Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание ингибиторов роста Micobacterium Tuberculosis на основе модифицированных нуклеозидов

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание ингибиторов роста Micobacterium Tuberculosis на основе модифицированных нуклеозидов"

На правах рукописи

ШМАЛЕНЮК Эдуард Ренатович

СОЗДАНИЕ ИНГИБИТОРОВ РОСТА MICOBACTERIUM TUBERCULOSIS НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ НУКЛЕОЗИДОВ

03.01.03 Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 8 НОЯ 2013

Москва 2013

005539711

005539711

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН).

Научный руководитель: Старший научный сотрудник Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений ИМБ РАН, кандидат химических наук Л.А. Александрова

Официальные оппоненты: профессор химического факультета Федерального

государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», доктор химических наук Т.С. Орецкая

Ведущий научный сотрудник Лаборатории стереохимии ферментативных реакций ИМБ РАН, доктор химических наук Э.Н. Тимофеев

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова»

Защита диссертации состоится «/?» г. в н часов на заседании

диссертационного Совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ РАН (119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32)

Автореферат разослан

«/Г» иол^рл

2013 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат химических наук

М. Крицын

Актуальность исследования. Туберкулез (ТБ) на протяжении столетий был и остается одним из наиболее опасных заболеваний человека. Со времен идентификации Р. Кохом в 1882 году этиологического агента заболевания — туберкулезной палочки Mycobacterium tuberculosis достигнут огромный прогресс в профилактике и лечении ТБ. Тем не менее примерно треть населения Земли инфицирована этой бактерией, а смертность от ТБ достигает 2 млн. человек в год. В связи с этим дальнейшая разработка средств борьбы с ТБ остается одной из актуальных и приоритетных задач здравоохранения.

В настоящее время созданы и успешно применяются в практике десятки эффективных анти-ТБ препаратов. Однако терапия ТБ осложняется возникновением лекарственно-устойчивых штаммов М. tuberculosis, в том числе с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) и с широкой лекарственной устойчивостью (XDR), на которые стандартные схемы химиотерапии практически не действуют. Очевидно, что существует острая необходимость в принципиально новых лекарствах, действующих на новые мишени и активных в отношении резистентных штаммов.

Целью работы было создание соединений нуклеозидной природы, подавляющих рост микобактерий, изучение их стабильности и метаболических превращений в биологических средах.

В ходе выполнения настоящей работы решались следующие задачи:

• разработка общей стратегии синтеза производных пиримидиновых 2'-дезоксинуклеозидов, содержащих в положении 5 гетероциклического основания протяженные алкилоксиметильные, либо алкилтриазолилметильные заместители;

• разработка рациональных методов синтеза 3'- и 5'- модифицированных производных 5-додецилоксиметил-2'-дезоксиуридина для исследования влияния заместителей в углеводном фрагменте нуклеозида на противотуберкулезную активность и цитотоксичность;

• синтез ряда монофосфатов модифицированных нуклеозидов с целью проверки ингибирующей активности в отношении потенциального фермента-мишени тимидилатсинтазы М. tuberculosis;

• анализ результатов изучения способности полученных нуклеозидных производных ингибировать рост in vitro двух штаммов М. tuberculosis — лабораторного штамма дикого типа H37Rv и клинического изолята MDR М. tuberculosis MS-115, устойчивого к действию пяти противотуберкулезных препаратов первой линии (исследование противотуберкулезной активности проводилось в Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза, РАМН).

Научная новизна и практическая значимость работы. Терапия вирусных инфекций часто основывается на использовании производных природных нуклеозидов. Напротив, наиболее распространенные противобактериальные препараты редко относятся к подобным соединениям. Анти-ТБ активность нуклеозидов до недавнего времени не была выявлена.

Однако, в последнее время было показано, что 5-модифицированные пиримидиновые нуклеозиды с протяженными 1-алкинильными заместителями обладают ингибирующей активностью против М. tuberculosis и М. bovis in vitro. Таким образом, нуклеозиды впервые становятся привлекательными объектами для создания новых противотуберкулезных препаратов.

В рамках данной работы синтезированы серии новых модифицированных нуклеозидов, содержащих в 5 положении пиримидинового основания протяженные алкильные заместители (октил, децил, додецил, тетрадецил), введенные посредством эфирного либо триазолильного линкера. Изучено влияние модификаций в 3'- и 5'- положениях углеводной части таких нуклеозидов на изменение их противотуберкулезной активности и цитотоксичности. Синтезирован ряд монофосфатов нуклеозидов, проявивших противотуберкулезную активность, для изучения возможного механизма действия. Методами компьютерного моделирования предложена схема связывания полученных монофосфатов с тимидилатсинтазой М. tuberculosis (потенциальной мишенью действия).

Установлено, что длина цепи введенных заместителей влияет на ингибирование роста двух штаммов М. tuberculosis. В работе также показана зависимость противотуберкулезной активности соединений и цитотоксичности от проведенных модификаций в углеводной части. Полученные модифицированные нуклеозиды могут послужить прототипом для создания новых противотуберкулёзных агентов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на следующих научных конференциях:

• «Наука и инновации в модернизации России и развитии мира», Москва 2010

• «XIX & XX International Roundtable of Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids» Leon 2010, Montreal 2012

• «XVth Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components» Cesky Krumlov 2011

• IV Всероссийский научно-практический семинар «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» Волгоград 2012

• 38'th FEBS Congress (Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ 2013. Биологические механизмы), Санкт-Петербург, 2013

• Первая Российская конференция по медицинской химии, Москва, 2013

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, 8 тезисов и подана заявка на патент.

Объем диссертации. Диссертация изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части и выводов. Материал иллюстрирован О таблицами, т рисунками и кг схемами. Список цитированной литературы включает^УЗ наименований.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№ 11-04-00603 и №13-04-91441), Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и Соглашения №8270 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 -2013 годы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Химический синтез

Синтезированы несколько серий производных пиримидиновых нуклеозидов, содержащих протяженные алкилоксиметильные либо алкилтриазолилметильные заместители в пятом положении нуклеинового основания (схема 1). Также получен ряд производных этих нуклеозидов, содержащих модификации в 3'- и 5'- положениях их углеводной части.

О N42 О О

нсх но. но^ „ ^О

уо-^1

но но к но

1а, Я=С10И2, 2, Я=С12Н25 За, Я=Ы3 4а, Я=1

1Ь, я=спн23 зь, ¡1=мн2 4ь, я=м3

1с, 11=С12Н25 Зс, И=К(С2Н5), 4с, я=ын2

1а, и=с14н29 за, я=м1с2н5

ъ ъ

НСЧ ? 41 V 7Нг к 1

о ХТ

.ГЛ. ^ _ ^Ло но-Го.

0=^Луос12Н25

о

_ |ч и —I--и. 1

но

6а я-г Н 7а К-Г Н К= С10Н21ОСН2

6а,Я-С8Н17 7а,Я-С8Н17 8Ь, Я= СиН23ОСН2

6Ь, Я-С10Н21 7Ь, Я-С10Н2, 8с я= с12Н25ОСН2

6с,Я=С12Н25 7с, а=с12н25 8(1, я=

м^^соон Ч ~ т ° нс\ I

10а, Я=ОН 10Ь, я=осн3

Схема 1. Синтезированные модифицированные нуклеозиды

В качестве исходного соединения для синтеза большинства 5-модифицированных производных нуклеозидов мы выбрали 5-бромметил-3',5'-диацетилтимидин 11, легко получаемый радикальным бромированием диацетата тимидина по методу [Ваг\уо1ГГ, В.;

Langen, P. 1978, Nucleic Acid Chemistry, 359]. Соединения 12a-d синтезированы конденсацией 11 с соответствующим 1-алканолом по простому и экономичному методу [Levina, A.S. et al. 1993, Bioconjugate Chem., 4, 319] (схема 2). Деблокирование синтонов 12а-d дало 5-замещенные 2'-дезоксиуридины la-d. Производное цитидина 2 синтезировали по методу [Divakar, K.J.; Reese, C.B. 1982, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1171] конденсацией синтона 12c с фосфо-/ирис-триазолидом и последующей обработкой водным раствором аммиака.

5-Додецилоксиметил-3'-азидо-2',3'-дидезоксиуридин За получали по описанному выше методу, исходя из 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидина 13 (схема 3).Было установлено, что З'-азидогруппа устойчива к действию брома при проведении радикального бромирования.

la, R=C,0H21 lb, R=C,,H23 lc, R=C12H25 Id, R=C14H29

2, R-C12H25

Схема 2. Синтез модифицированных нуклеозидов по разработанному методу

(О С|0Н2,ОН (а), СцН2зОН (Ь), С,2Н25ОН (с), Ci4H2,OH (d), DMF, 37 °С; (//) NH3/H20, rt; (ш) 9c, 1,2,4-триазол,

Et3N, POClj, CH3CN, +4 °C.

Наличие азидогруппы в соединениях 16 и За подтверждали масс-, ЯМР- и ИК-спектрами (характерный сигнал при 2114 см"1 в ИК-спектрах). Восстановление азидогруппы в соединении За дитиотреитолом по методу [Шаркин, Ю.А. и др. 1996, Биоорган, химия. 22,297] приводило к образованию 5-додецилоксиметил-3'-амино-2',3'-дидезоксиуридина ЗЬ. Обработка амина ЗЬ уксусным альдегидом с последующим восстановлением тетрагидридоборатом натрия по методу [Jasko, M.V. el al. 1995, Nucleosides & Nucleotides, 14, 23] дала смесь ди- и моноэтиламиновых производных Зс и 3d, которые были выделены препаративной тонкослойной хроматографией.

12а, R=Cj0H2I 12b, R=CnH23 12с, R=C12H25 12d, R=C14H29

nh N^O

n

о О о о

RO.

n3 n3 r r

v Г За, R^N3 3c,R=I

25 ЗЬ, R=NH2 3d, R=]

n3 n3

3c, R=N(C2H5)2 3d, R=NIIC2II5

Схема 3. Модификации в З'-положении углеводной части нуклеозида

(О Ас20, Ру, rt; (н) Вг2, С2Н4С12, 83 "С, hv; (ш) С,2Н25ОН, DMF, 37 "С; (iv) NH3/H20, rt; (v) DTT, NH3/H20, EtOH, rt; (vi) CH3C(0)H, NaBH4, rt.

5-Додецилоксиметил-5'-йод-2'-дезоксиуридин 4a был получен с выходом 70% по методу [Owen, G.R. et al. 1976, J. Org. Chem., 41, ЗОЮ] действием на раствор нуклеозида 1с в диоксане йода в присутствии трифенилфосфина и имидазола (схема 4). Нагревание соединения 4а с азидом натрия в диметилформамиде приводило к получению 5'-азидопроизводного 4Ь с выходом 93%. 5-Додецилоксиметил-5'-амино-2\5'-дидезоксиуридин 4с получали восстановлением азидогруппы соединения 4Ь дитиотреитолом.

.----h

Схема 4. Модификации в 5'-положении углеводной части нуклеозида (012, Ph3P, диоксан, имидазол, 70 °С; (/Y) NaN3, DMF, 50 °С; (ш) DTT, NH3/H20, EtOH, rt.

а-Аномер 5-додецилоксиметил-2'-дезоксиуридина 5 был синтезирован, как показано на схеме 5, посредством аномеризации 3',5'-диацетатил-2'дезокси-5-додецилоксиметилуридина 12с с помощью уксусного ангидрида и серной кислоты в ацетонитриле по методу [Ward, D.I. et al. 1993, Tetrahedron Lett., 34, 6779]. Смесь аномеров деблокировали водно-спиртовым раствором аммиака. Наличие объемного заместителя в 5 положении остатка основания позволило успешно выделить а- и ß-аномеры колоночной хроматографией на силикагеле с выходом 57 и 26%, соответственно.

о

о

о

[RO.

.о L»X"

АсО.

с12н25о у nh

\4 RO о^Л.ос,^«

АсО о

12c a Г 17, R=Ac

5, R=H

Схема 5. Обращение аномерного центра нуклеозида 12с (О Ас20, CHjCN, H2S04, rt; (н) NH3/H20, rt.

1,3-Диполярное циклоприсоединение органических азидов к алкинам, катализируемое солями меди (I), широко используется в органической химии. Синтезируемые в результате реакции производные 1,2,3-триазола не просто пассивные линкеры — они способны улучшать связывание полученных соединений с биологическими мишенями, благодаря образованию дополнительных водородных связей и дипольным взаимодействиям [обзор см. Amblard, F. et al. 2009, Chem. Rev., 109, 4207]. Для синтеза 5-алкилтриазолилметильных производных 2'-дезоксиуридина ба-с (схема 6) мы воспользовались вариантом метода [Lee, B.-Y. etal. 2006, Tetrahedron Lett., 47, 5105].

п.

N О

Yt

К

ь.

но.

r fj^^nh ' "

і л I Г >—< 6b,R=C10H21

Ас0> _ N О Дс0_ ^ Hi 6c,R=CI2H25

Ас0 АСО

ril,R = Br 19a,R=C8H17 XN' NH2

18, R = N3 19b,R=C10H21 LAn

19c, R=C|2H25 ІмЛп

НО.

ft N I „

Yx

7a,R=C8H17 7b, R=C10H2, 7c, R=C12H25

Схема 6. Схема синтеза триазолидных производных

(0 ИаЫз.ВМР, 50 °С; (н) С,0Н,8 (а), С,2Н22 (Ь), С|4Н26 (с), Си504-5Н20, аскорбат натрия, СН2С12, П; (ш) ИН3/Н20, П; (IV) гіагоіе, Е13М, РОС13, СН3СЫ, +4 °С.

Исходный 5-азидометил-3',5'-ди-0-ацетил-2'-дезоксиуридин 18 был получен азидированием 5-бромметил-3',5'-ди-0-ацетил-2'-дезоксиуридина 11. 1,3-Диполярное циклоприсоединение азида 18 с подходящими алкинами в двухфазной системе хлористый

метилен—вода при катализе Cu(I), полученным in situ из медного купороса и аскорбата натрия, приводило к 5-алкилтриазолилметильным производным 3',5'-ди-0-ацетил-2'-дезоксиуридина 19а-с. Деблокированием синтонов 19а-с водно-спиртовым раствором аммиака получали производные 2'-дезоксиуридина ба-с. 5-Алкилтриазолилметильные производные 2'-дезоксицитидина 7а-с синтезировали конденсацией синтонов 19а-с с фосфо-трнс-триазолилм с последующей обработкой водным раствором аммиака.

Для избирательного фосфорилирования 5'-гидроксильной группы нуклеозида использовалась комбинация защитных групп: третбутилдиметилсилильной и ацетильной. Синтез начинали с нуклеозидов la-d, полученных в соответствии с описанным ранее методом. Третбутилдиметилсилильную группу вводили по 5'-положению нуклеозида взаимодействием третбутилдиметилсилилхлорида (TBDMS-C1) с соответствующим 5-замещенным 2'-дезоксиуридином (la-d), за которым следовало ацилирование по 3'-положению и удаление 5'-защитной группы тетрабутиламмоний фторидом (TBAF). Получаемый продукт реакции (20a-d) выделяли колоночной хроматофафией на силикагеле.

Для фосфорилирования производных 2a-d применяли метод [Kraszewski, A; Stawinski, J. Tetrahedron Lett., 21, 2935], который давал лучший выход в данной реакции. Метод включает в себя использование фосфо-ягрыс-триазолида в качестве фосфорилирующего агента, который, как оказалось, был весьма эффективен в реакции с нуклеозидами. Затем следовало удаление защитной ацетильной группы действием аммиака (24% водн.) с получением желаемых нуклеотидов 8a-d, выделяемых на колонке с обращенно-фазовым силикагелем LiChroprep RP-18 в линейном градиенте этанола в воде (0—>40%).

la-d 20a-d 8a-d

R=C10H21OCH2(a), CuH23OCH2 (b), Ci2H25OCH2 (c) "2C-N-^y-C8H17 (d) N=N

Схема 7 Схема получения нуклеозидмонофосфатов

Реагенты и условия: (i) TBDMSC1, Ру, 4 °С; (//) Ас20, Ру; (ш) TBAF, THF; (iv) Et3N, РОСЬ, триазол, CH3CN, 4 °С; (v) NH3/H20.

Серьезной проблемой при изучении способности рассматриваемых модифицированных нуклеозидов подавлять рост М. tuberculosis in vitro является их низкая растворимость в воде. В качестве модели с целью преодоления этой проблемы при положении 5 остатка урацила вводился ряд гидрофильных заместителей. Заместителями были выбраны остатки триэтиленгликоля, его монометилового эфира и 4-(4-метоксиметил)амино-4-оксобутановой кислоты. Такой выбор заместителей обеспечивает цепочку из 10-12 атомов в С-5 положении пиримидинового основания, что соответствует нуклеозидам показавшим наилучшую противотуберкулезную активность.

Исходным соединением в синтезе 5-(2-карбоксиэтил-4-карбониламино-Лг-бутилоксиметил)-2'-дезоксиуридина 9 являлся 5-бромметил-3',5'-ди-0-ацетил- 2'-дезоксиуридин 11 (схема 8).

Схема 8 Синтез гидрофильных производных

Реагенты и условия: /) Лг-трифторацетил-4-аминобутанол, ПМГ, 37 °С; //) КН3/Н20; ш) янтарный ангидрид, Ру

Первым этапом проводилась конденсация с Лг-трифторацетил-4-аминобутанолом, за которым следовало деблокирование защитных групп. В дальнейшем взаимодействие промежуточного соединения 21 с янтарным ангидридом приводило к целевому продукту 9, выделяемому ионообменной хроматографией с последующей перекристаллизацией из этанола и этилацетата с выходом 67%.

Триэтиленгликолевые производные 10а,Ь синтезировали также из 5-бромметил-3',5'-ди-0-ацетил-2'-дезоксиуридина 11 конденсацией с триэтиленгликолем, либо монометиловым эфиром триэтиленгликоля с последующим деблокированием 3',5'-ацетильных групп действием водного раствора аммиака (схема 9) без выделения промежуточного соединения. Нуклеозиды 10а,Ь очищали хроматографией на обращенно-фазовом силикагеле в градиенте концентраций этанола в воде (0—>5%). Выход продуктов составил 74% и 61%, соответственно.

он іоь

Схема 9. Синтез триэтиленгликолевых производных

Реагенты и условия: (і) триэтиленгликоль, DMF, 37 °С; (й) NH3/H2O; (iii) монометиловый эфир триэтиленгликоля, DMF, 37 °С.

Исследования стабильности и биологических свойств полученных соединений

Изучение стабильности и цитотоксичности полученных соединений проводилось в нашей лаборатории, изучение противотуберкулезной активности - сотрудниками Федерального государственного бюджетного учреждения Центрального научно-исследовательского института туберкулеза РАМН.

Стабильность. Для анализа стабильности соединений la-d, 2, 5, ба-с и 7а-с в условиях химического и ферментативного гидролиза применялся метод обращенно-фазовой ВЭЖХ. Соединения были устойчивы более 24 часов к химическому гидролизу при трех различных значениях рН: 2.2 (буферный раствор глицин-НС1); 7.4 (фосфатно-солевой буфер) и 9.0 (буферный раствор глицин-NaOH) и в фетальной сыворотке теленка.

Цитотоксичность 5-модифицированных производных нуклеозидов была изучена на культурах клеток Vera (линия клеток почки африканской зеленой мартышки), Jurkat (линия лейкемических Т лимфоцитов человека) и А549 (линия клеток легочной аденокарциномы человека). Для всех соединений, за исключением За-d, 4а и 4с значение CD50 было равно или превышало 100 мкг/мл (таблица 1), что близко к токсичности препаратов применяемых для лечения туберкулеза препаратов. Модификация по 3' или 5' положению углеводного фрагмента приводила к значительному увеличению токсичности.

Антимикобактериальное действие синтезированных соединений изучали с использованием автоматизированной системы Bactec MGIT960 [Franzblau, S.G. et al. 1998, J. Clin. Microbiol. 36, 362] определяя их бактериостатическую активность (концентрации, ингибирующих рост, МИК) по темпам роста двух штаммов М. tuberculosis: лабораторном штамме М. tuberculosis дикого типа H37Rv и клинического изолята MDR М. tuberculosis MS-115 устойчивого к действию противотуберкулезных препаратов первой линии. В качестве

контроля использовали рифампицин, изониазид, офлаксоцин. Растворимость изучаемых соединений в воде очень низкая, поэтому мы использовали разработанный нами ранее метод приготовления стоковых растворов [Matyugina, Е. et al. 2012, Bioorg. Med. Chem. 20, 6680]. Смесь использованных растворителей не влияла на рост М. tuberculosis.

Результаты исследования активности соединений, ингибирующих рост лабораторного штамма М. tuberculosis H37Rv представлены в таблице 1. Данные по ингибированию роста MDR-штамма М. tuberculosis MS-115 наиболее активных на штамме H37Rv соединений приведены в таблице 2.

Таблица 1. Токсичность и антитуберкулезная активность 5-модифицированных производных пиримидиновых 2'-дезоксинуклеозидов

,спн2,

N=k/

'CnHon

1-5

6,7

Соед п X Y Z CL>5„ (мкг/мл), клетки М1С5„ М1С«"

Vero ÁS40 Jurkat мкг/мл мкг/мл

1а 10 ОН он он >100 H.oL Н.о 36 40

Ib 11 он он он >100 90 70 17 20

1с 12 он он он >100 100 100 12 20

Id 14 он он он >100 Н.о Н.о Н.о 200

2 12 nh2 он он >100 45 37 Н.о 200

За 12 он N3 он 15 10 8 Н.о 200

ЗЬ 12 он nh2 он 50 8 7 28 >20

Зс 12 он NEt2 он 7.5 5 5 17 20

3d 12 он NHEt он 13 5 5 8 10

4а 12 он ОН I 70 >100 >100 5 10

4Ь 12 он он N, >100 20 18 7 10

4с 12 он он nh2 14 8 7 13 20

5" 12 он он он >100 45 40 12.5 20

6а 8 он он он >100 >100 >100 13 20

6Ь 10 он он он >100 100 100 6 10

6с 12 он он он >100 >100 >100 8 10

7а 8 nh2 он он >100 >100 >100 25 40

7Ь 10 nh2 он он >100 100 100 27 40

7с 12 nh2 он он >100 100 100 8 10

Рифампицин >500 Н.о Н.о 1

a MIC99 концентрации соединения, при которой рост микобактерии ингибируется на 99% Ъ а-аномер

с Н.о - не определялось

Было показано, что производные 2'-дезоксиуридина и 2'-дезоксицитидина с протяженными алкильными заместителями la-d и 2 эффективно ингибировали рост М. tuberculosis H37Rv.

Таблица 2. Влияние 5-модифицированных производных пиримидиновых нуклеозидов на рост штаммов М. tuberculosis H37Rv и MS-115 in vitro

Активность, мкг/мл

H37Rv MS-115

Соед. М1С99*, %ингибирования М1С99,

мкг/мл (концентрация, мкг/мл) мкг/мл

1с 20 100 (200,50), 50 (2) 50

ЗЬ >20 100 (200, 50, 20) 20

6Ь 10 100 (50, 20), 99 (10), 75 (5) 10

6с 10 100 (50), 99 (20, 10), 90(5) 10

7Ь 40 100 (50), 75(20) 50

7с 10 100 (50, 20), 99(10) 10

рифампицин 1 H.a.4 H.a.

изониазид 0,1 H.a. H.a.

офлоксацин* 2 100 (2) 2

а MiC.w концентрации соединения, при которой рост микобакгерий ингибируется на 99%. b H.a.: неактивен.

с Стрептомицин, этамбутол, пиразинамид также не обладали активностью на MDR штамме MS-115.

В литературе известно, что в ряду модифицированных модифицированных нуклеозидов, содержащих протяженные алкинильные заместители наблюдалась зависимость ингибирующих свойств от длины введенного заместителя [M.Johar et al, 2005 Biorg. Med. Chem. 13, 6663] В нашем случае это так же наблюдалось (Рис. 1).

конц. (мкг/мл)

Рис 1. Зависимость ингибирующей активности нуклеозидов от концентрации и длины цепи введенного заместителя.

1а- 5-децилоксиметил-2'-дезоксиуридин, Ib- 5-ундецилоксиметил-2'-дезоксиуридин, 1с- 5-додецилоксиметил-2'-дезоксиуридин, Id- 5-тетрадецилоксиметил-2'-дезоксиуридин.

5-Ундецил- и 5-додецилоксиметил-2'-дезоксиуридин Ib,с полностью ингибировали рост М. tuberculosis H37Rv в концентрации МИК99 = 20 мкг/мл. Соединения 1а и Id с заместителями меньшей и большей протяженности оказались слабыми ингибиторами

(МИК99=40 и 200 мкг/мл, соответственно). 5-Додецилоксиметил-2'-дезоксиуридин 1с также полностью ингибировал рост MDR М. tuberculosis MS-115 в концентрации МИК99 = 50 мкг/мл (табл. 2). 5-Додецилоксиметил-2'-дезоксицитидин 2 был значительно менее активен, чем производное 2'-дезоксиуридина 1с с таким же заместителем.

Для изучения зависимости влияния модификации углеводной части молекулы на ингибирующее действие соединений мы выбрали производные 2'-дезоксиуридина с 5-додецилоксиметильным заместителем 1с.

5-Додецилоксиметил-3'-азидо-2',3'-дидезоксиуридин За полностью ингибировал рост М. tuberculosis H37Rv только в концентрации 200 мкг/мл, что совпадает с данными полученными для 5-хлор- и 5-бром-3'-азидо-2',3'-дидезоксиуридина [Srivastav, N.C. et al. 2012, Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 1091]. По-видимому, основную роль в проявлении ингибирующих свойств в ряду производных 3'-азидо-2',3'-дидезоксиуридина играет введение алкильного заместителя в С5 положение остатка урацила. Аминогруппа в 3'-положении остатка 2'-дезоксирибозы приводила к значительному повышению анти-ТБ действия 5-додецилоксиметил-3'-амино-2',3'-дидезоксиуридина ЗЬ (МИК99 >20 мкг/мл). Это же соединение полностью ингибировало рост MDR-штамма М. tuberculosis MS-115 в концентрации 20 мкг/мл, однако оно обладало высокой цитотоксичностью. Высокотоксичные З'-ди- и моноэтиламиновые производные 5-додецилоксиметил-2',3'-дидезоксиуридина Зс и 3d также полностью ингибировали рост М. tuberculosis H37Rv при концентрациях 50 и 20 мкг/мл, соответственно. В связи с вышесказанным, использование 3'-аминопроизводных для дальнейней разработки противотуберкулезных препаратов представляются неперспективными.

В работах Ван Коленберга и соавт. показано, что нуклеозидные ингибиторы тимидинмонофосфаткиназы M.tuberculosis проявляли значительную анти-ТБ активность in vitro, причем 5'-дезокси-5'-7У-арилтиомочевинные производные а-тимидина наиболее эффективно ингибировали рост М. bovis и М. tuberculosis [Van Calenbergh, S. et al. 2012, Curr.Top.Med.Chem. 12, 694]. Представлялось целесообразным синтезировать 5'-модифицированные производные 5-додецилоксиметил-2',5'-дидезоксиуридина 4а-с и его а-аномер 5. Действительно, противотуберкулезная активность а- и ß-аномеров 5-додецилоксиметил-2'-дезоксиуридина 5 и 1с оказалась одинаковыми (МИК99=20 мкг/мл), Это обстоятельство свидетельствует в пользу того, что наличие заместителя при С-5, а не конфигурация в аномерном центре является принципиальным для противомикобактериального действия 5-алкилоксиметильных производных 2'-дезоксиуридина.

На штамме М. tuberculosis H37Rv все 5'-модифицированные соединения 4а-с продемонстрировали (Таблица 1) значительное ингибирующее действие (МИК99=10, 10 и 20 мкг/мл, соответственно). Среди соединений этой группы, 5'-азидо-производное 4Ь не проявило токсичности (CD5o>100 мкг/мл), в то время как 5'-1- и в особенности 5'-аминопроизводные 4а и 4с оказались более токсичными (CD5o=70 и 14 мкг/мл). Полученные данные свидетельствуют о возможности введения различных групп в 5'-положение углеводного фрагмента без потери противотуберкулезной активности, что делает такого рода модификации перспективными для дальнейших исследований. Отсутствие 5'-гидроксильной группы и, следовательно, невозможность фосфорилирования соединений данной группы предполагает механизм противотуберкулезного действия, не связанный с ингибированием тимидилатсинтазы М. tuberculosis. Более того, можно предположить, что и другие ферменты биосинтеза нуклеиновых кислот микобактерии, скорее всего, не являются их мишенями, поскольку все эти ферменты в той или иной степени используют 5'-позицию нуклеозида.

Наилучшее антитуберкулезное действие среди описываемых соединений продемонстрировали низкотоксичные 5-алкилтриазолилметильные производные 2'-дезоксипиримидиновых нуклеозидов (Таблицы 1 и 2).

Как и в случае алкилоксиметильных производных пиримидиновых 2'-дезоксинуклеозидов la-d, выявлена зависимость ингибирующей активности от длины углеводородного заместителя в 5 положении триазольного цикла.

В отличие от алкилоксиметильных производных la-d, значительную ингибирующую активность продемонстрировали 5-додецил- и 5-децилтриазолилметил-2'-дезоксиуридин ба и 6Ь, которые полностью ингибировали рост обоих штаммов М. tuberculosis (H37Rv и MS-115) при концентрациях 10 мкг/мл. Противотуберкулезная активность производных 2'-дезоксицитидина 7а-с в отношении штамма М. tuberculosis H37Rv оказалась близкой к активности аналогичных производных 2'-дезоксиуридина (МИК99=40, 40 и 10 мкг/мл, соответственно), при этом она значительно превышала активность 5-додецилоксиметил-2'-дезоксицитидина 2. Соединения 7Ь и 7с полностью ингибировали рост MDR-штамма М. tuberculosis MS-115 при концентрации 50 и 10 мкг/мл.

Пример результата типичных экспериментов по изучению влияния природы нуклеинового основания и размера заместителя при С-5 на динамику роста MDR-штамма представлены на рис. 2. На графике, построенном в автоматическом режиме программным комплексом системы ВАСТЕС, наибольший интерес представляет изменение времени начала фазы активного деления бактерий в зависимости от концентрации ингибитора (5, 10, 20 мкг/мл).

GU 45000 40000

35000

30000

25000

20000

15000

10000

5000

0

5 10 15 20 25 30 35 40 День эксперимента

Рис 2. Кинетические кривые роста (штамм MS-115) М. tuberculosis в присутствии соединений 6с и 7с при различных концентрациях. GU- единицы роста.

Среди модифицированных нуклеозидов, содержащих гидрофильные заместители, не оказалось соединений с высокой противотуберкулезной активностью. 5-[2-Карбоксиэтил-4-карбониламино-Дг-бутилоксиметнл]-2'-дезоксиуридин 9 ингибировал рост М. tuberculosis лишь при концентрации М1С99=50 мкг/мл, а триэтиленгликолевые производные 10а,b не проявляли активности даже в более высоких концентрациях. Этот факт свидетельствует в пользу предположения о важности гидрофобной группы в С-5 положении пиримидинового основания для проявления противотуберкулезной активности в ряду данной серии нуклеозидов.

Модифицированные нуклеотиды 8a-d были протестированы в реакции тимидилатсинтазы М. tuberculosis коллегами из Лёвенского Католического университета в Бельгии. В этой серии соединений лишь нуклеотид 8а ингибировал фермент, в то время как активность остальных оказалась незначительной.

Для выяснения возможной причины низкой ингибирующей активности производных в отношении тимидилатсинтазы было использовано компьютерное моделирование связывания тестируемых соединений с активным центром фермента. Докинг проводился с использованием программы "Molecular Operating Environment" (Chemical computing group Inc., 2012). Результат моделирования показал, что наличие объемной гидрофобной группы в С5 положении пиримидинового основания может препятствовать продуктивному связыванию. При этом можно предположить, что заместитель связывается в активном центре

главным образом благодаря гидрофобным взаимодействиям, а углеводный фрагмент располагается снаружи гидрофобной полости (рис 3).

Несколько аминокислот активного центра, такие как А^87, Ащ\01, 5сг105 и 01пЮ6 участвуя во взаимодействии с природным субстратом 5'-монофосфатом 2'-дезоксиуридина (сШМР, рис ЗВ) связываются с ним за счет нескольких водородных связей. Однако в нашем случае эти остатки включаются в гидрофобное взаимодействие, тем самым снижая связывание лиганда с ферментом (рис. ЗА).

Водородные'",

СВЯЗИ

Аг£95 Е

b,zuy

(А)

^ , 3 LrnlM

A"ä" е <= Гидрофобное взаимодействие

Рис. 3 Предположительная диаграмма связывания нуклеотида 8с (А) по сравнению с dUMP (В). Выполнена с использованием "Ligplot" [A.Wallace et al, Protein engineering, 8, 127].

Антибактериальные тесты проводились с целью расширения спектра возможного действия на другие микроорганизмы (исследование осуществлялось в Научно-исследовательском институте по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе). Изучалось влияние полученных соединений на семь грамположительных бактерий: Bacillus subtilis АТСС 6633, В. pumilis NCTC 8241, В. mycoides 537, Micrococcus luteus NCTC 8340, Leuconostoc mesenteroides ВКПМ B-4177 (штамм, устойчивый к гликопептидным антибиотикам группы ванкомицина), Staphylococcus aureus FDA 209Р (метициллин-чувствительный штамм, MSSA), S. aureus ИНА 00761 (метициллин-устойчивый штамм, MRSA), две грамотрицательные бактерии: Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, грибную культуру Aspergillus niger ИНА 00760 и дрожжи Saccharomyces cerevisiae RIA 259. Соединения la-c, 5 и ба-с не проявили заметной антимикробной активности на этих микроорганизмах. Исключением был а-аномер 5-додецилоксиметил-2'-дезоксиуридина 5, который в концентрации 95 мкг/мл обладал

антибиотическим действием в отношении одного из тест-организмов — L. mesenteroides ВКПМ В-4177. Такая избирательность может быть обусловлена строением клеточной стенки L. mesenteroides [Brooker, В. Е. 1977, J Bacteriol. 131, 288]. Антимикробная активность в отношении М. tuberculosis и ее практическое отсутствие в отношении других микроорганизмов является показателем избирательности исследуемых соединений, что особенно ценно для лекарственного препарата длительного применения.

выводы

1. Синтезированы две новые серии производных нуклеозидов, в которых протяженный алкильный заместитель введен в положение 5 пиримидинового основания через оксиметильную или триазолилметильную группы. Получено и охарактеризовано физико-химическими методами 57 новых соединений.

2. Ряд синтезированных соединений с близкой эффективностью ингибирует рост двух штаммов М. tuberculosis - лабораторный штамм дикого типа H37R.v и клинический изолят MDR штамма MS-115) устойчивый к действию пяти противотуберкулезных препаратов первой линии.

3. Проведены модификации активных С5-замещенных производных в 3'- и 5'- положениях нуклеозида. Показано, что модификации не оказывают значительного влияния на противотуберкулезную активность соединений, но увеличивают их цитотоксиченость.

4. Элиминация 5'-гидроксильной группы в 5-додецилоксиметил-2'-дезоксиуридине не приводит к падению противотуберкулезной активности. Можно предположить, что действие полученных соединений не связано с ингибированием ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот, поскольку все эти ферменты в той или иной степени используют 5'-позицию нуклеозида.

Основное содержание работы отражено в публикациях

1. E.R. Shmalenyuk. L.N. Chernousova, I.L. Karpenko, S.N. Kochetkov, T.G. Smirnova, S.N. Andreevskaya, A.O. Chizhov, O.V. Efremenkova, L.A. Alexandrova

«Inhibition of Mycobacterium tuberculosis strains H37Rv and MDR MS-115 by a new set

of C5 modified pyrimidine nucleosides»

Bioorganic & Medicinal chemistry, 2013, 21, 4874-4884

2. Э.Р. Шмаленкж. C.H. Кочетков, JI.A. Александрова

«Новые ингибиторы роста M.tuberculosis на основе модифицированных пиримидиновых нуклеозидов и их аналогов» Успехи химии, 2013, 82, 896-915

3. JI.A. Александрова, Э.Р. Шмаленкж. С.Н. Кочетков, В.В. Ерохин, Т.Г. Смирнова, С.Н. Андреевская, JI.H. Черноусова

«Новые 5-модифицированные пиримидиновые нуклеозиды — ингибиторы роста

микобактерий»

Acta Naturae, 2010, 3, 89-92

Заявка на патент

4. JI.A. Александрова, Э.Р. Шмаленюк. Карпенко И.Л., Иванов М.А., Кочетков С.Н., Т.Г. Смирнова, С.Н.Андреевская, JI.H. Черноусова

«Новые 5-модифицированные пиримидиновые нуклеозиды — ингибиторы роста Mycobacterium tuberculosis» №2013102487 ot21.01.2013

Тезисы

5. E.R. Shmalenyuk. L.A. Alexandrova

«Inhibition of M.tuberculosis by a set of pyrimidine nucleoside derivatives bearing extended substitutients»

Первая Российская конференция по медицинской химии, Москва, 2013

6. E.Shmalenvuk. I.Karpenko, S.Kochetkov, T.Smirnova, S.Andreevskaya, L.Chernousova, O.Efremenkova, L.Alexandrova

«New nucleoside inhibitors of M.tuberculosis growth»

38'th FEBS Congress (Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ 2013. Биологические механизмы), Санкт-Петербург, 2013

7. E.R. Shmalenvuk. I.L. Karpenko, T.G. Smirnova, S.N. Andreevskaya, L.N. Chernousova, L.A. Alexandrova

«Application of click chemistry approach on synthesis of potent nucleoside inhibitors of Mycobacterium tuberculosis growth»

Abstract book. XX International Roundtable of Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Montreal, 2012, 1

8. Э.Р. Шмаленнж, JI.A. Александрова, Л.Н. Черноусова «Синтез новых нуклеозидов с антитуберкулезной активностью»

Вестник ВолгГМУ. Материалы IV Всеросийского научно-практического семинара молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск лекарственных стредств», 2012, 86

9. E.R. Shmalenvuk. М.А. Ivanov, I.L. Karpenko, L. A. Alexandrova

«Synthesis and some biological properties of 5'-alkoxymethyl derivatives of 2'-

deoxyuridine 5'-phosphonates»

Chemistry of nucleic acid components, 2011, 12, 457

10. M.A. Ivanov, I.L. Karpenko, E.R. Shmalenvuk. L.A. Alexandrova «New а/р/га-thymidine 5'-phosphonate derivatives» Chemistry of nucleic acid components, 2011, 12, 342

11.E.S. Matyugina, E.R. Shmalenvuk. A.L. Khandazhinskaya, T.G. Smirnova, S.N. Andreevskaya, L.N. Chernousova, L.A. Alexandrova

«Synthesis of new 5-substituted pyrimidine nucleosides as potential inhibitors of M. tuberculosis»

Abstract book. XIX International Roundtable of Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Leon, 2010, 120

12. E. Матюгина, Э. Шмаленюк. А. Хандажинская, Т. Смирнова, С. Андреевская, Л. Черноусова, Л. Александрова

«Дизайн и изучение новых производных нуклеозидов как ингибиторов микобактерий»

Наука и инновации в модернизации России и развитии мира, 2010, 140

Заказ № Ш-Р/10/2013 Подписано в печать 28.10.13 Тираж 90 экз. Усл. пл. 1,0

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Шмаленюк, Эдуард Ренатович, Москва

На правах рукописи

04201450239

Шмаленюк Эдуард Ренатович

СОЗДАНИЕ ИНГИБИТОРОВ РОСТ А MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ

НУКЛЕОЗИДОВ

03.01.03 Молекулярная биология

Научный руководитель: кандидат химических наук, JLA. Александрова

Москва 2013

1 СОДЕРЖАНИЕ

1 СОДЕРЖАНИЕ............................................................................................................................................2

2 ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................5

3 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.............................................................................................................................7

3.1 Производные пиримидиновых нуклеозидов................................................................................................9

3.2 Ациклические и карбоциклические аналоги пиримидиновых нуклеозидов...............................................21

3.3 Направленный синтез нуклеозидных ингибиторов ферментов микобактерий............................................26

3.3.1 Ингибиторы тимидинмонофосфаткиназы..............................................................................26

3.3.2 Ингибиторы тимидилатсинтазы.............................................................................................44

3.4 Заключение.................................................................................................................................................49

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..................................................................................................................51

4.1 Синтез 5-модифицированных производных пиримидиновых 2'-дезоксинуклеозидов.............................52

4.2 Синтез производых 2'-дезокси-5-додецилоксиметилуридина, модифицированных по углеводному фрагменту..............................................................................................................................................................54

4.2.1 Синтез З'-азидо и З'-аминопроизводных 2'-дезокси-5-додецилоксиметилуридина.............54

4.2.2 Синтез 5'-производных 2'-дезокси-5-додецилоксиметилуридина..........................................55

4.3 Получение альфа-аномера 2'-дезокси-5-додецилоксиметилуридина........................................................56

4.4 5-алкилтриазолидометильные производные 2'-дезоксиуридина и цитидина...........................................57

4.5 Получение монофосфатов С-5 модифицированных пиримидиновых нуклеозидов..................................58

4.6 Синтез гидрофильных производных С-5 модифицированных нуклеозидов...............................................60

4.7 Результаты биологических исследований..................................................................................................62

4.7.1 Противотуберкулезная активность........................................................................................62

4.7.2 Антибактериальное действие...................................................................................................68

4.7.3 Компьютерное моделирование связывания нуклеотида в активном центре фермента ТИуХ .........................................................................................................................................................68

4.7.4 Цитотоксичность........................................................................................................................69

4.7.5 Стабильность...............................................................................................................................70

4.8 Заключение.................................................................................................................................................70

5 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ................................................................................................................72

5.1 Общий метод синтеза 5-алкилоксиметил-3',5'-ди-0-ацетил-2'-дезоксиуридинов(12а-о, 16)..................72

5.1.1 5-Децилоксиметил-3',5'-ди-0-ацетил-2'-дезоксиуридин (12а)................................................72

5.1.2 5-Ундецилоксиметил-3',5'-ди-0-ацетил-2'-дезоксиуридин (12Ь)............................................73

5.1.3 5-додецилоксиметил-3',5'-ди-0-ацетил-2'-дезоксиуридин (12с)............................................73

5.1.4 5-додецилоксиметил-5'-0-ацетил-3'-азидо-2'-дезоксиуридин (16)........................................73

2

5.2 Общий метод деблокирования 5-модифицированных производных уридина (12а-с, 16 и 19а-с).............74

5.2.1 5-Децилоксиметил-2'-дезоксиуридин (1а).................................................................................74

5.2.2 5-Ундецилоксиметил-2'-дезоксиуридин (1Ь)..............................................................................74

5.2.3 5-додецилоксиметил-2'-дезоксиуридин (1с)..............................................................................75

5.2.4 5-додецилоксиметил-3'-азидо-2',3'-дидезоксиуридин (За)......................................................75

5.2.5 5-Октилтриазолидометил-2'-дезоксиуридин (6а)...................................................................75

5.2.6 5-Децилтриазолидометил-2'-дезоксиуридин (6Ь)....................................................................76

5.2.7 5-Додецилтриазолидометил-2'-дезоксиуридин (6с)................................................................76

5.3 Общий метод синтеза 5-модифицированных производных 2'-дезоксицитидина (2 и 7а-с)......................77

5.3.1 5-додецилоксиметил-2'-дезоксицитидин (2)............................................................................77

5.3.2 5-Октилтриазолидометил-2'-дезоксицитидин (7а)...............................................................78

5.3.3 5-Децилтриазолидометил-2'-дезоксицитидин (7Ь)................................................................78

5.3.4 5-Додецилтриазолидометил-2'-дезоксицитидин (7с).............................................................78

5.4 3'-Амино-2',3'-дидезокси-5-додецилоксиметилуридин (Зв).....................................................................79

5.5 3'-Диэтиламино-2',3'-дидезокси-5-додецилоксиметилуридин (Зс) и 3'-этиламино-2',3'-дидезокси-5-додецилоксиметилуридин (Зо).............................................................................................................................79

5.5.1 3'-Диэтиламино-2',3'-дидезокси-5-додецилоксиметилуридин (Зс)........................................80

5.5.2 3'-зтиламино-2',3'-дидезокси-5-додецилоксиметилуридин (3с1)............................................80

5.6 2'-дезокси-5'-йодо-5-додецилоксиметилуридин (4а)...............................................................................80

5.7 2'-дезокси-5'-азидо-5-додецилоксиметилуридин (4в)..............................................................................81

5.8 2'-дезокси-5'-амино-5-додецилоксиметилуридин (4с).............................................................................82

5.9 2'-дезокси-5-додецилоксиметил-а-уридин (5)...........................................................................................82

5.10 Общий метод получения 5-алкилтриазолидометил-3',5'-ди-0-ацетил-2'-дезоксиуридинов (19а-с) ..83

5.10.1 5-Октилтриазолидометил-3',5'-ди-0-ацетил-2'-дезоксиуридин (19а).................................83

I

5.10.2 5-Децилтриазолидометил-3',5'-ди-0-ацетил-2'-дезоксиуридин (19Ь)..................................83

5.10.3 5-Додецилтриазолидометил-3',5'-ди-0-ацетил-2'-дезоксиуридин (19с)..............................84

5.11 Общий метод синтеза З'-ацетильных производных (20а-о)..................................................................84

5.11.1 5-Децилоксиметил-3'-0-ацетил-2'-дезоксиуридин (20а).........................................................84

5.11.2 5-Ундецилоксиметил-3'-0-ацетил-2'-дезоксиуридин (20Ь).....................................................84

5.11.3 5-Додецилоксиметил-3'-0-ацетил-2'-дезоксиуридин (20с).....................................................85

5.11.4 5-[(4-Октил)-1,2,3-триазол-1-ил]метил-3'-0-ацетил-2'-дезоисиуридин (20д).....................85

5.12 Общий метод синтеза 5'-монофосфат производных (8а-о)..................................................................85

5.12.1 5-Децилоксиметил-2'-дезоксиуридин 5'-монофосфат (8а).....................................................86

5.12.2 5-Ундецилоксиметил-2'-дезоксиуридин 5'-монофосфат (8Ь).................................................86

5.12.3 5-Додецилоксиметил-2'-дезоксиуридин 5'-монофосфат (8с).................................................86

5.12.4 5-[(4-Октил)-1,2,3-триазол-1-ил]метил-3'-0-ацетил-2'-дезоксиуридин 5'-монофосфат (86) .........................................................................................................................................................87

5.13 5-(4-аминобутил)-оксиметил-2'-дезоксиуридин (21)...........................................................................87

5.14 5-(1-карбоксиэтил-4-карбониламино-Л/-бутилоксиметил)-2'-дезоксиуридин (9)................................88

5.15 Общий метод синтеза гликолевых производных 10а,в.........................................................................88

5.15.1 5-(2,5,8-триокса-10-гидроксидецил)-2'-дезоксиуридин (10а)...................................................89

5.15.2 5-(2,5,8,11-тетраоксадодецил)-2'-дезоксиуридин (10Ь)...........................................................89

6 ВЫВОДЫ..................................................................................................................................................90

7 БЛАГОДАРНОСТИ....................................................................................................................................91

8 ПРИЛОЖЕНИЕ..........................................................................................................................................92

8.1 Химическая и ферментативная стабильность соединений.........................................................................92

8.2 Эксперименты в клеточных культурах.........................................................................................................92

8.2.1 Цитотоксичность........................................................................................................................92

8.2.2 Противотуберкулезные тесты.................................................................................................93

8.2.3 Штаммы тест-организмов для определения антибиотического действия......................94

9 ЛИТЕРАТУРА............................................................................................................................................95

2 ВВЕДЕНИЕ

В 20 веке созданы эффективные антибиотики и противовирусные препараты, позволившие значительно снизить смертность от инфекционных заболеваний. Однако к настоящему времени большинство патогенных микроорганизмов и вирусов выработали резистентность к основному пулу используемых для их терапии лекарств, что делает необходимым поиск новых классов соединений, ингибирующих рост патогенных бактерий и вирусов [1].

Туберкулез (ТБ) занимает второе после СПИД место в мире среди причин смертности от инфекционных заболеваний, ежегодно убивая 1,4-2 миллиона человек. Появление новых штаммов возбудителя туберкулеза М. tuberculosis «с множественной лекарственной устойчивостью» (MDR) и практически неизлечимого «экстенсивно лекарственно устойчивого», на которые стандартные схемы химиотерапии практически не действуют, вызывает настоятельную необходимость создания новых противотуберкулезных препаратов. К настоящему времени выделено из природных объектов и синтезировано значительное число новых соединений, подавляющих рост М. tuberculosis, многие из которых проходят клинические испытания [2][3][4] однако с 70-х годов прошлого века новых противотуберкулезных препаратов в медицинскую практику введено не было. Очевидно, что существует острая необходимость в принципиально новых лекарствах, действующих на новые мишени и активных в отношении резистентных штаммов.

Только в последнее десятилетие появились сообщения о нескольких группах модифицированных нуклеозидов, продемонстрировавших на экспериментальных моделях in vitro заметное противотуберкулезное действие [5], однако в литературе отсутствуют сведения об их клинических испытаниях.

Все вышесказанное обосновывает необходимость создания принципиально

новых противотуберкулезных препаратов, обладающих направленностью действия

и низкой токсичностью в отношении организма человека. Одним из

привлекательных классов соединений такого рода являются производные

природных нуклеозидов, хорошо зарекомендовавшие себя ранее в качестве

5

антивирусных и антираковых препаратов [6]. Противотуберкулезная активность нуклеозидов до недавнего времени не была выявлена. Только в начале 21 века появились сообщения о нескольких группах модифицированных нуклеозидов, продемонстрировавших заметное антимикобактериальное действие in vitro [7] [8]. В частности, 5-модифицированные пиримидиновые нуклеозиды с протяженными 1-алкинильными заместителями обладают ингибирующей активностью в отношении М. tuberculosis, М. avium, и М. bovis.

Целью данной работы явился синтез нового типа 5-модифицированных пиримидиновых нуклеозидов, изучение их свойств и способности in vitro ингибировать рост М. tuberculosis.

В ходе выполнения настоящей работы решались следующие задачи:

• разработка общей стратегии синтеза производных пиримидиновых 2'-дезоксинуклеозидов, содержащих в положении 5 гетероциклического основания протяженные алкилоксиметильные, либо алкилтриазолилметильные заместители;

• разработка рациональных методов синтеза 3'- и 5'- модифицированных производных 5-додецилоксиметил-2'-дезоксиуридина для исследования влияния заместителей в углеводном фрагменте нуклеозида на противотуберкулезную активность и цитотоксичность;

® синтез ряда монофосфатов модифицированных нуклеозидов с целью проверки ингибирующей активности в отношении потенциального фермента-мишени тимидилатсинтазы М. tuberculosis',

• анализ результатов изучения способности полученных нуклеозидных производных ингибировать рост in vitro двух штаммов М. tuberculosis — лабораторного штамма дикого типа H37R.V и клинического изолята MDR М. tuberculosis MS-115, устойчивого к действию пяти противотуберкулезных препаратов первой линии (исследование противотуберкулезной активности проводилось в Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза, РАМН).

3 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Туберкулез (ТБ) — инфекционное заболевание, сопровождающее человечество, по-видимому, со времен возникновения Homo sapiens как вида; возможно даже, что ТБ унаследован человечеством еще от ранних гоминид [9]. Со времен идентификации Р. Кохом в 1882 году этиологического агента заболевания — бациллы М. tuberculosis разработка лекарственных средств терапии ТБ остается одной из приоритетных задач фармакологии и медицинской химии. При этом в латентной форме болезнь себя не проявляет и незаразна. Только 5— 10% лиц, инфицированных латентной формой, заболевают туберкулезом в течение жизни.

Свыше 95% случаев инфицирования и 98% летальных исходов от ТБ приходится на развивающиеся страны. ТБ является основной оппортунистической инфекцией у ВИЧ-инфицированных лиц, что значительно повышает риск прогрессирования ВИЧ-инфекции и развития летального исхода. Заражение ВИЧ повышает шанс активации латентной формы М. tuberculosis [10], и в то же время вызывает быстрое развитие болезни вскоре после инфицирования [11]. ТБ может быть вызван не только М. tuberculosis, но и другими микроорганизмами, в первую очередь микобактериями М. avium и М. bovis (на основе последней создана применяемая для вакцинации от ТБ бацилла БЦЖ, которая имеет более 98% гомологии с М. tuberculosis) [12]. Эти микобактерии часто изолируют у ВИЧ-инфицированных [13] [14].

Большинство лекарств, применяемых в настоящее время, были созданы в 50-х и 60-х годах прошлого века. В современной классификации противотуберкулезные препараты принято разделять на два ряда в зависимости от переносимости и клинической эффективности. К первому ряду относятся изониазид, рифампицин, стрептомицин, пиразинамид и этамбутол; ко второму — этионамид, протионамид, циклосерин, амикацин, капреомицин, канамицин, офлоксацин, ципрофлоксацин и параминосалициловая кислота. Препараты второго ряда слабее, но токсичнее, поэтому применяются только в случаях, когда у пациента наблюдается резистентность к препаратам первого ряда. На рис. 1 схематично представлена

микобактерия и традиционные мишени антитуберкулезных препаратов, механизм действия которых включает ингибирование разнообразных биологических процессов, таких, как биосинтез белков, нуклеиновых кислот, клеточной стенки или изменение мембранного потенциала клетки [15].

Рис. 1 Мишени действия применяемых противотуберкулезных препаратов

Современная противотуберкулезная терапия, включающая

многокомпонентные коктейли лекарств, представляет собой продолжительный курс не менее 6—9 месяцев. Схемы лечения ТБ часто включают производные природных соединений, относящихся к разным классам органических веществ: фенолам, хинонам, пептидам, углеводам, стероидам, алкалоидам, терпенам и др. (см. обзоры[16][17]). В настоящее время значительное число новых соединений проходят клинические испытания (см. обзоры[2][3][4]).

Проблема создания лекарственных препаратов для лечения туберкулеза осложняется возникновением лекарственно-устойчивых штаммов М. tuberculosis: практически неизлечимого штамма с широкой лекарственной устойчивостью

(XDR) и с множественной лекарственной устойчивостью (MDR), на которые

8

Клеточная стенка

рифампицин

фторхинолоны

<—РНК-.........>

полимераза

Метаболизм фолата

мРНК.

Рибосома

Клеточная I , стенка у

Синтез клеточной стенки.

изониазид циклосерин этамбутол

сульфаниламиды п-аминосалициловая кислота

диаминопиримидины

пиразинамид даптомицин?

Энергетический баланс

макролиды

Репликация Транскрипция

аминогликозиды (стрептомицин, канамицин)

Трансляция

стандартные схемы химиотерапии практически не действуют. Очевидно, что существует острая необходимость в принципиально новых лекарствах, действующих на новые мишени и активных в отношении резистентных штаммов.

Терапия вирусных инфекций и онкологических заболеваний часто основывается на использовании производных природных нуклеозидов [6], однако противотуберкулезная активность последних до недавнего времени не была выявлена. Только в последнее десятилетие появились сообщения о нескольких группах модифицированных нуклеозидов, продемонстрировавших на экспериментальных моделях заметное противотуберкулезное действие. Для получения этих соединений использовался широкий набор современных методов биоорганической химии.

В литературном обзоре рассмотрены способы синтеза и противотуберкулезная активность модифицированных пиримидиновых нуклеозидов и их аналогов. Эта тематика в значительной степени только «становится на ноги», ее изучением занимается относительно небольшой круг исследователей. Обзор был сознательно ограничен описанием только производных пиримидиновых нуклеозидов, поскольку противотуберкулезной активности производных пуриновых нуклеозидов посвящены подробные работы, в первую очередь синтезу и исследованию аналогов сульфамоил-аденозина — ингибитора биосинтеза сидерофоров — переносчиков железа, необходимого для выживания микобактерий [18][19].

3.1 Производные пиримидиновых нуклеозидов

Первая работа в этой област�