Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антибактериальное, в том числе антимикобактериальное, действие экзогенного кардиолипина

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Антибактериальное, в том числе антимикобактериальное, действие экзогенного кардиолипина"

На правах рукописи

Микулович Юлия Львовна

АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ, В ТОМ ЧИСЛЕ АНТИМИКОБАКТЕРИАЛЬНОЕ, ДЕЙСТВИЕ ЭКЗОГЕННОГО КАРДИОЛИПИНА

Специальности 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 6 МАЙ 2013

Москва-2013

005058380

005058380

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного университета тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова

Научные руководители:

кандидат химических наук, доцент

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник

Сорокоумова Галина Моисеевна Селищева Алла Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, зав. лабораторией химии липидов Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Водовозова Елена Львовна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Учреждения Российской академии наук

Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Дерябина Юлия Ивановна

Ведущая организация: Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита диссертации состоится «03» июня 2013 года в 15 ч 00 мин на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, проспект Вернадского, д. 86.

Автореферат диссертации разослан « Л9 » апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник

А.И. Лютик

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*

Актуальность темы. Несмотря на то, что к настоящему времени известно большое количество антибиотиков, борьба с туберкулезом (ТБ) до сих пор не окончена. Это связано со способностью возбудителя ТБ - Mycobacterium tuberculosis (МБТ) - переходить в дормантное (некультивируемое состояние), формируя латентную инфекцию, и приобретать резистентность к противотуберкулезным препаратам (ПТП). Эти факторы осложняют диагностику заболевания и его лечение. Схема терапии ТБ включает в себя прием одновременно нескольких ПТП в течение длительного периода времени, что сопровождается появлением у пациентов побочных эффектов. Кроме того, многие ПТП токсичны для организма человека, а лечение больных, зараженных резистентными штаммами МБТ, оказывается малоэффективным. Ввиду указанных выше недостатков ПТП актуальной является разработка принципиально новых лекарственных препаратов на основе природных наноразмерных липидных структур - липосом, которые легко захватываются фагоцитирующими клетками человека, в том числе макрофагами, в которых размножаются микобактерии туберкулеза (Bermudez L.E. et al., 1994; Kwon H.H. et al., 1995). Таким образом, с помощью липосом можно осуществить направленный транспорт лекарственных препаратов. Кроме того, минимальные ингибирующие концентрации (МИК) липосомальных форм ПТП в несколько раз меньше МИК традиционных форм препаратов (Mehta et al., 1993; Wiens et al., 2003). Как правило, липосомы с включенными в них препаратами получают на основе фосфатдилихолина (ФХ), который присутствует также в плазматической мембране фагоцитирующих клеток человека.

Ранние работы нашей лаборатории были посвящены изучению влияния «пустых» (не содержащих антибиотик) липосом различного липидного состава (из ФХ, кардиолипина (KJI), гликосфинголипидов) на рост Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Сорокоумова Г.М. и др., 2009). Было показано, что липосомы из KJI сами по себе обладают ингибирующим действием на рост этого микроорганизма. В связи с полученными результатами важным представлялось изучение действия липосомального КЛ на различные штаммы М. tuberculosis с перспективой создания новых форм

Список используемых сокращений: АФК - активные формы кислорода, БОЛВ - большие одноламеллярные везикулы (липосомы), ДК - диеновые конъюгаты, JIK — линолевая кислота, KJI - кардиолипин, лКЛ - лизокардиолипин, ллКЛ - бислизокардиолипин, Люц - люцигенин, Люц-ХЛ - люцигенин-активируемая хемилюминесценция, МИК - минимальная ингибирующая концентрация, МЛВ - мультиламеллярные везикулы, мРНК - матричная РНК, МЛУ - множественная лекарственная устойчивость, МБТ - микобактерии туберкулеза, Mycobacterium tuberculosis; ОЕФ - оптические единицы флуоресценции, ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, ПТП - противотуберкулезные препараты, САР - супероксид анион-радикалы, ТБ - туберкулез, ТБК - 2-тиобарбитуровая кислота, ТБК-АП - ТБК-активные продукты, топо I - топоизомераза I, ТСХ - тонкослойная хроматография, ФК - фосфатидная кислота, ФХ - фосфатидилхолин, ШЛУ - широкая лекарственная устойчивость, ERM - эритромицин, GSH — глутатион, MALDI-TOF MS - матрично активированная лазерная десорбция/ионизация времяпролетная (time of flight) масс-спектрометрия, OD - оптическая плотность (optical density), OFX - офлоксацин, LFX - левофлоксацин, RIF - рифампицин, SkQlH2 - Ю-(б'-пластохинонил)-децилтрифенилфосфоний.

лекарственных препаратов для лечения туберкулеза путем инкапскулирования в липосомы на основе KJI известных на сегодняшний день ПТП.

Цель работы - изучение антибактериальной активности экзогенного липосомального KJ1 в отношении различных бактерий, в том числе М. tuberculosis, и установление возможных механизмов бактерицидного действия KJI.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• получение и характеристика липосом на основе КЛ - липида природного происхождения, выделенного из сердца быка;

• оценка влияния липосомального KJI на рост чувствительного к ПТП лабораторного штамма М. tuberculosis H37Rv;

• исследование действия липосом из KJI на рост резистентных к ПТП клинических штаммов М. tuberculosis (с множественной (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ));

• изучение влияния липосомального KJI на рост грамотрицательных и грамположительных бактерий, не относящихся к роду Mycobacterium;

• исследование стабильности липосом на основе KJI в условиях роста М. tuberculosis (степень окисления липида, деструкция);

• выявление мишеней и механизма бактерицидного действия экзогенного липосомального KJI на Е. coli.

Научная новизна работы. Впервые исследовано влияние липосом из КЛ на рост бактерий: Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae и Escherichia coli. Установлено бактерицидное действие КЛ на чувствительный к ПТП штамм М. tuberculosis H37Rv и штаммы М. tuberculosis с МЛУ и ШЛУ (МИК = 335 мкМ), а также на E.coli (МИК = 500 мкМ) и Streptococcus pneumoniae (МИК =100 мкМ).

Изучена стабильность препарата КЛ в виде липосом (степень окисления липида и образование продуктов его деструкции). Обнаружено несущественное окисление КЛ в течение 30 ч при комнатной температуре и в процессе инкубации КЛ в среде роста М. tuberculosis (бульоне Дюбо). В последнем случае установлен факт деструкции КЛ с образованием лизокардиолипина (лКЛ), бислизокардиолипина (ллКЛ), фосфатидной (ФК) и линолевой кислот (ЛК), идентифицированных методами ТСХ и MALDI-TOF MS.

Впервые обнаружено многофакторное воздействие экзогенного липосомального КЛ на различные системы клеток Е. coli: ингибирование реакций, катализируемых ДНК-топоизомеразой II типа (ДНК-гираза), in vitro; индукция системы ДНК-репарационного SOS-ответа; повышение содержания в клетках супероксид анион-радикалов (САР).

Предложена схема бактерицидного действия липосом из КЛ на Е. coli, основанного на повреждении ДНК бактерий вторичными активными формами кислорода.

Практическая значимость работы. Установлен бактерицидный эффект экзогенного липосомального КЛ в отношении ряда микроорганизмов и прежде всего М. tuberculosis. Самым существенным является то, что такой активностью КЛ обладает не только в отношении чувствительного к ПТП штамма М. tuberculosis, но и штаммов с МЛУ и ШЛУ. Это открывает реальные возможности создания новых эффективных липосомальных форм

4

ПТП на основе КЛ для лечения резистентных форм ТБ: включение в липосомы из KJI известных на сегодняшний день ПТП может снизить концентрацию используемой активной субстанции, благодаря чему уменьшится токсичность препарата, и повысить эффективность действия липосомальной формы препарата на патогенные штаммы, нечувствительные к антибиотикам.

Основные положения, выносимые на защиту:

• характеристика полученных липосом из КЛ;

• бактерицидный эффект экзогенного липосомального КЛ в отношении лабораторного штамма М. tuberculosis H37Rv, чувствительного к ПТП, а также штаммов с МЛУ и ШЛУ в концентрациях выше 335 мкМ.

• действие липосом из КЛ на рост грамположительных бактерий, вызывающих инфекции верхних дыхательных путей, - Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae - и грамотрицательных на примере Escherichia coli. Антибактериальная активность КЛ в отношении Str. pneumoniae и Е. coli;

• деструкция липосомального КЛ в условиях роста М. tuberculosis с образованием лКЛ, ллКЛ, ФК и ЛК. Получение продуктов деструкции, их выделение и очистка. Использование полученных липидов для изучения их влияния на рост М. tuberculosis H37Rv;

• выявление механизма действия экзогенного липосомального КЛ на Е. coli:

а) индукция системы ДНК-репарационного SOS-ответа при культивировании Е. coli с липосомами из КЛ; отсутствие влияния липосомального КЛ на скорость трансляции белков; б) установление причин повреждения ДНК под действием летальных концентраций КЛ.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Россия, г. Москва, 2010); European Respiratory Society Annual Congress (Испания, г. Барселона, 2010); I и II международных научно-практических конференциях «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Россия, г. Москва, 2010; респ. Татарстан, г. Казань, 2012); VI и VII Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, г. Москва, 2011 и 2013); международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Россия, г. Москва, 2012).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 оригинальные статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, и 8 тезисов в материалах международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, материалов и методов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего j-t2 источников. Работа изложена на -/«ЗХ

страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 рисунками и содержит ХЗ таблиц.

Работа выполнена при финансовой поддержке и в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» Федерального агентства по образованию (ГК № П2277, ГК № 14.740.11.0120 и Соглашение с МОН РФ № 14.В 37.21.0193).

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранной темы диссертации, сформулирована цель и в соответствии с ней поставлены задачи исследования, указаны научная новизна и практическая значимость работы, количество публикаций и конференции, на которых были представлены основные результаты работы.

Глава 1. Обзор литературы

Обзор литературы состоит из трех разделов: в первом рассмотрено строение клеточной оболочки двух основных объектов исследования - бактерий М. tuberculosis и Е. coli, общим компонентом цитоплазматической мембраны которых является фосфолипид KJI; во втором освещены физико-химические свойства, метаболизм и роль фосфолипида КЛ в клетках бактерий. Акцентировано внимание на неравномерном распределении KJI с образованием доменов в цитоплазматической мембране, что связано с участием KJI в репликации ДНК и делении клеток. В третьем разделе обсуждены известные на сегодняшний день основные группы антибиотиков, их мишени и механизмы действия.

Глава 2. Материалы и методы исследования

В работе использовали динатриевую соль KJI из сердца быка, в состав которого входят остатки линолевой (~87%) и олеиновой (~8%) кислот, степень чистоты 98% по данным ВЭЖХ («Avanti Polar Lipids», США), ЛК («Acros Organics», Бельгия), ФХ из бобов сои Lipoid S-100, степень чистоты 94% по данным ВЭЖХ («Lipoid GmbH», Германия), в составе которого содержатся преимущественно остатки ЛК (~70%), плазмиду pUC19 («Invitrogene», США), топоизомеразу I из E.coli («New England Biolabs», США), ДНК-гиразу из E.coli, предоставленную доктором Энтони Максвеллом («John Innés Centre», UK), люцигенин («Sigma», США).

В качестве объектов исследования использовали следующие микроорганизмы: штаммы М. tuberculosis с различной чувствительностью к ПТП: лабораторный штамм М. tuberculosis H37Rv (чувствительный к ПТП); штамм М. tuberculosis MS-115, устойчивый к пяти ПТП 1-го ряда: рифампицину, изониазиду, стрептомицину, пиразинамиду и этамбутолу (МЛУ); штамм М. tuberculosis CS-37, резистентный, кроме перечисленных выше ПТП 1-го ряда, еще и к амикацину, капреомицину, офлоксацину (ШЛУ) (из коллекции ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН); грамположительные бактерии: штамм Staphylococcus aureus АТСС № 25923 (F-49), ГКПМ 201189; штамм Staphylococcus epidermidis 817/5 (клинический изолят из коллекции ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора); штамм Streptococcus pyogenes 23-10 (клинический изолят, ГКБ-23, Москва); штамм Streptococcus pneumoniae 101 (клинический изолят, Инфекционный Центр Агентства Общественного Здравоохранения, Лондон,

Великобритания); грамотрицательные бактерии штаммы Escherichia coli BL21(DE3), CSH50 XsflA::lacZ\ AtolC, трансформированный плазмидами pRFPCER-TrpL2A и pRFPCER-PsulA.

Получение липосом. Липосомы (большие одноламеллярные везикулы, БОЛВ) из КЛ получали методом экструзии (MacDonald R.C. et al., 1991) дисперсии КЛ в 0,9% NaCl (изотонический раствор NaCl) с использованием экструдера «LiposoFast Basic» («Avestin, Inc.», США) и поликарбонатных мембран с диаметром пор 400 и 100 нм («Whatman», США). Размер частиц определяли методами турбидиметрии (Кленин В.И. и др., 1977) и фотонно-корреляционной спектроскопии, ^-потенциал измеряли методом электрофоретического светорассеяния.

Действие КЛ па рост М. tuberculosis. Влияние различных концентраций липосомального КЛ на рост МБТ определяли при культивировании клеток в модифицированной среде Middlebrook 7Н9 при 37°С в течение 20-42 суток в автоматизированной системе регистрации роста ВАСТЕС MGIT 960 («BD». США). Рост микобактериальных клеток оценивали в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ). Для оценки динамики роста культуры М. tuberculosis в бульоне Дюбо в присутствии липосом из КЛ использовали также метод количественной ПЦР (Андреевская С.Н. и др., 2006).

Жизнеспособность микобактерий оценивали их окраской по методу Мурохаши (Murohashi Т. et al., 1957). Просмотр мазков осуществляли на световом микроскопе Olympus при увеличении х400 и хЮОО. Также выживаемость клеток определяли методом ПЦР с обратной транскрипцией СО'Г-Г 11 IP) (Андреевская С.Н. и др., 2006) по количеству мРНК. Во всех экспериментах использовали клетки МБТ, находящиеся в одной фазе роста.

Влияние КЛ па рост стрептококков. стафилококков и Е. coli. Культивирование клеток стрептококков и стафилококков с липосомами из КЛ осуществляли в мясопептонном бульоне без перемешивания при 37°С в течение 24 ч, Е. coli BL21(DE3) с КЛ - в жидкой среде LB в течение 5 ч при 37°С при перемешивании 200 об/мин. Для оценки роста микроорганизмов использовали метод подсчета КОЕ (проводили серии 10-кратных разведений образцов, высевали их на агаризованную среду и подсчитывали число жизнеспособных клеток).

Определение степени окисления КЛ. Количество диеновых конъюгатов (ДК) определяли спектрофотометрически в этанольном растворе липида при Х=233 нм (Pryor W.A. et al., 1985), ТБК-активные продукты (ТБК-АП) определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Ланкин В.З. и др., 1975).

Идентификация продуктов деструкции КЛ методами ТСХ и MALDI-TOF MS. Продукты деградации КЛ были выделены методом экстракции системой растворителей СНС13-СН3ОН (2:1) из смеси, полученной после инкубации липосом на основе КЛ в среде Дюбо (конечная концентрация КЛ 500 мкМ) в течение 10 мин (0-ые сутки) и 2 суток. Состав липидного экстракта анализировали методом ТСХ на пластинках с флуоресцентным индикатором Kieselgel 60 F254 («Merck», Германия) в системе растворителей СНС13-СН30Н-Н20 (65:25:4) (А). Визуализацию соединений проводили при орошении пластинок раствором молибденового синего или фосфорномолибденовой

кислоты (проявители 1 и 2 соответственно) с последующим прогреванием при ~120°С. Идентифицировали вещества в общем липидном экстракте методом MALDI-TOF MS. Масс-спектры получали на MALDI-TOF масс-спектрометре Autoflex III TOF («Bruker Daltonics», Германия) в режиме детектирования положительных ионов; Ы2-лазер, 337 нм; матрица - 2,5-дигидроксибензойная кислота.

Получение лКЛ и ллКЛ проводили по модифицированной методике, изложенной в работе (Болдырев И.А. и др., 2009), с использованием лиофилизированного порошка кардиолипина из сердца быка и фосфолипазы Л2 из Naja mossambica mossambica («Sigma», США).

Получение ФК полусинтезом с использованием фосфолипазы D. Сначала получали препарат неочищенной фосфолипазы D (КФ 3.1.4.4), которую использовали для получения ФК гидролизом соевого ФХ (Бергельсон Л.Д. и др., 1981).

Получение суперскрученной ДНК Е. coli для реакций с топоизомеуазой I и ДНК-гиразой. Суперскрученную плазмиду pUC19 получали и выделяли щелочным лизисом по протоколу с помощью QIAGEN Plasmid Maxi Kit. Реакции с топоизомеразой I и ДНК-гиуазой Е. coli in vitro проводили при 37°С в твердотельном термостате «Гном», рассчитанном на микропробирки типа «Eppendorf» («ДНК-технология», Россия) по методикам (Mizushima Т. et al., 1992) и (Reece R.J. et al., 1989) соответственно. Исследование накопления никованной и линейной ДНК под действием КЛ в реакциях с mono I и ДНК-гиразой соответственно проводили по методике (Meddle J. G. et al., 2001).

Люи-ХЛ клеток Е. coli в присутствии КЛ и офлоксаиина. Содержание 02 • (САР) в Е. coli в присутствии препаратов регистрировали с помощью Люц-XJI на приборе «Биотокс-7» («AHO Инженерный Центр - Экология», Россия) в режиме счета фотонов (имп/с) (в течение 100 секунд). Ночную культуру клеток Е. coli BL21(DE3) центрифугировали при 3,5 тыс. об/мин в течение 15 мин, отмывали фосфатным буфером (pH 8,16) и к ресуспендированным в том же буфере клеткам добавляли люцигенин (95 мкМ) и/или препараты (липосомы из КЛ, офлоксацин (OFX)).

Оценка роста Е. coli и М. tuberculosis в присутствии КЛ и антиоксидантов Культивирование Е. coli с липосомальным КЛ в присутствии антиоксиданта глутатиона (GSH) проводили в среде LB в течение 5 ч. Оценивали рост по КОЕ. Культивирование М. tuberculosis с липосомами из КЛ и антиоксидантом Ю-(б'-пластохинонил)-децилтрифенилфосфонием (SkQlHo) осуществляли в бульоне Дюбо в течение 20 суток, измеряя ежедневно OD600-

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Microsoft Office Excel. Оценку статистической значимости различий проводили с использованием критерия Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Глава 3. Основные результаты работы и их обсуждение

3.1. Характеристика полученных липосом КЛ

Полученные методом экструзии липосомы из КЛ (6,69 мМ) имели размер частиц 170,5 ± 25,5 нм, индекс полидисперсности 0,299 ± 0,150 и ¿¡-потенциал -35,72 ± 4,22 мВ, что характеризовало данные БОЛВ как достаточно однородные по размеру отрицательно заряженные частицы (рис. 1).

Рис. 1. А. Электронная микрофотография липосом из КЛ. полученная методом негативного контрастирования. Б. Распределение липосом на основе КЛ по размеру частиц согласно результатам фотонно-корреляционной спектроскопии. В. Распределение липосом из КЛ по электрофоретической подвижности согласно данным электрофоретического светорассеяния (определение (,-потенциала липосом).

Изучение физической стабильности липосомального КЛ методом светорассеяния при выдерживании его в течение 10 дней при температурах +4 и +23°С показало, что липосомы сохраняют свою однородность и имеют тот же размер частиц 170,5 ± 25,5 нм.

О химической стабильности липосом из КЛ в тех же условиях судили по окислению липида: образованию первичных (диеновые конъюгаты, ДК) и вторичных (ТБК-АП) продуктов окисления. Было показано, что содержание ДК и ТБК-АП в течение 5 часов практически не изменялось, а к 30-му часу увеличилось вдвое по сравнению с 0-ым часом (табл. 1) и составило 3,1 10'4 моль ДК/моль КЛ и 3,9-10~3 моль ТБК-АП/моль КЛ.

Таблица 1. Продукты окисления КЛ при хранении липосом в течение 30 ч при +23°С

Продукты окисления Оч 1 ч 5ч 30 ч

Диеновые конъюгаты (% от КЛ) 0,016 0,018 0,018 0,031

ТБК-активные продукты (% от КЛ) 0,19 0,23 0,24 0,39

3.2. Влияние КЛ на рост чувствительного к ПТП штамма М. tuberculosis H37Rvf

Полученные липосомы на основе КЛ были использованы для исследования их действия на рост культуры М. tuberculosis H37Rv различными методами, указанными в главе 2. Для оценки влияния КЛ (33, 167, 335 и 500 мкМ) на рост МБТ на 0, 4, 9 и 14-ые сутки методом количественной ПЦР в режиме реального времени выделяли ДНК из всего

f Все исследования с использованием различных штаммов М. tuberculosis проведены совместно с сотрудниками отдела микробиологии в ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН.

9

осадка М.tuberculosis набором «Проба-рапида» (НПФ «ДНК-технология», Россия). ПЦР проводили с «Набором для амплификации М. tuberculosis complex в режиме реального времени» (НПФ «ДНК-технология», Россия) в присутствии стандартов ДНК, соответствующих 103, 105 и 107 КОЕ микобактерий в образце. По калибровочной кривой определяли концентрацию МБТ в образцах. Установлено, что KJI в концентрациях 33 и 167 мкМ не оказывал никакого влияния на рост культуры, тогда как в концентрациях 335 и 500 мкМ наблюдалось достоверное (р<0,05) ингибирование роста (рис. 2). Полученный результат не давал однозначного ответа на вопрос о жизнеспособности клеток, поскольку под действием 335 и 500 мкМ KJ1 могло происходить как ингибирование роста клеток, так и их гибель.

Рис. 2. Изменение КОЕ по данным количественной ПЦР в реальном времени при инкубации М. tuberculosis H37Rv (в бульоне Дюбо) без препаратов (1) и в присутствии липосом из КЛ в концентрациях 33 мкМ (2), 167 мкМ (3), 335 мкМ (4) и 500 мкМ (5). Начальная концентрация клеток на 0-ые сутки была 3,9104 КОЕ/мл. Результаты представлены в виде среднего значения трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение (СО).

Действие различных концентраций KJI на рост культуры М. tuberculosis H37Rv также изучали в автоматизированной системе регистрации роста ВАСТЕС MGIT 960 (рис. 3).

Рис. 3. Кривые роста М. tuberculosis H37Rv без препаратов (1) и в присутствии KJ1 в концентрациях 33 мкМ (2) и 500 мкМ (3) по данным регистрации роста клеток в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960. Представлены усредненные результаты трех независимых экспериментов.

Рост культуры М. tuberculosis H37Rv без липосом (контроль) регистрировался на 8-ые сутки. В присутствии 33 мкМ KJ1 происходила достоверная (р<0,01) задержка роста культуры по сравнению с контролем на 2 суток, в то время как инкубация клеток с 500 мкМ КЛ приводила к полному ингибированию роста МБТ (рис. 3). Для установления того, что происходит с клетками под действием 500 мкМ КЛ - лизис или переход в некультивируемое состояние - была исследована жизнеспособность МБТ микроскопией с окраской мазков по методу Мурохаши (рис. 4).

При таком способе окраски живые клетки окрашивались в зеленый цвет, а мертвые -в красный. Из рис. 4.1 видно, что в контрольной культуре МБТ (без липосом) преобладали живые клетки, при инкубации клеток с 33 мкМ КЛ во всех полях зрения выявлялось около 40% погибших клеток (рис. 4.2), а после инкубации с 500 мкМ КЛ клетки микобактерий в мазке не визуализировались (рис. 4.3.).

Время инкубации, сутки

Рис. 4. Микроскопия мазка культуры М. tuberculosis H37Rv на 14-ые сутки роста без липосом (1) и в присутствии липосомального КЛ в концентрациях 33 мкМ (2) и 500 мкМ (3), окрашенного по методу Мурохаши (х 1000).

Для исследования жизнеспособности клеток методом подсчета колоний, выросших на плотной питательном среде, клетки МБТ (105 КОЕ/мл) в отсутствие (контроль) и присутствии липосом из КЛ (33, 167, 335 и 500 мкМ) культивировали в течение 4, 9 и 14 суток в бульоне Дюбо, затем дважды отмывали свежим бульоном Дюбо от невключенных липосом и проводили посев на агар Дюбо серии десятикратных разведений. Чашки Петри термостатировали при 37°С, подсчет колоний проводили на 21-ые сутки культивирования. Было показано, что после инкубации МБТ с 33 и 167 мкМ KJI число выросших колоний достоверно не отличалось от контроля без добавления KJ1, что свидетельствовало о том, что КЛ в этих концентрациях не влиял на рост культуры. После культивирования МБТ в присутствии 335 и 500 мкМ КЛ в течение 4 и 9 суток при пересеве на плотную питательную среду рост культуры отсутствовал.

В качестве другого метода оценки жизнеспособности клеток МБТ при культивировании с КЛ использовали метод ОТ-ПЦР, определяя количество мРНК. После гибели клеток РНК выходит в культуральную среду и, в отличие от ДНК, быстро разрушается, поэтому отсутствие РНК в образцах является подтверждением гибели клеток. Результаты определения относительного содержания мРНК в образцах по сравнению с исходным приведены в табл. 2.

Таблица 2. Относительное число копий мРНК гена rrslóS, кодирующего 16S рРНК, в процессе роста М tuberculosis H37Rv без липосом и в присутствии различных концентраций липосомального КЛ

0 сутки 2 сутки 6 сутки 8 сутки 14 сутки

H37Rv 1 1,86 14,91 32,33 170373

+ КЛ 84 мкМ 1 1,11 1,05 5,48 4,76

+ КЛ 500 мкМ 1 мРНК rrslóS отсутствует

Установлено, что в присутствии 84 мкМ КЛ содержание мРНК М. tuberculosis H37Rv в образце на протяжении всего срока эксперимента практически не отличалось от исходного уровня, в то время как в контроле к 14-ым суткам увеличивалось более чем в 170000 раз. В образцах МБТ, инкубировавшихся с 500 мкМ КЛ, начиная уже со 2-ых суток эксперимента, мРНК в пробах не обнаружена.

Таким образом, различными методами установлено дозозависимое действие КЛ на М. tuberculosis H37Rv: КЛ в концентрациях 33, 84 и 167 мкМ либо не влиял на рост (по данным ПЦР), либо вызывал задержку роста клеток (по данным ВАСТЕС MGIT 960), в то время как 335 и 500 мкМ КЛ полностью ингибировал рост клеток (по данным ПЦР,

BACTEC MGIT 960, подсчета КОЕ), вызывая их гибель (по данным ОТ-ПЦР и окрашивания мазков по методу Мурохаши).

Следующим этапом работы было изучение влияния липосомапьного KJ1 на рост резистентных штаммов МБТ.

3.3. Оценка роста резистентных штаммов М. tuberculosis при культивировании с КЛ

В качестве резистентных штаммов МБТ были использованы клинические штаммы из коллекции ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН: MS-115, устойчивый одновременно к пяти ПТП 1-го ряда (рифампицину, изониазиду, стрептомицину, этамбутолу, пиразинамиду) (штамм с МЛУ) и CN-37, резистентный, кроме перечисленных выше ПТП 1-го ряда, к амикацину, капреомицину, офлоксацину (штамм с ШЛУ). Действие липосом из КЛ на указанные штаммы МБТ оценивали с использованием тех же методов, что и для чувствительного штамма H37Rv.

Регистрацию роста M.tuberculosis с МЛУ и ШЛУ в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 проводили в присутствии липосом на основе КЛ (84, 335 и 500 мкМ), а также контрольных ПТП в их критических концентрациях: рифампицина (RIF, 1 мкг/мл) и офлоксацина (OFX, 2 мкг/мл) (рис. 5). Показано, что контрольный препарат R1F не влиял на рост штамма M.tuberculosis MS-115, тогда как OFX полностью ингибировал его рост. Рост клеток штамма M.tuberculosis CN-37 наблюдался в присутствии как RIF, так и OFX (рис. 5). При культивировании обоих штаммов M.tuberculosis с КЛ получены похожие результаты: липосомы КЛ 84 мкМ вызывали достоверную (р<0,01) задержку начала роста клеток на 4 и 5 суток соответственно штаммов с МЛУ и ШЛУ по сравнению с контрольной культурой (без КЛ). 335 и 500 мкМ КЛ полностью ингибировали рост клеток обоих штаммов.

I

5 10 15 20 25 30 Время инкубации, сутки

Время инкубации, сутки

Рис. 5. Кривые роста штамма M.tuberculosis MS-115 (МЛУ: А) и штамма CN-37 (ШЛУ; Б) по данным автоматизированной системы BACTEC MGIT 960 при культивировании клеток без антибиотиков (1), с липосомальным КЛ в концентрациях 84 мкМ (2), 335 мкМ (3) и 500 мкМ (4), а также с контрольными препаратами RIF (1 мкг/мл) (5) и OFX (2 мкг/мл) (6). Исходное количество клеток 10б КОЕ/мл. Представлены усредненные результаты трех независимых экспериментов.

Оценку роста резистентных штаммов МБТ при культивировании с КЛ методом количественной ПНР проводили на 0, 2, 4, 6, 8 и 14 сутки для МЛУ и на 0, 5, 8, 11, 14 и 18 сутки для ШЛУ. Исходное количество клеток было 106 КОЕ/мл (рис. 6).

Результаты, полученные при оценке влияния КЛ на рост штаммов М. tuberculosis с МЛУ и ШЛУ методом ПЦР, показали, что 84 мкМ КЛ ингибировал репликацию ДНК М. tuberculosis обоих штаммов, что выражалось в достоверной (р<0,05) задержке начала

роста клеток и снижении прироста МБТ к концу эксперимента по сравнению с контролем. 500 мкМ КЛ полностью ингибировал рост культуры МБТ обоих штаммов (рис. 6).

12 3 12 3

Рис. 6. Изменение КОЕ штаммов М. tuberculosis с МЛУ (А) и ШЛУ (Б) (в бульоне Дюбо) без препаратов (1) и в присутствии липосомального КЛ в концентрациях 84 мкМ (2) и 335 мкМ (3) по данным количественной ПЦР в реальном времени в пересчете на КОЕ. Представлены усредненные результаты трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение.

Определение жизнеспособности клеток методом окрашивания по Мурохаши выявило, что в контрольных культурах МБТ с МЛУ и ШЛУ (без добавления препаратов) преобладали живые клетки, при инкубации М tuberculosis с МЛУ и ШЛУ с 84 мкМ КЛ в мазках во всех полях зрения выявлено соответственно более 30 и 40% погибших клеток, а при культивировании обоих штаммов с 500 мкМ КЛ микобактерии в мазках не визуализировались.

Результаты оценки жизнеспособности М. tuberculosis с МЛУ методом ОТ-ПЦР в присутствии КЛ на 0, 2, 6, 8 и 14 сутки культивирования продемонстрированы в табл. 3.

Таблица 3. Относительное число копий мРНК гена rrslóS, кодирующего 16S рРНК, в процессе роста двух резистентных штаммов М. tuberculosis без препаратов и в присутствии различных концентраций липосомального КЛ

0 сутки 2 сутки 6 сутки 8 сутки 14 сутки

H37Rv МЛУ H37Rv МЛУ H37Rv МЛУ H37Rv МЛУ

Контроль 1 1,86 1,08 14,91 9,87 32,33 24,47 170373 125300

+ КЛ 84 мкМ 1 1,11 1,08 1,05 1,05 5,48 1,55 4,76 6,38

+ КЛ 500 мкМ 1 мРНК rrslóS отсутствует

Для штамма М. tuberculosis MS-115 (МЛУ) было зарегистрировано ингибирование роста культуры под действием 84 мкМ КЛ так же, как и для чувствительного штамма H37Rv (количество мРНК к концу эксперимента не отличалось от исходного количества), тогда как 500 мкМ КЛ вызывал гибель МБТ не позднее, чем на 2-ые сутки эксперимента (мРНК не обнаружена).

Таким образом, различными методами нами был достоверно обнаружен бактерицидный эффект КЛ в концентрациях выше 335 мкМ в отношении как чувствительного штамма М. tuberculosis H37Rv, так и клинических резистентных штаммов М. tuberculosis с МЛУ и ШЛУ.

На следующем этапе работы оценивали влияние КЛ на рост других бактерий.

3.4. Действие экзогенного линосомального KJI на рост грамотрицательных и грамположнтельных бактерий, не относящихся к роду Mycobacterium*

Для определения специфичности действия KJI по отношению к разным микроорганизмам изучали влияние различных концентраций липосомальной формы данного липида (33, 67, 100, 200, 335 и 669 мкМ) на рост грамположнтельных бактерий, вызывающих инфекции верхних дыхательных путей: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, и грамотрицательных, представителем которых является Escherichia coli. Оценку влияния KJI на рост стафилококков/стрептококков и Escherichia coli проводили методом подсчета КОЕ соответственно через 24 и 5 ч инкубации с липосомами (рис. 7). Установлено, что KJI не влиял на рост Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, ингибировал рост Streptococcus pneumoniae даже в наименьшей концентрации 33 мкМ, а в концентрациях свыше 100 мкМ обладал бактерицидной активностью в отношении Streptococcus pneumoniae и Escherichia coli.

Таким образом, мы показали, что KJI проявляет бактерицидный эффект в отношении не только лабораторного штамма М. tuberculosis H37Rv, штаммов М. tuberculosis с МЛУ и ШЛУ (МИК = 335 мкМ), но и в отношении Е. coli BL21(DE3) (МИК = 500 мкМ), а также Streptococcus pneumoniae (МИК = 100 мкМ).

3.5. Исследование стабилыюсти липосом KJI в условиях роста М. tuberculosis

Для понимания механизма бактерицидного действия КЛ на медленнорастущие клетки М. tuberculosis (время удвоения популяции клеток ~24 ч) важным представлялось изучение химической стабильности (степень окисления липида, деструкция) КЛ в липосомальной форме в условиях роста МБТ (37°С). Для определения сохранности КЛ в среде роста бактерий мы провели анализ состава экстракта липидов после инкубации липосом KJI в бульоне Дюбо в течение 0, 2, 4 и 6 суток как в отсутствие, так и присутствии клеток МБТ. Время инкубации КЛ выбирали с учетом того, что по данным ОТ-ПЦР гибель клеток МБТ после инкубации с летальной концентрацией КЛ происходила уже на 2-ые сутки эксперимента. В результате анализа экстракта липидов обнаружено незначительное окисление KJI и установлен факт деструкции КЛ уже на 2-ые сутки с образованием одного и того же ряда продуктов, которые были визуализированы нами методом ТСХ в системе А при проявлении обнаружителем 2 (рис. 8А) и идентифицированы методом MALDI-TOF MS (рис. 8Б). Идентификацию масс-ионов в спектре проводили с учетом возможности переноса одного или нескольких протонов и присоединения ионов Na+ или К+ к молекуле липида. Этими продуктами были лКЛ, ллКЛ, ФК (рис. 8В) и ЛК (данные не приведены), структурные формулы которых представлены на рис. 9.

: Работу с грамположительными бактериями выполняли совместно с сотрудниками ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, с Е. coli - в ФГБУН Институте биологии гена РАН.

Streptococcus pyogenes 23-10

Streptococcus pneumoniae 101

Я Str. pyogenes

(исходно) Ш Str. pyogenes (через 24 ч)

□ + КЛ (33 мкМ) D + КЛ (67 мкМ)

□ + КЛ (100 мкМ)

□ + КЛ (200 мкМ) И + КЛ (335 мкМ)

□ + КЛ (669 мкМ)

■ Str. pneumoniae

(исходно) 13 Str. pneumoniae (через 24 ч)

□ +КЛ(33 мкМ)

□ + КЛ (67 мкМ)

□ +КЛ (100 мкМ)

□ +КЛ (200 мкМ) 0 + КЛ (335 мкМ)

□ + КЛ (669 мкМ)

Staphylococcus aureus А ТСС № 25923

Staphylococcus epidermidis 817/5

■ St. aureus (исходно) В St. aureus (через 24 ч)

□ + КЛ (33 мкМ)

□ + КЛ (67 мкМ) О+КЛ (100 мкМ)

□ + КЛ (200 мкМ) В +- КЛ (335 мкМ) Q + КЛ (669 мкМ)

Escherichia coli BL21(DE3)

КЛ—►

лКЛ—► ллКЛ—*

■ Е. coli (исходно)

□ Е. coli (через 5 ч)

□ +КЛ 100 мкМ

□ + КЛ 200 мкМ Ш + КЛ 335 мкМ О + КЛ 500 мкМ

Г:=

*

St. epidermidis (исходно) В) Sr. epidermidis (через

24 ч) О + КЛ (33 мкМ)

□ + КЛ (67 мкМ)

□ + КЛ (100 мкМ)

□ + КЛ (200 мкМ) ш + КЛ (335 мкМ)

КЛ (669 мкМ)

Рис. 7. Изменение КОЕ St. aureus, St. epidermidis, Str. pyogenes, Str. pneumoniae через 24 ч и E. coli через 5 ч инкубации при 37°С с разными концентарциями КЛ (33, 67, 100, 200, 335 и 669 мкМ). Исходное количество клеток стрептококков и стафилококков 105 КОЕ/мл, Е. coli 31Сf КОЕ/мл. Результаты представлены в виде среднего значения двух независимых экспериментов ± стандартное отклонение (СО).

724.4 ФК + Na*

-КЛ

ФК лКЛ - ллКЛ

946.3 ллКЛ - Н* + Na*

ллКЛ - 2Н" + 2Na+

1515.9 КЛ - Н* + 3Na+

КЛ + 2Na

12 3 4

Рис. 8. ТСХ (А) и МАЬ0!-Т01' масс-спектр, полученный в режиме детектирования положительно заряженных ионов (Б'), продуктов деструкции КЛ в экстракте липидов после инкубации липосом из КЛ в бульоне Дюбо в течение 2 суток.^ч системе СНС1з-СНзОН-Н20 (65:25:4), проявитель -фосфорномолибденовая кислота. Дорожка № 1 - стандарты КЛ. лКЛ, ллКЛ и ЛК; 2 - экстракт липидов из среды Дюбо: 3 и 4 -экстракты липидов, содержащие продукты деструкции КЛ, соответственно на 0-ые и 2-ые сутки.

На основании полученных данных было выдвинуто предположение о том, что не только KJI, но и продукты его деструкции могут проявлять бактерицидное действие на МБТ. Из-за отсутствия коммерческих образцов продуктов деструкции KJI (лКЛ, ллКЛ, ФК) следующий этап работы был посвящен получению данных соединений.

3.6. Получение лизо- и бислизокардиолипина, а также фосфатидной кислоты и изучение их действия на рост М. tuberculosis H37Rv

Лизокардиолипин (лКЛ, 1 -(1,2-диацил-£я-глицеро-3-фосфо)-3-(1 '-ацил-зя-глицеро-З '-фосфо)глицерин, 2-лизокардиолипин), бислизокардиолипин (ллКЛ, 1-(1-ацил-™-глицеро-3-фосфо)-3-(1 '-ацил-^«-глицеро-3'-фосфо)глицерин, 2,2'-бислизокардиолипин) и фосфатидная кислота (ФК) были получены при действии фосфолипаз А2 и D на КЛ согласно схеме, представленной на рис. 9. Линолевую кислоту (ЛК) не получали ввиду доступности ее коммерческого образца.

ФХ 0 ФК 0

Рис. 9. Схема получения лКЛ, ллКЛ, ФК.

После выделения и очистки методом адсорбционной колоночной хроматографии эти вещества были использованы в качестве стандартов для идентификации продуктов деструкции КЛ методами ТСХ и MALDI-TOF MS. Далее исследовали их влияние на рост М. tuberculosis H37Rv спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность культуры при Х=600 нм (OÜ6oo) в формате 96-ти луночного планшета. Показано, что 500 мкМ лКЛ незначительно ингибировал (рис. 10А), ллКЛ не влиял на рост клеток во всех исследованных концентрациях (100, 200, 335 и 500 мкМ), тогда как ЛК и ФК полностью ингибировали рост в концентрации 400 мкМ (рис. 10Б) и 500 мкМ соответственно.

Учитывая, что минимальные ингибирующие концентрации липосомального КЛ и ЛК примерно одинаковые (335 и 400 мкМ соответственно), и КЛ разрушается при культивировании с МБТ на 2-ые сутки с образованием ряда продуктов, в том числе ЛК,

бактерицидное действие КЛ на МБТ можно было бы объяснить действием ЛК. Однако результаты определения липидного фосфора по модифицированному методу Бартлета СSvetashev V.l. et al., 1972) в липидном экстракте после инкубации КЛ с МБТ в среде Дюбо в течение 2 суток показали, что количество нативного КЛ на 2-ые сутки составляло 81,3%. А это значит, что ЛК не могла образоваться к этому времени в достаточном количестве, чтобы внести существенный вклад в бактерицидный эффект КЛ, который проявлялся уже на 2-ые сутки культивирования МБТ. Таким образом, гипотеза об антибактериальной активности КЛ за счет продуктов его деструкции была отвергнута.

Время инкубации, сутки Время """У6™". СУ™

Рис. 10. Кривые роста М. tuberculosis H37Rv без препаратов (1) и в присутствии липосомального лКЛ (А) в концентрациях 100 мкМ (2), 200 мкМ (3), 335 мкМ (4) и 500 мкМ (5) и JIK в растворе диметипсулъфоксида (Б) в концентрациях 335 мкМ (2), 400 мкМ (3) и 500 мкМ (4). Результаты представлены в виде среднего значения двух независимых экспериментов ± стандартное отклонение (СО).

Дальнейшие исследования были направлены на проверку второй гипотезы о вкладе самого КЛ в бактерицидный эффект. Выявление возможных механизмов бактерицидного действия КЛ проводили с использованием Е. coli, в отношении которой наряду с М. tuberculosis КЛ обладал выраженной антибактериальной активностью. Е. coli является быстрорастущим (время удвоения популяции клеток -30 мин) и хорошо изученным микроорганизмом, что облегчает проведение различных исследований с этой бактерией.

3.7. Установление механизмов бактерицидного действия экзогенного липосомального

КЛ на Е. coli

3.7.1. Выявление мишеней действия КЛ в клетках Е. coli: повреждение ДНК (индукция системы ДНК-репарационного SOS-ответа) и торможение трансляции

При помощи тест-систем на основе репортерных конструкций Е. coli мы определяли способность КЛ вызывать повреждения ДНК и тормозить трансляцию белков. В основе использованных тест-систем лежала регистрация уровня экспрессии репортерных генов -ß-галактозидазы (LacZ) или голубого флуоресцентного белка (CER, cerulean), -находящихся под контролем LexA-зависимого промотора sfiA, или sulA, в случае тест-системы на определение повреждения ДНК или же более сложной конструкции, в которой экспрессия CER зависит от скорости трансляции.

Следствием повреждения ДНК в клетках является индукция ДНК-репарационного SOS-ответа с последующей транскрипцией генов, в норме репрессированных регулятором транскрипции LexA. Для изучения SOS-ответа под действием КЛ был использован штамм

E. coli CSH50 sfiA::lacZ, содержащий репортерный ген lacZ под контролем LexA-зависимого промотора sfiA, в геноме которого имеется делеция хромосомного lac-оперона (работа проведена в ИБГ под руководством к.б.н. Гилярова Д.А. и д.б.н. Северинова К.В.). На газон указанных выше клеток, выращиваемых на среде МакКонки (содержащей глюкозу и pH-зависимые красители), наносили 5 мкл липосомального КЛ, в качестве положительных контролей использовали ципрофлоксацин (CFX) и микроцин В (МсВ), которые ингибируют рост клеток за счет блокирования ДНК-гиразы и индуцируют SOS-ответ, в качестве отрицательного контроля - микроцин С (МсС), ингибирующий рост клеток за счет инактивации аминоацил-тРНК-синтетаз, но не индуцирующий SOS-ответ. Инкубировали чашки Петри с клетками при 37°С в течение 24 ч. Индукцию SOS-ответа устанавливали по появлению ободков ярко-красного цвета вокруг зон ингибирования роста клеток. Показано, что КЛ подавлял рост клеток и индуцировал SOS-ответ, о чем свидетельствовало наличие зоны ингибирования роста клеток с ярко-красным ореолом вокруг нее (рис. IIA). Контрольные препараты CFX и МсВ индуцировали SOS-ответ, а МсС - нет.

В

Рис. 11. Фотографии чашек Петри с нанесенными на них газонами клеток. Для тестирования KJ1 на SOS-ответ использовали штаммы-репортеры Е. coli CSH50 sfiA::lacZ (А) и AtolC, трансформированный плазмидой pRFPCER-PsulA (Б). KJ1 - 3 мМ. Положительные контроли: CFX - ципрофлоксацин (12 мкМ), LFX - левофлоксацин (5 мкМ), МсВ - микроцин В (30 мкМ); отрицательный контроль: МсС - микроцин С (20 мкМ). В. Влияние КЛ на торможение трансляции белков в E.coli с использованием штамма-репортера, трансформированного плазмидой pRFPCER-TrpL2A. КЛ - 3 мМ, LFX - левофлоксацин (5 мкМ, отрицательный контроль), ERM- эритромицин (7 мкМ, положительный контроль).

Вторым используемым нами штаммом для определения повреждения ДНК был AtolC, трансформированный плазмидой pRFPCER-PsulA, содержащий репортерные гены красного флуоресцентного белка (RFP) в качестве внутреннего контроля и голубого флуоресцентного белка CER, находящегося под контролем Lex-зависимого промотора sulA (работа проведена на химфаке МГУ под руководством аспиранта Остермана И. и д.х.н. Сергиева П.В.). Регистрацию экспрессии гена CER в ответ на активацию гена sulA осуществляли с помощью флуоресценции. В газоне клеток, выращиваемых на среде LB в чашке Петри, прорезали лунки, в которые вносили по 50 мкл препаратов КЛ и левофлоксацина (LFX) в качестве положительного контроля. Клетки инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Индукцию SOS-ответа детектировали по появлению зеленого ореола вокруг зон ингибирования роста клеток (рис. 11 Б). Таким образом, установлено, что КЛ и LFX индуцировали SOS-ответ клеток.

Итак, с помощью двух штаммов-репортеров Е. coli показано, что KJ1 вызывает повреждения ДНК в бактериальных клетках и, как следствие, индукцию ДНК-репарационного SOS-ответа.

Также было изучено влияние КЛ на скорость трансляции. Для этого использовали штамм-репортер AtolC, трансформированный плазмидой pRFPCER-TrpL2A, в которой под контролем промотора фага Т5 находились ген CER и предшествующий ему ген лидерного пептида trpL триптофанового оперона с замененными в нем двумя триптофановыми кодонами на два аланиновые (во избежание зависимости экспрессии CER от концентрации триптофана). В этой двойной репортерной конструкции RFP по-прежнему выполнял роль внутреннего стандарта, а экспрессия репортерного гена CER зависела от скорости трансляции и регулировалась по механизму атгенуации (регулируемая терминация транскрипции, зависящая от относительной стабилизации альтернативных вторичных структур транскрибируемой мРНК). В отсутствие антибиотиков, тормозящих трансляцию, происходило образование вторичной структуры лидерного пептида мРНК, стимулирующей преждевременную терминацию транскрипции, в результате чего ген CER не экспрессировался. В присутствии антибиотика, замедляющего трансляцию, происходило образование альтернативной вторичной структуры мРНК, не препятствующей транскрипции гена CER, поэтому увеличивалась его экспрессия, что можно было детектировать методом флуоресценции.

Регистрацию экспрессии гена CER в присутствии KJI осуществляли с помощью флуоресценции по методике, описанной для изучения SOS-ответа с использованием штамма AtolC, трансформированного плазмидой pRFPCER-PsulA. О торможении трансляции судили по наличию зеленого ореола вокруг зоны ингибирования роста. В качестве положительного контроля использовали эритромицин (ERM, ингибирует трансляцию), отрицательного - LFX (не ингибирует). При действии на клетки KJI и LFX не наблюдали зеленого ободка вокруг зоны ингибирования роста (рис. 11В), что свидетельствовало о нормальной скорости трансляции. Действие ERM, напротив, приводило к появлению зеленого ореола вокруг зоны ингибирования роста (рис. 11В).

На основании полученных данных был сделан вывод о том, что бактерицидное действие KJI на Е. coli связано с повреждением ДНК клеток.

Система ДНК-репарационного SOS-ответа индуцируется вследствие накопления двухцепочечных разрывов ДНК (повреждение ДНК), причины появления которых могут быть разными: например, ингибирование антибиотиком ДНК-топоизомераз I и II типа за счет стабилизации переходного комплекса фермент-расщепленная ДНК или же окислительное повреждение ДНК, например, активными формами кислорода.

3.7.2. Влияние липосомального KJI на реакции, катализируемые топоизомеразой I и

ДНК-гиразой Е. coli in vitro

Для объяснения возникновения повреждения ДНК в клетках Е. coli под действием KJI сначала нами было исследовано влияние KJI на топоизомеразы I и II типа Е. coli in vitro. В литературе имеются сведения об ингибирующем действии KJI (в виде MJIB) на топоизомеразу I E.coli в концентрациях 300 мкМ (Mizushima Т. et al„ 1992). Наши

эксперименты с использованием БОЛВ на основе КЛ подтвердили эти результаты. Влияние КЛ на ДНК-гиразу было изучено впервые. Исследовали две реакции, катализируемые ДНК-гиразой: релаксацию и суперскручивание ДНК в отсутствие и присутствии АТФ соответственно. Реакции проводили, как описано в главе 2 «Материалы и методы». О действии липида на ферментативную активность судили после проведения электрофореза продуктов реакции в 0,9% агарозном геле и окрашивания геля бромистым этидием. Вывод об ингибировании реакции липидом делали на основании наличия на электрофореграмме одной или нескольких полос, соответствующих исходной форме ДНК или топоизомерам, расположенным ближе к исходной форме ДНК. Таким образом, установлено, что КЛ ингибировал релаксацию ДНК гиразой в концентрации 335 мкМ (рис. 12А), а суперскручивание ДНК — в концентрации 500 мкМ (рис. 12Б). В качестве положительного контроля в обеих реакциях использовали СРХ, действие которого хорошо иллюстрируется рисунком 12.

релаксДНК

ссДНК

Рис. 12. Электрофореграммы продуктов реакций, полученных с использованием ДНК-гиразы, в следующих реакциях: А — релаксация суперскрученной ДНК р\]С19 (в отсутствие АТФ). Б - суперскручивание релаксированной ДНК р11С19 (в присутствии А ТФ). А. Дорожки № 1, 2, 3,4, 5, 6, 7 и 8- ссДНК + гираза в отсутствие препаратов и присутствии соответственно 30, 100, 200, 335, 500 мкМ КЛ, 500 мкМ фосфатидилхолина (ФХ) и 4 мкМ ципрофлоксацина (СРХ). Б. Дорожка № 1 -релаксДНК, Л° 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 - релаксДНК + гираза в отсутствие препаратов и в присутствии 30, 100, 200, 335, 500 мкМ КЛ и 4 мкМ СРХ соответственно. РелаксДНК - релаксированная форма ДНК, ссДНК - суперскрученная форма ДНК.

В реакциях, катализируемых топоизомеразами обоих типов, выделяют следующие четыре стадии: 1) связывание ДНК с ферментом, 2) разрезание ферментом одной или двух цепей ДНК (в зависимости от типа топоизомеразы), 3) протаскивание другой цепи/участка той же ДНК через образовавшийся разрыв, 4) сшивание разрезанных концов ДНК. Фторхинолоны стабилизируют переходный комплекс гираза-расщепленная ДНК, предотвращая протекание четвертой стадии реакции. Это приводит к накоплению ДНК с двухцепочечными разрывами и, как следствие, к индукции БОЗ-ответа. Для выяснения того, является ли установленный нами факт ингибирования КЛ топоизомеразы I и ДНК-гиразы причиной повреждения ДНК, мы исследовали способность КЛ стабилизировать переходный комплекс фермент-расщепленная ДНК, что сопровождается накоплением никованной или линейной ДНК.

Исследование накопления никованной и линейной ДНК в присутствии КЛ

Было изучено влияние КЛ на накопление никованной (ДНК с одноцепочечным разрывом) и линейной ДНК (с двухцепочечным разрывом) в случае с топоизомеразой I и ДНК-гиразой соответственно. В качестве положительного контроля в реакциях с гиразой использовали СБХ, который вызывает накопление линейной ДНК.

Все реакции проводили в течение 2 ч при температуре 37°С в микропробирках. По окончании реакций к реакционным смесям добавляли протеиназу К и 0,5% 808 для деградации ферментов и инкубировали еще 30 минут при 37°С. Продукты реакций анализировали после проведения электрофореза в 0,9% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Последний интеркалирует в ДНК, в результате чего релаксированная форма ДНК, содержащая этидий бромид, приобретает положительную сверхспирализацию, и на электрофореграмме ее положение сливается с положением отрицательносуперскрученной ДНК. Никованная и линейная формы ДНК, связавшись с бромистым этидием, не могут приобретать положительную сверхспирализацию, поэтому их положение в геле четко различимо. При этом полоса, соответствующая линейной ДНК, располагается ниже той, которая соответствует никованной ДНК, но обе находятся значительно выше полос, соответствующих суперскрученной и релаксированной формам ДНК (рис. 13).

никДНК

ссДНК + релаксДНК

линДНК

—линДНК

ссДНК+ ""релаксДНК

Рис. 13. Электрофореграммы продуктов реакций: А - релаксации суперскрученной ДНК pUC19 топоизомеразой I (mono 1) и Б - гиразой из E.coli в отсутствие АТФ, В - суперскручивания релаксированной ДНК pUC19 гиразой при наличии АТФ - в присутствии КЛ. CFX - ципрофлоксацина, положительный контроль, ФХ - не влияющего на mono /- отрицательный контроль. Электрофорез проводили в течение 2 ч в 0,9% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия. никДНК -никованная ДНК (с одноцепочечным разрывом), линДНК - линейная ДНК (с двуцепочечным разрывом), ссДНК - суперскрученная форма ДНК, релаксДНК - релаксированная форма ДНК. А. 1 ссДНК, 2 - ссДНК + mono I. дорожки 3, 4, 5 - ссДНК + mono I в присутствии 500 мкМ и I мМ КЛ. 1 мМ ФХ соответственно. Б. 1 ссДНК + гираза, дорожки 2, 3, 4, 5 - ссДНК + гираза в присутствии 500 мкМ, 800 мкМ и 1 мМКЛ, 10 мкМ CFX соответственно. В. 1 - релаксДНК, 2 - релаксДНК + гираза. дорожки 3 и 4 -релаксДНК + гираза в присутствии 500 мкМКП и 10 мкМ CFXсоответственно.

Во всех реакциях, катализируемых как топоизомеразой I, так и ДНК-гиразой, действие KJI приводило к образованию никованной и линейной ДНК в количестве, сопоставимом с базовым уровнем, наблюдавшемся в реакции в отсутствие препаратов (рис. 13). A CFX в реакциях с участием ДНК-гиразы исходную ДНК полностью превращал в линейную форму, то есть стабилизировал комплекс гиразы с расщепленной ДНК.

Таким образом, наличие КЛ в реакционной смеси ни с топо I, ни с гиразой не приводило к явному накоплению соответственно никованной и линейной ДНК. Это свидетельствовало о том, что КЛ не стабилизировал комплекс фермент-расщепленная ДНК и механизм бактерицидного действия КЛ отличался от механизма действия фторхинолонов (на ДНК-гиразу) или камптотецина (на топо I).

Итак, идея о повреждении ДНК вследствие стабилизации кардиолипином переходных комплексов ДНК-топоизомераза I/II типа - расщепленная ДНК была отвергнута. Далее проверяли гипотезу о повреждении ДНК в присутствии КЛ активными формами кислорода.

3.7.3. Оценка содержания супероксид анион-радикалов в клетках Е. coli при культивировании с KJI

Супероксид анион-радикалы Ю? (САР) относятся к первичным АФК и являются короткоживущими продуктами процесса дыхания любой клетки, в которой существуют различные защитные механизмы от их деструктивного действия. Для обнаружения САР в клетках Е. coli в присутствии липосомального KJ1 и OFX (положительный контроль согласно (Kohanski М.А. et а!., 2007)) мы использовали люцигенин-активируемую хемилюминесценцию (Люц-XJI) вследствие высокой чувствительности люцигенина к САР (Greenlee L. et al., 1962). Результаты Люц-ХЛ выражали в светосуммах (количество импульсов за 100 с). В качестве контролей использовали: 1) фосфатный буфер; 2) фосфатный буфер + Люц; 3) фосфатный буфер + Люц + препарат; 4) Е. coli\ 5) Е. coli + Люц. Для наглядности результатов выразили вклад КЛ и OFX в Люц-ХЛ клеток в %, приняв за 100% Люц-ХЛ клеток Е. coli в отсутствие препаратов (рис. 14). Показано, что Люц-ХЛ клеток в присутствии 335 и 500 мкМ КЛ почти в 5 раз превышала Люц-ХЛ в отсутствие препарата (рис. 14). OFX проявлял меньший эффект, вызывая увеличение Люц-ХЛ всего лишь в 1,5 раза по сравнению с Люц-ХЛ клеток Е. coli в отсутствие препаратов, что согласуется с результатами работ (Liu Y. et al., 2013; Keren I. et al., 2013), опровергающих общий механизм действия разных классов бактерицидных антибиотиков за счет АФК (Kohanski М.А. et al., 2007).

А Б

■в- 100 S

Mf

1

Рис. 14. А. Регистрация на приборе «Биотокс-7» («AHO Инженерный Центр - Экология», Россия) в режиме счета фотонов (имп/с) хемилюминесценции Е. coli (1), Люц-ХЛ Е. coli без препаратов (2) и в присутствии 500 мкМ КЛ (3), а также 250 мкМ OFX (4). Б. Процентное соотношение между Люц-ХЛ Е. coli без препаратов (1) и в присутствии липосомального КЛ в концентрациях 335 мкМ (2) и 500 мкМ (3), а также 250 мкМ OFX (4). Результаты представлены в виде среднего значения четырех независимых экспериментов ± стандартное отклонение (СО).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что под действием липосом из КЛ на клетки Е. coli наблюдается увеличение концентрации САР, что может привести к образованию вторичных АФК (гидроксильный радикал), повреждающих ДНК клеток, и, в конечном счете, к гибели клеток.

3.7.4. Исследование жизнеспособности клеток Е. coli и М. tuberculosis под действием экзогенного KJT в присутствии антиоксидантов

Для подтверждения высказанного выше предположения был исследован рост Е. coli BL21(DE3) и М. tuberculosis H37Rv в присутствии летальных концентраций KJI и антиоксидантов GSH и SkQlH2 соответственно (рис. 15).

При культивировании клеток Е. coli (5,9-107 КОЕ/мл) с 500 мкМ KJI в течение 5 часов наблюдали резкое снижение КОЕ в 100 раз уже к 1-му часу и последующее постепенное уменьшение КОЕ до 104 клеток/мл к 5-му часу. Однако при инкубации с 10 мМ GSH, который сам по себе не влиял на рост клеток, жизнеспособность той же культуры клеток в присутствии KJI в течение первых трех часов повышалась по сравнению с культурой без добавления GSH (рис. 15А). При культивировании М. tuberculosis H37Rv (5ТО5 КОЕ/мл) с 200 мкМ KJ1 в течение 20 суток заметного роста МБТ не наблюдали (на 20-ые сутки OD6oo=0,033, рис. 15Б). При добавлении к культуре М. tuberculosis 200 мкМ КЛ и 10 мкМ антиоксиданта SkQlH2 происходило увеличение роста клеток (OD6oo=0,182 на 20-ые сутки). 10 мкМ SkQIHi не влиял на рост МБТ.

Таким образом, мы показали, что гибель клеток Е. coli под действием КЛ происходит из-за образования АФК, которые, возможно, и вызывают повреждение ДНК.

Основываясь на полученных нами результатах и литературных данных, мы предложили следующую схему бактерицидного действия экзогенного липосомального КЛ: взаимодействие липосомального КЛ с клетками Е. coli приводит к повышению концентрации САР, которые могут вступать в окислительно-восстановительные реакции с Fe-S-кластерами в составе железо-серных белков, в результате чего дестабилизируют кластеры с высвобождением железа(П). Fe2+ по реакции Фентона реагирует с Н202, исходно присутствующей в клетках, образуя токсичный гидроксильный радикал, который и разрушает ДНК бактерий, что в конечном счете приводит к гибели клеток (рис. 16).

10,5 9,5 Я 8,5

-3> 5,54.5 -3,5 -■ О

Рис. 15. Кривые роста клеток Е. coli BL21(DE3) (исходное количество 5,910? КОЕ/мл) (А) без препаратов (1), в присутствии 500 мкМ KJI без антиоксиданта (2) и с 10 мМ GSH (3), в присутствии только 10 мМ GSH (4) и М. tuberculosis H37Rv (исходное количество 5-103 КОЕ/мл) (Б) без препаратов (1), в присутствии 200 мкМ KJI без антиоксиданта (2) и с 10 мкМ SkQlH2 (3), в присутствии только! 0 мкМSkQlН2 (4).

клетка Е. coli (0,4—0,8 х 1—3 мкм)

ОВР и, как следствие, дестабилизация Fe-S-Kiacmepoe

^ липосома KJ1 (175 нм)

i«Q — 1 увеличение

' |2 ' концентрации САР

высвобождение железа (II)

Fe2+ + Н202

• Fe + ОМ -!

(реакция Фентона)

повреждение ДНК

' ДНК

ГИБЕЛЬ КЛЕТОК

Рис. 16. Предполагаемая схема бактерицидного действия кардиолипина на клетки Е. coli.

ОВР - окислительно-восстановительные реакции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поиск и разработка новых нетоксичных противотуберкулезных препаратов (ПТП) является актуальной задачей в связи с тем, что существующие ПТП могут вызывать образование резистентных штаммов М. tuberculosis. В результате проведенных нами исследований впервые показано, что экзогенно добавленный природный липид кардиолипин в виде липосом обладает бактерицидным действием не только на чувствительный, но и на резистентные штаммы М. tuberculosis с множественной и широкой лекарственной устойчивостью, а также на Escherichia coli и Streptococcus pneumoniae.

На примере Е. coli показано, что антибактериальная активность экзогенного липосомального кардиолипина связана с повреждением ДНК клеток, происходящего не по причине ингибирования кардиолипином топоизомеразы I и ДНК-гиразы (как в случае с камптотецином и фторхинолонами), а вследствие действия активных форм кислорода. Возможно, этот же механизм бактерицидного действия КЛ выполняется в случае микобактерий туберкулеза, так как в присутствии антиоксидантов бактерицидный эффект кардиолипина снижается.

III. выводы

1. Впервые обнаружено бактерицидное действие экзогенного липосомального кардиолипина на чувствительный к противотуберкулезным препаратам штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv и резистентные штаммы Mycobacterium tuberculosis с множественной и широкой лекарственной устойчивостью, а также Streptococcus pneumoniae и Escherichia coli.

2. Показано, что в условиях роста М. tuberculosis происходит незначительное окисление липосомального KJI и его деструкция с образованием ряда продуктов (лизо- и бислизокардиолипин, фосфатидная и линолевая кислоты), идентифицированных методами ТСХ и MALDI-TOF MS, которые в индивидуальном виде существенно не влияют на рост микобактерий.

3. Обнаружены индукция ДНК-репарационного SOS-ответа в клетках Е. coli, культивируемых с липосомами из кардиолипина, что свидетельствует о повреждении ДНК, и отсутствие влияния кардиолипина на скорость трансляции белков.

4. Показаны ингибирование кардиолипином реакций, катализируемых топоизомеразой I и ДНК-гиразой Е. coli, in vitro, и отсутствие стабилизации кардиолипином переходных комплексов фермент-расщепленная ДНК (в отличие от камптотецина и фторхинолонов).

5. Выявлено повышенное содержание супероксид анион-радикалов в клетках Е. coli под действием летальных концентраций экзогенного липосомального KJI. Обнаружено снижение бактерицидного эффекта кардиолипина на МБТ и Е. coli в присутствии антиоксидантов, что подтверждает гипотезу гибели клеток от окислительного повреждения активными формами кислорода. На основании этих данных предложен механизм бактерицидного действия экзогенного КЛ на клетки Е. coli.

IV. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах

1. Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Жогина Ю.А., Смирнова Д.И., Микулович Ю.Л.. Сорокоумова Г.М., Черноусова Л.Н., Селищева А.А., Швец В.И. Влияние экзогенного кардиолипина на рост и жизнеспособность Mycobacterium tuberculosis H37Rv in vitro II Доклады Академии наук. 2010. Т. 434. № 5. С. 705-708.

2. Смирнова Т.Г., Микулович Ю.Л.. Андреевская С.Н., Сорокоумова Г.М., Черноусова Л.Н., Селищева А.А., Швец В.И. Лизопроизводные кардиолипина подавляют жизнеспособность чувствительного и резистентного штаммов Mycobacterium tuberculosis II Биофармацевтический журнал. 2011. Т. 3. № 2. С. 19-27.

3. Микулович Ю.Л.. Сорокоумова Г.М., Селищева А.А., Швец В.И. Ингибирующее действие экзогенного кардиолипина на бактериальные ДНК-топоизомеразы I и II типа in vitro II Вестник МИТХТ. 2012. Т. 7. № 4. С. 58-63.

Тезисы докладов международных конференций:

1. Микулович ЮЛ.. Смирнова Д.И., Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Жогина Ю.А., Сорокоумова Г.М., Черноусова Л.Н., Селищева A.A., Швец В.И. Влияние липосом из кардиолипина на рост и выживаемость Mycobacterium tuberculosis H37Rv in vitro II Сборник материалов Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов». Москва, 15-17 марта 2010. С. 453-454.

2. Alla Selishcheva, Larisa Chernousova, Sofia Andreevskaya, Tatyana Smirnova, Galina Sorokoumova, Julia Mikulovich. Darya Smirnova, Julia Zhogina and Vitaliy Shvets. The influence of cardiolipin liposomes on growth and survival of Mycobacterium tuberculosis H37Rv in vitro // Abstracts of European Respiratory Society Annual Congress, Barcelona, 18-22 September, 2010. P. 89.

3. Микулович Ю.Л.. Андреевская C.H., Юсипов Р.Ш., Сорокоумова Г.М., Черноусова Л.Н., Селищева A.A., Швец В.И. Анализ липидного состава Mycobacterium tuberculosis H37Rv на разных стадиях роста // Сборник материалов I международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Москва, 17-19 ноября 2010. С. 66.

4. Микулович Ю.Л.. Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Сорокоумова Г.М., Черноусова Л.Н., Селищева A.A., Швец В.И. Влияние липосом из кардиолипина на рост и жизнеспособность резистентного штамма Mycobacterium tuberculosis in vitro II Сборник материалов I международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Москва, 17-19 ноября 2010. С. 67.

5. Микулович Ю.Л.. Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Сорокоумова Г.М., Черноусова Л.Н., Селищева A.A., Швец В.И. Ингибирующее действие лизофосфатидилхолина и продуктов гидролиза кардиолипина на рост Mycobacterium tuberculosis H37Rv in vitro // Сборник материалов VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 21-25 марта 2011. Т. 1. С. 83-84.

6. Микулович Ю.Л.. Гиляров Д.А., Сорокоумова Г.М., Селищева A.A., Швец В.И., Северинов К.В. Влияние липосомального кардиолипина на рост и жизнеспособность грамположительных и грамотрицательных бактерий // Сборник материалов международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии». Москва, 20-22 марта 2012. С. 243-245.

7. Микулович Ю.Л.. Сорокоумова Г.М., Селищева A.A., Швец В.И. Бактерицидное действие экзогенного кардиолипина в отношении Escherichia coli in vitro и его возможные мишени // Сборник материалов III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Казань, 22-24 ноября 2012. С. 66.

8. Микулович Ю.Л.. Сорокоумова Г.М., Селищева A.A., Швец В.И. Механизм бактерицидного действия липосомального кардиолипина на клетки Escherichia coli II Сборник материалов VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 19-22 марта 2013. Т. 1. С. 103-104.

Подписано в печать 25.04.2013

Заказ № 84 Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 80 экз. ООО «Генезис» 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86 8 (495) 936-88-35 8 (495) 434-83-55

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Микулович, Юлия Львовна, Москва

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования "Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова" (МИТХТ им. М.В. Ломоносова)

04201357287

На правах рукописи

Микулович Юлия Львовна

АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ, В ТОМ ЧИСЛЕ АНТИМИКОБАКТЕРИАЛЬНОЕ, ДЕЙСТВИЕ ЭКЗОГЕННОГО КАРДИОЛИПИНА

Специальности 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 02.00.10 - Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: кандидат химических наук, доцент Сорокоумова Г.М.

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Селищева A.A.

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................................6

2. ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................9

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................... 12

3.1. Структура клеточной оболочки Mycobacterium tuberculosis и

фосфолипидный состав микобактерий............................................................... 13

3.2. Структура клеточной оболочки Escherichia coli и фосфолипидный состав бактерий......17

3.3. Кардиолипин................................................................................................19

3.3.1. Исторический очерк...........................................................................................................19

3.3.2. Локализация...........................................................................................19

3.3.3. Структура и свойства................................................................................20

3.3.4. Метаболизм в прокариотических клетках......................................................26

3.3.4.1. Биосинтез........................................................................................26

3.3.4.2. Катаболизм.......................................................................................28

3.3.5. Неравномерное распределение в бактериальных мембранах

с образованием доменов............................................................................29

3.3.6. Взаимодействие с бактериальными мембраносвязанными белками

в различных процессах клеточного цикла.....................................................32

3.3.6.1. Репликация ДНК...............................................................................33

3.3.6.2. Деление клетки.................................................................................35

3.3.6.3. Транспорт белков и других веществ..............................................................37

3.3.6.4. Дыхание клетки................................................................................. 41

3.3.6.5. Образование спор...............................................................................42

3.3.7. Ингибирующее действие на ферменты.........................................................42

3.4. Основные группы антибиотиков, их мишени и механизмы действия..........................44

3.4.1. Ингибиторы репликации ДНК.....................................................................45

3.4.2. Ингибиторы синтеза РНК...........................................................................50

3.4.3. Ингибиторы синтеза клеточной стенки.........................................................51

3.4.4. Ингибиторы синтеза белков........................................................................54

4. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..........................................................60

4.1. Характеристика полученных липосом на основе кардиолипина и исследование их стабильности при хранении.............................................................................60

4.2. Влияние липосом из кардиолипина на рост чувствительного к противотуберкулезным препаратам лабораторного штамма М. tuberculosis H37Rv...................................... 61

4.3. Влияние липосомального кардиолипина на рост резистентных штаммов М. tuberculosis

с множественной и широкой лекарственной устойчивостью....................................66

4.4. Действие экзогенного липосомального кардиолипина на рост грамотрицательных и грамположительных бактерий, не относящихся к роду Mycobacterium.......................72

4.5. Анализ эндогенных фосфолипидов Mycobacterium tuberculosis H37Rv в разных

фазах роста (логарифмической, ранней и поздней стационарной).............................74

4.6. Выявление механизма бактерицидного действия экзогенного липосомального кардиолипина..............................................................................................77

4.6.1. Исследование стабильности липосом из кардиолипина в условиях роста

М. tuberculosis........................................................................................77

4.6.2. Получение лизо- и бислизокардиолипина, фосфатидной кислоты и исследование их влияния на рост М. tuberculosis H37Rv....................................79

4.6.2.1. Получение лизопроизводных кардиолипина............................................ 80

4.6.2.2. Получение фосфатидной кислоты полусинтезом с использованием фосфолипазы D.................................................................................81

4.6.2.3. Определение критических концентраций мицеллообразования кардиолипина и продуктов его деструкции...............................................82

4.6.2.4. Изучение влияния лизо- и бислизокардиолипина, фосфатидной и

линолевой кислот на рост М. tuberculosis H37Rv.......................................84

4.6.3. Установление возможных механизмов бактерицидного действия экзогенного липосомального кардиолипина на Е. coli......................................................87

4.6.3.1. Выявление мишеней кардиолипина.........................................................87

4.6.3.2. Влияние кардиолипина на реакции, катализируемые топоизомеразой I и ДНК-гиразой из Е. coli, in vitro.......................■......................................89

4.6.3.3. Оценка содержания супероксид анион-радикалов в клетках Е. coli в присутствии липосомального кардиолипина.............................................92

4.6.4. Исследование жизнеспособности клеток Е. coli и М. tuberculosis при культивировании с летальными концентрациями кардиолипина

в присутствии антиоксидантов...................................................................94

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..........................................................................97

5.1. Материалы и оборудование.............................................................................97

5.2. Методы........................................................................................................99

5.2.1. Получение липосом.................................................................................99

5.2.2. Определение степени окисления кардиолипина..............................................99

5.2.3. Идентификация продуктов деструкции кардиолипина методами ТСХ и MALDI-TOF масс-спектрометрии после его инкубации в бульоне Дюбо..............100

5.2.4. Получение лизо- и бислизокардиолипина....................................................101

5.2.5. Получение фосфатидной кислоты полусинтезом с использованием фосфолипазы D.....................................................................................102

5.2.6. Определение критических концентраций мицеллообразования липидов..............102

5.2.7. Исследования па Mycobacterium tuberculosis................................................ 103

5.2.7.1. Получение стандартизованной по генотипу, лекарственной чувствительности, фазе роста и колониеобразующим единицам культуры чувствительного к противотуберкулезным препаратам и резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной и широкой лекарственной устойчивостью................................................................................103

5.2.7.2. Влияние экзогенного липосомального кардиолипина на рост чувствительного к противотуберкулезным препаратам и резистентных штаммов М. tuberculosis...........................................................................................104

5.2.7.2.1. Культивирование М. tuberculosis в авоматизированной системе

ВАСТЕС MGIT 960............................................................................................ 104

5.2.7.2.2. Оценка роста М. tuberculosis методом ПЦР в реальном времени.................105

5.2.7.2.3. Определение жизнеспособности М. tuberculosis культуральным

методом (подсчет КОЕ)....................................................................................105

5.2.7.2.4. Оценка жизнеспособности М. tuberculosis микроскопией

с окразкой мазков по методу Мурохаши........................................................105

5.2.7.2.5. Определение жизнеспособности М. tuberculosis методом ПЦР

с обратной транскрипцией по количеству мРНК...........................................106

5.2.7.2.6. Регистрация роста М. tuberculosis в присутствии липосомального кардиолипина и антиоксиданта........................................................................106

5.2.7.3. Оценка роста М. tuberculosis H37R.V при культивировании с лизо- и бислизокардиолипином, фосфатидной и линолевой кислотами..........................107

5.2.7.4. Анализ эндогенных фосфолипидов М. tuberculosis H37Rv

в разных фазах роста................................................................................................107

5.2.7.4.1. Культивирование М. tuberculosis H37Rv.........................................................107

5.2.7.4.2. Экстракция липидов из клеток М. tuberculosis H37Rv, находящихся

в разных фазах роста.........................................................................................107

5.2.7.4.3. Количественный анализ фосфолипидов в полученных

экстрактах липидов...........................................................................................108

5.2.7.4.3.1. Определение липидного фосфора модифицированным методом Бартлета...............................................................................108

5.2.7.4.3.2. Определение содержания фосфолипидов денситометрией................109

5.2.8. Определение жизнеспособности стрептококков и стафилококков при культивировании с липосомальным кардиолипином методом подсчета КОЕ.......109

5.2.9. Исследования на Escherichia coli...............................................................109

5.2.9.1. Оценка жизнеспособности Escherichia coli при культивировании

с липосомальным кардиолипином в отсутствие и в присутствии антиоксидантов..............................................................................109

5.2.9.2. Изучение ДНК-репарационного SOS-ответа Е. coli при инкубации

с кардиолипином.......................................................................................................110

5.2.9.3. Изучение влияния кардиолипина на скорость трансляции белков Е. coli...........110

5.2.9.4. Влияние липосомального кардиолипина на активность ДНК-топоизомераз I и II типа из Е. coli.................................................................Ill

5.2.9.4.1. Получение суперскрученной ДНК из Е. coli для реакций с топоизомеразой I и ДНК-гиразой.....................................................................111

5.2.9.4.2. Получение релаксированной ДНК для реакции с ДНК-гиразой

в присутствии АТФ...........................................................................................111

5.2.9.4.3. Реакция релаксации суперскрученной ДНК, катализируемая топоизомеразой I...............................................................................................111

5.2.9.4.4. Реакция релаксации суперскрученной ДНК, катализируемая ДНК-гиразой в отсутствие АТФ.......................................................................111

5.2.9.4.5. Реакция суперскручивания релаксированной ДНК, катализируемая ДНК-гиразой в присутствии АТФ....................................................................112

5.2.9.4.6. Исследование накопления ДНК с одно- и двухцепочечньми разрывами

под действием кардиолипина на топоизомеразу I и ДНК-гиразу..............112

5.2.9.5. Люцигенин-активируемая хемилюминесценция клеток Е. coli

в присутствии кардиолипина...............................................................112

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................................................113

7. ВЫВОДЫ......................................................................................................115

8. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ........................ 116

9. БЛАГОДАРНОСТИ..........................................................................................118

10. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............................................................119

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - арабиногалактан

а.о. - аминокислотные остатки

АДФ - аденозиндифосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

АФК - активные формы кислорода

БОЛВ - большие одноламеллярные везикулы (липосомы)

ДИМ - фтиоцерольные димикоцерозаты

ДК - диеновые конъюгаты

ДМСО - диметилсульфоксид

ДМ-ТАП - 1,2-ди-0-миристоил-3-Лг,Аг,А'-триметиламинопропан

ДМФГ - 1,2-димиристоилфосфатидилглицерин

ДМФХ - 1,2-димиристоилфосфатидилхолин

ДМФЭ - 1,2-димиристоилфосфатидилэтаноламин

ДОФЭ - 1,2-диолеоилфосфатидилэтаноламин

ДПФХ - 1,2-дипальмитоилфосфатидилхолин

ДСК, DSC - дифференциальная сканирующая калориметрия

ЖК - жирные кислоты

кДНК - комплементарная ДНК

KJI - кардиолипин

КОЕ - колониеобразующие единицы

ЛАМ - липоарабиноманнан

ЛК - линолевая кислота

лКЛ, лизоКЛ - лизокардиолипин

ллКЛ, бислизоКЛ - бислизокардиолипин

ЛМ - липоманнан

Люц - люцигенин

Люц-ХЛ - люцигенин-активируемая хемилюминесценция

МБТ (М tuberculosis) - микобактерия туберкулеза, Mycobacterium tuberculosis

MB - метилвиологен, паракват

л/езо-ДАП - л/езо-диамипопимелиновая кислота

МИК - минимальная ингибирующая концентрация

МЛВ - мультиламеллярные везикулы

мРНК - матричная РНК

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

ОЕФ - оптические единицы флуоресценции

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

оц/дц/ссДНК - одноцепочечная/двухцепочечная/сверхспирализованная ДНК

пг - пептидогликан

ПОФХ - 1 -пальмитоил-2-олеоилфосфатидилхолин

ПОФЭ - 1 -пальмитоил-2-олеоилфосфатидилэтаноламин

птп - противотуберкулезные препараты

САР - супероксид анион-радикалы

со - стандартное отклонение

СОФХ - 1 -стеароил-2-олеоилфосфатидилхолин

СП - сигнальный пептид

ТБ - туберкулез

ТБК - 2-тиобарбитуровая кислота

ТБК-АП - ТБК-активные продукты

ТЛКЛ - 1,2-1 ',2'-тетралауроилкардиолипин

ТМКЛ - 1,2-1 ',2'-тетрамиристоилкардиолипин

топо I, topo I - ДНК-топоизомераза I

ТПКЛ - 1,2-1 ',2'-тетрапальмитоилкардиолипин

ТСКЛ - 1,2- Г,2 '-тетрастеароилкардиолипин

тех - тонкослойная хроматография

ТФФ - тетрафенилфосфоний

ФЭ - фосфатидилэтаноламии

ФИМ - фосфатидилинозитманнозиды

ФГ - фосфатидилглицерин

ФГЛ - димикоцерозаты фенолфтиоцеролов, или фенольные

гликолипиды

ФК - фосфатидная кислота

ФЛ - фосфолипиды

ФС - фосфатидилсерин

ФХ - фосфатидилхолин

ЦТФ - цитидинтрифосфат

ШЛУ - широкая лекарственная устойчивость

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол

ЕМВ - этамбутол

ERM - эритромицин

GSH - глутатион (восстановленная форма)

INH - изониазид

LFX - левофлоксацин

MALDI-TOF MS - матрично активированная лазерная десорбция/ионизация

времяпролетная (time of flight) масс-спектрометрия

NAO - 10-7У-нонил-3,6-бис(диметиламино)акридин,

10-тУ-нонилакридиновый оранжевый

OD - оптическая плотность (от «optical density»)

OFX - офлоксацин

oriC - ориджин репликации

PLAi, PLA2, PLC и - фосфолипазы Ai, A2, С и D PLD

RIF - рифампицин

SkQlH2 - 10-(6'-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний

Smr - маленькие множественнолекарственные белки-транспортеры

(от «small multidrug resistant») FTIR - ИК-спектрометрия с преобразованием Фурье

La - ламеллярная жидкокристаллическая фаза

Lp - ламеллярная гелевая фаза

Lc - ламеллярная кристаллическая фаза

Тт - средняя температура перехода из ламеллярной гелевой в

жидкокристаллическую фазу Нц - обращенная гексагональная структура

Qn - обращенная кубическая структура

2. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Несмотря на то, что к настоящему времени известно большое количество антибиотиков, борьба с туберкулезом (ТБ) до сих пор не окончена. Это связано со способностью возбудителя ТБ - Mycobacterium tuberculosis (МБТ) - переходить в дормантное (некультивируемое состояние), формируя латентную инфекцию, и приобретать резистентность к противотуберкулезным препаратам (ПТП). Эти факторы осложняют диагностику заболевания и его лечение. Схема терапии ТБ включает в себя прием одновременно нескольких ПТП в течение длительного периода времени, что сопровождается появлением у пациентов побочных эффектов. Кроме того, многие ПТП токсичны для организма человека, а лечение больных, зараженных резистентными штаммами МБТ, оказывается малоэффективным. Ввиду указанных выше недостатков ПТП актуальной является разработка принципиально новых лекарственных препаратов на основе природных наноразмерных липидных структур - липосом, которые легко захватываются фагоцитирующими клетками человека, в том числе макрофагами, в которых размножаются микобактерии туберкулеза [1, 2]. Таким образом, с помощью липосом можно осуществить направленный транспорт лекарственных препаратов. Кроме того, минимальные ингибирующие концентрации (МИК) липосомальных форм ПТП в несколько раз меньше МИК традиционных форм препаратов [3, 4]. Как правило, липосомы с включенными в них препаратами получают на основе фосфатдилихолина (ФХ), который присутствует также в плазматической мембране фагоцитирующих клеток человека.

Ранние работы нашей лаборатории были посвящены изучению влияния «пустых» (не содержащих антибиотик) липосом различного липидного состава (из ФХ, кардиолипина (KJI), гликосфинголипидов) на рост Mycobacterium tuberculosis H37Rv [5]. Было показано, что сами липосомы из КЛ обладают ингибирующим действием на рост этого микроорганизма. В связи с полученными результатами важным представлялось изучение действия липосомального KJI на различные штаммы М. tuberculosis с перспективой создания новых форм лекарственных препаратов для лечения туберкулеза путем инкапскулирования в липосомы на основе KJI известных на сегодняшний день ПТП.

Цель работы - изучение антибактериальной активности экзогенного липосомального KJI в отношении различных бактерий, в том числе М. tuberculosis, и установление возможных механизмов бактерицидного действия KJI.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• получение и характеристика липосом на основе КЛ - липида природного происхождения, выделенного из сердца быка;

• оценка влияния липосомального KJI на рост чувствительного к ПТП лабораторного штамма М. tuberculosis H37Rv;

• исследование действия липосом из KJ1 на рост резистентных к ПТП клинических штаммов М. tuberculosis (с множественной (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ));

• изучение влияния липосомального KJI на рост грамотрицательных и грамположительных бактерий, не относящихся к роду Mycobacterium',

• исследование стабильности липосом на основе KJI в условиях роста М. tuberculosis (степень окисления липида, деструкция);

• выявление мишеней и механизма бактерицидного действия экзогенного липосомального KJ1 на Е. coli.

Научная новизна работы. Впервые исследовано влияние липосом из KJ1 на рост бактерий: Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae и Escherichia coli. Установлено бактерицидное действие KJI на чувствительный к ПТП шта