Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пластичность нигростриатной дофаминергической системы при моделировании паркинсонизма у мышей

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Пластичность нигростриатной дофаминергической системы при моделировании паркинсонизма у мышей"

На правах рукописи #

Козина Елена Александровна

ПЛАСТИЧНОСТЬ НИГРОСТРИАТНОЙ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ПАРКИНСОНИЗМА У МЫШЕЙ

03.03.01. - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 Ж1

Москва - 2012

005012803

Работа выполнена в лаборатории гормональных регуляций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, академик РАН Угрюмов Михаил Вениаминович

Официальные оппоненты:

Раевский Владимир Вячеславович - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук, руководитель лаборатории нейроонтогенеза

Ковалев Георгий Иванович - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук, руководитель лаборатории радиоизотопных методов исследований

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский научно-исследовательский институт психиатрии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится « 18 » апреля 2012 г. в 1400 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26

Автореферат разослан « марта 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из наиболее распространенных нейромедиаторов в мозге является дофамин. Нарушение метаболизма дофамина при гибели синтезирующих его нейронов у человека приводит к развитию одного из тяжелейших нейродегенеративных заболеваний - болезни Паркинсона (БП) (.Bernheimer et al., 1973; Agid, 1991). В основе патогенеза БП лежит деградация дофаминергической нигростриатной системы мозга, обеспечивающей регуляцию двигательных функций. Характерной особенностью БП является длительное бессимптомное течение на протяжении многих лет, что, предположительно, обусловлено включением механизмов пластичности мозга. Появление со временем симптомов БП связывают не только со значительной деградацией нигростриатной системы, но и с практически полным истощением компенсаторных резервов мозга {Agid, 1991).

В силу невозможности изучения эндогенных процессов, протекающих в мозге человека на досимптомной стадии БП, вопрос о развитии нейродегенеративных и компенсаторных процессов на ранних стадиях заболевания до сих пор остается открытым и является актуальной проблемой нейронауки. Важно отметить, что фармакотерапия БП, которая начинает проводиться только после появления двигательных нарушений, со временем становится менее эффективной и приводит к появлению ряда осложнений (Mones et al., 1971; Poewe, 2006). В данной ситуации становится очевидной необходимость разработки доклинической диагностики и превентивного лечения БП. Однако создание подобных технологий невозможно без комплексного изучения механизмов пластичности мозга на ранней досимптомной стадии заболевания. Единственно возможным способом изучения ранних нейродегенеративных и компенсаторных изменений в мозге является экспериментальное моделирование БП на животных, причем основной акцент при моделировании необходимо сделать на длительное развитие нейродегенеративных процессов. В большинстве экспериментальных исследований БП, создаются модели, при которых у животных в течение короткого времени развивается симптомная стадия заболевания. При таких способах моделирования невозможно оценить не только компенсаторные процессы, включающиеся на длительной досимптомной стадии, но и те изменения, которые запускают переход заболевания из одной стадии в другую. Именно эти изменения могут служить в дальнейшем мишенью для поиска лекарственных средств, предотвращающих появление симптомов заболевания.

Таким образом, вопрос о разработке экспериментальной модели пролонгированной досимптомной стадии БП до сих пор остается актуальным, причем особый акцент при моделировании необходимо сделать на медленное и постепенное развитие патологических процессов в нигростриатной дофаминергической системе.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка экспериментальной модели пролонгированной во времени досимптомной стадии БП, а также изучение механизмов пластичности мозга на досимптомной стадии различной протяженности (коротко- и длительно-развивающейся). Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. С помощью нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП) разработать модель пролонгированного развития БП.

2. На моделях досимптомной и симптомной стадий БП в черной субстанции и в стриатуме оценить:

а) содержание моноаминов и их метаболитов;

б) количество тел дофаминергических нейронов и терминалей их аксонов;

в) содержание мРНК и белка тирозингидроксилазы, а также ее ферментативную активность.

г) Содержание мРНК Д2-рецепторов

3. Провести анализ иннервации дорзального стриатума при моделировании БП.

4. Оценить метаболизм МФТП в дофаминергической нигростриатной системе при его хроническом введении.

Научная новизна. Впервые путем введения нейротоксина МФТП в течение длительного времени смоделировано несколько последовательных фаз хронической досимптомной стадии БП и ее дальнейший переход в симптомную стадию. Получен ряд важных данных о замедлении скорости развития нейродегенеративного процесса, а именно - замедлении скорости снижения уровня дофамина и дегенерации дофаминергических терминалей в стриатуме, а также активации компенсаторных процессов в нигростриатной системе и за ее пределами при длительном введении МФТП.

Впервые показано, что при моделировании БП с помощью МФТП у животных развиваются адаптационные процессы, происходящие на уровне изменения захвата нейротоксина в дофаминергические нейроны и направленные на выработку устойчивости нейронов к токсическому действию МФТП.

Научная и практическая значимость работы. Разработанная модель хронической досимптомной стадии БП в дальнейшем может быть использована для:

а) поиска периферических эндогенных маркеров досимптомной стадии БП;

б) разработки превентивной лекарственной терапии, основанной на снижении чувствительности нейронов нигростриатной системы к действию экзогенного или эндогенного токсина и направленной на остановку или замедление дегенерации дофаминергических нейронов.

Личное участие автора. Автором были спланированы и выполнены все эксперименты, описанные в работе, за исключением части экспериментов по анализу моторного поведения животных и высокоэффективной жидкостной хроматографии, которые были проведены совместно с Институтом патологии и общей патофизиологии РАМН и Институтом фармакологии РАМН. Поставленные задачи были решены с применением современных методов физиологии, клеточной и молекулярной биологии. Выводы сформулированы на основе собственных оригинальных данных.

Апробация работы. Материалы диссертации были обсуждены на российских и международных симпозиумах: конференция «Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций» (Москва, 2008); «2-й Съезд физиологов СНГ» (Кишинев, 2008); конференция «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008); «39th annual meeting Society for Neuroscience» (Чикаго, 2009); «The Second International Workshop on Image Mining - Theory and Applications» (Lisboa, 2009); «XXI съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова» (Калуга, 2010); «II Национальный Конгресс по болезни Паркинсона и расстройствам движений» (Москва, 2011); «41st annual meeting Society for Neuroscience» (Вашингтон, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах из списка ВАК, 1 статья в зарубежном рецензируемом журнале, 1 глава в коллективной монографии и 27 тезисов конференций.

Работа поддержана грантами: РФФИ 09-04-12106-офи_м; Российский фонд гуманитарных наук 09-06-00543а; Научные школы 2110.2008.4; Программа Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине"; РФФИ-10-04-93108-НЦНИЛа.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов,

обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 342 источника. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 38 рисунков и 9 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Животные, схема эксперимента. В работе использовано 260 мышей-самцов линии C57BL/6 в возрасте 2-2,5 месяца и весом 22-26 г на момент начала эксперимента. Для моделирования хронически развивающегося паркинсонизма животным однократно раз в неделю подкожно вводили МФТП (Sigma, США) в дозе 12 мг/кг в течение 5, 7 и 10 недель (обозначается как 5x12, 7x12, 10x12). В контроле животным, по аналогичной опытным животным схеме, вводили физиологический раствор (0.9% NaCl). В экспериментах по определению активности тирозингидроксилазы (ТГ) опытным и контрольным животным за 30 минут до декапитации внутрибрюшинно вводили ингибитор второго фермента синтеза дофамина (ДА) - декарбоксилазы ароматических L-аминокислот (ДАА) - 3-гидроксибензилгидразин (NSD-1015) (Sigma, США) в концентрации 100 мг/кг (Carlsson, 1973).

Для воспроизведения модели быстроразвивающегося паркинсонизма («острая» модель) использовались следующие схемы введения МФТП: (а) двукратно с 2-х часовым интервалом в дозе 12 мг/кг для моделирования поздней досимптомной стадии (обозначается как 2x12); (б) четырехкратно с 2-х часовым интервалом в дозе 12 мг/кг для моделирования ранней симптомной стадии (обозначается как 4x12).

Оценка поведения. В хронических экспериментах каждые 7 дней (накануне перед следующей инъекцией МФТП) животных тестировали в "открытом поле" (Opto-Varimex-3, "Columbus instruments", США). В течение 3-х минут измеряли пройденный путь, время без движений и число вертикальных стоек (Kryzhanovsky et al. 1997). Дополнительно определяли длину шага (Tillerson et al. 2003). Используемые поведенческие тесты позволяют выявить основные симптомы БП - гипокинезию, атаксию и ригидность (Muralikrishnan and Mohanakumar 1998; Sedelis et al., 2001).

Взятие материала. В хронических экспериментах сбор материала проводили через неделю после последней инъекции МФТП. Животных из экспериментальных и контрольных групп декапитировали, извлекали мозг и разрезали его по среднесагитгальной плоскости. Из правой половины мозга выделяли черную субстанцию (ЧС) и стриатум (Козина и др., 2010), а затем в образцах измеряли содержание моноаминов с помощью высокоэффективной

жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ-ЭД). Левую половину мозга фиксировали иммерсией в 4% параформальдегиде, промывали в фосфатно-солевом буфере, инкубировали в 20%-й сахарозе и замораживали в гексане (Lecbiopharm, Россия). Для проведения ПЦР и определения активности ТГ, ЧС и стриатум выделяли из обоих полушарий мозга. В экспериментах с использованием острой модели БП (2x12 и 4x12) сбор материала проводили через 2 недели после введения МФТП.

ВЭЖХ. Определение содержания ДА, метаболитов ДА дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), гомованилиновой кислоты (ГВК), а также норадреналина (НА), серотонина (5-гидрокситриптамин, 5-ГТ) и метаболита серотонина - 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) в ЧС и в стриатуме проводили на обращённо-фазной колонке ReproSil-Pur, ODS-3, 4x100 мм с диаметром пор 3 мкм (Dr. Majsch GMBH, «Элсико», Россия) в 0.1М цитратно-фосфатном буфере, содержащем 1.1 мМ октансульфоновую кислоту, 0.1 мМ ЭДТА и 9% ацетонитрил с последующей электрохимической детекцией на стеклоугольном электроде (+0.85 V). В экспериментах по определению активности ТГ в собранных образцах оценивали содержание L-3,4-дигидроксифенилаланина (L-ДОФА), которое является показателем активности данного фермента.

Кроме этого, после десяти недель введений МФТП в опыте и 0.9% NaCl в контроле определяли содержание 1-метил-4-фенил-пиридин иона (МФП+) в ЧС и в стриатуме. Для этого всем животным на 11-й неделе дополнительно однократно вводили МФТП в дозе 12 мг/кг и через 20 минут после инъекции выделяли ЧС и стриатум. Определение содержания МФП+ проводили при помощи ВЭЖХ-УФ по модифицированной методике, описанной ранее Кавасаки с соавторами (Kawasaki et aï., 2007). Измерение проводили на хроматографе Agilent 1100 с диодно-матричным детектором при длине волны поглощения 295 нм. В состав мобильной фазы входили 50 мМ KH2P04 и 15% ацетонитрил. Все биохимические данные представлены в виде изменения содержания измеряемых веществ в опыте по отношению к контролю, принятому за 100%.

Стереотаксические инъекции. Для анализа иннервации стриатума при моделировании БП через 2 недели после четырехкратного введения МФТП в дозе 12 мг/кг (4x12) в опыте и 0.9% NaCl в контроле проводили стереотаксические инъекции флуоресцентного ретроградного трейсера в стриатум. Инъекции (0.5 мкл) 10% раствора трейсера (FluoroRuby, Invitrogen, США) проводили в область дорзального стриатума правой половины мозга.

Через неделю после инъекции трейсера проводили транскардиальную перфузию сначала 0.02 М фосфатно-солевым буфером в течение 15 минут, а затем охлажденным (до +4°С) 4% параформальдегидом на 0.2 М фосфатном буфере в течение 15 мин. После этого мозг постфиксировали погружением в тот же фиксатор, промывали в 0.02 М фосфатно-солевом буфере, инкубировали в 20% сахарозе и замораживали в гексане.

Иммуноцитохимия. Для моно-иммуномечения ТГ на криостате Leica (Leica СМ1850, Германия) приготавливали фронтальные серийные срезы ЧС толщиной 20 мкм и фронтальные срезы стриатума толщиной 12 мкм. В работе использовали кроличьи поликлональные антитела к ТГ (1:2000) (предоставлены проф. Тибо, Франция), вторые биотинилированные антитела (1:200) (Vector Laboratories, США) и авидин-биотиновый комплекс, связанный с пероксидазой (Vector Laboratories, США). Пероксидазу авидин-биотинового комплекса выявляли инкубацией с диаминобензидином (Sigma, США) и Н2О2.

Для двойного иммунофлуоресцентного мечения ТГ и ДАА в аксонах стриатума на «плавающих» срезах толщиной 30 мкм использовали овечьи поликлональные антитела к ТГ (1:700) (Chemicon, США), поликлональные антитела к ДАА (1:300) (Abeam, США), вторые антитела, меченные флуоресцеинизотиоционатом (FITC) (1:40) (Sigma, США) и вторые антитела, меченные цианином (СуЗ) (1:500) (Sigma, США).

Микроскопия, анализ изображений. Срезы ЧС после моно-иммуномечения на ТГ исследовали в микроскопе Olympus ВХ51 (Япония), оснащенном цифровой камерой Olympus DP70 (Япония), при увеличении объектива *10. Изображения срезов анализировали с помощью программы AnalySIS 5.0. (Olympus, Япония): на каждом срезе обводили область компактной части ЧС, содержащей тела ДА-ергических нейронов, после чего подсчитывали число нейронов, причем только с видимым ядром. Для исключения двойного подсчета нейронов, расположенных на соседних срезах, использовали метод Аберкромби (Abercrombie, 1946).

Для количественного анализа терминалей аксонов срезы стриатума после двойного иммуномечения на ТГ и ДАА исследовали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP1 (Германия). Полученные в конфокальном микроскопе «оптические» срезы толщиной 0.2 мкм анализировали с помощью программы ImageJ (NIH, США). Аксональные терминали подсчитывали в дорзальном стриатуме на площади среза 900 мкм2.

Для полуколичественного анализа ТГ в нейронах ЧС на каждом десятом срезе обводили все нейроны в компактной части ЧС. Оптическую плотность

нейронов, коррелирующую с концентрацией ТГ, определяли как «уровень серого» по следующей формуле: оптическая плотность = log (уровень сер0Г0ф0на /уровень серогосипила). Для полуколичественного анализа ТГ в волокнах стриатума использовалась разработанная совместно с Вычислительным Центром им. А.А. Дородницына РАН в ходе данной работы программа «Striatum Image Analysis» (Gurevich et. ah, 2010).

ПЦР в реальном времени. Содержание мРНК ТГ и Д2-рецепторов в ЧС и в стриатуме оценивали методом ПЦР в реальном времени. После выделения РНК из образцов проводили реакцию обратной транскрипции с помощью кита RevertAid™ Н Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, США), после чего проводили ПЦР с использованием интеркалирующего красителя SYBRGreen (Maxima SYBR Green Kit, Fermentas) на приборе IQ5 Cycler (Biorad, США). Для определения содержания мРНК ТГ использовали следующие праймеры: 5'-CGCTGGATACGAGAGGCATAG-3', 5'

GTCAGAGGAGCCCGAGGTC-3' (Синтол, Россия). Для определения содержания мРНК Д2-рецепторов использовали следующие праймеры: 5'-GTGGTGACTGGGAGGGATGG-3', 5'-GTGAACAGGCGGAGAATGGATG-3'. При стандартизации реакции определяли содержание мРНК актина (housekeeping gene) по двум последовательностям праймеров: 5'-CCAGAGGCATACAGGGACAGC-3' и 5'-TGGCACCACACCTTCTACAATG-3'. Количественную разницу в экспрессии между опытными и контрольными образцами определяли по формуле: 2'MC<t)'

Определение активности транспортера дофамина в срезах мозга ех vivo. После десяти недель введений МФТП для определения активности транспортера ДА использовали метод инкубации срезов ЧС и стриатума с меченым тритием ДА (3Н-ДА), описанный ранее (Хакимова и др., 2011).

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обрабатывали статистически с помощью F-теста для определения однородности выборки и t-теста Стьюдента для определения достоверности различий.

Результаты и обсуждение

Двигательная активность животных. Через неделю после инъекций МФТП в дозе 12 мг/кг в течение 5 и 7 недель в экспериментальных группах по сравнению с контрольными не обнаружено различий по всем используемым показателям двигательной активности (Табл. 1). Однако через 10 недель введений МФТП наблюдались изменения двух показателей из четырех -пройденный путь и длина шага снизились по сравнению с контролем на 23% и

17% соответственно (Табл. 1). Таким образом, через 5 и 7 недель введений МФТП была получена модель досимптомной стадии паркинсонизма, а через 10 недель - модель ранней симптомной стадии.

Биохимические изменения в нигростриатной системе. Через 5 недель введений МФТП содержание ДА в ЧС увеличилось на 40%, а в дальнейшем наблюдалось снижение его содержания - через 7 недель введений МФТП - до уровня контроля, а через 10 недель - на 40% относительно контроля (Рис. 1 А).

Табл. 1. Показатели двигательной активности животных через 5, 7 и 10 недель введений МФТП в эксперименте и 0.9% ИаС1 в контроле.

ХЛоказатель »ведения МФТП \ Пройденный путь (см) Число стоек Время без движения (сек) Длина шага (см)

0,9%ЫаС1 МФТП 0,9%ЫаС1 МФТП о,9%та МФТП 0,9%ЫаС1 МФТП

5х12мг/кг 727,3±91,7 726,6± 139,0 8,0±1,4 11,0±3,0 60,7±7,2 65,6±9,4 4,5 ±0,3 4,6±0,3

7x12 мг/кг 1000,2±111,7 1008,6±125,6 14,5±2,1 10,6±2,3 42,7±4,6 45,4±7,9 4,7±0,4 4,6±0,5

10x12 мг/кг 989,3±57,1 756,7±51,6* 18,8±2,9 14,1±1,7 51,8±5,3 64,2±5,9 5,2 ±0,2 4,3±0,2*

*Р<0,05 по сравнению с контролем.

При этом в стриатуме снижение содержания ДА наблюдалось уже через 5 недель введений МФТП и далее продолжало постепенно снижаться (Рис. 1Б). При этом после 10 недель введений достигло порога (80%-го снижения), что, вероятнее всего, и привело к появлению двигательных нарушений. Помимо ДА, в ЧС и в стриатуме на всех стадиях были проанализированы метаболиты ДА -ДОФУК и ГВК, а также моноамины - НА, 5-ГТ и 5-ГИУК. Изменений в содержании НА или 5-ГТ в ЧС ни на одном из сроков обнаружено не было. В стриатуме ни на одной из полученных моделей не было обнаружено достоверных изменений в уровне 5-ГТ, однако на модели ранней досимптомной стадии (через 5 недель введений МФТП) наблюдалось снижение уровня НА на 44%, при этом в дальнейшем его уровень в стриатуме оставался неизменным (Табл. 2). Можно предположить, что уменьшение концентрации НА в стриатуме является показателем нарушения НА-ергической иннервации стриатума на ранней стадии развития патологического процесса в нигростриатной системе. Дальнейшее отсутствие изменений в содержании НА в стриатуме относительно контроля может являться компенсаторным проявлением, так называемой, недофаминергической нейротрансмиссии (Лсмме/е/ а а!., 2003), наблюдаемой при истощении ДА-ергической нигростриатной системы.

Важным функциональным показателем при анализе состояния нигростриатной ДА-ергической системы является соотношение метаболит/медиатор, который в литературе рассматривается как показатель оборота ДА, включающего в себя синтез, распад, выделение и обратный захват

ДА.

□ 0,9%ЫаС1 ИМФТП

О ЕГ

со <

ч:

*

а, о ч о

и

120 1

5x12

7x12 10x12 МФТП, мг/кг

<

« й?

Я и

* 5.

св >>

е- Й

Е 5

& е-

к °

о «

пЬ)

*

40 -

п J--В1--

5x12 7x12

10x12

МФТП, мг/кг

Рис. 1. Содержание ДА в черной субстанции (ЧС) (А) и концентраг{ия в стриатуме (Б) через 5, 7 и 10 недель введений МФТП. Контроль принят за 100%. *Р<0,05 по сравнению с контролем.

Увеличение этого соотношения может интерпретироваться как компенсаторное усиление дофаминовой ейротрансмиссии. В данной работе увеличение соотношения ДОФУК/ДА и ГВК/ДА в стриатуме было обнаружено через 7 недель введений МФТП, т.е. на поздней досимптомной стадии, а через 10 недель введений МФТП - с появлением первых симптомов, данное соотношения значительно снижалось (Табл. 2).

Морфологические изменения в нигростриатной системе. Несмотря на наличие биохимических изменений в ЧС, в компактной части ЧС отсутствовала дегенерация ДА-ергических нейронов через 5, 7 и 10 недель введений МФТП (Рис. 2, ЗА). Также отсутствовали изменения размера (площадь и диаметр) нейронов. При отсутствии дегенерации нейронов в компактной части ЧС, в стриатуме на всех стадиях наблюдалась дегенерация терминалей ДА-ергических аксонов, содержащих оба фермента синтеза ДА - ТГ и ДАА (Рис. ЗБ, 4), при этом размер выживших после введения МФТП терминалей аксонов не изменялся.

Табл. 2. Содержание биогенных аминов и их метаболитов в стриатуме через 5,7 и 10 недель введений МФТП в опыте и 0.9% ЫаС1 в контроле. Контроль принят за 100%.

"~\Схема введения МФТП Моноаминь1-\^ и метаболиты 5x12 мг/кг 7x12 мг/кг 10x12 мг/кг

0,9% N00 МФТП 0,9% та МФТП 0,9% N00 МФТП

ДОФУК 100±9,3 58,3+3,6* 100+5.91 41,6±2,7* 100±4,3 15.2±2,0*

ГВК 100±10,8 57,1±3,4* 100+6,4 55.4±4,1* 100±8,2 33,9±1.5*

ДОФУК/ДА 100 2,5 116,2 4,2 100+4,8 137,7+6,5* 100+5,2 65,2+8,0*

ГВК/ДА 100 8,1 115,4 9,6 10014^ 184,5±9,7* 100±7,9 143,3+5,1*

НА 100±13Д 56,8+10,2* 100 18,3 114 20,8 100 16,3 110,2 12,5

5-ГТ 100 4,5 94 4,2 100 2,4 107,8 6,6 100 11,8 107,5 3,5

5-ГИУК 100 8,3 104,5 8 100 2,6 107,9 6,9 100 11,7 93,7 3,5

5-ГИУК/5-ГТ 100 6,5 103,6 2,7 100 4,5 89,1 3,4 100 12,1 82,4 4,5

*Р<0,05 по сравнению с контролем.

«5*

"Ч

81:. .-V. . . Ч'^'

. -ЧЯтШ ж

в

Я в - . • 161.>1.

«2

11118

к.

Рис. 2. Световая микроскопия. ТГ-иммунореактивные нейроны в компактной части черной субстанции (ЧСк) в контроле (А) и через 5 (Б), 7 (В) и 10 (Г) недель введений МФТП. Объектив х]0. ВТО - вентральная тегментная область; ЧСр -ретикулярная часть черной субстанции.

Интересно отметить, что помимо терминалей аксонов, содержащих оба фермента синтеза ДА, в стриатуме были обнаружены терминали, содержащие только один из ферментов синтеза ДА - либо ТГ, либо ДАА, при этом число моноферментных ДАА-иммунореактивных терминалей аксонов уменьшалось после введения МФТП, а число моноферментных ТГ-иммунореактивных -увеличивалось. Аналогичные результаты по изменению иннервации стриатума, а именно увеличение количества моноферментных ТГ-иммунореактивных терминалей аксонов, были продемонстрированы и на острых моделях БП. В связи с этим острая модель была выбрана нами как наиболее удобная и быстро-воспроизводимая модель для дальнейшего выяснения происхождения моноферментных ТГ-иммунореактивных терминалей и аксонов стриатума.

Сочетание методов ретроградного мечения нейронов флуоресцентным маркером (трейсером) и иммуногистохимии на ТГ позволило проанализировать все группы нейронов, которые иннервируют стриатум в норме и после введения МФТП. У животных после введения МФТП не было обнаружено групп нейронов, содержащих флуоресцентный трейсер и экспрессирущих ТГ, отличных от контрольных животных. Однако были обнаружены единичные нейроны такого фенотипа в цингулярной коре (Рис. 5А, Б) и гранулярном слое обонятельных луковиц (Рис. 5В, Г).

□ о, 9% №С1 ИМФТП

2? 120 1

+

< еГ 0) 100

< о.

о 80

+ >н

и о 60

н ч 03

о я 40

и а № 1 р. Щ 20

*

I

5x12

7x12 10x12 10x12 МФТП, мг/кг+2х12

*

I

*

I

*

1

5x12 7x12 10x12 10x12 МФТП, мг/кг +2x12

Рис. 3. Количество ТГ-иммунореактивных (ТГ+) нейронов в компактной масти черной субстанции (ЧС) (А) и терминалей аксонов в стриатуме (ТГ+/ДАА+ иммунореактивных) (Б) через 5, 7 и 10 недель введений МФТП, а также аналогичные показатели через 10 недель введений и дополнительных инъекций МФТП (10x12+2x12). Контроль принят за 100%. *Р<0,05 по сравнению с контролем.

Таким образом, был сделан вывод, что после введения МФТП может усиливаться регенерация (обратное отрастание) поврежденных ДА-ергических волокон из компактной части ЧС, при этом компенсаторное усиление экспрессии ТГ выражено ярче, чем ДАА, т.к. именно ТГ определяет скорость синтеза ДА. Также не исключается, что может происходить снижение экспрессии ДАА в выживших после действия нейротоксина ДА-ергических терминалях и аксонах стриатума.

Суммируя данные о биохимических и морфологических изменениях в стриатуме можно сделать вывод, что по мере введения МФТП происходит замедление скорости снижения ДА и дегенерации терминалей ДА-ергических аксонов: после первых пяти недель введений МФТП уровень ДА и число терминалей ДА-ергических аксонов в стриатуме снизились на 50% и 47% относительно контроля, тогда как после десяти недель введений - на 80% и 70% относительно контроля (Рис. 6). Таким образом, при хроническом моделировании БП наблюдается медленное и постепенное нарушение функционирования ДА-ергической нигростриатной системы.

Компенсаторные и адаптивные изменения в нигростриатной системе. Замедление скорости снижения ДА в стриатуме может быть связано с увеличением активности ТГ - ключевого фермента синтеза ДА - в выживших терминалях ДА-ергических аксонов стриатума. Действительно, оказалось, что активность ТГ (оцениваемая по накоплению Ь-ДОФА через 30 минут после введения ингибитора ДАА) в одинаковой степени снижается относительно контроля во всех анализируемых моделях (Рис. 7). С учетом количества дегенерировавших терминалей ДА-ергических аксонов стриатума, можно сделать вывод о компенсаторном увеличении активности ТГ в выживших терминалях ДА-ергических аксонов стриатума, что, вероятнее всего, и привело к отсутствию дальнейшего снижения в них содержания ДА.

Рис. 4. Конфокальная микроскопия. Изображения аксонов и терминалей аксонов стриатума, меченых по ТГ (А, Б, В, Г), ДАА (А', Б', В', Г') и совмещенные изображения (А", Б", В", Г") в контроле (А, А', А") и после 5 недель (Б, Б', Б"), 7 недель (В, В', В") и 10 недель (Г, Г', Г") введений МФТП. Бар -10 мкм. Стрелками отмечены терминали разного фенотипа.

Рис. 5. Флуоресцентная микроскопия. Изображения нейронов, меченых трейсером (А, В) и ТГ-иммунореактивных нейронов (Б, Г) в цингулярной коре (А, Б) и гранулярном слое обонятельных луковиц (В, Г) после четырехкратного введения МФТП в дозе 12 мг/кг. Объектив х40. Бар -100 мкм.

ЧЕРНАЯ СУБСТАНЦИЯ

-■-дофамин

-■— тела нейронов

160

«140

§120 О,

нюо

I 80

в4

40%1

НОРМА

\ \50%

порог

появление симптомов

5x12

7x12

10x12

120 \ В-100

и

П. 80 И

в 60 £ 40

^ 20 0

%

СТРИАТУМ

-•— дофамин

-■— терминали

аксонов

НОРМА

50%

30%

подог.........

появление симптомов

5x12

7x12

10x12

Рис. 6. Графическое представление развития нейродегенеративного процесса в стриатуме и в черной субстанции при хроническом введении МФТП в течение 5, 7 и 10 недель.

□ 0,9% N301 ИМФТП

150 п

и

У

со

и юо н н

Л

и о о Ж я К

£ С

50

0

11М

150 п

н ^

100 -

® з

со 8 ^ & 50 -

5x12

7x12

10x12

0

гЬ

г1~|

* ^

I* *

и

5x12 7x12 10x12

МФТП, мг/кг МФТП, мг/кг

Рис. 7. Активность тирозингидроксилазы (ТГ) в черной субстанции (ЧС) (А) и стриатуме (Б) через 5, 7 и 10 недель введений МФТП. Контроль принят за 100%. *Р<0,05 по сравнению с контролем.

Несмотря на увеличение ферментативной активности ТГ в выживших терминалях аксонов стриатума, было обнаружено, что в терминалях происходит уменьшение содержания белка ТГ (Рис. 8Б), при этом в нейронах компактной части ЧС практически на всех сроках введения МФТП происходит компенсаторное увеличение содержания белка ТГ (Рис. 8А). Наиболее ярко данный эффект был выражен через 10 недель введений МФТП. Возможными причинами данного явления могут быть нарушение быстрого антероградного аксонального транспорта, с помощью которого происходит перенос ТГ от тела

нейрона к его отростку и/или усиление активности пептидаз, разрушающих ТГ, в терминалях стриатума. Несмотря на увеличение внутринейронального содержания белка ТГ, после введения МФТП в нейронах ЧС не происходило увеличение уровня мРНК ТГ (Рис. 9А), что может свидетельствовать об увеличении скорости трансляции молекулы ТГ.

□ 0,9% №01 ИМФТП

150 1

л

н

ё я «

н V

о ч 100

сЗ

С X

5

еа 2 Й & 50

о

5x12 7x12 10x12 МФТП, мг/кг

ПН О

¡ш

5x12 7x12 10x12 МФТП, мг/кг

Рис. 8. Оптическая плотность ТГ-иммунореактивных (ТГ+) нейронов компактной части черной субстанции (А), а также ТГ-иммунореактивных терминалей стриатума (Б) через 5, 7 и 10 недель введений МФТП. Контроль принят за 100%. *Р<0,05 по сравнению с контролем.

Интересно отметить, что в стриатуме на ранней симптомной стадии (10x12) происходило повышение содержания мРНК ТГ (Рис. 9Б). Аналогичные результаты были получены и на ранней симптомной стадии острой модели БП, когда после четырехкратного введения МФТП в дозе 12 мг/кг с 2-х часовым интервалом увеличивалось содержание мРНК ТГ в стриатуме (Рис. 9В). При этом мРНК ТГ в ЧС оставалась на неизменном уровне во всех исследуемых моделях (Рис. 9А). Исходя из полученных данных, можно предположить, что при значительной деградации нигростриатной системы может усиливаться экспрессия гена ТГ в аксональных терминалях и/или «включаться» экспрессия гена ТГ в недофаминергических нейронах стриатума.

Наряду с усилением экспрессии гена ТГ в стриатуме, на ранней симптомной стадии также было обнаружено компенсаторное увеличение (на 15%) экспрессии гена Д2-рецепторов (рис. 10). Данный результат может отражать увеличение количества рецепторов на мембране нейронов-мишеней стриатума, что приводит к повышению чувствительности этих нейронов к пониженному уровню ДА. Однако, поскольку увеличение экспрессии Д2-рецепторов было не значительно, то, по-видимому, 80%-го снижения ДА в

стриатуме не достаточно для более выраженной активации данного компенсаторного процесса.

□ 0,9% №01 ИМФТП

к

1 * I 0,6

Iй 0,4

о °'2 0,0-

1,4 пА ¡Б В ¿[1,4

1 0 " ! гЛ ' I " ]Г2 | &

5x12 7x12 10x12

5x12 7x12 10x12 МФТП, мг/кг

2x12 4x12

Рис. 9. Содержание мРНК тирозингидроксилазы (ТГ) в черной субстанции (ЧС) через 5,7 и 10 недель введений МФТП (А), а также в стриатуме при хроническом (Б) и остром моделировании БП (В). Контроль принят за 1. *Р<0,05 по сравнению с контролем.

5x12 7x12 10x12 МФТП, мг/кг

Рис. 10. Содержание мРНК Д2-рецепторов в стриатуме через 5, 7 и 10 недель введений МФТП. Контроль принят за 1. *Р<0,05 по сравнению с контролем.

Поскольку после 10 недель введений МФТП нами не было обнаружено дегенерации нейронов в компактной части ЧС, то мы предприняли попытку «сорвать» адаптационные процессы и вызвать дегенерацию нейронов ЧС путем дополнительного двукратного введения МФТП в дозе 12 мг/кг с 2-х часовым интервалом (2x12), поскольку подобная схема введения МФТП, вводимая интактным животным (т.е. животным без предварительных введений МФТП) вызывает уменьшение числа ДА-ергических нейронов компактной части ЧС на

25% (Хаиндрава и др. 2010). Для этого животным после десяти недель введений МФТП на 11-й неделе (через 7 дней после последней инъекции) МФТП был введен двукратно в дозе 12 мг/кг с 2-х часовым интервалом (обозначается как 10x12+2x12). Проведение иммуногистохимического окрашивания на ТГ и последующего подсчета ТГ-иммунореактивных нейронов на серийных срезах ЧС показало, что в компактной части ЧС даже при такой схеме введения нейротоксина по-прежнему отсутствуют изменения числа ДА-ергических нейронов (Рис. ЗА). Более того, после дополнительных двукратных инъекций МФТП наблюдалось меньшее снижение числа терминалей ДА-ергических аксонов в стриатуме, чем после только десяти недель введений МФТП (Рис. ЗБ). Таким образом, подтвердилось наше предположение о том, что в нигростриатной ДА-ергической системе развивается ранее неизвестный процесс адаптации к нейротоксическому действию МФТП.

Отсутствие дегенерации нейронов компактной части ЧС может быть обусловлено включением целого ряда механизмов, развивающихся на уровне: (а) поступления МФТП в мозг (прохождении через гематоэнцефалический барьер); (б) его метаболизма в мозге (ферментативного превращения МФТП в МФП+ с помощью фермента МАО Б); (в) захвата МФП+ внутрь нейрона с помощью транспортера ДА, расположенного на мембране ДА-ергического нейрона. Изменения на каждом из этих этапов вместе или по отдельности могут привести к тому, что в мозг или в нейрон попадает меньшее количество нейротоксина, а это, соответственно, приводит к уменьшению вероятности гибели клетки. Изменения на этапе поступления МФТП, который является предшественником нейротоксина, в мозг и его дальнейшего ферментативного превращения в нейротоксин - МФП+, суммарно могут привести к снижению общего содержания МФП+ в тканях мозга. Для проверки данного предположения контрольным животным (тем, которым вводили в течение 10 недель 0.9% №С1) и опытным животным (тем, которым вводили в течение 10 недель МФТП) однократно был введен МФТП в дозе 12 мг/кг и через 20 минут собран материал для анализа содержания МФП+ в ЧС и в стриатуме. Оказалось, что содержание нейротоксина МФП+ в тканях ЧС и стриатума опытных животных аналогично его содержанию в тканях контрольных животных (Рис. 11 А). Таким образом, изменение поступления МФТП в мозг и его дальнейшего метаболизма в МФП+ были исключены как причины развития адаптации к МФТП. Поскольку МФП+ поступает из межклеточной щели в нейрон при помощи транспортера ДА, то на следующем этапе были проведены эксперименты по оценке активности транспортера ДА.

□ 0,9%ИаС1 ИМФТП

150

8 ^ О е-£ ^ Й §100

^ ГО

¡3 й

ш оа

о х

о. оЗ

¡?Г «

Стриатум

*

XI

ЧС Стриатум

Рис. 11. Содержание МФП* в черной субстанции (ЧС) и в стриатуме через 20 минут после введения МФТП животным из контрольной и опытной групп (А), а также активность транспортера дофамина в срезах ЧС и стриатум а через 10 недель введений МФТП (Б). Контроль принят за 100%. *Р < 0,05 по сравнению с контролем.

В ходе данных экспериментов было показано, что через 10 недель введений МФТП уровень обратного захвата 3Н-ДА через транспортер ДА в ЧС и в стриатуме снижается по отношению к контрольным животным на 50% и 57% соответственно (Рис. 11Б). В случае стриатума снижение уровня обратного захвата 3Н-ДА, вероятно, отчасти отражает дегенерацию терминалей ДА-ергических аксонов. Однако в случае ЧС, где дегенерация тел ДА-ергических нейронов отсутствовала вовсе, снижение активности транспортера дофамина, вероятнее всего, является адаптационным механизмом, направленным на меньшее поступление МФП+ в нейроны. Нельзя исключить, что на ранних стадиях развития БП у человека, при наличии эндогенного нейротоксина или экзогенно поступающего нейротоксина, может происходить аналогичная компенсаторная перестройка ДА-ергической нигростриатной системы для сохранения целостности нейрональной популяции.

ВЫВОДЫ

1. С помощью нейротоксина МФТП на мышах разработана модель пролонгированного развития БП.

2. На модели симптомной стадии БП по сравнению с досимптомной стадией наблюдается:

а) замедление скорости снижения содержания дофамина в стриатуме за счет увеличения активности тирозингидроксилазы в выживших терминалях дофаминергических аксонов;

б) увеличение содержания белка тирозингидроксилазы в нейронах черной субстанции и его уменьшение в аксональных терминалях стриатума, вероятнее всего, за счет нарушения аксоплазматического транспорта;

в) отсутствие изменений в экспрессии гена тирозингидроксилазы в черной субстанции и усиление его экспрессии в стриатуме.

3. При моделировании БП увеличивается число тирозингидроксилаза-содержащих волокон в дорзальном стриатуме, однако усиления иннервации стриатума из других областей мозга не обнаруживается.

4. На модели ранней симптомной стадии БП происходит уменьшение чувствительности нейронов черной субстанции к нейротоксину МФП+ за счет снижения активности транспортера дофамина, захватывающего МФП+ из межклеточной щели в нейрон.

Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК и рецензируемых иностранных изданиях:

1. Козина Е.А., Хаиндрава В.Г., Кудрин B.C., Кучеряну В.Г., Клодт П.Д., Бочаров Е.В., Раевский К.С., Крыжановский Г.Н., Угрюмов М.В. Экспериментальное моделирование функциональной недостаточности нигростриатной дофаминергической системы у мышей // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2010. Т. 96 (3). С. 270-282.

2. Хаиндрава В.Г., Козина Е.А., Кучеряну В.Г., Крыжановский Г.Н., Кудрин B.C., Клодт П.Д., Бочаров Е.В., Раевский К.С., Угрюмов М.В. Моделирование преклинической и ранней клинической стадий болезни Паркинсона // Журнал неврологии и психиатрии. 2010. Т. 7. С. 40-47.

3. Хаиндрава В.Г., Кудрин B.C., Кучеряну В.Г., Клодт П.Д., Бочаров Е.В., Нанаев А.К., Козина Е.А., Крыжановский Г.Н., Раевский К.С., Угрюмов М.В. Экспериментальное моделирование клинической и преклинической стадий болезни Паркинсона // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. Т.150 (11). С. 494-497.

4. Gurevich I.B., Kozina Е.А., Myagkov A.A., Ugryumov M.V., and Yashina V.V. Automating extraction and analysis of dopaminergic axon terminals in images of frontal slices of the striatum // Pattern Recognition and Image Analysis. Advances in Mathematical Theory and Applications. 2010. V. 20 (3). P. 349-359.

5. Ugrumov M.V., Khaindrava V.G., Kozina E.A., Kucheryanu V.G., Bocharov E.V., Kryzhanovsky G.N., Kudrin V.S., Narkevich V.B., Klodt P.M., Rayevsky

K.S. and Pronina T.S. Modeling of preclinical and clinical stages of Parkinson's disease in mice // Neuroscience. 2011. V. 181. P. 175-188.

6. Угрюмов M.B., Козина E.A., Хаиндрава В.Г., Кудрин B.C., Кучеряну В.Г., Клодт П.Д., Наркевич В.Б., Бочаров Е.В., Крыжановский Г.Н., Раевский КС. Моделирование паркинсонизма у мышей при помощи МФТП: от ранней досимптомной до поздней симптомной стадии // Технологии живых систем. 2011. №8. С. 3-13.

Глава в коллективной монографии Угрюмов М.В., Козина Е.А. Модель досимптомной стадии паркинсонизма. В кн.: «Нейродегенеративные заболевания: фундаментальные и прикладные аспекты. 2010. С. 223-229.

Труды конференций

1. Gurevich I., Koryabkina I., Kozina E., Myagkov A., Niemann H., Ugrumov M., and Yashina V. Method for automatic extraction of dopaminergic neuron terminals on striatum frontal section images // Image Mining Theory and Applications - IMTA 2009 (in conjunction with VISIGRAPP 2009). 2009. P. 3039.

2. Gurevich I., Koryabkina I., Kozina E., Myagkov A., Niemann H., Ugrumov M., and Yashina V. Automated extraction of data for construction of Parkinson's disease experimental model // Pattern Recognition and Information Processing (PRIP). 2009. P. 308-313.

Список сокращений

5-ГИУК, 5-гидроксииндолуксусная кислота;

5-ГТ, 5-гидрокситриптамин, серотонин;

L-ДОФА, Ь-3,4-дигидроксифенилаланин;

БП, болезнь Паркинсона;

ГВК, гомованилиновая кислота;

ДА, дофамин;

ДАА, декарбоксилаза ароматических L-аминокислот;

ДОФУК, 3,4-дигидроксифенилуксусная кислота;

МАО, моноаминоксидаза;

МФТП, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин;

МФП+, 1-метил-4-фенил-пиридин ион;

НА, норадреналин;

ТГ, тирозингидроксилаза;

ЧС, черная субстанция.

Заказ № 342-1/03/2012 Подписано в печать 12.03.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:irtfo@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козина, Елена Александровна, Москва

61 12-3/753

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

На правах рукописи

Козина Елена Александровна

ПЛАСТИЧНОСТЬ НИГРОСТРИАТНОЙ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ПАРКИНСОНИЗМА

У МЫШЕЙ

Специальность 03.03.01. - физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: академик, профессор доктор биологических наук, Михаил Вениаминович Угрюмов

Москва - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.......................................................................................................7

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................8

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................14

1.1. Общие характеристики дофаминергических нейронов....................................14

1.1.1. Общие представления о дофамине.................................................................14

1.1.2. Ферменты синтеза дофамина.........................................................................14

1.1.3. Ферменты деградации дофамина...................................................................19

1.1.4. Высвобождение и обратный захват дофамина...........................................21

1.1.5. Рецепторы к дофамину.....................................................................................23

1.1.6. Топография групп дофаминергических нейронов в мозге............................25

1.2. Дофаминергическая нигростриатная система взрослых млекопитающих

в норме и патологии..............................................................................................................27

1.2.1. Морфологические и функциональные характеристики дофаминергических нейронов черной субстанции.......................................................28

1.2.2. Нервная и гуморальная регуляция дофаминергических нейронов нигростриатной системы...............................................................................................28

1.2.3. Афферентная дофаминергическая иннервация стриатума......................30

1.2.4. Нейроны-мишени для дофамина в стриатуме.............................................32

1.2.5. Роль дофаминергической нигростриатной системы в регуляции моторного поведения.........................................................................................................32

1.2.6. Функциональная недостаточность дофаминергической нигростриатной системы при болезни Паркинсона..................................................34

1.2.6.1. Этиология и патогенез Болезни Паркинсона...............................................34

1.2.6.2. Компенсаторные механизмы при болезни Паркинсона...............................36

1.2.6.3. Возможная роль нейротоксинов в развитии болезни Паркинсона............38

1.3. Создание экспериментальных моделей болезни Паркинсона на животных.41

1.3.1. Фармакологические модели..............................................................................42

1.3.1.1. Резерпин вызванная модель............................................................................42

1.3.1.2. а-метил-пара-тирозин вызванная модель....................................................42

1.3.2. Генетические модели........................................................................................43

1.3.3. Нейротоксические модели...............................................................................44

2

1.3.3.1. 6-гидроксидофамин-вызванная модель.........................................................44

1.3.3.2. Ротенон-вызванная модель............................................................................45

1.3.3.3. Паракват-вызванная модель..........................................................................46

1.3.3.4. 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-вызванная модель.............46

1.3.3.4.1. МФТП-МОДЕЛИ НА МЫШАХ.............................................................................50

1.3.3.4.2. МФТП-МОДЕЛИ НА ПРИМАТАХ.......................................................................52

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................55

2.1. Животные, схемы введения МФТП.......................................................................55

2.2. Оценка двигательной активности животных при хроническом моделировании болезни Паркинсона................................................................................56

2.3. Взятие материала......................................................................................................57

2.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография при хроническом моделировании болезни Паркинсона................................................................................58

2.4.1. Определение содержания моноаминов и метаболитов..............................58

2.4.2. Определение содержания МФГ/ .....................................................................58

2.5. Стереотаксическое введение нейронального трейсера в стриатум при остром моделировании болезни Паркинсона...................................................................59

2.6. Иммуноцитохимия....................................................................................................60

2.6.1. Моноиммуномечение тирозингидроксилазы при хроническом моделировании болезни Паркинсона..............................................................................60

2.6.2. Двойное иммуномечение тирозингидроксилазы и декарбоксилазы ароматических аминокислот при хроническом моделировании болезни Паркинсона..........................................................................................................................60

2.6.3. Моноиммуномечение тирозингидроксилазы и двойное иммуномечение тирозингидроксилазы и декарбоксилазы ароматических аминокислот при остром моделировании болезни Паркинсона................................................................61

2.7. Микроскопия и анализ изображений....................................................................62

2.7.1. Световая микроскопия и количественная оценка дофаминергических нейронов черной субстанции при хроническом моделировании болезни Паркинсона..........................................................................................................................62

2.7.2. Конфокальная микроскопия и количественная оценка дофаминергических терминалей стриатума при хроническом моделировании болезни Паркинсона...........................................................................................................63

2.7.3. Флуоресцентная микроскопия и анализ нейронов, содержащих трейсер

и экспрессирующих ферменты синтеза дофамина при остром моделировании

болезни Паркинсона...........................................................................................................64

2.7.4. Полуколичественный анализ тирозингидроксилазы в нейронах черной субстанции и терминалях стриатума при хроническом моделировании болезни Паркинсона..........................................................................................................................64

2.8. Полимеразная цепная реакция в реальном времени при остром и хроническом моделировании болезни Паркинсона........................................................65

2.9. Определение активности тирозингидроксилазы при хроническом моделировании болезни Паркинсона................................................................................66

2.10. Определение скорости захвата 3Н-дофамина в срезах мозга ex vivo при хроническом моделировании болезни Паркинсона........................................................67

2.11. Статистика..................................................................................................................67

3. РЕЗУЛЬТАТЫ...................................................................................................................68

3.1. Характеристика дофаминергических нейронов нигростриатной системы при остром моделировании досимптомной и симптомной стадий болезни Паркинсона у мышей............................................................................................................68

3.1.1. Содержание мРНК тирозингидроксилазы в черной субстанции и стриатуме...........................................................................................................................68

3.1.2. Содержание мРНК Д2-рецепторов в стриатуме........................................68

3.1.3. Моноферментные тирозингидроксилаза- и декарбоксилаза-иммунореактивные нейроны в мозге до и после введения МФТП.............................69

3.2. Моделирование хронической досимптомной стадии болезни Паркинсона на мышах......................................................................................................................................70

3.2.1. Двигательная активность животных..........................................................70

3.2.2. Содержание катехоламинов в черной субстанции и стриатуме.............74

3.2.3. Количественный анализ дофаминергических нейронов в компактной части черной субстанции................................................................................................76

3.2.4. Количественный анализ аксональных терминалей стриатума...............76

3.3. Компенсаторные процессы при хроническом моделировании досимптомной стадии болезни Паркинсона на мышах.............................................................................80

3.3.1. Содержание мРНК тирозингидроксилазы в черной субстанции и стриатуме...........................................................................................................................80

3.3.2. Внутринейрональное содержание белка тирозингидроксилазы в нейронах черной субстанции и терминалях стриатума...........................................81

3.3.3. Ферментативная активность тирозингидроксилазы в черной субстанции и стриатуме.................................................................................................81

3.3.4. Содержание мРНКД2рецепторов в черной субстанции и стриатуме..83

3.3.5. Биохимические показатели в пересчете на отдельные тела нейронов и терминали их аксонов.......................................................................................................83

3.3.6. Содержание МФП* в черной субстанции и стриатуме через 10 недель введения МФТП..................................................................................................................86

3.3.7. Обратный захват Н-дофамина в черной субстанции и стриатуме после 10 недель введения МФТП................................................................................................86

4. ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................................................88

4.1. Компенсаторные процессы в нигростриатной системе и за ее пределами при остром моделировании досимптомной и симптомной стадий болезни Паркинсона

88

4.1.1. Компенсаторные изменения экспрессии гена тирозингидроксилазы и рецепторов к дофамину....................................................................................................89

4.1.2. Моноферментные тирозингидроксиалаза- и декарбоксилаза иммунореактивные волокна в стриатуме....................................................................91

4.1.3. Недостатки острой модели болезни Паркинсона.......................................96

4.2. Моделирование хронической досимптомной и симптомной стадий болезни Паркинсона.............................................................................................................................97

4.2.1. Развитие нейродегенеративного процесса в дофаминергической нигростриатной системе................................................................................................97

4.2.2. Возможные механизмы развития адаптации нигростриатной системы к длительному воздействию МФТП.............................................................................101

4.2.2.1. Содержание МФП+ в черной субстанции и стриатуме...........................101

4.2.2.2. Изменение обратного захвата дофамина в нигростриатной системе..102

4.2.3. Сравнение функциональных показателей нигростриатной системы на хронических моделях досимптомной и симптомной стадий болезни Паркинсона

102

4.2.4. Метаболизм серотонина и норадреналина при хроническом моделировании болезни Паркинсона............................................................................104

4.2.5. Развитие компенсаторных процессов в нигростриатной системе при хроническом моделировании болезни Паркинсона.....................................................106

4.3. Могут ли экспериментальные модели болезни Паркинсона на животных быть адекватны болезни Паркинсона у человека?......................................................110

ВЫВОДЫ..................................................................................................................................114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................115

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

5-ГИУК, 5-гидроксииндолуксусная кислота;

5-ГТ, 5-гидрокситриптамин, серотонин;

6-ГДА, 6-гидроксидофамин; Ь-ДОФА, Ь-3,4-дигидроксифенилаланин; БП, болезнь Паркинсона;

БШвн, внутренняя часть бледного шара;

БШн, наружная часть бледного шара;

ВМАТ2, везикулярный транспортер моноаминов 2-го типа;

ВТО, вентральная тегментная область;

ВЭЖХ, высокоэффективная жидкостная хроматография;

ГАМК, гамма-аминомасляная кислота;

ГВК, гомованилиновая кислота;

ДА, дофамин;

ДАА, декарбоксилаза ароматических Ь-аминокислот;

ДАТ, транспортер дофамина;

ДОФУК, 3,4-дигидроксифенилуксусная кислота;

КОМТ, катехол-О-метилтрансфераза;

МАО, моноаминоксидаза;

МППМ, медиальный пучок переднего мозга;

МФТП, 1 -метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин;

МФП+ , 1 -метил-4-фенил-пиридин ион;

НА, норадреналин;

СТЯ, субталамическое ядро;

ТГ, тирозингидроксилаза;

ЧС, черная субстанция;

а-МПТ, а-метил-пара-тирозин.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Одним из наиболее распространенных нейромедиаторов в мозге является дофамин (ДА). Нарушение метаболизма ДА при гибели синтезирующих его нейронов у человека приводит к развитию одного из тяжелейших нейродегенеративных заболеваний - болезни Паркинсона (БП) (Bernheimer et al, 1973; Agid, 1991). БП наряду с другими нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера, хорея Гентингтона и рассеянный склероз относят к социально значимым заболеваниям {Marras, Tanner, 2004) в силу их широкого распространения и значительных финансовых затрат на лечение больных (Winter et al., 2009). В последние годы к этим факторам добавился также рост числа людей, страдающих данными заболеваниями и тенденция к «омоложению» заболеваний, что многие исследователи связывают с усилением неблагоприятного воздействия факторов окружающей среды (Wirdefeldt et al, 2011). Однако, несмотря на весьма внушительное число проводимых в мире исследований, истинные этиологические причины развития БП до сих пор остаются неизвестными.

Специфическим проявлением патогенеза БП является деградация ДА-ергической нигростриатной системы мозга, обеспечивающей регуляцию двигательной и вегетативной функций, а также участвующей в осуществлении интегративных процессов высшей нервной деятельности. Главной особенностью БП является длительное бессимптомное течение (без проявления моторных нарушений) на протяжении многих лет (Agid, 1991), что, по-видимому, обусловлено включением компенсаторных процессов по мере деградации системы. Появление со временем симптомов БП связывают не только со значительной деградацией нигростриатной системы, но и с практически полным истощением ее компенсаторных резервов. Однако в силу невозможности изучения эндогенных процессов, протекающих в мозге человека на досимптомной стадии БП (из-за отсутствия неинвазивных и доступных методов диагностики), а также противоречивого характера данных, полученных на экспериментальных моделях БП, вопрос о развитии нейродегенеративных и компенсаторных процессов на разных стадиях заболевания до сих пор остается открытым.

Характерными симптомами БП являются дискинезия или замедленность движений (брадикинезия, акинезия), ригидность мышц, тремор покоя, неустойчивость положений тела и нарушение равновесия, а на более поздних стадиях заболевания - вегетативные и когнитивные расстройства. После появления моторных нарушений больному ставят диагноз и начинают лечение при помощи леводопы (предшественника ДА), а также

лигандов ДА-овых рецепторов или ингибиторов ферментов деградации ДА (Fahn, 2008).

8

Терапия L-ДОФА-содержащими препаратами, позволяющая продлить функциональное благополучие больного, в среднем, на 5 лет, со временем становится менее эффективной и приводит к появлению ряда осложнений, в частности медикаментозных дискинезий (Mones et al, 1971; Голубев и др., 1999; Poewe, 2006). На основании этого, в медицине окончательно пришли к выводу о том, что фармакологическое лечение людей с БП в симптомной стадии заболевания является бесперспективным {Гусев и др., 2010).

Таким образом, на сегодняшний день отсутствуют радикальные методы лечения БП и большинства других нейродегенеративных заболеваний, которые позволили бы остановить патологический процесс и значительно улучшить функциональное благополучие больного на долгое время. В данной ситуации становится очевидным, что необходимы разработка технологий доклинической диагностики и превентивного лечения БП, направленного на остановку или замедление дегенерации нейронов, а также на активацию естественных компенсаторных процессов. Создание подобных технологий невозможно без комплексного изучения механизмов пластичности мозга на ранней досимптомной стадии заболевания. Единственно возможным способом изучения ранних патологических изменений в мозге является экспериментальное моделирование БП на животных с акцентом на досимптомную стадию, причем немаловажно учесть главную особенность данного заболевания - длительное бессимптомное течение. Очевидно, что воспроизвести на животных все аспекты сложного патологического процесса, происходящего в мозге человека, невозможно, однако учет в экспериментальных исследованиях характерного хронического бессимптомного течения данного заболевания, даст возможность приблизиться к патогенезу БП у человека.

В большинстве существующих на сегодняшний день экспериментальных исследований БП, используется острая или подострая схема воссоздания данного заболевания, путем применения высоких и зачастую полулетальных доз нейротоксинов (при моделировании погибает большая часть животных) (Linder et al., 1987). При этом в течение короткого времени после инъекции нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) у животных развивается поздняя (продвинутая) симптомная стадия заболевания, полностью минуя досимптомную стадию. Лишь в единичных работах при помощи небольших доз нейротоксинов были предприняты попытки создать модели досимптомной стадии БП на мышах {Bezard et al, 1997; Prediger et al., 2010), крысах (Ossowska et al., 2005; Reksidler et al., 2008) и обезьянах {Bezard et al., 2001; Perez et al, 2008). Однако в случае одной из моделей досимптомной стадий на крысах симптомы не развивались только в течение первых трех дней после первой инъекции, а дальнейшие инъекции нейротоксина привели к появлению симпт