Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы из ESCHERICHIA COLI с олигодезоксирибонуклеотидами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы из ESCHERICHIA COLI с олигодезоксирибонуклеотидами"

РГ6 од

на правах рукописи

4 АПР 1958

ИЩЕНКО АЛЕКСАНДР АНАТОЛЬЕВИЧ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ 8-ОКСОГУАНИН-ДНК-ГЛИКОЗИЛАЗЫ ИЗ ЕБСНЕШСтЛ СОЫ С ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДАМИ

03.00.04-Биохимия

Новосибирск 1998

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Невинский Г.А.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Малыгин Э. Г. кандидат биологических наук Синицина О. И.

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится " " ^ ¿у/^ё-*-^_1998 года

в $?^часов на заседании диссертационного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект ак. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института бйоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан " <?3> " /М^СС^?^-^ 1998 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор химических наук

О.С. Федорова

Характеристика работы.

Актуальность проблемы. Оксидативные повреждения ДНК являются наиболее важными причинами мутаций и могут играть решающую роль в процессах старения и возникновении раковых заболеваний людей. За репарацию большей части таких повреждений ДНК клетки отвечает фермент - 8-оксогуанин(формамидопиримидин)-ДНК-гликозилаза (OG-ДГ). Гликозилаза обладает широкой субстратной специфичностью, выщепляя окисленные пуриновые основания ДНК. При этом основными субстратами для нее являются 8-оксогуанин и 5-формамидопиримидины ДНК. Кроме того, OG-ДГ из Е. coli обладает ассоциированной апурин/апиримидин-лиазной и 5'-концевой дезоксирибозофосфатазной активностями, что является уникальным свойством фермента этого класса. К настоящему времени обнаружена 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазная активность также в клетках эукариот и человека. OG-ДГ из E.coli биохимически достаточно хорошо охарактеризована. Однако, несмотря на значительный прогресс в ее изучении, информация о взаимодействии гликозилазы с ДНК-субстратом и специфическими звеньями, в литературе практически отсутствует. В связи с этим изучение взаимодействия OG-ДГ с ДНК является чрезвычайно актуальным и необходимым для более глубокого понимания механизмов узнавания гликозилазой ДНК-субстрата и ее роли в репарации нарушений ДНК, возникающих при действии активных форм кислорода. Цель работы. Целью работы было изучение закономерностей взаимодействия OG-ДГ с ДНК. В работе решались следующие задачи: 1) разработка метода получения гомогенных препаратов OG-ДГ из Е. coli\ 2) исследование активности OG-ДГ по отношению к одно- и двухцепочечным олигонуклеотидам; 3) изучение влияния расположения и окружения модифицированных нуклеотидных звеньев в олигонуклеотидах различного состава и их комплексов на активность OG-ДГ; 4) определение протяженности участков ДНК, защищаемых ферментом от нуклеазного расщепления; 5) изучение специфических и неспецифических, сильных и слабых взаимодействий OG-ДГ с ДНК на количественном уровне с помощью анализа ингибирования, исследуемого фермента олигонуклеотидами различного состава и длины; 6) оценка относительного вклада неспецифических взаимодействий OG-ДГ с ДНК в обеспечение специфичности действия фермента.

Научная новизна и практическая ценность работы. Работа представляет собой первое, на количественном уровне, систематическое исследование механизмов узнавания OG-ДГ ДНК, дезоксирибоолигонуклеотидов (ON) и их производных, содержащих 8-оксогуанин (8-oxoG) в различных положениях цепи. Разработан эффективный и легко

воспроизводимый метод получения электрофоретически гомогенных препаратов OG-ДГ из клеток суперпродуцирующего штамма Е. coli. Впервые показана возможность расщепления ферментом одноцепочечных ON, содержащих 8-oxoG. Выявлена закономерность изменения величин Кт и Fmax в реакции, катализируемой гликозилазой, в зависимости от положения 8-oxoG в составе одно- и двухцепочечных ON. Впервые показано, что: а) введение в дуплекс двух соседних 8-oxoG в большей степени замедляет катализ выщепления обоих оснований, чем влияет на эффективность комплексообразования; б) расщепление субстратов OG-ДГ происходит только в том случае, когда модифицированное основание удалено по крайней мере на 2-звена от 3'-конца ON. Показано, что только в случае ON, содержащих 8-oxoG в первом положении с 5'-конца, для расщепления олигонуклеотида необходимо наличие 5'-концевого фосфата. Оценена протяженность участка ДНК, защищаемого OG-ДГ от нуклеазного расщепления (10-14 звеньев). Показано, что при переходе от одно- к двухцепочечной ДНК возрастает число звеньев ON, взаимодействующих с гликозилазой. Установлено, что АР-лиазный центр OG-ДГ расположен на расстоянии не более 3 нуклеотидных звеньев от 5'-конца 10-14 звенного фрагмента ДНК, находящегося в пределах белковой глобулы фермента. Впервые определены величины К\ (AG"), характеризующие эффективность комплексообразования OG-ДГ с ON различного состава и длины. Проведен анализ роли оснований и межнуклеотидных фосфатных групп ON в их связывании с OG-ДГ. Показано, что специфичность функционирования гликозилазы обеспечивается не на стадии комплексообразования, а на стадии катализа за счет увеличения (на несколько порядков) величины константы скорости реакции в случае ON, содержащих 8-oxoG.

Результаты работы являются чрезвычайно важными для понимания механизмов репарации и белково-нуклеиновых взаимодействий.

Объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах, включая 20 рисунков и 5 таблиц. Список цитированной литературы включает 189 работ. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов работы и их обсуждения, выводов.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Основные результаты работы докладывались на Научно-практической конференции врачей "Актуальные проблемы развития и совершенствования военной медицины в Сибирском военном округе" (Новосибирск, 1995), Международном симпозиуме "Recombination: mechanism and biological consequences" (Avignon, 1995), Двухсторонних симпозиумах "Regulation of Gene Expression" Франция-Россия (Новосибирск, 1995; Montpellier-

Ile, 1997), Международной конференции "Современные концепции эволюционной генетики" (Новосибирск, 1997), Международной конференции (Volga River, June 9-14,1997).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Выделение гомогенного препарата OG-ДГ из клеток E.coli.

Разработан эффективный и легко воспроизводимый метод получения электрофоретически гомогенных препаратов OG-ДГ из клеток суперпродуцирующего штамма E.coli (рис. 1). Данные выделения суммированы в таблице 1. Использование ультразвука для разрушения клеток, ионнообменных хроматографий на Q- и SP-сефарозе, а также гель-фильтрации на Fractogel HW-50 позволило сократить время выделения гликозилазы с 4-5 (Boiteux, 1990) до 1-2 дней. Показано, что препарат фермента обладает высокой удельной активностью (1х105 ед.акт./мг) и не содержит ферментов, расщепляющих нуклеиновые кислоты.

2. Расщепление OG-ДГ одноцепочечиых ON.

В работе использованы ON, представленные в таблице 2. Введены сокращения, в которых цифра после OG соответствует положению 8-oxoG звена относительно 5'-конца (OG№) или З'-конца ON (OG№').

Впервые показано, что фермент способен расщеплять одноцепочечные ON (onON), содержащие 8-oxoG в различных положениях цепи (рис. 2). Эффективность расщепления ouON значительно ниже, чем двухцепочечных ON OmON) (рис. 3). В отличие от дуплексов, когда образуется только один [32Р]-продукт, расщепление оцОМ, приводит, примерно с одинаковой эффективностью, к образованию двух продуктов. Один из продуктов соответствует по электрофоретической подвижности продукту, образующемуся в случае а подвижность второго была близка к таковой для более длинного на одно звено ON (рис. 3). Принимая во внимание двухстадийность процесса выщепления OG-ДГ остатка сахара в результате расщепления фосфодиэфирных связей справа и слева от него, сделано предположение о том, что в случае ouON одним из продуктов является ON с не отщепленным остатком сахара. В случае дц-и ouOGl, содержащего 8-oxoG в первом положении с 5'-конца, образуется только один продукт расщепления, электрофоретическая подвижность которого соответствует дезоксирибозофосфату, что говорит о протекании только первой стадии реакции.

3. Анализ взаимодействия OG-ДГ со специфическими ON.

Выявлена закономерность изменения величин Кт и Ктах реакции,

катализируемой OG-ДГ, в зависимости от положения 8-oxoG в составе ouON и дцО!Ч. Показано, что среди дуплексов, содержащих 8-oxoG

вблизи 5'-конца, сродство и скорость превращения дуплекса, соответствующего OG1, имеют минимальное значение (табл. 3). При дальнейшем удалении модифицированного звена от 3'- и 5'-концов ON происходит сначала резкое, а затем медленное понижение величины Кт с одновременным повышением величины Vmax. В конечном итоге скорость расщепления при переходе от OG1 к OG11 . дуплексу возрастает более чем на три порядка, тогда как величина Кт понижается всего на один порядок. Показано, что введение в дуплекс двух соседних 8-oxoG в большей степени замедляет каталю выщепления обоих оснований, чем влияет на эффективность комплексообразования. При переходе от дуплексов к соответствующим оц(Ж наблюдается резкое понижение сродства субстратов к ферменту.

Таблица 1. Протокол очистки OG-ДГ из суперпродуцентного штамма E.coli.

Стадия очистки . Общий белок, мг Удельная активность х10"3, ед.акт./мг Суммарная активность хЮ"6, ед.акт Выход, % Степень очистки

Исходный клеточный материал 225 5,5 1,23 100 1

Очистка на 0-сефарозе 125 9,1 1,14 93 1,8

Хроматография на ЭР-сефарозе 6,3 97 0,61 50 35

Гельфильтрация на РгасЮде! Н\/У-50 5,2 100 0,52 42 43

Таблица 2. оц(Ж, содержащие 8-oxoG (G*) и комплементарные им ON

Сокраще-ние Дезоксирибоолигонуклеотил

OG1 С'СТСТСССТГССТССПТССТСТ

OG2 CG*TCTCCCTTCCTCCTTTCCTCT

OG3 GTG*CTCCCTTCCTCCTTTCCTCT

OG4 CTCG*TCCCTTCCTCCTTTCCTCT

OG5 CTCTG*CCCTTCCTCCTTTCCTCT

OG6 стстссссттсстссптсстст

OG11 CTCTCCCTTCG*CTCCnTCCTCT

OG(II,I2) CCTCTCCCTTG*G*TCCTrrCCTCT

OG2' стсстсссттсстссттгсстс*т

OG3' СТССТСССТТССТССТП CCG*CT

OG4' CTCCTCCCTTCCTCCTTTCG«TCT

G6 CTCTCGCCTTCCTCCTTTCCTCT

G11 CTCTCCCTTCGCTCCTTTCCTCT

С№ комплементарные указанным выше OG№ ON, содержащие С напротив G* оснований соответственно.

С(П,12>* AGAGGAAAGGACCAAGGGAGGAG

Рис. 1. Электрофорети-ческий анализ препаратов OG-ДГ в 15%-ном ПААГ. Дорожка (М) - маркерные белки, (1) - OG-ДГ.

«Да « »

^

67- . (Ьь 62-

l

SO- j

!

Рис. 2. Электрофоретический анализ в 20%-ном ПААГ расщепления об-ДГ дуплекса СЮ 11 (дорожка 1) и оц(Х}11 (2). Концентрация фермента в случае оцСЮ11 (50 мкг/мл) превышала таковую для дуплекса примерно в 3x103 раза. Дорожка (К) - соответствует ООП, подвергнутому , 2 3 4 5 6 7 в 9 10 „ расщеплению по Максаму

и Гилберту. Цифры слева ^ в

указывают положение - • -

контрольных (Ж различной длины (п). ^

Олигонук-леотиды нМ V * ' шах , % нМ/ми Н Соотношение констант

Двухцепо-чечные £т(ОЦ) -Мдц)

(ХЛ 60 0,04 0,67 12,5

002 16 0,44 28 81

ООЗ 15 31 2000 67

ОС4 12 22 1800 91

005 10 10 1000 120

СЮ6 8 100 12000 113

ООП 6 100 17000 167

ОС(11,12) 38 0,8 21 17

00(11,12). С(11,12)* 60 2 33 -

ООЗ' 40 0,03 0,75 15

004' 6 0,1 17 92

Одноцепо-чечные К™, (оц) Ут* (дц)

001 750 2 2,7 50

002 1300 0,6 0,46 1,4

ООЗ 1000 1,5 1,5 0,05

004 1100 2 1,8 0,09

005 1200 1 0,83 0,1

ООб 900 0,6 0,67 0,006

ООП 1000 4,6 4,6 0,05

00(11,12) 660 5,3 8,0 6,6

ООЗ' 600 0,27 0,45 9

004' 550 0,22 0,4 2,2

Рис. 3. Радиоавтограф элек-трофоретического разделения продуктов расщепления СЮ-ДГ одной из цепей дуплексов, соответствующих ОСП (1), ООб (3), (Ю5 (5), 004 (7) и ОвЗ (9), в 20%-ном ПААГ. Дорожки 2, 4, б, 8 и 10 соответствуют указанным выше дуплексам, инкубированным в отсутствие фермента; 11 - дуплексу 011.

Таблица 3

Данные о величинах

•Кп, Ктах И Кка/Кт,

характеризующих сродство и эффективность расщепления оцОИ и их дуплексов ОО-ДГ.

* Рта* для дуплекса ООП принята за 100%.

Величины Кт и Vma% для oitON слабо зависят от положения 8-oxoG в их составе по сравнению с дцСЖ. Сделано предположение, что низкая эффективность расщепления onON OG-ДГ обусловлена син-конформацией 8-oxoG-3Bena, поскольку выгодная для фермента анти-конформация S-oxoG-звена не может быть стабилизирована в случае оц-субстрата основаниями второй цепи.

Показано, что расщепление субстратов OG-ДГ, как и в случае урацил-ДНК-гликозилазы (УДГ), происходит только при удалении модифицированного основания, по крайней мере, на 2-звена от 3'-конца ON (рис. 4). Показано, что только в случае ON, содержащих 8-oxoG в первом положении с 5'-конца, для расщепления олигонуклеотида необходимо наличие 5'-концевого фосфата (рис. 5). С помощью обработки реакционной смеси пиперидином после инкубации фермента с дуплексом OG1, было показано, что низкая скорость расщепления дуплекса OG1 лимитируется стадией действия гликозилазного, а не АР-лиазного центра фермента.

д • ^ Рис. 4. Радиоавтограф электро-

2 3 1 2 3 форетического разделения в 20%-

ном ПААГ продуктов расщепления ОС-ДГ дуплексов (А) и оцОЫ (Б), соответствующих (ХЩ!), СЮЗ'(2) и СЮ4'(3).

12 3 12 3

Mi шш

тФ ф

Полученные данные указывают на общий характер субстратной специфичности и структурно-функциональных особенностей ОС-ДГ и УДГ.

На основании анализа полученных результатов сделан вывод о том, что положение 8-охой в дуплексе влияет, главным образом, на скорость выщепления модифицированного основания и, в меньшей степени, на эффективность комплексообразования анализируемого дуплекса с ферментом. В случае оцОИ положение 8-охоС слабо влияет на термодинамические и кинетические параметры реакции.

4. Ингибиторный анализ взаимодействия ОС-ДГ с ОГЧ.

Одним из наиболее удобных и информативных методов определения количественных характеристик взаимодействия Ой-ДГ и ДНК, как было показано нами, является ингибиторный анализ с использованием ОК различной длины и состава. Сравнение этих результатов и данных, полученных для других ДНК-зависимых ферментов, представляется интересным в плане исследования общих закономерностей белково-нуклеинового узнавания.

Мы проанализировали влияние 0N на скорость расщепления и показали, что различные специфические и неспецифические ON и их дуплексы ингибируют реакцию расщепления дуплекса, соответствующего OG3 и других ON, содержащих'8-oxoG.

Рис. 5. Кинетические кривые расщепления гликозилазой OG1 и OG2. Кривые I и 5 - ouOGl и ouOG2, несущие монофосфат на 5'-конце; 2 и 6 - onOGl и ouOG2, несущие ОН-группу на 5'-конце;

3 и 7 - дуплексы OG1 и OG2, несущие монофосфат на 5'-конце;

4 и 8 - дуплексы OG1 и OG2, несущие ОН-группу на 5'-конце, соответственно.

Было показано, что

Время, мин —

ингибирование катализируемой ферментом реакции достигается в результате конкуренции различных ON с субстратом OG3«C3 за активный центр OG-ДГ (рис. 6). В использованных нами условиях при концентрации субстрата OG3»C3 равной 2К» при конкурентном ингибировании величина /so должна быть равна что и наблюдается в опытах, где в качестве ингибиторов использовали d(pC)9 (/50= 500 мкМ, К{ = 170 мкМ), d(pT)10 (/50 = 350 мкМ, ^¡ = 110 мкМ) и d(pA)I0 (/50= 250 мкМ, = 80 мкМ), а также их комплексы с комплементарными цепями (табл. 4). Эти данные говорят о том, что с помощью ингибиторного анализа можно проводить корректную оценку сродства различных ON к ДНК-связывающему участку OG-ДГ. Величины /50 для всех использованных модельных оц- и дц-dipN),, суммированы в табл. 4 и представлены на рис. 7 в виде зависимостей величин lg/50 от длины (п) лигандов. Видно, что все зависимости являются линейными до п= 9-10 для оцОЫ и п=13-14 для дцОИ, соответственно. Линейность зависимостей свидетельствует об аддитивном характере взаимодействия отдельных нуклеотидных звеньев оцОЫ и пар нуклеотидов дцОИ с OG-ДГ. В связи с этим, участок связывания ДНК на OG-ДГ можно представить состоящим из 10-13 подцентров, взаимодействующих с таким же числом отдельных звеньев ДНК. Сродство oi.;ON практически не изменяется при п>10, в то время как для дуплексов только при п>14 (рис. 7). Это может свидетельствовать в пользу того, что при переходе от ouON к ähON происходит изменение числа нуклеотидных звеньев, находящихся в пределах глобулы фермента и взаимодействующих с OG-ДГ.

I • -г

-ОД О

0,4 ' 0^6 [G11*C11J, мкМ

О 10 20

1/1G11*C11],mkM"

Рис. 6. Зависимости начальных скоростей реакции расщепления дуплекса OG3*C3, катализируемой OG-ДГ, от концентрации ингибитора G11*C11 при различных концентрациях субстрата OG3»C3 в координатах MV от I (а) и Fol(Vo-V) от 1II {б), где V0 и V начальные скорости реакции в отсутствие и в присутствии ингибитора, соответственно. Кривые 1,2,3 соответствуют 20, 30 и 40 нМ концентрации OG3»C3 дуплекса.

7 -6 -54

3 -21 -

Рис. 7. Зависимости отрицательных значений логарифмов величин /50 от числа мононук-леотидных звеньев (п) в с1(рМ)п и их дуплексах. Кривые 1, 2, 3, 4 соответствуют ё(рА)п, (3(рТ)„, <1(рС)„ и

с1(рА)п*с1(рТ)п.

П I I I I Г

10 12 14 16 18 20

П

5. Защита ДНК СЮ-ДГ от нуклеазного гидролиза.

Предположение об изменении числа нуклеотидных звеньев ДНК, находящихся в пределах глобулы фермента при переходе от оц- к дцСЖ, было подтверждено в экспериментах по оценке числа нуклеотидных звеньев, защищаемых ферментом от нуклеазного гидролиза, в составе

комплексов OG-ДГ с оц- и дц(Ж. Перед обработкой комплексов нуклеазами была проведена «сшивка» фермента с 23 звенными гетеро-onON с помощью г/мс-аквагидроксидиаминоплатины.

Таблица 4. Величины /50*, характеризующие сродство различных нуклеозидмонофосфатов, оцСЖ и их дуплексов к OG-ДГ из Escherichia coli.

Нуклео- ^50' Олиго- hoi Олигонук- hoy

зидмоно- мМ нуклео- MM леотид мМ Дуплексы MKM

фосфаты тид

КН2РО„ 30 d(pA)2 8 d(pT)2 10 d(pT)6.d(pA)e 800

R** 470 dA(pA)2 8 dT(PT)2 - d(pT)8.d(pA)8 150

pR 25 d(pA), 5 d(pT), 5 d(pT),0.d(pA)l() 20

dAMP 10 d(pA)4 - d(pT)4 4 d(pT),2*d(pA),2 6

dTMP 25 d(pA)6 2.3 d(pT)6 1.75 d(pT)|4»d(pA),4 1.5

dCMP 25 d(pA), 0.75 d(pT)8 - d(pT)16.d(pA),6 2

dGMP 10 ФА),„ 0.25 d(pT),0 0.35 d(pT)20»d(pA)20 3

d(pA)„ - d(pT)12 0.4

d(pA)u 0.25 d(pT)„ 0.15

d(pA),6 0.25 d(pT)16 0.1

d(pA)20 0.2 d(pT)20 0.1

d(PC)5 2.5

d(pC)7 1.5 d[p(Et)T]10 0.9

d(PC), 0.5 d(pF***),pT 0.25

d(pC)I4 0.15

Gll 0.030 OG11 0.007 Gll'Cll 0.2

G6 0.030 OG6 0.006

Cll 0.018 OG1 0.006 OGNC1 . 0.02

C3 0.030 OG2 0.001 OG2.C2 0.03

Ошибка в определении величин /50 не превышала 20-40 %, приведены усредненные данные 3-4 измерений.

** Я - дезоксирибоза, *** Р - производное тетрагидрофурана.

Полученные аддукты фермента с ОЫ подвергали обработке смесью фосфодиэстеразы и эндонуклеазы из змеиного яда, а затем, для получения свободных ОМ, донорно-акцепторные связи иона платины с гликозилазой и ОЫ разрушали с помощью ЫаСЫ. Как видно из рис. 8, в составе стабильных аддуктов фермент защищает 9 звеньев оцО!Ч, а при добавлении комплементарной цепи длина защищаемого ОК возрастает до 13 звеньев.

Далее была сделана попытка локализовать АР-лиазный центр на ферменте. Для этого нами были использованы литературные данные об образовании основания Шиффа между ЫН-группой остатка Рго1 Ов-

ДГ и Сг-атомом дезоксирибозы модифицированного звена после удаления 8-oxoG основания. На первой стадии гликозилаза была модифицирована специфическими ON, содержащими 8-oxoG основание в различных положениях с 5'-конца, путем инкубации фермента с оц-или дц-[5'-32Р](ХН - OG11 и одновременного восстановления образующихся интермедиатов боргидридом натрия. Затем для удаления [32Р]-метки из ON, 5'-концевая зона которых находится за пределами белковой глобулы фермента, ковалентные аддукты белка с суицидными реагентами, в первом случае, были обработаны смесью фосфодиэстеразы и эндонуклеазы из змеиного яда, а во втором, щелочной фосфатазой. Данные рис. 9 свидетельствуют о том, что фермент защищает от расщепления нуклеазами 5'-концевую зону OG1 -OG5 ON, а в случае фосфатазы только OG1 - OG4 ON (рис. 10). Таким образом, можно сделать вывод, что АР-лиазный центр фермента расположен в 5'-концевой области ДНК-связывающего участка фермента - на расстоянии не более 3 нуклеотидных звеньев от 5'-конца, связываемых ферментом 9-13 звенных ON.

6. Взаимодействие OG-ДГ с неспецифическими ON

Как следует из данных табл. 4, величины /50 (25-30 мМ) для ортофосфата (P¡), 5'-дезоксирибозофосфата и dNMP практически не отличаются, а величина /50 для дезоксирибозы превышает 0,4 М. Следовательно, основной вклад в узнавание ферментом dNMP (и одного из звеньев ON) вносит фосфатная группа этих лигандов. Аналогичный вывод о важности одной из межнуклеозидных фосфатных групп ON для их узнавания сделан ранее в случае ферментов репликации, репарации и топоизомеризации (Невинский и др., 19901997). '

Рис. 8. Электрофоретический анализ длины неспецифических оц- и дц(Ж, защищаемых OG-ДГ от гидролиза нуклеазами. К - исходный Gl 1, модифицированный Pt2+ - реагентом. К' - Gl 1 после разрушения его ковалентной связи с белком до обработки аддукта нуклеазами; 1 и 2 - Gl 1 после обработки аддуктов фосфодиэстеразой и эндонуклеазой в случае оц- (7) и гетеро-дцСЖ (2), соответственно. Цифры слева указывают положение контрольных ON различной длины (п).

К К' / 2

23-

«8

и- ч» *

%

9- Ь |

1 3 5 7 9 и 13 2 4 6 8 10 12 14

м-.

Г

а

1 3 5 7 9 И 13 2 4 6 8 10 12 14

• * I I •

V

Дорожки 1 2 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12 13 14

имп/мин*10° 145 140 30 28 150 130 60 65 30 32 22 10 100 25

Дорожки 1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14

нмп/мии*1()3 48 50 48 46 49 44 73 60 70 60 20 8 22 5

Рис. 9. Радиоавтограф электрофоретического анализа содержания в белке 32Р-метки, ковалентно присоединенных к СЮ-ДГ специфических оц- (а) и дц-[5'-32Р]ОЫ (б) до и после обработки аддуктов белка с (Ж нуклеазами. Дорожки 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 - аддукты белка с СЮ1 -СЮб, (Ю11 до обработки, а дорожки 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 - после их обработки фосфодиэстеразой и эндонуклеазой. М - положение немодифицированной ОО-ДГ.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

ф : Ш '.Ч ^ .. V, . ^ ,, _, фф I

м ->

Рис. 10. Радиоавтограф электрофоретического анализа содержания в белке [32Р]-метки ковалентно присоединенных к OG-ДГ специфических оц-[5'-32Р](Ж (дорожки 1-8) и au-[5'-32P]ON (дорожки 9-14) до (1, 3, 5, 7, 9, 11, 13) и после (дорожки 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14) обработки аддуктов белка с этими ON щелочной фосфатазой. Дорожки 1, 2 - с OG11; дорожки 3, 4, 9, 10.- с OG6; дорожки 5, 6, 11, 12 - с OG5; дорожки 7, 8, 13 и 14 - аддукты белка с OG4, соответственно. М- положение немодифицированной OG-ДГ.

Изменение величины Kt (Kä\ /50) для всех исследованных ouON можно описать с помощью убывающей геометрической прогрессии: ^[(dpN)„l= /Ц^МР)1.[едГ' = *■„[(dNMP)I.ll/yr', где ^[(dNMP)] - константа, характеризующая сродство фермента к минимальному лиганду (dNMP), /Cd(n) = Mf - К, для любого другого нуклеотидного звена протяженного лиганда (при 1<п<10 эти значения практически равны); п - число нуклеотидных звеньев в составе лиганда, /- фактор увеличения сродства при возрастании длины лиганда на одно звено.

Значения величин фактора / для ё(рС)п, с1(рТ)„ и с!(рА)п равны 1,41,6, а для с1(рТ)п«с1(рА)п - 2,2, соответственно. Изменение сродства в 1,41,6 раза при удлинении оцОЫ на одно звено соответствует изменению свободной энергии Гиббса на -0,2...-0,28 ккал/моль, что сравнимо с соответствующими величинами для слабых гидрофобных, ион-дипольных и диполь-дипольных взаимодействий. Значения фактора / (1,40-1,60) и величин Кл (0,62-0,71М) для оцСЖ, характеризующие слабые взаимодействия ОО-ДГ с 9-тью нуклеотидными звеньями, практически не зависят от природы нуклеотидных звеньев. Это свидетельствует об определяющем вкладе сахарофосфатного остова оцОИ в узнавание СЮ-ДГ ОМ-субстратов. Дополнительным свидетельством в пользу этого является то, что сродство всех <1(рК)10 к ферменту практически не отличается от такового для олигомера <1(рР)9рТ (табл. 4), не содержащего 9 из 10 оснований: Б - химически стабильный аналог дезоксирибозы - производное тетрагидрофурана (рис. 11).

Рис. 11. Производное

тетрагидрофурана (Т). роль межНуКЛеозидных фосфатных групп (Ж в их связываниии с Ов-ДГ исследована с помощью

НО—СН п Н

аналога олиготимидилата, этилирован-ного по межнуклеозидным фосфатным группам - с![р(Е1)Т] ,0 (табл. 4). Показано, что сродство Ов-ДГ к межнуклеотидной фосфатной группе определяется он н не только образованием электростатического контакта с атомом кислорода Р-О , но и Р=0 группы (Ж Сделано предположение, что взаимодействие отрицательно заряженных межнуклеозидных групп с положительно заряженной поверхностью ДНК-узнающего центра фермента может происходить по типу взаимодействия не непосредственно контактирующих групп, а противоположно заряженных поверхностей биополимеров.

Как ввдно из рис. 7 и табл. 4, минимальным лигандом, проявляющим свойства дуплекса в случае ОО-ДГ, является комплекс с!Т(рТ)7*с1А(рА)7, который в растворе имеет температуру плавления 21°С, близкую к температуре проведения реакции (25°С). Таким образом, существенной стабилизации коротких дуплексов за счет их взаимодействия с ОО-ДГ, как в случае ДНК-топоизомеразы I (Бугреев и др., 1997), не происходит. Это объясняется отсутствием сильных контактов с обоими цепями дуплексов: только одна из межнуклеозидных фосфатных групп "сканируемой" цепи дуплекса образует дополнительные контакты с активным центром фермента.

В отличие от оц01Ч, линейный рост величин для дуплексов при п>8 наблюдается до п<14. Изменение сродства дуплексов, например,

I 7«

с!(рТ)п»с1(рА)п, при увеличении их длины (п>8) описывается убывающей геометрической прогрессией аналогичной таковой для оцСЖ: фактор / возрастает от 1,4-1,6 до 2,2 (табл. 4). Исходя из полученных и литературных данных сделано предположение, чт'о в узнавании одной цепи участвуют 9-10 подцентров, а вторая цепь дуплекса взаимодействует с дополнительными 3-4 подцентрами фермента, при этом в увеличении числа подцентров, взаимодействующих с дцДНК может быть задействован "цинковый палец" СЮ-ДГ, который, как известно, взаимодействует с обеими цепями ДНК.

Как видно из табл. 4, замена в оцОЫ сЮ на 8-охосЮ звено приводит к возрастанию их сродства к ферменту лишь в 4-5 раз. В случае дуплексов, соответствующих СЮ2 и 001 (плохие субстраты фермента) и аналогичных дуплексов, содержащих (Ю вместо 8-охосЮ звена, разница в сродстве составляет 7-10 раз, соответственно. Согласно литературным данным величина Кл дуплекса, соответствующего ОС11, равна 0,6 нМ: эта величина на 2 порядка ниже, чем К{ для соответствующего неспецифического дуплекса С11. Таким образом, как и в случае других исследованных ранее ферментов, вклад специфического звена в сродство модифицированной ДНК к ОО-ДГ не превышает одного -двух порядков. В то же время, совокупность слабых аддитивных взаимодействий ДНК с ОС-ДГ обеспечивает около семи порядков сродства (рис. 12). Как следует из литературных и полученных нами данных, Ов-ДГ не способна с заметной эффективностью выщеплять основания из немодифицированной ДНК: скорость реакции в случае неспецифических субстратов понижается более чем на 5 порядков.

Рис. 12. Гипотетическая схема образования специфического комплекса 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы с ДНК.

Электростатические, ион-дипольные взаимодействия АС°=- 1,4 ккал/моль

(3*-конец)

Аддитивные электростатические, ион-дипольные взаимодействия АС°(114)= - 7,0...- 8,4 ккал/моль

Таким образом, стадия комплексообразования не может обеспечить специфичности действия OG-ДГ. Специфичность OG-ДГ ' обеспечивается возрастанием константы скорости реакции при переходе от неспецифической к специфической ДНК.

Выводы

1. Разработан простой и эффективный метод получения электрофоретически гомогенных препаратов 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (OG-ДГ) из клеток E.coli. Препараты фермента с высокой удельной активностью не содержат белков, расщепляющих нуклеиновые кислоты.

2. Проведена оценка протяженности участков ДНК, взаимодействующих с OG-ДГ: фермент защищает от расщепления нуклеазами 9 звеньев одноцепочечных (оц) олигонуклеотидов (ON) и 13 пар нуклеотидов двухцепочечных (дц) ДНК. Установлено, что АР-лиазный центр OG-ДГ расположен на расстоянии не более 3 нуклеотидных звеньев от 5'-конца 9-13 звенного фрагмента ДНК, находящегося в комплексе с ферментом.

3. Впервые проведен детальный кинетический и термодинамический анализ закономерностей взаимодействия OG-ДГ с ДНК.

а) Показано, что минимальным лигандом ДНК-связывающего центра фермента является dNMP, основной вклад в сродство которого дает его фосфатная группа. Увеличение длины неспецифических оц- и дц-d(pN)„ на одно звено (при п<10-14) приводит к возрастанию их сродства к ферменту в 1,7 - 2,2 раза, в основном, за счет слабых (преимущественно электростатических) аддитивных взаимодействий фермента с сахарофосфатным остовом ДНК. Фермент не стабилизирует короткие дуплексы: относительный вклад одной из цепей дуплекса в его сродство к OG-ДГ на несколько порядков больше, чем второй. Совокупность неспецифических аддитивных взаимодействий OG-ДГ с ДНК обеспечивает до 7 порядков от общего сродства фермента к специфической ДНК (Kd = 1 нМ).

б) Показано, что OG-ДГ способна расщеплять не только дцОЫ, но и ouON, содержащие 8-оксогуанин (8-oxoG). Выявлена закономерность ИЗМеНеНИЯ веЛИЧИН Кт И Ктах для субстратов в зависимости от положения 8-oxoG в составе оц- и auON. Два соседних 8-oxoG звена дуплекса в большей степени замедляют выщепление оснований, чем влияют на эффективность комплексообразования. OG-ДГ расщепляет только те ON, у которых 8-oxoG удален от их З'-конца по крайней мере на 2 звена. Показано, что только в случае ON, содержащих 8-oxoG в первом положении с 5'-конца, для расщепления олигонуклеотида необходимо наличие 5'-концевого фосфата.

в) Оценено изменение термодинамических и кинетических параметров при переходе от неспецифических к специфическим оц- и дцСЖ. Показано, что введение 8-oxoG в дуплексы приводит к возрастанию скорости реакции более чем на 6 порядков, а сродства лигандов только на 1-2 порядка. Сделано заключение о том, что специфичность действия OG-ДГ обеспечивается в основном на стадии катализа реакции, а не на стадии комплексообразования.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Невинский Г.А., Романникова И.В., Василенко Н.Л., Булычев Н.В., Колочева Т.И., Петрусева И.О., Жарков Д.О., Иванов К.А., Белоглазова Н.Г., Ищенко А.А. Разработка методов синтеза моно-, олиго- и полинуклеотидов, содержащих мутированные основания // Химия. М.: Московский университет. 1994. С. 155-165

2. Ищенко А.А., Булычев Н.В., Максакова Г.А., Наумов В.А., Невинский Г. А. Исследование ферментативных свойств 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы - шаг к пониманию механизмов стабильности генетического материала клетки. // Тезисы научно-практической конференции врачей "Актуальные проблемы развития и совершенствования военной медицины в Сибирском военном округе". Новосибирск. 1995. С. 69-70.

3. Ищенко А.А., Булычев Н.В., Жарков Д.О., Максакова Г.А., Джонсон Ф., Невинский Г. А. Выделение 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы из Escherichia coli и исследование субстратной специфичности фермента// Молек. биология. 1997. Т. 31. С. 193-198.

4. Ищенко А.А., Булычев Н.В., Максакова Г.А., Джонсон Ф., Невинский Г.А. Узнавание и превращение одно- и двухцепочечных олигонуклеотидных субстратов 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой из Escherichia coli // Биохимия. 1997. Т. 62. С. 240-248.

5. Ищенко А.А., Булычев Н.В., Максакова Г.А., Джонсон Ф., Невинский Г.А. Взаимодействие 8-оксогуанин-ДНК гликозилазы из Escherichia coli с одноцепочечными дезоксиолигонуклеотидами и их комплексами // Молек. биология. 1998. Т. 32. №3. С. 52.0 • 529

Подписано к печати 12.03.98

Формат бумаги 60x84 1/16 Объем 1,3 печ. л.

Уч.-изд. л. 1,3 Заказ №_Тираж 100 экз.

Полиграфический участок НИБХ СО РАН

630090, Новосибирск 90, проспект акад. Лаврентьева, 8.