Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Производные цитокининов

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Производные цитокининов"

На правах рукописи

КОЛЯЧКИНА Светлана Викторовна

ПРОИЗВОДНЫЕ ЦИТОКИНИНОВ: СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

г О Ш! 2013

Москва 2013

005062063

Работа выполнена в Лаборатории стереохимии ферментативных реакций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Научный руководитель: заведующий Лабораторией стереохимии ферментативных реакций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН), доктор химических наук, профессор С.Н. Михайлов

Официальные оппоненты: главный научный сотрудник Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» доктор химических наук, профессор М.Б. Готгих

ведущий научный сотрудник Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, доктор химических наук А.Р. Хомутов

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биоорганической химии им. академиков Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина Российской академии наук

Защита диссертации состоится «27» июня 2013 г. в 12-30 часов на заседании диссертационного Совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан « 2013 г.

Актуальность исследования. Аденозин и его производные играют важную роль во многих биохимических процессах. Аденозин и 2'-дезоксиаденозин входят в состав РНК и ДНК. Из тРНК выделено более 20 минорных адениновых нуклеозидов, таких как М-метиладенозин, N6-метиладенозин, 2-О-метиладенозин, 2'-0-Р-0-рибофуранозиладенозин, //'-изопентениладенозин и другие. АТР и ADP играют исключительно важную роль в энергетическом обмене во всех живых организмах. Я-Аденозилметионин принимает участие в реакциях переноса метальных групп, а кофермент А - в реакциях переноса ацильных групп. Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) -кофермент, присутствующий во всех живых клетках, входит в состав ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Важными метаболитами НАД являются поли(АОР-рибоза) и цикло(ЛОР-рибоза). 2'-5'-Олигоаденилаты являются медиаторами антивирусного действия интерферона. .

Еще одной биологически важной группой адениновых производных являются цитокинины. Классифицируют два типа цитокининов: ароматические - 6-бензиламинопурин, тополины, кинетин, и алифатические - Л^-изопентениладенин, цис- и транс-зеатины. Цитокинины обладают многообразным физиологическим действием на растения. Биосинтез цитокининов включает введение изопренильного остатка в 6-ое положение AMP, ADP и АТР с помощью аденозинфосфат-изопентенилтрансферазы, последующее дефосфорилирование осуществляется фосфатазой, и гидролиз Л-гликозидной связи - пуриннуклеозидфосфорилазой. Поэтому соответствующие А^-замещенные рибонуклеозиды также проявляют цитокининовую активность (H.Sakakibara Annu. Rev. Plant Biol. 2006, 57, 431). Также известно, что //'-замещенные аденозины обладают выраженной противоопухолевой активностью (Voilera J. et al Phytochemistry 2010, 71, 1350-1359; Ottria R. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 8396-8402). Вышесказанное свидетельствует об актуальности и важности получения цитокининовых нуклеозидов и изучения их биологической активности.

Целью работы являлся синтез и изучение биологических свойств известных и новых замещенных аденозинов. В ходе работы решались следующие задачи:

- разработка удобного региоселективного метода алкилирования //-ацетил-2',3',5'-три-0-ацетиладенозина;

- препаративный синтез //'-ацетил-2|;3,,5'-три-0-ацетгааденозина;

- синтез //'-замещенных аденинов;

- синтез пропаргилзамещенных пуриновых нуклеозидов и изучение их реакций, катализируемых одновалентной медью;

- изучение цитокининовой и цитотоксической активности полученных соединений.

Научная новизна н практическая значимость работы. Разработан препаративный метод синтеза Лл-ацетил-2',3',5'-три-0-ацетиладенозина. Показано, что это соединение региоселективно алкилируется с образованием Л^-замещенных производных. Предложенный новый подход позволяет синтезировать широкий ряд А^-производных аденозина, исходя из галоидных алкилов и спиртов. Предложен простой способ синтеза Л^-замещенных аденинов кислотным гидролизом соответствующих защищенных нуклеозидов. Показана возможность использования пропаргильных производных пуриновых нуклеозидов для их дальнейшей модификации [3+2]-циклоприсоединением с азидами и реакциями с аллилбромидами, катализируемыми одновалентной медью. В ходе работы синтезировано 34 новых соединений, структура которых подтверждена данными масс-спектрометрии, УФ- и ЯМР-спектроскопии. Исследовано цитотоксическое действие полученных нуклеозидов на раковые клетки in vitro. Наиболее активными оказались А,6-(гекс-5-ен-2-инил)аденозин и Л^-(6-метилгепт-5-ен-2-инил)аденозин, активность которых выше, чем у Л^-изопрениладенозина, и сравнима с активностью известного препарата гемцитабина.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на XXIII зимней молодежной школе-конференции Института биоорганической химии им. академиков Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина РАН (Москва, 7-10 февраля 2011), на научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Крым, Украина, 23-28 мая 2011 года), на XV международном симпозиуме по химии компонентов нуклеиновых кислот (Cesky Krumlov, Czech Republic, June 510, 2011), на VII съезде общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 4-10 июля 2011), на VII-ой международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». (Минск, Беларусь, 26-28 октября 2011) и на научной конференции молодых ученых ИМБ РАН (Москва, 30 октября 2012).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 5 тезисов докладов.

Струютпа н объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы ( наименований). Работа изложена на страницах, включает рисунков, схем и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Известно несколько методов получения //'-замещенных аденозинов. Первый и самый распространенный заключается в реакции 6-хлорпуринрибозида с аминами. К недостаткам этого способа можно отнести использование избытков аминов, которые в большинстве случаев

малодоступны, а также сложность выделения и очистки незащищенных нуклеозидов. Второй путь - алкилирование аденозина галоидными алкилами в Л'1-положение с последующей перегруппировкой Димрота в щелочной среде. Однако только метилирование протекает количественно. При использовании же высших галоидных алкилов требуется повышенная температура, что сопровождается расщеплением гликозидной связи.

Было показано, что Л'6-ацетил-2,,3|,5,-три-0-(трет-бутилдиметилсилил)аденозин алкилируется по 6-му положению в условиях межфазного катализа (Aritomo К. et al. Chem. Soc. Perkin Trans I, 1995, 1837-1844). //-Ацетильная группа увеличивает N-H кислотность и обеспечивает региоселективное алкилирование. Было целесообразно использовать в качестве исходного соединения в реакции алкилирования Лй-ацетил-2',3',5'-три-0-ацетиладе1юзи11. Применение защитных и активирующих групп одного типа существенно упрощает синтез исходных соединений, деблокирование промежуточных и выделение конечных продуктов.

Препаративный метод получения N6-ацет11л-2',3',5'-трн-0-ацеп1ладенозина (2)

Известно, что ацетилирование аденозина (1) уксусным ангидридом в пиридине при повышенной температуре приводит к образованию двух продуктов - М'-ацетил-г'.З'^'-три-О-ацетиладенозин (2) и Лл-диацетил-2')3',5'-три-0-ацст1шаденоэип (3) (схема 1). Соотношение продуктов в реакционной смеси зависит от температуры и избытка уксусного ангидрида. До настоящего времени описано только хроматографическое выделение нуклеозида 2 из смеси продуктов. Однако этот метод достаточно трудоемок. Показано, что альтернативным путем получения соединения 2 является региоселективное дезацетилирование пентаацетиладенозина 3. Протекание реакции легко контролируется хроматографически, так как продукты реакции разделяются на ТСХ. Оказалось, что в метаноле в интервале температур 20 - 68 °С дезацетилирование Л^-диацетил-г^З'^'-три-О-ацетиладенозина (3) не идет. Было найдено, что добавление имидазола катализирует селективное дезацетилирование 3 в метаноле при 20 °С с образованием продукта 2. После полной конверсии исходного соединения (7-8 часов) ТСХ были зафиксированы лишь следовые количества 2', 3',5'-три-0-ацетил аденозина. Было показано, что в присутствии имидазола метанолиз смеси нуклеозидов 2 и 3 в этих условиях также приводит к практически чистому целевому продукту 2 (схема 1). Таким образом, для препаративного синтеза 2 ацетилирование аденозина не обязательно доводить до полного превращения в пентаацетиладенозин 3, необходимо, чтобы в реакционной смеси отсутствовал 2',3',5'-три-0-ацетиладенозин. Разработанный метод дает возможность получить в граммовых количествах тетраацетиладенозин 2 с чистотой больше 97% и выходом 80-85% из аденозина без дополнительной хроматографической очистки (рисунок 1).

АсЫН

+

АсО

АсМАс

-

Схема 1. Синтез Л^-ацетил-г'.З'^'-три-О-ацетиладенозина (2): а. Ас20, Ру, 20 °С, 16 ч, затем 60 'С, 8 ч, Ь. имидазол, МеОН, 20 °С, 6 ч.

Рисунок 1. *Н ЯМР-спектр Д^-ацетил ^'.З'^'-три-О-ацетиладенозина 2 (СБСЬ, 32 °С, 400 МГц).

Алкилирование Л^-ацетил^'.З'З'-три-О-ацетиладенозина (2)

Было показано, что тетраацетиладенозин 2 является удобным исходным соединением для селективного алкилирования по Л6 -положению (схема 2 и таблица 1). Алкилирование тетраацетиладенозина (2) можно проводить при комнатной температуре либо галоидными алкилами или тозилатами в присутствии оснований (метод А или В), либо в условиях реакции

Мицунобу с использованием спиртов (метод С). В качестве оснований были использованы 1,8 -диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (ВГШ) и К2СОз. БВи является стерически затрудненным сильным основанием с рКа 11.6, которое растворяется в большинстве органических растворителей, что позволяет проводить реакцию в гомогенных условиях.

2 4а-к 5а-к

Схема 2. Синтез Л^-производных аденозина. а. метод A: RX, DBU, MeCN, 20 °С, 16 ч; Ь. метод В: RX или TsOR, К2С03, DMF, 20 °С, 16 ч; с. метод С: ROH, Ph3P, DEAD, THF, 20 °C, 20 ч; d. 7M NH3 в MeOH, 20° C, 48 ч.

Таблица 1. Синтез Л^-производных аденозина.

алкилирование дезацетилирование

метод Алкилирующий агент 4 (выход, %) 5 (выход, %)

А Вг-СН2С=СН 4a (82) 5a (41)

В Вг-СН2С=СН 4a (85)

С НО-СН2С=СН 4a (74)

А Cl-CH2OCH2Ph 4b (80) 5b (66)

А Br-CH2Ph 4c (76) 5c (78)

В Br-CH2CH=CH(Me)2 4d (98) 5d (76)

С фурфуриловый спирт 4e* 5e (63**)

С HO-CH2CH=CHCH2OH-(Z) 4f* 5f (42**)

С НО-СН2С=ССН2ОН 4g* 5g (61**).

А Mel 4h (82) 5h (51).

В TsO-CH2CH2CH2Ph 4i (60) 5i (84).

В TsO-CH2CH2Ph 4j (55) 5j(65)

В Br-CH2CH=CH2 4k (77) 5k (71)

*Вещества в чистом виде выделить не удалось. ** Приведен выход на две стадии.

Во всех приведенных в таблице 1 примерах образуется только один продукт алкилирования, что было определено хроматографическими и спектральными методами анализа. Направление алкилирования было однозначно установлено на примере реакции соединения 2 с Mel в присутствии DBU. Единственный продукт алкилирования 4h был выделен хроматографически с выходом 82%. Нуклеозид 5h был получен обработкой соединения 4h 7М раствором аммиака в метаноле (схема 2). По своим спектральным характеристикам нуклеозид 5h был идентичен полученному другим способом Л^-метиладенозину и отличался отМ-метиладенозина.

Алкилирование соединения 2 в условиях реакции Мицунобу протекает с сохранением региоселективпости в N* -положение. Единственный нуклеозидный продукт реакции 4а был выделен хроматографически с выходом 74% при взаимодействии соединения 2 с пропаргиловым спиртом в условии реакции Мицунобу. Спектр 'Н ЯМР и хроматографическая подвижность этого продукта были идентичны соответствующим характеристикам соединения, полученного алкилированием 2 пропаргилбромидом в присутствии оснований. Таким образом, региоселективность алкилирования галоидными алкилами в присутствии основания и в условиях реакции Мицунобу с использованием спиртов одинакова.

В препаративном плане реакция Мицунобу более сложна, так как требует трудоемкой хроматографической очистки целевого продукта. Например, соединение 4а удалось очистить только после трехкратной колоночной хроматографии с использованием различных элюентов. Соединения 4e-g не удалось выделить в чистом виде. Если реакция Мицунобу не является конечной стадией синтеза, то возможна очистка соединений на следующей стадии. Например, частично очищенные соединения 4e-g подвергались аммонолизу, а образовавшиеся нуклеозиды были выделены колоночной хроматографией на силикагеле. Таким путем были получены соединения 5е и 5g с хорошими общими выходами 63% и 61% соответственно, в расчете на исходный тетраацетиладенозин 2. Невысокий выход соединения 5f (42%) обусловлен тем, что после выделения соединения колоночной хроматографией на силикагеле необходима дополнительная очистка перекристаллизацией из воды.

Структура синтезированных соединений подтверждена данными масс-спектрометрии, УФ- и ЯМР-спектроскопии. Необходимо отметить, что в спектрах всех аденозиновых производных 5а-к наблюдается сильное уширение сигнала атомов водорода при углероде, связанном с N6 атомом. Такой эффект типичен для всех .'"/'-производных аденозина, что в литературе объясняется медленными взаимными превращениями таутомеров (Casati S. et al. Magn. Res. Chem., 2010, 745749, Vicha J., Magn. Res. Chem. 2010, 318-322).

Таким образом, было показано, что тетраацетиладенозин 2 является универсальным соединением для получения большого ряда ^-производных аденозина. На наш взгляд, самым

эффективным методом является его алкилирование с использованием ОЕШ в качестве основания. Основными преимуществами является то, что реакция проходит в гомогенных условиях, и не возникает сложности при выделении целевых продуктов.

Получение А^-замещенных адепинов

Для получения //'-замещенных аденинов был использован кислотный гидролиз нуклеозидов 4а, 4j, 4k (схема 3), при котором происходит расщепление гликозидной связи и удаление Д-ацетильной группы. После окончания реакции в реакционную смесь добавляют концентрированный аммиак до рН 7. При этом нуклеиновые основания выпадают в осадок. Так, гидролизом в 0,5N соляной кислоте при 100 °С были получены А^-производные аденина 6а, 6j, 6k с выходами 70-90%.

Альтернативным методом получения пуриновых оснований является двустадийный синтез, включающий аммонолиз защищенных нуклеозидов и ферментативный гидролиз гликозидной связи, катализируемый пуриннуклеозидфосфорилазой. Этот метод лимитируется субстратной специфичностью пуриннуклеозидфосфорилазы. Кроме того, равновесие ферментативной реакции сдвинуто в сторону исходных нуклеозидов, поэтому для препаративных целей требуется добавление в реакционную смесь щелочной фосфатазы (Tararov V. I. et al. Synthesis, 2011, 24832489).

Таким образом, найден простой и экономичный метод расщепления гликозидной связи в промежуточных ацетильных производных. В этом синтезе рибозный остаток выполняет функцию защитной группы. Следует отметить, что нуклеозиды дешевле соответствующих гетероциклических оснований, и при работе с нуклеозидами значительно облегчается хроматографическая очистка веществ.

л m-r R

AcN

HN

N

АСОП о 1 H N

W

4a, 6a R = -CH2C=CH 4j,6j R = -CH2CH2Ph 4k, 6k R = -CH2CH=CH2

6a,K,j

АсО ОАс 4a,k,j

Схема 3. Химический гидролиз, а. 0,5N HCl, 100 °С, 8 часов, 6а - 95%, 6j - 84%, 6k - 70%.

Реакции пропаргильных производных пуриновых нуклеозидов

Химия ацетиленовых производных интересна и разнообразна. На схеме 4 приведены

некоторые реакции терминальных ацетиленов, проходящие в мягких условиях, которые изучались

9

в настоящей работе. Ацетиленовые соединения вступают в реакцию окислительной димеризации в присутствии одновалентной меди с образованием симметричных продуктов реакции (схема 4, путь а). В этих же условиях смесь двух разных ацетиленов одновременно дает несимметричные продукты (схема 4, путь Ь). Интересной реакцией является реакция аллилирования, также катализируемая одновалентной медью, приводящая к образованию полиненасыщенных структур (схема 4, путь с). И, наконец, важная и широко используемая в настоящее время в синтетической химии реакция - [3+2]-циклоприсоединение с азидами, приводящее к триазолам (схема 4, путь (1). Представлялось интересным распространить эти подходы для синтеза новых аналогов нуклеозидов.

Схема 4. Возможные пути модификации терминальных ацетиленов, катализируемые медью.

Реакция циклоприсоединения азидов к алкинам с образованием 1,2,3-триазолов, катализируемая медью, является одним из примеров реакций, которые в органической химии выделены в группу «сПск»-реакций. Такие реакции характеризуются высокими выходами, мягкими и простыми условиями (реакции проводят при комнатной температуре в водных растворах или используют легко удаляемые растворители, например, ацетонитрил), доступностью исходных материалов и простым выделением продуктов.

Хотя 1,2,3-триазолы пока не обнаружены в природе, ряд таких соединений проявляет различную биологическую активность. Кроме того, сама реакция циклоприсоединения широко используется для маркировки многих биологических объектов: полипептидов, полисахаридов, белков и нуклеиновых кислот.

Было показано, что Лл-ацетил-Л/'-пропаргил-2',3',5'-три-(9-ацетиладснозин (4а) легко вступает в реакцию [3+2]-циклоприсоединения с азидами, катализируемую СиС1 в ацетонитриле (схема 5). Соответствующие азиды легко получаются из галоидных алкилов в Б МБ О при комнатной температуре. Продукты циклоприсоединения 7а-7(1 получены с высокими выходами. Нуклеозиды

10

8а-8с1 были получены по стандартной методике аммонолиза с выходами 46-84%, структура этих соединений подтверждена данными масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии.

АсО

НО ОН

АсО ОАс

АсО ОАс

4а

7ак1

8 а-4

7а № = Ме 7Ь № = СН2ОСН2РЬ 7с № = СН2РИ 7с1 № = СН2СН2ОВг

8а = Ме 8Ь Р' = СН2ОСН2РИ 8с № = СН2Р(1 8с) № = СН2СН2ОН

Схема 5. Синтез Л^-триазольных производных аденозина: а. алкилазид, СиС1, МеСМ, 20 "С, 20 ч, 7а - 64%, 7Ь - 93%, 7с - 78%, 1А - 92%.; Ь. 7М 1ЧН3 в МеОН, 20 °С, 48 ч, 8а - 56%, 8Ь - 74%, 8с -84%, 8(1 - 46%.

Окислительное сдваивание терминальных ацетиленов, катализируемое солями меди, детально исследовано на простых соединениях и является одним из распространенных способов синтеза симметричных 1,3-диацетиленов. Однако эта реакция практически не применялась в химии нуклеозидов. В качестве субстратов были выбраны -пропаргиладенозин 4а, Д'1-пропаргилинозин 9 и Об-пропаргилинозин 10 (схема 6).

Реакцию проводили при комнатной температуре в присутствии хлорида меди (I) в открытой колбе для доступа воздуха. В этих условиях только в случае N1 -производного инозина 9 выход димера И был близок к количественному. В случае двух других нуклеозидов 10 и 4а в этих условиях наблюдалось разложение исходных продуктов с образованием окрашенных полимерных продуктов. Для Л^-производного аденозина 4а удалось подобрать условия (добавление ОВИ), в которых продукт реакции 13 образуется с невысоким выходом 24%.

Структура 11 была установлена физико-химическими методами. В спектре исходного соединения 9 присутствует сигнал ацетиленового водорода с химическим сдвигом 5 = 2.53 м.д. и константой спин-спинового взаимодействия 4У= 2.6 Гц. Сигнал Л'1-С]_Ь-группы в виде дублета с такой же константой спин-спинового взаимодействия 4У = 2.6 Гц расположен при 8 = 4.87 м.д. В спектре димера 11 отсутствует сигнал ацетиленового водорода, а сигнал М-СГЬ-группы имеет форму синглета. Еще одним доказательством образования димера 11 служат данные ВЭЖХ-масс-спектрометрического анализа. По данным ВЭЖХ выделенный продукт 11 является

индивидуальным соединением. Найденная масса молекулярного иона М+Н+ = 863.40 соответствует рассчитанной массе = 863.25.

О О О

4а

Схема 6. Образование бис-ацетиленовых производных в условиях окислительного сдваивания: а. СиС1, МеСЫ, воздух, 20 °С; 12 ч, Ь. СиС1, МеСИ, БВИ, воздух, 20 °С, 12 ч, 11 - 95%, 12 - 27%, 13 - 24%.

Аналогично была подтверждена димерная структура аденозинового аналога 13. Также как и в предыдущем случае, при переходе от мономера 4а к димеру 13 мультиплетность СНг-группы меняется от дублета (V = 2.5 Гц) к синглету. Данные масс-спектра также подтверждают димерную структуру 13. По данным ВЭЖХ выделенный продукт 13 является индивидуальным соединением. Найденная масса молекулярного иона М+Н+ = 946.21 соответствует массе протонированного димера (рассчитанная масса 945.29).

К сожалению, аммонолиз продуктов 11 и 13 с целью удаления ацетильных групп приводит к разложению данных соединений. Очевидно, что успех реакции образования бис-ацетиленовых производных зависит от структуры гетероциклического основания.

Реакции окислительного кросс-сочетания широко используются в органическом синтезе, однако следует отметить, что такие реакции проводились только на простых ацетиленах. В нашем случае, также как и окислительное сдваивание, результат реакции окислительного кросс-сочетания зависит от структуры нуклеозида. Этого можно было ожидать, так как обе реакции идут по одному и тому же механизму. Только в случае производного инозина 9 кросс-реакция приводит к соответствующим производным с препаративными выходами (таблица 2). В случае О6- и Лл-пропаргильных производных 10 и 4а выходы продуктов были низкими, меньше 10%.

Как представлено на схеме 7, пропаргильное производное инозина 9 дает три продукта: два продукта гомосочетания (димеры) и целевой кросс-продукт (14а-<1). На примере гексина было показано, что при прочих равных условиях выход кросс-продукта возрастает при увеличении избытка алкина к исходному соединению 9. Однако это не является единственным фактором, влияющим на выход продукта кросс-сочетания. Из данных таблицы 2 видно, что структура ацетиленов играет также немаловажную роль. Например, в случае фенилацетилена по сравнению с гексином выход продукта 14Ь был выше при таком же соотношении исходных реагентов. Также, при использовании НС=ССН2ОВг и З-бензоил-М-пропаргилтимина в двукратном избытке выходы соединений 14с и 14(1 различались почти в два раза (соответственно 55 и 30%).

Интересно отметить, что кросс-продукты 14а-<1 оказались устойчивы к условиям аммонолиза в отличие от симметричных димерных продуктов 11, 12. Соответствующие незащищенные нуклеозиды 15а-(1 были получены с выходами 51-74% (схема 7).

азР4

АсО ОАс

АсО ОАс 14 а-с!

+ гснсЪ

но он

15а-с1

14а Я = -ОС(СН2)2Ме 14Ь Я = -С=СРЬ 14с К. = -С=ССН2ОВг

14(1 Я =

нас\'

N^0 №г

15а а = -СнС(СН2)2СМе 15Ь Я = -С=СРЬ 15с Я = -С=ССН2ОН

15(1 Я =

N^0 Ш

Схема 7. Кросс-реакции пропаргильного производного инозина 9: а. НС=СЯ, СиС1, МеСМ, воздух, 20 °С, 48 ч, 14а - 51%, 14Ь - 65%, 14с -55%, 14а - 30%; Ь. 7М >Ш3 в МеОН, 20 °С, 48 ч, 15а - 51%, 15Ь - 60%, 15с - 73%, 15(1 - 74%.

Таблица 2. Окислительное кросс-сочетание Л'1-пропаргилинозина 9 с ацетиленами.

Исходный алкин Соотношение алкин/9 14 (выход в %) Масс-спектры

вычислено найдено

СНз(СН2)зС=СН СНз(СН2)зС=СН СНз(СН2)зОСН 2 5 10 14а (29) 14а (41) 14а (51) с25н28к4о8+н+ 512.51 513.36

НОСРЬ 10 14Ь (65) с27н24к4о8+н+ 532.50 533.35

НС=ССН2ОВг 2 14с(55) С21)Н2^40ю+Н+ 590.54 591.41

нсгс-сн2 нИт"" О 2 Ш (30) Сз4НзоК6Он+Н+ 698.64 699.57

Известно, что алкилирование ацетиленовых производных различными галоидными алкилами проходит в присутствии сильных оснований, таких как бутиллитий или ИаН. В то же время реакции аллилирования проходят при использовании слабых оснований и присутствии меди (I) в качестве катализатора. Было изучено аллилирование защищенных нуклеозидов 4а, 9 и 10. Как видно из данных таблицы 3, реакция протекает с хорошими выходами в случае аллилбромида. При переходе к диметилаллилбромиду хороший выход наблюдается только в случае производного аденозина 4а. В случае соединения 9 реакция с диметилаллилбромидом дает с невысоким выходом неразделимую смесь двух продуктов (в соотношении 2:1), нормального и аномального:

АсО ОАс АсО ОАс

Таблица 3. Аллилирование пропаргильных производных пуриновых нуклеозидов (условия: СиС1, К2С03, ОМР, 20 "С, 48 ч,).

*В реакционной смеси образуется смесь двух изомеров (2:1):

Соотношение продуктов реакции 9 с ВгСН2СН=СМе2 было определено методом 'Н ЯМР по интегральной интенсивности сигналов метальных групп. В случае нормального продукта химические сдвиги сигналов двух метильных групп различаются, поскольку имеют цис- и трансрасположение относительно двойной связи. А в случае аномального продукта химические сдвиги обеих метильных групп совпадают и сдвинуты в сторону сильных полей, поскольку связаны с ¡р1-гибридизованным атомом углерода. Образование смеси продуктов в реакции с диметилаллилбромидом не является неожиданным, поскольку образование подобных продуктов наблюдалось для ряда простых ацетиленов. Однако сам факт того, что строение пуринового

гетероцикла влияет на направление реакции, непонятен. Интересно отметить, что в этих условиях Mel и ВпВг не вступают в реакцию, что может свидетельствовать о сложном механизме катализа ионами меди (I).

Аммонолизом в 7М растворе аммиака в метаноле соединений 16а, 16Ь, 17а были получены нуклеозиды 18, 19, 20 с выходами 41-76%. Структура полученных соединений подтверждена данными ЯМР и масс-спектрометрии.

HN м

НО он 18

НО он

Разработанные методы были использованы для синтеза Л^-изопрениладенозин (5d) и Лл-(гекс-5-ен-2-инил)аденозина (18) в граммовых количествах для биологических испытаний на лабораторных животных.

Биологическая активность А-6 -замешенных пуриновых нуклеозидов

Цитокининовая активность синтезированных в данной работе соединений изучалась в лаборатории профессора Г.А. Романова в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Биологическая активность полученных соединений была протестирована на двух растительных системах. Первая система, в которой была исследована цитокининовая активность, это тест-система проростков арабидопсиса, экспрессирующих репортерный ген GUS под контролем цитокинин-чувствительного промотора ARR5. Транскрипция такой трансгенной конструкции является чувствительной и специфичной по отношению к цитокининам. Другая модельная система основана на проростках амаранта, которые быстро отвечают на действие цитокининов накоплением красного пигмента амарантина. В обеих системах 6-бензиламинопурин (БАП) был выбран в качестве контрольного соединения. Все соединения были протестированы в концентрации 5 мкМ. Активность соединений оценивали в % от значения активности БАП. Полученные результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4. Цитокининовая активность Л6 -производных аденозина в % по отношению к

активности БАП.

Соединение СКУ-тест (в % от БАП) Амараит-тест (в % от БАП)

5а 21.6±0.1 22±2

5Ь 38±4 57±5

5с 92±24 99±12

5(1 160±20 94±2

5е 89±8 66±3

5Г 60±18 38±3

42±1 51±3

7а 9±2 25±6

7Ъ 14±3 33±1

7с 11±7 17±1

7(1 9.5±0.1 28±5

Без обработки 23±10 26±4

Рибозиды природных цитокининов 5с, 5(1 и 5е показали высокую активность, сравнимую с БАП. Умеренную активность проявило соединение 5Ь, в котором фенильный остаток связан с аденином более длинным линкером чем у БАП, а также нуклеозиды 5Г и 5й с дополнительной гидроксильной группой. Л^'-Пропаргиладенозин 5а и триазольные производные 7а-7(1 неактивны в обоих тестах.

До настоящего времени были известны два соединения, имеющих антицитокининовую активность, т.е. способность подавлять сигналинг цитокининов именно на уровне их рецепторов. Этими соединениями являются производные Л^-бензиламинопурина (БАП): Л,/'-(2-гидроксн-3-метилбензил)аденин (Р1-55) и Ак5-(2,5-дигидроксибензил)аденин (ЬОК-991). В настоящей работе выявили антицитокининовую активность для Л'6-(бензилоксиметил)аденозина 5Ь. Это соединение принципиально отличается от двух ранее описанных антицитокининов более длинным линкером, соединяющим ароматический остаток с аденином. Этот новый антицитокинин, как и ранее описанный Р1-55, подавляет активацию рецептора СИЕ1/ЛНК4, но не рецептора АНКЗ.

При проведении биотеста на проростках мутантного Vark^GUS арабидопсиса, экспрессирующих единственный рецептор CRE1/AHK4, было показано, что 5Ь достоверно ингибирует действие БАП при их совместном добавлении к проросткам. При этом эффекты 5Ь и антицитокинина PI-55 практически совпали, что служит прямым подтверждением антицитокининовых свойств 5Ь. Антицитокининовый эффект 5Ь, как и PI-55, отсутствовал на проростках, экспрессирующих АНКЗ как единственный рецептор цитокининов, что было ожидаемо, исходя из низкого сродства 5Ь к этому рецептору.

Антицитокининовый эффект 5Ь зависел от дозы этого соединения, точнее от соотношения используемых концентраций БАП и антицитокинина 5Ь. При концентрации 50 мкМ, превышающей концентрацию БАП в 500 раз, 5Ь подавлял активацию рецептора CRE1/AHK4 цитокинином на 50-60%.

Цитотоксическое действие соединений на различные клеточные линии изучалось в лаборатории д.м.н. Е.В. Степановой (ФГБУ «Российский Онкологический Научный Центр имени H.H. Блохина» РАМН). Цитотоксический эффект М'-производных аденозина оценивали при помощи МТТ-теста (см. таблицу 5). Ряд синтезированных в работе соединений был исследован в культуре мышиных эндотелиальных клеток SVEC-4-10, в клетках меланомы кожи Mel Kor, рака яичников SKOV-3, рака молочной железы MCF-7, лимфобластного лейкоза Jurkat, и рака лёгких А549. Полученные данные показали, что самый сильный цитотоксический эффект наблюдается в клетках эпителиального типа (рака яичников, рака молочной железы и рака легких). Было показано, что соединения 5с-5е вызывают апоптоз лейкозных клеток человека Jurkat в различных концентрациях. Так, соединения 5с-5е в концентрации 100 мкМ вызывают апоптоз 70 % клеток через 48 часов.

В качестве контроля использовался известный препарат гемцитабин (2',2'-дифтор-2|-дезоксицитидин) и Л^'-изопрениладенозина 5d. Последний в 70-е годы прошлого века проходил клинические испытания на пациентах с промиелоцитарной лейкемией, хроническим миелобластным лейкозом, хроническим лимфолейкозом. В ряду протестированных соединений //-(гекс-5-ен-2-инил)аденозин (18) и А^-(6-метилгепт-5-ен-2-инил)аденозин (19) обладают активностью, превышающей Л^-изопрениладенозин (5d) и сравнимой с известным препаратом гемцитабином.

В ряду 6-замещенных пуриновых нуклеозидов выявлены новые вещества-лидеры для последующей оптимизации. Наличие ненасыщенного заместителя (например, в изопрениладенозине 5d) приводит к выраженной противоопухолевой активности, которая может быть усилена введением полиненасыщенного фрагмента терпенового типа. Результаты

полученных исследований показали, что те соединения, которые проявляют цитокининовую активность, также имеют выраженную противоопухолевую активность.

Таблица 5. Цитотоксическое действие соединений на клеточные линии нормальных клеток (культура эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10) и опухолей человека (Jurkat - лейкозные Т-лимфоциты; Mel Kor - меланома кожи; SKOV-3 - рак яичников; MCF-7 - рак молочной железы; А549 — рак лёгких).

соединение 1С50 (цМ)

SVEC-4-10 Jurkat Mel Kor SKOV-3 MCF-7 А549

5а 86±3 92±28 73±12 76±12 48±12 19±7

5с 49±14 31±6 96±39 22±11 15±3 31±15

5d 45±8 39±8 53±12 28±6 14±3 14±5

5е 48±11 41 ±27 57±3 29±б 20±3 11±4

5f 46±4 128±85 69±10 78±11 45±9 66±22

5g 139±6 >500 87±15 86±1 383±88 113±31

10 н.о. н.о. 17±1 18±1 18±1 н.о.

18 н.о. н.о. 15±1 23±3 19±3 н.о.

19 н.о. н.о. 14±1 21±1 19±1 н.о.

гемцнтабин н.о. н.о. н.о. 21±7 16±4 8±4

н.о. — не определено

Выводы

1. Разработан препаративный метод синтеза Лл-ацетил-2',3',5'-трл-<9-ацетил аденозина. Показано, что это соединение региоселективно алкилируется по N6 -положению. Предложенный новый подход позволяет синтезировать широкий ряд Л^-производных аденозина, исходя из галоидных алкилов и спиртов. Предложен простой способ синтеза Л^-замещенных аденинов кислотным гидролизом соответствующих защищенных нуклеозидов.

2. Показана возможность использования пропаргильных производных пуриновых нуклеозидов для их дальнейшей модификации [3+2]- циклоприсоединением с азидами и реакциями с аллилбромидами, катализируемыми одновалентной медью.

3. С использованием разработанных методов синтезировано 34 новых соединения, структура которых подтверждена данными масс-спектрометрии, УФ- и ЯМР-спектроскопии.

4. Исследована цитокининовая активность синтезированных соединений в тест-системах проростков арабидопсиса и амаранта. Показано, что цитокининовая активность ряда JV6-производных аденозина близка к активности 6-бензиламинопурина.

5. Исследовано цитотоксическое действие полученных нуклеозидов на культуры опухолевых клеток in vitro. Наиболее перспективными оказались Л/б-(гекс-5-ен-2-инил)аденозин и //'-(6-метилгепт-5-ен-2-инил)аденозин, активность которых превышает активность N6-изопрениладенозина и сравнима с известным препаратом гемцитабином.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:

1. V.I. Tararov, S.V. Kolyachkina, C.S. Alexeev, S.N. Mikhailov. iV6-Acetyl-2',3,,5,-tri-0-acetyladenosine — a convenient, missed out substrate for regioselective JV6-alkylations. Synthesis, No 15, 2483-2489 (2011).

2. S.V. Kolyachkina, V.I. Tararov, C.S. Alexeev, D.M. Krivosheev, G.A. Romanov, E.V. Stepanova, E.S. Solomko, A.N. Inshakov, S.N. Mikhailov. M'-Substituted adenosines. Cytokinin and antitumor activities. Collection of Czechoslovak Chemical Communications, 76, No 11, 1361-1378 (2011).

3. Д.М.Кривошеев, С.В.Колячкина, С.Н.Михайлов, В.И.Тараров, Б.Ф.Ванюшин, Г.А.Романов. N6-(Бензилоксиметил)аденозин — новый антицитокинин, антагонист для рецептора CRE1/AHK4 арабидопсиса. Доклады Академии наук, том 444, № 6, с.687-690, (2012).

4. S.V. Kolyachkina, V.I. Tararov, C.S. Alexeev, S.N. Mikhailov. Synthesis of M-substituted adenosines. Collection Symposium sériés, 12, 405-407 (2011).

5. C.B. Колячкина, K.C. Алексеев, Д.М. Кривошеее. Получение М'-замещенных аденозинов и их цитокининовая активность. XXIII Международная зимняя молодежная научная школа-конференция Института биоорганической химии им. академиков Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина РАН «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» в ИБХ РАН (7-10 февраля 2011 года, Москва). Материалы конференции, с. 125.

6. Д.М. Кривошеев, C.B. Колячкина, К.С. Алексеев, С.Н. Ломин, И.А. Гетман, В.И. Тараров, С.Н. Михайлов, Г.А. Романов. Поиск новых соединений с цитокининовой активностью на основе синтетических Л6 -производных аденозина. Научно-практическая конференция «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения». (23-28 мая 2011 года, Новый свет, Крым, Украина). Conference book pp.99-100.

7. Д.М. Кривошеев, C.B. Колячкина, К.С. Алексеев, С.Н. Ломин, И.А. Гетман, В.И. Тараров, С.Н. Михайлов, Г.А. Романов. Анализ цитокининовой активности синтетических //'-производных аденозина. VII съезд общества физиологов растений России. «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий». (4-10 июля 2011, Нижний Новгород, Россия). Материалы конференции, с. 383.

8. Д.М. Кривошеев, C.B. Колячкина, К.С. Алексеев, И.А. Гетман, С.Н. Ломин, В.И. Тараров, С.Н. Михайлов, Г.А. Романов. Новые синтетические .//'-производные аденозина с цитокининовой активностью. VII-ая Международная научная конференция «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (26-28 октября 2011 г. Минск, Беларусь). Материалы конференции, с. 114.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ и программы РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Список пспользовапных сокращений.

AMP - аденозин 5'-монофосфат

ADP - аденозин 5'-дифосфат

АТР — аденозин 5-трифосфат

DBU - 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундец-7-ен

DEAD — диэтиловый эфир азодикарбоновой кислоты

DMF - М,М-диметилформамид

DMSO - диметилсульфоксид

IC50 - концентрация ингибитора, вызывающая гибель 50% клеток БАП - 6-бензиламинопурин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

THF - тетрагидрофуран

ТСХ - тонкослойная хроматография

МТТ-тест используется для оценки цитотоксичности потенциально противоопухолевых соединений в эксперименте и основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола (МТТ-реагента) до голубого кристаллического фармазана

Заказ № 54-р/05/2013 Подписано в печать 22.05.2013 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1

^^ ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

www.cfr.ru; е-таИ:2ак@с/г.ги

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Колячкина, Светлана Викторовна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА РАН

На правах рукописи

04201357961

Колячкина Светлана Викторовна

ПРОИЗВОДНЫЕ ЦИТОКИНИНОВ: СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

03.01.03 - Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: доктор химических наук, проф. МИХАЙЛОВ С.Н.

Москва 2013

Содержание

Стр

Список использованных сокращений 2

Введение 3

Глава 1. Цитокинины и их свойства (Литературный обзор) 5

1.1. История открытия цитокининов 6

1.2. Структура природных цитокининов 6

1.3. Распространенность цитокининов 7

1.5. Биосинтез цитокининов 8

1.6. Метаболизм цитокининов 9

1.7. Сигнальная трансдукция 11

1.8. Взаимосвязь между структурой и их биологической активностью 14

1.8.1. Эффект заместитетлей в ТУ6 -положение аденина 14

1.8.2. Влияние заместителей в различном положении пуринового кольца 30

2. Противоопухолевая активность 33

3. Цитокинины как косметические средства 36

4. Методы синтеза производных аденозина 36 Глава 2. Обсуждение результатов 41

2.1. Препаративный метод получения А^-ацетил-2',3',5'-три-0-ацетиладенозина 41

2.2. Алкилирование Л^-ацетил-^'З'^'-три-О-ацетиладенозина 43

2.3. Получение Л^-замещенных аденинов 51

2.4. Алкилирование инозина 52

2.5. Реакции пропаргильных производных пуриновы нуклеозидов 55

2.6. Биологическая активность пуриновых оснований и их нуклеозидов 66 Глава 3. Экспериментальная часть 73 Список литературы 109

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

В работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного Союза чистой и прикладной химии (IUPAC) и Международного Союза биохимиков (IUB), а также следующие обозначения: AMP - аденозин 5'-монофосфат ADP - аденозин 5'-дифосфат АТР - аденозин 5'-трифосфат DBU - 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундец-7-ен DEAD - диэтиловый эфир азодикарбоновой кислоты DMF - Ы,Ы-диметилформамид DMSO - диметилсульфоксид

IC50 - концентрация ингибитора, вызывающая гибель 50% клеток HeLa - - клетки раковой опухоли шейки матки человека БАП - 6-бензиламинопурин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

THF - тетрагидрофуран

ТСХ - тонкослойная хроматография

МТТ-тест используется для оценки цитотоксичности потенциально противоопухолевых соединений в эксперименте и основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола (МТТ-реагента) до голубого кристаллического фармазана

Нумерация схем, таблиц и рисунков в экспериментальной части соответствует нумерации в обсуждении результатов. В литературном обзоре используется отдельная нумерация.

ВВЕДЕНИЕ

Аденозин и его производные играют важную роль во многих биохимических процессах. Аденозин и 2'-дезоксиаденозин входят в состав РНК и ДНК. Из тРНК выделено более 20 минорных адениновых нуклеозидов, таких как М -метиладенозин, N6-метиладенозин, 2'-Ометиладенозин, 2'-0-(3-В-рибофуранозиладенозин, N6-изопентениладенозин и другие. АТР и ADP играют исключительно важную роль в энергетическом обмене во всех живых организмах. ¿"-Аденозилметионин принимает участие в реакциях переноса метальных групп, а кофермент А - в реакциях переноса ацильных групп. Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) - кофермент, присутствующий во всех живых клетках, входит в состав ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Важными метаболитами НАД являются поли(АОР-рибоза) и цикло(АОР-рибоза). 2'-5'-Олигоаденилаты являются медиаторами антивирусного действия интерферона.

Еще одной биологически важной группой адениновых производных являются цитокинины. Классифицируют два типа цитокининов: ароматические - 6-бензиламинопурин, тополины, кинетин, и алифатические - N6 -изопентениладенин, цис- и транс-зеатины [1]. Цитокинины обладают многообразным физиологическим действием на растения [2]. Биосинтез цитокининов включает введение изопренильного остатка в 6-ое положение AMP, ADP и АТР с помощью аденозинфосфат-изопентенилтрансферазы, последующее дефосфорилирование осуществляется фосфатазой, и гидролиз N-гликозидной связи - пуриннуклеозидфосфорилазой[3]. Поэтому соответствующие N6-замещенные рибонуклеозиды также проявляют цитокининовую активность[1,4,5].

Первые работы по синтезу и цитотоксичной активности N6 -замещенных аденозинов появились 50 лет назад [6]. В 70-е годы проводились клинические испытания N6-изопентениладенозина и А^-бензиладенозина на пациентах с различными формами рака. Положительные результаты были получены при лечении некоторых форм лейкемии, лимфолейкоза, саркомы и карциномы [7]. Вышесказанное свидетельствует об актуальности и важности получения цитокининовых нуклеозидов и изучения их биологической активности.

В последние годы возобновился интерес к этой группе соединений [8, 9]. Было обнаружено, что N6 -изопентениладенозин обладает выраженной цитотоксичностью к клеткам рака мочевого пузыря [10]. Были предприняты попытки оптимизации структуры соединения, однако модификация в углеводной части и гетероциклическом N6 -алкильном заместителе не привела к созданию более активных соединений.

Известно несколько методов получения А/6 -замещенных аденозинов. Первый и самый распространенный заключается в реакции 6-хлорпуринрибозида с аминами [9]. К недостаткам этого способа можно отнести использование избытков аминов, которые в большинстве случаев малодоступны, а также сложность выделения и очистки незащищенных нуклеозидов. Второй путь - алкилирование аденозина галоидными алкилами в N1 -положение с последующей перегруппировкой Димрота в щелочной среде [11]. Однако только метилирование протекает количественно. При использовании же высших галоидных алкилов требуется повышенная температура, что сопровождается расщеплением гликозидной связи.

Было показано, что ТУ6 -ацетил-2',3',5'-три-0-(трет-бутилдиметисилил)аденозин акликилируется по 6-му положению в условиях межфазного катализа [12]. А/6 -Ацетильная группа увеличивает 1Ч-Н кислотность и обеспечивает региоселективное алкилирование. Было целесообразно использовать в качестве исходного соединения в реакции алкилирования -ацетил-2',3',5'-три-(9-ацетиладенозин. Применение защитных и активирующих групп одного типа существенно упрощает синтез исходных соединений, деблокирование промежуточных и выделение конечных продуктов.

Целью работы являлся синтез и изучение биологических свойств известных и новых А^-замещенных аденозинов. В ходе работы решались следующие задачи:

- разработка удобного региоселективного метода алкилирования

А/6

ацетиладенозина;

- препаративный синтез А^-ацетил-2',3',5'-три-0-ацетиладенозина;

- синтез А^-замещенных аденинов;

- синтез пропаргилзамещенных пуриновых нуклеозидов и изучение их реакций, катализируемых одновалентной медью;

- изучение цитокининовой и цитотоксической активности полученных соединений.

Глава 1. Цитокинины и их свойства (Литературный обзор)

1.1 Истории открытия цитокининов

Цитокинины - группа фитогормонов растений, которые оказывают многообразное действие на рост и развитие растений. В настоящее время имеется большое количество химических соединений, проявляющих цитокининовую активность, различных по структуре и происхождению. Особое положение занимает группа соединений, выделенных из природных источников - природные цитокинины. Они представляют собой производные аденина, модифицированные по экзоциклическому атому азота соположение) [6].

Цитокинины были открыты в 1955 году, когда Ф. Скуг и К. Миллер выделили вещество, названное позже кинетином (от греч. "кинезис" - "деление"), из автоклавированного образца ДНК молоки сельди [13]. и показали, что это вещество вызывает активное деление клеток в каллусе табака. Вскоре из эндосперма кукурузы было выделено другое природное вещество - зеатин (Zea - кукуруза), которое стимулирует деление клеток растений [14]. Так было положено начало новой группы растительных гормонов - цитокининов [15].

1.2. Структура природных цитокининов.

Природные цитокинины представляют собой относительно простые производные аденина или аденозина, модифицированные по атому азота в 6-положении пурина СN6-положение) (Рис 1, 2). В зависимости от строения боковой цепи, цитокинины классифицируются на алифатические (iP, cZ, tZ) [1] и ароматические (шТ, оТ, ВА, МеоТ, MemT, KIN). Ароматические цитокинины в природных источниках встречаются гораздо реже.

В семейство алифатических цитокининов входит N6 -изопентениладенин и зеатины. Зеатины отличаются от изопентениладенина наличием одной гидроксилированной метильной группы, в результате чего наблюдается цис- или транс-изомерия у двойной связи, как показано на рисунке 1. Активность транс-формы (tZ) выше активности цис-формы (cZ). Цитокинины в растениях находятся в виде свободных оснований, рибонуклеозидов или рибонуклеотидов. Однако наиболее активной формой являются свободные основания [16]. Предполагается, что рибонуклеозиды и рибонуклеотиды являются депо-формами цитокининов.

iP cZ tz

Рисунок 1. Алифатические цитокинины: iP - изопентениладенин, cZ- цис-зеатин, tZ - транс-зеатин

шТ оТ ВА MeoT MemT KIN

Рисунок 2. Ароматические цитокинины: шТ - мета-тополин; оТ - орто-тополин; ВА - N6-бензиладенин; МеоТ - орто-метокситополин; MemT - мета-метокситополин; KIN -кинетин

1.3. Распространенность цитокининов.

Цитокинины распространены в биосфере повсеместно. Они найдены практически во всех живых организмах, в том числе и в организме человека, а также в воде и почве. У животных обнаруживается небольшое количество цитокининов, хотя эти соединения вряд ли имеют гормональные функции. Дело в том, что некоторые тРНК содержат по соседству с антикодоном модифицированные нуклеиновые основания, такие как, N6-изопентениладенин, цис-зеатин и его метилтиопроизводное. При распаде тРНК цитокинины высвобождаются и в принципе могли бы влиять на метаболизм клеток. Однако у растений тРНК не является основным источником цитокининов [17]. У цитокинин-продуцирующих бактерий также обнаружены ферменты прямого, не через тРНК, биосинтеза цитокининов. Содержание цитокининов в соках растений обычно невелико, на уровне наномолей и десятка наномолей [4].

1.4. Физиологическое действие цитокининов.

Цитокинины обладают многообразным физиологическим действием на растения, причем характер действия этих гормонов сильно зависит от их концентрации. Одним из

важнейших эффектов цитокининов, благодаря которому эти фитогормоны и были обнаружены, является стимуляция деления клеток. Помимо деления, цитокинины способствуют также растяжению клеток, особенно в семядолях и листьях. В культуре растительных каллусов или тканей цитокинины вызывают формирование побегов. Цитокинины способствуют фотосинтезу, активируя формирование хлоропластов, часто даже в темноте. У многих растений задерживается старение листьев. Также у целого ряда растений цитокинины стимулируют прорастание семян и образование пигментов. В высоких концентрациях цитокинины, наоборот, ингибируют рост и даже вызывают апоптоз клеток. Следует также отметить, что эти фитогормоны участвуют в формировании побегов в культурах каллусов [4].

1.5. Биосинтез цитокининов.

Биосинтез цитокининов происходит в высших растениях, мхах, водорослях, ряде бактерий и грибов и даже некоторых насекомых-паразитах растений. Общепринятая схема биосинтеза N6 -изопентениладенина представлена на рисунке 3. Начальной стадией биосинтеза является реакция диметилаллилдифосфата с аденозинфосфатами (moho-, ди-, три-), катализируемая изопентенилтрансферазой, с образованием А^-изопентениладенозин 5'-фосфатов (moho-, ди-, три-). Последние под действием фосфатазы дают изопентениладенозин. Расщепление гликозидной связи с образованием N6-изопентениладенина катализируется пуриннуклеозидфосфорилазой. Цитокининовую активность проявляют как А^-производные аденина так и соответствующие им нуклеозиды, однако свободное основание более активно [3, 18]. Можно предположить, что и в других случаях активность оснований выше активности соответствующих нуклеозидов.

Механизм биосинтеза других соединений до конца неясен. Интересной в этом плане является история кинетина. Изначально он считался продуктом термического разложения ДНК в результате автоклавирования. Не так давно было показано, что он входит непосредственно в состав ДНК и был предложен механизм его образования из ДНК [19, 20].

Рисунок 3. Биосинтез цитокининов на примере N6 -изопентениладенина. 1 изопентенилтрансфераза; 2 - фосфатаза; 3 - аденозинкиназа; 4 пуриннуклеозидфосфорилаза, п=1, 2, 3, DMAPP - диметиаллилдифосфат.

1.6. Метаболизм цитокининов.

Метаболизм цитокининов можно наблюдать в растениях при помощи метода радиационного маркирования. Когда такие маркированные цитокинины попадают в ткани растений, они обычно распределяются между нуклеотидами, нуклеозидами и свободными основаниями и далее метаболизируются [21]. Метаболизм описан на примере превращенияа А^-изопентениладенина в соответвующие нуклеозиды, нуклеотиды и в зеатины.

Дефосфорилирование цитокининовых нуклеотидов до нуклеозидов катализируется фосфатазой. Например, фосфатаза переводит AMP в аденозин, а цитокининовый нуклеотид в соответсвующий нуклеозид [22]. Стадия дерибозилирования цитокининовых нуклеозидов в свободные основания катализируется пуриннуклеозидфосфорилазой. Из-за того, что свободные основания являются физиологически более активными, это превращение является самым важным для регуляции цитокининового действия [23]. Обратный переход из свободного основания в нуклеозиды также катализируется этим же ферментом [24].

Формирование цитокинового нуклеотида из соответствующего нуклеозида катализируется аденозинкиназой [25]. TV-Гликозилирование цитокининов проходит в 7 и 9 положения пуринового кольца, что приводит к неактивным соединениям. Формирование 7 и 9-замещенных гликозидов катализируется гликозилтрансферазой [26]. Хотя этот фермент распознает большое количество адениновых производных как субстраты, самая высокая скорость конверсии наблюдалась у N6 -производных, имеющих боковую цепь, состоящую, по меньшей мере, из 3 атомов [26, 27].

Переход Л^-изопентениладенина в транс-зеатин катализируется гидроксилазой. Гидроксилаза способна переводить как А*6 -изопентениладенин в транс-зеатин, так и Л6-изопентенилрибозид в соответсвующий транс-зеатинрибозид. Превращение ^ис-формы зеатина в транс-форму катализирутся зеатиновой изомеразой. Хотя физиологичечкое значение изомеризации в цитокининовом метаболизме не ясно до конца, возможно, она обеспечивает связь между тРНК метаболизмом и синтезом транс-зеатина. Необратимый переход транс-зеатина в дигидрозеатин катализирует зеатиновая редуктаза. Из-за того, что дигидрозеатин и его производные не являются субстратами для цитокининовой оксидазы, редуктивный переход стабилизирует физиологическое действие цитокининов. Данный фермент имеет высокую специфичность к транс-зеатииу [24].

Разрушение цитокининов играет важную роль при контроле накопления цитокиновых метаболитов и их распределения в растениях. Эта реакция катализируется цитокининовой оксидазой/дегидрогиназой, которая необратимо дезактивирует цитокинины с отщеплением боковой цепи. Цитокининовая оксидаза/дегидрогиназа разрушает свободные формы оснований и нуклеозидов изопреноидных цитокининов (рисунок 4). Нуклеотиды не восприимчивы к действию этого фермента. В случае У-изопентениладенина продуктами разложения являются аденин и З-метил-2-бутеналь [28].

Рисунок 4. Окисление Л^-изопентениладенина под действием оксидазы.

Двойная связь в изопеноидной цепи устойчива к действию цитокининовой оксидазы/дегидрогиназы. Для разрыва связи между пуриновым основанием и боковой цепью не требуется присутствие кислорода или продуктов разложения перкоксида водорода. О-Гликозилированные цитокинины устойчивы к отщеплению боковой цепи цитокининовыми оксидазами.

Таким образом, в настоящее время установлено, что у растений существует сложная система ферментов, участвующих в многостадийном биосинтезе цитокининов. Функционирование ферментов биосинтеза и деградации цитокининов поддерживает в тканях растений концентрации этих гормонов, необходимые для выполнения ими физиологических функций.

1.7. Сигнальная трансдукция.

Т. Какимото и его коллеги впервые провели исследования по действию цитокининов на культуру тканей арабидопсиса и открыли важную роль гистидинкиназ в цитокининовой сигнальной трансдукции. Они показали, что гистидинкиназы являются преобладающими сенсорами в прокариотах, и они инициируют сигнальную систему путем переноса фосфорной группы между гистидинами и аспартатами (фосфотранслирующая сигн�