Новые подходы к разработке противотуберкулезных средств и их биологическая активность

Азаев, Мамедьяр Шакир оглы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые подходы к разработке противотуберкулезных средств и их биологическая активность
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Новые подходы к разработке противотуберкулезных средств и их биологическая активность"

На правах рукописи

Азаев Мамедьяр Шакир оглы

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К РАЗРАБОТКЕ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ СРЕДСТВ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

03.01.06 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени доктора биологических наук

" 4 ШР 2010

Кольцове - 2010

003493626

Работа выполнена

в ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии

«Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвигия России

Научный консультант:

доктор медицинских наук Ставскин Евгении Александрович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Аликпп Юрий Серафимович доктор биологических наук Беклемпшев Анатолий Борисович доктор медицинских наук, профессор Никонов Сергей Данилович

Ведущая организация:

ФГУН «Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича» Роспотребнадзора, Москва

Защита состоится «23» апреля 2010 года в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при «ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу. ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцове Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан «/0» 2010 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

д.б.н. Л.И. Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Актуальность проблемы

В Российской Федерации ежегодно регистрируется около 40 млн. случаев инфекционных заболеваний. Экономический ущерб, наносимый инфекционными болезнями, составляет свыше 18 млрд. рублей в год. В связи с этим одной га приоритетных государственных задач является создание в Российской Федерации собственной государственной системы разработки и производства лечебно-профилактических препаратов против возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний1.

Росту заболеваемости туберкулезом в Российской Федерации способствуют неблагоприятные изменения социально-экономических условий, резкое увеличение миграционных потоков, снижение качества противотуберкулезной службы и объема профилактических обследований. Эксперты ВОЗ подразделяют страны мира на три группы по частоте заболеваний туберкулезом: с заболеваемостью менее 25,0 на 100 тыс. населения, от 25,0 до 100,0 и свыше 100,0. Российская Федерация с показателем заболеваемости 70,99 на 100 тыс. населения (2006 г.) относится к странам с относительно высоким уровнем заболеваемости (Волкова К.И. и др., 2001; Петрухина М.И. и др., 2003; Кондратенко Т.А. и др., 2007).

Распространение лекарственно-устойчивого туберкулеза в настоящее время приняло характер мировой пандемии, способной дестабилизировать общество. Несмотря на все предпринимаемые меры, положение с этой формой туберкулеза продолжает ухудшаться. Это вызвало необходимость введения нового термина - туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью к препаратам первого и второго (резервного) ряда, а также ко всем фторхинолонам (Зипкоуа О.У. е1 а1.,2005; Сивков А.Ю. и др., 2006; Воронкова О.В. и др., 2007).

Для борьбы с лекарственно-устойчивыми формами туберкулеза в настоящее время ведутся интенсивные научные работы с целью повышения антимикобактериалыюй активности противотуберкулезных препаратов, изучение их механизма действия и адресной доставки антибиотиков и химиопрепаратов в зараженные микобакгериями макрофаги, что имеет важное клиническое значение.

'Концепция «Национальной системы химической и биологической безопасности РФ (2009 - 2013)», утв. постановлением Правительства Российской Федерации от 27 октября 2008 года.

В Российской Федерации для борьбы с туберкулезом была разработана система не только федеральных, но и региональных программ борьбы с этим заболеванием (Шевченко Ю.Л., 2000). На период 2007-2011 гг. в России действует федеральная целевая программа "Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями", где 34% всего финансирования программы направлены на противотуберкулезные мероприятия. Важной целью программы является поддержка исследований, направленных на создание современных средств диагностики, профилактики и лечения туберкулеза. Данное положение актуализировало проблему импортозамещения лекарственных препаратов зарубежного производства на отечественные и показало государственную значимость задач по разработке новых средств лечения и иммунопрофилактики опасных инфекционных заболеваний для обеспечения биологической безопасности Российской Федерации (Пальцев М.А., 2003).

Как известно, вакцинный штамм BCG из М. bovis был получен французскими учёными Кальметгом A. (Calmette А.) и Гереном К. (Guerin С.) в результате 13-летнего культивирования М. bovis (230 пассажей) на картофельно-глицериновой среде с желчью (Petroff S.A., Branch А., 1928). Однако этот вакцинный штамм и его подтипы не обеспечивают полной защиты от туберкулеза (Cole S.T., 1998) и способны вызывать генерализованные BCG-инфекции (Малярова Е.Ю. и др., 2005; Rezai M.S. et al., 2008).

В существующем в настоящее время комплексе мер по борьбе с туберкулезом, наряду со специфической химиотерапией, по-прежнему имеет большое значение вакцинопрофилактика. Поэтому исследования, направленные на совершенствование эффективности и безопасности вакцины против туберкулеза, являются актуальной задачей (Ryan A.A. et al., 2007; Maue A.C. et al., 2007).

Повышение иммуногенности вакцины BCG, создание на ее основе новых вакцинных композиций, конструирование вакцин против туберкулеза на основе достижений современной молекулярной биологии и иммунологии имеют важное значение для общественного здравоохранения. Учитывая широкий иммунобиологический эффект цитокинов, лекарственные композиции, изготовленные на их основе, могут быть использованы для иммунопрофилактики инфекционных заболеваний (Кетлинский С.А., 1992; Воробьев A.A., 1999; Авдеева Ж.И., 2000). Показано, что совместное введение вакцины BCG с гамма-интерфероном (ИФН-у) приводит к ускорению дифференцировки Т- и B-лимфоцитов, а совместное введение с

фактором некроза опухоли (ФНО-а) стимулирует их пролиферацию (Ярилин A.A., 1997).

Одним из многообещающих подходов к решению проблемы туберкулеза является создание субъединичных вакцин (Elhay M. J., 1997; Orme I.M., 1997). К настоящему времени обнаружено несколько антигенов (Ag85B, Ag85A, ESAT-6, Ag38, Agi 9, PstS-3 и др.) M. tuberculosis, которые индуцировали иммунопротективный ответ на грызунах (Lowrie D.B., 1997; Strugnell R.A., 1997; Ulmer J.B., 1997; Zhu X., 1997; Denis О., 1998; Tanghe А, 1999; Dhiman N., 1999; Brandt L., 2000). Однако для существенного повышения иммунопротективного действия при вакцинации новыми более перспективными иммуногенами необходимо разрабатывать более эффективные системы доставки антигенов. Особый интерес вызывают липосомы (Fries L.F., 1992) и биодеградируемые микрочастицы (Vordermeier Н.М., 1995) в качестве систем доставки антигенов для избирательного воздействия на иммунокомпетенгные клетки макроорганизма, имеющие в своей основе высокоочшценные протективные антигены, например белки теплового шока (Murray P. J., 1992). Перспективность этого направления была продемонстрирована конструированием вирусоподобных частиц на основе реополиглюкина и специально отобранных В- и Т-клеточных эпитопов, которые содержат только необходимые для формирования специфического иммунитета фрагменты вирусных белков (Лебедев Л.Р. и др., 2000; Karpenko L.I. et al., 2003). Публикации по аналогичным исследованиям, направленным на создание иммунопрофилактических средств против бактериальных патогенов в доступной литературе отсутствуют.

Известно, что иммуногенный потенциал антигенов в составе микрочастицы намного выше, чем в виде растворимых белков (Gregoriadis G., 1999; Venkataprasad N.. 1999; Beyer T., 2001). Кроме того, искусственные частицы должны имитировать везикулы, образующиеся при апоптозе инфицированных М. tuberculosis макрофагов, что является особенно важным с учетом незавершенного характера фагоцитоза при туберкулезной инфекции. Такие везикулы и, предположительно, микрочастицы способны эффективно процессироваться дендритными клетками и активировать цитотоксические лимфоциты, что является необходимым фактором повышения иммунного ответа на введение противотуберкулезных вакцин (Sibille Y., 1990; Kaufmann S.H., 2001).

эффективных средств профилактики и лечения туберкулеза явились основанием для проведения данной исследовательской работы.

Цель и задачи исследования

Цель настоящего исследования - конструирование средств иммунопрофилактики туберкулеза, оценка их эффективности и безопасности и изучение антимикобактериальных свойств препарата на основе коньюгата карбоксиметил-(1 -»3)-ß-D-nnoKana с моксифлоксащшом.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать методы получения микобактериальных частиц (МБЧ) на основе антигенов вакцинного штамма М. bovis и иммуномодулируюших препаратов;

- исследовать физико-химические свойства полученного препарата;

- оценить противотуберкулезную и иммунологическую эффективность и безвредность (острая токсичность, хроническая токсичность, анафилактогенность, пирогенность) применения микобактериальных частиц по сравнению с вакциной М. bovis BCG на лабораторных животных;

- изучить антимикобактериальную активность коньюгата моксифлоксацин-карбоксиметил-(1 -»3)-Р-0-глюкана in vitro и in vivo.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые разработан и предложен метод получения искусственных микобактериальных частиц на основе белков вакцинного штамма М. bovis для создания экспериментальных серий иммунопрофилактических препаратов против туберкулеза.

В экспериментах на лабораторных животных показана перспективность использования искусственных микобактериальных частиц на основе белков вакцинного штамма М. bovis для формирования противотуберкулезного иммунитета при экспериментальной туберкулезной инфекции у морских свинок, вызванной М. bovis (штамм 14ХВНИИБТЖ).

Впервые предложены вакцинные композиции на основе искусственных микобактериальных частиц (МБЧ-ИФН-у и МБЧ-ИФН-у-ФНО-а), которые обладают выраженными протективными свойствами и не уступают по эффективности вакцине М. bovis BCG.

Показано, что микобактериальные частицы на основе дсРНК (двуспиральная рибонуклеиновая кислота) и белков М bovis BCG безвредны для лабораторных животных (атоксичны, апирогенны, не анафилактогенны).

Впервые показана элиминация микобактерий туберкулеза в линии макрофагальных клеток 1774, а также в органах и тканях инфицированных экспериментальных лабораторных животных под действием копыогата моксифлоксацин-карбоксиметил-(1->3)-Р-В-глюкана с дозозависимым эффектом.

Результаты проведенных исследований являются экспериментальным обоснованием дальнейших работ по конструированию лечебно-профилактических препаратов нового поколения на основе искусственных иммуногенов в виде микрочастиц и получения коньюгированных форм химиопрепаратов. Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтверждена 2 патентами Российской Федерации на изобретения: №2190417 от 10.10.2002 «Средство для снижения токсичности химически синтезированных противотуберкулезных лекарственных препаратов» и №2242245 от 20.12.2004 «Искусственные микобактериальные частицы и противотуберкулезная вакцинная композиция на их основе».

Апробация работы

Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях и симпозиумах:

Международном симпозиуме «Интегративная Медицина в XXI веке» (Судак, Украина, 2004);

Международном Кейстоуновском симпозиуме «Интеграция хозяина и патология патогена» (Вистлер, Канада, 2005);

У1-м конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, Россия, 2005);

Международном междисциплинарном семинаре «Новые технологии в интегративной медицине и биологии» (Бангкок-Паттая, Таиланд, 2006);

П-ой интернациональной конференции «ТБ вакцины в мире» (Вена, Австрия, 2006);

Ш-ей Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006);

Работа выполнена в 2001-2009 годах в ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора в рамках научных тем организации и по грантам МНТЦ. Основные положения, выводы и практические предложения диссертации были обсуждены и одобрены на заседании научного семинара ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (2009).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Искусственные микобактериальные частицы на основе антигенов вакцинного штамма М. bovis BCG и дсРНК являются атоксичными и апиро генными для лабораторных животных и обладают высокой стабильностью и хорошей растворимостью.

2. Искусственные микобактериальные частицы обладают выраженным иммуностимулирующим воздействием на факторы Т-клеточного иммунного звена.

3. Созданные противотуберкулезные искусственные микобактериальные частицы (МБЧ) на основе антигенов вакцинного штамма М. bovis BCG и дсРНК обладают высокой иммуногенностью при экспериментальной туберкулезной инфекции.

4. Совместное введение МБЧ и цитокинов (ИФН-у и ФНО-а) формируют более высокую степень защиты лабораторных животных к экспериментальной туберкулезной инфекции. При этом степень резистентности и интенсивность факторов клеточного иммунного ответа возрастает в ряду: BCG -»• МБЧ МБЧ-ИФН-у-ФНО-а — МБЧ-ИФН-7.

5. Препарат карбоксиметил-(1-+3)-Р-0-глюкана с ковалентно связанным моксифлоксацином обладает выраженным антимикобактериальным эффектом.

Публикации результатов исследований

По теме диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе 11 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации. Получено 2 патента Российской Федерации.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 215 страницах машинописного текста, включает 23 таблицы и 32 рисунка и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, практические предложения, выводы и список литературы, содержащий 356 работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследований

Штаммы микроорганизмов

В работе использовали следующие штаммы микобактерий:

- вакцинный штамм М. bovis (вакцина BCG), полученный из НИИ вакцин и сывороток, Ставрополь. Штамм использовали для получения белков-антигенов и для иммунизации морских свинок и мышей линии BALB/c;

- возбудитель бычьего туберкулеза Л/, bovis, штамм 14х ВНИИБТЖ

(предоставлен д.в.н. Донченко H.A., заведующим лабораторией

туберкулеза сельскохозяйственных животных НИИ экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН). Штамм культивировали на плотной питательной среде Финн-2. Образцы готового материала хранили после сбора биомассы не более 72 ч при температуре +4°С и использовали в дальнейшем для заражения морских свинок и мышей линии BALB/c;

- штамм М. tuberculosis Erdman получен из ГЙСК им. JI.A. Тарасевича. Штамм культивировали до концентрации 5 х Ю8 бактериальных клеток/мл на плотной питательной среде (Левенштейна - Йенсена) и на жидкой питательной среде (Middlebrook 7Н9 agar base, Difco Laboratories) с добавлением бычьего сывороточного альбумина (фракция 5). После пассажа на питательных средах проводили подтверждение стабильности культуральных, морфологических, ферментативных свойств штамма в соответствии с паспортом культуры микроорганизма. Штамм использовали для заражения моноцитов и макрофагов;

- лекарственно-устойчивые штаммы М. tuberculosis выделены в бактериологической лаборатории Новосибирского научно-исследовательского института туберкулеза из мокроты больных с деструктивными и диссеминированными формами туберкулеза легких (в работе использован штамм №131, устойчивый к изониазиду, и штамм №234, устойчивый к рифампицину).

Для модели туберкулезной инфекции использовали пгтамм М. tuberculosis H37Rv, полученный из коллекции микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Штамм депонирован в Коллекцию культур микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером В-900.

Животные

В работе использовали кроликов породы «Советская шиншилла» весом 2-2,2 кг, аутбредных морских свинок весом 250-300 г, нелинейных белых

мышей весом 18-20 г, мышей линии C57B1/6J (генотип Н-2Ь) весом 18-20 г, мышей линии BALB/c весом 18-20 г. Все животные были получены го питомника лабораторных животных ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и содержались на стандартном рапионе с достаточным количеством воды. Все манипуляции с животными в экспериментах проводили в соответствии с требованиями биоэтическош комитета ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и на основе «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Уход за инфицированными животными и работу с ними осуществляли в условиях инфекционного вивария с уровнем биологической безопасности BSL-2.

Биохимические методы

Получение препарата МБЧ. 20 мг сухой биомассы бактерий вакцинного штамма М. bovis (вакцина BCG) суспендировали в 5,0 мл буфера (10 мМ калий-фосфат, pH 7,5, 150 мМ NaCl) и обрабатывали ультразвуком (УЗДН-2Т, 22 кГц) 5 экспозиций по 20 сек. К полученной суспензии для удаления липополисахаридов добавляли 250 мкл хлороформа, интенсивно перемешивали 5 мин и центрифугировали (20 мин при 10000 об/мин). Отбирали водную фазу и к ней для осаждения ДНК добавляли 1,3 мл раствора 5 М NaCl и 0,3 мл 10%-ного раствора полиэтиленимина. Смесь перемешивали, инкубировали 20 мин на ледяной бане и центрифугировали (20 мин при 10000 об/мин). Водную фазу диализовали против карбонатного буфера (25 мМ NaHC03, pH 9,0), содержащею 150 мМ NaCl.

Для синтеза коньюгата суммарных антигенов BCG с полиглюкином 3 мг полиглюкина растворяли в 0,5 мл 10 мМ раствора периодата натрия и инкубировали 2 ч при 20°С. Активированный полисахарид отделяли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 (V=2 мл) и добавляли 6 мл раствора, содержащего 1,0 мг спермидина и 5,0 мг антигенов BCG. После инкубации в течение ночи при 6°С непрореагировавшие компоненты удаляли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 (V=20 мл).

В качестве «центрального ядра» искусственной МБЧ использовали дсРНК дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae М437 Y116 (L-форма - 3 МДа, М-форма - 1,2 МДа). Для сборки частиц к 3,0 мг дсРНК, растворенной в 1 мл физиологического раствора, добавляли полученный коньюгат, смесь инкубировали 2 ч при 4°С и образовавшийся комплекс отделяли гель-фильтрацией на колонке с сефарозой CL-6B (V=25 мл). Полученный препарат стерилизовали ультрафильтрацией на фильтрах Millipore с размером пор 0,45 мкм.

Для получения вакцинных композиций на основе препарата МБЧ в раствор с полученными МБЧ добавляли препараты цитокинов: ИФН-7 (препарат

МБЧ-ИФН-у) или совместно: ИФН-у и ФНО-а (препарат МБЧ-ИФН-у-ФНО-а) го расчета на 30 мкг белков-антигенов BCG 10 мкг (105 ME) ИФН-у или 10 мкг (105 ME) ИФН-у и 10 мкг (105 ME) ФНО-а. В работе использовали препараты дсРНК, ИФН-у и ФНО-а производства ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Молекулярную массу компонентов препарата МБЧ определяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле (Маниатис Т., 1984). В качестве стандарта молекулярных масс использовали гидролизат ДНК фага X/EcoRI. В соседние лунки геля вносили по 1-3 мкг препаратов. Электрофоретическое разделение проводили в течение 1 ч при 120 В. Нуклеиновые кислоты в геле окрашивали раствором бромистого этидия и визуализировали в ультрафиолетовом свете.

Биофизические методы

Для электронной микроскопии препарат МБЧ адсорбировали на сегочках с формваровой подложкой в течение 1-2 мин. Был применен метод негативного контрастирования образцов 1%-ным раствором уранилацетата. Электронная микроскопия была нроиедена д.б.н., профессором Е.И. Рябчиковой (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора). Исследование проводили с использованием электрошюго микроскопа JEM100C (Япония).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью вычислений средних значений и среднестатистических отклонений (М±ш) с использованием пакета программ для статобработки Microsoft Excel. Оценку специфичности и чувствительности серологических методов проводили с использованием таблиц Генеса (Генес B.C., 1967). Достоверность полученных данных оценивали с использованием различных уровней значимости (0,05; 0,01; 0,001) (Ашмарин И.П., Воробьев А А, 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты, связанные с получением препарата МБЧ и вакцинных композиций и оценкой их иммуногенных и протектиеных свойств, изучением токсикогенных эффектов препарата МБЧ (пирогенность, острая и хроническая токсичность, анафилактогенность)

В данной работе мы использовали принцип объединения в одной композиции цитокинов и антигенов BCG. В качестве средств доставки иммуногеиов использован! искусственные микобактериальные частицы.

Стадии получения МБЧ:

■ Стадия 1. Получение белков-антигенов вакцинного штамма М. bovis (вакцины BCG).

■ Стадия 2. Синтез конъюгата антигены BCG-спермидин-полиглюкин.

■ Стадия 3. Сборка МБЧ.

■ Стадия 4. Получение противотуберкулезной вакцинной композиции. Организация микобактериальной частицы представлена на рис. 1.

Рис. 1. Организация микобак1ериальной часгицы:

1- антигены ВСО в составе коньюгата спермидин-нолт люкин

2- дсРНК дрожжей

3- спермидин-полш люкин

Известно, что синтетические и природные двуспиральные РНК усиливают иммунный ответ на целевой иммуноген при иммунизации (Лебедев Л.Р. и др., 2000). В связи с этим в качестве «центрального ядра» конструкции была использована дсРНК дрожжей (2). Второй компонент' -полиглюкин (3), собственно формирующий МБЧ, представлен низкомолекулярной фракцией природного декстрана с молекулярной массой 60±10 кДа.

Спермидин содержит 3 аминогруппы и в составе конъюгата придает последнему положительный заряд. За счет этого молекулы конъюгата формируют внешнюю оболочку, взаимодействуя с отрицательно заряженными молекулами нуклеиновой кислоты.

Для получения коньюгата использовали окисление декстрана периодатом натрия до образования альдегидных групп, которые затем реагировали с аминогруппами вносимых веществ (спермидина и антигенов). Не вступившие в реакцию альдегидные фунны блокировали компонентами

буфера, содержащими аминогруппы. Промежуточные соединения, несущие азометшювую группу, восстанавливали внесением боргидрида натрия. Такой метод иммобилизации не требует присоединения дополнительных химических реагентов к конечному продукту в виде спейсерных групп (глутаровый альдегид, эпихлоргидрин и т.п.). В этом случае не повышается токсичность получаемого препарата. Конечный препарат МБЧ переводили в физиологический раствор.

Известно, что ведущую роль в стимуляции иммунного ответа играет ИФН-у, и индивиды с нарушенной системой продукции ИФН более подвержены воздействию инфекционных агентов (Ьа1уащ А., 1998). Исходя из этих данных, и были сконструированы МБЧ с индуктором ИФН-у -композиция, включающая один из цитокинов. В состав другой вакцинной композиции помимо ИФН-у был введен цитокин ФНО-а из расчета по 10 мкг (105 МЕ) ИФН-у и ФНО-а на 30 мкг белков-антигенов ВСО.

Таким образом, был получен препарат МБЧ и две вакцинные композиции на его основе: препарат МБЧ в комбинации с ИФН-у и препарат МБЧ в комбинации с ИФН-у и ФНО-а одновременно.

Изучение физико-химических свойств препарата МБЧ По физико-химическим свойствам препарат МБЧ представляет собой набор микрочастиц с молекулярной массой 10-12 МДа. Основные физико-химические показатели представлены в табл. 1.

Таблица 1

Физико-химические свойства препарата МБЧ

Показатель Описание

Внешний вид Порошок белого цвета, без запаха, гигроскопичен

Растворимость Растворим в воде, практически не растворим в спирте, хлороформе, эфире

Молекулярная масса 10-12 МДа

Содержание белка в одной дозе (30 мкг) Не более 40%

На электрофореграмме в агарозном геле (рис. 2) видно, что дсРНК (Ь- и М-формы), покрытая коныогатом «полиглюкин-спермидин», имеет меньшую подвижность. Это можно объяснить увеличением молекулярной массы и тем, что положительно заряженный сиермидин частично нейтрализует в

комплексе отрицательный заряд РНК. МБЧ (дсРНК, покрытые конъюгатом «спермидин-полиглюкш-белки ВСй») имеют еще меньшую подвижность в геле агарозы - на уровне фрагментов ДНК с молекулярной массой около 1012 МДа.

Рис. 2. Электрофора рамма компонентов препарата МЬЧ в 1%-ном геле агарозы:

1 - исходная дсРНК;

2 - дсРНК в оболочке из коныогата «спермидин-иолиглюкин»;

3 - дсРНК в оболочке из конъюгата «спермидин-иолиглюкин-антигенные белки ВСС»;

4 - маркеры молекулярной массы (гидролизат ДНК фага Х!ЕсоШ)

На рис. 3 представлена электрофореграмма белков вакцинного препарата ВСО и МБЧ, полученная после электрофореза в 10%-ном ДСН-ПААГ.

66 кДа

45 кДэ 36 кДа 29 кДа

20,1 кДа 14,4 кДа

Рис. 3. Элекгрофоре! рамма белков вакцинного препарата ВСО и МБЧ. Электрофорез проводили в 10%-ном ДСН-ПААГ:

1. Маркеры молекулярных масс белков (66 кДа, 45 кДа, 36 кДа, 29 кДа, 20,1 кДа и 14,4 кДа);

2. Ьелковый спектр микобаюерий ВССт;

3. Белковый спектр препарата МБЧ

Электрофореграмма белков вакцинного препарата ВСО и МБЧ в 10%-ном ДСН-ПААГ показывает, что в состав препарата МБЧ входят белки вакцинного препарата ВСй с молекулярными массами в диапазоне от 14,4 кДа до 66 к Да.

Для проверки полноты упаковки нуклеотидного материала в собранной конструкции и его защищенности от воздействия нуклеаз проводили обработку конструкции РНКазой (0,05 мг/мл). Реакционные смеси

анализировали с помощью гель-электрофореза. Микрочастицы в полученном препарате сохраняли свою компактную структуру при 4°С не менее 6 месяцев.

Электронная микроскопии препарата МБЧ Полученные искусственные микрочастицы имели шарообразную форму с диаметром в диапазоне 10-25 нм (рис. 4). Такой размер частиц позволяет использовать МБЧ для иммунизации без адъювантов как полноценные антигены.

ШГ'Щттт

О °

Q ф

so им

Рис. 4. Электронная микрофотография препарата МБЧ

Оценка иммуногенных и протективных свойств препарата МБЧ и вакцинных композиций

Изучение протективных свойств препарата МБЧ и вакцинных композит»! на его основе проводили на однородной партии здоровых морских свинок, предварительно проверенных на отсутствие контаминации М. bovis. Заражение животных проводили внутримышечно возбудителем М. bovis (штамм 14х ВНИИБТЖ) в объеме 0,5 мл физиологического раствора, содержащего 10' микробных клеток, на 30-е сутки после иммунизации животных вакциной BCG, препаратом МБЧ и вакцинными композициями МБЧ-ИФН-у и МБЧ-ИФН-у-ФНО-а.

Протективные свойства препарата МБЧ и вакцинных композиций оценивали по количеству выживших животных после заражения М. bovis. Полученные данные представлены в таблице 2.

Таблица 2

Восприимчивость морских свинок к заражению М. bovis через 30 суток после иммунизации вакциной BCG, препаратом МБЧ и вакцинными композициями

Наименование препарата, .loia н способ иммунизации Количесию жнв01ны.ч и оныге СПЖ заболевших ;ки вотных (cvikii) Ко. i и чес i но погибших живошыхот |\Серкулезнои инфекции % гибели

1. DCG. 30 мкг, п'к 20 94±13 14 70

2. МБЧ, 30 мкг, п'к 20 102+6 11 55

3. МБЧ-ИФ1 {-у:(МБЧ + 10 мкг (10' МЕ) ИФН-у на 30 мкг белков-антигенов BCG), и к 20 135±5 10 50

4. МБЧ-ИФН-у-ФИО-а: (МЬЧ + 10як1 (10s МЕ) ИФН -у г 10мкт(105МЕ) ФНО-а наЗО mki белков-антигепов ВСО). п к 20 105±7 12 00

5. Контроль (К+): M.bovis, в'м 10 71±7 10 100

6. Кош роль (К-): здоровые неиммушпиропзиные животные (ф|п. р-р 0,5 мл). в'м 10 - - 0

Примечание: СПЖ - срелняя продолжительность язпнн

МЕ - межд>народная единица

В результате проведенного эксперимента установлено, что при применении вакцины BCG количество больных и павших животных достигало 70%, а при применении вакцинной композиции МБЧ-ИФН-у - не более 50%. Количество больных и павших животных при применении МБЧ-ИФН-у-ФНО-а состашшо 60%. Следует особо отметить, что сам препарат МБЧ также способствовал формированию противотуберкулезного иммунитета у морских свинок без совместного введения с цигокинами. При .макроскопическом исследовании павших после заражения М. bovis животных отмечались поражения бронхиальных, брыжеечных, иредлонаточных лимфатических узлов. Наиболее высокая частота патологических изменении отмечалась п легких и в печени. Средняя продолжительность жизни (СПЖ) морских свинок, иммунизированных вакциной BCG, составила 94±13 суток, а в группе морских свинок, иммунизированных препаратом МБЧ-ИФН-у -

135±5 (наиболее продолжительная СГОК относительно других групп животных). Гибель нсиммупшированных животных (из контрольной группы) наступала на 71 ±7 сутки после заражения возбудителем М. bovis.

Максимальный протектнпный эффект наблюдался при использовании вакцинной композиции МБЧ-ИФИ-у.

Пчучанм'. воздействия препарата МЯЧ и еакгпшных композиций на факторы клеточного иммунного ответа у морских спинок

Для изучения состояния клеточного иммунного ответа п клинической и экспериментальной иммунологии чаще всего используется РБТЛ (реакция бластной трансформации лимфоцитов), заключающаяся в определении пролиферации лимфоцитов и появлении бластоцитов при воздействии на пул лимфоцитов антигенами и митогонами. Проведенное сравнительное изучение интенсивности пролиферативного ответа лнмфоцнтои иммуиизнровашшх морских свинок in vitro показало, что уровень пролиферативного ответа у иммунизированных животных вакцинными композициями МБЧ-НФН-у, МБЧ-ИФН-у-ФНО-сс выше, чем при применении вакцины BCG (табл. 3). У морских евниок, иммунизированных препаратами МБЧ-ИФН-у, МБЧ-ИФН-у-ФНО-а, лимфоциты периферической кровн лучше отвечали на туберкулин (PPD), чем на ФГ'Л в реакции РБТЛ. Это свидетельствует о том, что введение микобактериальиых частиц совместно с пшма-шггерферопо.м человека дополнительно усиливало уровень клеточного иммунного ответа.

Таблица 3

Про.шфсратлвная активность лимфоцитов периферическом крови морских свинок, имму нитрованных вакциной ВС О, препаратом МБЧ н вакцинными композициями

Наименование препарата С>1КИ ОТ начала иммунизации ИС =' анмиси (мшогеи) / нпироль, ими/мин

ИС : ГРО ИС : ФГА Кош роль: смотанная пролиферация

МБЧ 3-й 7-е 1,91 ±0,4 1.88 + 0.2 2.92 ±0,4 2.98 ± 0.3 4102 ±347 4119 ±380

МЬЧ-МФН-у 3-й 7-о 3,40 ±0,3* 3.20 ±0,1* 2,63 ±0.5 2,74 ±0,2 4256±356 4132+343

МБЧ-ИФН-у-ФНО-а 3-й 7-о 1,92 ±0,3 1,99 ±0,2 2,82 ±0.2 2,79 + 0,3 •4230+ 305 4489± 415

ВСО (гготро.и,) 3-й 1-е 1,87±0,1 1,84±0.2 2.77 ±0.6 2,94 ±0,3 4213± 532 4225± 439

11ри№>шиг:-*да1шыб досювсрно огдичакмея от ком(роля (Р= 0.05)

Индекс стимуляции (ИС) пролнферативнои активности лимфоцитов во всех группах морских свинок, иммунизированных препаратами МБЧ-ИФН-у, МБЧ-ИФН-у-ФНО-а, был выше относительно вакцины ВСО. В дальнейшем под воздействием туберкулезного процесса, протекающего в организме животных, ИС пролиферативной активности лимфоцитов снижался (табл. 4).

Таблица 4

Пролифератиишя активность лимфоцитов периферической крови морских свинок, иммунизированных вакциной BCG, препаратом МБЧ и вакцинными композициями на 5-е сутки после заражения М. bovis

Наименование препарата HC "an пл ен (миюген)/ кошроль, ими'мни

HC: №D ИС: ФГА Контроль: сиощанная пролиферация

МБЧ МБЧ-ИФН-у МБЧ-ИФН-у-ФНО-а BCG (контроль) 1.87 ±0,3* 2.88 ±0,6* 2,14 ±0.6* 1,26 ±0,1 2,37 ± 0,4* 2,12 ±0,6 2,18 ±0,3* 2,05 ±0,1 3008 ± 399 3088 ±389 3178 ±451 31121-406

Примечание:-*дапные достоверно отличаются ог контроля (Р=0.05)

Пролиферативная акгивность лимфоцитов у морских сшшок, иммунизированных вакциноН BCG и вакцинными композициями МБЧ-ИФ1 I-у и МБЧ-ИФН-у-ФНО-а, сохранялась па высоком уровне и после заражения М. bovis. У морских свинок, иммунизированных BCG, наблюдали сравнительно низкую пролнферативную активность лимфоцитов.

Изучение фактороп нестнифического иммунного ответа у морских свтюк, шщущтцюваниых вакциной RCG. препаратом МБЧ и вакцинной композицией МБЧ-ИФИ-у пли жсперпуентачнчаи зпражетш возбудителем туберкулеза

Нсспецифнчсская резистентность организма проявляется как через активность таких факторов, как система ИФН, ИЛ, ФИО, так и посредством макрофагов и ПК. Из исследованных образцов сывороток наиболее высокие титры сывороточного ИФН установлены в сыворотках кропи морских свинок, иммунизированных вакцинной композицией МБЧ-ИФН-у (рис. 5). После заражения морских свинок патогенным штаммом М. bovis максимальные титры сывороточного ИФН незначительно возрастали. Максимальные титры сывороточного ИФН в группах морских свинок, иммунизированных вакциной BCG и препаратом МБЧ, не поднимались выше 40-50 МЕ/мл.

1 2 3

лиспе иммунизации

1 2 3

после заражения

Группы ж и но! ны* 1 - BCG: 2 - МБЧ: 3 - МБЧ-ИФН-у

Рис. 5. Динамика аюинносш ИФН в сыворо1ках крови морских свинок имм>нюироианны\ вакциной ВСО. нреиараюм МЬЧ и вакцинной композицией МЬЧ-ИФН-7 до и после заражения М. bovis (на 2-е cyikh)

Наиболее выраженный эффект специфической защиты при экспериментальной туберкулезной инфекции установлен при использовании МБЧ-ИФН-у, что связано с активацией клеточных факторов иммунного ответа и индукцией ИЛ-l, способного активировать антиген-презентирующие клетки. Иеспецифические факторы иммунного ответа участвуют взаимосвязанно во всех фазах иммунного ответа с индукцией эндогенного ИФН-у и синтезом ИЛ-1 и ИЛ-2.

Изучение тщуногепных. свойств препарата МЕЧ и. вакцинных колтомшт на модели мыгией BALB с

Изучение иммуногеиных свойств препарата МБЧ и вакцинных композиций на его основе проводили на однородной партии мышей BALB/c массой тела 18-20 г. Иммунизацию мышей проводили внутримышечно 3-кратно с интервалом 10-12 дней препаратом МБЧ (30 мкг) и вакцинными композициями на его основе (в объеме 0,1 мл). Иммунологические показатели снимали после всего цикла иммунизации.

Из данных, представленных на рис. 6, видно, что уровень суммарных антимикобактериальных антител при иммунизации мышей BALB/c

препаратом МБЧ и вакцинными композициями на его основе выше, чем при использовании вакцины BOG. Введение в состав вакцинной композиции цигокина ИФН-у способствует повышению уровня антител; введение ФНО-«, напротив, способствует снижению их индукции.

ОЛ«и

0,9 0.3 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0,1 о

d 4p

■ | I

ff Ii: :. f ¡ü i; 'Ii Ш и Щ

; i Сt I Г ' I Щ

12 3 4 5

Группы животных

Рис. 6. Уровень суммарных антимикобактериальиых антител у мышей ВАЬВ'с после иммунизации различными образцами препаратов:

1. ВСО (30 мкг)

2. МБЧ: дсРНК (20 мкг)-белки-антигеиы ВСО (30 мет)

3. МБЧ-ИФН-? [10 мкг (105 МЕ)]

4. МБЧ-ИФН-у [Ю мкг (105 МЕ)]-ФНО-а [ 1 Омкг (105 МЕ)]

5. Физиоло! ический раствор (кон (рольные жижм ныв)

Фагоцитарную активность МНК иммунизированных мышей изучали на 35-й день после иммунизации. Результаты экспериментов по влиянию на фагоцитарную активность МНК испытанных препаратов представлены на рис. 7. Видно, что фагоцитарная активность МНК в 1 руине мышей, иммунизированных препаратом МБЧ, выше, чем в группе животных, иммунизированных вакциной ВСО. Введение в состав композиции цитокинов ИФН-у, а также ИФН-у-ФНО-а, приводило к повышению фагоцитарной активности.

2 3 4 5

Группы животных

Рис. 7 Фагоцитарная активность МНК па 35-е сутки поело иммунизации мышей BALB'c вакциной BCG, препаратом МБЧ и вакцинными композициями:

! ВСО (30 мкг)

2. МБЧ: дсРИК(20 мкгубелки ВСО (30 мкг)

3. МБЧ-ИФН-у [10 мкг (10s ME)]

4. МБЧ-ИФН-у i ¡0 мкг (10s МЕ)|-ФНО-а (10 мкг (10s ME)]

5 Физиоло! ический раствор (кон i рольные живогные)

Изучении токсикоз иных и нирогеиных эффектов препарата МЕЧ и саштпых композиций

Для изучения биологических свойств полученного препарата, необходимо исследовать его безвредность. Исследование препарата МБЧ на безвредность проводили с определением гематологических и биохимических показателей при однократном и многократном введении возрастающих доз препарата: 100 мкг, 200 мкг, 300 мкг на каждое животное. Взятие крови у животных для гематологических исследований осуществляли на 7-е сутки, а для биохимических исследований - на 1-е, 7-е и i4-е сутки после введения препарата.

¡¡■¡учеты, tíchmoü токсичности препарата S:ÍB4. Однократное введение препарата МБЧ в дозах 100 мкг, 200 мкг, 300 мкг внутривенно и подкожно нелинейным белым мышам и внутримышечно морским свинкам не вызывало гибели и снижения массы тела животного. На месте инъекции препаратов патологические изменения (абсцессы, некрозы) отсутствовали. Коэффициенты прироста массы тела в течение эксперимента также не отличались от контроля.

Таким образом, тюле однократного введения препарата МБЧ нелинейным белым мышам и морским свинкам различными способами в дозах 100 мкг, 200 мкг, 300 мкг биологические показатели остаются в пределах физиологической нормы.

Изучение хронической токсичности препарата МБЧ Изучение хронической токсичности препарата МБЧ проводили при 3-кратиом введении препарата нелинейным бельм мышам подкожно и морским свинкам внутримышечно с интервалом введения в 3 дня.

Введение препарата МБЧ в дозах 100 мкг, 200 мкг, 300 мкг подкожно нелинейным белым мышам и внутримышечно морским свинкам не вызывало гибели и снижения массы тела животных. На месте инъекции препаратов патологические изменения (абсцессы, некрозы) отсутствовали. Коэффициенты прироста массы тела в течение эксперпмеггта также не отличались от консольной груши,г животных.

Изучение биохимических показателей периферической крови у экспериментальных животных

Определение АсТФ, АчТФ, мочевины и общего белка проводили с использованием наборов фирмы «Boehringer Mannheim». Германия. При большом разнообразии экспериментальных и методических приемов, применяемых в биохимии для изучения обменных функций печени и почек при введении чужеродных агентов, использование этих наборов гарантирует высокую чувствительность и воспроизводимость.

Известно, что основными органами в системе биотрансформации чужеродных агентов являются печень п почки. При введении препарата МБЧ нелинейным белым мышам подкожно и морским свинкам внутримышечно наблюдалась незначительная тенденция в сторону повышения АсТФ, АлТФ и мочевины по сравнению с контрольной группой животных на всех сроках определения. Незначительные сдвиги биохимических показателей не связаны с патологией печени и почек, т.к. при патоморфологическом исследовании паренхиматозных органон нелинейных белых мышей и морских свинок отмечено нормальное состояние микроциркуляторного русла печени и почек, архитектоника печени нормальная. Долысовос строение подчеркивалось характерным распределением гликогена с преобладанием его п гепатоцитах, расположенных по периферии долек. В ночках экспериментальных животных патологических изменений не выявлялось. Архитектоника была сохранена. Кровенаполнение умеренное. Базалыше капилляры клубочков не утолщены. Канальцевый эпителий без дегенеративных изменений. Таким образом, введение препарата МБЧ нелинейным белым мышам и морским

свинкам не вызывало патологических изменений в органах и тканях экспериментальных животных; нарушений обменных функций печени и почек отмечено не было.

Изучение анайтактогенности препарата МБЧ Препарат МБЧ в разрешающей дозе 100 мкг (1 мл) не вызывал у морских свинок симптомов анафилактического шока (отсутствовала взъерошенная шерсть, чихание, почесывание н гибель животных) на 25-й день от начала сенсибилизации.

Изучение пирогенных свойств препарата МБЧ

При разработке инъекционных форм лекарственных препаратов показатель пирогешюсга является одним из существенных параметров при контроле качества иммунобиологических препаратов. Динамика температурной реакции кроликов при изучении пирогенных свойств препарата МБЧ представлена в табл. 5.

Таблица 5

Оценка пирогенных свойств препарата МБЧ

Температура тела до введении препарата, "С Температура тела после введения препарата, "С Повышение чемперагуры тела, "С Сумма максимальных изменений температу ры по 3-м животным, °С

Через 1ч Через 2ч Через Зч

39,0 39,0 39,2 39,3 0,3 1,1

38,8 39,1 39,2 39,1 0,4

38,9 39,3 39,3 39,2 0,4

В ходе проведенного исследования установлено, что препарат МБЧ анирогенен в иммунизирующей дозе 30 мкг на одного кролика.

Получение препарата МБЧ и вакцинных композиций и обсуждение механизмов иммунологического реагирования

Одной из особенностей возбудителя туберкулеза является бактерионосительство. Это свидетельствует о недостаточной стимуляции Т-клеточного иммунного ответа после иммунопрофилактики вакциной ВСО (активация цнтотоксических лимфоцитов, способных элиминировать зараженные клетки организма). Поэтому проблема повышения

иммуногенности вакцины ВСв имеет важное эпидемиологическое и эпгооотологическое значение.

Для вакцинации людей и животных перспективным представляется создание такой конструкции противотуберкулезной вакцины, которая бы сочетала в себе широкий спектр антигенов возбудителя, стимуляторов иммунного ответа и имела бы размер, сравнимый с микобактерией, т.е. имитировала бы полный антиген. Известна молекулярная конструкция вирусоподобного типа как средство доставки иммуногенов, содержащая в центре полирибонуклеотид дсРНК (стимулятор иммунной резистентности организма), покрытый слоем конъюгата: спермидин-полиглюкин-субстрат и/или аналог субстрата фермента, а на поверхности частиц - гибридные белки, содержащие эпитопы инфекционного агента и фермент. Такого рода вирусоподобные частицы вызывали повышение и пролонгацию иммунного ответа, выступая в качестве своеобразного депо антигенов инфекционного агента (например, ВИЧ) (Лебедев Л.Р., 2000). Описанная конструкция до нашей работы применялась только для создания противовирусных вакцин.

Основной задачей нашей работы являлось создание противотуберкулезной вакцинной композиции на основе широкого спектра антигенов микобактерий вакцинного штамма ВСв, способной эффективно стимулировать Т- и В-клеточные звенья иммунного ответа у млекопитающих. Поставленная задача решалась путем создания молекулярной конструкции, которая представляет собой МБЧ, в центре которых находится дсРНК, а на поверхности - набор белков-антигенов вакцинного штамма ВСв в составе конъюгата спермидин-полиглюкин.

В механизме иммунного ответа при вакцинации препаратом МБЧ существенным фактором является воздействие дсРНК на макрофаги и НК-клетки (неспецифические клетки-киллеры) и индукция синтеза интерферонов, в основном ИФН-у. Известно, что важнейшим событием в процессе формирования иммунного ответа является определение пути, по которому пойдет развитие Т-хелперов. Индукция синтеза ИФН-у при вакцинации наряду со стимуляцией гуморального (В-клеточного, Т2-хелперного) пути стимулирует Т-клеточный (Т1-хелперный) иммунный ответ. Совместное введение микобактериальных антигенов с индуктором ИФН-у (дсРНК) в составе МБЧ приводит к ускорению дифференцировки Т-лимфоцитов.

Результаты исследования противотуберкулезной эффективности коньюгата моксифлоксацина с карбоксиметилглюкапом в экспериментах in vitro

В работе исследована противотуберкулезная активность соединения, в котором моксифлоксацин коныогирован с высокомолекулярным носителем карбоксиметил-(1-»3)-Р-0-глюканом. Коныогат для исследований противотуберкулезной активности был предоставлен в рамках проекта МНТЦ 2174р д.м.н. М.И. Душкиным и к.м.н. Я.Ш. Шварцем, обосновавшими возможность использования карбоксиметил-(1-»3)-Р-0-глюкана в качестве средства целенаправленного транспорта лекарственных средств в макрофаги и показавшими селективный захват через скавенджер-рецепторы и повышенную аккумуляцию коньюгата в макрофагах (Dushkin et al., 1996; Schwartz et al., 2006).

Используемый в работе коныогат содержал 107 мг моксифлоксацина на 1 г коньюгата. Рабочая концентрация коньюгата 2,5 мкг/мл была выбрана на основании литературных данных (Roseeuw Е. et al., 2003) как минимальная ингибирующая концентраты моксифлоксацина для М. tuberculosis in vitro, которая соответствует концентрации 0,25 мкг/мл моксифлоксацина по активному веществу.

Внесение коньюгата в концентрации 2,5 мкг/мл в инкубационную среду макрофагальных клеток линии J774, инфицированных микобактериями туберкулеза, приводило к значительному подавлению роста высеваемых микобактерий. Через 4 часа после добавления моксифлоксацина или коныогата количество микобактерий туберкулеза снижалось в среднем в 10 раз. В то же время в культуре необработанных макрофагов или макрофагов после добавления карбоксиметилглюкана количество микобактерий не уменьшалось. Увеличение конце!гтрации коньюгата приводило к дальнейшему снижению количества высеваемых микобактериальных клеток.

Оценка действия карбоксиметилглюкана и моксифлоксацина на фагоцитарную активность макрофагов по отношению к микобактерням

Макрофагалыше клетки линии J774 культивировали в 24-луночных планшетах до формирования монослоя (0,5-1,0 х 106 кл/лунку) при 37°С в атмосфере 5% С02 в питательной среде RPMI-1640 с добавлением 10% FCS и 2 мМ L-глутамина, далее ¡слетки инкубировали 3 часа в присутствии моксифлоксацина, карбоксиметилглюкана. Затем для оценки поглотительной активности клеток в монослои вносили микобактерии BCG (М bovis) из расчета 100 микробных тел/клетку, инкубировали в течение 60 мин, 3-кратно

отмывали PBS с pH 7,4, клетки фиксировали, окрашивали по Романовскому -Гимза и определяли процент фагоцитирующих клеток.

Монослои макрофагов были подразделены на группы: интактные клетки (контроль), клетки, инкубированные с М. bovis, моксифлоксацином (4 мкг/мл)+М. bovis, и клетки, инкубированные с карбоксиметилглюканом (100 мкг/мл) + М. bovis. Результаты оценки поглотительной активности представлены на рис. 8.

70 1

60 .

В 40 " >. а s

s 30 -

о i—

¡3

-е- 2о -

о4

10 -о -

Контрогь BCG Mox+BCG CMG+BCG

*- различия статистически значимы по отношению к группе BCG при Р<0,05.

Рис. 8. Фагоцитарная активность клеток J774 по отношению к М. bovis

Полученные данные (рис. 8) показывают, что более 60% М. bovis фагоцитируются макрофатальными клетками в течение 60 мин. При этом карбоксиметилглюкан стимулирует фагоцитарную активность макрофагов, что, очевидно, может способствовать более активной элиминации микобактерий макрофагами.

Изучение противотуберкулезного_действуя конъюгата;

моксифлоксацина с карбоксиметилглюканом в экспериментах in vivo

В модели острой туберкулезной инфекции, вызванной заражением мышей линии С57В1/6 микобактериями штамма М. tuberculosis Erdman, было показано, что как свободный моксифлоксацин, так и конъюгат моксифлоксацина с карбоксиметилглюканом подавляют размножение

микобактерий. При высеве 10%-ных гомогенатов органов (печень, селезенка) на питательную среду М1с1с11еЬгоок 7Н10 в контрольной группе животных наблюдали значительно более интенсивный рост микобактериальных колоний, чем в группах животных, обработанных свободным или конъюгированным моксифлоксацином (рис. 9).

Конъюга! 200 |>дЛ<д Коныст 5(1 ||д1кд Коныагп 51/д/кд Мош 209 мдЛсд МомЭТрд/кд Мот 5 рд/кд г

ф*

ь-4-4

И-н

.. . .... . ,■ 1 ,

ь—1—1

4-,-,---,---, ■ 50 10« АЫ 290 25« 300 Количество микобактерий а 104 гомогенаге печени (КОЕЛМ мп)

Конывга! 260 рдДсд Коныоги 38 |1а*о Конывгет 5 рДОв Мож 200 Мой 60 |1дЛ<д МОИ15 |:у|<д э*

>-н

-И

■ 1

■1-,-,-,-,-,-, 0 50 106 150 200 250 300 Количество микобактерий в 10% гомогенаже селезенки (К0Е/0.1 мл)

Примечание: *- различия при дозах конъюгата 50 и 200 мкг/кг достоверны по сравнению с эквимолярными дозами свободного моксифлоксацина, при Р<0.05 Рис. 9. Влияние моксифлоксацина и его конъюгата на размножение микобактерий

Из представленных данных (рис. 9) видно, что при введении максимальной дозы конъюгата 200 мкг/кг го органов экспериментальных животных высевались единичные колонии микобактерий. Конъюгированный препарат оказывал более выраженный антимикобактериальный эффект, чем свободный моксифлоксацин (различия при дозах конъюгата 50 и 200 мкг/кг высокодостоверны по сравнению с эквимолярными дозами свободного моксифлоксацина). Эффективность подавления размножения микобактерий в органах животных, которым вводили моксифлоксацин и конъюгат, была дозозависимой.

Таким образом, конъюгат моксифлоксацина с карбоксиметилглюканом обладает выраженным антитуберкулезным эффектом, проявляющимся в ингибировании размножения микобактерий в органах инфицированных животных.

Известно, что макрофаги имеют множество специфических рецепторов на цитоплазматической мембране (Kodama Т., 1990; Suzuki Н., 1997), с которыми связываются различные лиганды. Среди рецепторов имеются так называемые маннановые, глюкановые и галактановые рецепторы, которые связываются с нейтральными полисахаридами бактериальной природы, в результате чего осуществляется перенос этих полисахаридов внутрь клетки через рецептор-опосредованный фагоцитоз (РОФ) (Koren Н., 1992). Низкая эффективность иммунного ответа против туберкулезной инфекции связана в том числе и с супрессированием продукции ИФН-у, вызываемой отсутствием активации макрофагов и снижением в них продукции ИЛ-12 - основного цитокина, стимулирующего антитуберкулезный ответ (Zhang М„ 1995; Flynn J., 1995). Можно предположить, что адресная доставка противотуберкулезного препарата в инфицированные макрофаги не только снизит бактериальную нагрузку на организм, но и приведет к активации как специфических, так и неспецифических факторов иммунитета при лечении туберкулеза. Способность конъюгированных с лекарствами нейтральных полисахаридов активировать макрофаги является дополнительным механизмом антитуберкулезной активности. Кроме этого известны макрофагальные рецепторы, связывающие заряженные макромолекулы для захвата лиганда. Данные рецепторы высокоаффинны не только к незаряженным полисахаридам (арабиногалакгану, машину, ß-i люкану и др.), но и к полианжншым молекулам, включая отрицательно заряженные полисахариды (дексфансульфат, гепарин, бактериальные липополисахариды) и модифицированные липопротеины и протеины (Krieger М., 1994). Кроме того, химическое связывание лекарственных средств (препаратов) с глюканами по карбоксильным или сульфатным группам ведет

к селективному захвату лекарственных средств макрофагами через РОФ (Groman E.V., 1995; DushkinM., 1996).

Первичное распознавание микобактериальных клеток, которое происходит благодаря набору генетически кодируемых рецепторов, приводит к клеточной активации и в конечном счете к селективной доставке коньюгатов антитуберкулезных препаратов с лигандами непосредственно внутрь клетки, что способствует созданию высоких концентраций антитуберкулезных препаратов непосредственно в местах интенсивного размножения микобакгерий, т.е. внутри макрофагов. Такой подход (доставка лекарственных средств посредством лигандов к клеткам-мишеням через специфические рецепторы к незаряженным полисахаридам) уже широко используется для лечения различных инфекционных заболеваний (Groman E.V., 1995; Groman E.V., 1996). Аналогичный подход - через ЮФ - в противотуберкулезной терапии применен при использовании конъюгата пара-аминосалициловой кислоты с бычьим сывороточным альбумином. Эта работа продемонстрировала повышение антибактериальной эффективности конъюгата в сравнении с неконъюгированным препаратом как в культуре мышиных макрофагов in vitro, так и на модели инфицированных морских свинок in vivo (Majumdar S., 1995).

В заключение необходимо отметить, что в вопросах разработки эффективных лечебно-профилактических препаратов против туберкулеза приходится искать новые пути решения этой сложнейшей задачи в русле современных знаний о биологии возбудителя туберкулеза, с использованием новейших методов молекулярной биологии и биотехнологии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Полученные результаты научных исследований являются основой к созданию и производству препаратов нового поколения для профилактики и лечения туберкулеза. Федеральная целевая профамма «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы) предусматривает разработку современных средств профилактики, диагностики, лечения и реабилитации, а также технологий производства противотуберкулезных препаратов.

выводы

1. Впервые созданы конструкции искусственных микобактериальных частиц (МБЧ) на основе антигенов BCG и дсРНК и разработан метод их получения.

2. Показано, что сконструированные искусственные микобактериальные частицы на основе антигенов вакцинного штамма М. bovis могут быть использованы для формирования противотуберкулезного иммунитета.

3. Иммунизация лабораторных животных микобактериальными частицами на основе антигенов BCG и дсРНК с включенными в их состав цитокинами (ИФН-у и ФНО-а) существенно повышает степень их резистентности к экспериментальной туберкулезной инфекции (на 20% и 10% относительно вакцины BCG соответственно).

4. Искусственные микобактериальные частицы на основе белков BCG и дсРНК устойчивы к действию рибонуклеаз и обладают высокой стабильностью и хорошей растворимостью.

5. Искусственные микобактериальные частицы в иммунизирующей дозе 30 мкг/животное обладают высокой иммуногенностыо, апирогенны и не анафилактогенны.

6. Искусственные микобактериальные частицы в дозах, в 3-10 раз превышающих иммунизирующую дозу, являются безвредными (не приводят к изменению основных биохимических и гематологических показателей у экспериментальных лабораторных животных и не вызывают токсических эффектов).

7. Введение у-интерферона и искусственных микобактериальных частиц обеспечивает повышенный уровень специфического клеточного иммунного ответа по сравнению с таковым, вызванным иммунизацией вакциной BCG.

8. Впервые показана противотуберкулезная эффективность конъюгированной формы карбоксиметил-(1 -»3>р-1>глюкана с моксифлоксацином in vivo и in vitro.

10. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации основных результатов

диссертации

1. Азаев М.Ш., Лебедев Л.Р., Кузьмичёва Г.А., Туманов Ю.В., Донченко H.A., Татьков С.И., Носарева О.В., Ильичев A.A. Исследование роли искусственных микобактериальных частиц в реализации иммунологических процессов при экспериментальном туберкулезе животных. // Проблемы туберкулеза и болезней легких. -№ 2.- 2007. - С. 38-42.

2. Носарева О.В., Нестеров А.Е., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Порываев В.Д., Азаев М.Ш., Татьков С.И.. Конструирование и изучение иммуногенных свойств препарата на основе рекомбинантной плазмиды, кодирующей микобактериальный антиген ESAT-6, и модифицированного полисахаридного конъюгата. Биотехнология. -2007. - №6. - С. 18-26.

3. Schwartz YS, Dushkin MI, Vavilin VA, Melnikova EV, Khoschenko OM, Kozlov VA,Agafonov AP, Alekseev АУ, Rassadkin Y, Shestapalov AM, Azaev MSh, Saraev DV.Filimonov PN, Kurunov Y, Svistelnik AV, Krasnov VA, Pathak A, Derrick SC,Reynolds RC, Morris S, Blinov VM. Novel Conjugate of Moxifloxacin and Carboxymethylated Glucan with Enhanced Activity against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 2006 Jun;50(6):1982-8.

4. Сивков А.Ю., Болдырев A.H., Азаев М.Ш. и др. Определение причин распространения MDR-штаммов на основе анализа популяции рифампицин-и /или изониазидустойчивых юолятов М. TUBERCULOSIS // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология: научно-теоретический журнал. - № 2. -2006.-С. 20-25.

5. Азаев М.Ш., Агафонов А.П., Боднев С.А., Блинов В.М. Исследование противотуберкулезной активности молекулярно-биологических конструкций на основе конъюгата антибиотика моксифлоксацина с лигандом к скавенджер-рецептору макрофага // Антибиотики и химиотерапия. - № 11-12 (ноябрь-декабрь). - 2006. - С. 5-8.

6. Азаев М.Ш., Лебедев Л.Р., Туманов Ю.В. и др. Получение искусственных микобактериальных частиц и исследование их иммуногенных свойств // Биотехнология.-№4.- 2004,- С.34-40.

7. Мокеева A.B., Орешкова С.Ф., Попова А.Г., Сивков А.Ю., Туманов Ю.В., Азаев М.Ш., Татьков С.И., Ильичев A.A.. Генотипический полиморфизм клинических штаммов микобактерий туберкулеза, циркулирующих на

территории Новосибирской области // Вестник Российской АМН. - № 1. 2005. - С. 20-23.

8. Татьков С.И., Норкина О.В., Филипенко M.JI., Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Азаев М.Ш., Киншт В.Н., Курунов Ю.Н., Краснов В.А., Медведева Е.В., Баранова О.И., Ивлев-Дунгау А.П., Боднев СЛ., Блинова JI.H., Пасечников А.Д. Молекулярно-генетическая характеристика устойчивых к рифампицину и (или) изониазиду изолятов Mycobacterium tuberculosis, выделенных в Новосибирской и Томской областях // Вестник Российской АМН. -№7. - 2005. -С.26-36.

9. Лебедев Л.Р., Азаев М.Ш., Туманов Ю.В, Сизов A.A., Ильичев A.A., Татьков С.И. Искусственные микобактериальные частицы для иммунизации против туберкулеза // Доклады Академии наук. Т. 387. - № 2. - 2002. - С.272-275.

10. Тушнова О.Ю., Кувшинов В.Н., Азаев М.Ш., Машарский А.Э., Климов H.A., Козлов А.П., Ильичев A.A., Сандахчиев Л.С. Получение пептидов-имитаторов эпитопа белка gp41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), узнаваемого вируснейтрализующими антителами 2F5. Молекулярная биология,- 2001Т.35. - №. 1С. 1-6.

11. Лебедев Л.Р., Карпенко Л.И., Порываева В.А., Азаев М.Ш. и др. Конструирование вирусоподобных частиц, экспонирующих эпитопы ВИЧ-1. Молекулярная биология. - 2000. -Т.34.- №3. - С.1-6.

Патенты:

12. Азаев М.Ш., Татьков С.И., Донченко H.A.

Средство для снижения токсичности химически синтезированных противотуберкулезных лекарственных препаратов. Патент на изобретение № 2190417 г. Москва, 10 октября 2002 г.

13. Азаев. М.Ш., Лебедев Л.Р., Кузьмичева P.A., Татьков С.И. Искусственные микобактериальные частицы и противотуберкулезная вакцинная композиция на их основе. Патент на изобретение. № 2242245. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20 декабря 2004 г.

Методические указания

14. Покровский А.Г., Азаев М.Ш., Федюк Н.В.

Лабораторная диагностика туберкулеза. Методические указания для студентов. - Новосибирский государственный университет. - 2003.

Работы, опубликованные в сборниках научных трудов, материалах конференций и других изданиях

15. Татьков С.И., Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Азаев М.Ш., Кожина Е.М., Дунтау А.П., Медведева Е.В., Баранова О.И., Гришаева О.Н. Исследование генетических причин устойчивости к рифампицину штаммов M.Tuberculosis, циркулирующих в г. Новосибирске // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Вторая научная конференция с международным участием. Новосибирск. Россия. 29-30 мая 2002.-С.212.

16. Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Азаев М.Ш., Медведева Е.В., Дунтау А.П., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Рекомбинангные белки M.íuberculosis в серологической диагностике туберкулеза // Межрегиональная научная конференция, посвященная 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С .П. Карпова (Тезисы докладов 7-10 октября, 2003), Томск-2003. - С.170-171.

17. Азаев М.Ш., Лебедев Л.Р., Кузьмичева Г.А., Туманов Ю.В., Сизов A.A., Татьков С.И. Иммунобиологические свойства искусственных микобактериальных частиц // Межрегиональная научная конференция, посвященная 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова (Тезисы докладов 7-10 октября, 2003), Томск-2003,- С. 140-141.

18. Душкин М.И., Шварц Я.[П., Сенников C.B., Вавилин В.А., Мельникова Е.В., Козлов В.А., Агафонов А.П., Алексеев А.Ю., Рассадкин Ю.Н, Шесталалов A.M., Иванькина Т.Ю., Сараев Д.В., Азаев М.Ш., Фрейдин М.Б., Фрейдин A.B., Рудько A.B., Пузырев В.П., Курунов Ю.Н., Краснов В.А., Reynolds R., Morris R., Блинов В.М. Целенаправленная доставка противотуберкулезных антибиотиков в макрофаги, инфицированные Mycobacterium tuberculosis II Международная конференция: «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». Новосибирская область, «Сосновка», 8-10 сентября 2004 г. -С.142-143.

19. Татьков С.И., Болдырев А.Н., Сивков А.Ю., Боднев С.А., Кузьмичева Г.А., Смирнова О.Ю., Азаев М.Ш., Туманов Ю.В., Дунтау А.П., Медведева Е.В., Лисиченко Г.М., Курунов Ю.Н., Краснов В.А., Уразова О.И., Стрелис А.К., Сурикова О.В., Филипнеко М.Л., Блинова Л.Н., Пасечников А.Д. Генетический анализ MDR-штаммов М. tuberculosis, распространенных на территории Новосибирской и Томской областей // Международная конференция: «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». Новосибирская область, «Сосновка», 8-10 сентября 2004 г. - С.153-154.

20. Nosareva О., Smirnova О., Boldyrev A, Tumanov Yu., Azaev M., Lebedev L., Tatkov S. Construction of artificial virus-like particles exposing Mycobacterial ESAT-6, and the study of their immunogenic properties // Abstract book Keystone Symposia "Tuberculosis: Integrating Host and Pathogen Biology". Whistler, British Columbia, Canada.-2005.-P.94.

21. Azaev M.Sh., Korolev St.A, Lebedev L.R., Kuzmicheva G.A., Tumanov Yu.V., Nosareva O.V., Tatkov S.I. Artificial mycobacterial particles as a novel, compound for immunoprophylactic against tuberculosis // Proceedings of international scientific interdisciplinary workshop. Thailand- Bangkok. March, 2006. -P.6-7.

22. Туманов Ю.В., Болдырев A.H., Смирнова О.Ю., Лебедев Л.Р., Азаев М.Ш., Носарева О.В., Ивлев-Дунтау А.П., Татьков С.И. Выявление маркеров Т-клеточного иммунитета в видоспецифической диагностике туберкулеза Н Ш Российская конференция с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" г. Новосибирск, 27-29 сентября 2006. - С. 166-167.

23. Лебедев Л.Р., Карпенко Л.И., Бажан С.И., Белявская В.А., Порываева

B.А., Азаев М.Ш., Рябчикова Е.И., Зайцев Б.Н., Масычева В.И., Ильичев А.А. Конструирование искусственных иммуногенов // III Российская конференция с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" г. Новосибирск, 27-29 сентября 2006. - С.74-75.

24. Азаев М.Ш., Лебедев Л.Р., Туманов Ю.В., Донченко Н.А., Кузьмичева Г.А., Татьков С.И., Ильичев А.А. Создание искусственных микобакгериальных частиц и исследование их роли в реализации иммунологических процессов при экспериментальном туберкулезе животных) // Ш Российская конференция с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" г. Новосибирск, 27-29 сентября 2006. - С.132-133.

25. Азаев М.Ш., Лебедев Л.Р., Татьков С.И., Азаева Э.М., Вердиханова A.M., Ильичев А.А. Создание вакцинных композиций для профилактики туберкулеза // Труды Национального научно-исследовательского института медицинской профилактики им. В. Ахундова Минздрава Азербайджана, том 1, Баку, 2007.-С. 535-536.

26. Азаев М.Ш., Донченко Н.А., Кузьмичева Г.А., Ильичев А.А., Татьков

C.И. Исследование действия ФНО-а, Реаферона и ДНК из молок лососевых рыб на инфекционный и вакцинальный процессы при экспериментальном туберкулезе // Проблемы биологической и экологической безопасности. Международная конференция. Тез. докл. Оболенск, 2000,- С. 219-221.

27. Мордвинов В.А., Татьков С.И., Сивков А.Ю., Азаев М.Ш. и др. Генетическое разнообразие штаммов М/мЬегсн/о.ш в Западной Сибири и проблема иммунопрофилактики туберкулеза // Международная научно-практическая конференция: «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС и противодействия угрозе инфекционных болезней. Новосибирск. Россия. 14-15 мая 2009,- С.153.

Азаев Мамедьяр Шаккр оглы

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К РАЗРАБОТКЕ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ СРЕДСТВ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

Автореф. дисс. на соискание ученой степени доктора биологических наук. Подписано в печать 11.01.2010. Заказ № 2. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии Института катализа СО РАН 630090 Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Азаев, Мамедьяр Шакир оглы

Список используемых сокращений

Введение

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТРЫ

1.1. Туберкулез в современном мире

1.1.1. Молекулярно-биологическая характеристика микобактерии туберкулеза

1.1.2. Генотипирование микобактерий туберкулеза

1.1.3. Лекарственная устойчивость

1.1.4. Методы выявления и определения лекарственной устойчивости микобактерий

1.1.5. Профилактика туберкулеза

1.1.6. Основные противотуберкулезные препараты

1.1.7. Резервуар инфекции

1.1.8. Транснациональные случаи резистентного туберкулеза

1.1.9. Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в мире

1.1.10. Туберкулез в России (историческая справка)

1.2. Туберкулез сельскохозяйственных животных

1.2.1. Восприимчивость животных к туберкулезу

1.2.2. Патогенез

1.2.3. Клиническая картина

1.2.4. Туберкулез лабораторных животных

1.2.5. Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота

1.3. Иммуномодуляторы 5 4 1.3.1. Иммунобиологические свойства иммуномодуляторов

1.3.2. Роль цитокинов в формировании неспецифического и специфического иммунитета при инфекционном процессе

1.3.3. Интерфероны

1.3.4. Факторы некроза опухолей

1.3.5. Иммунная природа хронических инфекций

1.3.6. Важность определения иммунного статуса организма

1.3.7. Сочетанное применение иммуномодуляторов и вакцин. Адъювантные свойства иммуномодуляторов

1.3.8. Исследование биологических свойств иммуномодуляторов in vitro. Побочные эффекты иммуномодуляторов

1.3.9. Роль первичных иммунодефицитов в формировании чувствительности и устойчивости к туберкулезной инфекции

1.4. Основные направления в разработке новых вакцин

1.4.1. Эффективная вакцинация как мера борьбы с туберкулезом сельскохозяйственных животных

1.4.2. Методы повышения эффективности доставки

ДНК-вакцин

1.4.3. Роль геномики и протеомики в разработке эффективных вакцин против туберкулеза

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые подходы к разработке противотуберкулезных средств и их биологическая активность"

В Российской Федерации ежегодно регистрируется около 40 млн. случаев инфекционных заболеваний. Экономический ущерб, наносимый инфекционными болезнями, составляет свыше 18 млрд. рублей в год. В связи с этим одной из приоритетных государственных задач является создание в Российской Федерации собственной государственной системы разработки и производства лечебно-профилактических препаратов против возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний [Концепция «Национальной системы химической и биологической безопасности РФ (2009-2013)», утвержденной постановлением Правительства Российской Федерации от 27 октября 2008 г.].

Наиболее важной и глобальной проблемой в мире и в Российской Федерации за последние десятилетия стал неуклонный рост заболеваемости туберкулезом. В Российской Федерации росту заболеваемости туберкулезом способствуют неблагоприятные изменения социально-экономических условий, резкое увеличение миграционных потоков, снижение качества противотуберкулезной службы и объема профилактических обследований. Эксперты ВОЗ подразделяют страны мира на три группы по частоте заболеваний туберкулезом: с заболеваемостью менее 25,0 на 100 тыс. населения, от 25,0 до 100,0 и свыше 100,0. Российская Федерация с показателем заболеваемости 70,99 на 100 тыс. населения (2006 г.) относится к странам с относительно высоким уровнем заболеваемости [Волкова К.И.и др., 2001; Петрухина М.И. и др., 2003; Кондратенко Т.А. и др., 2007].

Распространение лекарственно-устойчивого туберкулеза в настоящее время приняло характер мировой пандемии, способной дестабилизировать общество. Несмотря на все предпринимаемые меры, положение с этой формой туберкулеза продолжает ухудшаться, что вызвало необходимость введения нового термина — туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью к препаратам первого и второго (резервного) ряда, а также и ко всем фторхинолонам [Surikova, O.V. et al., 2005; Сивков, А.Ю. и др., 2006; Воронкова О. В. и др., 2007].

Учитывая, что в последние годы появились штаммы М. tuberculosis, резистентные к препаратам нового поколения фторхинолонов (моксифлоксацин), для борьбы с лекарственно-устойчивыми формами туберкулеза в настоящее время ведутся интенсивные научные работы с целью повышения антимикобактериальной активности противотуберкулезных препаратов, изучение их механизма действия и адресной доставки антибиотиков и химиопрепаратов в зараженные микобактериями макрофаги, что имеет важное клиническое значение.

В Российской Федерации для борьбы с туберкулезом была разработана система не только федеральных, но и региональных программ борьбы с этим заболеванием [Шевченко Ю.Л., 2000]. На период 2007-2011 гг. в России действует федеральная целевая программа "Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями", где 34% всего финансирования программы направлены на противотуберкулезные мероприятия. Общий объем финансирования подпрограммы "Туберкулез" в рамках федеральной программы составляет 26,28 млрд. руб., в т.ч. за счет средств федерального бюджета - 9,78 млрд. руб., за счет бюджетов субъектов РФ - 16,5 млрд. руб. Важной целью программы является поддержка исследований, направленных на создание современных средств диагностики, профилактики и лечения туберкулеза. Данное положение актуализировало проблему импортозамещения лекарственных препаратов зарубежного производства на отечественные и показало государственную значимость задач по разработке новых средств лечения и иммунопрофилактики опасных инфекционных заболеваний для обеспечения биологической безопасности Российской Федерации [Пальцев М.А., 2003].

В существующем в настоящее время комплексе мер по борьбе с туберкулезом на ряду со специфической химиотерапией по прежнему имеет большое значение вакцинопрофилактика, поэтому исследования, направленные на совершенствование эффективности и безопасности вакцины против туберкулеза, являются крайне актуальной задачей. Как известно, вакцинный штамм BCG из М. bovis был получен французскими учеными Кальметтом A. [Calmette А.] и Гереном К. [Guérin С.], в результате 13-летнего культивирования М. bovis (230 пассажей) на картофельно-глицериновой среде с желчью [Petroff S.A., Branch А, 1928]. Однако этот вакцинный штамм и его подтипы не обеспечивают полной защиты от туберкулеза [Cole S.T., 1998] и способны вызывать генерализованные BCG-инфекции [Малярова Е.Ю. и др., 2005; Rezai M.S. et al., 2008].

Безусловно, конструирование безопасных вакцин против туберкулеза в настоящее время является актуальной проблемой [Ryan A.A. et al., 2007; Maue A.C. et al., 2007]. Повышение иммуногенности вакцины BCG, создание на ее основе новых вакцинных композиций, конструирование вакцин против туберкулеза на основе достижений современной молекулярной биологии и иммунологии имеют важное значение для общественного здравоохранения. Показано, что совместное введение вакцины BCG с гамма-интерфероном (ИФН-у) приводит к ускорению дифференцировки Т- и B-лимфоцитов, а совместное введение с альфа-фактором некроза опухоли (ФНО-а) стимулирует их пролиферацию [Ярилин A.A., 1997]. Учитывая широкий иммунобиологический эффект цитокинов, лекарственные композиции, изготовленные на их основе, могут быть использованы для иммунопрофилактики инфекционных заболеваний [Кетлинский С.А., 1992; Воробьев A.A., 1999; Авдеева Ж.И., 2000].

Одним из многообещающих подходов к решению проблемы туберкулеза является создание субъединичных вакцин (Elhay M.J., 1997; Orme I.M., 1997). К настоящему времени обнаружено несколько видовых антигенов (Ag85B, Ag85A, ESAT-6, Ag38, Agl9, PstS-3 и др.) M. tuberculosis, которые индуцировали иммунопротективный ответ на грызунах (Lowrie D.B., 1997; Strugnell R.A., 1997; Ulmer J.B., 1997; Zhu X., 1997; Zhu X., 1997; Denis O., 1998; Tanghe A., 1999; Dhiman N., 1999; Brandt L., 2000). Однако для существенного повышения иммунопротективного действия при вакцинации новыми более перспективными иммуногенами необходимо разрабатывать более эффективные системы доставки антигенов. Особый интерес вызывают липосомы (Fries L.F., 1992) и биодеградируемые микрочастицы (Vordermeier Н.М., 1995) в качестве систем доставки антигенов для избирательного воздействия на иммунокомпетентные клетки макроорганизма, имеющие в своей основе высокоочищенные протективные антигены, например белки теплового шока (Murray P.J., 1992). Перспективность этого направления была продемонстрирована конструированием вирусоподобных частиц на основе реополиглюкина и специально отобранных В- и Т-клеточных эпитопов, которые содержат только необходимые для формирования специфического иммунитета фрагменты вирусных белков (Лебедев JI.P. и др., 2000; Karpenko L.I. et al., 2003). Публикации по аналогичным исследованиям, направленным на создание иммунопрофилактических средств против бактериальных патогенов в доступной литературе отсутствуют.

Известно, что иммуногенный потенциал антигенов в составе микрочастицы намного выше, чем в виде растворимых белков [Gregoriadis G., 1999; Venkataprasad N., 1999; Beyer Т., 2001]. Кроме того, искусственные частицы должны имитировать везикулы, образующиеся при апоптозе инфицированных М. tuberculosis макрофагов, что является особенно важным с учетом незавершенного характера фагоцитоза при туберкулезной инфекции. Такие везикулы и, предположительно, микрочастицы способны эффективно процессироваться дендритными клетками и активировать цитотоксические лимфоциты, что является необходимым фактором повышения иммунного ответа на введение противотуберкулезных вакцин [Sibille Y., 1990; Kaufmann S.H., 2001].

Таким образом, широкое распространение лекарственно-устойчивых форм туберкулеза в мире и в Российской Федерации и высокая значимость для общественного здравоохранения разработки и создания новых эффективных средств профилактики и лечения туберкулеза явились основанием для проведения данной исследовательской работы.

Цель и задачи исследования

Цель настоящего исследования — конструирование средств иммунопрофилактики туберкулеза, оценка их эффективности и безопасности и изучение антимикобактериальных свойств препарата на основе конъюгата карбоксиметил-(1->3)-р-0-глюкана с моксифлоксацином.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать методы получения микобактериальных частиц (МБЧ) на основе антигенов вакцинного штамма М, bovis и иммуномодулирующих препаратов;

- исследовать физико-химические свойства полученного препарата;

- изучить антимикобактериальную активность конъюгата моксифлоксацин-карбоксиметил-(1->3)-р-В-глюкана in vitro и in vivo.

Научная новизна и практическая значимость работы

Показано, что микобактериальные частицы на основе дсРНК (двуспиральная рибонуклеиновая кислота) и белков М. bovis BCG безвредны для лабораторных животных (атоксичны, апирогенны, не анафилактогенны).

Впервые показана элиминация микобактерий туберкулеза в линии макрофагальных клеток J774, а также в органах и тканях инфицированных экспериментальных лабораторных животных под действием конъюгата моксифлоксацин-карбоксиметил-(1-»3)-Р-0-глюкана с дозозависимым эффектом.

Результаты проведенных исследований являются экспериментальным обоснованием дальнейших работ по конструированию лечебно-профилактических препаратов нового поколения на основе искусственных иммуногенов в виде микрочастиц и получения конъюгированных форм химиопрепаратов. Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтверждена 2 патентами Российской Федерации на изобретения: №2190417 от 10.10.2002 «Средство для снижения токсичности химически синтезированных противотуберкулезных лекарственных препаратов» и №2242245 от 20.12.2004 «Искусственные микобактериальные частицы и противотуберкулезная вакцинная композиция на их основе».

Апробация работы

Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях и симпозиумах: Международном симпозиуме «Интегративная Медицина в XXI веке» (Судак, Украина, 2004);

Международном Кейстоуновском симпозиуме «Интеграция хозяина и патология патогена» (Вистлер, Канада, 2005);

VI-м конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, Россия, 2005);

Международном междисциплинарном семинаре «Новые технологии в интегративной медицине и биологии» (Бангкок-Паттая, Таиланд, 2006); П-ой интернациональной конференции «ТБ вакцины в мире» (Вена, Австрия, 2006);

Основные положения, выносимые на защиту

1. Искусственные микобактериальные частицы на основе антигенов вакцинного штамма М. bovis BCG и дсРНК являются атоксичными и апирогенными для лабораторных животных и обладают высокой стабильностью и хорошей растворимостью.

4. Совместное введение МБЧ и цитокинов (ИФН-у и ФНО-а) формируют более высокую степень защиты лабораторных животных к экспериментальной туберкулезной инфекции. При этом степень резистентности и интенсивность факторов клеточного иммунного ответа возрастает в ряду: ВСв МБЧ -> МБЧ-ИФН-у-ФНО-а —► МБЧ-ИФН-у.

5. Препарат карбоксиметил-(1-*3)-|3-В-глюкана с ковалентно связанным моксифлоксацином обладает выраженным антимикобактериальным эффектом.

Публикации результатов исследований

Структура и объем работы

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Азаев, Мамедьяр Шакир оглы

выводы

3. Иммунизация лабораторных животных микобактериальными частицами на основе антигенов BCG и дсРНК с включёнными в их состав цитокинами (ИФН-у и ФНО-а) существенно повышает степень их резистентности к экспериментальной туберкулезной инфекции (на 20% и 10% относительно вакцины BCG соответственно).

5. Искусственные микобактериальные частицы в иммунизирующей дозе 30 мкг/животное обладают высокой иммуногенностью, апирогенны и не анафилактогенны.

8. Впервые показана противотуберкулезная эффективность конъюгирован-ной формы карбоксиметил-(1->3)-Р~0-глюкана с моксифлоксацином in vivo и in vitro.

Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно поставленной цели и задачам исследования, работа включает 2 основных направления. Первое направление посвящено разработке и изучению препарата МБЧ и вакцинных композиций. Поскольку используемая с 1921 г. вакцина ВСО утрачивает свои позиции (во-первых, ее эффективность варьирует от 0 до 80% в различных регионах; во-вторых, вакцина защищает только от первичного туберкулеза, но не предотвращает эндогенной реактивации или экзогенной реинфекции, которые как раз и отвечают за распространение туберкулеза. Кроме этого, введение вакцины ВСО на фоне иммуносупрессии чревато развитием иммунодефицитных состоянии макроорганизма), в мире разрабатывается несколько новых вакцин. На уровне лабораторных испытаний находятся свыше 200 вариантов вакцин, среди них цельно-клеточные (аттенуированные, векторные), субъединичные, ДНК-вакцины и др.

МБЧ содержат в центре полинуклеотидный комплекс (дсРНК -стимулятор неспецифической резистентности организма), а на поверхности -белки-антигены вакцины ВСО в составе конъюгата: спермидин-полиглюкин. Связь между полинуклеотидным комплексом и конъюгатом осуществляется посредством ионного взаимодействия между отрицательным зарядом полинуклеотидного комплекса и положительным зарядом спермидина.

Предлагаемый подход позволяет:

- экспонировать на поверхности молекулярной конструкции полный репертуар белков вакцинного штамма ВСО;

- использовать дсРНК в молекулярной конструкции («центральное ядро» частиц) в качестве неспецифического стимулятора иммунного ответа;

- используемый для получения конъюгата полиглюкин также является стимулятором иммунного ответа.

Боле того, сравнительно большие размеры частиц молекулярной конструкции (около 25 нм) позволяют использовать их без применения

171 каких-либо адъювантов, достигая необходимого полноценного иммунного ответа.

Введение в состав противотуберкулезной вакцинной композиции цитокинов (ИФН-у) приводит к более выраженному ответу клеточного звена иммунной системы организма млекопитающего.

Второе направление нашей работы посвящено оценке антимикобактериальной эффективности конъюгата моксифлоксацина с карбоксиметилглюканом в культуре in vitro и на мышиной модели заболевания in vivo. Изучение этого вопроса связано с разработкой технологий конъюгирования антитуберкулезных препаратов с лигандами, а также их химического синтеза и очистки в прицельной доставке лекарственных препаратов к макрофагам через известные лиганды к рецепторам макрофагов. При изучении данного вопроса требовалось решение ряда научно-технических подходов:

- отработка моделей гематогенной туберкулезной инфекции на мышах;

- изучение влияния конъюгатов на выживание животных на модели острой туберкулезной инфекции;

- оценка противотуберкулезной активности конъюгатов по численности бактериальных колониеобразующих единиц и органной патологии при экспериментальном туберкулезе у мышей.

В результате проведенных исследований установлены антимикобактериальное действие конъюгированных и неконъюгированных препаратов в культуре in vitro и на мышиной модели заболевания in vivo и определены наиболее эффективные и нетоксичные дозы для экспериментальных животных.

Объем проделанной работы в рамках диссертации представлен на рис. 32.

Лучение антимикобгктериапьной акт ибност и кон ъкг эта моксифлоксацина слигандсм к скэвендж ер-рецептору макрофага ¡п

Оценка эффект ивност и кон ъкт эта моксифлоксацинас лигандом к скаеендж ер-рецептору макрофага ¡п \Лго

СЦенка иммуногенньсхи протективнь к свойств препарата МБЧ ивакцинньк композиций не его основе

Изучение физико-химических свойств препарата МБЧ

Получение и ха растеризация препарата МБЧ и вакцтных композиций на его основе

Оценка эффективности кон ью га та моксифпоксацина с лигащом к ска вецдюер-рецвлтору макроф а га

Изучение токсигенньк эффектов препарата МБЧ

Из/чение токсикогенных аффектов конькгата моксифлоксацина с лигандом к скавендж ер-рецептору макрофага

Новые подходы в разработке п р от ив огу беркул ез н ы ж средств

Рис. 32. Объем проделанной работы.

Таким образом, в настоящем исследовании разработан перспективный метод создания искусственных микобактериальных частиц. Показано, что введение МБЧ приводит к усилению протективного ответа против туберкулеза по сравнению с иммунизацией вакциной ВСО. Направленное влияние конъюгата моксифлоксацина с карбоксиметелглюканом действует физиологично, соединяясь с рецептором на соответствующей клетке-мишени, эффективны в низких дозах и не оказывают побочного действия. Полученные результаты, открывает возможность создания лечебно-профилактических препаратов нового поколения против туберкулеза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты научных исследований являются основой к созданию препаратов нового поколения для профилактики и лечения туберкулеза животных, для обеспечения профилактических мероприятий и в связи с необходимостью разработки современных средств диагностики и более эффективных препаратов для вакцинации. В рамках четвертого приоритетного направления в постановлении Правительства Российской Федерации от 27 октября 2008 г. №791, Федеральная целевая программа «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы) предусматривает разработку современных средств профилактики, диагностики, лечения и реабилитации, а также технологий производства противотуберкулезных препаратов.

В условиях чрезвычайно высокой зависимости отечественного рынка лекарственных препаратов от импортных поставок субстанций и готовых средств требуется создание в Российской Федерации собственной государственной системы разработки и производства лечебно-профилактических препаратов против возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний, а также современных антибактериальных средств.

Материалы диссертации используются, в том числе и в учебно-образовательном процессе при проведении курсов повышения квалификации специалистов микробиологических лабораторий Министерства здравоохранения и социального развития РФ и Министерства сельского хозяйства РФ по принципам обеспечения биологической безопасности в микробиологических лабораториях при работе с возбудителями опасных и особо опасных инфекций в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

По результатам научных исследований издано 1 методическое указание и разработаны учебно-образовательные программы:

- Лабораторная диагностика туберкулеза. Министерство образования Российской Федерации. Новосибирский государственный университет. МУ. Новосибирск, 2003 год. С. 18.

- Программа курсов первичной специализации и усовершенствования врачей и биологов по ООИ (для специалистов с высшим медицинским, биологическим и ветеринарным образованием в объеме более 500 академических часов, (программа утверждена руководителем Роспотребнадзора Г.Г. Онищенко, 2005 г. и представлена экспертам Федеральной службы по надзору в сфере образования и науки РФ). На основании данной программы получена лицензия (А№166191) на образовательную деятельность ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

- Программа по принципам обеспечения биологической безопасности в микробиологических лабораториях (для специалистов ветеринарных лаборатории в объеме 72 академических часа), утверждена генеральным директором ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, 2007 г.). В рамках реализации данной программы проведено повышение квалификации 64 специалистов ветеринарных лаборатории Россельхознадзора Сибирского федерального округа и научно-исследовательских институтов ветеринарного профиля с вручением документов установленного государственного образца «Удостоверения о краткосрочном повышении квалификации».

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Азаев, Мамедьяр Шакир оглы, Кольцово

1. Авдеева Ж.И., Алпатова H.A., Медуницын Н.В., Масычева В.И. Разработка новых лекарственных препаратов на основе рекомбинантных цитокинов человека (ФНО-а, Г-КСФ, ИЛ-8) // Аллергия, астма и клиническая иммунология. — 2000. Т. 7. — С. 1719.

2. Агзамова P.A. Пути снижения туберкулезной эндемии на эпидемиологически и эпизоотически неблагополучных территориях (клинико-эпидемиологическое исследование): Дисс. докт. мед. наук -Алматы,- 1997.-296 с.

3. Адо А.Д., Ишимова JIM. // Патологическая физиология. М.: «Медицина». - 1980. - 520 с.

4. Александров И.Д. Коррекция иммунодефицита у телят / И.Д. Александров, И.П. Хабузов, Н.С. Ладан, Г.М. Танеева // V Российский нац. конгресс «Человек и лекарство». М. - 1998. - С. 425.

5. Александров И.Д. Т- и В-активины и протективные свойства вакцины БЦЖ / И.Д. Александров, И.П. Хабузов, Н.С. Ладан // Ветеринария. 2000. - № 1. - С. 23-28.

6. Аликин Ю.С. Стимуляторы неспецифической резистентности на основе РНК для ветеринарной медицины: Дисс. докт. биол. наук. — 1998.-340 с.

7. Ашмарин И.П., Воробьев Д.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JL: «Гос. изд. мед. Лит». - 1962.- 174 с.

8. Беседкова H.H. Спектр и некоторые механизмы действия иммуномодуляторов природного происхождения // Тез. докл. в сб. «Иммуномодуляторы и их значение в инфекционной и неинфекционной патологии». М. - 1988. - С. 17.

9. З.Борисов Л.Б. // Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.: «Медицина». - 2002. - С. 437-441.

10. М.Брондз Б.Д., Рохлин О.В. // Молекулярные и клеточные основы иммунологического распознавания. М.: - 1978. - 335 с.

11. Вайсман И., Худ Л., Вуд У. // Введение в иммунологию. М.: «Высшая школа». — 1983. - 160 с.

12. Воронкова О. В., В. В. Новицкий, О. И. Уразова и др. Генетическая гетерогенность лекарст-венно-резистентных штаммов М. tuberculosis, циркулирующих на территории Томской облас-ти. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2007. - № 2. - С.21-27.

13. Волкова К. И., Кокосов А. Н., Браженко Н. А. Туберкулез в период эпидемии ВИЧ/СГ1ИД и наркомании // Проблемы туберкулеза. -2001. № 2. - С.61-65.

14. Вершигора А.Е. // Общая иммунология: Учебное пособие. Киев: «ВЫЩА школа». - 1990. - 736 с.

15. Визель A.A., Гурылева М.Э. // Туберкулез. М.: «ГЭОТАР Медицина». - 1999. - 208 с.

16. Виноград H.A., Сайиткулов A.M., Тазулахова Э.Б., Ершов Ф.И., Шаткип A.A. Применение индуктора интерферона лафарина при экспериментальной нелетальной хламидийпой инфекции мышей // Интерферон-89: Сб. научных трудов. 1989. - С. 129-132.

17. Вишневский П.П. Результаты опытов с БЦЖ на мелких лабораторных животных и крупном рогатом скоте // Вест, соврем, ветеринарии. 1928. - Т. 6. - С. 22.

18. Воробьев A.A., Васильев Н.И. // Адъюванты (неспецифические стимуляторы иммуногенеза). М.: «Медицина». - 1969. -207 с.

19. Воробьев A.A., Медуницын Н.В. Новые принципы и методы создания иммунобиологических препаратов // Российские медицинские вести. 1999. - Т. 4. - С. 55-58.

20. Галактионов В.Г. // Иммунология. М.: «РИД МКД». - 2000. - 488 с.

21. Генерозов Э.В. Молекулярная характеристика полирезистентных клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis из России // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2000 г. -Т.1.-С. 117.

22. Генес B.C. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. М. -1967.-180 с.

23. Государственная фармакопея. Одиннадцатое издание. М.: «Медицина». -1990. - С. 183-185.

24. Готтшалк Г. // Метаболизм бактерий. М.: «Мир». - 1982. - 310 с.

25. Григорян С.С., Майоров И.А., Иванова A.M. и др. Оценка интерферонового статуса людей по пробам цельной крови // Вопросы вирусологии. 1988. - № 4. - С. 43-47.

26. Денисов A.A., Пинегин Б.В., Еремин О.Ф., Кулаков В.В. и др. Изучение иммунорегуляторных свойств рекомбинантного лимфотоксина человека // Иммунология. 1996. - Т. 1. - С. 34-39.

27. Донченко A.C. Изолированое выращивание здоровых телят в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах // Эпизоотология и меры борьбы с инфекционными болезнями: Сб. науч. тр. / ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ие. Новосибирск. - 1986. - С. 60-64.

28. Донченко A.C. Применение биологически активных веществ в ветеринарии и медицине (обзор литературы) /A.C. Донченко Ю.С. Аликин, В.Н. Донченко. Новосибирск, - 1989. - 41 с.

29. Донченко A.C. Состояние и перспективы научных исследований по туберкулезу животных // Ветеринария. 1985а. - Т. 8. - С. 70-71.

30. Донченко A.C., Донченко В.Н. Взаимосвязь туберкулеза человека и животных // Эпизоотология и меры борьбы с туберкулезом и бруцеллезом с.-х. животных: Науч. -техн. бюл. ВАСХНИЛ. Сиб, отд-ние. ИЭВС и ДВ. 19856. - Т. 32. - С. 5-8.

31. Донченко A.C., Донченко В.Н. Повышение протективных свойств вакцины БЦЖ // Вестник РАСХН. 1995. - Т. 5. - С. 58-61.

32. Донченко A.C., Донченко В.Н. // Туберкулез крупного рогатого скота, верблюдов, яков, овец и пантовых оленей / Профилактика туберкулеза крупного рогатого скота путем применения вакцины БЦЖ. Новосибирск. - 1994. - 194 с.

33. Дончспко В.Н., Дончспко A.C., Дончспко H.A. Влияние различных иммуномодуляторов на развитие туберкулезного процесса у морских свинок // Сб. науч. тр. РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. 1997. - С. 124-127.

34. Донченко H.A. Совершенствование методических подходов и методик расчета экономического ущерба при туберкулезе крупного рогатого скота / Соавт.: Буяндалай Цацралт, А.Н.Шевьев // Сиб. вестник с.-х. науки. 2007. -№ 12. - С. 83-89.

35. Ершов Ф.И. Интерфероны (к 40-летию открытия) // Вопросы вирусологии. 1998. Т.9. - С. 247-252.

36. Ершов Ф.И. // Система интерферона в норме и при патологии. — М. «Мир». 1996. - 145 с.

37. Ершов Ф.И., Сайиткулов A.M. Микрометод для изучения индукторов интерферона in vitro // Вопросы вирусологии. 1984. -Т. 29.-С. 756-757.

38. Ершов Ф.Н., Жданов В.М. Индукторы интерферона // Сб. науч. тр. АМН СССР, Ин-т вирусологии им. Д.И. Ивановского. М. - 1982. -201 с.

39. Земсков В.М., Земсков A.M. Принципы дифференцированной иммунокоррекции // Иммунология. — 1996. — Т. 3. С. 4-6.

40. Земсков М.В., Земсков A.M. Диалектика некоторых форм современной иммунопатологии // Иммунология. 1984. - Т. 1. - С. 5-10.

41. Игнатенко Н.Г., Седов В.А., Зелепукиы B.C., Гущин В.И. Сибирская язва сельскохозяйственных животных / Исследование патологического материала. 1987. - М. «АГРОПРОМИЗДАТ». - С. 156-164.

42. Ильина Т.Я. Распространенность рецидивов туберкулеза органов дыхания при напряженной эпидемической ситуации // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2005. - № 7. — С.32.

43. Иоффе В.И. // Клиническая и эпидемиологическая иммунология. Л. - 1968.-373 с.

44. Кабанов В.А., Петров Р.В., Хаитов P.M. Итоги науки и техники // Сер. Иммунология. 1984. - Т. 13. - С. 6-53.

45. Карачунский М.А. Туберкулез в наши дни // РМЖ. 2001. - Т. 9. -№21.-С. 951.

46. Кассич Ю.Я., Тихонов П.М. Совершенствование и сравнительное изучение методов обработки материала из объектов внешней среды для культуральной диагностики туберкулеза // Ветеринария. 1984. -Т. 54. - С.16-18.

47. Квапинский Е., Брэдли С., Эквист Л., Вудсайд Е., Албах Р. и др. // Молекулярная микробиология. Пер. с англ. 1977. - М.: - 520 с.

48. Кетлинский С.А., Калинина П.М. // Иммунология для врача. СПб.: «Гиппократ». - 1998. - 142 с.

49. Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., Воробьев A.A. // Эндогенные иммуномодуляторы. СПб.: «Гиппократ». - 1992. - 255 с.

50. Кисленко В.Н. Выживаемость микобактерий туберкулеза бычьего типа в почве пастбища // Ветеринария. 1972. - Т. 6. - С.48-51.

51. Ковалев С.И., Скорняков С.Н., Кравченко М.А., Камаев ЕЛО. Туберкулез сегодня: Материалы 7-го Российского съезда фтизиатров. 2003.

52. Кокуричеев П.И. Влияние типа туберкулиновых микробов и вида животных на характер патологоанатомических изменений при туберкулезе //Тезисы докл. научн. тр. Всесоюз. межвуз. конф. по патолого-анатомии с-х животных. 2007. - С. 20-23.

53. Коляков Я.Е. // Ветеринарная иммунология. М.: «Агропромиздат». - 1986.-270 с.

54. Конопаткина A.A. // Эпизоотология и инфекционные болезни сельскохозяйственных животных. М.: «Колос». - 1984. - 537с.

55. Кост Е.А. // Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. М.: «Медицина». — 1975. - 384 с.

56. Косяков П.Н. // Общая и частная вирусология. М.: «Медицина». -1982.-345 с.

57. Краткое сообщение о деятельности ВОЗ // Бюллетень ВОЗ. 1990. Т.68. №1. С.87-95.

58. Кремлев Е.П. Причины возникновения туберкулеза крупного рогатого скота в ранее оздоровленных хозяйствах // Современныепроблемы профилактики и лечения зоонозных заболеваний и лейкозов. -2007. С. 34.

59. Культура животных клеток. Методы / Исключение красителя для определения жизнеспособных клеток // Под редакцией Р. Фрешни. — М. «Мир». 1989.-С. 116.

60. Культура животных клеток. Методы / Среды для безсывороточных культур клеток или с низкой концентрацией сывороток // Под редакцией Р. Фрешни. М. «Мир». - 1989. - С. 45-46.

61. Лапина А.И. Организация борьбы с туберкулезом в СССР. М.: «Медицина». - 1969. - 145 с.

62. Лебедев Л.Р., Карпенко Л.И., Порываева В.А., Азаев М.Ш., Рябчикова Е.И., Гилева И.П., Ильичев A.A. Конструирование вирусоподобных частиц, экспонирующих эпитопы ВИЧ-1 // Молекулярная биология. 2000. - Т. 34. - С. 1-6.

63. Малярова Е.Ю., Мушкин А.Ю., Коваленко КН., Кондратенко И.В. // Лечение множественных костных поражений у ребенка сгенерализованной BCG-инфекцией. 2005. - Пробл. туберк. болезн. лёгких. -№. 11.-С. 34-36.

64. Луницын В.Г., Донченко А.С .// Туберкулез пантовых оленей 1994.- Барнаул. 285 с.

65. Магнитский В.А. Динамика эндемии туберкулеза среди сельского населения РСФСР // Туберкулез в сельской местности. 1990. - С. 915.

66. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Гель-электрофорез // Молекулярное клонирование. 1984. - М. «Мир». - 480 с.

67. Марчук Г.И. // Математические модели в иммунологии. — М.: «Наука». 1980.-264 с.

68. Масычева В.И. и др. Изучение иммуномодулирующей активности рекомбинантпого человеческого фактора некроза опухоли-бета (ФНО-ß) // Сб. научных трудов сотрудников НИКТИ Б AB. 1996. -Бердск. - 103 с.

69. Масычева В.И., Хомов В.В., Сизов A.A., Фадина В.А., Барановская Г.А., Сизова Л.Ю. Иммуностимулирующие и адаптогенные свойства препарата "фагостим" // Сб. научных тр. сотрудников НИКТИ БАВ.- 1996.-Бердск.-С. 185-189.

70. Мишин В.Ю. Диагностика туберкулеза органов дыхания // Рус. мед. журн. — 1998. — Т. 6(17).-С. 1135-1137.

71. Мишин В.Ю. Современная стратегия лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза легких // Лечащий врач. 2000. - Т. 3. — С. 4-9.

72. Мишин В.Ю. Современные режимы химиотерапии туберкулеза легких, вызванного лекарственно-чувствительными и лекарственно-резистентными микобактериями // Российский мед. журнал. 2003. -Т. 11.-С. 12-14.

73. Мишин В.Ю., Борисов С.Е., Соколова Г.Б. Разработка современных протоколов диагностики и лечения туберкулеза органов дыхания // Consilium medicum. -2001,- Т. 3 С. 148-154.

74. Накимсон„ Л.И. Критическая оценка экспериментальных методов определения эффективности вакцины БЦЖ // Бюл. Ин-та туберкулеза АМН СССР. 1951.-Т. 1.-С. 120-129.

75. Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Лимещенко Е.В. и др. Характеристика циркулирующих на северо-западе России штаммов Mycobacterium tuberculosis с использованием сполиготипирования // Пробл. туберкулеза. 2002. - Т. 4. - С.44-47.

76. Новиков Д.К. Общие принципы иммунодиагностики и иммунотерапии: Иммунологический статус как феномен болезни и критерии целенаправленной иммунокоррекции // Иммунодиагностика и иммунотерапия / Сб. науч. тр. : Л. — 1986. — Т. 6.-С. 3-13.

77. Ноздрин Г.А. Фармакологическая коррекция иммунодефицитов у телят в ранний постнатальный период жизни. Автореферат дисс. докт вет. наук. СПб. 1996. - 46 с.

78. Пальцев М.А. О биологической безопасности // Вестник Российской академий наук. 2003. - Т. 73. - № 2. - С .99-109.

79. Патент РФ №2186109, кл. С 12 N 15/11, опубл. 27.07.2002.

80. Патент РФ №2190018, кл. С 12 N 15/87, опубл. 27.09.2002.

81. Патент США №5504005, кл. С 12 N 15/64, опубл. 02.04.1996.

82. Патент США №5776465, кл. А 61 К 39/04, опубл. 07.07.1998.

83. Патент США №6270774, кл. А 61 К 35/00, опубл. 07.08.2001.

84. Перельман М.И. О концепции Национальной Российской программы борьбы с туберкулезом // Пробл. туберкулеза. 2000. — Т. З.-С. 51-55.

85. Перельман М.Н., Корякин В. А., Протопопова Н.М. // Туберкулез. М.: «Медицина». - 1990. - 304 с.

86. Перт Дж. С. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / Методы окрашивания. М.: «Мир». - 1978. - С.33-34.

87. Петров Р.В. // Иммунология. М.: «Медицина». - 1982. — 367 с.

88. Петров Р.В., Михайлова A.A., Захарова Л.А. Костномозговые медиаторы, регулирующие иммунный ответ (миелопептиды) // Гематология и трансфузиология, 1984. - Т. 2. - С. 43-45.

89. Петров Р.В., Павлюк A.C., Ковальчук JI.B. Интерлейкинзависимые иммунодефициты человека. // Иммунология. 1987.-Т. 4.-С. 20-23.

90. Петров Р.В., Хаитов P.M. Искусственные антигены и вакцины //-М.: «Медицина», 1988.-288 с.

91. Петров Р.В., Чередеев А.Н., Ковальчук JI.B. Проблема клинической иммунологии на современном этапе // Иммунология. — 1984.-Т. 6.-С. 9-11.

92. Петухов B.JI., Жигачев А.И,, Назарова Г.А. // Ветеринарная генетика с основами вариационной статистики. — М.: «Агропромиздат». 1985. - 368 с.

93. Петрухина М. И., Русакова Е. В. Ющенко Г. В. Эпидемиологический надзор за туберкулезом в современных условиях // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиологии. — 2003. № 5. - С.93-96.

94. Погожева Л.М., Мурашкина Г.С., Новикова Н.М, Алексеева Т.В., Силаикина С.Т. Туберкулез в Сибири в начале XXI века // Проблемы туберкулеза. — 2003. Т. 5. - С. 51-64.

95. Подымова С.Д. // Болезни печени (Руководство для врачей). — М.: «Медицина». 1998. - 704 с.

96. Порядок и методы контроля иммунологической безопасности вакцин. Общие методические принципы. МЗ СССР. РД 42-28-1090. -М.:- 1989.

97. Практикум по иммунологии // Под. ред. И.А. Кондратьевой, В.Д. Самуилова. -М.: МГУ. 2001. - 224 с.

98. Практикум по микробиологии. Учебное пособие для студентов высших учебных заведений / Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук М.Л. и др.: Под редакцией А.И. Нетрусова. -М.: Издательский центр «Академия», 2005. 608 с.

99. Пузик В.И. // Проблемы иммуноморфологии туберкулеза. -1966. М.: «Медицина». - 180 с.

100. Пунга В.В., Капков Л.П. Туберкулез в России // Проблемы туберкулеза. 1999. - Т. 1. - С. 4-6.

101. ГГшеиичников В.А., Семенов Б.Ф., Зезеров Е.Г.// Стандартизация вирусологических исследований. 1974. - М. - С. 123-126.

102. Рабухин А.Е. // Химиотерапия больных туберкулезом легких. -1970.-М.-400 с.

103. Руководство по вакцинному и сывороточному делу // Под редакцией Бургасова П.Н. 1978. - М.: «Медицина». - 440 с.

104. Руководство по иммунофармакологии // Под редакцией М.М. Дейла, Дж.К. Формена. 1998. - М.: «Медицина». -332 с.

105. Рыкова М.П., Спиранде И.В., Зедгенидзе М.С. и др. Новая высокочувствительная техника тестирования нормальных киллеров //Иммунология, 1981.-№3.-С. 88-90.

106. Самойлова А.Г., Марьяндышев А.О. Лекарственная устойчивость микобактерии туберкулеза актуальная проблема фтизиатрии // Проблемы туберкулеза. - 2005. - Т. 7. - С. 3-9.

107. Сивков, А. Ю., Болдырев А. 11., Азаев М. Ш. и др. Определение причин распространения MDR-штаммов на основе анализа популяции рифампицин- и/или изониазид-устойчивых изо-лятов M.tuberculosis // Мол. генетика, микробиология и вирусология. -2006. С.20-25.

108. Скотникова О.И. Молекулярно-биологическис методы во фтизиатрии // Проблемы туберкулеза. 2005. - Т. 8. - С. 5-10.

109. Скотникова О.И., Соболев А.Ю., Исаев Е.А. // Лабораторная диагностика. 2007. - М.: - 342 с.

110. Смирнов A.M. Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных // Вет. патология. М. - 2007. -С. 31-37.

111. Сорокин A.B. // Пирогепы. 1965. -М.: «Медицина». - 176 с,

112. Степанян И.Э. Вопросы диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза органов дыхания в современных условиях // Российский мед. журнал. 1999. - Т. 7. - С. 836.

113. Технические условия / 9291-037-23609643-98 "Ветом"-3. -1998. 11 с.

114. То1унова А.И. Иммунизация живой вакциной против туберкулеза // Профилактика инфекции живыми вакцинами. Под ред. М.И. Соколова. М.: «Медгиз». - 1960. - С. 199-345.

115. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль / Под ред. Барри Р. Блума. М.: «Медицина». - 2002. - 696 с.

116. Урсов И.Г., Краснов В.А. Проблемы эпидемии туберкулеза в западной Сибири // Тезисы докл. Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. /Новосибирск. 1998.-С. 164-165.

117. Фармер П. Е., А. С. Кононец С.Е., Борисов А., Гольдфарб Б.Н., Крисверт Т., Хилинг М., МакКи. Новая волна туберкулеза в Российской Федерации // «Полирезистептный туберкулез: угроза человечеству». 1998. - 275 с.

118. Фельдман Г.Я., Умбрашко Ю.Б., Буйкис А.Х. Физико-химические и биологические свойства двуспиральной РНК -индуктор интерферона // Вопросы вирусологии. 1984. - Т. 4. - С. 463-468.

119. Фомина А.Н., Григорян С.С. Биологическая активность нового отечественного природного индуктора двунитевой РНК // Антибиотики. - 1980. - Т. 1. - С. 28-32.

120. Фролова Ф. Н., Кулаков И. М., Зайнутдинова Н. Г., Фатыхова P. X. О заболеваемости туберкулёзом в г.Казань // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. 2002 - Вып. 5. -С. 144-146.

121. Хабиб О. Туберкулез: настоящее и будущее // Рус. мед. журн.1999. Т. 7.-С. 16.

122. Хабузов И.П. Иммунокоррекция Т- и В-систем иммунитета у круп-ного рогатого скота, иммунизированного вакциной БЦЖ /И.П. Хабузов //Итоги науч.-исл. работы ДонГАУ. Персиановский. -2001.-С. 158-159.

123. Хазипов Н.З., Сафин М.А., Идрисов Г.З. // Туберкулез крупного рогатого скота. 1985. - М.: «АГРОПРОМИЗДАТ». - 127 с.

124. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные представления о защите организма от инфекции // Иммунология. 2000. - №1. - С. 61-64.

125. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Основные представления об иммунотропных лекарственных средствах // Иммунология. 1996. -Т. 6. - С. 4-9.

126. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Основные принципы иммуномодулирующей терапии // Аллергия, астма клин иммунол.2000.-Т. 1. С.9-16.

127. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Современные представления о защите организма от инфекции // Иммунология. 2000. - № 1. - С. 61-64.

128. Хайкин Б.Я., Кравец А.Т., Зубакин В.А. Профилактическая эффективность вакцины БЦЖ при разных методах введения крупному рогатому скоту // Инфекционные болезни с.-х. животных / ВАСХНИЛ. Сиб. отд-нис. Новосибирск. 1984. - С. 3-7.

129. Хоменко А.Г. // Туберкулез / Руководство для врачей. М.: «Медицина». - 1996. - 493 с.

130. Хоменко А.Г. Основы диагностики туберкулеза // Российский мед. журнал. — 1995. Т. 1. - С. 25.

131. Хоменко А.Г. Туберкулез как международная и национальная проблема // Проблемы туберкулеза. 1994. - Т. 2. - С. 2-4.

132. Хоменко А.Г. Химиотерапия туберкулеза история и современность // Проблемы туберкулеза. - 1996. - Т. 3. - С. 2-6.

133. Хоробрых В.В., Пронин В.А., Киркин Ф. А., Санин В.А. Методы постановки реакции бласттрансформации в микромодификации // Иммунология. 1983. - № 3. - С. 76-79.

134. Чередева А.Н., Ковальчук JI.B. Интерпретация лабораторных показателей при оценке иммунного статуса человека // Лабораторное дело,- 1991,-Т.2.- С. 6-14.

135. Черпоусова Л.11. Молекулярная эпидемиология туберкулеза в тюрьмах // Актуальные проблемы пенитенциарной медицины. Материалы международной научно-практич. конференции. 2001. -Минск.-С. 48-50.

136. Черноусова Л.Н. Современные тенденции и возможности микробиологической диагностики туберкулеза // Рус. мед. журнал. -2002.-Т. 10.-С. 697.

137. Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В., Голышевская В.И. Роль ПЦР-анализа в комплексных бактериологических анализах во фтизиатрии // Проблемы туберкулеза.-2001.-Т. З.-С. 58-60.

138. Чуканов В.И. Основные принципы лечения больных туберкулезом легких // Рус. медицинский журн. 1998. - Т. 6. - С. 1138-1142.

139. Чучалин А.Г. Новые данные иммунных реакций при туберкулезе // Рус. мед. журн. 2004. - Т. 4. — С. 12.

140. Чучалин А.Г. Новые данные иммунных реакций при туберкулезе // Рус. мед. журн. 2004. - Т. 12. - С. 21.

141. Шевченко Ю.Л. Борьба с туберкулезом в России на пороге XXI века // Проблемы туберкулеза. 2000. - Т. 3 — С. 2-6.

142. Шиндлер Е.М. // К вопросу о взаимосвязи туберкулеза человека и крупного рогатого скота. Алма-Ата. - 1977. - 37 с.

143. ШирипскиЙ B.C., Старостина Н.М., Сенникова Ю.А., Малышева О.А. Проблемы диагностики и классификации вторичных иммунодефицитов // Аллергология и иммунология. 2000. - Т. 1. -С. 62-70.

144. Шишков В.П. // Ветеринарный энциклопедический словарь. -М.: «Советская энциклопедия». 1981. - 528 с.

145. Шишков В.П., Жарков А.В., Налетов Н.А. // Патолого-анатомическая диагностика болезней крупного рогатого скота. — М.: «АГРОПРОМИЗДАТ». 1987. - 87 с.

146. Шишков В.П., Ткачев-Кузьмин А.В., Качанова С.П. // Туберкулез животных, методы диагностики и профилактики. — М.: «ВНИИТЭИСХ». 1986. - 44 с.

147. Шлеева М.О., Мукамолова Г.В., Телков М.В., Березинская Т.Д., Сыроежкин А.В., Бикетов С.Ф., Капрельянц А.С. Образование некультуральных Mycobacterium tuberculosis и их размножение // Микробиология. 2003. - Т. 72. - С. 76-83.

148. Ярилин А. А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии // Иммунология. 1997. -Т. 5.-С. 7-14.

149. Abrams P.G., McClamrock Е. and Foon К. A. Evening administration of alpha interferon // N. Engl. J. Med. 1985. - V. 312. -P. 443-444.

150. Agastno C., deLeon P., Lasmer R. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. -1998.-V. 2.-P. 518-520.

151. Aggarwal B.B., Henzel W.J., Moffat B., Kohr W.J. and Harkins R.N. Primary structure of human lymphotoxin derived from 1788 lymphoblastoid cell line // J. Biol. Chem. 1985. - V. 260 - P. 23342344.

152. Ahmad S., Amoudy H.A., Thole J.E., Young D.B. and Mustafa A.S. Identification of a novel protein antigen encoded by a Mycobacterium tuberculosis-specific RD1 region gene // Scand. J. Immunol. 1999.-V. 49. - P. 515-522.

153. Allison A.C. and Byars N.E. Immunological adjuvants: desirable properties and side-effects // Mol. Immunol. 1991. - V. 28 - p.279-284.

154. Ando S., Putnam D., Pack D.W., Langer R. PLGA microspheres containing plasmid DNA: preservation of supercoiled DNA via cryopreparation and carbohydrate stabilization // J. Pharm. Sci. 1999. -V. 88.-P. 126-130.

155. Aronson N.E., Santosham M., Comstock G.W., Howard R.S., Moulton L.H., Rhoades E.R. and Harrison L.H. Long-term efficacy of BCG vaccine in American Indians and Alaska Natives: A 60-year follow-up study // JAMA. 2004. - V. 291. - P. 2086-2091.

156. Azuma I. Synthetic immunoadjuvants: application to non-specific host stimulation and potentiation of vaccine immunogenicity // Vaccine. -1992,-V. 10.-P. 1000-1006.

157. Balazs D., Cojocaru R. and Damian M. Molecular characterization of Mycobacterium bovis BCG: Romanian sub-strain // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - V. 3. - P. 542-545.

158. Balkwill F.R., Lee A., Aldam G., Moodie E., Thomas J.A., Tavernier J. and Fiers W. Human tumor xenografts treated withrecombinant human tumor necrosis factor alone or in combination with interferons // Cancer Res. 1986. -V. 46. - P. 3990-3993.

159. Benoit M.A., Baras B., Gillard J. Preparation and characterization of protein-loaded poly(epsilon-caprolactone) microparticles for oral vaccine delivery // International Journal of Pharmaceutics. 1999. - V, 184.-P. 73-84.

160. Bergmeyer H. And Holder A // Clin. Chem. Acta. 1980. - V. 105.-P. 147-152.

161. Berthet F.X., Rasmussen P.B., Rosenkrands I., Andersen P., Gicquel B. A Mycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT-6 and a novel low-molecular-mass culture filtrate protein (CFP-10) // Microbiology. 1998. - V. 144. - P. 3195-3203.

162. Beutler B., Cerami A. Cachectin and tumour necrosis factor as two sides of the same biological coin // Nature. 1986. - V. 320. - P. 584588.

163. Beutler B., Greenwald D., Hulmes J.D., Chang M., Pan Y.C., Mathison J., Ulevitch R. and Cerami A. Identity of tumour necrosis factor and the macrophage-secreted factor cachectin // Nature. 1985. - V. 316. -P. 552-554.

164. Beutler B., Milsark I.W., Cerami A.C. Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin//Science. 1985.-V. 229. - P. 869-871.

165. Beyer T., Herrmann M., Reiser C., Bertling W., Hess J. Bacterial carriers and virus-like-particles as antigen delivery devices: role of dendritic cells in antigen presentation // Curr. Drug Targets. Infect. Disord. 2001. - V. 1. - P. 287-302.

166. Borchard G. Chitosans for gene delivery // Adv. Drug Deliv. Rev. -2001.-V. 52.-P. 145-150.

167. Brandt L., Elhay M., Rosenkrands I., Lindblad E.B. and Andersen P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis // Infect. Immun 2000. - V. 68.-P. 791-795.

168. Britton W.J. and Palendira U. Improving vaccines against tuberculosis// Immunol. Cell Biol. 2003. - V. 81.-P. 34-45.

169. Brodin P., Rosenkrands I., Andersen P., Cole S.T., Brosch R. ESAT-6 proteins: protective antigens and virulence factors? // Trends Microbiol. 2004. - V. 12. - P. 500-508.

170. Camus J.C., Pryor M.J., Medigue C., Cole S.T. Re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv // Microbiology. 2002. - V. 148. - P. 2967-2973.

171. Carswell E.A., Old L.J., Kassel R.L., Green S., Fiore N.,Williamson B. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1975. - V. 72. - P. 36663670.

172. CDC. WHO/IUATLD Global project on anti-tuberculosis drug resistance survillance // TB Notes. 1997. - V. 4. - P. 15-18.

173. Cha Y., Pitt C.G. The biodegradability of polyester blends // Biomaterials 1990.- V. 11.-P. 108-112.

174. Champion P.A., Stanley S.A., Champion M.M., Brown E.J., Cox J.S. C-terminal signal sequence promotes virulence factor secretion in Mycobacterium tuberculosis // Science. 2006. - V. 313. - P. 1632-1636.

175. Cole S.T., Barrell B.G. Analysis of the genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv // Novartis. Found. Symp. 1998a. - V. 217. - P. 160-172.

176. Collins F.M., Wayne L.G., Montalbine. The effect of cultural conditions on the distribution of Mycobacterium tuberculosis in the spleens and lungs of specific pathogen-free mice //Am Rev Respir Dis. -1974.-V. 110.-P. 147-156.

177. Cross A.S., Sadoff J.C., Kelly N., Bernton E., Gemski P. Pretreatment with recombinant murine tumor necrosis factor alpha/cachectin and murine interleukin 1 alpha protects mice from lethal bacterial infection// J. Exp. Med. 1989.-V. 169.-P. 2021-2027.

178. Daniel T.M. The history of tuberculosis // Respir Med. -2006. -V. 100.-P. 1862-1870.

179. Dannenberg A.M., Jr. Immune mechanisms in the pathogenesis of pulmonary tuberculosis // Rev. Infect. Dis. 1989. - V. 11. - P. 369-378.

180. Denis-Mize K.S., Dupuis M., MacKichan M.L., Singh M., Doe B., OTIagan D., Ulmer J.B., Donnelly J.J., McDonald D.M., Ott G. Plasmid197

181. DNA adsorbed onto cationic microparticles mediates target gene expression and antigen presentation by dendritic cells // Gene Ther. -2000.-V. 7.-P. 2105-2112.

182. Dhiman N. and Khuller G.K. Mycobacterial proteins—immune targets for antituberculous subunit vaccine // Indian J. Exp. Biol. 1999. -V. 37.-P. 1157-1166.

183. Doe B., Selby M., Barnett S., Baenziger J., Walker C.M. Induction of cytotoxic T lymphocytes by intramuscular immunization with plasmid DNA is facilitated by bone marrow-derived cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. - V. 93. - P. 8578-8583.

184. Donnelly J.J., Liu M.A., Ulmer J.B. Antigen presentation and DNA vaccines // Am. J. Respir. Crit Care Med. 2000. - V. 162. - P. 190-193.

185. Elhay M.J., Andersen P. Immunological requirements for a subunit vaccine against tuberculosis // Immunol. Cell Biol. 1997. - V. 75. — P. 595-603.

186. Esser D., Amanuma H., Yoshiki A., Kusakabe M., Rudolph R., Bohm G. A hyperthermostable bacterial histone-like protein as an efficient mediator for transfection of eukaryotic cells // Nat. Biotechnol. -2000,-V. 18.-P. 1211-1213.

187. Flynn J. IL-12 increases resistance of BALB/c mice to Mycobacterium tuberculosis infection // J. Immunol. 1995. - V, 155. — P. 2515-2524.

188. Flynn J.L. Immunology of tuberculosis and implications in vaccine development // Tuberculosis. (Edinb.). 2004. - V. 84. - P. 93-101.

189. Fries L.F., Gordon D.M., Richards R.L., Egan J.E., Hollingdale M.R., Gross M., Silverman C., Alving C.R. Liposomal malaria vaccine in humans: a safe and potent adjuvant strategy // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992. - V. 89. - P. 358-362.

190. Fynan E.F., Webster R.G., Fuller D.H., Haynes J.R., Santoro J.C., Robinson H.L. DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1993.-V. 90.-P. 11478-11482.

191. Gangadharam PR. BCG vaccination and non-tuberculous Mycobacteria // Tubercle. 1981 . - V. 62. - P. 223-224.

192. Garba S.A., Terry R.J., Adegboye D.S., Lamorde A.G., Abalaka J.A. The choice of adjuvants in Mycoplasma vaccines // Microbios. -1989.-V. 57. — P. 15-19.

193. Gey Van Pittius N.C., Gamieldien J., Hide W., Brown G.D., Siezen R.J., Beyers A.D. The ESAT-6 gene cluster of Mycobacterium tuberculosis and other high G+C Gram-positive bacteria // Genome Biol. -2001.-V. 2.-P. 25-26.

194. Global tuberculosis control: surveillance, planning, financing. WHO report 2005 / Geneva, World Health Organization. 2005.

195. Gregoriadis G., McCormack B., Obrenovic M., Saffie R., Zadi B., Perrie Y. Vaccine entrapment in liposomes // Methods. 1999. - V. 19. -P. 156-162.

196. Groman E.V.; Menz E.T.; Enriquez P.M.; Jung, C.; Lewis J.M.; Josephson L. Delivery of therapeutic agents to receptors using polysaccharides. U.S. A. Patent 5, 554, 386, 1996.

197. Groman E.V.; Menz E.T.; Enriquez P.M.; Jung, C.; Lewis, J.M.; Josephson, L. Delivery of therapeutic agents to receptors using polysaccharides. International Patent W095/34325, 1995.

198. Groves M.J. BCG: прошлое, настоящее и будущее туберкулезной вакцины П. .Pharm. and Pharmacol. 1997.Vol.49. Suppl. С.7-15.

199. Gurunathan S., Klinman D.M., Seder R.A. DNA vaccines: immunology, application, and optimization // Annu. Rev. Immunol. -2000,- V. 18.-P. 927-974.

200. Haines T.A., Komov V., Jagoe C.H. Lake acidity and mercury content of fish in Darwin National Reserve, Russia // Environ. Pollut. -1992.-V. 78.-P. 107-112.

201. Haranaka K., Carswell E.A., Williamson B.D., Prendergast J.S., Satomi N., Old L.J. Purification, characterization, and antitumor activity of nonrecombinant mouse tumor necrosis factor // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1986. - V. 83. - P. 3949-3953.

202. Medley M.L., Curlcy J. and Urban R. Microspheres containing plasmid-encoded antigens elicit cytotoxic T-cell responses // Nat. Med. -1998.-V. 4.-P. 365-368.

203. Hemmi H., Takeuchi O., Kawai T., Kaisho T., Sato S., Sanjo H., Matsumoto M., Hoshino K., Wagner H., Takeda K., Akira S. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA // Nature. 2000. - V. 408. - P. 74074.

204. Herberman R.B., Ortaldo J.R., Timonen T., Reynolds C.W., Djeu J.Y., Pestka S., Stanton J. Interferon and natural killer (NK) cells // Tex. Rep. Biol. Med. 1981.-V.41.-P. 590-595.

205. Hoag H. New vaccines enter fray in fight against tuberculosis // Nat. Med. 2004. - V. 10. - P. 6.

206. Horwitz M.A., Harth G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis // Infect. Immun. 2003. - V. 71. — P. 1672-1679.

207. Ijzermans J.N., Bouwman E., Bijma A., Jeekel J., van der Meide P.I I., Marquet R.L. Immunomodulation by recombinant rat interferon-gamma in vivo // J. Interferon Res. 1990. - V. 10. - P. 203-211.

208. Ildirim I., Sapan N., Cavusoglu B. Comparison of BCG vaccination at birth and at third month of life // Arch. Dis. Child. 1992. -V. 67.-P. 80-82.

209. Iseman M.D. and Madsen L.A. Drug-resistant tuberculosis // Clin. Chest Med. 1989.-V. 10.-P. 341-353.

210. Iwasaki A., Torres C.A., Ohashi P.S., Robinson H.L., Barber B.H. The dominant role of bone marrow-derived cells in CTL induction following plasmid DNA immunization at different sites // J. Immunol. -1997.-V. 159.-P. 11-14.

211. Jouanguy E., Doffinger R., Dupuis S., Pallier A., Altare F., Casanova J.L. IL-12 and IFN-gamma in host defense against mycobacteria and salmonella in mice and men // Curr. Opin. Immunol. -1999.-V. 11.-P. 346-351.

212. Kamath A.T., Feng C.G., Macdonald M., Briscoe H., Britton W.J. Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis // Infect. Immun. 1999. - V. 67. -P. 1702-1707.

213. Karpenko LI, Ivanisenko VA, Pika IA, Chikaev NA, Eroshkin AM, Veremeiko TA, Ilyichev AA. Insertion of foreign epitopes in HBcAg: how to make the chimeric particle assemble // Amino Acids. -2000. V. 18(4).-P. 329-337.

214. Kaufmann S.H. How can immunology contribute to the control of tuberculosis? // Nat. Rev. Immunol. 2001. - V. 1. - P. 20-30.

215. Kaufmann S.H. Is the development of a new tuberculosis vaccine possible? // Nat. Med. 2000. - V. 6. - P. 955-960.

216. Kodama T., Freeman M., Rohrer L. et al. Type I macrophage scavenger receptor contained alpha-helical and collagen-like coiled coils //Nature. 1990.-V. 343.-P. 531-535.

217. Koren H. and Becker S. Antimicrobial defense mechanisms. In: Comprehensive Treatise on Pulmonary Toxicology / Parent RA, ed., Boca Raton, FL, CRC-Press. 1992. - P. 747-769.

218. Krauzewicz N., Stokrova J., Jenkins C., Elliott M., Higgins C.F., Griffin B.E. Virus-like gene transfer into cells mediated by polyoma virus pseudocapsids // Gene Ther. -2000. V. 7. - P. 2122-2131.

219. Krieger M. and Herz J. Structure and function of multiligand lipoprotein receptors: macrophage scavenger receptors and LDL receptor-related proteins // Ann. Rev. Biochem. 1994. - V. 63. - P. 601-637.

220. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680685.

221. Lalvani A., Brookes R., Wilkinson R.J. et al. "Human cytolytic and interferon y-secreting CD8f T lymphocytes specific for Mycobacterium tuberculosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 270-272.

222. Lavy A., Mates A. A 10 year survey on Mycobacterium tuberculosis isolates in Israel and their drug resistance // Isr. J. Med. Sci. -1994.-V. 30.-P. 805-810.

223. Lewis K.N., Liao R., Guinn K.M., Hickey M.J., Smith S., Behr M.A., Sherman D.R. Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmette-Guerin attenuation // J. Infect. Dis. 2003. - V. 187.-P. 117-123.

224. Lowric D.B., Silva C.I,., Colston M.J., Ragno S., Tascon R.E. Protection against tuberculosis by a plasmid DNA vaccine // Vaccine. — 1997.-V. 15.-P. 834-838.

225. Lowrie D.B., Silva C.L., Tascon R.E, Genetic vaccination against tuberculosis // Springer Semin. Imraunopathol. 1997. - V. 19. - P. 161173.

226. Mahairas G.G., Sabo P.J., Hickey M.J., Singh D.C., Stover C.K. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BU>K and virulent M. bovis // J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 12741282.

227. Majumdar S.; Basu S.K. Receptor-Mediated Delivery of p-Aminosalicylic Acid Conjugated to Maleylated Serum Albumin against Mycobacterium tuberculosis Infection in Guinea Pigs // Drug Delivery. — 1995.-V. 2.-P. 144-149.

228. Maloy K.J., Donachie A.M., O'Hagan D.T., Mowat A.M. Induction of mucosal and systemic immune responses by immunization with ovalbumin entrapped in poly(lactide-co-glycolide) microparticles // Immunology. 1994.-V. 81.-P. 661-667.

229. Marei A., Ghaemmaghami A., Renshaw P., Wiselka M., Barer M., Carr M., Ziegler-Heitbrock L. Superior T cell activation by ESAT-6 as compared with the ESAT-6-CFP-10 complex // Int. Immunol. 2005. -V. 17.-P. 1439-1446.

230. Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms//J. Mol. Biol. 1961. - V. 3. - P. 208-218.

231. Maue A.C., Waters W.R., Palmer M.V., Nonnecke B.J., Minion F.C., Brown W.C., Norimine J., Foote M.R., Scherer C.F., Estes D.M. // An ESAT-6:CFP10 DNA vaccine administered in conjunction with Mycobacterium bovis BCG confers

232. McAdam J.M., Brickner P.W., Scharer L.L., Crocco J.A., Duff A.E. The spectrum of tuberculosis in a New York City men's shelter clinic (1982-1988) // Chest. 1990. - V. 97. - P. 798-805.

233. Meher A.K., Bai N.C., Chary K.V., Arora A. Mycobacterium tuberculosis P137Rv ESAT-6-CFP-10 complex formation- confers thermodynamic and biochemical stability // FEBS J. 2006. - V. 273. -P. 1445-1462.

234. Milstien J.B., Gibson J.J. Quality control of EL^K vaccine by WHO: a review of factors that may influence vaccine effectiveness and safety // Bull. World Health Organ. 1990. - V. 68. - P. 93-108.

235. Minion F.C., Menon S.A., Mahairas G.G., Wannemuehler M.J. Enhanced murine antigen-specific gamma interferon and immunoglobulin G2a responses by using mycobacterial ESAT-6 sequences in DNA vaccines // Infect. Immun. 2003. - V. 71. - P. 2239-2243.

236. Mitchinson D. A. // Tubercle. 1985. - V. 66. - P. 219-225.

237. Mokrousov I., Otten T., Vyazovaya A., Limcschenko E., Filipenko M.L., Sola C., Rastogi N., Steklova L., Vyshnevskiy B., Narvskaya O.206

238. PCR-based methodology for detecting multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis Beijing family circulating in Russia // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2003. - V. 22. - P. 342-348.

239. Murray P.J., Young R.A. Stress and immunological recognition in host-pathogen interactions // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 41934196.

240. Musser J.M. Antimicrobial agent resistance in mycobacteria: molecular genetic insights // Clin. Microbiol. Rev. 1995. - V. 8. - P. 496-514.

241. Mustafa A.S. Development of new vaccines and diagnostic reagents against tuberculosis // Mol. Immunol. 2002. - V. 39. - P. 113-119.

242. Mustafa A.S., Shaban F.A. ProPred analysis and experimental evaluation of promiscuous T-cell epitopes of three major secrcted antigens of Mycobacterium tuberculosis // Tuberculosis. (Edinb. ). -2006.-V. 86.-P. 115-124.

243. Nisar M., Davics P.D. Current trends in tuberculosis mortality in England and Wales // Thorax. 1991. - V. 46. - P. 438-440.

244. O'Hagan D.T., Rahman D., McGee J.P., Jeffery H., Davies M.C., Williams P., Davis S.S., Challacombe S.J. Biodegradable microparticles as controlled release antigen delivery systems // Immunology. — 1991. — V. 73. P. 239-242.

245. O'Hagan D.T., Rappuoli R. Novel approaches to pediatric vaccine delivery//Adv. Drug Deliv. Rev. -2006. V. 58.-P. 29-51.

246. Ohara N., Yamada T. Recombinant EipK vaccines // Vaccine. -2001.-V. 19.-P. 4089-4098.

247. Orme I.M. Progress in the development of new vaccines against tuberculosis // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1997. - V. 1. - P. 95-100.

248. Parant M. Effects of TNF in bacterial infections // Ann. Inst. Pasteur Immunol. 1988.-V. 139.-P. 301-304.

249. Park T.G., Jeong J.H., Kim S.W. Current status of polymeric gene delivery systems // Adv. Drug Deliv. Rev. 2006. - V. 58. - P. 467-486.

250. Pearson F.C. Pyrogens and depyrogenation: Theory and practice // Sterile pharmaceutical manufacturing applications for the 1990. 2007. -V. 2.-P. 75-100.

251. Petroff SA, Branch A. Bacillus Calmette-Guerin (B.C.G.): Animal Experimentation and Prophylactic Immunization of Children. Am J Public Health Nations Health. 1928 (Jul.). - 18(7):843-64

252. Pym A.S., Brodin P., Majlessi L., Brosch R., Demangel C., Williams A., Griffiths K.E., Marchal G., Leclerc C., Cole S.T. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis // Nat. Med. 2003. - V. 9. - P. 533-539.

253. Raju P.A., McSloy N., Truong N.K., Kendall M.A. Assessment of epidermal cell viability by near infrared multi-photon microscopy following ballistic delivery of gold micro-particles // Vaccine. 2006. -V. 24.-P. 4644-4647.

254. Rapaport E., Levina A., Metelev V., Zamecnik P.C. Antimycobacterial activities of antisense oligodeoxynucleotide phosphorothioates in drug-resistant strains // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996.-V. 93.-P. 709-713.

255. Reed S.G., Alderson M.R., Dalemans W., Lobet Y., Skeiky Y.A. Prospects for a better vaccine against tuberculosis // Tuberculosis. (Edinb. ). 2003. - V. 83.-P. 213-219.

256. Rook G.A., Seah G., Ustianowski A. M. tuberculosis: immunology and vaccination//Eur. Respir. J. -2001. V. 17.-P. 537-557.

257. Roseeuw E., Cossens V., Balazuc A.M. et al. Synthesis degradation, and antimicrobial properties of targered macromoleculars prodrugs of noriloxin // Antimicrob Agent Chemother. 2003. - V. 47. — P. 3435-3441.

258. Sato T., Ishii T., Okahata Y. In vitro gene delivery mediated by chitosan. effect of pH, serum, and molecular mass of chitosan on the transfection efficiency // Biomaterials. 2001. - V. 22. - P. 2075-2080.

259. Sato Y., Roman M., Tighe H., Lee D., Corr M., Nguyen M.D., Silverman G.J., Lötz M., Carson D.A., Raz E. Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization // Science. 1996. - V. 273. - P. 352-354.

260. Scanga C.A., Mohan V. P., Joseph P., Yu K., Chan J., Flynn J.L.

261. Reactivation of Latent Tuberculosis: Variations on the Cornell Murine

262. Model//Inf. Immun., Sept. 1999.-V. 67. - P. 4531-4538.

263. Scheerlinck J.Y. Genetic adjuvants for DNA vaccines // Vaccine. -2001.-V. 19.-P. 2647-2656.

264. Schwendeman S.P., Costantino U.R., Gupta R.K., Tobio M., Chang A.C., Alonso M.J., Siber G.R., Langer R. Strategics for stabilising tetanustoxoid towards the development of a single-dose tetanus vaccine // Dev. Biol. Stand. 1996. - V. 87. - P. 293-306.

265. Sherman L.F., Fujiwara P.I., Cook S.V., Bazerman L.B., Frieden T.R. Patient and health care system delays in the diagnosis and treatment of tuberculosis // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - V. 3. - P. 1088-1095.

266. Sibille Y., Reynolds I-I.Y. Macrophages and polymorphonuclear neutrophils in lung defense and injury // Am. Rev. Respir. Dis. 1990.1. V. 141.-P. 471-501.

267. Sirinavin S., Chotpitayasunondh T., Suwanjutha S., Sunakorn P. and Chantarojanasiri T. Protective efficacy of neonatal Bacillus Calmette-Guerin vaccination against tuberculosis // Pediatr. Infect. Dis. J. 1991. -V. 10.-P. 359-365.

268. Sizemore D.R., Branstrom A.A., Sadoff J.C. Attenuated bacteria as a DNA delivery vehicle for DNA-mediated immunization // Vaccine. — 1997.-V. 15.-P. 804-807.

269. Smith I. Mycobacterium tuberculosis pathogenesis and molecular determinants of virulence // Clin. Microbiol. Rev. 2003. - V. 16. -P. 463-496.

270. Smith P.G. Epidemiological methods to evaluate vaccine efficacy // Br. Med. Bull. 44.: 679-690

271. Snider D.E., Jr., Cauthcn G.M., Farer L.S., Kelly G.D., Kilburn J.O., Good R.C., Dooley S.W. Drug-resistant tuberculosis // Am. Rev. Respir. Dis. 1991.-V. 4.-P. 144-732.

272. Sosna J., Shulimzon T., Roznman J., Lidgi M., Lavy A., Ben Dov I.Z., Ben Dov I. Drug-resistant pulmonary tuberculosis in Israel, a society of immigrants: 1985-1994 // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. -V. 3. -. P. 689-694.

273. Strugnell R.A., Drew D., Mercieca J., DiNatale S., Firez N., Dunstan S.J., Simmons C.P., Vadolas J. DNA vaccines for bacterial infections // Immunol. Cell Biol. 1997. - V. 75. - P. 364-369.

274. Stuart-Harris C.H. Adjuvant influenza vaccines // Bull. World • Health Organ. 1969. - V. 41. - P. 617-621.

275. Sudre P., ten Dam G., Kochi A. Tuberculosis: a global overview of the situation today // Bull. World Health Organ. 1992. - V. 70. - P. 149159.

276. Suzuki PI., Kurihara Y., Takeya M. et al. A role of macrophage scavenger receptors in atherosclerosis and susceptibility to infection // Nature. 1997. - V. 386. - P. 292-296.

277. Surikova, O. V., D. V. Voitykh, G. A. Kuz'micheva et al. Differentiation of the Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family strains from the Russian Federation by the VNTR-typing // Mol Gen Microbiol Virusol. 2005. - P.22-29.

278. Tabata Y., Ikada Y. Drug delivery systems for antitumor activation of macrophages // Crit Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1990. - V. 7. - P. 121-148.

279. Takayama K., Kilburn J.O. Inhibition of synthesis of arabinogalactan by ethambutol in Mycobacterium smegmatis // Antimicrob. Agents Chemother. 1989. - V. 33. - P. 1493-1499.

280. Tascon R.E., Colston M.J., Ragno S., Stavropoulos E., Gregory D., Lowrie D.B. Vaccination against tuberculosis by DNA injection // Nat. Med. 1996. - V. 2. - P. 888-892.

281. The European Pharmacopoeia, Pirogens. 1990. — Vol. 2.1.9.

282. The Pharmacopoeia of Japan The Pharmacopoeia of Japan. — 1990.

283. The United States Pharmacopoeia The United States Pharmacopoeia. 1990.- 1493 p.

284. Tsuchiya Ii.M., Jeanes A., Bricer H.M., William C.A. Dextran-degrading enzymes from molds // J. Bacteriol. 1952. - V. 64. - P. 513519.

285. TUBERCULOSIS. A Manual for Medical Students. WHO/ Geneva. WHO/CDS/TB/99.272. 1999.

286. Ulmer J.B. Tuberculosis DNA vaccines // Scand. J. Infect. Dis. -2001.-V. 33.-P. 246-248.

287. Walter M.R., Windsor W.T., Nagabhushan T.L., Lundell D.J., Lunn C.A., Zauodny P.J., Narula S.K. Crystal structure of a complex between interferon-gamma and its soluble high-affinity receptor // Nature. — 1995. -V. 376.-P. 230-235.

288. Warren H.S., Vogel F.R., Chedid L.A. Current status of immunological adjuvants // Annu. Rev. Immunol. 1986. - V. 4. - P. 369-388.

289. Wheelock E.F. Interferon-like virus-inhibitor induced in human leukocytes by phytohemagglutinin // Science. 1965. - V. 149. — P. 310311.

290. Wise R., Andrews J.M., Bedford K.A. LY127935, a novel oxa-beta-lactam: an in vitro comparison with other beta-lactam antibiotics // Antimicrob. Agents Chemother. 1979. - V. 16. - P. 341-345.

291. Wolff J.A., Ludtke J.J., Acsadi G., Williams P., Jani A. Long-term persistence of plasmid DNA and foreign gene expression in mouse muscle//Hum. Mol. Genet. 1992. - V.l.-P. 363-369.

292. Wustenberg P., Henneicke-von Zepelin H.H., Kohler G., Stammwitz U. Efficacy and mode of action of an immunomodulator herbal preparation containing Echinacea, wild indigo, and white cedar // Adv. Ther.- 1999. V.16. - P. 51-70.

293. Zhang M. et. ah', T cell cytokine responses in human infection with Mycobacterium tuberculosis II Infect.Immun. 1995. - V. 63. - P. 32313234.

294. Zhu X., Stauss H.J., Ivanyi J., Vordermeier U.M. Specificity of CD8+ T cells from subunit-vaccinated and infected H-2b mice recognizing the 38 kDa antigen of Mycobacterium tuberculosis // Int. Immunol. 1997. - V.9. - P. 1669-1676.

295. Zhu X., Venkataprasad N., Ivanyi J., Vordermeier H.M. Vaccination with recombinant vaccinia viruses protects mice against Mycobacterium tuberculosis infection // Immunology. 1997. - V.92. -P. 6-9.

296. Zinkernagel R.M. Immunity, immunopathology and vaccines against HIV? // Vaccine. 2002. - V.20. - P. 1913-1917.

Информация о работе

Азаев, Мамедьяр Шакир оглы
доктора биологических наук
Кольцово, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Новые подходы к разработке противотуберкулезных средств и их биологическая активность - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы