Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка комплексного подхода для выявления противотуберкулезной активности низкомолекулярных химических соединений

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка комплексного подхода для выявления противотуберкулезной активности низкомолекулярных химических соединений"

На правах рукописи

Мухина Татьяна Николаевна

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОГО ПОДХОДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ АКТИВНОСТИ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

03.02.03. - микробиология 03.01.06. — биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

13 М'0Н 2013

005061422

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки

«Государственный научный центр прикладной микробиологии и

биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Черноусова Лариса Николаевна - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Центральный научно-исследовательский институт туберкулёза» РАМН, заведующая отделом микробиологии

Игнатов Сергей Георгиевич — доктор биологических наук, Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», заведующий лабораторией нанобиотехнологии

Ведущая организация: Государственное казенное учреждение здравоохранения города Москвы «Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы»

Защита диссертации состоится «21» июня 2013 г. в 11 часов-на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская область, Серпуховской район, п. Оболенск

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ) •

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

Шемякин Игорь Георгиевич Богун Александр Геннадьевич

Автореферат разослан « > мая 2013 г.

Фурсова Надежда Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Туберкулез остается одной из самых распространенных инфекций в мире, представляя собой угрозу для населения большинства стран, включая экономически развитые. Примерно одна треть населения Земли инфицирована микобактериями туберкулеза. Как причина смерти туберкулез по-прежнему занимает одно из первых мест среди инфекционных заболеваний.

Положение усугубляется распространением туберкулеза, вызванного микобактериями с множественной лекарственной устойчивостью (т.е. устойчивыми одновременно к изониазиду и рифампицину - двум самым мощным противотуберкулезным препаратам) - МЛУ-ТБ, а также туберкулеза, вызванного микобактериями с широкой лекарственной устойчивостью (устойчивыми наряду к изониазиду и рифампицину к одному из фторхинолонов и любому из противотуберкулезных инъекционных препаратов второй линии - капреомицину, кана-мицину или амикацину) - ШЛУ-ТБ. По данным ВОЗ, только за один год (с 2008 по 2009 год) заболеваемость ШЛУ-ТБ выросла вдвое (WHO, 2010).

Во многих лабораториях, как в России, так и за рубежом огромное внимание уделяется поиску и разработке новых лекарственных препаратов, обладающих активностью против Mycobacterium tuberculosis. Для оценки их активности в условиях лаборатории используют биохимические, молекулярно-биологические и микробиологические методы. Наиболее информативными являются микробиологические методы. Их также применяют при определении минимальных подавляющих концентраций при расчете критических концентраций как «резервных» так и вновь разрабатываемых противотуберкулезных препаратов.

Как правило, при определении активности новых препаратов используют лабораторные референс-штаммы М. tuberculosis, однако они отличаются по своим свойствам от клинических, лекарственно устойчивых штаммов микобак-терий. Поэтому активность препаратов необходимо исследовать также и по отношению к клиническим штаммам М. tuberculosis.

Цель исследования

Разработать алгоритм определения противотуберкулезной активности химических соединений - потенциальных кандидатов в новые лекарственные препараты, основанный на использовании клинических штаммов М. tuberculosis, обладающих лекарственной устойчивостью.

Задачи исследования

1. Создать панель современных клинических штаммов М. tuberculosis, обладающих разной лекарственной чувствительностью и относящихся к разным генетическим семействам.

2. Определить основные параметры экспресс-микрометода для выявления противотуберкулезной активности новых химических соединений в отношении клинических штаммов М. tuberculosis, основанного на использовании флюоресцентного красителя Alamar Blue.

3. Изучить минимальные подавляющие (МПК) и минимальные бактерицидные концентрации (МБК) экспериментальных химических соединений в от-

3

ношении клинических штаммов М. tuberculosis в условиях макрообъемов, используя микробиологические пробирки.

4. Разработать алгоритм определения противотуберкулезной активности новых химических соединений с использованием клинических штаммов М. tuberculosis и оценить его эффективность при тестировании коллекций химических соединений - потенциальных лекарственных препаратов.

Научная новизна

Модифицирован экспресс-микрометод, основанный на использовании флюоресцентного красителя AlamarBlue, позволяющий выявлять противотуберкулезную активность у новых химических соединений.

Показана возможность использования модифицированного микрометода для ускоренного выявления бактериостатической или бактерицидной активности экспериментальных химических соединений, что позволяет сократить срок исследования почти в два раза.

Усовершенствованы микробиологические макрометоды определения минимальных подавляющих и минимальных бактерицидных концентраций химических соединений с использованием клинических штаммов М. tuberculosis, за счет изменения посевной концентрации, использования визуального учета при определении МПК и применения чашек со средой Middlebrook 7Н10 при определении МБК.

Теоретическая и практическая значимость работы

Модифицированные микро- и макрометоды определения противотуберкулезной активности новых химических соединений позволяют значительно снизить трудоемкость метода, сократить срок учета результатов и повысить их воспроизводимость.

Alamar В1ие-метод позволяет осуществлять скрининг большого количества химических соединений с минимальными материальными и трудовыми затратами. С помощью метода протестировали более двух тысяч экспериментальных химических соединений.

Результаты экспериментальных исследований оформлены в виде двух методических рекомендаций «Определение противотуберкулезной активности фармакологических препаратов микробиологическими методами» и «Определение критических концентраций канамицина, капреомицина и офлоксацина, используемых для оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis методом абсолютных концентраций на питательной среде Левен-штейна-Йенсена».

Методология и методы исследования

Работа основана на использовании экспериментальных методов исследования: микробиологических (культивирование микобактерий, определение лекарственной чувствительности), биохимических (биохимические тесты для идентификации М. tuberculosis), молекулярно-биологических (сполиготипиро-вание, Ю^ЬР-Ш/УО-типирование, MIRU-VNTR-типирование), а также культу-ральных (применение клеток линии НЕК 293) и биологических с использованием белых мышей.

Положения, выносимые на защиту

1. Подобранные параметры экспресс-микрометода Alamar Blue (длительность культивирования М. tuberculosis, время инкубации микобактерий с красителем, посевная концентрация клеток) позволяют выявлять противотуберкулезную активность новых химических соединений, исследуя большое количество соединений за короткий срок (3-5 суток).

2. Модифицированный Alamar В1ие-метод может быть использован в качестве экспресс-метода для выявления бактериостатической или бактерицидной активностей химических соединений, что позволяет сократить срок эксперимента почти в два раза (с 56 до 33 дней).

3. Усовершенствованные макрометоды определения минимальных подавляющих и минимальных бактерицидных концентраций экспериментальных химических соединений с использованием клинических штаммов М. tuberculosis позволяют сократить срок учета результатов, снизить трудоемкость метода и повысить воспроизводимость результатов.

4. Разработанный алгоритм определения противотуберкулезной активности новых химических соединений позволяет в короткие сроки протестировать многочисленные библиотеки химических соединений с помощью микрометода Alamar Blue и выявить основные характеристики активных соединений с помощью макрометодов, а также оценить противотуберкулезную активность химических соединений по отношению к клиническим штаммам М. tuberculosis.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты диссертационной работы представлены и доложены на семи конференциях: VII межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 3-5 октября 2006 г.); 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» (Москва, 28-30 ноября 2007 г.); Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития и научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 6-7 декабря 2007 г.); Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 21-22 апреля 2009 г.); Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010 г.); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 24-26 ноября 2010 г.); III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 31 мая-2 июня 2011 г.).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ 18 февраля 2011г. (протокол №2, приказ №46 от

25.02.2011 г.), с изменениями, утвержденными на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ от 29 января 2013 г. (протокол №2). Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ 21 февраля 2013 г. (протокол № 27).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 18 научных публикациях, в том числе в шести статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждения, заключение, выводы, список сокращений и список литературы. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 21 таблицей.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

В работе использовали 100 клинических штаммов М. tuberculosis, выделенные из мокроты больных туберкулезом легких (Москва и Московская область). Образцы мокроты получены из НИИ фтизиопульмонологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова в период с 2008 по 2009 г. Лабораторные референс-штаммы М. tuberculosis H37Ra и H37R.V предоставлены National Institutes of Health, MD, USA. Референс-штамм M. bovis BCG получен из ГИСКа им. Тарасевича.

Экспериментальные химические соединения предоставлены Центром Высоких Технологий «ХимРар» (г. Химки, Московская область). Химические соединения получали с помощью методов комбинаторной химии и имели массу не более 500 Da.

Для культивирования штаммов М. tuberculosis использовали питательные среды Левенштейна-Йенсена («ГНЦПМБ», Россия), Middlebrook 7Н9 Broth и Middlebrook 7Н10 Agar («BD, Difco», USA). Культуры хранили в лактозно-глицериновой защитной среде при температуре -70°С.

Видовую идентификацию клинических штаммов М. tuberculosis проводили в соответствии с приказом № 109 от 21 марта 2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в РФ», Методическими рекомендациями по проведению микробиологических исследований на туберкулез - М., 2001 и A Guide for the Level III Laboratory (Public Health Mycobacteriology) - Atlanta: Center for Disease Control, PHS, 1985. При культивировании микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена учитывали скорость роста культуры, а также морфологию колоний. При микроскопическом исследовании мазков, окрашенных по методу Циля-Нильсена, учитывали цвет, размер и расположение клеток.

При идентификации микобактерий с помощью биохимических методов использовали тест на способность продуцировать никотиновую кислоту (ниа-циновый тест), тест на наличие нитратредуктазы, каталазный тест и тест с натрием салициловокислым.

Лекарственную чувствительность М. tuberculosis к основным

противотуберкулезным препаратам (изониазид, рифампицин, стрептомицин и этамбутол) определяли методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена (Приказ «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в РФ», 2003). Мутации, детерминирующие устойчивость к противотуберкулезным препаратам, определяли секвенированием генов на автоматическом секвенаторе MegaBase 750 («Amersham», США).

Выделение микобактериальной ДНК осуществляли СТАВ-методом (Spo-ligotyping kit manual, Isogen Biosolutions). Концентрацию ДНК определяли с помощью спектрофотометра (GeneQuantpro RNA/DNA Calculator).

Сполиготипирование клинических штаммов осуществляли по методике Kamerbeek J. et al. (1997). Результаты учитывали визуально. Восьмеричный код определяли согласно рекомендации, приведенной в работе J. Dale et al., 1997.

RFLP-IS6//0-THnHpoBaHHe осуществляли по методу, приведенному в работе van Embden J.D.A. et al. (1993). Компьютерный анализ данных проводили методом UPGMA с помощью пакета программ GelComparll (version 2.5, для Windows 98, Бельгия). RFLP-IS6//0 паттерны обрабатывали методом кластеризации UPGMA с коэффициентом Жаккарда (погрешность 1 %). Размеры фрагментов рестрикции определяли по двадцати пяти внешним маркерам молекулярных масс с размерами от 700 п. о. до 15010 п. о.

Для MIRU-VNTR-типирования использовали метод, основанный на анализе шести локусов: ETR-A, ETR-B, ETR-C, ETR-D, ETR-E и ETR-F (Frothingham R. и Meeker-O'Connell W.A., 1998). Размер ПЦР-продуктов определяли с помощью электрофореза в агарозном геле.

Для определения противотуберкулезной активности тестируемых химических соединений использовали метод, основанный на применении красителя Alamar Blue (Chemical Diversity, Inc., USA). В лунку 96-ти луночного планшета вносили тестируемое химическое соединение, микобактериальную суспензию и краситель Alamar Blue. После инкубации в термостате в лунке измеряли интенсивность флюоресценции с помощью прибора «ФФМ-01» (возбуждение при длине волны 530 нм, регистрация при длине волны 595 нм). По интенсивности флюоресценции оценивали жизнеспособность клеток (Franzblau S.G. et al., 1998).

Для определения цитотоксического действия химических соединений использовали клетки линии НЕК 293. Клетки культивировали в жидкой питательной среде DMEM, дополненной 2 мМ L-глютамина, 10 % фетальной сыворотки («Ну Clone», США) и 100 мкг/мл гентамицина в С02-икубаторе (5 % С02) при температуре 37°С. Жизнеспособность клеток после воздействия на них химических соединений оценивали по способности митохондриального фермента сук-цинат-дегидрогеназы расщеплять тетразолиевую соль МТТ с образованием продукта формазана, окрашенного в синий цвет (Hiroko Tada et al., 1986). Оптическую плотность измеряли при длине волны 595 нм на спектрофотометре «Пикон» (Россия).

Для изучения терапевтической эффективности химических соединений использовали классическую модель генерализованного туберкулеза у мышей

BALB/c. Заражение животных осуществляли двухнедельной вирулентной культурой М. tuberculosis H37Rv, выращенной в жидкой питательной среде Middle-brook 7Н9 с добавлением глицерина и Твина 80, путем введения 0,25 мл суспензии микобактерий в дозе 5х 106 кл/мл в хвостовую вену. Лечение животных проводили внутрибрюшинно и per os дважды в день, ежедневно в течение 30 дней. Эвтаназию животных осуществляли с помощью С02. С целью определения противотуберкулезной эффективности исследуемых соединений учитывали макроскопические изменения в легких и селезенке мышей, обсеменен-ность микобактериями легких и селезенки, а также учитывали вес животных и их выживаемость.

Результаты и обсуждения

Создание панели современных клинических штаммов М. tuberculosis

Для создания панели клинических штаммов М. tuberculosis исследовали 100 изолятов М. tuberculosis, выделенных из мокроты больных туберкулезом легких (Москва и Московская область) в период с 2008 по 2009 год, полученных из НИИ фтизиопульмонологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова.

Видовую идентификацию клинических изолятов М. tuberculosis проводили с использованием культуральных и биохимических методов исследования. По окончании исследований установили, что для всех исследуемых изолятов характерен медленный рост на среде Левенштейна-Йенсена при температуре 37°С в виде R-колоний желтоватого или кремового цвета, наличие кислото-устойчивости, синтез большого количества никотиновой кислоты, наличие нитратредуктазы, наличие термолабильной каталазы, отсутствие роста на среде с салициловокислым натрием (таблица 1). По результатам тестирования изоля-ты отнесли к виду М. tuberculosis.

Таблица 1 - Культуральные и биохимические характеристики исследуемых изолятов М. tuberculosis

Культуральная характеристика Биохимические тесты идентификации

Скорость роста на среде Левенштейна-Йенсена Пигменто-образование (цвет колоний) Морфология колоний Наличие кислотоустойчивое™ Температура роста Ниациновый тест Тест на наличие нитратредуктазы Катал азный тест Тест с натрием салициловокислым

Тест на наличие каталазы Тест на термостабильность каталазы

более 3 недель цвет слоновой кости R-форма + 37°С + + + - -

Определение лекарственной устойчивости. Все исследуемые штаммы М. tuberculosis протестировали на устойчивость к стрептомицину, изониазиду, рифампицину и этамбутолу методом абсолютных концентраций. Данные по устойчивости к этим препаратам, полученные микробиологическими методами, подтверждены секвенированием соответствующих участков генов.

В результате исследования лекарственной чувствительности ста клинических штаммов определили, что 24 (24 %) штамма устойчивы ко всем четырем лекарственным препаратам, 10 (10 %) штаммов - к трем препаратам, 5 (5 %) штаммов - к двум препаратам и 16 (16 %) штаммов - к одному препарату. Остальные штаммы были чувствительными. Мутации в гене katG обнаружили у 37 (86 %) из 43 изониазид-устойчивых штаммов, мутации в гене гроВ обнаружили у 26 (96 %) из 27 рифампицин-устойчивых штаммов, в генах 16SrRNA и rpsL мутации обнаружили у 40 (78%) из 51 стрептомицин-устойчивых штаммов, мутации в гене ешЬВ обнаружили у 22 (71 %) из 31 этамбутол-устойчивых штаммов. Из ста исследуемых штаммов 27 (27 %) идентифицировали как МЛУ, что подтверждено секвенированием участков генов, ответственных за устойчивость микобактерий к изониазиду (katG) и рифампицину (гроВ).

Чтобы отобрать штаммы, относящиеся к различным филогенетическим линиям использовали следующие молекулярно-биологические методы: споли-готипирование, RFLP-IS6/ /0-типироание и VNTR-типироание. Молекулярно-биологические методы типирования микобактерий позволяют определить их принадлежность к разным филогенетическим линиям. Эта информация представляет интерес при разработке новых препаратов для лечения туберкулеза, поскольку препараты должны быть проверены на эффективность по отношению к штаммам, распространенным в разных регионах мира.

Сполиготипирование. Для первоначального анализа популяционной структуры М. tuberculosis и определения основных генетических групп (семейств), а также для исключения возможного изогенного происхождения штаммов использовали метод сполиготипирования.

При сполиготипировании штаммы распределились следующим образом (таблица 2): Beijing семейство - 57 % (п 57), LAMI - 1 % (n 1), LAM9 -4 % (п 4), Haarlem - 1 % (n 1), Haarleml - 1 % (n 1), Haarlem3 - 4% (п 4), Нааг1еш4 - 6 % (п 6), Т1 - 10 % (п 10), Т2 - 1 % (n 1), Т4 CEU1 - 1 % (n 1), Т5 RUS1 - 8 % (п 8), MANU2 - 2 % (п 2), XI - 1 % (n 1). Принадлежность трех штаммов к известным сполигосемействам не удалось установить. Всего в результате сполиготипирования выявили 22 сполиготипа. Уникальный профиль гибридизации имели 10 % (п=10) штаммов.

Таблица 2 - Сполиготипы клинических штаммов М. tuberculosis

Сполиго-семейство Сполигограмма (■ - наличие сигнала, □ - отсутствие сигнала при гибридизации) Сполигопаттерн (восьмеричный код) Количество штаммов

Beijing 000000000003771 52

000000000003371 2

□□□□□□□□□□ □□□□□□□□□□ □□□□□□□□□□ ваш 000000000003731 2

□□□□□□□□□□ □□□□□□□□□□ □□□□□□□□□□ 000000000003661 1

Haarlem ■■■■□■■■■■ ■■■■■■■■□□ □■□□□□■■■■ ■■■ 774767777420771 1

777777774020671 1

Haarlem3 777777777720771 4

Haarlem4 777737777420771 4

774777777420771 2

LAMI 771740003760771 1

LAM9 777777607760771 4

MANU2 777777777760771 2

TI 763777777760771 3

777777777760771 3

777777777760700 2

■■■■■■■■■■ ■■■■■■■■■■ ■■□□□□■■■■ ■■■ 737777777760771 1

770000777760771 1

T2 ■■■■■■■■■■ ■■■■■■■■■■ ■■□□□□■■■□ ■■■ 777777777760731 1

T4 CEU1 777777347760471 1

T5 RUS1 777760007760771 8

Unidentified ■■■■■■■■■■ ■■■■■■■■■■ ■■■ 777777770000771 2

777760000000000 1

XI 777736777760771 1

MIRU-VNTR - типирование. Для описания генетического полиморфизма клинических штаммов М. tuberculosis использовали метод MIRU-VNTR-типирования, основанный на анализе шести локусов (ETR-A, ETR-B, ETR-C, ETR-D, ETR-E и ETR-F).

В результате MIRU-VNTR-типирования клинических штаммов М. tuberculosis обнаружили 32 паттерна (таблица 3). Двадцать штаммов являются уникальными, остальные распределились следующим образом: 12 штаммов сформировали шесть кластеров, состоящих из двух штаммов, другие 12 штаммов разбились на два кластера, каждый из которых состоял из шести штаммов. Оставшиеся распределились на четыре кластера, содержащие три, семь, восемь и тридцать восемь штаммов М. tuberculosis.

RFLP-IS6770- типирование. Для эффективной межштаммовой дифференциации использовали метод RFLP-типирования. Метод RFLP-IS6Í-/0-типирования обладает более высокой разрешающей способностью, чем споли-готипирование. Штаммы, имеющие идентичные RFLP профили объединяли в кластеры.

При RFLP-IS6/70-THnHpoBaHHH штаммов М. tuberculosis обнаружили 67 вариантов паттернов. Половина штаммов 50 % (п 50) имела уникальные паттерны RFLP-IS6770, а вторая половина штаммов 50 % (п 50) распределилась на 17 кластеров. Двенадцать из которых включали по два штамма, два - состояли

из трех штаммов, один - включал шесть штаммов и два - включали по семь штаммов М. tuberculosis.

Таблица 3 - Результаты MIRU-VNTR-типирования клинических штаммов М. tuberculosis

Количество штаммов MIRU-VNTR локусы

ETR-A ETR-B ETR-C ETR-D ETR-E ETR-F

38 4 2 4 2 5 3

8 2 2 2 2 2 2

7 3 2 3 2 3 3

6 3 2 4 2 5 3

6 4 2 4 2 4 3

3 2 2 4 2 3 3

2 2 2 1 2 2 2

2 2 2 4 1 3 2

2 3 2 4 0 3 2

2 4 2 4 2 2 2

2 4 2 4 2 6 3

2 2 2 25 2 2 2

1 2 1 4 2 3 3

1 2 2 2 2 4 2

1 2 2 4 2 3 2

1 2 2 4 2 4 3

1 2 2 5 2 2 5

1 3 2 3 2 2 3

1 3 2 3 2 3 4

1 3 2 3 3 4 3

1 3 2 4 0 3 3

1 3 2 4 1 3 3

1 3 2 4 2 3 3

1 3 2 4 2 5 1,8

1 3 2 4 2 5 2

1 3 2 5 2 2 2

1 4 2 4 2 5 2

1 4 2 4 2 5 3,8

1 4 2 5 2 2 1

1 4 2 5 2 2 2

1 4 3 4 2 5 3

1 5 2 4 2 3 2

Проанализировав данные, полученные с помощью молекулярно-биологических методов, установили, что по результатам сполиготипирования клинических штаммов М. tuberculosis преобладают штаммы семейства Beijing, следующим по числу встречаемости штаммов является семейство Т1, затем следуют семейства T5 RUS1 и Haarlem4. Наибольшее число кластеризованных штаммов М. tuberculosis по данным RFLP-IS67/0 и MIRU-VNTR-типирования выявили среди семейства Beijing.

С использованием микробиологических и молекулярно-биологических методов исследования из ста клинических штаммов М. tuberculosis для создания рабочей панели отобрали 15 штаммов (таблица 4), обладающих разной лекарственной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам (стрептомицину, изониазиду, рифампицину и этамбутолу), а также различающихся по мо-лекулярно-биологическим характеристикам.

Таблица 4 - Панель клинических штаммов М. tuberculosis, отобранная для дальнейшей работы

Штамм Лекарственная устойчивость Сполиготипирование MIRU-VNTR-типирование RFLP-IS6Z /0-типирование

Стр Изо Риф Этам Сполигопатгерн (восьмеричный код) Сполиго-семей-ство ETR-A ETR-B ETR-C ETR-D ETR-E ETR-F RFLP-профиль

1907 S S S S 000000000003661 Beijing 4 2 4 2 5 3 iter,

5772 R R R R 000000000003771 Beijing 4 2 4 2 5 3 1 t fifi

3665 R S S S 000000000003771 Beijing 3 2 4 2 5 3 ННи».* II 1 1 t l ü I * ttltlllV.I 3"s

914 R R S S 000000000003371 Beijing 4 2 4 2 5 3 i í jrt

6015 R R R R 000000000003731 Beijing 4 2 4 2 5 3 t ! I I J Q m

1869 R S S S 777737777420771 Haarlem4 5 2 4 2 3 2 IIBC I I ш,

2174 S R S S 774777777420771 Haarlem4 4 2 5 2 2 2 I 1! im

3418 R R S R 777737777420771 Haarlem4 4 2 4 2 2 2 t | 11' Í411

1520 S S S S 771740003760771 LAM1 2 2 1 2 2 2 ti 1 1 fl 1 III

5876 R S S S 777777777760700- T1 2 2 4 1 3 2 С 1 В я«

3297 S S S S 777777347760471 T4CEU1 3 2 3 2 3 4 ! 'КПП 1 I зд«

6030 R S S S 777760007760771 T5 RUS1 2 2 2 2 2 2 ;i IИ Í"¡O

1994 R R S R 777760007760771 T5 RUS1 2 2 1 2 2 2 I тч

4040 S R S S 777760007760771 T5 RUS1 2 2 25 2 2 2 WW

Примечания: Стр - стрептомицин, Изо - изониазид, Риф - рифампицин, Этам - этамбутол

Определение основных параметров Alamar В1ие-метода

В результате проведенных экспериментов определили параметры экспресс-микрометода для выявления противотуберкулезной активности экспериментальных химических соединений, используя краситель Alamar Blue. Оптимальным сроком культивирования клеток М. tuberculosis двух референс-штаммов H37Ra и H37Rv является 24 часа. Необходимое время инкубации ми-кобактериальных клеток с красителем Alamar Blue равно 17 часам для обоих штаммов H37Ra и H37Rv. Оптимальной посевной концентрацией М. tuberculosis, вносимой в лунки планшета, является концентрация 103 кл/мл как для штамма H37Ra, так и для штамма H37Rv. Выявлено, что ДМСО в концентрации 0,165 % (конечная концентрация в лунке планшета) не оказывает токсического действия на микобактериальные клетки.

Таким образом, подобранные условия проведения Alamar В1ие-метода позволяют в короткие сроки проводить скрининг большого числа химических соединений на обнаружение у них противотуберкулезной активности.

Использование Alamar В1ие-метода для быстрого скрининга новых химических соединений

Оценка противотуберкулезной активности новых химических соединений в отношении референс-штамма М. tuberculosis H37Rv. Для тестирования новых химических соединений с целью обнаружения у них противотуберкулезной активности использовали референс-штамм М. tuberculosis H37Rv. Рабочие растворы химических соединений получали методом разведения исходных растворов химических соединений (4 мг химического соединения в 500 мкл ДМСО) жидкой питательной средой Middlebrook 7Н9 до концентрации 66 мкМ. Каждое соединение тестировали па одном планшете в трех повторах (рисунок 1). На планшете ставили контроли питательной среды, микобактери-альной культуры и ДМСО. В качестве контрольного противотуберкулезного препарата использовали рифампицин в концентрации 40 мкг/мл.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А Н,0 н,о Н,0 Н,0 Н,0 Н20 Н,0 Н,0 Н20 Н,0 Н,0 Н20

В Н20 х.с.1 х.с.2 х.с.З х.с.4 х.с.5 х.с.6 х.с.7 х.с.8 культ. ДМСО Н20

С Н20 х.с.1 х.с.2 х.с.З х.с.4 х.с.5 X.C.6 х.с.7 х.с.8 культ. ДМСО Н20

D н2о х.с.1 х.с.2 х.с.З х.с.4 х.с.5 х.с.6 х.с.7 х.с.8 культ. ДМСО Н20

Е н2о х.с.9 х.с.Ю х.с.11 х.с.12 х.с.13 X.C. 14 х.с.15 X.C.16 Риф среда Н20

F н,о х.с.9 х.с.10 х.с.11 х.с.12 х.с.13 х.с.14 х.с.15 х.с.16 Риф среда Н20

G Н20 Х.С.9 х.с.Ю х.с.11 х.с.12 х.с.13 х.с.14 х.с.15 х.с.16 Риф среда н2о

Н Н20 н2о Н20 Н20 Н20 Н,0 н2о н2о Н20 Н,0 Н,0 Н20

Рисунок 1 - Схема эксперимента по определению противотуберкулезной активности новых химических соединений Обозначения: х.с.1 - химическое соединение с порядковым номером 1; культ. - суспензированная культура клеток М. tuberculosis штамм H37Rv; ДМСО - раствор диметилсульфокси-да; Риф - раствор рифампицина; среда - жидкая питательная среда Middlebrook 7Н9.

По окончании времени инкубации микобактерий с химическими соединениями измеряли интенсивность флюоресценции. После измерения вычисляли процент активности химического соединения по формуле:

А = [(FI культуры - FI химического соединения)^! культуры] х 100, (1)

где FI - флюоресценция, выраженная в относительных единицах измерения, А - активность химического соединения

Результаты двенадцати активных химических соединений представлены в таблице 5. Два соединения (820-0655, 820-0658) проявили наибольшую активность по отношению к штамму М. tuberculosis H37Rv.

Таблица 5 - Противотуберкулезная активность химических соединений

Номер химических соединений Относительные единицы флюоресценции Антибактериальная активность химического соединения(%) Антибактериальная активность рифампицина(%)

820-0655 12180 ±1564 85 76

820-0658 20666 ±2559 74 76

820-0851 23940±1921 67 76

820-0807 24145 ± 942 62 70

820-0653 31631±1673 60 76

820-0883 32213 ±3095 59 75

820-0664 35647 ±3481 59 78

820-0731 30535±1176 56 76

820-0670 39174 ±3738 55 78

820-0652 36288±1035 55 76

820-0685 39564 ±4533 53 77

820-0739 33473 ±4179 52 76

В процессе скрининга новых химических соединений отбирались соединения, обладающие наибольшей противотуберкулезной активностью, для дальнейшего их тестирования в отношении моно- и мультирезистентных клинических штаммов М. tuberculosis, для выявления их бактерицидного или бактерио-статического действия, а также для оценки интенсивности противотуберкулезной активности.

Оценка бактерицидного и бактериостатического действия новых химических соединений. В процессе тестирования новых химических соединений с помощью Alamar В1ие-метода, для соединений, проявивших активность по отношению к микобактериям, можно определить их бактериостатическую или бактерицидную активность. Данный метод использовали как предварительный экспресс-метод, в результате которого были получены дополнительные данные о свойствах тестируемых химических соединений, обладают ли они

бактерицидным или бактериостатическим действиями. Это позволило сократить срок исследования почти в два раза (с 56 до 33 дней) по сравнению с классическими методами.

Оценка интенсивности противотуберкулезной активности новых химических соединений. Оценку интенсивности противотуберкулезной активности тестируемых соединений осуществляли методом серийных разведений в микропланшетах. Данные интенсивности противотуберкулезной активности двух наиболее активных химических соединений в сравнении с рифампицином представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Противотуберкулезная активность двух наиболее активных химических соединений в разведениях

Номер химических соединений Разведение Относительные единицы флюоресценции Антибактериальная активность химического соединения(%) Антибактериальная активность рифампицина(%)

820-0655 1 24776±11854 66 66

1/2 21436 ± 7079 71 65

1/4 25912 ±3566 65 65

1/8 43490 ± 423 41 63

1/16 59412±13923 19 63

1/32 61688 ±4557 16 64

1/64 68665 ± 5645 7 63

1/128 64440±16613 13 58

1/256 68652 ±7379 7 62

820-0658 1 19355 ±3161 74 66

1/2 28932 ± 2843 61 65

1/4 36722 ± 7982 50 65

1/8 48325 ± 7608 34 63

1/16 63384 ±11066 14 63

1/32 70609 ± 3591 4 64

1/64 74558±12031 -1 63

1/128 81229 ±5 -10 58

1/256 78641±1283 -7 62

Химическое соединение 820-0655 проявляло свою противотуберкулезную активность при разведении в четыре раза, тогда как активность химического соединения 820-0658 снижалась после разведения 1/2.

Данный эксперимент позволяет оценить уровень противотуберкулезной активности тестируемых соединений. Эксперимент использовали как предварительный экспресс-метод, в результате которого получали дополнительные характеристики тестируемых химических соединений.

Оценка противотуберкулезной активности химических соединений в отношении моно- и мультирезистентных клинических штаммов М. tuberculosis. Определив активность новых химических соединений по отношению к референс-штамму H37Rv, мы приступили к анализу активности соединений в отношении клинических штаммов М. tuberculosis. Для этих целей была создана панель из 15 клинических штаммов, имеющих различный спектр устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам, а также относящихся к разным генетическим группам (таблица 4).

Было протестировано двенадцать химических соединений, проявивших активность в предыдущих опытах. На рисунке 2 приведены диаграммы, где в качестве примеров представлена активность химических соединений в отношении четырех лекарственно устойчивых штаммов М. tuberculosis.

I 50000

f 45000 5

1 40000

2 35000 X 30000 | 25000

5 20000

¿ 15000

£ 10000

S 5000

I 0

? £ & £ ¿ .

¡Г & f é

j „ч) м

V V V V V <Ь Химические соединения

¡ 45000 | 40000 S 35000

1 30000 | 25000 | 20000

2 15000

g юооо I 5000

f f f f

Химические соединения

ff

Монорезистентный изониазид-устойчивый штамм М. tuberculosis 1284

МЛУ-штамм М. tuberculosis (устойчивый к стрептомицину, изониазиду, рифампицину и этамбутолу) 5772

s 50000 | 45000 S 40000 8 35000 30000 | 25000 J 20000 | 15000 5 10000 § 5000

f / / / / / / / / / / / / / / / / / / у

Химические соединения

¡ 40000

3

| 35000

I

| 30000

4 25000

1 20000

2 15000

I 10000

s 5000

/ / / f f 4 / # / é # Химические соединения

Мультирезистентный (устойчивый к стрепто- Монорезистентный стрептомицин-устойчи-мицину, изониазиду и этамбутолу) штамм вый штамм М. tuberculosis 6030 М. tuberculosis 3418

Рисунок 2 — Активность химических соединений в отношении лекарственно устойчивых штаммов М. tuberculosis (1284, 5772, 3418, 6030)

Два химических соединения (820-0655 и 820-0658) проявили наибольшую противотуберкулезную активность по сравнению с другими соединениями, однако их активность оказалась ниже по сравнению с активностью контрольных препаратов - рифампицина и канамицина.

Несмотря на то, что соединение 820-0655 и соединение 820-0658 обладали высокой активностью в отношении референс-штамма Н37Яу, их активность в отношении клинических штаммов оказалась значительно ниже (рисунок 3).

■ штамм 1284

■ штамм 6030

820-0655

■ штамм 5772 «штамм 3418

■ штамм H37Rv

¿1% 18% 19% 18% ни

820-0658

■ штамм1284 Шштамм5772 ' штамм3418

■ штамм (5030 ■ штамм H37RV

Рисунок 3 - Активности двух химических соединений (820-0655 и 820-0658) по отношению к клиническим штаммам М. tuberculosis и штамму H37R.V

Это подтверждает, что тестирование химических соединений нужно проводить, используя не только референс-штаммы, но и клинические лекарственно устойчивые штаммы М. tuberculosis.

Оценка токсичности новых химических соединений для эукариотических клеток

Протестировав новые химические соединения на наличие противотуберкулезной активности и отобрав наиболее активные соединения, провели эксперименты по определению у них цитотоксического действия. Для этого использовали эукариотические клетки линии НЕК 293. Жизнеспособность клеток после воздействия на них химических соединений оценивали в стандартном МТТ тесте согласно методике Хироко Тада.

В предварительных опытах оценивали токсичность ДМСО для эукариотических клеток. Экспериментально установили, что ДМСО, в концентрации, применяемой для растворения химических соединений, не оказывает токсического действия на клетки НЕК 293.

Цитотоксическое действие химических соединений исследовали также при различных концентрациях химических соединений с целью определения

концентрации, наименее токсичной для клеток НЕК 293. Результаты исследования двух наиболее активных химических соединений представлены на рисунке 4.

Рисунок 4 - Выживаемость клеток линии НЕК 293 в зависимости от концентрации химических соединений

Химическое соединение 820-0658 не снижает жизнеспособность клеток линии НЕК 293 в концентрации 8,3 мкМ и ниже, а соединение 820-0655 - в концентрации 4,1 мкМ и ниже.

Проведенные эксперименты с использованием эукариотических клеток позволили выявить наличие или отсутствие цитотоксического эффекта в тестируемых химических соединениях, а также определить концентрации соединений, наименее токсичные для клеток НЕК 293.

Тестирование новых химических соединений с помощью микробиологических методов (макрометод)

Оценку противотуберкулезной активности новых химических соединений в условиях макрообъемов (пробирочный вариант) осуществляли, используя микробиологические методы определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) и минимальной бактерицидной концентрации (МБК). В работе использовали референс-штамм М. tuberculosis H37Rv, а также клинические штаммы, отобранные в результате вышеописанных микробиологических и мо-лекулярно-биологических методов (таблица 4).

Результаты определения МПК и МБК для двух активных химических соединений представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Показатели МПК и МБК двух активных химических соединений

Штамм Химическое соединение

820-0655 820-0658

МПК (мкг/мл) МБК (мкг/мл) МПК (мкг/мл) МБК (мкг/мл)

М. tuberculosis 1907 100 >100 100 >100

М. tuberculosis 5772 50 100 50 100

М. tuberculosis 1284 100 100 50 100

М. tuberculosis 3665 100 >100 100 >100

М. tuberculosis 914 100 >100 100 >100

М. tuberculosis 6015 100 >100 100 >100

М. tuberculosis 1869 100 >100 100 >100

М. tuberculosis 2174 100 >100 100 >100

М. tuberculosis 3418 100 >100 100 100

М. tuberculosis 1520 100 >100 100 >100

М. tuberculosis 5876 100 >100 100 >100

М. tuberculosis 3297 ¡00 >100 100 >100

М. tuberculosis 6030 100 >100 100 >100

М. tuberculosis 1994 100 >100 100 >100

М. tuberculosis 4040 100 >100 100 >100

М. tuberculosis H37Rv 25 25 25 25

В результате определения МПК и МБК тестируемых химических соединений выявили, что соединение 820-0655 проявляет активность к двум клиническим штаммам М. tuberculosis (5772, 1284), а соединение 820-0658 - к трём штаммам (5772, 1284, 3418). Однако их активность в четыре раза слабее активности по отношению к референс-штамму H37Rv.

В результате данного исследования модифицировали метод определения МПК и МБК тестируемых соединений, в котором МПК определяли с помощью визуального учета, МБК определяли методом высева микобактерий на плотные питательные среды Middlebrook 7Н10 с последующим учетом выросших колоний, а также для посева использовали культуру М. tuberculosis в концентрации 5x10s кл/мл. Использование модифицированного нами метода снижало его трудоемкость, сокращало срок учета результатов и повышало их воспроизводимость.

Определение терапевтической эффективности новых химических соединений

Для изучения противотуберкулезной терапевтической эффективности химических соединений использовали классическую модель гематогенно-диссеминированного туберкулеза у мышей BALB/c. Тестировали одно химическое соединение 820-0658, проявившее активность по результатам ранее проводимых экспериментов. В качестве контрольного препарата использовали рифампицин в лечебной дозе 25 мг на кг веса животного. Эксперимент включал три экспериментальные и три контрольные группы. В каждой группе со-

держалось по 10 мышей. Заражение животных осуществляли двухнедельной вирулентной культурой М. tuberculosis H37Rv путем введения 0,25 мл суспензии в дозе 5х106 кл/мл в хвостовую вену. Введение препаратов животным опытных групп начинали на следующий день после заражения. Эвтаназию животных осуществляли с помощью С02. Для выявления терапевтической эффективности исследуемого соединения учитывали макроскопические изменения в легких и селезенке, высеваемость микобактерий туберкулеза из легких и селезенки, а также учитывали выживаемость и вес животных. Результаты представлены в таблице 8 и на рисунке 5.

Таблица 8 - Влияние химического соединения 820-0658 на выживаемость мышей, зараженных вирулентной культурой М. tuberculosis H37Rv

Характеристика 820-0658 (30 мг/кг) в/б 820-0658 (30 мг/кг) per os 820-0658 (90 мг/кг) per os Рифампицин (25 мг/кг) в/б Контроль (заражение без лечения) Контроль (без заражения и без лечения)

Выжившие мыши/общее количество мышей 2/10 4/10 3/10 10/10 0/10 10/10

Средний срок жизни мышей (сутки) 24,4 26,1 25,1 30,0* 22,:3 30,0

Примечание: * - на 31 сутки выжившие животные были эвтаназированы, в/б - введение препарата внутрибрюшинно, per os - введение препарата перорально.

22

О 5 10 15 20 25 30

Врем, сутки

—•— 820-0658(30мг/кг) в/б -«-820-0658(30мг/кг) peros

—820-0658 (90 мг/кг) peros -Рифампицин (25 мг/кг)

Контроль (заражение без лечения) —♦—Контроль (без заражения и без лечения)

Рисунок 5 - Изменение веса мышей в процессе эксперимента

В течение первой недели эксперимента группы животных, получавших химическое соединение 820-0658 (30 мг/кг, в/б и peros) вели себя активнее группы, леченной рифампицин. В течение второй недели у животных всех трех групп, получавших соединение 820-0658, появлялся озноб, шерсть становилась взъерошенной, начинала заостряться грудная клетка. У животных, леченых ри-фампицином, эти симптомы отсутствовали. У животных, получавших химическое соединение 820-0658 (90 мг/кг, per os), при вскрытии обнаружены изменения окраски печени. Она становилась белесоватой.

В результате проведенных экспериментов выявили противотуберкулезный эффект у тестируемого соединения 820-0658 в опыте на модели генерализованного туберкулеза у мышей линии BALB/c. Протективный эффект выражен в большей степени при введении тестируемого соединения инфицированным мышам per os.

Таким образом, в результате проведенной работы разработали алгоритм по выявлению противотуберкулезной активности низкомолекулярных химических соединений в отношении как к референс-штамму H37R.V, так и к резистентным клиническим штаммам М. tuberculosis'.

1. Тестирование с помощью экспресс-микрометода (Alamar В1ие-метод) новых химических соединений для обнаружения у них противотуберкулезной активности в отношении М. tuberculosis штамма H37Rv;

2. Определение бактерицидного или бактериостатического действия химических соединений по отношению к референс-штамму М. tuberculosis H37Rv в микропланшетах;

3. Оценка интенсивности противотуберкулезной активности химических соединений, обладающих достаточной активностью по отношению к штамму H37Rv методом сравнения показателей минимальных подавляющих концентраций (МПК), в условиях микропланшет;

4. Определение противотуберкулезной активности химических соединений с использованием моно- и мультирезистентных клинических штаммов М. tuberculosis, в условиях микропланшет;

5. Определение цитотоксического действия химических соединений на линии клеток НЕК 293;

6. Определение МПК и МБК химических соединений, обладающих достаточной противотуберкулезной активностью, с помощью макрометода, используя клинические штаммы М. tuberculosis',

7. Изучение терапевтической эффективности химических соединений на классической модели туберкулеза у мышей.

Заключение

В результате исследования найдено два химических соединения, которые проявили высокую активность в отношении референс-штамма H37Rv, а также обладали наименьшей токсичностью для эукариотических клеток. В опыте на модели туберкулеза у мышей исследуемое химическое соединение 820-0658 наряду с противотуберкулезным эффектом вызывало токсическое поражение

внутренних органов лабораторных животных. Наибольшее токсическое воздействие соединение оказывало на печень мышей. Подобные отрицательные явления можно уменьшить, применяя гепатопротекторы. Однако это было бы оправдано в случае высокой активности соединения по отношению к лекарственно устойчивым штаммам. Так как химическое соединение 820-0658 оказывает слабый эффект на клинические штаммы М. tuberculosis, потенциал исследуемого соединения как лекарственного препарата оказывается очень низким.

ВЫВОДЫ

1. Создана панель из пятнадцати клинических штаммов М. tuberculosis, обладающих разной лекарственной устойчивостью к основным противотуберкулезным препаратам (стрептомицину, изониазиду, рифампицину и этамбуто-лу) и относящихся к разным генетическим семействам.

2. Определены значения основных параметров Alamar В 1ие-метода для выявления противотуберкулезной активности химических соединений. В условиях микропланшет длительность культивирования клеток М. tuberculosis ре-ференс-штаммов составляет 24 часа, клинических штаммов - 48 часов. Время инкубации микобактериальных клеток с красителем Alamar Blue составляет 17 часов как для референс-штаммов, так и для клинических штаммов. Оптимальной посевной концентрацией референс-штаммов является концентрация 105 кл/мл, клинических штаммов - 106 кл/мл.

3. Показана возможность использования модифицированного Alamar В1ие-метода в качестве ускоренного метода для выявления бактериоста-тической или бактерицидной активности химических соединений, что позволяет сократить срок исследования почти в два раза (с 56 до 33 дней).

4. Усовершенствованы микробиологические макрометоды определения минимальных подавляющих и минимальных бактерицидных концентраций химических соединений с использованием клинических штаммов М. tuberculosis. Посевная концентрация микобактериальных клеток 5х105 кл/мл, визуальный учет результатов при определении МПК и использование чашек с плотной питательной средой Middlebrook 7Н10 при определении МБК позволяют сократить срок учета результатов, повысить их воспроизводимость и снизить трудоемкость методов.

5. Разработан алгоритм определения противотуберкулезной активности химических соединений - кандидатов в новые лекарственные препараты, включающий микро- и макрометоды, определение токсичности химических соеди-

нений для эукариотических клеток (клетки НЕК 293), а также выявление терапевтической эффективности соединений с использованием биологической модели туберкулеза (мыши BALB/c).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

а) статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК

1. Степаншина, В.Н. Разработка комплексного подхода для выявления противотуберкулезной активности низкомолекулярных химических соединений / Степаншина

B.Н., Т.Н. Мухнна, С.А. Блашдатских, Р.И. Миронова, И.Г. Шемякин, Е.В. Белова // Туберкулез и болезни легких. - 2009. -№ 8. - С. 41-45.

2. Степаншина, В.Н. Определение критической концентрации канамицина для Mycobacterium tuberculosis в системе MGIT ВАСТЕС 960 / В.Н. Степаншина, С.А. Попов, Н.А. Апарина, Р.И. Миронова, Т.Н. Мухина, А.В. Низова, Н.В. Майская, О.Г. Николаева, А.Г. Богун, С.А. Благодатских, И.Г. Шемякин, Д.П. Цегельски // Туберкулез и болезни легких. - 2009. - № 12. - С. 71-78.

3. Лиманская, О.Ю. Детекция изолятов дикого типа и точечных мутаций в геноме устойчивых к изониазиду микобактерий туберкулеза / О.Ю. Лиманская, Т.Н. Мухнна, В.Н. Степаншина, И.Г. Шемякин, X. Wu, J. Zhang, Т.В. Фесенко, В.А. Покровский, А.П. Лиманский // Молекулярная биология. - 2010. - Том 44. - № 4. - С. 635645.

4. Лиманская, О.Ю. Детекция изолятов дикого типа и устойчивых к изониазиду микобактерий туберкулеза / О.Ю. Лиманская, Т.Н. Мухина, В.Н. Степаншина, И.Г. Шемякин, В.В. Минухин, А.П. Лиманский // Туберкулез и болезни легких. -

2010.-№9. -С. 45-50.

5. Limanskaya, O.Yu. Characterization of oligonucleotides with LNA-monomers for PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genome / O.Yu. Limanskaya, T.N. Fesenko, V.A. Pokrovskiy, T.N. Mukhina, V.N. Stepanshina, I.G. Shemyakin,

A.P. Limanskii // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. -

2011.-Vol. 5.-No. 2.-P. 144-151.

6. Степаншина, В.Н. Устойчивость к канамицину распространенных генетических семейств М. tuberculosis / В.Н. Степаншина, С.А. Попов, А.В. Низова, Н.А. Апарина, Р.И. Миронова, Т.Н. Мухина, Н.В. Майская, О.Г. Николаева, А.Г. Богун,

C.А. Благодатских, И.Г. Шемякин // Туберкулез и болезни легких. - 2011. - № 5. -С. 174-175.

б) методические рекомендации

7. Определение критических концентраций противотуберкулезных препаратов второго ряда (канамицин, офлоксацин, капреомицин), используемых для оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis', методические рекомендации / Степаншина В.Н., Низова А.В., Мухина Т.Н., Миронова Р.И., Николаева О.Г., Шемякин И.Г. - Оболенск: ФБУН ГНЦ ПМБ, 2010. - 14 с.

8. Определение противотуберкулезной активности фармакологических препаратов микробиологическими методами: методические рекомендации / Мухина Т.Н., Степаншина В.Н., Миронова Р.И., Шемякин И.Г. - Оболенск: ФБУН ГНЦ ПМБ, 2011. -14 с.

в) тезисы научных конференций

9. Мухина, Т.Н. Использование флюориметра «ФФМ-01» для оценки антибактериальной активности новых химических соединений / Т.Н. Мухина,

B.Н. Степаншина, Р.И. Миронова, С.А. Благодатских, И.Г. Шемякин // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий

государств-участников Содружества Независимых Государств: материалы VII межгосударственной научно-практической конференции. - Оболенск, 2006. - С. 224.

10. Низова, А.В. Анализ результатов определения чувствительности к рифампи-цину клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis микробиологическими и мо-лекулярно-биологическими методами / А.В. Низова, В.Н. Степаншина, А.А. Майорова, Н.В. Майская, С.А. Благодатских, Т.Н. Мухина, И.Г. Шемякин // Молекулярная диагностика - 2007: сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Москва, 2007. - Т. 3. — С. 39-40.

11. Степаншина, В.Н. Разработка комплексного подхода для выявления противотуберкулезной активности низкомолекулярных химических соединений / В.Н. Степаншина, Т.Н. Мухина, С.А. Благодатских, Р.И. Миронова, И.Г. Шемякин, Е.В. Белова // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития и научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы: сборник тезисов. - Москва, 2007.-С. 60-61.

12. Мухина, Т.Н. Разработка методики быстрого скрининга новых химических соединений для выявления их противотуберкулезной активности / Т.Н. Мухина,

B.Н. Степаншина, Р.И. Миронова, С.А. Благодатских, Е.В. Белова, И.Г. Шемякин // Биологическая безопасность в современном мире: материалы научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - Оболенск, 2009. -

C. 242-244.

13. Мухина, Т.Н. Характеристика лекарственной устойчивости штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от впервые выявленных больных туберкулезом легких / Т.Н. Мухина, В.Н. Степаншина, Р.И. Миронова, А.В. Низова, И.Г. Шемякин // Биологическая безопасность в современном мире: материалы научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - Оболенск, 2009. - С. 244-245.

14. Низова, А.В. Определение устойчивости клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам первого и второго ряда / А.В. Низова, В.Н. Степаншина, Н.В. Майская, Р.И. Миронова, Т.Н. Мухина, И.Г. Шемякин // Биологическая безопасность в современном мире: материалы научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - Оболенск, 2009.-С. 246-248.

15. Мухина, Т.Н. Определение противотуберкулезной активности фармакологических препаратов микробиологическими методами / Т.Н. Мухина, В.Н. Степаншина, Р.И. Миронова, И.Г. Шемякин // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: материалы научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. — Оболенск, 2010. — С. 247-249.

16. Богун, А.Г. Использование молекулярно-генетических методов для комплексного анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis / А.Г. Богун, Т.Н. Мухина, В.Н. Степаншина, И.Г. Шемякин // Молекулярная диагностика-2010: сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. -Москва, 2010. - Т. 1. - С. 106-109.

17. Низова, A.B. Алгоритм исследования критических концентраций противотуберкулезных препаратов / A.B. Низова, В.Н. Степаншина, Р.И. Миронова, Т.Н. Мухина, Н.В. Майская, И.Г. Шемякин // Молекулярная диагностика-2010: сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием - Москва, 2010. — Т. 1. - С. 162-164.

18. Мухина, Т.Н. Молекулярно-биологическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от впервые выявленных больных туберкулезом легких / Т.Н. Мухина, В.Н. Степаншина, А.Г. Богун, С.А. Благодатских, И.Г. Шемякин // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: материалы III научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - Оболенск, 2011. - С. 109-111.

Список сокращений

в/б - внутрибрюшинно

ДМСО - диметилсульфоксид

МБК - минимальная бактерицидная концентрация

МЛУ-ТБ - туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью

МПК - минимальная ингибирующая концентрация

п. о. - пара оснований

ШЛУ-ТБ - туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью

16SrRNA - ген, кодирующий lóS-компонент рибосомальной РНК

BALB/c - популяция лабораторных мышей-альбиносов

СТАВ (cetyltrimethylammonium bromide) - цетилтриметиламмоний бромид

DMEM (Dulbecco modified Eagle's medium) - модифицированная по способу

Дульбекко среда Игла

embB - ген, кодирующий фермент арабинозилтрансферазу ETR - exact tandem repeat

НЕК293 (human embryonic kidney) - эпителиальные клетки почки эмбриона человека

katG - ген каталазы-пероксидазы

MIRU (mycobacterial interspersed repetitive units) - рассеянные микобактериаль-ные повторяющиеся участки

МТТ (dimethyl thiazolyl diphenyl tetrazolium salt) - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид per os - перорально (через рот)

RFLP-IS677Ö (restriction fragment length polymorphism) - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) с использованием инсерционной последовательности 6110

гроВ - бета-субъединица РНК-полимеразы rpsL - ген, кодирующий рибосомальный белок S12

VNTR (variable number tandem repeats) - вариабельные тандемные повторы

Благодарности

Приношу искреннюю благодарность своим научным руководителям д.б.н., профессору Шемякину И.Г. и к.б.н. Богуну А.Г. за руководство и ценные консультации при выполнении данной работы, а также её материально-техническое обеспечение.

Выражаю искреннюю благодарность к.б.н. Степаншиной В.Н. за консультации по проведению исследований и рекомендации по интерпретации полученных данных.

Особую благодарность выражаю н.с. Мироновой Р.И. за неоценимую помощь при проведении микробиологических исследований.

Благодарю всех сотрудников лаборатории молекулярной биологии, в особенности: м.н.с. Благодатских С.А., к.б.н. Белову Е.В., н.с. Майскую Н.В., к.б.н. Кисличкину A.A. и лаборанта-исследователя Кириллину Н.Ф. за помощь при проведении экспериментов на разных этапах исследования.

Подписано в печать: 16.05.2013

Заказ № 8488 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru