Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль свободных радикалов в развитии нейродегенеративных процессов в ткани мозга и методы оценки окислительного стресса при болезни Паркинсона

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль свободных радикалов в развитии нейродегенеративных процессов в ткани мозга и методы оценки окислительного стресса при болезни Паркинсона"

На правах рукописи

ПОЛИМОВА АНАСТАСИЯ МИХАЙЛОВНА

РОЛЬ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В РАЗВИТИИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ В ТКАНИ МОЗГА И МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА ПРИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА

03.01.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических тук

11 НОЯ 2015

Москва-2015

005564350

005564350

Работа выполнена иа кафедре медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова»

Научный руководитель: кандидат химических наук,

доцент Проскуриина Елена Васильевна

Научный консультант:

доктор биологических наук,

профессор Владимиров Юрий Андреевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Иванов Илья Ильич

ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», биологический факультет, главный научный сотрудник кафедры биофизики

доктор биологических наук Михальчик Елена Владимировна

ФГБУН НИИФХМ ФМБА России, ведущий научный сотрудник лаборатории биофизических методов диагностики

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Зашита состоится « 21 » января 2016 года в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.14 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.ИЛирогова Минздрава России по адресу. 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Мишдрава России по адресу 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «..........»............................2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Свободные радикалы играют важную роль при развитии болезни Паркинсона (БП). В основе патогенеза этого заболевания лежит поражение дофаминергических нейронов. Значительный вклад в разрушение нейронов вносит чрезмерное выделение активных форм кислорода (АФК) и азота митохондриями самих нейронов и клеток микроглии. Изучение механшма нейродегенерации в результате этого процесса позволит внести коррективы в патогенетическую терапию, разработать доклиническую диагностику заболевания и превентивное лечение. На сегодняшний день для понимания механизмов пластичности мозга и нейродегенерации разрабатываются многочисленные модели паркинсонизма у животных, соответствующие клиническим и доклиническим стадиям БП у людей.

Болезнь Паркинсот - полигенное и системное заболевание. Это означает, что патологические процессы нигростриатной системы захватывают и другие отделы головного мозга, а также периферическую нервную систему, что приводит к нарушениям работы внутренних органов, что в свою очередь отражается на составе гуморальных сред. Таким образом, окислительный стресс при БП проявляется и за пределами ЦНС - в плазме крови. Интересным представляется оценка нарушения баланса между про- и аштюксиданпюй системами организма - окислительного стресса (ОС) - при БП. К настоящему времени нет единого стандартизированного подхода оценки уровня ОС в организме. Поэтому разработка методов оценки уровня ОС в организме является важной задачей для фундаментальной и прикладной медицины как для изучения механщмов развития патологии, так и контроля окислительного стресса и может помочь контролировать прогрессировать и терапию данного заболевания.

Поэтому первая часть настоящей работы посвящена исследованию роли свободных радикалов в развили нейродегенеративных процессов в ткани мозга у лабораторных животных с паркинсоншмом, а вторая — разработке методики оценки уровня окислительного стресса в плазме крови у больных с БП.

Цель работы: разработать люминесцентные методы оценки уровня локального и системного окислительного стресса, изучить роль свободных радикалов в патогенезе паркинсонизма у животных и болезни Паркинсона у людей и оцгнигь перспективы применения разработанных методов в далях диагностики и контроля терапии.

Задачи исследования:

1 Разработать методику оценки радикалобразующей способности ткани мозга методом активированной хемитоминесценции.

2 Изучить образование свободных радикалов при различной степгни деградации нигростриатной системы мозга на модели паркинсонизма у крыс, вызванного нейгороксином 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагвдропиридином (МФТП).

3 Исследовать роль свободнорадикального окисления липцдов в запуске апоптоза и развитии болезни Паркинсона на модели паркинсонизма у крыс, вызванного митохоцдриальным ядом ротеноном.

4 Изучить возможные механизмы окислительной модификации белков крови (альбумина) при окислительном стрессе.

5 Разработать, на основе полученных данных, метод оценки уровня окислительного стресса в плазме крови в клинике и применить этот метод при исследовании пациентов с болезнью Паркинсона.

Научная новизна. В данной работе предложена новая методика оценки радикалобразующей способности изолированных образцов ткани, отражающая образование супероксидного радикала в митохондриях. Впервые показано изменение уровня супероксцц анион-радикалов, нарабатываемых в про не с се дыхания митохондрий, при различной степени деградащш нигростриатной системы у мышей, соответствующей ранней симпгомной стадии БП у человека.

Впервые предложен метод оценки содержания кардиолипина в плазме крови и показано значимое увеличение некоторых молекулярных видов кардиолипина при токсин-ивдуцированном паркинсонизме. Показано увеличение содержания окисленных форм кардиолипина в области черной субстанции (ЧС).

Предложен новый простой флуоресцентный метод оценки уровня ОС три БП в

плазме крови по изменению доли окисленного альбумина.

Научная и практическая значимость работы. Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизме действия окислительного стресса в организме при БП.

Предложено техническое решение аэрации образцов для хемилюминесцентсюго измерения продукции тканью свободных радикалов в условиях сохранения жизнеспособности клеток. Разработана методика, позволяющая регистрировать радикалобразующую способность тонких срезов ткани массой в несколько мг. Данный метод может быть успешно применен в научных исследованиях механизма нейродегенеративных процессов и поиске эффективных нейропротекторов.

Предложена новая методика определения уровня окислительного стресса в организме, основанная на оценке степени окислительном модификации сывороточного альбумина с использованием простого флуоресцентного метода. Данные методики могут быть использованы для диагностических целей и контроля эффективности терапии.

Результаты выполненных исследований легли в основу евразийского патенга№018686 «Способ определения функционального состояния биологической ткани и применение этого способа для определения ее жизнеспособности и/или степени некротизации» (2013.09.30).

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы в работах, рекомендованных ВАК и получен один Евразийский патент. Результаты работы были представлены в виде устных сообщений и тезисов конференций: Фундаментальные науки - медицине, тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям программы в 2010-2012 гг, (Москва); VI Международ1йя Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых (Москва, 2011 г.), Научный симпозиум с международным участием «Проблемы медицинской биофизики» (Москва, 2012 г.), конференция «Ломоносов» (Москва, 2013), второй съезд аналитиков России (Москва, 2013 г.), ХЬ Международная научно-практическая конференция «Применение лазеров в медицине» (Ялта, Украина, 2013 г.), Одиннадцатый международный

междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, Россия, 2015 г.).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 198 источник. Работа выполнена на 129 страницах машинописного текста. Иллюстрированный материал представлен 49 рисунками и 6 таблицами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Люцигенин-активированная хемютоминесценция срезов мозга является результатом продукции супероксцд анион-радикалов в матрикс митохондрий. Данный метод позволяет проводит оценку наработки радикалов митохондриями в срезах ткани, сохраняющей свою жизнеспособность.

2. При паркинсонизме у мышей (на стадиях, соответствующие досимгггомной и ранней симпгомной стадии болезни Паркинсона у человека) происходит усиление образования супероксцд анион-радикалов в нигростриатной системе в результате нарушения работы комплекса I митохондрий.

3. При паркинсонизме у крыс на симпгомной стадии происходит окисление молекулярных видов кардиолипина, преимущественно окисляются остатки линолевой кислоты С18 2 фосфолипвда, в то время как более легкоокисляемые жирнокислотные остатки, такие как С204 и С226 не подвергаются окислению, также происходит увеличение содержания кардиолипина в плазме крови.

4. Альбумин и входящие в его состав аминокислоты (тирозин и триптофан) подвергаются окислительной модификации при воздействии УФ и других различных моделей ОС, при этом происходит изменение его флуоресцентных и ангиоксидантных свойств.

5. Изменение флуоресценции при окислительной модификации альбумина можно использовать для опенки уровня окислительного стресса. В качестве параметра для оценки окислительного стресса предложено использовать долю окисленного альбумина.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Спектры поглощения и флуоресценции регистрировали в кварцевых кюветах (/=1,00 см) на спектрофотометре SPECORD 200 («AnalyticJena», Германия) и спектрофлуориметре RF-5301PC (SHIMADZU, Япония), соответственно.

Для измерения хемшпоминесиенции (ХЛ) использовали хемшпоминометр Lum-5773 (Россия). В качестве хемилюминесцентных зондов использовали люминол (5-амино-2,3-дигццро-1,4-фталазицдион; «ICN Biomedicals», США), кумарин С-525 (2,3,5,6-1Н,4Н-тетрагидро-9-(2,-бензоимидазолил; ООО НПФ «Альфа-Аконис», Россия) и люцигенин (динитрат 10,10-диметил-9,9-биакридиния; Sigma, США).

Приготовление срезов мозга. В работе использовано 60 мышей-самцов линии C57BL/6 в возрасте 2-2,5 месяца и весом 22-26 г. Животных декаптировали, выделяли мозг, а из мозга — блоки ткани, содержащие области стриатум и область ЧС. Из блоков ткани с помощью вибратома (Vibratome 1000 Plus, Vibratome, США) получали срезы толщиной 300 мкм. Из полученных срезов выделяли область стриатума (область проекции дофаминергических аксонов) и под контролем бинокулярной лупы область ЧС (место локализации тел дофаминергических нейронов).

Исследование природы и происхождения радикалов ткани. К срезам мозга добавляли ингибитор супероксид анион-радикала - миметик супероксиддисмутазы 519В (СОД-миметик 519В, комплексное соединения iV-ацнл-/.-иистеина C5H7N03SCo-5,5H20 [Паг.РФ №225608 от 26 июля 2004г, М=470,93 г/моль]), разобщитель окислительного фосфорилирования - 2,4-дшшрофенол (ДНФ) (Sigma, США), ингибитор Комплекса I - ротенон (MP Biomedicals, Inc.), wirn6irrop миелопероксдазы - азид натрия (Sigma, США). Растворители для ингибиторов: метиловый спирт (MerckKGaA, Германия), диметилсульфоксид (ДМСО, MP Biomedicals).

Оценка радикалобразующей способности ткани мозга в норме и при паркинсонизме. Раннюю симттгомную стадию паркинсонизма у мышей моделировали четырехкратным с двухчасовым интервалом между инъекциями подкожным введением 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП,

пронейгротоксин, Sigma, США). Данная экспериментальная модель была разработана сотрудниками Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН совместно с коллегами из других институтов. Эксперименты с животными (мышами) проводили на базе Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Животным в контрольном опыте по такой же схеме вводили 0,9% NaCl. Дальнейшие манипуляции проводили через 12 часов или на 14 день после введения последней дозы токсина. Срезы мозга помещали в модифицированный раствор Кребс-Рингера (г/л: NaCl -6,96; KCl - 0,36; СаС12 - 0,22; MgSOrHiO - 0,33; NaHC03 - 2,1, D-глюкоза - 1,82; HEPES - 4,8; аскорбиновая кислота - 0,02, все реактивы производства Sigma, США; pH 7,4), содержащий 60 мкМ люцигенина, инкубировали при 37°С в течение 10 минут без аэрации, затем кювету с образом помещали в хемилюминометр. Начинали аэрацию, путем продувания через раствор слабого тока воздуха при помощи перистальтического насоса (Watson Marlow Pumps 323, Великобритания). Аналитический сигнал - суммарная интенсивность XJI (5), отображающая общее количество образовавшихся радикалов за выбранный промежуток времени.

Хроматомасс-спектрометрическое исследование переписного окисления фосфолипидов при паркинсонизме. В опытах, проведенных совместно с сотрудниками лаборатории профессора В.Е Кагана (Пиггсбургский университет, Пенсильвания, США), мы использовали ротеноновую модель паркинсонизма у крыс. Для моделирования симпгомной стадии БП крысам-самцам линии Lewis вводили внутрибрюшинно 3,0 мг/кг/день ротенона (Sigma-Aldrich, США). Животным контрольной группы по такой же схеме вводили ДМСО (растворитель для ротенона в опыте).

Экстракцию липидов из тканей области ЧС и плазмы проводили методом Фолча (Folch, 1957) и методом Блай и Дайер (Bligh and Dyer, 1959). Определение содержания фосфора липидов проводили микро методом (Boettcher, 1961). Для гидролиза ацильной цепи по положению sn-l или sn-2 липиды обрабатывали фосфолипазой Ai (PLAi, Sigma-Aldrich, США) или фосфолипазой Аз (PLA2, Sigma-Aldrich, США), соответственно. Анализ жирных кислот фосфолипидов и самих фосфолипидов был проведен с помощью метода ВЭЖХ/МС с помощью ВЭЖХ

системы Dionex Ultimate™ 3000 совмещенной с квадрупольным масс-спектрометрометром высокого разрешения с Фурье-преобразованием Q-Exactive (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA).

Выделение альбумина из плазмы крови. В работе исследованы пробы крови, взятой у 30 пациентов научного центра Неврологии РАМН с болезнью Паркинсона на различной стадии заболевания. Для определения степени выраженности расстройств движений использовали шкалу оценки Хен и Яра. К 100 мл плазмы добавляли равное количество насыщенного раствора сульфата аммония (Sigma-Aldrich, США). Смесь перемешивали и осадок отделяли центрифугированием в течение 10 минут при 450 g. Собирали надосадочную жидкость, содержащую альбумин.

Окислительная модификация белков. Окислительную модификацию альбумина осуществляли радикалами, образующиеся при термораспаде азосоединения АБАП (2,2'-азо-бис(2-амидинопропан)гидрохлорид, «Fluka», Германия) при 37°С и при добавлении к системе Со2+ (0,3 мМ) + Н2О2 (3 мМ) также раствор белка облучали ультрафиолетом в закрытой бактерицидной камере «Микроцид» (модель 1) с ртутной лампой низкого давления. Воздействовали на плазму крови BaSOj или активатором нейгрофилов (ФМЛФ, Л'-формил-метионил-лейцил-фенилаланин, Sigma-Aldrich), с последующим выделением альбуминовой фракции.

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обрабатывали статистически. Все результаты проведенного исследования представлены в виде значений средней арифметической величины ± стандартная ошибка среднего, рассчитанных по данным не менее трех экспериментов. Для оценки значимости различий между данными исследований в разных группах использован критерий Вилкоксона-Манна-Уигни р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

I. Активированная хемшиоминесценция как метод оценки радикалобразующей способности ткани мозга

Разработка метода. Для оценки изменения образования свободных радикалов в ткани мозга у мышей при паркинсонизме была разработана хемилюминесценгная методика. Срезы определенного участки ткани мозга толщиной около 300 мкм

помещали в инкубационный раствор, находящийся в кювете хемилюминометра. Для обеспечения жизнеспособности ткани во время измерений через раствор в кювете продували воздух при помощи перистальтического насоса (Рис. 1). Было показано, что скорость подачи воздуха 10 об/мин обеспечивала перемешивание раствора и достаточный приток кислорода к клеткам, при сохранении их жизнеспособности. Регистрацию ХЛ проводили в термостатированных условиях (37°С). Система была весьма чувствительна к температурному режиму: при 28°С интенсивность ХЛ срезов мозга области стриатума оставалась на уровне темнового тока — 0,07-0,08 В, в то время как при физиологической температуре 37°С достигала 1 В. Выбранная толщина срезов (300 мкм) обеспечивала достаточный доступ кислорода и субстратов дыхания ко всем клеткам образца. Таким образом, в кювете хемилюминометра были созданы условия регистрации свечения, при которых ткань сохраняла свою жизнеспособность.

А

Перистальтический насос

Рис. 1. Техническое решение аэрации срезов ткани при одновременной регистрации хемилюминесценции образцов: А - перистальтической насос для аэрации образцов и хемилюминометр для регистрации хемилюминесценции; Б — кювета для аэрации образцов: схема подачи воздуха в кювету (верхний рисунок), фотография процесса аэрации образца (нижний рисунок).

Роль аэрации. Объектом исследования служили область ЧС и стриатума у мышей линии С57В1/6. Свечение ткани наблюдалось только в условиях аэрации образцов и его перемешивания пузырьками воздуха. (Рис. 2). Прекращение пропускания воздуха приводило к появлению кратковременной вспышки, за которой следовало происходившее в течение пяти минут затухание ХЛ до уровня фонового сигнала (Рис. 2, В).

срезы

Хемилюминометр

Капилляр для подачи

2 А

1.5

В

1.5

Ш

.вкл

0.5

0.5 0

О -1-,-,-1-

О 5 10 15 20 25 Время, мин

о

0 2 4 6

Время, мин

о

5 10

Время, мин

Рис. 2. Кривые развития хемитоминесцгнции области срезов мозга стриатума с разными режимами аэрации: А — аэрацию осуществляли в течение всего опыта; Б — аэрацию начинали в момент, указанный стрелкой; В — варьировали режим аэрации образца. Стрелками указаны моменты времени включения (ВКЛ) и выключения насоса (ВЫКЛ).

Причина появления кратковременной вспышки сразу после прекращения аэрации неизвестна (Рис. 2, В); возможно, при обычных концентрациях кислорода интенсивность ХЛ уменьшена в результате кислородного тушения люминесценции возбужденных молекул продукта хемилюминесценгной реакции, и это тушение ослабевает при уменьшении концентрации кислорода. Последующее снижение ХЛ в отсутствии аэрации связано с уменьшением кислорода в среде в результате его потребления митохондриями и, соответственно, с прекращением образования супероксидного радикала в реакции восстановления кислорода дыхательной цепью. Возобновление аэрации приводило к быстрому росту свечения.

Исследование природы регистрируемых радикалов. Для оценки образования свободных радикалов в ткани в качестве активатора ХЛ использовали люццгенин, являющийся селективным зондом на супероксидный анион-радикал. Исследовано развитие ХЛ в присутствии других активаторов. Хемилюминесценция в системе, содержащей люминол, чувствительного к активным формам кислорода, была очень слабой, тогда как ХЛ в присутствии кумарина С-525 — активатора, усиливающего сверхслабое свечение при реакциях цепного окисления липидов, вообще не была обнаружена.

Для подтверждения внутриклеточного образования СЬ"- в систему с тканью добавляли СОД-миметик 519В (низкомолекулярный аналог фермента супероксиодисмутазы) в концентрации 0,01 мМ. Это привело к снижению интенсивности ХЛ на 30%. Было щучено влияние на ХЛ срезов мозга разобщителя

окислительного фосфорилирования 2,4-динигрофенола (ДНФ), ингибитора переноса электронов, а комплексе I дыхательной цепи митохондрий, ротенона и ингибитора гемовых пероксцдаз - азида натрия. (ЫаМз).

ДНФ снижал ХЛ ткани области стриатума на 58% в концентрации 0,5 мМ и на 80% в концентрации 1 мМ. Образование радикалов, продуцируемых срезами мозга области ЧС, ДНФ снижал на 56% и 87% в концентрациях 0,5 мМ и 1 мМ, соответственно. Добавление ингибитора дыхательной цепи митохондрий ротенона приводило к возрастанию образования супероксид анион-радикалов при концентрациях 2-40 мкМ. Хемилюминесценция начинала нарастать на 4-й минуте после добавления реагента. Высокая концентрация ротенона (0,1мМ) приводила, наоборот, к снижению интенсивности ХЛ тонких срезов в областях стриатума и ЧС на 54% и 56% соответственно. Азид натрия, являющийся ингибитором миелопероксдазы и др. гемосодержащих ферментов, даже в концентрации 0,1 мМ не оказывал ингибирующего действия на ХЛ ткани областей ЧС и стриатума.

Полученные результаты показывают, что люццгенин-активированная ХЛ срезов мозга в условиях аэрации обусловлена образованием супероксвд анион-радикалов в матриксе митохондрий. На основании проведенных исследований предложена методика оценки образования супероксвд анион-радикалов митохондриями в составе живой ткани, основанный на измерении люцигенин-зависимой хемилюминесценции срезов или биопгатов.

Изменение образования супероксид анион-радикалов при паркинсонизме у мышей. Возможность применения предложенной методики оценки образования супероксвд анион-радикалов срезами ткани мозга зависит, прежде всего, от разброса данных в пределах одной группы животных. В качестве параметра мы использовали светосумму хемилюминесценции в течение первых трех минут измерения, нормированную, в случае области стриатума, на массу образца (5'(ХЛ), В*с/мг ткани). Для области ЧС нормирование не производилось в виду малой массы образцов ((¿■(ХЛ), В*с). В обоих случаях была получена хорошая воспроизводимость результатов для здоровых мышей (ошибка средней лежит в пределах ±25%) (Рис. 3).

Рис. 3. Воспроизводимость результатов тканевой

хемилюминесценции срезов мозга. А и Б - область стриатума, В и Г -область ЧС. А и В - левое полушарие, Б и Г - правое полушарие. Аналитический сигнал - светосумма ХЛ за 3 минуты, значения представлены в виде среднее ± £Ц р = 0,95, п = 6.

Это позволяет исследовать сравнительно небольшие изменения образования свободных радикалов при нарушении работы митохондрий в малых образцах ткани. Нами была проведена оценка уровня образования супероксид анион-радикалов в срезах мозга мышей на ранней симгггомной и досимгггомной стадиях паркинсонизма (различное время после введения токсина: через 14 дней и через 12 часов после последнего введения — Рис. 4, Рис. 5).

Время, мин

Рис. 4. Увеличение образования радикалов в срезах мозга мышей при развитии паркинсонизма на ранней симгггомной стадии на 14 день последнего введения дозы токсина: А — данные для области стриатума, Б — для области ЧС. Темные столбики — контрольные животные с введенным раствором 0,9% ИаО, светлые столбики -животные после введения пронейротоксина МФТП. Аналитической сигнал -светосумма за три минуты. Данные представлены в виде среднее ± 50, *р <0,01, **р < 0,05 (опыт по отношению к контролю), п = 4.

Рис. 5. Увеличение образования супероксид анион-радикала в срезах мозга мышей при развитии паркинсонизма на досимптомной стадии через 12 часов после введения последней дозы токсина: А - срезы мозга области стриатум (среднее ± 5Д р < 0,01 опыт по сравнению с контролем, п = 4); Б - срезы области ЧС, индивидуальные изменения, где контроль - значения для контрольной группы животных с введенным 0,9% ЫаС1, МФТП - значения для опытной группы животных с введенным МФТП. В качестве аналитического параметра использовали суммарную интенсивность

хемилюминесценции ^(ХЛ) за 15 минут, нормированная на массу образца для области стриатума и ненормированная для ЧС.

В обоих случаях после введения МФТП происходило увеличение образования свободных радикалов в исследуемых образцах ткани областей стриатума и ЧС более чем в 1,5 раза. Стоит отметить, что увеличение уровня ОС произошло за долго до появления первых симптомов паркинсонизма, всего через 12 часов после введения пронейротоксина.

Все эксперименты, анализ полученных данных данного блока был проведены непосредственно автором за исключением введения инъекций животным.

2. Хроматомасс-спектрометрическое исследование перекисного окисления фосфолипидов при паркинсонизме

После увеличения образования митохондриями супероксид анион-радикалов одним из возможных путей развития гибели нейронов является запуск апоптоза по внутреннему (митоховдриальному механизму). В этом случае в митохондриях образуется белково-липвдный комплекс, состоящий из цщохрома с и митохоцдриального фосфолипида - кардиолипина, обладающий пероксидазной активностью. Под действием супероксиддисмутазы из образовавшегося при нарушении работы Комплекса I Ог" образуется Н2О2. Как показано в модельных экспериментах, комплекс цитохром с/кардиолипин в присутствии пероксвда водорода окисляет кардиолипин, что в свою очередь, служит сигналом для запуска апоптоза клетки (Ка§ап, 2005). Для проверки этой гипотезы мы провели анализ фосфолигщдов области ЧС у здоровых лабораторных животных (крыс) и у животных с паркинсонизмом.

Исследование изменения кардиолипина в области черной субстанции при паркинсонизме. Предварительный анализ жирноккслотных остатков фосфолипидов области ЧС показал, что окисленные продукты жирных кислот содержатся главным образом в положении sn-1. Среди выделенных ПНЖК, лит юле пая кислота (Ст) окислялась до мода-кислородсодержащих гедрокси-(HODE) и эпокси-продуктов (ЕрОМЕ), в то время как более легко окисляемые жирные кислоты, такие как С20 4 и Сг2:б не подвергались окислению.

В основных классах фосфолипидов окисляемые жирные кислоты (Сиг, Сго:4 и Сг2:4) расположены главным образом в положении sn~2, в то время как для кардиолипина могут быть равномерно распределены между положениями sn-\ и sn-2 (Tyurina, 2014). Это говорит в пользу того, что окисленные формы Сиг, обнаруженные в ЧС мозга крыс, вероятнее всего располагаются в положении sn-1 кардиолипина. Поэтому в дальнейшем исследование было сфокусирована на анализе кардиолипина ЧС. Были идентифицированы молекулярные виды кардиолипина, содержащие жирные кислоты с 2-6 двойными связями (Таблица 1). Происходило значимое снижение этих видов в области ЧС для опытной группы крыс для всех временных точек. Все молекулярные виды кардиолипина содержали в своем составе по крайней мере один остаток Ci8:2. Никаких изменений в содержании молекулярных видов кардиолипина не было обнаружено для коры головного мозга для тех же экспериментальных и контрольных групп. Таким образом, снижение содержания окисляемых молекулярных видов кардиолипина может быть связано с нарушением работы митохондрий в области ЧС после введения ротенона.

Исходя из предположения, что перекисное окисление липидов может вызывать снижение окисляемых видов кардиолипина, был проведен анализ окисленных видов кардиолипина, выделенных из ЧС. Было определено значимое увеличение содержания мот-кислородсодержащих молекулярных видов кардиолипина на 10-14 день после введения ротенона (Рис. 6). Содержать этих молекулярных видов снижалось для экспериментальных групп животных и эти виды содержат в своем составе по крайней мере один остаток жирной кислоты Си г (Таблица 1, Рис. 6).

Таблица 1. Основные окисленные и неокисленные молекулярные вицы, зарегистрированные в черной субстанции и плазме крыс с введенным ротеноном*

m/z CJV.Dß Молекулярные виды кардиолипина 14 оно-кислородсодержащис молекулярные виды кардполишша черный субстанции (т/г) Молекулярные виды карднолишша в плазме (m/Z)

1425,9771 70:5 16:1/18:1/18:1/18:2 16:0/18:2/18:1/18:2 \ 1441,9735 1425,9832

1427,9966 70:4 16:0/18:1/18:1/18:2 16:1/18:1/18:1/18:1 16:0/18:2/18:1/18:1 1443,9903 1427,9962

1430,0077 703 16:0/18:2/18:1/18:0 16:0/18:1/18:1/18:1 16:1/18:1/18:1/18:0 1446,0038 1430,0088

1454,0059 72:5 18:1/18:1/18:1/18:2 1470,0074 1454,0051

1456,0260 72:4 18:1/18:1/18:0/18:2 1472,0189 1456,0249

1475,9943 74:8 18:1/18:1/18:2/20:4 18:0/18:2/18:2/20:4 1491,9891 1475,9922

1478,0067 74:7 18:0/18:1/18:2/20:4 18;1/18:1/18:1/20:4 18:1/18:2/18:0/20:4 16:0/18:1/18:2/22:4 16:1/18:0/18:2/22:4 16:0/18:1/18:0/22:6 16:1/18:0/18:0/22:6 : 1494,0033 1478,0150

1499,9929 76:10 18:1/20:4/18:1/20:4 18:2/18:0/18:2/22:6 18:1/18:1/18:2/22:6 1515,9889 Н/О

1502,0061 76:9 18:1/18:2/18:0/22:6 18:0/18:2/18:1/22:6 18:1/18:1/18:1/22:6 18:1/202/18:0/20:4 18:2/20:3/18:0/20:4 18:1/203/18:1/20:4 1518,0026 Н/О

* где m/z - отношение массы иона к заряду иона; CN and DB обозначают общее

количество атомов углерода в углеродных цепях жирных кислот кардиолипина (Carbon Numbers) и общее количество ненасыщенных связей в кардиолипине (Double Bonds), соответственно; Н/О - не обнаружено.

4.0

¡¡3.0

11 | g 2.0

I t,n

lüAO

1

D Контрольная группа ■ Ротенон

5 День 10-14 День

§ £ 0,8 г s „.

I

ff о" •

2,0 m/z= 1491,9891

с ее 1,6 - •

1 | 1.2

■а S

1 I0,8 •

1 m 0,4

к с 0,0

5 День 10-14День 5ДенЫ0-14 День

m/z=1494,0033

m/z=1515,9889

5 День 10-14 День m/z=1518,0026

5 День 10-14 День 5 День 10-14 День 5 День 10-14 День 5 День 10-14 День

° Контрольная фуппа • Ротенон

Рис. 6. Количественна оценка общего содержания (А) и индивидуальных молекулярных видов окисленного кардиолипина (Б), выделенных из черной субстанции мозга контрольной и опытной группы крыс (с введенным ротеноном). Молекулярные виды кардиолипина с m/z 1443,9903; m/z 1446,0038; m/z 1472,0189; m/z 1491,9891; m/z 1494,0033; m/z 1515,9889; -m/z 1518,0026 образованные из молекулярных видов с m/z 1427,9966 m/z; 1430,0077; m/z 1456,0260; m/z 1475,9943; m/z 1478,0067; m/z 1499,9929; m/z 1502,0061; соответственно, после присоединения одной молекулы кислорода. Данные представлены в виде среднее ± SD, п = 4-5, *р < 0,05 относительно соответствующей контрольной группы.

Исследование изменения кардиолипина в плазме крови при паркинсонизме. После повреждения клеток окисленные и неокисленные формы кардиолипина могут попасть в межклеточное пространство и выступить в качестве так называемого сигнала «опасности», распознаваемого системой врожденного иммунитета (Krysko, 2011). Поэтому был проведен анализ содержания кардиолипина в плазме крыс.

11

1День 5 День

3 Контрольная группа I Ротенон

5 т/;-=1425.9832 (70:5)

с 3

г

"3 2

Г

* • ■

»*

1День 5 День

т/г=1427.9962 (70:4)

I

т/2=1430.0088

(70.3) 0 контрольная группа

• Ротенон

Г

1День 5 День

Рис. 7. Количественная оценка кардиолипина, выделенного из плазмы крови крыс. Количественное определение кардиолипина (А) и его молекулярные виды плазмы крови (Б). Данные представлены в виде среднее ± 573, п = 3-5, *р < 0,05 относительно соответствующей контрольной группы.

МС-анализ показал значимое увеличение некоторых молекулярных видов кардиолипина (Рис. 7). Кардиолипин в плазме был представлен неокисленными молекулярными видами (Таблица I).

Автором в данном блоке полностью была проведена пробоподготовка и анализ липвдной фракции кардиолипина.

3. Окислительная модификация альбумина как маркер окислительного при

болезни Паркинсона

При БП нарушение баланса наработки свободных радикалов происходит и за пределами ЦНС. Целесообразно для оценки уровня ОС использовать периферические маркеры, доступные для анализа.

Воздействие моделей окислительного стресса на сывороточный альбумин человека. Таким маркером может выступать сывороточный альбумин человека (САЧ). Повреждение любого участка белка под действием свободных радикалов может приводить к изменению конфигурации белка, что в свою очередь отражается на его флуоресцентных свойствах. Поэтому для исследования влияния действия

свободных радикалов на флуоресцентные свойства САЧ воздействовали различными моделями ОС (Рис. 8).

АБАП Со"*Н20, УФ нейтрофилы

Рис. 8. Изменение флуоресценции 0,66 мкМ альбумина в ФБ при воздействии различных моделей ОС: термоицдуцированный распад азосоединения АБАП, система Со2+ (0,ЗмМ) + 1ЬО; (ЗмМ), воздействие УФ-облучения (254 нм), активировшшые нейтрофилы (активация ВаБОд или фМЛФ).

Эффект окислительного стресса, вызванный воздействием липвдных радикалов (образуемых при термораспаде азосоединения АБАП, физико-химическая модель), гвдроксильного радикала (система Со2++Н202, химическая модель), УФ-облучения и нейгрофияов, активированных ФМЛФ (биологическая модель), проявляется в изменении флуоресценции альбумина, а именно в снижении интенсивности. Изменение флуоресцгнции может быть использовано для оценки повреждающего действия ОС.

Оценка уровня окислительного стресса по доле окисленного альбумина. Для простоты исследования была выбрана модель воздействия УФ: легко дозировать, не требуется добавления дополнительных реагентов в исследуемую систему. Была построена кривая зависимости изменения ДОА от дозы воздействия УФ (Рис. 9). В данном случае ДОА рассчитывалась по формуле:

Д0А = ^ (1),

'о

где /о — интенсивность флуоресценции (Хта.х=335 нм, Х«=260 нм) необлученного 0,66мкМ САЧ в ЮОмМ ФБ (рН 7,4), I — интенсивность САЧ после облучения УФ различными дозами.

08 0,6 0,4 0.2 0

✓ /

0 2 4 8

УФ облучение, Дж/см2

Рис. 9. Кривая зависимости доли окисленного альбумина (ДОА) от дозы воздействия УФ облучения. 0,66мкМ САЧ в ЮОмМ ФБ, рН 7,4. Долю окисленного альбумина определяли по изменению интенсивности флуоресценции Ктах — 335 нм, А*х= 260 нм.

Получили дозозависимое изменение параметра ДОЛ Причем сильные изменения параметра происходили при малых дозах воздействия УФ.

Определение уровня окислительного стресса при болезни Паркинсона. Подход оценки уровня ОС по степени окисленности САЧ был применен к исследованию плазмы крови пациентов с БП научного центра Неврологии РАМН. Выделенный САЧ предварительно разбавляли в 500 раз в 100 мМ ФБ (рН 7,4) и одновременно регистрировали спектр флуоресценции и спектр поглощения. Для расчета доли окисленного альбумина использовали формулу 1, где /- флуоресценция выделенного из плазмы крови альбумина (335 нм), 1а — теоретическая флуоресценция САЧ, рассчитанная с использованием градуировочной зависимости /фл (335 нм) = 0,6688-с (САЧ, мкг/мл). Содержание САЧ в кварцгвых кюветах рассчитывали спектрофотометрически при 225 нм, использую градуировочную зависимость: А (225 нм) =0,0063 с(САЧ, мкг/мл).

Рис. 10. Значения доли окисленного альбумина (ДОА) для доноров (Контроль) и

< 0,5 о

0,4

0,3 0.2 0,1 -0,0

8

0,30±0,01

О

0,2410,04 о

в

О

0,1810,07

пациентов с впервые выявленной БП (1-стадия и 2-стадия БП), * р< 0,05, **р < 0,01 для пациентов относительно контрольной группы, п = 5.

Установлено статистически значимое увеличение доли окисленного альбумина для пациентов с впервые выявленной болезнью Паркинсона по сравнению с группой доноров.

Все эксперименты, анализ полученных данных данного блока был проведены непосредственно автором за исключением отбора крови у пациентов и установлен™ степени заболевания.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Свободные радикалы играют важную роль в патогенезе БП (Рис. И). При данном заболевании имеет место как локальный (тканевой), так и системный окислительный стресс.

Изучение роли АФК в гибели нейронов (локальный ОС) нигростриатной системы возможно только на животных моделях. Под воздействием экзогенных или эндогенных факторов происходит блокирование переноса электронов через дыхательный Комплекса I цепи митохондрий нейронов области ЧС. Это приводит к угнетению дыхания, снижению синтеза АТФ и, самое важное - к увеличению образования митохондриями супероксидного аниона радикала. Этот этап в нашей работе изучался методом люцигенин-активированной ХЛ. Разработанная методика может быть успешна применена для поиска и оценки эффективности работы нейропротекторов как in vitro так и in vivo.

На следующем этапе из супероксидного анион-радикала ферментативным образом образуется пероксвд водорода, что в сою очередь приводит к липидной пероксцдации. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) на внутренней мембране митохондрий является ключевым моментом в развитии апогтгоза. Этап окисления фосфолипидов в данной работе исследовали методам хроматомасс-спектрометрии.

Дальнейшие процгссы в результате приводят к гибели нейронов и проявляются позднее в нарушении двигательной функции организма. Несмотря на многочисленные исследования роли окислительного стресса при нейродегенеративюм заболевании, до сих пор остается не выясненным факты является ли окислительный стресс причиной или следствием дегенерации нейронов и как взаимосвязаны локальный и системный окислительный стресс.

Одним га возможных путей взаимосвязи локального стресса с системным является тот факт, что в результате апогтгоза и последующего повреждения клетки ее содержимое, в том числе и фосфолипид кардиолипин может попасть в межклеточное

пространство. Это в свою очередь может служить тригером увеличения уровня системного ОС в организме. Так кардиолипин может выступать в качестве сигнальной молекулы «опасности», распознаваемой системой иммунитета. Возможно увеличение содержания кардиолипина в крови может служить биомаркером заболевания. Изменение содержания фосфолипида в работе было исследовано методом хроматомасс-спектрометрии.

Локальный ОС Системный ОС

(ткань) (кровь)

Эндогенные Экаогенкы!

факторы факторы

Нарушение двигательной функции

Рис. И. Роль свободных радикалов при болезни ТТаркинсона.

Причины увеличения уровня системного ОС при болезни БП до конца неясны, но чрезмерное образование свободных радикалов приводит к тому, что последние атакуют элементы крови: липцды, форменные элементы крови и в том числе и белки. Для оценки пагубного действия АФК была разработана методика оценки уровня ОС в плазме крови на основе оценки степени повреждения альбумина крови. Окислительная модификация белка в данной работе была исследована флуоресцентным методом.

В рамках данной работы' была показаны возможность оценки уровня образования супероксид-анион-радякалов в ткани мозга на разных стадиях деградации нигростриатной системы; показано окисление фосфолипида кардиолипина, являющееся ключевым моментом при запуске апоптоза; предложены методы оценки уровня окислительного стресса (локального и системного). Полученные данные открывают перспективу разработки, тестирования новых лекарственных веществ с нейропротекторными свойствами и контроля

эффективность терапии, что позволит, если не остановить, то хотя бы замедлить гибель нейронов и продлить комфортную жизнь пациентов с болезнью Паркинсона.

ВЫВОДЫ

1. Исследована радикалобразующая способность срезов ткани мозга методом люцегинин-активированной хемилюминесценции. Были подобраны условия измерения, при которых ткань сохраняла жизнеспособность: толщина срезов ткани (300 мкм); режим аэрации и перемешивания (10 об/мин), термостатирование образцов во время всего эксперимента (37°С), состав среды (модифицированный раствор Кребса-Рингера, рН 7,4). Методом ингибигорного анализа показано, что хемилюминссценция срезов ткани обусловлена образованием супероксид анион-радикалов, выделяемых в матрикс митохондрий.

2. Используя разработанный метод, изучено образование свободных радикалов в срезах ткани при токсин-ицдуцированном паркинсонизме (ранняя симгггомная стадия), вызванном действием нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП). Установлено, что на ранней с им гтгомной стадии паркинсонизма происходит усиление образования супероксид анион-радикалов более чем в 1,5 раза в области стриатума (область проекции аксонов дофаминергических нейронов) и ЧС (место локализации тел дофаминергических нейронов) на 14 день после введения МФТП; зафиксирована тенденция увеличения образования супероксид анион-радикалов в области черной субстанции и значимое увеличение в 1,8 раз в области стриатума через 12 часов после введения токсина.

3. На с им гтгомной стадии паркинсонизма у крыс показано увеличение содержания окисленных молекулярных видов кардиолипина в области черной субстанции, главным образом, за счет окисления жирнокислотного остатка линолевой кислоты (С182). Происходит значимое увеличение содержания молекулярных вцдов кардиолипина в плазме крови, что может служить маркером происходящих процессов гибели нейронов.

4. Альбумин и составляющие его аминокислоты тирозин и триптофан под действием УФ-облучение и других моделей окислительного стресса (действие АБАП, системы Со+2+Н2СЬ), действие нейгрофилов) претерпевают окислительную модификацию, что

выражается в снижении интенсивности УФ-флуоресценции и появлении продуктов, обладающих антиоксидангным действием, в том числе диоксифенилаланин и продукты окисления триптофана.

5. Для оценки уровня ОС в организме был предложен параметр - доля окисленного альбумина (ДОА). Показано достоверное увеличение параметра ДОА для пациентов с впервые выявленной болезнью Паркинсона.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Полимова, A.M. Продукты окисления ароматических аминокислот — антиоксиданты / А.М. Полимова, Г.А. Владимирова, Е.В. Проскурнина, Ю.А. Владимиров // Биофизика. — 2011. — Т. 56, №4. — С. 581-586.

2. Полимова, А.М. Активированная хемилюминесценция как метод оценки радикалобразующгй способности ткани мозга / A.M. Полимова, Г.Р. Хакимова, Г.К. Владимиров, Т.В. Жидкова, Д.Ю. Измайлов, Е.В. Проскурнина, М.В. Угрюмов, Ю.А. Владимиров // Технологии живых систем. — 2012. Т. 9, №10. — С. 3-13.

3. Пат. 018686 Российская Федерация, МПК51 G 01 N 33/483, G 01 N 21/76. Способ определения функционального состояния биологической ткани и применение этого способа для определения ее жизнеспособности и/или степени некротизации [текст] / Д.Ю. Измайлов, Ю.А. Владимиров, A.M. Полимова ; заявитель и патентообладатель общество с ограниченной ответственностью «ДИСофг». — № 201200925 ; заявл. 2012.07.04 ; опубл. 2013.09.30, Бюл. №9. — С. 1-7: ил.

4. Tyurina, Y.Y. LC/MS analysis of cardiolipins in substantia nigra and plasma of rotenone-treated rats: Implication for mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease / Y.Y. Tyurina, A.M. Polimova, E Maciel, V.A. Tyurin, V.l. Kapralova, D.E. Winnica, A.S. Vikulina, M.R.M. Domingues, J. McCoy, L.H. Sanders, H. Bayir, J.T. Greenamyre, V.E. Kagan // Free Radical Research. — 2015. — V. 49, №5. — P. 681 -691.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ: АФК — активные формы кислорода, ПНЖК — полиненасыщенные жирные кислоты, БП — болезнь Паркинсона, ДОА — доля окисленного альбумина, МФТП — 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин, ОС — окислительный стресс, ПОЛ — перекисное окисление липидов, САЧ — сывороточный альбумин человека, СОД-миметик — миметик супероксвддисмутазы, ХЛ — хемилюминесценция, ЧС — черная субстанция.

Подписано в печать: 19.10.2015

Заказ № 10967 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56

www.autoreferat.ru