. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.//Nature. 1970. V.227. P.680-685.

207. Nielsen B.L., Brown L.R. The basis for coloured silver-protein complex formation in stained polyacrylamide gels.// Anal. Biochem. 1984. V.141. P.311-315.

208. Suelter C.H. A particial guide to enzymology.// Biochemistry: A series of monographs. 1985. P. 164-166.

209. Корниш-Боуден. Основы ферментативной кинетики.//М: Мир. 1978. С.260-266.

210. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты.//М.: Мир. 1982. С.482-530.

211. Келети Т. Основы ферментативной кинетики.// М. Мир. 1990. С.1-348.

212. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование.//М: Наука. 1981.

213. Kolocheva T.I.,Nevinsky G.A., Volchkova V.A., Levina A.S., Khomov V.V., Lavrik O.I. DNA polymerase I (Klenow Fragment): role of the structure and length of a template in enzyme recognition.//FEBS Lett. 1989. V.248. P.97-100.

214. Невинский Г.А., Левина A.C., Подуст B.H., Лаврик О.И. ДНК-полимеразы эукариот и прокариот. Роль межнуклеозидных фосфатных групп матрицы в ее связывании с ферментом.//Биоорган. химия. 1987. Т.13. С.58-68.

215. Knorre D.G., Lavrik O.I., Nevinsky G.A. Protein-nucleic acid interaction in reaction catalyzed by DNA-polymerases.//Biochimie. 1988. V.70. P.655-661.

216. Невинский Г.А., Подуст B.H., Левина A.C., Халабуда О.В., Лаврик О.И. ДНК-полимераза а плаценты человека. Эффективность взаимодействия олиготимидилатов различной длины с участком связывания матрицы.// Биоорган, химия. 1986. Т.12. С.357-368.

217. Невинский Г.А., Левина А.С., Фролова Е.И., Подуст В.Н. Влияние некомплементарных матрице оснований на эффективность взаимодействия праймеров с ДНК-полимеразой а из плаценты человека.// Молекуляр.биология. 1987. Т.21.С.1193-1200.

218. Nevinsky G.A., Bugreev D.V., Buneva V.N., Yasui Y., Nishizawa M., Andoh T. High affinity interaction of mammalian DNA topoisomerase I with short single- and double-stranded oligonucleotides.//FEBS Lett. 1995. V.368. P.97-100.

219. Белоглазова Н.Г., Лохова И.А., Максакова Г.А., Цветков И.В., Невинский Г.А. Апурин/алиримидиновая эндонуклеаза из плаценты человека. Узнавание ферментом апуринизированной ДНК.//Молекуляр. биология. 1996. Т.ЗО. С.220-230.

220. Колочева Т.Н., Демидов С.А., Максакова Г.А., Невинский Г.А. Взаимодействие эндонуклеазы EcoRI с короткими специфическими и неспецифическими олигонуклеотидами.// Молекуляр. биология. 1998. Т.32. С.865-872.

221. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов.//М., Мир. 1980. С.272-291.

222. Nevinsky G.A.,Levina A.S., Doronin S.V., Podust V.N., Lavrik O.I.//Eds.Brusik K.S., Stec E.I. Amsterdam: Elsevier. 1987. P.339-399.

223. Ferrin L.I., Mildvan A.E. NMR studies of conformations and interactions of substrates and ribonucleotide templates bound to the large fragment of DNA polymerase I//Biochemistry. 1986. V.25. P.5131-5145.

224. Breslauer K.J., Frank R., Blocker H., Marky L.A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V.3. P.3746-3750.

225. Zimmerman S.B., Pheiffer B.M. A RNA- DNA hybrid that can adopt two comformations: an X-ray diffractions study of poly(rA)«poiy(dT) in concentrated solutions or in fibers.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V.78. P.78-82.

226. Gromova E.S., Kubareva E.A., Vinogradova M.N., Oretskaya T.S., Shabarova Z.A. Peculiarities of recognition of CCa/tGG sequence in DNA by restriction endonuclease Mval and EcoRII.//J. Mol. Recogn. 1991. V.4. P.133-141.

227. Aurup Н., Williams D.M., Eckstein F. 2'-fluoro- and 2'-amino -2' -deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerases .//Biochemistry. 1992. V.31. P.9636-9641.

Информация о работе

Василенко, Наталья Леонидовна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Узнавание ДНК урацил-ДНК-гликозилазой из плаценты человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы