Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфонаты нуклеозидов как потенциальные противовирусные агенты: синтез и подходы к молекулярному механизму действия

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Фосфонаты нуклеозидов как потенциальные противовирусные агенты: синтез и подходы к молекулярному механизму действия"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. ВАЭНГЕЛЬГАРДГА

РГБ ОД---

2 5 СЕН 1995 -

На правах рукописи

Арзуманов Андрей Александрович

ФОСФОНАТЫ НУКЛЕОЗИДОВ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРОТИВОВИРУСНЫЕ АГЕНТЫ: СИНТЕЗ И ПОДХОДЫ К МОЛЕКУЛЯРНОМУ МЕХАНИЗМУ ДЕЙСТВИЯ

03. 00. 03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1995

>*

Рабата выполнена в Лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАК.

Научный руководитель:

Кандидат химических наук Н.Б. Дяткина

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор ВД. Смирнов Доктор химических наук С.Н. Михайлов Ведущая организация - Институт биохимии им. А.Н.Баха, РАН

Защита состоится -МгтЫл 995 года в часов на заседании диссертационного совета Д 002.79.01 Института молекулярной биологии им. В А-Эигсльгардга РАН по адресу:-117984, Москва, В-334, ул. Вавилова, 32. -

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В-А-Энгельгардга РАН.

Автореферат разослан '

995 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

А.М. КРИЦЫН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биосинтез ДНК является одним из ключевых процессов в клетке. Ферменты, принимающие участие в этом процессе, такие, как ДНК-полимеразы, привлекают внимание широкого круга исследователей. В последние годы большое значение приобрело сравнительное изучение ДНК-полимераз различного происхождения, в первую очередь ферментов человека и вирусов человека. Особая актуальность этой задачи связана с распространением СПИД и поиском соединений - ингибиторов биосинтеза провирусной ' ДНК, катализируемого обратной транскриптазой вируса иммунодефицита человека (НГУ): В настоящее время все разрешенные для лечения больных СПИД препараты являются нуклеозидами. Действие этих веществ основано на их внутриклеточном превращении в 5'-три фосфаты - терминаторные субстраты обратной транскриптазы НГУ. Фосфорилирование модифицированных нуклео-зипов клеточными ферментами происходит значительно менее эффективно, чем природных 2-дезоксинуклеозидов. Чтобы достичь в клетках эффективной концентрации 5'-трифосфагов модифицированных нуклеознпов, приходится создавать высокие концентрации последних. Это влияет на весь баланс нуклеозидов в клетке и приводит к нарушению нормальных метаболических процессов. Наиболее часто лимитирующей стадией в процессе превращения нуклеозида в соответствующий 5'-трифосфат является введение первого фосфатного остатка. С этой точки зрения перспективным может оказаться введение в' клетку" фосфорсодержащих" модифицированных " нуклеотидов, которые могут быть или предшественниками нуклеозидов в клетке, или подвергаться дальнейшим превращениям, имитируя природные нуклеотиды. В настоящей работе рассмотрены некоторые новые группы нуклеотидных аналогов, обладающих антиретровирусной активностью.

Целью исследования явился 1) синтез нуклеотидных производных с целью поиска,- эффективных блокаторов репродукции НГ/ в клеточных культурах и изучение их устойчивости в сыворотке крови человека; 2) синтез фосфонахдифосфатных производных нуклеозидов и изучение их субстратных свойств по отношению к ДНК-лолимеразам различного происхождения.

Научная новизна работы. Осуществлен синтез новых групп соединений -5'-фосфонатов и 5'-фторфосфатов нуклеозидов, модифицированных по углеводному остатку, часть которых оказалась высокоэффективными ингибиторами репродукции НГ/ в клеточных культурах.

Получены а-Р- и у-?- алкилированные и арилированные производные нулеознд-У-трифосфатов. Предложен способ получения а-Р-метилированных * аналогов ТТР без выделения промежуточных продуктов. Продемонстрирована низкая специфичность обратных транскрдопаз к модификациям а- или у-фосфатных остатков.

Практическая ценность работы. Найдены четыре модифицированных нуклеотида, эффективно ингибирующих репродукцию HIV в культурах клеток. Разработаны препаративные методы получения потенциальных противовирусных фосфонатов.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на 9-ом Симпозиуме по химии компонентов нуклеиновых кислот (Чехия, 1993 г.), на 9-ом, 10-ом и 11-ом Международных круглых столах "Нуклеозиды, нуклеегтиды и их биологическое применение" (Уппсала, 1990 г.; Парк-Сиги, 1992 г.; Лувен, 1994 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на ¿й/стр., содержит<>6/ схем,«^таблиц, Я/ рисунков. Она состоит из введения, литературного обзора "Депо-формы активных противовирусных нуклеозидов", обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литерэтуры (/^ссылок на литературные источники).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Несколько лет назад были синтезированы и изучены в качестве ингибиторов репродукции HIV нуклеозид-5'-Н-фосфонаты и нуклеозид-5'-алкилфосфонаты. Некоторые соединения показали умеренную и даже высокую активность при исследованиях на клетках, инфицированных HIV. Наиболее активное соединение - Н-фосфонат З'-азвдо-З'-дезокситкмвдина - прошел все стадии доклинических исследований и передан в настоящее время на клинические исследования. Молекулярный механизм действия этих соединений изучен не был. Можно было предположить следующие возможные пути превращения аналогов нуклеозид-5-монофосфата (dNMP) в клетке (рис. 1). Во-первых, такие аналоги, в ряде случаев являются непосредственными предшественниками dNMP, которые превращаются в соответствующие трифосфагы (путь А). Во-вторых, аналог dNMP может подвергаться дефосфорилированию при катализе дефосфорилирующими ферментами.. Образующиеся нуклеозиды далее фосфорилируются и трифосфорилируются при катализе клеточными куклеозидкиназами и нуклеотндкиназамк, также превращаясь в терминаторные субстраты обратной транскрюттазы HIV (путь В). Наконец, можно предположить, что фосфошты нуклеозидов имитируют dNMP, превращаясь в а-фосфонил-р.т-дифосфагные производите, выступающие в качестве субстратов ДН К-полимераз (путь С).

С "целью поиска эффективных анти-HIV агентов и изучения возможных путей метаболизма в клетке нуклеозид-5'-фосфонатов нами были получены аналоги dNMP, содержащие различные заместители при атоме фосфора, изучена стабильность некоторых из них в сыворотке крови человека, а также

рис. 1

синтезированы и изучены в качестве субстратов ДНК- полимераз нуклеозид-5'-фосфонатдифосфатные производные.

1. Синтез 5'-фосфонатов З'-галовд-З'-дезоксшимидина и З'-хлор-2',3'-дидсзоксиаденозина

К началу нашей работы было показано, что некоторые ..фосфонаты .3'-. азидо-З'-дезохситимидина- (AZT) обладают высокой противовирусной активностью, при том, что их токсичность ниже, чем у родительских нукпеозидов. Нам представлялось интересным синтезировать и сравнить противовирусные свойства других фосфонатов нуклеозидов с целью изучения взаимоотношения "структура-активность".

1.1. Синтез З'-хлор-Т-дезокеихимвдина и 3'-хлор-2',3-двдезоксиаденозина

В качестве исходных соединений взяты нуклеозиды с родственной модификацией в З'-положении, но сильно отличающиеся по противовирусной истивнссти: З'-фтор-, З'-хлор-З'-дезоксигимидин, а также 3'-хлор-2',3'-шдезоксиаденозин. ' ■

З'-Фгор-З'-дезокситимидин (FLT) является сильным ингибитором >епродукики HIV вследствие того, что его 5-трифосфат проявляет субстратные :войства по отношению к обратной транскрипгазе HIV. Однако З'-хлор-З'-кзокситдапщин (3) не проявил противовирусных свойств, хотя было показано, по его 5-трифосфат терминирует синтез ДНК, катализируемый ДНК юлимеразой I Ecoli, концевой дезоксинуклеотвдилтрансферазой (TdT) тимуса ■еленка к обратной транскриптазой вируса миелобластоза птиц (AMV)."'

Первый этап нашей работы заключался в получении исходных нуклеозидов - У-хлор-З'-дезокситимидина 3 и 3-хлор-2\3'-днцезоксиэденозина 5а. Хлортимлщин 3 получен раскрытием цикла 2,3'-ангидрстимидина 1 действием ЫН«С1 (схема 1). Обработка нуклеозида 2 0.2 М ЫаОЕ! в течение 0,5 часа с целью удаления 5'-0-толуильной зашитой группы привела к смеси нуклеозида 3 (67%) и 2',3,-дидезокси-2',3'-дидегидротимидина (<14Т) (20%). Замена 5'-0-толуильной группы ангидронуклепзида . 1 на 5-0-трифенилметильную позволила избежать образование побочного продукта. Удаление трифенилметильной защитной группы4 „ проводили 2% трифторуксусной кислотой в дихлорэтане в течение I часа.

схема 1

УГ *

° 5а с/ 5b

i: NH4Q, ДМФА, 100°С, 2-4 ч; ii: 0,2 М EtONa; iii: Bzl-Ade, N.O-бис-триметкдошшацегамид, TMSTf, ДХЭ

Синтез хлораценозина 5а осуществляли методом трансгликозилирования, исходя из нуклеозида 2. В результате реакции образуется смесь аир аномеров, после деацилирования и колоночной хроматографии были получены ß 5а (25,5%) и а 5Ь (16%) аномеры 3'-хлор-2ч,ЗЧощезохсиаденозина.

Введение атома хлора в молекулу нуклеозида подтверждается наличием в масс-спектрах характерных для хлорсодержащих соединений пиков с интенсивностью 3:1 : m/z 260, 262 (М+-Н) для 3 и m/z 270, 272 (М++1) для 5а.

• • г

Отнесение аномеров нуклеозидов 5а и 5Ь проводили на основании нализа спектров ПМР. Сравнение констант спин-спинового взаимодействия [ротонов Н-Г и Н-2'а,Ь соединений 5а и 5Ь позволяет приписать р-:онфигурацию 5а, сигнал Н-Г которого имеет форму псевдотрнплета ^1,,2'а=-Ь\2Ъ=б,3 Гц), в то время как сигнал Н-Г нуклеозида 5Ь имеет форму ублета дублетов (^-д'а^.З Гц, ■1г,2,Ъ!=3,5 Гц).

.2. Синтез 5'-фосфонатов нуклеозидов .

Следующий этап нашей работа состоял в получении 5'-фосфонатов »уклсозидов 3, 5а и ИХ- Синтез фосфонатов нуклеозидов ранее )сущестшмлся, как правило, действием хлорангидридов фосфоновых кислот ши активированных К.Ы'-дициклогексилкарбодиимидом (Е>СС) фосфоновых си слот на нуклеозид. Отсутствие вторичной гидроксильной группы в 3'-юложении в молекулах нуклеозидов 3, 5а и ИЛ" позволило нам использовать шя активации 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорид (ТР5С1).

Для реакции были использованы различные фосфоновые кислоты и фосфористая кислота. Ряд фосфоновых кислот подобран таким образом, чтобы зни содержали разнообразные заместители: алкильные, галогеналкильные зазличного размера, а также несущие функциональные группы. Исходные сислоты были любезно предоставлены докт. хим. наук Б.И. Мартыновым.

Таблица 1. Условия реакции конденсации

Соединение Конд. агент Время реакции (мин) Выход реакции, % ТСХ*, 1?г

7Ь БСС 16ч ' 62 0.65

7с ТРБС! 50 72 0,68

1й ТРБСЛ 40 70 0,72

7е ТРБО 40 79 0,76

8Ь ТРБС1 30 76 0.60

8с трбсл 30 76 0.61

8а трэа 30 78 0.60

8е БСС 72ч 56 0.59

8Г трва 30 72 0.60

8к трва 20 70 0.63

8Ь ТРБС! 40 63 0.64

81 ТРЭС! 20 69 0.64

9а БСС 16ч 58 0,47

9Ь ТРБС1 2ч 54 0,53

1 ТСХ проводили в системе изопропанол : 25% КН}бН : вода (7:1:3, о'бьемн.)

схема

НО—P-

I

ан2с

у,

X но—p —

X В

3 а Thy

5а а Ade

FLT F Thy

X

7a а 8a F

X

X B R

7ь a Thy н

с а тьу сн3 тьу

d а тьу ch2j | у у

8 b F Thy CH2F HOCH2 Х-/ с F Thy CH2J /

d F Thy CHFj л

e F Thy CHFC1 7f C1

f F Thy CH=CH2 ^ 8j F

g F Thy COOEt

h F Thy CN

9 a a Ade H

b CI Ade CH3

i: 1) СЮН2Р(0)С12, (ЕЮ)3РО, 0°C, 2) пиридин/вода; ii: 1) для 7b, 8c и 9a H3PO3 или РС1СНР(0)(0Н)2хВиз1Ч, DCC, ДМФА/пиридин; для остальных три-н-бутиламмо-ниевая соль соответствующей фосфоновой кислоты, TPSC1, ДМФА/пиридин; 2) вода; ш: 1) Ac0CH2P(0)(0H)2xBu3N, TPSC1, ДМФА/пиридин, 2) вода; ir. 1) 0,3 М NaOH, 2) DowexSO W(H+)

Синтез фосфонатов проводили по схеме 2 конденсацией нуклеозида с соответствующей фосфоновой кислотой в присутствии TPSC1 или, как-в случае фторхлорметилфосфоната 8е, DCC. Синтез Н-фосфонагов ~7Ь и 9а осуществляли конденсацией 3 и 5а с фосфористой кислотой в присутствии DCC в течение ночи. Хпорметилфосфонаты 7а и 8а получали реакцией нуклеозида с дихлорангидридоы хлормегал фосфоновой кислоты в триэтилфосфате при пониженной температуре (схема 2 i). Гнцроксимсхильные производные 7f и 8j получали конденсацией нуклеозццов- с ацетоксимеггилфосфоновой кислотой с последующим щелочным гидролизом фосфонатов 7е и 8i. Время и выход реакции различались в зависимости от

используемой фосфоновой кислоты (табл. 1). Полученные фосфонаты нуклеозидов выделяли ионообменной хроматографией _ и дополнительно очишали от солей с помощью обращеннофазовой хроматографии на силикокированном силикагеле LiChroprep С-18. Полученные фосфонаты имели характерные для тимидиновых и аденозшовых нуклеотидов УФ-спектры, были гомогенны по ТСХ-анализу, данные FAB масс-спектров подтверждают предполагаемые молекулярные формулы.

"Доказательством структуры полученных фосфонатов нуклеозидов мохет служить появление в спектрах lH-ЯМР сигналов протонов фосфонатной группы с .характерным протон-фосфорным расщеплением (2Jhc-P от 5 Д° 20 Гц, Jh-p ~ 650 Гц); небольшое - 0,4-0,6 мд. смещение сигналов протонов Н-5'а,Ь в слабое поле вследствие присоединения фосфонатной труппы, я также дополнительное расщепление сигналов Н-5' на фосфоре, (табл. 2). Спектры регистрировали в D20 относительно трет.-бутанола в качестве внутреннего стандарта. Спейр углеводного фрагмента молекул 7a-f и 9а,Ь соответствует спектру соответствующего нуклеозида- В 31Р-ЯМР спектре соединения 8h, фосфонатная ipynna которого не содержит протонов, наблюдался один синглет с химическим сдвигом 9,8 мл. (спектр снят с развязкой от протонов).

Синтезированные соединения были изучены в качестве ингибиторов репродукции HIV в клеточной культуре МТ-4. Тестирование соединений было проведено компанией American Cyanamid. Большинство соединений не показало активности в подавлении репродукции вируса, лишь фосфонаты 8е и 9Ъ обладали умеренными противовирусными свойствами (2,5 и 3,5 цМ, соответственно). В то же время известно, что производные А2Т, аналогичные. 7а, 7b, 7f и 8g обладают активностью в подавлении репродукции HIV в культуре МТ-4 клеток. Эти производные AZT, хотя и не превосходят родительский нуклгозид по активности, значительно менее токсичны. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что перспективным является синтез фосфонатных производных нуклеозидов, обладающих высокой противовирусной активностью с целью понижения их токсического действия.

2.1 .Синтез и противовирусные свойства 5*-фгорфосфатов нуклеозидов

Следующим этапом работы был синтез и изучение противовирусных свойств 5'-фторфосфатов нуклеозидов. Атом фтора можно рассматривать как изостерный атому водорода и изоэлекгронный - кислороду. Вследствие этого, 5-фторфосфаты нуклеозидов моделируют dNMP. Ранее было предложено несколько подходов к 'синтезу фторфосфатсв нуклеозидов. Так, было описано фторирование нуклеозид-5'-монофосфатов под действием 2,4-динитрофторбензола или SOjClF. Инозин-5'-фторфосфат был получен

Таблица 2. Некоторые данные спектров ЯМР соединений 7а-Г и 9а, характеризующие строение фосфорсодержащего фрагмента

Соединение Заместитель при Р-атоме 1Н-ЯМР, 8, мл. или 1н.р, Гц -'нУ.Р Гц

7а СН2С1 4,55д 10 6,0

7Ь Н 6,81д 660. 6,5

7с СН3 3,60д 19,5 \ 5,5

7(1 СН^ З.Обд б 5,0 •

7е СН2ОАс 4,28д 8 5,0

11 СН2ОН 3,78д 7 5,5

9а н . 6,53д 634 8,0 .

9Ь СНз 3,78д 18 5,0

Таблица 3. Данные 'Н-ЯМР спектров 5'-фосфонатов З'-фтор-З дезоксихимидина, хим. сдвиг.(8, мл.)

Соединение Н-Г Н-2'а,Ь Н-3' Н-4' Н-5"а,Ь Другие

8а 6,42дд 2,67м(2'а) 2,41м(2Ъ) 5,50м 4,57м 4,31-4,21м 3,58а РСН2С1

8Ь 6,41дя 2,71м(2'а) 2,38м(2Ъ) 5,47м 4,50м 4,28-4,10м 4,64дд РСН2Р

8с 6,40дя 2,66м(2'а) 2,43м(2Ъ) 5,48м 4,54м 4,23-4,06м 2,91ц РСН21

. 8<1 6,40да 2,68м(2'а) 2,ЗЗм(2*Ь) 5,42м 4,50м 4,28-4,10м 6,22дт РСНР2

8с* 6,40дв 2,78м(2'а) 2,35м(2Ъ) 5,50м 4,Ям 4,32-4,20м б,42дц, 6,40дд рсниа

8Г 6,40дц 2,88м(2'а) 2Д)м(2Ъ) 5,49м 4,50м 4,30-4,20м 5,65-5,98м РСН=СН2

»8 6,42дд 2,95-2,10м 5,50м 4,50м 4,30-4,10м 1,20дт СНзСН2 4,25-4,19м СН3СН2

8Ь 6,41дд 2,68м(2'а) 238м(2Ъ) 5,49м 4,50м 4,29-4,09м

81 6,45дд 2,70-2Д0м 5,-52м 4,60м 4,35-4,20м - 2,22с СНз 4,28д РСН2

8] , 6,44дд 2,«м(Ха) 2,42м(2Ъ) 5,49м 5,55м 4,28-4,10м 3,79д РСН2ОН

* смесь диастереомеров 1:1

Таблица 4. Данные 'Н-ЯМР спектров 5'-фосфонатов З'-фтор-З'-дезокситимидина, КССВ (I, Иг).

N 1',2'а 1',2'Ь 2'а,2'Ь 2'а,3'* 2'а,Ь,Н З'.Р 4',5'а 4',5'Ь 5'а,5'Ь 5'а,Р 5'Ь,Р Другие

8а 5,5 5.5 15,0 5,0 21,5 41,5 54,0 28,0 3 - 12 5,5 - 9,5 (СН2,Р>

8Ь 5,5 9,5 15,0 5,0 21,5 41.5 53,0 23,0 .3 1,5 12 5 3 4,5(СН2,Р); 48.0 iF.Pl

8с V 9,5 15,0 5,5 21,5 41,5 53,0 28,0 2,5 2 11,5 .5 3 9,5 (СН2,Р)

за 5,0 / 8,5 14,0 5,0 21,5 38,0 54,0 - - - - - - 21,0 (СН,Р); 48,0 (ЪР)

8с 5,5 9,5 15,0 5,0 22,0 38,0 53,0 28,0 - - - - - 6,5 (СН,Р); 46,0 (ЕР)

8Г 6,0 8,0 14,0 5,0 20,0 38,0 52;5 28,0 - - - - - -

8g 5,5 8,5 15,0 5,0 20,0 39,0 52,0 28,0 - - - - 0,8 (СН2,Р) 7,5 (СН3,СН2)

8Ь 5,0 9,0 | 14,5 5,0 21,0 38,0 ' 53,0 ,28,0 - ■ - - - - -

81 5,2 9,8 15,0 5'° 22,0 40,0 54,0 28,0 - - 11 - - 7,8(СН2,Р)

8] 5,0 9,0 13,5 5,0 19,5 37,5 48,5 25,0 2,5 1,5 9 4,5 4 7,5 (СН2,Р)

* ^2Ь,3 <0,5 Гц

г

конденсацией инозина с фгорфосфорной кислотой в присутствии БСС. Мы синтезировали 5'-фторфосфаты нукпеозидов аналогично 5'-фосфонатам .реакцией конденсации фгорфосфорной кислоты с нуклеозвдом в присутствии ТР5С1 или 1-(2-мезипиенсульфонил)-3-нитро-1,2,4-триазолида (МБКТ) (схема 3). Были синтезированы 5'-фторфосфаты ■ нуклеозидов, обладающих ярко выраженными анти-ШУ свойствами: АСТ, ИЛ, 2',3'-дидезоксицитидина ^С), ¿4Т, а также 2',3'-дидезоксиуридина (¿¿и), 5'-трифосфат которого является ингибитором биосинтеза ДНК, катализируемого обратной транс-криптазой Н1У. Выделение и очистка соединений проводились

аналогично описанному ранее для 5'-фосфонатов. Условия реакции конденсации, выход и хроматографические. характеристики фторфосфатов 10а-£ приведены в таблице 5.

схема 3

О II

- В НО-Р-О-

э. | i

N I р

но-

В я

аат ТЬу н

ddU ига н

ТЬу N3

РЬТ ТЬу р

6 ТЬу ОАс

—I л в Я

10

в я

ТЬу Н

ига Н

ТЬу N3

ТЬу Р

ТЬу О Ас

ТЬу ОН

аас

но

№=СНМ(СН3)2

л ■'

О Р

но-

Ы=СН-Ы(СН3)2

л ■

0

II • но—р—

1 р

■ Су1

X...

а4Т

" ТЬу

»-р-ф

юи

¡: 1)РР(0)(0Н)2хВи3Ы, ТРБСП или МБОТ, пиридин; 2) вода; и) (СНз)2НСН(ОСНз)2, ДМ ФА; Ш) КН4НС03; ¡у) 0,5 N ИаОН, 2 часа

Таблица 5. Условия реакции конденсации

Соединение Конд. агент Время реакции, мин Выход, % тех*,

10а МБНТ 50 64 0.62

10Ь М5КГ Зч 60 0158

Юс МЭНГ 2ч 36 0.59

юа ТРБС! 20 -62 0.58

10е МЗМТ 1ч 67 0,48

ЮГ ТР5С1 40 65 0,63

ЮЬ ТРБС! 45 44 0.61

* ТСХ проводили в системе изопропанол : 25% КН4ОН : вода (7:1:3, обьемн.)

Тгблица 6. Данные Ш-ЯМР спектров 5'-фторфосфатов нуклеозидов. Хим. сдвиг (5, м.д.)

Соединение н-г Н-2'а.Ь Н-31 Н-4' Н-5'а,Ь

10а 5,04дд 2,40- 1,90м 4,25м 4,08-3.92м

1СЬ 5,26м 2,40- 1,90м' 4,28м 4.07-3,93м

10с 6,50дд 2,50-2,40м 5.53м 4,80м 4,20-4,15м

10:1 6,48дг. 2,74м(2'а) 2,48м(2Ъ) 5,48м 4,60м 4,18-4,12м

!0с 5,98лд 2,49- 1,90м 4,30м 4,07-3,93м

№ ■б,15дц - , 2,15-2,02м . 4,34м , . 3,92шс 3,70-3,75м

101г 6,85м 6,39ддд 5.88длд 5,04м 4,00-4, Юм

Таблица '/. Данные Щ-ЯМР спектров 5'-фторфосфатов нуклеозидов, КССВ (I. Гц) •_

N 1',2'а Г,2Ъ ! 2'а.2Ъ 2'а,3' 3\4' 5'а.5Ъ другие

10а 4,0 6,0 - - - 9,4

ЮЬ 3,5 5,5 - - - 9,0

Юс 6,0 6,0 12,0 2,8 3,2 11,5 ••сНз.Н-б"!,8

Ш 5,0 9,0 15,0 5,0 - 11,0 14^р=25,0 ^НЗ,Н-б=1,8

10е 4,0 5,5 - - - 9,5 }Н-5,Н-6~7

6,5 6; 5 13,7 4,1 - ■ -

ЮЬ 3,5 7,0 3,0 10,5 З3-,г=2,0 ■>СНч,Н-6=1.8

Полученные 5'-фторфосфаты нуклеозидов имели характерные УФ-спекгры, были гомогенны по TOd Структура соединен;!;! подтверждена данными FAB масс-спектров, 'Н- и 31Р- ЯМР спеюров (табл.6-8). В 31Р-ЯМР спектрах наблюдались сигналы атома пятивалентного фосфора с присоединенным к нему фтором, представляющие собой дублет мудьтиплетов, который при подавлении Р-Н спин-спинового взаимодействия трансформировались в дублет с характеристичной Jp.p, равной ~ 930 Гц. Спектры регистрировали в DjO с использованием трет.-бутанола (внутренний стандарт, !Н-ЯМР) и 85% Н3РО4 (внешний стандарт, 31Р-ЯМР)

Таблица 8. Данные 31Р-ЯМР спектров 5'-фторфосфатов нуклеозидов

Соединение Химический сдвиг кссв

мл. (8 ) Jpf(Hz)

10а -7,00 „ 932

10Ь -6,9 8 933

10с -6,91 932

10d -6,88 934

10е -6,90 935

10g -6,85 930

10h -6,88 934

Таблица 9. Подавление репродукции HIV 5'-фторфосфатами нуклеозидов

Нуклеозвд Фгорфосфат нуклеозвда

Клетки EC50,hM CC50,nM SI ЕС50,цМ CC50>tiM SI

ddT PBL 1.4 4300 3070 100 580 5,8

ddU PBL 100 ** 100 *

AZT PBL 0,0047 >1000 >212766 0,00010,001 578 >578000

H9 0,23 >100 >435 0,1 >100 >1000

FLT PBL 0,002 775 387500 0,004 630 157500

H9 oa >100 >500 0,3 >100 >333

ddC PBL 0,008 3500 437500 <0,08 >1000 >12500

d4T PBL .. 0,05 349 6980 0,05 -571 1142.0

ЕСэд - эффективная концентрация 50% подавления репродукции ИГУ, СС50 -концентрация, при которой жизнеспособность клеток ингибируется на 50%, - индекс селективности, отношение ССзд /ЕСэд,* нет данных,

Бьгла исследована способность синтезированных нами соединениий подавлять репродукцию HIV в культурах клеток PBL и ,Н9. Тестирование проводилось доктором Б.Польсхи в Memorial Sloan Kettering Cancer Center (Нью-Йорк) совместно с компанией American Cyanamid. Оказалось, что нуклеотид Юс обладает большей противовирусной активностью, чем исходный AZT. Фторфосфаты lOd, 10е и 10h проявили равную или близкую к исходным нуклеозвдам FLT, ddC и d4T, соответственно, активность в подавлении репродукции HIV. Неактивными оказались 5'-фторфосфаты 10а и 10b. Токсичность полученных соединений была одного порядка величины с токсичностью исходных нуклеозидов. В результате индекс селективности для фторфосфатов Юс и 10h был вдвое выше, чем таковой для исходных нуклеозидов (табл. 9). .

2.2. Изучение стабильности 5'-фторфосфатов нуклеозидов в сыворотке крови человека

Следующим этапом исследования было определение стабильности 5'-фторфосфатов Юс, 10d и 10g в сыворотке крови человека. Существенно было сравнить их с фосфатами и Н-фосфонатами нуклеозидов, а также выявить возможную зависимость стабильности от модификации в углеводном фрагменте, молекулы. Для этого нами были синтезированы по известным методикам 5'-фосфаты и 5'-Н-фосфонаты AZT, FLT и тимадина. Была изучена стабильность этих соединений и 5'-фгорфосфатов Юс, 10d и 10g в сыворотке крови человека. ... ..- .... ....

Синтезированные нами вещества инкубировали с сывороткой крови человека при 37°С, после чего образцы осаждали добавлением метанола до конечной концентрации 70%, выдерживали 30 мин при -20°С, центрифугировали, супернатант отбирали, упаривали метанол. Полученный остаток хроматографировали ВЭЖХ на колонке Nucleosil 100 С18 (5 мкм, 4x150 мм). Элюцию проводили 50 мМ КНгРО^буфером (pH 6,8) в градиенте метанола от 0 до 35% за 25 мин.

На основе ВЭЖХ анализа продуктов гидролиза исследованных соединений были построены кривые дефосфорйлирования и определено время дефосфорилирования их половинного количества (табл. 10).

В результате были обнаружены следующие закономерности.

1) 5-Фторфосфаты AZT (10с) и FLT (10d) гидролизуются в сыворотке крови человека значительно быстрее, чем соответствующие 5 -Н-фосфонаты А2ГГ и FLT, но примерно вдвое медленнее, чем 5'-фосфать: AZT и FLТ.

2) 5-Н-Фосфонаггы AZT, FLT и тимидина гидролизуются непосредственно до соответствующих нуклеозидов, хотя нельзя исключить их медленное предварительное окисление до 5 -фосфатов AZT, FLT и тимишша, которые, в свою очередь, быстро гидролизуются до нуклеозидов.

3) 5-Фгорфосфаты Юс, 10d и 10g гидрализуюгся в сыворотке крови до соответствующих монофосфатов нуклеозидов, которые в свою очередь дефосфорилируются до нуклеозидов.

Полученные данные иллюстрируют возможные молекулярные механизмы действия этих групп нуклеотидов при ингибировании репродукции HIV (рис. 1). Так, нуклеозид-5'-Н-фосфонат1.1 .-шлются депо-формами соответствующих нуклеозидов (путь В), хотя нельзя ис-адачить возможности их метаболизма другими путями. 5'-Фгорфосфаты тамидиновых производив; могут быть депо-формами как соответствующих нуклеозидов (путь В), так и их S'-фосфатов (путь А), и реальные пути их превращений зависят, по-видимому, от скорости их диффузии в клетки и соотношения ферментов гидролиза и фосфорилирования в клетках.

Таблица 10. Время дефосфорилирования половинного количества исследуемых соединений

5'-Н-фосфонаты 5-фторфосфаты 5'-фосфаты

AZT FLT ACT (Юс) FLT (10d) AZT FLT Thd

33 час 60 час 65 мин 70 мин 35 мин 40 мин 20 мин

3. Синтез 5'-а-фосфонил-р,у-днфосфатов нукхеозидов

Как мы отмечали ранее, одной из возможных причин противовирусного действия 5'-фосфонатов нуклеозидов может быть их включение в анаболические пути нуклеотидов, то есть превращение в а-фосфоннл-|3,у-дифосфат нуклеозидов (ряс. 1, путь С) и последующее ингибирование блосинтеза провнрусной ДНК по терминационному или иному механизмам. Ранее было показано, что 5Ч*-мегапфосфонил--р,у-дифосфат тимидкна является субстратом ТсГГ тимуса теленка, обратных транскрюттаз НГУ и АМУ, ДНК-полимеразы (5 печени хр:лс. Субстратом последних трех ферментов является также и 5'-а-мет!шфосфонил-р,у-дифосфат РЬТ.

3.1. Синтез 5'-айфосфоюш-р,у-дифосфатов нукксгавдо» с обьекныни заместителями у а-Р атома

Нами . был осуществлен синтез модифицированных нуклеозидтрифосфатов с объемными заместителями у оР атома. Изменяя размер присоединенного к а-фосфору радикала, мк надеялись получить селективные ингибиторы вирусных ДНК-полимераз. Кроме" того, введение объемного заместителя могло облепить разделение диастереомерной смеси методом ВЭЖХ.

Решая зги задачи, мы синтезировали 5'-а-фенилфосфонил-Р,у-дифосфаты тимидина 14а и FLT 14Ь, а также 5'-а-децилфосфонил-р,-г-дифосфат тимидииа 14с. Синтез был осуществлен по схеме 4 (I, 2, 3) , исходя из З'-ацетнлированного тимидина б или FLT. Нуклеозид-5'-фосфонаты 12a,c,d получали конденсацией нуклеозидов б или FLT с фенил- или децилфосфоновой кислотой в присутствии TPSC1 с выходом около 60%. Активированные К,№-карбониддиимидазолом (CDI) фосфонаты вводили в реакцию с пирофосфатом. Соединения 14а-с выделяли ионобменной хроматографией. Фракции, содержащие трифосфатный аналог, немедленно замораживали и лиофилизовали. Окончательная очистка от солей и монофосфоната нуклеозида проводилась обращеннофазовой хроматографией.

Структура трифосфатных аналогов 14а-с, а также фосфонатов. 12Ь,с,е подтверждена данными спектров !Н- и 31Р-ЯМР и FAB масс-спектров (табл. 12). Спектры ЯМР регистрировали в Р2О с использованием трег-бутанола (внутренний стандарт, Щ-ЯМР) и 85% Н3РО4 (внешний стандарт, 31Р-ЯМР). Их чистота контролировалась ионобменной и обращеннофазовой ВЭЖХ.

Полученная смесь диастереомеров 14а бьша разделена препаративной обращеннофазовой ВЭЖХ. Разделение проводили в градиенте ацетонитрила в. КНзРО^буфере. Соответствующие фракции лиофилизовали и очищали от "солей обращеннофазовой хроматографией в 5% метаноле. В 'Н- и 31Р-ЯМР спектрах чистых диастереомеров наблюдалось различие. В 'Н-ЯМР спектрах

.Таблица 11. Выход. реакции, ТСХ и „ВЭЖХ .анализ синтезированных соединений_______

Соединение Выход реакции, % тех*, Яг ВЭЖХ**, t***(MHH)

А В С D

12Ь 60 0,63 20,0 16,0

12с . 68 0,67 27,1 5,0

12е 55 0,72 23,0 15,2

14а* 13 0,32 12,0 19,0

14а" 13 • 0,32 12,4 21,0

14Ь 23 0,35 12,0; 12,5 25,0

14с 20 0,43 13,8; 15,1 17,2

14d 27 0,1 0,2 17,0 25,2

14е •25; 32 0,15. 0,22 18,5 26,7

14f 25 0,26 0,54 26,3 28,0

* ТСХ проводили в системах А - изопропанол : 25% NH4OH : вода (7:1:3,

обьемн.) и В - диоксан : 25% NH4OH': вода (6:1:4); "ВЭЖХ проводили на

колонках Spherisorb С-18 (8 мкм, 4x150 мм) (С) и Hypeisil APS (5 мкм, 4,6x250 мм) (D). Элюшпо вели соответственно линейным градиентом ацетонитрила в 0,1 М ТЭАБ (рН 7) от 0 до 30% за 30 мин, и линейным градиентом КН2РО4-буфера (рН 5,5) от 0,05 до 1 М за 25 мин;***время удерживания.

схема 4 В

14

R

с6н5 C6HS С10Н21 СН3 СН3 СН,

X

ОН F

ОН ОН

N3

0-1SÍ1

>

12с -*• 14Ь 12а — 12Ь -»■ 14а 12d -*■ 12е 14с 13а-*" 14d 13d-»- 14f14d 13b,c -»-14c

1,2,4-тригзсйшл; Im - имидазолил; [Si] - трет.-буталдимгшлсилил г.фосфоновая кислота, TPSC1, пирндп:; ii: СН3Р(0)С12, 1,2,4-триазол, триэтиламин, ацстонитрил; iü: NH^OH; jv: CDI, ДМФА; v: б>/о-тр11-н-бугю;аммонисвая соль пирофосфорной кислоты, ДМФА; vi: TsQH, ацстонитрчл/вода

(1) (2) (3) (*)

(S) '(fi)

Tri-

FLT-6 -6 -lia ■ 11b-AZT-

Таблица 12.

Данные Щ- и 31Р-ЯМР и РАВ-масс спектров соединений 12-14

Соединение 1Н-ЯМР химические сдвиги, 5 м.д. и КССВ, Днс-Р> - Гц 31Р-ЯМР химические сдвиги, 5 м.д. , 3,Р-ЯМР КССВ, РАВ-масс, т/г

' протоны групп, связанных с фосфором а-Р Р-Р У -Р а-р Р-У

12Ь 7,72м , 7,5бм, 7,48м 15,40 с 383(М++1) * 400(М++1+ ЫНО

12с 7,7бм , 7,57м, 7,44м 15,41с 385(М++1) 402(М++1+ ЫН,)

12е 1,72м 29,55шс 447(М++1) 464(М++1+ ЫН,)

14а 7,85м (12), 7,69м, 7,5бм 12,7 5д 12,70д -22,50м -22,20м -9,50шс -8,50шс 24,10 22,70 542(М+) 559(М++ЫНЧ)

14Ь ' 7,80м(10,5), 7,6£м, 7,54м 27,80д 27,40д -26,03 м -13,06шс 25,00 25,50 544(М+) 56КМ+4-ЫН,)

14с > 1,8бм 11,23д Ю,93д -23,65м -Ю,18шс 23,90 23.50 * 60б(М+) бгзсм+ч-ин,)

Ш 1,69д (19) 25,18д 25,08д -22,96м -23,77м -9,72д -9,77д 21.31 22.32 19,76 19,25 480(М+) 497(М++ЫН,)

14с • 1,84д (18,1) 1.83д (18,2) 26,48д -22,64д -22,77д -8,71шс 20,05 506(М+) 523(М++1+ ЫН,)

14Г 1,83д (18,09) 26,23д 2б,10д -22,74д . -22,87д -8,97шс -9,09шс 21,20 19,03 • 595(М+) 612(М++1+ ЫНч)

изомера 14а', имеющего меньшее время удерживания, наблюдался сдвиг сигналов СНз-группы тимина, Н-б и Н-Г в сильное поле по сравнению с аналогичными сигналами изомера 14а" и фосфоната 12Ь на 0,1-0,2 мл.

. Диастереомерные смеси 14Ь, 14с и индивидуальные изомеры 14а' и 14а" были изучены в модельной системе биосинтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразами (данные Л.С.Викторовой и М.К.Кухановой). Были использованы Т(ГГ, обратные транскриптазы АМУ и НГУ, ДНК-полимеразы I (фрагмент Кленова), а и р из плаценты человека и ДНК-полимеразы вирусов человека: цитомегаловируса (СМУ) и вируса герпеса простого, тип 1 (Н5У-1). Оказалось, что ДНК-полимеразы а, СМУ, Н5У-1 не включают нуклеозидфосфонатный остаток в растущую цепь ДНК, в то время как ДНК-полимераза ¡3, ретровирусные обратные транскриптазы и ТсГГ способны катализировать образование фосфонодиэфирной связи. Диастереомер 14а" не обладал субстратными свойствами по ' отношению ни к одной из ДНК-полимераз.

Таким образом, нуклеозид-5'-а-фосфонил-р,у-дифосфаты с объемными заместителями являются субстратами некоторых ДНК-полимераз, в том числе обратной транскриптазы Н1У. Следовательно, механизм действия фосфонатов нуклеозидов, основанный на их превращении в соответствующие трифосфатные аналоги (рис. 1, путь С) и включении нуклеозидфосфонатного звена в цепь ДНК, может рассматриваться как вполне вероятный.

3.2. Новый метод синтеза 5'-а-мет1шфосфонш1-р,т-дифосфатов нуклеозидов

' Предложенный ранее и использованный" нами двустадийный метод получения фосфонатдифосфатов является достаточно трудоемким и продолжительным по времени. Поэтому возникла необходимость разработки способа получения трифосфагных производных, без выделения промежуточных продуктов. Возможности предложенной нами схемы продемонстрированы на примере синтеза 5'-а-метилфосфонил-р,т-дифосфатов тимидина и АСТ. х.. Мы основывались на методах, применяющихся для получения нуклеозид-5-трифосфатов, заменив хлорокись фосфора на дихпорангидрвд мепитфосфоновой кислоты. Тимидин или АСТ обрабатывали хлорангидридом метилфосфоновой кислоты в триалкил фосфате, полученные нуклеотиды 13а,Ь без выделения конденсировачи с пирофосфатом [схема 4 (4, б)]. При этом окало 30% нуклеотица 13а,Ъ не вступало в реакцию, что позволяло получить трифосфаты 14<1 и 14с с выходом не более 25%. Другой подход заключался в использовании метил фосфоно-&гс-( 1,2,4-триазолида). Фосфонилирование АСТ, успешно ~ осуществленное с помощью метилфосфоно-йяс-{1,2,4-триазолида), полученного из хлорангидрида метилфосфоновой кислоты и триазола, приводило к обр1азованию триазольиого. производного 13с схема 4 (б). Для фосфонилирования тимидина требовалось защитить гидрокенльную

группу в З'-положении. Защитные группы ацильного типа оказались неподходящими, т.к. в процессе дезацилирования трифосфатное производное полностью разрушалось. Введение в З'-положение яимегокситритильной группы сделало 5'-гидроксил инертным в реакции фосфонилирования. Наиболее удачной в данном случае оказалась трет.-бутилдиметилсилильная защита. Обработка З'-трег.-бугиддиметилсилильного производного тимидина lib метилфосфоно-6>/с-(],2,4-триазш1Идом) приводит к нуюгеотиду 13d [схема 4 (5)]. Нуклеотиды 13с,d без выделения обрабатывали пирофосфатом, образовавшиеся трифосфатные производные 14е и 14f выделяли ионообменной хроматографией на DEAE-носителе. Трет.-бутилдиметилсилильную защиту удаляли с хорошим выходом обработкой трифосфата 14f п-толуолсульфокислотой (TsOH) в водном ацетонитриле с образованием трифосфата 14d. Этот способ ■ позволил получить соединения 14d и 14с с выходами около 30%.

Структура трифосфатных аналогов 14d-f, полученных в виде смеси R- и S-диастсреомеров в равных количествах, подтверждена данными спектров 1Н-И 31Р-ЯМР и FAB масс-спектров (табл. 12).

4. Синтез и изучение субстратных свойств 5'-у-фосфонил-а,р-дифосфатов нуклеозидов

Следующим этапом нашей работы было изучение влияния на ... субстратные свойства ярифосфатных аналогов модификации по у-атому фосфора. Для этого были синтезированы у-фосфонил-а,|3-дифосфаты тимидина и AZT по схеме 5.

Предварительно были получены пирофосфатные аналоги 18а,Ь, содержащие фосфонильную группу. Активация метил- 15а или фенилфосфоновой 15Ь кислоты CDI приводила к имвдазольньш производным 17а,Ь, которые конденсировали-с Н3РО4 (схема 5). Полученные таким образом пирофосфатные аналога 18а,Ь очищали ионообменной хроматографией на Dowex 50 W в пиридиниевой форме и обращённофазозой хроматографией. Обработка 5'-монофосфатов AZT и З'-О-трэт.-бупидиметилсилилгимидина 16а и 1бЬ, соответственно, CDI приводила к образованию имидазолидов 19а,Ь, которые вводили в конденсацию с йгё-три-н-бугиламмонневыми салями пирофосфатных аналогов 18а,Ь. Так были синтезированы у-метилфосфонил-а,|3-дифосфат AZT 20а, а также у-фенилфосфонил-а,р-дифосфаты AZT и 3'-защшценного тимидина 20Ь и 20с, соответственно. Выделение и очистку трифосфатных' аналогов 20а-с проводили аналогично описанному выше для а-модифицированных производных. После удаления трет,-бутилдиметилсилильной группы действием TsOH в водном ацетонитриле получали фосфонатди фосфат 20d. Выход целевых продуктов составил

схема 5

20 Ъ

Л Мс РЬ

К,

"" с РЬ 01&)-,

<1 РЬ он

' п С01, ДМФА; й: СН3'ОН, 30 мин, Ш: Н3РО4 х2Ви3Я'; ¡г ЪоН, СН3СК/вода

соответственно 20а - 12%, 20Ь - 18% и 20с -22%, а 20Л из 20с -75%. Нам удалось выделить и идентифицировать побочные продукты 21 и 22 (рис. 2), образующиеся с выходом 13% и 22%, соответственно, в реакции конденсации пирофосфатного производного 18а и нуклеотида 19а.

рис. 2

43

Н А А та*

ро-р-о-р-о-л О НО НО НО \_I

В . А

но—р—о— р-СН3 но

21

N1

22

' Структура трифосфатных аналогов 20а-3 и побочных продуктов 21 и 22 подтверждена данными спектров 'Н- и 3,Р-ЯМР и БАБ масс-спектров (табл. 13, 14). Их чистота контролировалась обращеннофазовой ВЭЖХ. Пирофосфаггныс производные 18а,Ъ охарактеризованы спектрами Э1Р-ЯМР (табл. 14)

Таблица 13. Данные 1Н- и 31Р-ЯМР и ИАВ масс-спектров соединений 20а-с1

Соединение 31Р-ЯМР химические сдвиги, 5 м.д. Э1Р-ЯМР кссв,}, т 1Н-ЯМР * химические сдвиги, 5 м.д. и КССВ, JHF.Pi Гц РАВ-масс, т/г

а-Р 0-Р т-Р ос-0 1Нг

20а : -Ю,74д -21,83м 19,77д 19,01 20,31 1,84д (17) 481 (М++1), 498 (М++1+ЫН,)

20Ь -10.82д -22,26м ■ б,80д 18,25 25,18 7,82м (6,8), 7,52м 568 (М++1)

20с -10,69д -22,04м 6,86д 18,23 23,48 7,63м (6,7), 7,29м 658 (М++1)

20(1 -Ю.ббд -22.20м 6,91д 19,02 25,42 , 7,64м (7), 7,32м 543 (М++1), 560 (М++1+ЫН,)

* сигналы протонов групп, связанных с атомом фосфора

Таблица 14. Данные 31Р-ЯМР спектров соединений 18а,Ь-, 21 и 22

Соединение 31Р-ЯМР 31Р-ЯМР

химические сдвиги, 5 м.д. КССВ, I, Нг

18а 18,26 дк,-9,34 д 1р Р=22,60 Гц, 1ис,р= 17,34 Гц

18Ь 6,62 м, -9,34 д ;Р|Р=25,52 Гц

21 -10,71 д (2Р), -22,18 т 1р р=18,8 Гц

22 18,13 дк, -11,02 д }Р 13=24,42 Гц, 1цг р= 17,09 Гц

Трифосфатные аналоги 20a,b и d были изучены в модельной системе биосинтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразой а из плаценты человека, TdT и ретровирусными обратными транскриптазами (данные Д.Г.Семизарова). Было обнаружено, что все три соединения эффективно" включаются в растущую цепь ДНК обратными транскриптазами HIV и AMV, но не узнаются TdT и ДНК-полимеразой а, причем константа Михаэлиса включения соединения 20d лишь в два раза выше таковой для ТТР (3 и 1,25 цМ, соответственно). Таким образом, нам удалось синтезировать аналоги нуклеозидтрифосфатов, являющиеся субстратами рстровирусных обратных транскриптаз и не узнающиеся, эукариотическими ДНК-полимеразами а и TdT. n

с. ВЫВОДЫ

^ <

1. Предложен новый тип ингибиторов репродукции HIV - 5-фтор-фосфаты З'-модифицированных нуклеозидов.

а) Разработан метод синтеза, позволяющий получить эти соединения в препаративных количествах; одно из соединений З'-азидо-З'-дезокситимидин-5-фторфосфат оказался в 5 раз активнее и 2 раза токсичнее в клетках PBL своего прототипа - З'-азидо-З'-дезокситимидина.

б) Показано, что в результате гидролиза сывороткой крови человека 5'-фторфосфаты нуклеозидов превращаются в 5-монофосфаты соответствующих нуклеозидов.

2. Синтезированы 5-фосфонаты З'-фтор-З'-дсзокситнмидина, З'-хлор-З'-дезоксигимидина и 3'-хлор-2',3'-двдезоксиаденозина и определена их анги-HIV активность в МТ-4 клетках. Умеренную активность продемонстрировали 5'-фторхлормегилфосфонат З'-фтор-З'-дезоксшимидина и 5'-метилфосфонат 3'-хлор-2',3'-дидезоксиаденазина.

3. Разработаны методы синтеза а-Р и у-Р алкилированных и арилированных аналогов ТТР. Предложен быстрый и эффективный способ получения а-метилфосфонил-р.т-дифосфатов нуклеозидов без выделения промежуточных соединений. Разделена диастереомерная смесь и получены индивидуальные изомеры а-фекилфосфонил-Р.у-дифосфата тимидина. а-Модифицированные аналоги ТТР являются субстратами ДНК-полимеразы Р, TdT и ретровирусных обратных транскриптаз, в то время как у-модифшшрованные аналоги проявляют субстратные свойства только по отношению к обратным транскриптазам.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. N.Dyatkina, AArzumanov, N.Tarvssova. Synthesis of 5-H-phosphonates of

З'-substituted purine deoxynucleosides. Nucleosides & Nucleotides 1991,

v.10, N 1-3, p.731-732. ( - .

2. АААрзуманов, Н.БДяткина, М.К.Куханова, АА-Краевский,

Ф.М.Семченко, О.Г.Еремин, Б.И.Маргынов. З'-Фтор-З'-дезоксигимидин-У-фторфосфат - эффективный ингибитор репродукции вируса иммунодифицига человека в клеточных культурах. Биоорг. химия 1993, т.19, N 10, с.978-980.

3. J.Matulic-Adamic, ¡.Rosenberg, AArzumanov, N.Dyatkina, RShirokOva, A-Krayevsky, K.Watanabc. A simple multi-gram synthesis of 5*-phosphorofluoridates of sugar modified nucleosides. Nucleosides & Nucleotides 1993, v.12, N 10, p.1085-1092.

4. N.Dyatkina, AArzumanov, LVictorova. Nucleoside 5'-a-phosphonyl~p,y-diphosphates: synthesis and functional study. Coll. Czechosl. Chcm. Commun. 1993, v-58, p.91-93.

5. ОАМамаева, ОАПлясунова, А.Г.Покровский, Н.БДяткина, АААрзуманов. Изучение анги-НГУ-активности 5-фосфонатов азидотимидина и фтортимидина. Мол. биол. 1994, т.28, N 1, с.137-142.

6. N.Dyatkina, AArzumanov, A-Krayevsky, В.О'Нага, Y.Gluzman, P.Baron, С. MacLow, B.Polsky. Synthesis and antiviral activity of some fluorinated " nucleotide derivatives. Nucleosides & Nucleotides 1994, v.13, N 1-3, p.325-337.

" 7. AArzumanov, N.Dyatkina. An alternative route for preparation of a-methyl-p,y-diphosphates of thymidine derivatives. Nucleosides & Nucleotides, 1994, v.13, N 5, p.1031-1039. 8. Е-В.Кузнецова, М.К.Куханова, AA. Арзуманов, ААКраевский. Реакции 5'-Н-фосфонатов, 5'-Р-фосфатов и 5-фосфатов модифицированных тимидинов в плазме крови человека. Мол. биол. 1995, т.. 29, N. 2, с. 415-420. - - 9. N.Dyatkina, AArzumanov, LVictorova, M-Kukhanova, A-Krayevsky

"Synthesis and substrate properties of ТГР analogs with large hydrophobic substituent groups at a-P atom", Nucleosides & Nucleotides 1995, v. 14, N. 1-2, p. 91-104.