Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Получение специфического иммуномодулятора на основе антигенов микобактерий и его свойства

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Получение специфического иммуномодулятора на основе антигенов микобактерий и его свойства"

На правах рукописи

Шулико Елена Михайловна

ПОЛУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНОМОДУЛЯТОРА НА ОСНОВЕ АНТИГЕНОВ МИКОБАКТЕРИЙ И ЕГО СВОЙСТВА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

2 ИЮ9 2011

Омск 2011

4848895

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте бруцеллеза и туберкулеза животных Россельхозакадемии

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Власенко Василий Сергеевич

Официальные е::;:с::г::ти: доктор ветеринарных наук, профессор

Плешакова Валентина Ивановна

доктор ветеринарных наук, профессор Чекишев Валерий Михайлович

Ведущая организация:

ФГОУ ВПО «Алтайский государственный аграрный университет»

Защита состоится «¿^ »

¿¿¿асЛ 2011 года, в Я часов, на заседании диссертационного совета Д 220.050.03 при ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет» в институте ветеринарной медицины по адресу: 644122, Омск-122, ул. Октябрьская, 92, тел. (3812) 24-15-35, факс (3812) 24-39-63

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО ОмГАУ.

Электронный вариант автореферата и текст объявления о защите диссертации размещены на официальном сайте организации www.omgau.ru

Автореферат разослан « 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринар наук, доцент

Н.А. Лещёва

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Туберкулез крупного рогатого скота во многих странах мира и Российской Федерации остается одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии, наносит значительный экономический ущерб неблагополучным хозяйствам, владельцам животных и представляет большую опасность в заражении людей. Против туберкулеза нет достаточно эффективных средств специфической профилактики и лечения.

Применение вакцины БЦЖ в общем комплексе противотуберкулезных мероприятий позволяет сократить сроки оздоровления ферм с меньшими материальными затратами, однако при этом создаются определенные трудности в оценке постинфекционных и поствакцинальных туберкулиновых реакций на взрослом скоте, что сдерживает оздоровление неблагополучных пунктов ограничивает возможность создания у животных перманентного противотуберкулезного иммунитета. Проблема оздоровления ферм от туберкулеза крупного рогатого скота остается сложной (A.C. Донченко, 1995; М.А. Сафин, 2001; Н.М. Колычев с соавт., 2007, 2010; H.A. Донченко, 2008; А. X. Найманов, 2009; Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, Н.Г. Толстенко с соавт., 2009).

Одно из направлений, которое многие эксперта определяют как наиболее перспективный путь к победе над туберкулезом - это создание эффективных средств специфической профилактики и лечения. Развитие средств иммунологической защиты людей и животных идет по нескольким направлениям: продолжаются поиски в области традиционного вакцинного дела; создание ии^с-ственных вакцинных макромолекул, не имеющих аналогов в природе; регуляция иммунологической реактивности с помощью неспецифической стимуляции; другие работы посвящены созданию препаратов иммуностимулирующей, иммуномодулирующей активности и адьювантных свойств синтетических и естественных средств (Р.В Петров, P.M. Хаитов, В.М. Манько, A.A. Михайлов, 1981; В.А. Кабанов, Р.В. Петров, P.M. Хаитов, 1982; К. Masini, W. Brehmer, W. Zange et al., 1985 P.IO. Романова, 1992; P.B. Петров, P.M. Хаитов, В.И. Литвинов с соавт., 2000; М.А. Бажин, В.В. Шамов, В.Г. Ощепков с соавт., 2003; П.Н. Сисягин с соавт., 2007; Ф.П. Петрянкин, 2009).

Известно, что иммунная система является первой мишенью при воздействии на организм вредных факторов физического, химического, биологического генеза. В отличие от этого, патогенные микроорганизмы, условно патогенная микрофлора, обладают уникальной способностью к изменчивости и адаптации, могут повышать свою вирулентность, способность преодоления естественных защитных барьеров. Названные факторы влияют на становление иммунной системы на ранних этапах онтогенеза, обусловливая у плода и новорожденного нарушение в ней, сопровождающиеся снижением иммунного ответа, развитием толерантности, иммунодефицитных состояний (Ю.Н. Федоров, 1996; К.А. Лебедев, И.Д. Понякина, 2003; И.М. Донник, 2001,2003).

В связи с этим проблема регуляции и восстановления защитных функций организма при заболеваниях и воздействии дестабилизирующих факторов окружающей среды на основе специфических иммуномодулирующих средств является одной из актуальных проблем ветеринарной медицины.

Цель исследований - разработать технологию изготовления нммуномоду-лирующего средства на основе антигенного комплекса БЦЖ и полиэлектролитов.

Для достижения цели поставлены задачи:

- разработать технологию изготовления специфического иммуномодулято-ра на основе антигенов микобактерий и поливинилпирролидона (ПВП);

- отработать методику оценки способности иммуномодулирующих средств восстанавливать у животных утраченную иммунологическую реактивность;

- изучить иммуномодулирующие и протективные свойства препаратов на морских свинках и молодняке крупного рогатого скота;

Научная новизна. Разработана новая технологическая схема получения специфического иммуномодулятора микробного происхождения (КИМ-М). Оптимизированы условия выделения антигенного комплекса из вакцинного штамма БЦЖ, условия инкубации с раствором формальдегида и конъюгации с неприродным полиэлектролитом (ПВП). Определены иммуномодулирующие и протективные свойства препарата на морских свинках и молодняке крупного рогатого скота и дана оценка КИМ-М на способность восстанавливать у животных иммунологическую реактивность устранять вторичные иммунодефициты, усиливать протективные свойства вакцины БЦЖ.

Разработан новый метод оценки иммуномодулирующих свойств известных и вновь синтезируемых биологических препаратов на толерантных морских свинках, который предпочтительно использовать как более точный и экономически выгодный. Индуцирована иммунологическая толерантность у морских свинок к ППД туберкулину для млекопитающих и разработана методика восстановления реактивности с помощью иммуномодулирующих средств.

Теоретическая и практическая ценность работы. Теоретически обоснованы методы оценки способности иммуномодулирующих свойств препаратов восстанавливать у животных утраченную иммунологическую реактивность.

Разработаны рекомендации «Методы оценки иммуномодулирующих препаратов» (Утв. Ученым советом ГНУ ВНИИБТЖ, протокол № 11 от 28 декабря 2009; секцией «Инфекционная патология» Россельхозакадемии протокол № 2 от 19 апреля 2010).

Получен патент на изобретение № 2366455 Российская Федерация, МПК А61К 39/04, С12К 1/20, С1211 1/32. «Способ получения специфического иммуномодулятора» от 10.09.2009 г. Полученный специфический иммуномодулятор способен восстанавливать у животных утраченную иммунологическую реактивность, устранять вторичные иммунодефициты, усиливать протективные свойства вакцины БЦЖ.

Апробация полученных результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии (2007-2010), Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропоноз-ных инфекций» (Омск, 2009), X Международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные аспекты диагностики и профилактики болезней животных» (Омск, 2010).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 4 статьи в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Ветеринарная патология», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Достижения науки и техники АПК», Научно-практический журнал «Интеллектуальная собственность (перспективные российские разработки)»), методические рекомендации.

Объем я структура диссертация. Работа изложена на 116 страницах компьютерного набора и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения полученных результатов, заключение, выводы, практические предложения и приложение. Список литературы включает 200 работ, в том числе 160 отечественных и 40 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами, 8 рисунками.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Технология изготовления специфического иммуномодулятора на основе антигенов микобактерий.

2. Методы оценки иммуномодулирующих препаратов

3. Оценка иммуномодулирующих и протективных свойств иммуномодулятора на основе антигенов микобактерий.

За помощь в выполнении работы выражаем большую благодарность сотрудникам лаборатории М.А. Бажину, А.Н. Новикову, JI.A. Таллер, Г.П. Нево-ротовой.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Настоящая работа выполнена в лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом, секторе иммунитета и специфической профилактики туберкулеза животных Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Россельхоза-кадемии за период 2007-2010 годов.

Исследования проведены в соответствии с тематическим планом НИР по заданию: 08.01.04. «Создать систему иммунной защиты крупного рогатого скота от туберкулеза с применением молекулярных вакцин. Выявить молекулярно-генетические аспекты паразитохозяйнных отношений при туберкулезе животных. и обосновать ускоренную диагностику с учетом изменчивости свойств возбудителя (2006-2010гг.).

Исследования проведены на морских свинках в количестве 212 голов и молодняке крупного рогатого скота в количестве 60 голов в соответствии с «Правилами работы с использованием экспериментальных животных» (Приложения к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755). Лабораторных животных содержали в условиях вивария, кормление осуществляли согласно нормам рациона для лабораторных животных (Г.Е. Батрак, A.M. Кудрин, 1979). За подопытными животными вели постоянное наблюдение, в опыт брали только клинически здоровых животных.

Комплекс антигенов для конъюгации с полиэлектролитами (ПВП - синтетический неприродный полиэлектролит, модулирующий иммуногенез, обла-

дающий митогенными свойствами, стимулирующий миграцию стволовых клеток) выделяли из культуры вакцинного штамма БЦЖ, которую выращивали на жидкой синтетической среде Сотона, подвергали ультразвуковой дезинтеграции на аппарате УЗДН-1 (22 кГц, 60-70Вт/см2 в течение ЗОмин). Полученную взвесь центрифугировали и в надосадочкой жидкости определяли содержание белка по методу, описанному Е.В. Лехтцинд, Д.А. Эльгорд (1987), и биуретовой пробой на фотометре - 5010V5+. При оценке иммуномодулирующих и протек-тивных свойств препаратов на морских свинках использовали метод С.И. Гель-берга, Е.А. Финкель (1959) и индекс защиты, предложенный А.И.Тогуновой (1951). Иммуногенез у животных изучали с помощью иммунологических реакций: спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) определяли в периферической крови животных количество Т-лимфоцитов; непрямого глобулинового розеткообразования с эритроцитами быка (ЕА-РОК) - лимфоцитов-киллеров; комплементарного розеткообразования с эритроцитами быка (ЕАС-РОК) - В-лимфоцитов; иммунокомпетентные клетки, распознающие антигены микобактерий с помощью розеткообразования (ЕТ-РОК) с эритроцитами быка, адсорбировавшими ППД-туберкулин. Постановку и учет реакций розеткообразования проводили в соответствии с методическими рекомендациями (М.А. Бажин и соавт., 1989). Подсчет лейкоцитов и лейкограмм проводили по общепринятым методикам. Для экспериментального заражения морских свинок использовали вирулентную культуру M. bovis шт. 14 (ВНИИБТЖ) подкожно в дозе 0,0001мг/мл. Работа проводилась в соответствии с санитарноэпидемиоло-гическими правилами (CII 1.3.2322-08) «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней), введ.2008-05-01; Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза, приложение №11 к приказу «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в РФ» от 21 марта 2003г. №109; Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.32322-08 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности»; рекомендации «Лабораторная диагностика туберкулеза», 1988; МУ 1.3.1888-04.

В эксперименте на морских свинках были использованы иммунокорректо-ры различных классов: полиоксидоний, ронколейкин, поливинилпирролидон в дозах, соответствующих инструкции по их применению. Аллергические исследования проводили ППД-туберкулином для млекопитающих производства Курской биофабрики.

Цифровой материал экспериментальных исследований обработан математической статистикой по методике, описанной А.Т. Усович, П.Т. Лебедев (1970) с использованием t-критерия по Стьюденту и программы Microsoft Excel.

2.2. Результаты исследовании.

2.2.1. Технология изготовления специфического иммуномодулятора

Для получения иммуномодулятора проводили посев БЦЖ на жидкую синтетическую среду Сотона. Вакцинный штамм культивировали в конических колбах емкостью 0,5-1,0 л при температуре 37°С в течение 2-3-х педель. Вы-

росшую бактериальную массу собирали и трижды отмывали стерильным физиологическим раствором, центрифугировали в течение 20 минут при 3 тыс. об/мин. Отмытую бактериальную массу ресуспендировали в стерильном физиологическом растворе из расчета 1:5 (1,0г бактериальной массы в 5 мл физиологического раствора). Флаконы с суспензией бактериальных клеток помещали на 24 часа на шуттель-аппарат при комнатной температуре.

Суспензию бактериальных клеток подвергали ультразвуковой дезинтеграции на аппарате УЗДН-1 (22 кГц, 60-70 Вт/см2 в течение 30 мин.), полученную взвесь центрифугировали 30 мин. при 15000 об/мин (этот параметр является оптимальным для получения комплекса антигенов цитоплазматической фракции и клеточных оболочек БЦЖ). Надосадочную жидкость сливали.

В объем антигенного комплекса (99,3 мл) с содержанием белка 1мг/мл добавили 37%-ного медицинского формальдегида 0,7 мл или 40%-ного - 0,6мл. Реакционную смесь инкубировали в термостате при 37°С в течение 5-9 суток, конъюгировали с ноливинилпирролидоном молекулярной массой 12600±2700 в соотношении 1:400, 1:600, 1:800 мг). В результате установили, что оптимальной концентрацией является соотношение 1:600, так как удается получить гомогенную слегка вязкую жидкость, которая легко вводится через инъекционную иглу и обеспечивает необходимую дозу ПВП на 1 кг массы животного. При соотношение 1:400 легко растворяется в жидкости и не обеспечивает достаточного количества ПВП для дозы. При соотношении 1:800 получается сильно вязкая жидкость, которую невозможно ввести через инъекционную иглу. В антигенный комплекс постепенно частями добавляют ПВП, размешивая на магнитной мешалке при комнатной температуре до получения эффекта, вновь измеряли содержание белка. Необходимую дозу по содержанию белка на кг массы животного можно довести: добавляя в одном случае надосадочную жидкость разрушенной БЦЖ с известным содержание белка; во втором - стерильный физиологический раствор. Стимулирующий эффект ПВП с молекулярной массой 12600 дальтон наиболее выражен в дозе 10-20 мг/кг массы животного (Р.В. Петров, 1983). Реакционную смесь разливали во флаконы и стерилизовали на установке «АСИС» при 80°С в течение 30 мин и в стерильном боксе закрывали пробками. В результате получали комплексный иммуномодулятор микробного происхождения (КИМ-М).

В процессе работы белок во фракциях разрушенной БЦЖ определяли на полуавтоматическом программируемом фотометре 5010 V5f (производство «Human» Германия), который применяется в клинической химии и для иммунологических анализов. Прибор управляется через сенсорный дисплей, предусмотрена возможность управления через последовательный интерфейс. .

В основе определения на приборе общего белка в жидкостях используется общеизвестный биуретовый метод. Ионы меди реагируют в щелочной среде, формируя фиолетовый комплекс. Оптическая плотность образованного комплекса пропорциональна концентрации белка в пробе.

Оптическую плотность определяли в сравнении со стандартом при длине волны 546 нм, при этом оптический путь составляет 1 см при температуре 20...25°С. Измерение осуществляется против холостой пробы по реагенту (одна холостая проба на серию).

Применение фотометра 5010 У5+ и комплексов реагентов, изготавливаемых в Германии, во многом повышает производительность труда, создает условия для проведения массовых исследований.

2.2.2. Разработка способа оценки иммуномодулирующих свойств препаратов

Известно, что различные факторы могут влиять на становления иммунной системы на ранних этапах онтогенеза, обусловливая у плода и новорожденного нарушение, сопровождающееся снижением иммунного ответа, развитием толерантности, иммунодефицитных состояний. Описаны факторы, вызывающие утрату иммунологической толерантности (ареактивности), которые относятся в основном к двум группам: 1-я группа - неспецифические факторы, стимулирующие иммунный ответ толерантных животных; 2-я группа - специфические по отношению к антигену, вызывавшему толерантность.

В связи с этим были проведены исследования по разработке способа индуцирования иммунологической толерантности у морских свинок ППД-туберкулином и восстановление иммунологической реактивности с помощью известных иммуномодулирующих средств.

Исследования были проведены на 25 морских свинок массой 350-400г., по определению продолжительности состояния иммунологической толерантности у животных, вызванной ППД-туберкулином для млекопитающих.

С целью индукции у морских свинок иммунологической толерантности 20-ти животным ввели аллерген - Г1ПД-тубсркулии для млекопитающих подкожно в дозе 1,5 мл. Затем 20 морских свинок разделили на 5 групп по 4 в каждой. Животных 1-й группы иммунизировали вакциной БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1мг в 0,1мл физиологического раствора через 3 суток после толерогенной обработки; 2-ой-через 7 суток; 3-ей-через 14 суток; 4-ой-через 21 сутки; 5-ой-через 28 суток. Морских свинок 6-ой группы (5 животных) иммунизировали вакциной БЦЖ без предварительной толерогенной обработки. Всех морских свинок исследовали ППД-туберкулином через 30 суток после вакцинации.

Результаты кожной аллергической реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Кожная аллергическая реакция у морских свинок на вакцину БЦЖ после толерогенной обработки

Группы животных Количество животных Сроки введения БЦЖ животным после толерогенной обработки, сутки Кожная реакция на ППД-туберкулин через 30 суток после вакцинации, мм

Реагирующих животных М±ш

1 4 через 3 -

2 4 7 -

3 4 14 -

4 4 21 2 6,25±3,66

5 4 28 3 10,0±3,56

6 5 за 30 суток до исследования ППД-туберкулином 5 16,4±3,47

Из таблицы 1 видно, что у морских свинок восстановление утраченной иммунологической реактивности начинается с 21 суток после толерогенной обработки. В течение первых двух недель после толерогенной обработки морские свинки не отвечают на вакцину БЦЖ кожной аллергической реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих. Следовательно, в эти сроки можно испытывать препараты на способность устранять у животных толерантное состояние. Таким образом, оптимальным сроком введения вакцины БЦЖ является 14-16 сутки после введения ППД-туберкулина или 7-10 сутки после введения имму-номодулятора.

2.23. Оценка иммуномодуляторов на их способность восстанавливать у животных утраченную иммунную реактивность

Мы провели сравнительную оценку иммуномодулирующих препаратов, определяя иммунные реакции, и способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность. В эксперименте использовали ронколейкин (ре-комбинантный интерлейюш-2 человека), лолиоксидоний, поливинилпироли-дон, вакцину БЦЖ.

15-ти морским свинкам ввели толероген и разделили на 3 группы: 1-ой группе морских свинок через 3 суток после толерогенной обработки подкожно ввели ронколейкин трижды с интервалом 24 часа в дозе по 3,5 тыс. ЕД в 0,2 мл физиологического раствора (общая доза на животное-10,5 тыс. ЕД); 2-ой группе животных ввели внутримышечно полиоксидоний трижды по 0,06 мг в 0,2 мл физиологического раствора (общая доза на животного 0,18 мг); 3-ей - ввели поливиниляирролидои (ПВП) по 5 мг на животное в I мл физиологического раствора (кратность и дозы препаратов соответствуют инструкции по их применению). Через 10 суток после введения иммуномодуляторов морских свинок иммунизировали вакциной БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1 мг в 0,1 мл физиологического раствора. 4-ая группа интактных морских свинок также была привита вакциной БЦЖ; 5-ая группа интактных морских свинок, была контрольной. Всех животных через 30 суток после иммунизации БЦЖ инфицировали вирулентной культурой М. bovis подкожно в дозе 0,0001мг в 1мл физиологического раствора.

Иммунологическая перестройка в организме морских свинок через 30 суток после вакцинации сопровождается увеличением числа иммунокомпетент-ных клеток, при этом высокой степени достоверности достигает увеличения числа Т-лимфоцитов у животных всех групп. Зарегистрировано достоверное увеличения числа Е-рок (соответственно: 2,95±0,62; Р<0,05) - 1-я группа; (4,55±0,81; Р<0,05) - 2-я группа; (2,61 ±0,40; Р <0,05) - 3-я группа, кроме морских свинок 4-й группы (1,91±0,36; Р >0,05).

Через 30 дней после инфицирования также отмечаем увеличение числа Т-лимфоцитов, однако достоверных различий достигает у животных, которым вводили ронколейкин ( 4,39±0,82; Р<0,05) и вакцину БЦЖ (3,77±0,30; Р <0,05).

Из данных видно, что оценку иммуномодулирующих препаратов возможно провести, определяя наиболее активные в иммунном ответе иммунокомпе-тентные клетки, однако это затрудняет проводить оценку эффективности каж-

дого иммуномодулирующего средства в сравнительном аспекте. Затраты на одно исследование 30 морских свинок составили 12000 рублей.

Для продолжения исследований использовали этих же морских свинок, которых через 30 дней после инфицирования убили, провели патологоанатомиче-ские исследования и оценили степень пораженное™ внутренних органов животных и определили индекс защиты.

Для оценки напряженности иммунитета из среднего показателя интенсивности поражения контрольной группы вычитали такой же показатель, установленный для опытной группы. Затем полученный остаток, взятый в процентах, делили на средний показатель интенсивности поражения контрольной группы. Вычисления проводили по формуле:

8

С=——^Х 100%

, где

С - индекс защиты;

В*- показатель интенсивности поражений в контрольной группе;

Во - показатель интенсивности поражений в опытной группе.

Результаты опыта представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что ронколейкин является наиболее эффективным препаратом для восстановления иммунологической реактивности (индекс защиты 79%), ПВП и полиоксидоний (соответственно: 48 и 43%).

Таблица 2 - Результаты оценки иммуномодулирующих свойств препаратов на способность восстанавливать иммунологическую реактивность морских свинок.

№ групп Вводимый препарат Кожная аллергическая реакция через 30 дней после заражения, мм Степень по-раженности органов, баллы М±т Индекс защиты, %

п реагировало М±ш

1 Ронколейкин-2 5 5 13,2±10,2 1,2±0,73 79

2 Полиоксидоний 5 5 13,0±1,78 3,25±0Д5 43

3 ПВП 5 5 10,6±1,12 3,0±0,77 48

4 Вакцина БЦЖ 5 5 12,0±0,63 2,2±0,97 67

5 Контроль 5 4 12,0±0,63 5,75±1,03 0

Таким образом, сущность оценки иммуномодулирующих препаратов восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность заключается в том, что индуцируют иммунологическую толерантность аллергеном (ППД-туберкулин для млекопитающих, инкубированный с формалином) у морских свинок подкожно в дозе 1,3-1,8 мл на животное. Затем через 3-5 суток паренте-

ралыю вводят изучаемый препарат для восстановления утраченной иммунологической реактивности. Затем через 7-10 суток иммунизируют морских свинок вакциной БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1мг. Через 30 суток заражают вирулентной культурой микобактерий М. bovis штамм 14 подкожно в дозе 0,0001мг/мл. Через 30 суток проводят убой морских свинок и по результатам патологоанато-мического исследования оценивают иммуномодулирующие свойства изучаемых препаратов по индексу защиты от 67% до 100% - высокая способность иммуномодулирующего средства, 43-66% - средняя способность, от 42% и меньше - низкая.

Результаты показали, что предлагаемый способ оценки иммуномодули-рующих свойств препаратов предпочтительно использовать, как экономически выгодный и более точный. Затраты на одно исследование 30 морских свинок составили 1200 рублей, что в 10 раз дешевле, чем при оценке иммунного статуса.

2.2.4. Оценка антигенных комплексов на их способность восстанавливать у морских свинок иммунологическую реактивность

С целью индукции толерантности 16-ти морским свинкам ввели ППД-туберкулин для млекопитающих подкожно в дозе 1,5 мл и разделили на 4 группы по 4 морских свинки в каждой. Через 5 суток после индукции толерантности 1-ой группе морских свинок ввели комплекс антигенов БЦЖ (КАГ-БЦЖ) подкожно в дозе 500 мкг белка; 2-ой ввели комплекс антигенов БЦЖ, иикубиро-ванный с формалином (1САГ-БЦЖ-Ф) подкожно в дозе 500 мкг белка; 3-ей группе животных ввели комплекс антигенов БЦЖ, инкубированный с формалином и конъюгированый с ПВП (КАГ-БЦЖ-Ф-ПВП) подкожно в дозе 500 мкг; 4-ой группе морских свинок ввели известное иммуномодулирующее средство (ИМС - Ласкавый, Рыбин) подкожно в дозе 1,5 мл.

5-я группа здоровых морских свинок служила в качестве контроля.

Морские свинки первых 4-х групп через 7 суток после введение изучаемых препаратов были иммунизированы вакцинной БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1мг в 0,1мл физиологического раствора. Через 30 суток после прививки морские свинки были заражены вирулентной культурой М. bovis шт. 14 подкожно в дозе 0,0001мг/мл, затем через 30 суток убиты для проведения патологоанатомиче-ских исследований.

Перед проведением опыта, через 30 суток после прививки вакциной БЦЖ и через 30 суток после заражения морские свинки были исследованы ППД-туберкулином для млекопитающих.

Результаты исследования показали (табл. 3), что наиболее высокая способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность у морских свинок установлена у препарата, изготовленного из комплекса антигенов БЦЖ, инкубированного с формалином и конъюгированного с ПВП, степень поражен-ности органов при его применении - 1,75±0,75 баллов; индекс защиты-80%, тогда как только у антигенного комплекса БЦЖ, соответственно: 4,0±0,00; 53,8%. Несколько выше эта способность у известного иммуномодулирующего средст-

ва (ИМС - Ласкавый, Рыбин),: 3,66±0,66; 57,7% соответственно. Способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность у препарата, изготовленного из комплекса антигенов БЦЖ, инкубированного с формалином выше, соответственно: 2,66±0,66; 69,3%.

Таблица 3 - Результаты оценки иммуномодулирующих свойств препаратов на их способность восстанавливать иммунологическую реактивность у морских свинок_____

Группа животных, введенный препарат Кожная аллергическая реакция через 30 суток после вакцинации, мм Кожная аллергическая реакция через 30 суток после заражения, мм Степень пораженное™ органов, баллы М±ш Индекс защиты %

п реагировало М±ш п реагировало М±ш

1-я КАГ-БЦЖ 4 - - 3 3 14,0±1,15 4,0±0,00 53,8

2-я КАГ-БЦЯС-Ф 4 3 7,0±1,48 3 3 14,0±1,53 2,66±0,66 69,3

3-я КАГ-БЦЖ-Ф-ПВП 4 4 6,75±1,03 4 4 13,75±0,48 1,75±0,75 80

4-я ИМС* 4 2 4,75±3,30 3 3 1б,33±3,18 3,66±0,66 57,7

5-я Контроль 4 - - 4 4 14,0±1,22 8,66±0,33 0

*ИМС - Ласкавый, Рыбин

Таким образом, препараты, изготовляемые на основе антигенного комплекса БЦЖ и поливинилпирролидона (КИМ-М) способны восстанавливать иммунологическую реактивность у толерантных морских свинок.

2.2.5. Определение иммунологической активности комплексного им-муномодулятора микробного происхождения (КИМ-М) на морских свинках

Проведено сравнительное испытание иммуномодулятора, полученного на основе комплекса антигенов БЦЖ, инкубированного с формалином и конъюги-рованного с ПВП (КИМ-М) и белково-целлюлозного комплекса, также полученного на основе антигенов БЦЖ и конъюгированного с суспензией целлюлозы (ТБЦ-2).

В опыт взяли 27 морских свинок живой массы 300-350 г и разделили на 6 групп: 1-ой группе морских свинок ввели подкожно КИМ-М в дозе 0,5мл (500 мкг белка); 2-ой - КИМ-М в дозе 1мл (1000 мкг белка); 3-ей - ввели подкожно КИМ-М в дозе 1,5мл (1500мкг белка); 4-ой - ввели подкожно ТБЦ-2 в дозе 500 мкг; 5-ой - ввели вакцину БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1мг; 6-я группа была контрольной. Через 30 суток морские свинки всех групп были инфицированы вирулентной культурой М. bovis шт. 14 подкожно в дозе 0,0001мг бактериальной массы. Через 30 суток животные были убиты для изучения туберкулезного процесса

Интенсивность кожной туберкулиновой реакции (ГЗТ) у морских свинок опытных групп через месяц после инфицирования достоверно была ниже по отношению к контролю (табл. 4).

Таблица 4 - Протективные свойства препаратов

Группа животных, дозы препарата ГЗТ через 30 дней после заражения, мм Степень пораженности баллы, М±ш Индекс защиты, %

п реагиро вало М±т Р

1-я КИМ-М - 0,5мл 4 4 7,66±1,66 0,01 3,33±0,33 61

2-я КИМ-М - 1,0мл 4 4 8,25±0,48 0,002 4,5±0,64 47

3-я КИМ-М - 1,5мл 5 3 6,6±2,82 0,02 3,8±0,20 55

4-я ТБЦ-2 - 0,5мл 5 2 5,0±3,06 0,01 4,2±0,20 50

5-я БЦЖ-0,1мл 5 5 12,0±0,63 0,04 2,3±0,81 73

6-я Контроль(без препарата) 4 4 15,25±1,18 - 8,5±0,29 0

Наиболее высокие протективные свойства зарегистрированы у вакцины БЦЖ, степень пораженности органов животных составляет 2,3±0,81 и индекс защиты 73%; у морских свинок, привитых КИМ-М в дозе 0,5мл (500мкг белка), несколько ниже и составляют соответственно: 3,33±0,33 и 61%, при этом индекс защиты выше, чем у морских свинок, привитых белково-целлюлозным комплексом (ТБЦ-2), где индекс защиты 50% и степень пораженности 4,2±0,20. Увеличение в дозе белка не снижает у морских свинок пораженности органов и не повышает индекс защиты.

С целью изучения ревакцинаторного эффекта КИМ-М на морских свинках, ранее привитых вакциной БЦЖ, был проведен опыт. Для этого были сформированы 5-ть групп. Морские свинки первых 4-х групп были привиты БЦЖ внут-рикожно в дозе 0,1мг. Затем 1-ю группу морских свинок реиммунизировали КИМ-М через 45 суток в дозе 500мкг белка, затем этим же препаратом через 90 и 135 суток; 2-ю групп реиммунизировали КИМ-М в той же дозе через 90 и 135 суток и 3-ю группу через 135 суток. Морские свинки 4-ой группы были привиты только вакцинной БЦЖ, 5-ая группа была контрольной.

Животные всех групп через 30 суток после последней прививки были исследованы ППД-туберкулином для млекопитающих и инфицированы вирулентной культурой М. bovis шт. 14. Затем через 30 суток у зараженных животных было проведено повторное аллергическое исследование ППД-туберкулином для млекопитающих. После убоя была определена степень пораженности органов и рассчитан индекс защиты (табл. 5).

Таблица 5 - Результаты оценки ревакцинаторного эффекта у морских сви-

нок, привитых БЦЖ и реиммунизированных КИМ-М

Группа животных Кожная аллергическая реакция через 30 дней после вакцинации, мм Кожная аллергическая реакция через 30 дней после заражения, мм Степень пораженное™ органов, баллы, М±т Индекс защиты, %

п реагировало М±т п реагировало М±т

1-я 4 3 4,25±1,54 4 4 7,75±1,54 3,5±0,29 55,0

2-я 4 - - 4 3 5,60±2,31 4,0±0,44 48,0

3-я 4 1 1,0±1,0 4 4 6,25±0,85 3,25±0,25 58,0

4-я 3 3 6,66±6,66 3 3 12,6б±0,88 2,33±0,33 70,0

5-я 4 - - 4 3 13,75±4,60 7,75±0,48 0

Из таблицы 5 видно, что у морских свинок, привитых БЦЖ, последующее трехкратное введение КИМ-М снижает уровень ответных иммунных реакций, что приводит к отрицательному ревакцинаторному эффекту. Несколько выше индекс защиты (58%) у животных после однократного введения КИМ-М и наивысший (70%) установлен у животных, привитых только БЦЖ.

С целью изучения стимулирующего эффекта КИМ-М на повышение за-, щитных свойств вакцины БЦЖ проведено исследование на морских свинках. Из морских свинок сформировали 5 групп. Животные первых 3 групп были привиты КИМ-М, затем ревакцинированы вакциной БЦЖ: через 15 суток (1-я группа); через 45 (2-я группа); через 75 суток (3-я группа). Морские свинки 4-й группы были привиты КИМ-М и через 45 суток были повторно ревакцинированы КИМ-М; животные 5-й группы были контрольными. Животные всех групп были исследованы ППД-туберкулином для млекопитающих и заражены вирулентной культурой М. bovis щт. 14. Затем через 30 суток у зараженных животных было проведено повторное аллергическое исследование ППД-туберкулином для млекопитающих. После убоя была определена степень пора-женности органов и рассчитан индеек защиты (табл. 6).

Таблица 6 - Результаты оценки стимулирующего эффекта КИМ-М на про-тективные свойства БЦЖ___

Группа животных Кожиая аллергическая реакция через 30 суток после вакцинации, мм ожная аллергическая реакция через 30 суток после заражения, мм Степень по-раженности органов, баллы М±ш Индекс защиты, %

п реагировало М±ш п реагировало М±т

1-я 5 4 8=0±2,16 5 5 11,0±1,67 1,80±0,73 76,0

2-я 5 5 12,0±0,95 4 4 12,0±1,68 2,25*0,75 70,0

3-я 4 3 8,5±ЗД8 4 4 13,0±0,70 3,25*0,25 56,0

4-я S - - 4 3 11,75±4,25 6,0±1,08 19,0

5-я 5 - - 5 5 13,0±0,95 7,40±0,51 0

При изучении ревакцинаторного эффекта КИМ-М на морских свинках, ранее привитых вакцинной БЦЖ, было установлено, что испытуемый препарат не вызывает ревакцинаторного эффекта, наоборот, в системе иммунитета, видимо, усиливается супрессорная активность и сдерживается развитие иммунного ответа, вызванного вакциной БЦЖ. Индекс защиты у ревакцинированных КИМ-М ниже, чем у привитых только вакциной БЦЖ. Тогда, как у морских свинок, первоначально привитых КИМ-М и затем БЦЖ, индекс защиты выше, чем у морских свинок после ревакцинации КИМ-М.

2.2.6. Оценка специфического иммуномодулятора на молодняке крупного рогатого скота

С целью испытания иммуномодулирующих свойств КИМ-М на молодняке крупного рогатого скота из 60 телят в возрасте от 10 до 20 дней сформировали 3 группы по 20 голов в каждой (ОАО ОПХ «СибМИС» Омской области). Телятам 1-й группы ввели КИМ-М подкожно в дозе 20 мкг белка 1 кг массы животного (0,8-1,0 мг белка в 1мл на теленка). Через 30 суток этих телят привили вакциной БЦЖ в дозе 1мг/0,2 мл. Телят 2-й группы привили также вакциной БЦЖ, молодняк 3-й группы использовали в качестве контроля. Через 4 месяца у животных всех групп произвели отбор венозной крови, в которой определили концентрацию нейтрофилов, Т-лимфоцитов (Е-рок), Т-киллеров (ЕА-рок), Т-лимфоцитов, распознающих антигены микобактерий туберкулеза (ЕТ-рок), В-лимфоциты (ЕАС-рок). Иммунологические параметры анализировали с помощью дискретно - динамического анализа: составляли дифференциально-прогностические таблицы и определили состояние иммунитета.

Содержание всех иммунокомпетентных клеток у телят, привитых вакциной БЦЖ после введения КИМ-М (1-я группа), достоверно выше. Чем у контрольных животных, особенно выше содержание Т-лимфоцитов и Т-киллеров (р<0,001). Повышенное количество клеток-киллеров, В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, распознающих антиген, установлено также у телят, привитых только вакциной БЦЖ (таб. 7).

Таблица 7 - Средние показатели иммунологических параметров у телят

Группы живот ных Символы статистики Иммунологические параметры, тыс./мкл.

Т- лимфоциты Т-киллеры В- лимфоциты Т- антиген-реактивные Нейтрофи-лы

1-я М±т Р 3,05±0,24 <0,001 5,08±0,53 <0,001 3,06±0,46 <0,01 0,96±0,10 <0,001 3,99±0,44 <0,01

2-я М±т Р 1,67±0,19 >0,05 1,86±0,20 <0,001 2,68±0,25 <0,01 1,45±0,18 <0,001 1,42±0,18 <0,05

3-я М±т 1,72±0,28 0,65±0,08 1,63±0,30 0,11 ±0,02 0,98±0,10

Дискретно-динамическим анализом выявлено у телят 1-й группы семь значимых сочетаний параметров, у телят 2-й - девять, у интактных четыре. Далее используя значения базисного и вариабельного параметров дифференциально-прогностической таблицы, оценивали каждого животного исследуемой группы по всем значимым сочетаниям параметров. Например, наибольшее прогностическое значение у контрольных телят приобретает содержание нейтрофилов от 0,95 тыс./мкг н ниже в качестве базисного параметра при содержании у вариабельных Т-лимфоцитов < 0,52 тыс./мкл и В-лимфоцитов <0,75 тыс./мкл; содержание лейкоцитов в качестве базисного <5,80 тыс./мкл при вариабельном В-лимфоцитов <0,85 тыс./мкл; содержание антиген-реактивных лимфоцитов в качестве базисного <0,04 тыс^мкл при вариабельном Т-киллеров <0,51 тыс/мкл.

Результаты оценки иммунитета у телят опытных групп следующие: наибольший процент иммунных животных у привитых вакциной БЦЖ после введения препарата КИМ-М - 90% , у привитых лишь вакцинной БЦЖ - 75% и у интактных телят 40%. Повышенная противотуберкулезная устойчивость у части интактного молодняка крупного рогатого скота связана, вероятно, с генетическими факторами (врожденный иммунитет).

Таким образом, препарат КИМ-М, изготовленный из комплекса антигенов БЦЖ, инкубированный с формалином и конъюгированный с поливинилпирро-лидоном, обладает протективными свойствами, способностью восстанавливать нарушенную иммунологическую реактивность, усиливать протективные свойства вакцины БЦЖ.

Разработаны и составлены технические условия (ТУ) и лабораторный регламент по изготовлению комплексного иммуномодулирующего средства микробного происхождения. Контроль иммуногенности препарат (КИМ-М), на морских свинках предусматривает оценку защитных свойств по степени инфи-цированности органов и индекс защиты. Используют 20 морских свинок живой массой 300-350 г. Опытной группе из 10 морских свинок вводят КИМ-М под кожу живота в область паха в дозе 500 мг белка. Через 30 суток этой группе и 10 интактным морским свинкам вводят вирулентный штамм М. bovis штамм 14 (ВНИИБТЖ) подкожно в дозе 0,0001 мг. Через 30 суток всех животных убивают, вскрывают в условиях бокса и проводят патологоанатомические исследования. По результатам исследования рассчитывают индекс защиты по формуле:

А-В

ИЗ = —г— х 100%,где В

А - показатель интенсивности поражения контрольной группы,

В - показатель интенсивности поражения опытной группы.

Рассчитывают интенсивность поражения органов и индеек защиты.

Препарат считают иммуногенным, если в результате патологоанатом иче-ских и статистических исследований различия достоверны (Р<0,05) между показателями интенсивности поражения у опытной и контрольных групп, при индексе защиты не менее 60%.

3. выводы

1. Разработана, испытана и оптимизирована технологическая схема получения специфического иммуномодулятора (КИМ-М) на основе антигенного комплекса вакцинного штамма БЦЖ, инкубированного с раствором формальдегида и конъюгированного с поливинилпирролидоном

2. Разработан новый метод оценки иммуномодулирующих свойств синтезируемых биологических препаратов, который предпочтительно использовать как более точный и экономически выгодный. Оценивать свойства препаратов следует на морских свинках по индексу защиты от 100% до 67% - высокая, 66%-43% - средняя, от 42% и меньше - низкая способность восстанавливать у животных утраченную иммунологическую реактивность.

3. КИМ-М наиболее эффективен при восстановлении иммунологической реактивности у толерантных морских свинок по отношению к антигенному комплексу БЦЖ, инкубированному с формалином и без инкубации - индекс защиты 80% у животных привитых КИМ-М; 69,3% - у привитых антигенным комплексом, инкубированным с формалином; 53,8% у привитых только антигенным комплексом.

4. Протективные свойства КИМ-М сопоставимы с протективными свойствами вакцины БЦЖ: индекс защиты 61 % - средний уровень у морских свинок, привитых КИМ-М, и 73% - высокий уровень у привитых вакциной БЦЖ.

5. Иммунный статус у молодняка крупного рогатого скота, привитого БЦЖ после введения КИМ-М, характеризуется повышенным содержанием в крови иммунокомпетентных клеток, особенно Т-лимфоцитов и Т-киллеров (Р<0,01). У привитых вакцинной БЦЖ характеризуется повышением в крови клеток-киллеров и Т-лимфоцитов, распознающих антиген (Р<0,001).

6. КИМ-М, введенный телятам в возрасте до 20 дней, усиливает иммуно-генные свойства вакцины БЦЖ, о чем свидетельствует повышение уровня связанности структурных компонентов и числа иммунных телят, выявленных с помощью дискретно-динамического анализа: из числа привитых БЦЖ после введения препарата - 90%; привитых только вакциной БЦЖ - 75%; интактного молодняка - 40%.

7. Контроль нммуногенности препарата на морских свинках предусматривает оценку защитных свойств по степени инфицированное™ органов и индекса защиты. Препарат считают иммуногенным, если в результате патологоана-томических и статистических исследований различия достоверны (Р<0,05) между показателями интенсивности поражения у опытной и контрольной группы, при индексе защиты 60% и выше.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предлагается новая технология изготовления специфического иммуномодулятора на основе комплекса антигенов вакцинного штамма БЦЖ и неприродных полиэлектролитов, которую можно применить для изготовления препаратов, восстанавливающих у животных утраченную иммунологическую реак-

тивность и усиливающих протективные свойства вакцины БЦЖ. Описание изобретения к пат. №2366455, А61/К39/04 (РФ). Способ получения специфического иммуномодулятора / заявка № 2007139594,10 сентября 2009г.

2. Предлагается новый метод оценки известных и вновь синтезируемых иммуномодуляторов на их способность восстанавливать у животных утраченную иммунологическую реактивность. Методические рекомендации «Оценка иммуномодулирующих свойств препаратов на их способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность», утвержденные ученым советом ГНУ Всероссийский НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных Россельхозака-демии (протокол №11 от 28 декабря 2009) и секцией «Инфекционная патология животных» отделение ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 2 от 19 апреля 2010г.).

СПИСОК

опубликованных работ по теме диссертации

1. Шулико, Е.М. Оценка иммуномодулирующих свойств препаратов на их способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность / Е.М. Шулико, В.С Власенко, М.А. Бажнн, А.Н. Новиков, // Ветеринарная патология. - 2007. - № 3. - С. 195-199.

2. Шулико, Е.М. Иммуномодулирующне свойства препаратов, изготовленных на основе антигенов вакцинного штамма БЦЖ и полиэлектролитов / Е.М. Шулико, В.С. Власенко, МА. Бажин, А.Н. Новиков, // Снб. вестник с.-х. науки. - 2008. - №10. - С.68-73.

3. Шулнко, Е.М. Иммуностимулирующие свойства коньюгатов, изготовленных на основе антигенов БЦЖ с поливиншгаирролидоном / Е.М. Шулико, В.С. Власенко, С.Ю. Петров, МА. Бажин, А.Н. Новиков // Достижения науки и техники АПК. - 2009. - №12. - С. 47-50.

4.Шулико, Е.М. Протективные свойства коньюгатов, приготовленных на основе антигенов БЦЖ и синтетических полиэлектролитов / Е.М. Шулико, М.А. Бажин, B.C. Власенко, А.Н. Новиков, С.Ю. Петров // Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций: Матер. Всерос. науч.-практ. конф. - Омск, 2009. - С. 99-102.

5. Пат. 2366455 Российская Федерация, МПК А61К 39/04, C12N 1/20, C12R 1/32. Способ получения специфического иммуномодулятора / Бажин М.А., Власенко B.C., Новиков А.Н., Неворотова Г.П., Шулико Е.М., Реутова Т.С.; заявитель и патентообладатели: Министерство сельского хозяйства и продовольствия Омской области, Всерос. науч.-исслед. ин-т бруцеллеза и туберкулеза животных.-№ 2007139594; заявл. 25.10.07; опубл. 10.09.09, Бюл. № 25. - 8 с.

6. Шулико, Е.М. Способ получения специфического иммуномодулятора / Е.М. Шулико, М.А. Бажин, B.C. Власенко, А.Н. Новиков, Т.С. Реутова // Науч.-практ. журнал: Интеллектуальная собственность (перспективные российские разработки). - 2010. - №5.- С. 67.

7. Бажин, М.А. Оценка иммуномодулирующих свойств препаратов на их способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность:

методические рекомендации / Сост. М.А. Бажин, Шулико Е.М. и др.: ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии; ГНУ СО Россельхозакадемии - Омск, 2010.— 12 с.

8. Шулико, Е.М. Лабораторный регламент приготовления специфического иммуномодулятора и его свойства / Е.М. Шулико // Актуальные проблемы инфекционных незаразных патологий животных: Матер. Междун. науч.-практ. конф. - Омск: Вариант-Омск. - 2010. - С. 230-235.

Подписано к печати 10.05.2011. Формат бумаги 60x84, 1/ 16. Печать оперативная. Гарнитура Times New Roman. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Отпечатано с оригинал-макета в типографии ООО «Вариант-Омск» 644043, г. Омск, ул. Фрунзе 1, корп. 3, оф. 13. Тел./факс: 211-600

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Шулико, Елена Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура микобактерий туберкулеза.

1.1.1. Понятие «антиген» и общие свойства антигенных молекул.

1.1.2. Химическая структура микобактерий.

1.1.3. Строение клетки микобактерий.

1.2. Основные принципы работы иммунной системы.

1.2.1. Режимы функционирования иммунной системы.

1.2.2. Недостаточность работы иммунной системы при воспалительных заболеваниях.

1.3. Механизм действия иммуномодулирующих средств и их применение.

1.3.1. Препараты микробного происхождения и их синтетические аналоги.

1.3.2. Препараты тимуса, костного мозга, селезенки и их синтетические аналоги.

1.3.3. Иммуноглобулины.

1.3.4.Интерферон ы.

1.3.5. Интерлейкиы.

1.3.6. Адаптогены и препараты растительного происхождения.

1.3.7. Иммуномодулирующие свойства вакцин БЦЖ.

1.4. Искусственные антигены и вакцины на основе синтетических полиионов.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Получение специфического иммуномодулятора на основе антигенов микобактерий и его свойства"

Актуальность проблемы. Туберкулез крупного рогатого скота во многих странах мира и Российской Федерации остается из одной наиболее слож ных проблем инфекционной патологии, наносит значительный экономический ущерб неблагополучным хозяйствам, владельцам животных и представляет большую опасность в заражении людей. Против туберкулеза нет достаточно эффективных средств специфической профилактики и лечения.

Применение вакцины БЦЖ в общем комплексе противотуберкулезных мероприятий позволяет сократить сроки оздоровления ферм с меньшими материальными затратами, однако при этом создаются определенные трудности в оценке постинфекционных и поствакцинальных туберкулиновых реакций на взрослом скоте, что сдерживает оздоровление неблагополучных пунктов ограничивает возможность создания у животных перманентного противотуберкулезного иммунитета. Проблема оздоровления ферм от туберкулеза крупного рогатого скота остается сложной (A.C. Донченко, 1995; М.А. Са-фин, 2001; Н.М. Колычев с соавт., 2007, 2010; H.A. Донченко, 2008; А. X. Найманов, 2009; Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, Н.Г. Толстенко с соавт., 2009).

Одно из направлений, которое многие эксперты определяют как наиболее перспективный путь к победе над туберкулезом — это создание эффективных средств специфической профилактики и лечения. Развитие средств иммунологической защиты людей и животных идет по нескольким направлениям: продолжаются поиски в области традиционного вакцинного дела; создание искусственных вакцинных макромолекул, не имеющих аналогов в природе; регуляция иммунологической реактивности с помощью неспецифической стимуляции; другие работы посвящены созданию препаратов иммуностимулирующей, иммуномодулирующей активности и адъювантных свойств синтетических и естественных средств (Р.В Петров, P.M. Хаитов, В.М. Манько, A.A. Михайлов, 1981; В.А. Кабанов, Р.В. Петров, P.M. Хаитов, 1982; К-. Masini, W. Brehmer, W. Zange et al., 1985 Р.Ю. Романова, 1992; P.B.

Петров, P.M. Хаитов, В.И. Литвинов с соавт., 2000; М.А. Бажин, В.В. Шамов, В.Г. Ощепков с соавт., 2003; П.Н. Сисягин с соавт., 2007; Ф.П. Петрянкин, 2009).

Известно, что иммунная система является первой мишенью при воздействии на организм вредных факторов физического, химического, биологического генеза. В отличие от этого, патогенные микроорганизмы, условно патогенная микрофлора, обладают уникальной способностью к изменчивости и адоптации, могут повышать свою вирулентность, способность преодоления естественных защитных барьеров. Названные факторы влияют на становление иммунной системы на ранних этапах онтогенеза, обусловливая у плода и новорожденного нарушение в ней, сопровождающиеся снижением иммунного ответа, развитием толерантности, иммунодефицитных состояний (Ю.Н. Федоров, 1996; К.А. Лебедев, И.Д. Понякина, 2003; И.М: Донник, 2001,2003).

В . связи с этим проблема-регуляции и восстановления защитных функций» организма при заболеваниях и воздействии дестабилизирующих факторов окружающей среды на основе специфических иммуномодулирующих средств является одной из актуальных проблем ветеринарной медицины.

Цель - разработать технологию изготовления иммуномодулирующего средства на основе антигенного комплекса БЦЖ и полиэлектролитов.

Для,достижения цели поставлены задачи:

- разработать технологию изготовление специфического иммуномодуля-тора на основе антигенов микобактерий и поливинилпирролидона (ПВП);

- отработать методику оценки способности иммуномодулирующих средств восстанавливать у животных утраченную иммунологическую реактивность;

- изучить иммуномодулирующие свойства препаратов на морских свинках и молодняке крупного рогатого скота;

Научная новизна. Разработана новая технологическая схема получения специфического иммуномодулятора микробного происхождения (КИМ-М). Оптимизированы условия выделения антигенного комплекса из вакцинного штамма БЦЖ, условия инкубации с раствором формальдегида и конъюгации с неприродным полиэлектролитом (ПВП). Определены иммуномоду-лирующие и протективные свойства препарата на морских свинках и молодняке крупного рогатого скота и дана оценка КИМ-М на способность восстанавливать у животных иммунологическую реактивность устранять вторичные иммунодефициты, усиливать протективные свойства вакцины БЦЖ.

Разработан новый метод оценки иммуномодулирующих свойств известных и вновь синтезируемых биологических препаратов на толерантных морских свинках, который предпочтительно использовать как более точный и экономически выгодный. Индуцирована иммунологическая толерантность у морских свинок к ППД туберкулину для млекопитающих и разработана методика восстановления реактивности с помощью иммуномодулирующих средств.

Теоретическая и практическая ценность работы. Теоретически обоснованы методы оценки иммуномодулирующих свойств препаратов на их способность восстанавливать у животных утраченную иммунологическую реактивность.

Разработаны рекомендации «Методы оценки иммуномодулирующих препаратов» (Утв. Ученым советом ГНУ ВНИИБТЖ, протокол № 11 от 28 декабря 2009; секцией «Инфекционная патология» Россельхозакадемии протокол № 2 от 19 апреля 2010). Предложенные методы оценки повышают точность, снижают трудоемкость и материальные затраты. На одно исследование 30 морских свинок предлагаемым способом без учета лабораторных животных и их содержания затраты составили 1200 рублей, в то время как материальные затраты с оценкой иммунного статуса составили 12000 рублей, что в 10 раз дороже предлагаемого способа. Получен патент на изобретение № 2366455 «Способ получения специфического иммуномодулятора» от 10.09.2009 г. Полученный специфических иммуномодулятор способен восстанавливать у животных утраченную иммунологическую реактивность, устранять вторичные иммунодефициты, усиливать протективные свойства вакцины БЦЖ.

Апробация полученных результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИБТЖ СО Рос-сельхозакадемии (2007-2010), Всероссийской научно-практической конфе-> ренции, посвященной памяти заслуженного деятеля науки РФ, доктора ветеринарных наук, профессора И.А. Косилова «Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций (Омск 2009), X Международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные аспекты диагностики и профилактики болезней животных» посвященной памяти выдающегося организатора Сибирской ветеринарной науки A.B. Копырину (Омск, 2010).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано в 8 научных работ, 4 статьи в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Ветеринарная патология», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Достижения науки и техники АПК», Научно-практический журнал «Интеллектуальная собственность (перспективные разработки)»), методические рекомендации.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 116 страницах компьютерного набора и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения полученных результатов, заключение, выводы, практические предложения и приложение. Список литературы включает 200 работ, в том числе 160 отечественных и 40 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами, 8 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Шулико, Елена Михайловна

92 4. ВЫВОДЫ

1. Разработана, оптимизирована и испытана технологическая схема получения специфического иммуномодулятора (КИМ-М) на основе антигенного комплекса вакцинного штамма БЦЖ, инкубированного с раствором формальдегида и конъюгированного с поливинилпирролидоном.

2. Разработан новый метод оценки иммуномодулирующих свойств синтезируемых биологических препаратов, который предпочтительно использовать как более точный и экономически выгодный. Оценивать свойства препаратов следует на морских свинках по индексу защиты от 100% до 67% -высокая^66%-43%- средняя; от 42% и меньше — низкая способность восстанавливать у животных утраченную иммунологическую реактивность.

3. КИМ-М наиболее эффективен при восстановлении иммунологической реактивности у толерантных морских свинок по отношению к антигенному комплексу БЦЖ инкубированному с формалином и без инкубации - индекс защиты 80% у животных привитых КИМ-М; 69,3% — у привитых антигенным' комплексом,, инкубированным с формалином; 53,8% у привитых только антигенным комплексом.

4; Протективные свойства КИМ-М сопоставимы с протективными! свойствами; вакцины^ БЦЖ: индекс защиты 61 % — средний1 уровень у морских свинок, привитых КИМ-М, и 73% - высокий уровень у привитых вакциной БЦЖ.

5: Иммунный статус у молодняка крупного рогатого скота, привитого БЦЖ после введения КИМ-М, характеризуется повышенным содержанием в крови иммунокомпетентных клеток, особенно Т-лимфоцитов и Т-киллеров (Р<0,01). У привитых вакцинной БЦЖ характеризуется повышением в крови клеток-киллеров и Т-лимфоцитов, распознающих антиген (Р<0,001).

6. КИМ-М, введенный телятам; в» возрасте до 20 дней, усиливает имму-ногенные свойства вакцины БЦЖ о чем свидетельствует повышение уровня связанности? структурных компонентов?и- числа иммунных телят, выявленных с помощью дискретно-динамического > анализа:. из числа привитых БЦЖ поеле введения препарата - 90%; привитых только вакциной БЦЖ - 75%; ин-тактного молодняка - 40%.

7. Контроль иммуногенности препарата на морских свинках предусматривает оценку защитных свойств по степени инфицированности органов и индекса защиты. Препарат считают иммуногенным, если в результате пато-логоанатомических и статистических исследований различия достоверны (Р<0,05) между показателями интенсивности поражения у опытной и контрольной группы, при индексе защиты 60% и выше.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предлагается новая технология изготовления специфического имму-номодулятора на основе комплекса антигенов вакцинного штамма БЦЖ и неприродных полиэлектролитов, которую можно применить для изготовления препаратов, восстанавливающих у животных утраченную иммунологическую реактивность и усиливающих протективные свойства вакцины БЦЖ. Описание изобретения к пат. №2366455, А61/К39/04 (РФ). Способ получения специфического иммуномодулятора / заявка № 2007139594, 10 сентября 2009г.

2. Предлагается новый метод оценки известных и вновь синтезируемых иммуномодуляторов на их способность восстанавливать у животных утраченную иммунологическую реактивность. Методические рекомендации «Оценка иммуномодулирующих свойств препаратов на их способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность», утвержденные ученным советом ГНУ Всероссийский НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных СО Россельхозакадемии (протокол № 11 от 28 декабря 2009) и секцией «Инфекционная патология животных» отделение ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 2 от 19 апреля 2010г.).

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Шулико, Елена Михайловна, Омск

1. Авербах, М.М. Повышенная чувствительность замедленного типа, реактивность иммунокомпетентных клеток и противотуберкулезный иммунитет / М.М. Авербах, В.И. Литвинов // Тр. XXI Международной конференции по туберкулезу. М.: Медицина, 1972. - С. 380-383.

2. Авербах, М.М. Действие антилимфоцитарной сыворотки на повышенную чувствительность замедленного типа при туберкулезе / М.М. Авербах, В.И. Литвинов, А.И. Мороз // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1973. - № 3. - С. 79-83.

3. Авербах, М.М. Повышенная, чувствительность замедленного типа и инфекционный процесс / М.М. Авербах, В.Я. Гергерт, В.И. Литвинов. М.: Медицина, 1974.-247 с.

4. Авербах, М.М. Иммунология и иммунопатология туберкулеза / М.М. Авербах. М.: Медицина, 1976. - 312 с.

5. Авербах, М. М. Иммунология и иммунодиагностика туберкулеза / М.М. Авербах, В.Я. Гергерт. В кн.: Иммунологические аспекты легочной патологии. -М.: Медицина, 1980. - С. 36-49.

6. Арион, В.Я. Иммунологические активные факторы тимуса // Медиаторы иммунной системы М.: ВИНИТК, 1981. С. 10-50 - (Итоги науки и техники. Сер. Иммунология. - Т. 9).

7. Аутенашлюс, А.И., Содержание Т-лимфоцитов и уровни антител к ти-могенну у детей с поражением центральной нервной системой / А.И. Аутенашлюс, А. Н. Шкунов, Е.С. Михайлова, О.В. Иванова, Ю.В. Седова // Иммунология. 2003. № 4. - том 24. - С. 231-233.

8. Бажин, М.А. Иммуногенные и протективные свойства иммобилизиро-ванных на-целлюлозной матрице антигенов микобактерий / М.А. Бажин, В.В.

9. Шамов // Актуальные проблемы бруцеллеза и туберкулеза животных: сб. науч. тр. / ВНИИБТЖ. Омск, 2000. - С. 61-66.

10. Бажин, М.А. Способ получения вакцины против туберкулеза / М.А. Бажин, В.В. Шамов, В.Г. Ощепков и др. // Описание изобретение к патенту № 2217164. -27.11.2003. -Бюл. № 33.

11. Базарбаев, М. Иммуногенность противотуберкулезной жидкой вакцины / М. Базарбаев // Меры борьбы с туберкулезом и бруцеллезом с.-х. животных в Казахстане: Сб. науч. тр. Алма-Ата, 1986. - С. 36-40.

12. Батрак, Г.Е. Дозирование лекарственных средств экспериментальным животным / Г.Е. Батрак, А.Н. Кудрин. М.: Медицина, 1979. - С. 158-159.

13. Белокрылов, Г.А. О путях стимулирующего действия инсулина, низкомолекулярных полипептидов из тимуса и коры головного мозга на тимус зависимый иммунный ответ у мышей / Г.А. Белокрылов // Иммунология. — 1982.-№ 1.- С. 33-38.

14. Белокрылов, Г.А. Сравнительная характеристика иммуностимулирующей активности низкомолекулярных полипептидов из тимуса и коры головного мозга телят / Г.А. Белокрылов // Иммунология. — 1984. № 3 — С. 3438.

15. Бернет, Ф. Клеточная иммунология / Ф. Бернет. — М.: Мир, 1971. 544с.

16. Билько, И.П. Современные представления об ультраструктуре и функции клеточной стенки микобактерий туберкулеза / И.П. Билько, В.Г. Матусевич // Проблем. Туберкулеза. 1986. - № 9.- С. 65-70.

17. Благодарный Я.А. Источники туберкулеза и меры профилактики. — Алма-Ата. 1980. - 145 с.

18. Бобылев, А.К., Об эффективности использования сухой биомассы корня женьшеня при выращивания молодняка сельскохозяйственных животных и птицы / А.К. Бобылев, Е.А. Семенов, A.A. Алексеева и др. // Сельскохозяйственная биология. 2005. № 4. - С. 40-44.

19. Власенко, B.C. Оценка иммуномодулирующих свойств препаратов на их способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность / B.C. Власенко, М.А. Бажин, А.Н. Новиков; Е.М. Шулико // Ветеринарная патология. 2007. - № 3. - С. 195-199.

20. Галактионов, В.Г. Генетический контроль взаимодействия макрофагов с Т- лимфоцитами /В.Г. Галактионов, Т.В. Анфалова // Иммунология. -1983.-№2.-С. 5-11.

21. Гельберг, С.И. К методике экспериментального изучения иммуноген-ных свойств противотуберкулезных вакцин и эффективности методов их применения / С.И. Гельберг, Е.А. Финкель // Пробл. туберкулеза1. 1959. -№2. - С. 80-84.

22. Губарев; М.И. Влияние полиионов иммуностимуляторов на неспецифические (КонА- индуцирование) Т- супрессоры в культуре in vitro / М.И. Губарев, В.В. Гончаров, Т.В. Абраменко // Иммунология. 1988. - № 2.- С. 50-53.

23. Дидовец, С.Р. Опыт борьбы, с туберкулезом крупного'рогатого скота в Украинской ССР / С.Р. Дидовец, Ю.Я. Кассич; А.Т. Борзяк // Матер. Всесоюз. науч. конф. Омск, 1980. - С. 71-73.

24. Хивинсон // Иммунология. 1990. - № 2. - С. 31-32.

25. Донченко, A.C. Повышение протективных свойств вакцины» БЦЖ / A.C. Донченко'г// Вестник. Российской-академии с.-х. наук. 1995. - № 5*. С. 58-61.

26. Донченко, H.A. Усовершенствование, средств и методов диагностики-и профилактики туберкулеза крупного рогатого скота: автореф. дис. докт. ветеринар. наук / H.A. Донченко. Новосибирск, 2008. - 36 с.

27. Донник, ИМ. Экология и здоровье животных / И.М; Донник, П.Н. Смирнов. Екатеринбург: Издательско-редакционное агентство УТК, 2001. -331с.

28. Донник, И.М. Иммунограмма животных в клинической практике / И.М. Донник // Ветеринарнаяшатология. — 2003. № 2. - С. 56-58.

29. Драбкина, PIO. Микробиология. -М.: Медгиз, 1963. 255 с.

30. Дуплищева, А.П. Стимуляция бактериальным полисахаридом сальмо-заном естественной-резистентности организма к инфекции / А.ГТ. Дуплищева, Е.Б. Мысянин, Е.И. Рамашевская, Н'.Г. Синилова, М.А. Туманян // Иммунология. 1988. № 1. - С. 60-62.

31. Елисеева, Л.С. Биологических эффект связывания серотонина с иммуноглобулином / Л.С. Елисеева // Иммунология. — 1988. № 5. - С. 42-46.

32. Елькин, A.B. Интерлейкины: клинико-экспериментальное обоснование применения в комплексном лечении туберкулеза / A.B. Елькин и др. -Санкт-Петербург, 2005 .-32с.

33. Захарова, JI.A. Физико-химическая характеристика медиатора костного мозга, стимулирующего антителогенез / JI.A. Захарова, A.B. Китлинский,

34. Р.Н. Степаненко, JI.A. Стрелков, A.A. Михайлова // Иммунология. — 1986. -№3.-С. 35-38.

35. Иванченко. Н.Ш. Использование эхинтцеи пурпурной в животноводстве / Н. Ш. Иванченко, Н.Д. Колесник // Зоотехния. 2001. - № 1. - С. 24-25.

36. Иммуногенные свойства сухой вакцины БЦЖ / А.И. Тогунова и др. // Бюл. ин-та туберкулеза АМН СССР. 1951. - №1. - С. 27-33.

37. Кабанов, В.А. Новый принцип создания искусственных иммуногенов / В.А. Кабанов, Р.В. Петров, P.M. Хаитов // Ж. Всесоюзн. Хим. об-ва им Д. И. Менделеева 1982. - Т. 27. - С. 57-68.

38. Калинович, А.Г. Различное действие супраоптимальной дозы антигена и иммунных комплексов на формировании субпопуляций Т- и В — клеток /

39. А.Г. Калинович, И.К. Варданян, Б.В. Пинегин // Иммунология. 1983. - № 2.t-С. 47-49.t

40. Кетлинский, С.А. Перспективы клинического применения рекомби-натных цитокинов / С.А. Кетлинский // Вестник РАИ. 1993. - № 2. - С. 1116.

41. Китаева, М.Н; Иммуноадъювантные свойства ионофоров / М.Н. Ки-таева, Д.М.Аббуллаев, Р.И. Атауллаханов, Г.Н. Торсу нова//Иммунология.-1986. № 1. - С. 69-72.

42. Коваленко, A.M. Изучение некоторых физико-химических свойств вакцинных препаратов против туберкулеза / A.M. Коваленко, В.М. Гнатов-ская //Информац. бюл. ИЭКВМ. Харьков, 1995. - С. 17-19.

43. Козлов, В.А. Интерлейкин 1 / В.А. Козлов, Н.Ю. Громыхина //Иммунология - 1987. - № 4. - С. 24-30.

44. Колычев, Н.М. Иммунология, микробиология;, эпизоотология бруцеллеза и туберкулеза животных: монография / Н.М. Колычев, М.А. Бажин, A.A. Новицкий, B.C. Власенко. Омск: Изд-во ФГОУ ВПО ОмГАУ, 2007. - 377 с.

45. Конопля, А.И. Использование лекарственных препаратов растительного происхождения в качестве иммуномодуляторов / А.И. Конопля, Г.Л. Дрозд, Н.Н; Кедровская // Фармация. 1988.:- Т.37. № 2. - С. 17-19.

46. Кузнецов, В.П. Интерфероны как средство иммуномодуляции // иммунология. 1987. - № 4 - С. 30-34.

47. Курбанов, К.З. Регуляторное влияние миелопида на эффекторную функцию макрофагов и рост меланомы В16 / К.З. Курбанов, Е.В. Соколов, JI.B. Ковальчук, Р.В. Петров // Иммунология. 1989. - № 6.- С. 45-47.

48. Лебедев, JT.Р. Изучение цитокинового профеля при иммунизации геном интерлейкина 2 человека в составе рекомбинантной плазмиды / Л.Р. Лебедев // Иммунология. - 2007. - Т. 28. - № 3. - С. 143-147.

49. Лехцинд, Е.В. Приготовление иммуносорбентов на основе суспензии диальдегидцеллюлозы / Е. В. Лехтцинд, Д.А. Эльгорт // Сб. науч. тр. НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи / Иммуносорбенты и их использование в биотехнологии. -М., 1987.-С. 92-95.

50. Линникова, М.А. Биологические свойства белковых фракций очищенного туберкулина / М.А. Линникова, З.И. Жукова // Микробиология. 1976. -№ 10.-С. 10-11.

51. Литвинова, В.И. Медиаторы иммуногенеза. Определение. Классификация, источники, механизмы синтеза и действия / В.И. Литвинова // В кн.: Медивторы клеточного иммунитета и межклеточного взаимодействия. — М.: Медицина, 1980. С. 7-16.

52. Литвинов, В.И. Гормоны тимуса / В.И. Литвинов // В кн.: Медиаторы клеточного иммунитета и межклеточного взаимодействия. М.: Медицина, 1980.-С. 147-164.

53. Ломакин, М.С. Синтетические антигены и иммуномодуляторы как факторы, повышающие противоопухолевую резистентность. / М.С. Ломакин, Г.М. Бочко //Иммунология. 1988 - № 1. - С. 11-18.

54. Луганская, Е.А. Индукция иммуномодуляторных клеток препаратами иммуноглобулинов / Е.А. Луганская // Иммунология. 1988. - № 3. - С. 4951.

55. Лысенко, А.П. Антигенные комплексы М. bovis и их значение в диагностике туберкулеза: Автореф. дис. канд. вет наук / А.П. Лысенко. — Минск, 1984.-23 с.

56. Ляшенко, В.А. Молекулярные основы иммуногенности антигенов / В.А. Ляшенко, A.A. Воробьёв. М.: Медицина, 1982. - 272 с.

57. Ляшенко, В.А. Механизмы активации иммунокомпетентных клеток / В.А. Ляшенко, В.А. Дроженников, И.М. Молотковская. М.: Медицина, 1988.-240 с.

58. Маркова, Т.П. Изучение влияния тактивина на экспрессию цитоплаз-матических и поверхностных иммуноглобулинов / Т.П. Маркова // Иммунология. 1988. - № 1. - С. 40-43.

59. Мартма, О.В., Овдиенко Н.П., Ткачев Кузьмин A.B. Классификация микобактерий туберкулеза сельскохозяйственных животных / Под. ред. Шишкова В.П., Урбан В.П., - М.: Агропромиздат, 1991. - 255 с. - (Научные труды ВАСХНИЛ).

60. Медуница, Н.В. Лимфоциты, влияющие на миграцию полиморфноя-дерных лейкоцитов / Н.В. Медуница //В кн.: Медиаторы клеточного иммунитета и межклеточного взаимодействия. — М.: Медицина, 1980. С. 101-110.

61. Методы оценки Т- и B-систем иммунитета у крупного рогатого скота при бруцеллезе и туберкулезе: метод, рекомендации / М.А. Бажин и др. // ВАСХНИЛ, ВНИИБТЖ. Омск. 1989. - 37 с.

62. Мешков, В.М. Влияние дибазола и экстракта элеутерококка на со-стояне фагоцитоза у коз / В.М. Мешков // Ветеринария. — 1988 № 1. — С. 5456.

63. Мирошкин, O.A. Иммуномодуляторы в России / O.A. Мирошкин, Ю.В. Редькин // Справочник. Омск, 2006. - 428 с.

64. Михайлова, A.A. Гуморальные факторы костного мозга, регулирующие антителогенез / A.A. Михайлова // Итоги науки и техн. ВНИТИ. Иммунология. - 1981.-Т. 9.-С. 110-143.

65. Мороз, A.M. Интерферон / A.M. Мороз // В кн.: Медиаторы клетосно-го иммунитета межклеточного взаимодействия. М.: Медицина, 1980. С. 164-177.

66. Москалева, Е.Ю. Продукция интерферона у лимфоцитами больных раком предстательной железы при индукции противоопухолевого Т - клеточного иммунного ответа с помощью клеток in vitro / Е.Ю. Москалева, A.B.

67. Хомяков, Л.П. Позднякова, О.Н. Попова, С.Е. Северен // Иммунология. -2008. -№ 1.-Т. 29.-С. 10-15.

68. Новиков, Д.К. Иммуномодулирующие эффекты стафилококкового экзотоксина / Д.К Новиков, И.А. Новикова, В.П. Булавкин // Иммунология. -1987.-№6.-С. 46-48.

69. Носков, Ф.С. Иммуностимулирующая и антиинфекционная активность синтетических аналогов гликопептидов клеточной стенки бактерий / Ф.С. Носков, Л.Е. Никитина, Л.К. Маслинников, Э.А. Фридман // Иммунология. 1984. - № 4. - С. 53-55.

70. Овдиенко, Н.П. Совершенствование системы противотуберкулезных мероприятий в сельских очагах туберкулеза / Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, Н.Г. Толстенко // Ветеринарный врач. 2009. - №4. - С. 37-39.

71. Оковитый, C.B. Клиническая фармакология иммуностимуляторов / С. В. Оковитый // ФАРМ индекс: Практик. - 2003. - № 4. - С. 104-149.

72. Осмаев, И.А. Иммуномодулирующие свойства эндогенного интерферона у телят / И.А. Осмаев, К.П. Юров, М.П. Неустроев // Ветеринария. -2007.-№ 1.-С. 11-12.

73. Пак, В.Г. Сравнительная оценка иммуностимулирующей активности естественных и синтетических олигодезоксинуклеотидов in vitro и in vivo / В.Г Пак, И.В. Сергеев, Д.Ю. Трофимов // Иммунология. 2004. - №4. - С. 207-210.

74. Пат. 2112543 Российская Федерация, МПК 6 А 61 К 39/40, А 61 К 47/48. Иммунологическое лекарственное средство / А.Г. Хоменко, Р.В. Петров, P.M. Хаитов и др. №961139399/14; заявл. 26.09.1996; опубл. 10.06.1998.

75. Петров, Р.В. Иммунология и иммуногенетика / Р.В. Петров. М.: Медицина, 1976. - 333 с.

76. Петров, Р.В. Искусственные полиэлектролиты новые биологические активные соединения, влияющие на иммуногенез / Р.В. Петров, P.M. Хаитов // МРЖ. -1977. - вып. 21. - № 7. - С. 18-27.

77. Петров Р.В. Регуляторная роль костного мозга в антителогенезе / Р.В.

78. Петров, P.M. Хаитов, Р.И. Атауллаханов. В кн.: Итоги науки итехники.

79. Иммунология. Вып. 9. М.: ВИНИТИ. 1978. - С. 572-581.

80. Петров, Р.В. Иммунный ответ и искусственные антигены / Р.В. Петров, P.M. Хаитов // Успехи совр. Биол. 1979. - Т. 88. - В. 6. - С. 307-321.

81. Петров, Р.В. Модификация иммунного ответа при помощи антигена, связанного с неприродными полиэлектролитами / Р. В. Петров, В.А. Кабанов, P.M. Хаитов и др. // ЖМЭИ. 1981. - № 2. - с. 58-65.

82. Петров, Р.В. Контроль и регуляция иммунного ответа / Р.В. Петров, P.M. Хаитов, В.М Манько, A.A. Михайлова. М.: Медицина, 1981. - 311 с.

83. Петров, Р.В. Поликлональная активность B-лимфоцитов синтетическими полиэлектролитами / Р.В. Петров, P.M. Хаитов, А.Ш. Норимов, С.Г. Завгородный // Бюлл. экспер. биол. 1981. - № 4. - С. 385 - 512.

84. Петров, Р.В. Иммуногенетика и искусственные антигены / Р.В. Петров, P.M. Хаитов, Р.И. Атауллаханов // АМН СССР. М.: Медицина, 1983, 256 с.

85. Петров, Р.В. Иммунофармакологические подходы к оценке иммуно-модуляторов / Р.В. Петров, P.M. Хаитов, А.Н. Чередеев, Е.В. Кожинова // Сб.