Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Оценка эффективности иммунных реакций у крупного рогатого скота, привитого специфическим иммуномодулятором, в противотуберкулезной защите

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Оценка эффективности иммунных реакций у крупного рогатого скота, привитого специфическим иммуномодулятором, в противотуберкулезной защите"

На правах рукописи

ПЕЛИК Валентина Александровна

ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУННЫХ РЕАКЦИЙ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ПРИВИТОГО СПЕЦИФИЧЕСКИМ ИММУНОМОДУЛЯТОРОМ, В ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ЗАЩИТЕ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

005548284

1 5 ИДИ 2014

Омск-2014

005548284

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте бруцеллеза и туберкулеза животных Россельхозакадемии

Научный руководитель: Власенко Василий Сергеевич

доктор биологических наук, доцент

Официальные оппоненты: Аликин Юрий Серафимович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории нуклеиновых кислот и рекомбинантных белков Институт медицинской биотехнологии ФБУН ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Прудников Степан Ильич

доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный ветеринарный врач РФ, заведующий лабораторией ветеринарной паразитологии и болезней свиней ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии

Ведущая организация: ФГБУ "Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных"

Защита состоится 20 июня 2014 г., в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.050.03 при ФГБОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет имени П.А. Столыпина» по адресу: 644008, г. Омск, ул. Институтская площадь, 2, тел. (3812) 24-39-63, факс (3812) 24-39-63, c-maii: iescheva@Jist.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина www.omgau.ru

Автореферат разослан « » ¡-¿¿Cci ) 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, канд. ветеринар, наук, доцент

Н.А. Лещёва

1.0БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Туберкулез продолжает оставаться одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии в большинстве стран мира, включая Российскую Федерацию. Значительный экономический ущерб, наносимый туберкулезной инфекцией, приводит к острой необходимости специфической защиты животных и охране здоровья людей (A.C. Донченко, 2004; Н.М. Колычев с соавт., 2007, 2010; H.A. Донченко, 2008).

В настоящее время стоит задача сокращения в качестве вакцин цельных микробных клеток, введение которых хотя и оказывает высокий протективный эффект, но является далеко не безвредным. Вакцина БЦЖ, применяемая в настоящее время с целью профилактики туберкулеза, стимулирует одновременно естественную резистентность организма, а также используется для специфической патогенетической терапии больных туберкулезом легких. Стимулирующие свойства вакцины БЦЖ послужили основанием для приготовления из отдельных фракций разрушенной культуры БЦЖ иммуномодулирующих средств (А.Г. Хомеико с соавт., 1998; М.А. Бажин с соавт., 2003, 2010).

Открытие генов иммунного ответа и механизмов генетического контроля иммунного ответа определили необходимость фенотипической коррекции иммунного ответа, изыскание препаратов, способных перевести животных с генетически низкой реактивностью в высокореагирующие.

Создание вакцин особого типа с включением в них стимулирующего компонента открывает такую возможность. Для осуществления фенотипической коррекции разрабатываются комплексные антигены - такие искусственные макромолекулярные комплексы, в состав которых входят необходимые антигенные детерминанты, и стимулирующая (адъювантная) структура, обеспечивающая фенотипическую коррекцию. Необходимыми для этого свойствами обладают синтетические неприродные полиэлектролиты (Р.В. Петров, P.M. Хаитов, 1976,2011).

Следовательно, для более эффективного восстановления реактивности у животных можно использовать молекулярные препараты, позитивно воздействующие на систему иммунитета и не осложняющие контроль за туберкулезной инфекцией в стадах, которые могут быть созданы на основе конъюгации антигенов, выделенных из вакцинного штамма БЦЖ, с полимеразной матрицей. Включение таких препаратов в схему специфической профилактики туберкулеза животных является актуальным.

Степень разработанности проблемы. Принцип создания иммуногенов и вакцин путем химического соединения (конъюгирования) заданных антигенов с иммуностимулирующим полиэлектролитом теоретически обоснован и экспериментально разработан Р.В. Петровым, В.А. Кабаковым, P.M. Хаитовым и другими (1981) в ГНЦ РФ - Институт иммунологии федерального медико-биологического агентства. Приняв за основу этот принцип создания иммуногенов, учеными ВНИИБТЖ была разработана технология изготовления специфического (противотуберкулезного) иммуномодулирующего средства (М.А. Бажин с соавт., 2009; Е.М. Шулико, 2011), которая, как показали исследования, нуждается в дальнейшем усовершенствовании.

Цель и задачи исследования. Цель исследований состояла в разработке технологии изготовления специфического иммуномодулятора и оценке эффективности иммунных реакций на его введение у крупного рогатого скота в противотуберкулезном иммунитете.

Для достижения намеченной цели были определены следующие задачи:

- разработать технологию изготовления специфического иммуномодули-рующего средства на основе антигенов микобактерий вакцинного штамма БЦЖ и полиэлектролитов;

- изучить на морских свинках иммуностимулирующие и протективные свойства иммуномодулятора, изготовленного на основе антигенного комплекса разрушенной культуры БЦЖ;

- изучить иммунные реакции у крупного рогатого скота разного возраста на введение специфического иммуномодулирующего средства;

- разработать схему специфической профилактики туберкулеза и микобак-териозов крупного рогатого скота с применением специфического иммуномодулирующего средства.

Научная новизна. Разработана технологическая схема изготовления про-тективных специфических средств микробного происхождения из комплекса антигенов разрушенной культуры БЦЖ и полиэлектролитов. Установлено, что наиболее эффективным конъюгатом является составленный на основе комплекса антигенов разрушенной культуры БЦЖ, инкубированный с формалином, и конъюгированный с ПВП и ПЭГ в соотношении 1 мг/мл белка комплекса антигенов к 480 мг ПВП и 120 мг ПЭГ. Определены иммуномодулирующие и протективные свойства препарата на морских свинках и крупном рогатом скоте разного возраста.

Разработаны условия применения специфического иммуномодулятора микробного происхождения КИМ-М2 на крупном рогатом скоте и дана оценка иммунного статуса животных на основе взаимосвязей в системе иммунитета.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретически обоснована технология изготовления специфических экологически безопасных молекулярных препаратов и оценена эффективность иммунных реакций на их введение у крупного рогатого скота в противотуберкулезном иммунитете.

Материалы диссертации вошли в проект нормативно-технической документации на препарат, а также использованы для разработки методических рекомендаций по методам дифференциальной диагностики и профилактики туберкулеза и микобактериозов у крупного рогатого скота.

По результатам работы получен патент РФ на изобретение №2478399 от 10.04.2013 г. «Способ получения специфического иммуномодулятора».

Методология и методы исследования. Методологическая основа исследований - анализ и синтез информации по проблеме совершенствования и создания новых средств и методов иммунной защиты на основе применения молекулярных специфических препаратов, представленной в отечественных и зарубежных источниках литературы, а также полученной в экспериментальных условиях. Для достижения поставленной цели изготовлен специфический имму-номодулятор по измененной технологии и оценена степень его влияния на иммунный статус лабораторных животных и крупного рогатого скота разного возраста.

В работе использованы следующие методы исследований: аллергические, иммунологические, фотометрические, серологические, патологоанатомические, бактериологические и биометрические.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технология изготовления специфического иммуномодулятора и степень его влияния на иммунный статус морских свинок и крупного рогатого скота;

2. Материалы по разработке схемы специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота с использованием специфического иммуномоду-лятора.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов подтверждается организацией большого количества экспериментов в лабораторных и производственных условиях с использованием комплекса современных методов исследований и статистической обработкой цифрового материала с помощью программы одно- и многофакторного корреляционного и регрессионного анализов, а также одним из вариантов регрессионного метода - дискретно-динамическим анализом. Степень достоверности полученных показателей оценена путем сравнения величин вариационных рядов с помощью критерия Стьюдента.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены па заседаниях Ученого совета Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных (Омск, 2011-2014), на Международных научно-практических конференциях «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых» (пос. Краснообск, 2012) и «Обеспечение ветеринарного благополучия в животноводстве и птицеводстве» (Омск, 2013).

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: кандидат ветеринарных наук А.Н. Новиков и кандидат ветеринарных наук Е.М. Шулико.

Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи доктору ветеринарных наук, профессору М.А. Бажину.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом, секторе иммунитета и специфической профилактики туберкулеза Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных в период 2011-2014 гг.

Диссертация выполнена в соответствии с тематическим планом НИР ВНИИБТЖ 08.02.01.02.05. «Изучить распространение и роль различных видов атипичных микобактерий в развитии микобактериозов и неспецифических реакций на ППД-туберкулин у сельскохозяйственных животных и на основе выявленных закономерностей создать более эффективные методы дифференциальной диагностики и профилактики туберкулеза и микобактериозов».

Объектом исследования являлись 1250 голов крупного рогатого скота разного возраста и пола, периферическая кровь и сыворотка крови 160 гол. молодняка крупного рогатого скота, нетелей и коров из благополучного по туберкулезу хозяйства. В опытах с заражением культурой возбудителя бычьего вида использовано 114 морских свинок массой 350-400 г. Исследования проведены в соответствии с «Правилами работы с использованием экспериментальных животных» (Приложения к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 №755).

Лабораторных животных содержали в условиях вивария, кормление осуществляли согласно нормам рациона для лабораторных животных (Г.Е. Батрак,

5

A.М.Кудрин, 1979). За подопытными животными вели постоянное наблюдение, в опыт брали только клинически здоровых животных. Для экспериментального заражения лабораторных животных использовали микобактерии вирулентного штамма 14 М. bovis. При анализе протективных свойств противотуберкулезных препаратов на морских свинках применяли метод С.И. Гельберг, Е.А. Финкель (1959), для оценки напряженности иммунитета использовали индекс защиты, предложенный А.И. Тогуновой (1951). Оценку препаратов на их способность восстанавливать у морских свинок иммунологическую реактивность проводили по способу М.А. Бажина с соавт. (2009).

Комплекс антигенов для конъюгации с полиэлектролитами (ПВП и ПЭГ) выделяли из культуры вакцинного штамма БЦЖ, которую выращивали на жидкой синтетической среде Сотона, подвергали ультразвуковой дезинтеграции на аппарате УЗДН-1 (22-35кГц, 60-70Вт/см2 в течение 30 мин). Полученную взвесь центрифугировали и в надосадочной жидкости определяли содержание белка биуретовой пробой на фотометре — 5010 V5+.

Аллергические исследования проводили ПГЩ-туберкулином для млекопитающих производства Курской биофабрики.

Иммуногенез у животных изучали с помощью иммунологических реакций: число Т-лимфоцитов определяли с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (E-рок); Т-киллеров - непрямого глобулинового розеткообразования с эритроцитами быка (ЕА-рок); Т-антиген-реактивных лимфоцитов - туберкулинового розеткообразования с эритроцитами быка, адсорбировавшими ППД-туберкулин (ЕТ-рок); В-лимфоцитов — комплементарного розеткообразования с эритроцитами быка (М.А. Бажин с соавт., 2005). Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) методом осаждения полиэтиленглю-колем (ПЭГ) с молекулярной массой 6000 (Ю.А. Гриневич, А.Н. Алферов, 1981). Функциональное состояние нейтрофилов оценивали в тесте с нитроси-ним тетразолием (НСТ-тест) фотометрическим методом в спонтанном без нагрузки и стимулированном с использованием вакцины БЦЖ (М.А. Годков,

B.Ю. Зинкин, 2003). Окраску мазков крови, подсчет лейкоцитов и выведение лейкоцитарной формулы проводили по общепринятым методикам.

Биометрическую обработку цифрового материала экспериментальных исследований проводили с помощью дискретно-динамического анализа. Для оценки существенности различий между двумя средними величинами Мх и Му использовали t-критерий Стьюдента (В.Ю. Урбах, 1964; А.Т. Усович, П.Т. Лебедев, 1970; B.C. Власенко с соавт., 2010).

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Разработка новых способов повышения иммуномодулирующих свойств синтезируемых препаратов

Известно, что полианионы и поликатионы, в том числе поливинилпирро-лидон (ПВП), наряду с иммуностимулирующими свойствами обладают определенной токсичностью при введении in vivo и негативно влияют на отдельные этапы иммуногенеза. Введение в матрицу водорастворимого неионогенного полимера - полиэтиленгликоля (ПЭГ) усиливает способность взаимодействовать с билипидным слоем клеточных мембран. Кроме того, использование ПЭГ в ка-

честве носителя антигенных детерминант перспективно из-за его нетоксичности и то, что функциональные группы ПЭГ находятся на концах полимерной цепи, позволяет фиксировать определенные положения антигенных детерминант.

В связи с вышесказанным нами было изготовлено четыре типа комплексного иммуномодулятора микробного происхождения (КИМ-М) с использованием разных матриц (КИМ-М2; КИМ-МЗ; КИМ-М4) и проведено изучение синтезированных иммуномодуляторов в сравнительном аспекте с ранее приготовленным КИМ-М на их способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность. С этой целью к ПВП добавляли разное количество водорастворимого неионогенного полимера - полиэтиленгликоль (ПЭГ): ПВП 4 части + 1 часть ПЭГ (КИМ-М2); 3,5 части ПВП + 1,5 части ПЭГ (КИМ-МЗ); ПВП 2,5 части + 2,5 части ПЭГ (КИМ-М4).

2.2.1.1. Оценка синтезируемых препаратов на их способность восстанавливать у морских свинок иммунологическую реактивность

В опыт были взяты 29 морских свинок. Через 3 дня после индукции толерантности 5 морским свинкам ввели КИМ-М (1-я группа); 5 - ввели КИМ-М2 (2-я группа); 5 - ввели КИМ-МЗ (3-я группа); 5- ввели КИМ-М4 (4-я группа). Через 12 дней после толерогенной обработки морские свинки были привиты вакциной БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1 мг; другие 5 морские свинки были иммунизированы БЦЖ без толерогенной обработки (5-я группа) и 4 интактных морских свинок служили в качестве контроля (6-я группа). Через месяц после иммунизации вакциной БЦЖ все морские свинки были инфицированы вирулентной культурой М. bovis штамм 14 подкожно в дозе 0,0001 мг и через 30 дней были подвергнуты эвтаназии для оценки степени инфицированности, используя схему СМ. Гельберга, Е.А. Финкеля и индекс защиты А.И. Торцовой.

Результаты испытания вновь синтезируемых препаратов на их способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность представлены в таблице 1.

Таблица 1. - Результаты оценки иммуномодулирующих свойств препаратов на их способность восстанавливать иммунологическую реактивность у морских свинок_______

Группа животных Кожная аллергическая реакция через 30 дней после вакцинации, мм Кожная аллергическая реакция через 30 дней после заражения, мм Степень поражен ности органов, баллы М±ш Индекс защиты, %

п Реагировало М±ш п Реагировало М±ш

КИМ-М 5 5 6,75±1,03 5 5 13,75±0,48 1,75±0,75 70

КИМ-М2 5 3 4,6±2,11 5 2 2,2±1,35 0,6±0, 6 89

КИМ-МЗ 5 5 8,4±0,92 5 5 6,2±0,58 3,6±0,4 37

КИМ-М4 5 4 6,8±1,93 4 4 7,0±1,08 3,5±0,5 39

БЦЖ 5 5 16,4±3,47 5 5 12,0±0,63 2,2±0,97 67

Контроль 4 - - 4 3 12,25±4,11 5,75±1,03 0

При испытании синтезированных иммуномодуляторов установлено, что наиболее высокая способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность у морских свинок установлена у препарата КИМ-М2 (соотношение по массе ПВП к ПЭГ 4:1). Степень пораженности органов - 0,60±0,60 баллов; индекс защиты - 89 %, тогда как у препарата КИМ-М - 70% и у морских свинок, привитых вакциной БЦЖ - 67 %. Более низкая способность у препаратов КИМ-МЗ и КИМ-М4, соответственно: 3,60±0,40; 37%иЗДЫ),50; 39 %.

2.2.1.2. Испытание иммунологической активности специфического им-муномодулятора микробного происхоаедения (КИМ-М2) на морских свинках

По результатам первого опыта из трех синтезированных иммуномодуляторов с целью изучения иммуногенных свойств был взят как наиболее эффективный препарат КИМ-М2 и в сравнении с имеющимся (КИМ-М) и вакциной БЦЖ были определены иммуногенные и протективные свойства по следующей схеме: 5 морским свинкам был введен КИМ-М (1-я группа); 10 морским свинкам вновь сконструированный КИМ-М2 (2-я группа); 5 - были привиты вакциной БЦЖ (3-я группа) и 4 морские свинки контрольные (4-я группа). Через 30 дней после прививки животные всех групп были инфицированы М. bovis штамм 14 подкожно в дозе 0,0001 мг/мл и через 30 дней были убиты. Результаты исследования показаны в таблице 2.

Таблица 2. - Результаты оценки протективных свойств препаратов

Группа животных Кожная аллергическая реакция через 30 дней после вакцинации, мм Кожная аллергическая реакция через 30 дней после заражения, мм Степень пораженности органов, баллы М±га Индекс защиты, %

п Реагировало М±т п Реагировало М±т

КИМ-М2 5 - - 5 5 12.0±0,81 1,80±0,73 59

КИМ-М 5 - - 4 4 12,0±1,08 1,75±0,75 60

БЦЖ 5 5 9,0±1,18 5 5 6,80±0,66 1,60±0,68 63

Контроль 5 - - 5 5 9,8±0,80 4,40±0,24 0

Из таблицы 2 видно, что вакцина БЦЖ наиболее активно защищает морских свинок от экспериментального заражения: степень пораженности - 1,60±0,68 и индекс защиты 63%; затем препарат КИМ-М, соответственно 1,75±0,75, 60% и КИМ-М2, соответственно 1,80±0,73, 59%.

Таким образом, результаты показали высокий уровень защиты у морских свинок, привитых КИМ-М2 - 59 %, и этот уровень сопоставим с уровнем у привитых вакциной БЦЖ - 63%, причем у морских свинок, привитых КИМ-М2, не развивается кожная аллергическая реакция, тогда как у привитых вакциной БЦЖ, она составила 9,0±1,18 мм, что является чрезвычайно важным отличительным признаком.

При изучении свойств КИМ-М2 на морских свинках в зависимости дозы иммуномодулятора было установлено, что при введении испытуемого препара-

8

та в дозах от 150 мкг до 1000 мкг на одно животное индекс защиты находился на близком по значению уровне, тогда как у животных при инокуляции в дозе 2000 мкг индекс защиты был самым низким (44 %).

По результатам оценки на лабораторных животных для дальнейшего испытания в производственных условиях был отобран конъюгат КИМ-М2, изготовленный из комплекса антигенов БЦЖ, инкубированный с формалином и конъюгированный с поливинилпирролидоном (ПВП) и полиэтигенгликолем (ПЭГ) (соотношение по массе ПВП к ПЭГ 4:1).

Методика приготовления иммуномодулирующего средства. Комплекс антигенов для конъюгации с полиэлектролитами выделяли из вакцинного штамма БЦЖ. Для этого его культуру выращивали на жидкой синтетической среде Со-тона и подвергали ультразвуковой дезинтеграции на аппарате УЗДН-1 (22... 35 кГц, 60...70 Вт/см2 в течение 30 мин). Полученную взвесь центрифугировали 30 мин при 15000 об/мин и определяли содержание белка в надосадочной жидкости биуретовым методом на полуавтоматическом программируемом фотометре 5010 V5+.

Для получения специфического иммуномодулятора микробного происхождения (КИМ-М2) реакционную смесь 99,3 мл антигенного комплекса и 0,7 мл 37 %-ного медицинского или 0,6 мл 40 %-ного формальдегида) инкубировали в термостате при 37°С в течение 5...9 суток, конъюгировали с поливинилпирролидоном молекулярной массой 12600±2700 и полиэтиленгликолем молекулярной массой 6000, концентрацию которых доводили на 1 мг/мл белка до 480 и 120 мг соответственно. После конъюгации реакционной смеси с ПВП и ПЭГ вновь определяли содержание белка биуретовым методом для подбора дозы полученного препарата. Затем реакционную смесь разливали во флаконы и стерилизовали на установке АСИС при 80°С в течение 30 мин и в стерильном боксе закрывали пробками. В результате получили специфический иммуномодуля-тор микробного происхождения (КИМ-М2).

Контроль стерильности, безвредности и иммуногенности КИМ-М2. Стерильность иммуномодулятора определяли по ГОСТ 28085-89. Посевы на питательные среды должны быть стерильными.

Определение безвредности иммуномодулятора проводили путем подкожного введения 0,3 мл из смеси содержимого 5 флаконов 10 мышам массой 18-20 г. Доза белка должна составлять 300 мкг на голову, в качестве растворителя использовали стерильный физиологический раствор. За животными наблюдали 10 суток. Препарат считали безвредным, если все мыши остаются живыми и клинически здоровыми. На месте введения иммуномодулятора не должно быть видимых изменений. При гибели хотя бы одной мыши проверку повторяли на удвоенном количестве мышей. При повторной гибели подопытного животного серию препарата браковали.

Контроль иммуногенности иммуномодулятора на морских свинках предусматривает оценку ее защитных свойств по степени инфицированности органов и индекса защиты.

Препарат считали иммуногепным, если в результате патологоанатомиче-ских и статистических исследований различия будут достоверны (Р<0,05) между показателями интенсивности поражения у опытной и контрольной групп .

2.2.2. Производственное испытание специфического иммуномодулято-ра на крупном рогатом скоте

2.2.2.1. Иммунные реакции у молодняка крупного рогатого скота на введение специфического иммуномодулятора КИМ-М2

Эксперимент был поставлен на телятах в возрасте от 20-и суток до 4 месяцев (всего 90 голов) по следующей схеме. Всем телятам иммуномодулятор инъецировали подкожно в дозе 2,5 мг белка на голову. Перед введением препарата, а также на 45-е сутки после всех животных подвергали исследованию ППД-туберкулином. Кровь для оценки иммунного статуса отбирали выборочно у 20-и телят одного возраста до введения КИМ-М2, на 20-е, 45-е и 180-е сутки после введения препарата.

Содержание всех иммунокомпетентных клеток у телят на 20-е сутки после введения препарата было выше, чем у животных контрольной группы. Особенно можно выделить различия в количестве Т-лимфоцитов (1,68±0,15 и 0,90±0,14 тыс./мкл; Р<0,001), Т-киллеров (3,20±0,21 и 1,91±0,24 тыс./мкл; Р<0,001) и Т-антиген-реактивных лимфоцитов (2,47±0,32 и 0,85±0,16 тыс./мкл; Р<0,001). В спонтанном варианте НСТ-теста установлено снижение уровня функциональной активности нейтрофилов (0,57±0,02 и 0,82±0,08 ед. оп. пл.; Р<0,01) и, наоборот, его увеличение при стимулировании БЦЖ (0,48±0,01 и 0,42±0,02 ед. оп. пл.; Р<0,01). Одновременно зафиксировано недостоверное снижение числа ЦИК (26,15±2,40 и 28,60±4,96 у.е.; РХ),05).

Аналогичная картина наблюдается у телят на 45-е сутки после введения КИМ-М2, за исключением того, что происходит накопление числа иммунных комплексов (35,75±2,89 и 28,60±4,96 у.е.; Р>0,05) и сохраняется на этом уровне в более поздние сроки исследования (36,65±2,28 у.е.). У всех животных не установлена кожная реакция на ППД-туберкулин.

Через 180 суток после введения комплексного иммуномодулятора концентрация иммунокомпетентных клеток возвращается к исходному уровню, однако число Т-лимфоцитов продолжает оставаться высоким (1,43±0,17 и 0,90±0,14 тыс./мкл; Р<0,05). Функциональная активность нейтрофилов, также как и в ранние сроки исследования снижена в спонтанном варианте (0,60±0,01 и 0,82±0,08 ед. оп. пл.; Р<0,01) и, наоборот, увеличена в стимулированном варианте (0,59±0,01 и 0,42±0,02 ед. оп. пл.; Р<0,001).

Исследование опытных групп дискретно-динамическим анализом позволило установить, что трансформация взаимосвязей наиболее выражена у животных на 45-е сутки после введения иммуномодулятора КИМ-М2, чуть слабее на 21-е сутки и наименее-у молодняка на 180-е сутки после введения препарата.

Из всей совокупности многочисленных взаимосвязей удалось выявить приоритетные. Так, у телят перед введением иммуномодулятора установлено 15 достоверных взаимосвязей. Молодняк крупного рогатого скота на 20-е сутки

после введения КИМ-М2 имеет 1 пару таких сочетаний. 3 пары сочетаний определено у телят на 45-е сутки после введения препарата. Выявлено 6 пар сочетаний у животных на 180-е сутки после введения иммуномодулятора.

На основании выявленных достоверно различающихся (Р<0,05) значимых сочетаний параметров с помощью компьютерной программы составили дифференциально-прогностические таблицы. Так, изучением числа связей каждого определяемого показателя с другими у телят перед введением КИМ-М2 установлено, что наибольшим их числом обладают В-лимфоциты (3 раза в качестве базисного и 4 раза в качестве вариабельного), Т-лимфоциты, Т-киллеры и Т-антиген-реактивные лимфоциты (по 3 раза в качестве базисного и в качестве вариабельного), наименьшим - НСТспонт. (2).

Число значимых сочетаний у молодняка крупного рогатого скота на 20-е сутки после введения КИМ-М2 уменьшается до 1-го. Так, B-лимфоциты в качестве базисного параметра с высокой степенью достоверности взаимосвязаны с Т-киллерами.

На 45-е сутки после введения КИМ-М2 выявлено 3 значимых сочетания. Наибольшую активность приобретает HCT как в спонтанном, так и стимулированном БЦЖ вариантах (по 1 разу в качестве базисного и вариабельного параметров).

Количество значимых сочетаний увеличивается до 6-ти через 180 суток после введения КИМ-М2 (табл. 3). Наибольшим числом сочетаний обладают Т-киллеры, B-лимфоциты, Т-антиген-реактивные лимфоциты, HCT в спонтанном варианте и ЦИК (все по 2).

Таблица 3. - Дифференциально-прогностическая таблица по оценке иммунного статуса молодняка крупного рогатого скота на 45-е сутки после введения КИМ-М2, тыс./мкл_____

№ п/п Сочетание: базис (вариабельный параметр) п t- критерий по Стью-денту базис вариабельный

1 Т-киллеры (В-лимфоциты) 5,85 <1,46 <1,38

2 B-лимфоциты (Т-киллеры) 4,47 <1,38 <1,31

3 ЦИК (НСТспонт.) 20 3,72 >39,0 <0,53

4 НСТспонт.(ЦИК) 3,22 <0,58 >62,0

5 Т-атига ьреакшвные лимфоциты (нейгрофилы) 2,58 <0,71 <2,58

6 Т-лимфоцть1(Т-а1Пиган*ак1№ныелимфоциш) 2,54 <0,87 <0,71

Количество животных с функциональным напряжением иммунной системы 9 45%

В дальнейшем, используя значения базисного и вариабельного параметров таблиц, оценивали каждого животного исследуемых групп по всем значимым сочетаниям параметров. Если показатели числа иммунокомпетентных клеток животного соответствовали интервалам хотя бы одного из сочетаний (базисно-

го, вариабельного) таблицы, таких животных признавали с функциональным напряжением иммунной системы или с наличием иммунной недостаточности.

Согласно результатам такого анализа функциональным напряжением иммунной системы характеризовались 50 % животных до введения КИМ-М2 и 45 % - через 180 суток после введения препарата. В остальные сроки исследования животных с напряженным иммунитетом не выявлено.

Таким образом, по результатам дискретно-динамического анализа можно прийти к выводу, что иммунная система молодняка крупного рогатого скота (50% животных) находилась в состоянии функционального напряжения, о чем свидетельствовало наличие 15 выявленных значимых (Р<0,05) сочетаний. Последующие исследования на 20-е и 45-е сутки после введения КИМ-М2 показали, что иммунная система перешла в режим спокойного функционирования (более высокого уровня здоровья), что подтверждает малое число взаимосвязей изученных иммунологических показателей и отсутствие животных с напряженным иммунитетом. На 180-е сутки напряженность иммунной системы вновь возрастает и появляется необходимость повторной иммунизации специфическим иммуномодулятором.

2.2.2.2. Иммунные реакции у коров на введение специфического им-муномодулятора КИМ-М2

Эксперимент был поставлен на коровах и нетелях (всего 310 голов) по следующей схеме. Всем животным иммуномодулятор инъецировали подкожно в дозе 5-7 мг белка на голову. Перед введением препарата, а также через 6 мес. после всех животных подвергали исследованию ППД-туберкулином. Кровь для оценки эффективности иммунных реакций отбирали методом случайной выборки у 20-и коров до введения КИМ-М2, через 3, 6 и 12 мес. после введения препарата.

У крупного рогатого скота через 3 мес. после введения КИМ-М2 по сравнению с животными перед введением препарата наблюдается значительное увеличение числа Т-лимфоцитов (1,16±0,12 и 0,66±0,05 тыс./мкл; Р<0,001), 'Г-антиген-реактивных лимфоцитов (1,47±0,11 и 0,73±0,13 тыс./мкл; Р<0,001) и усиление функциональной активности нейтрофилов в НСТ-тесте как в спонтанном (0,57±0,01 и 0,51 ±0,02 ед. оп. пл.; Р<0,01), так и стимулированном БЦЖ вариантах (0,52±0,01 и 0,46±0,01 ед. оп. пл.; Р<0,001). Одновременно зафиксировано увеличение числа нейтрофилов (2,00±0,26 и 1,71±0,21 тыс./мкл; Р>0,05) и ЦИК (107,55±5,13 и 100,7±7,5 тыс./мкл; Р>0,05).

Аналогичная картина наблюдается у коров через 6 мес. после введения иммуномодулятора КИМ-М2, за исключением того, что концентрация В-лимфоцитов, также подвержена существенному увеличению (1,80±0,16 и 1,07±0,22 тыс./мкл; Р<0,01).

Через 12 мес. после введения КИМ-М2 сохранилось повышенное число большинства иммунокомпетентных клеток, однако достоверному изменению подвержено только содержание Т-антиген-реактивных лимфоцитов (1,81±0,23 и 0,73±0,13 тыс./мкл; Р<0,001).

Функциональная активность нейтрофилов, как и в предыдущие сроки исследования, с высокой степенью достоверности увеличена. Одновременно зафиксировано снижение числа ЦИК (96,90±7,6 и 100,7±7,5 тыс./мкл; Р>0,05).

Дискретно-динамический анализ, проведенный в дальнейшем, позволил установить степень связанности между параметрами иммунной системы, определяемую числом сильных (достоверных) взаимосвязей и провести дифференцированное описание иммунного статуса экспериментальных групп животных.

На основании выявленных со степенью достоверности (Р<0,05) значимых сочетаний параметров составили дифференциально-прогностические таблицы.

В дифференциально-прогностической таблице по оценке иммунного статуса у животных перед введением иммуномодулятора КИМ-М2 представлено 5 значимых сочетаний параметров (табл. 4). Изучение числа связей каждого определяемого показателя с другими позволило установить, что наибольшей долей участия обладают Т-лимфоциты (3 раза в качестве базисного и 2 раза в качестве вариабельного параметров), наименьшей - Т-антиген-реактивные лимфоциты (1 раз).

Таблица 4. - Дифференциально-прогностическая таблица по оценке иммунного статуса крупного рогатого скота перед введением специфического иммуномодулятора КИМ-М2, тыс./мкл____

№ п/п Сочетание: базис (вариабельный параметр) п t-критерий по Стьюденту базис вариабельный

1 Т-лимфоциты (Т-киллеры) 2,90 <0,54 <1,82

2 Т-лимфоциты (Нейтрофилы) 2,87 <0,54 <1,28

3 Т-киллеры (Т-лимфоциты) 20 2,80 <1,17 <0,81

4 Напрофилы (Т-лимфоципы) 2,50 <1,07 <0,48

5 Т-лимфощпы (Т-аншгаьреакшвные лимфоищы) 2,48 <0,54 <0,29

Количество животных с функциональным напряжением иммунной системы 8 40%

Уровень сопряженности (связанности) компонентов иммунной системы у животных через 3 мес. после введения препарата не изменяется и также составляет 5 значимых сочетаний. Большей активностью стали обладать В-лимфоци-ты (по 2 раза в качестве базисного и вариабельного параметров), а меньшей -Т-лимфоциты (3) и Т-антиген-реактивные лимфоциты (3).

Через 6 мес. после введения КИМ-М2 происходит перестройка иммунной системы, сопровождающаяся уменьшением числа значимых сочетаний по сравнению с группой животных перед введением иммуномодулятора и как следствие, только одно значимое сочетание.

Степень связанности компонентов иммунной системы у животных через 12 мес. после введения препарата увеличивается до 4-х и возвращается к исходному уровню (табл. 5). Наибольшей долей участия обладают Т-лимфоциты, Т-антиген-реактивные лимфоциты и НСТ-тест в спонтанном варианте (по 2 раза), наименьшей - нейтрофилы и В-лимфоциты.

В дальнейшем, используя значения базисного и вариабельного параметров дифференциально-прогностических таблиц, оценивали каждого животного исследуемых групп по соответствию интервалов показателей числа иммуноком-петентных клеток хотя бы одному из сочетаний таблицы для выявления особей с функциональным напряжением иммунной системы.

Таблица 5. - Дифференциально-прогностическая таблица по оценке иммунного статуса крупного рогатого скота через 12 мес. после введения специфического иммуномодулятора КИМ-М2, тыс./мкл___

№ п/п Сочетание: базис (вариабельный параметр) п ^критерий по Стьюденту базис вариабельный

1 Нейтрофилы (Г-лимфощтгы) 20 5,46 <2,03 <0,44

2 Т-шпигенфеактвныелимфощпъ1(НСТспо1лО 5,36 <1,34 <0,64

3 Т-лимфонипл (Г-га гшга ьреамии гые лимфоцшы) 4,79 <0,61 <1,72

4 НСГатшг (В-лимфошпы) 2,83 <0,65 <1,54

Количество животных с функциональным напряжением иммунной системы В 40%

Согласно результатам анализа функциональным напряжением иммунной системы характеризовалось 40 % животных до введения препарата, 15 % - через 3 мес. после введения КИМ-М2, 10 % - через 6 мес. и вновь 40 % - через 12 мес. после введения КИМ-М2.

Таким образом, анализ дифференциально-прогностических таблиц по оценке иммунного статуса крупного рогатого скота позволяет утверждать, что через 6 мес. после введения препарата иммунная система находится на более высоком уровне здоровья, что подтверждается малым числом взаимосвязей и животных с напряженным иммунитетом (10 %). Уровень напряженности иммунной системы через 12 мес. после введения иммуномодулятора возрастает, в результате чего можно сделать вывод, что оптимальным сроком реиммуниза-ции КИМ-М2 является 12 мес. после первичного введения КИМ-М2.

2.2.3. Разработка схемы специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота с применением специфического иммуномодули-рующего средства КИМ-М2

Разработанная схема специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота с применением специфического иммуномодулятора КИМ-М2 была испытана на базе ОАО ОПХ СибМИС Таврического района Омской области.

Опыты, проведенные на морских свинках, показали, что протективные свойства специфического иммуномодулятора КИМ-М2 сопоставимы с протек-тивными свойствами вакцины БЦЖ, при этом у лабораторных животных не развивалась кожная аллергическая реакция. Все это послужило основанием использовать КИМ-М2 для иммунизации крупного рогатого скота разного возраста.

Для проведения производственного эксперимента было отобрано 90 телок в возрасте от 20-и суток до 4-х мес. Всем животным иммуномодулятор инъецировали подкожно в шею па расстоянии 8-10 см от переднего края лопатки в до1 зе 2,5 мг белка на голову. Затем через 45 суток после введения препарата телят исследовали на туберкулез с помощью однократной туберкулиновой пробы.

Контроль за испытанием специфического иммуномодулятора КИМ-М2 вели с помощью способа оценки иммунного статуса. С этой целью определяли в периферической крови число иммунокомпетентных клеток, функциональную активность нейтрофилов, концентрацию иммунных комплексов в сыворотке крови и их взаимосвязи дискретно-динамическим анализом.

С помощью специальной программы для ПК составляли дифференциально-прогностические таблицы, позволяющие оценить иммунный статус животных, иммунизированных противотуберкулезными препаратами, а также выявить животных с функциональных напряжением иммунной системы. Кроме того, описанный способ позволяет установить сроки очередной иммунизации.

В результате исследований установили функциональное напряжение иммунной системы у 50 % животных в 20-дневном возрасте перед введением препарата и у 45 % через 180 суток после введения КИМ-М2. На 20-е и 45-е сутки после введения иммуномодулятора телят с напряженным иммунитетом не выявлено.

Результаты этих исследований убедили в необходимости повторного введения специфического иммуномодулятора через 6 мес. после первичной иммунизации.

Таким образом, применение специфического иммуномодулятора КИМ-М2 возможно на всех возрастных группах с 10-20 дневного возраста 2 раза в год на молодняке крупного рогатого скота

Иммунный статус коров определяли также с помощью дискретно-динамического анализа. Перед введением иммуномодулятора животных исследовали туберкулиновой аллергической пробой и установили, что у всех коров кожная реакция на ППД-туберкулин отсутствовала. Коровам специфический иммуномодулятор вводили подкожно в дозе 5-7 мг белка на одно животное.

Через 6 мес. после введения КИМ-М2 животных исследовали туберкулиновой аллергической пробой, а также провели оценку иммунного статуса дискретно-динамическим анализом. Кожной сенсибилизации у коров не обнаружено. Исследованием коров через 6 мес. после введения иммуномодулятора с помощью регрессионного анализа установлено только у 10 % крупного рогатого скота функциональное напряжение иммунной системы.

Аналогичные исследования коров с помощью дискретно-динамического анализа через 12 мес. после введения специфического иммуномодулятора КИМ-М2 выявили 40 % животных с функциональным напряжением иммунной системы, т.е. точно такое же число, что и перед введением этого препарата. Это побудило нас провести повторную иммунизацию коров иммуномодулятором КИМ-М2.

Полученные результаты послужили основанием для применения специфического иммуномодулятора КИМ-М2 на коровах 1 раз в год после исследования ППД-туберкулиновой пробой.

В последующем по результатам дискретно-динамического анализа иммунизацию коров провели еще дважды с интервалом 12 месяцев, что позволило закрепить оздоровительные мероприятия ранее неблагополучной по туберкулезу ферме в течение более 10-ти лет.

Таким образом, в эксперименте разработана схема специфической профилактики, которая способствовала восстановлению утраченной иммунологической реактивности и устранению вторичных иммунодефицитов у новорожденных телят.

Необходимо отметить, что создаваемый в стаде противотуберкулезный иммунитет профилактировал неспецифические туберкулиновые реакции, тем самым исключив необоснованный убой маточного поголовья.

Полученные результаты побудили нас применить специфический иммуно-модулятор в благополучном по туберкулезу хозяйстве, в котором при систематических диагностических исследованиях на туберкулез постоянно выявляются реагирующие на ППД-туберкулин животные. Так, в июле 2012 года в одном из таких хозяйств (СПК «Колхоз Восход» Куйбышевского района Новосибирской области) при исследовании на туберкулез было выделено 28 животных, реагирующих на ППД-туберкулин. По результатам пальпебральной пробы было отобрано 4 головы для контрольно-диагностического убоя. При патологоанатоми-ческом и бактериологическом исследовании туберкулез исключен. У одного животного были выделены атипичные микобактерии IV группы по Раньону.

С целью профилактики микобактериозов нами был использован специфический (противотуберкулезный) иммуномодулятор КИМ-М2. Специфическое иммуномодулирующее средство было применено в СПК «Колхоз Восход» в июле 2012 года на всех возрастных группах с 10-20 дневного возраста на молодняке крупного рогатого скота и коровах после исследования ППД-туберкулиновой пробой. Всего было подвергнуто иммунизации 753 головы, в т.ч. 345 коров. Затем через 6 месяцев 158 голов молодняка крупного рогатого скота реиммунизировали, а также был иммунизирован народившийся молодняк в количестве 81 голова.

В последующем при трехкратном диагностическом исследовании коров, реагирующих на туберкулез, не выявлено. При диагностическом исследовании молодняка крупного рогатого скота ППД-туберкулином, реиммунизированного препаратом КИМ-М2, и родившегося от иммунизированных коров, в количестве 370 голов положительно реагирующих не выявлено.

Следовательно, с целью профилактики и закрепления оздоровительных мероприятий специфическое иммуномодулирующее средство (КИМ-М2) рекомендуется применять на всех возрастных группах с 10-20 суточного возраста 2 раза в год на молодняке крупного рогатого скота и один раз в год на коровах после исследования ППД-туберкулиновой пробой. Последующие исследования крупного рогатого скота привитого КИМ-М2 необходимо проводить в соответствии с планом противотуберкулезных мероприятий хозяйства (фермы).

3. выводы

1. Разработана биотехнология изготовления специфических средств на основе комплекса антигенов микобактерий вакцинного штамма БЦЖ и полиэлектролитов (ПВП и ПЭГ), позволяющая конструировать препараты, эффективно восстанавливающие у животных нарушенную иммунологическую реактивность, устраняющие вторичные иммунодефицита, обладающие выраженными протективными свойствами и не оказывающие токсического действия.

2. Иммуномодулятор КИМ-М2, разработанный на основе комплекса антигенов микобактерий БЦЖ, инкубированный с формалином, и коныогирован-ный в соотношении 1 мг/мл белка антигенного комплекса к 480 мг ПВП и 120 мг ПЭГ в эксперименте на морских свинках эффективно восстанавливал иммунологическую реактивность и имел протективные свойства, аналогичные с протективными свойствами вакцины БЦЖ (индекс защиты, соответственно: 59 и 63%).

3. Иммунный статус у молодняка крупного рогатого скота, иммунизированного КИМ-М2 в раннем возрасте, характеризуется увеличением в крови числа иммунокомпетентных клеток в 1,16-4,3 раза и усилением функциональной активности лейкоцитов в НСТ-тесте, стимулированном БЦЖ в 1,14-1,4 раза. На 180-е сутки после введения препарата концентрация Т-киллеров, В-лимфоцитов и Т-антиген-реактивных лимфоцитов снижалась, и только содержание Т-лимфоцитов продолжало оставаться довольно высоким (1,43±0,17 и 0,90±0,14 тыс./мкл; Р<0,05).

4. Иммунный статус у коров, сенсибилизированных КИМ-М2, характеризуется повышенным содержанием в крови иммунокомпетентных клеток, особенно Т-лимфоцитов и Т-антиген-реактивных лимфоцитов (Р<0,001) и увеличением показателей в НСТ-тесте, как в спонтанном, так и стимулированном БЦЖ вариантах (Р<0,001). К 12-ти месяцам после введения специфического иммуномодулятора из иммунокомпетентных клеток достоверно увеличено содержание Т-антиген-реактивных лимфоцитов (1,81±0,23 и 0,73±0,13 тыс./мкл; Р<0,001). Значительный рост числа клеток и усиление функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов отражают повышенную устойчивость к туберкулезу, индуцированную при введении специфического иммуномодулятора.

5. На основе взаимосвязей в системе иммунитета изучен иммунный статус телят, сенсибилизированных специфическим иммуномодулятором КИМ-М2 в раннем возрасте, при этом выявлено с функциональным напряжением иммунной системы 50% до введения и 45% животных на 180-е сутки после введения препарата. Реиммунизацию животных иммуномодулятором КИМ-М2 целесообразно проводить через 6 мес. после его введения.

6. Специфический иммуномодулятор КЙМ-М2 уменьшает число животных с функциональным напряжением иммунной системы с 40% до 10% через 6 мес. после введения иммуномодулятора. Через 12 мес. после введения препарата количество животных с напряжением иммунной системы возвращается к

исходному уровню (40%), что указывает на необходимость повторной реимму-низации иммуномодулятором КИМ-М2.

7. Разработана схема специфической профилактики крупного рогатого скота от туберкулеза и микобактериозов с применением специфического имму-номодулятора КИМ-М2, предусматривающая иммунизацию молодняка с 10-20 суточного возраста 2 раза в год с интервалом 6 месяцев и коров - 1 раз в год. Исследование животных аллергической туберкулиновой пробой проводят через 6 месяцев 2 раза в год.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методическое пособие «Методы дифференциальной диагностики и профилактики туберкулеза и микобактериозов у крупного рогатого скота», утверждено Ученым советом ГНУ ВНИИБТЖ СО Россельхозакадемии (протокол № 1 от 24 февраля 2014 г.). Предназначено для ветеринарных специалистов научных учреждений, ветеринарных производственных лабораторий, занимающихся диагностикой туберкулеза крупного рогатого скота.

2. Временное наставление по применению специфического иммуномоду-лятора микробного происхождения (КИМ-М2) (У тверждено директором ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии 27 января 2014 г.).

3. Технология изготовления специфического иммуномодулятора на основе комплекса антигенов микобактерий вакцинного штамма БЦЖ и неприродных полиэлектролитов (ПВП и ПЭГ), позволяющей эффективно восстанавливать у животных нарушенную иммунологическую реактивность и имеющего выраженные протективные свойства. Патент РФ на изобретение №2478399 от 10.04.2013 г. «Способ получения специфического иммуномодулятора».

СПИСОК

опубликованных работ по теме диссертации

1. Власенко, B.C. Специфическое иммуномодулирующее средство для профилактики туберкулеза и микобактериозов крупного рогатого скота / B.C. Власенко, М.А. Бажин, А.П. Новиков, С.Ю. Петров, Е.М. Шулико, В.А. Назарова* // Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 9. - С. 7578.

2. Назарова*, В.А. Профилактика туберкулеза и микобактериозов крупного рогатого скота с использованием иммуномодулятора КИМ-М2 // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых: тр. V Между-нар. науч.-практ. конф. молодых учёных, посвященной 10-летию её проведения (20 апреля 2012 г., пос. Краснообск) / СО Россельхозакадемии. - Новосибирск, 2012.-С. 127-129.

3. Пелик, В.А. Иммунные реакции у коров на введение специфического иммуномодулятора КИМ-М2 / В.А. Пелик, B.C. Власенко, М.А. Бажин, А.Н. Новиков, Е.М. Шулико // Ветеринарный врач. - 2013. -№3. - С. 35-38.

4. Власенко, B.C. Характеристика иммунного статуса у молодняка крупного рогатого скота, иммунизированного противотуберкулезным иммуномодуля-тором КИМ-М2 / B.C. Власенко, В.А. Пелик, М.А. Бажин, А.Н. Новиков, Е.М. Шулико // Обеспечение ветеринарного благополучия в животноводстве и птицеводстве: Матер. Матер. Междунар. науч.-практич. конф., посвященной ветеранам ветеринарной науки (Омск, 2-3 октября 2013 г.). - Омск, 2013. -С. 94-98.

5. Пат. 2478399 Российская Федерация, МПК А61К 39/04, А61К 47/48. Способ получения специфического иммуномодулятора / Бажин М.А., Новиков

A.Н., Власенко B.C., Неворотова Г.П., Петров С.Ю., Шулико Е.М., Назарова*

B.А.; заявитель и патентообладатель: Всерос. науч.-исслед. ин-т бруцеллеза и туберкулеза животных. - № 2011124695; заявл. 16.06.11; опубл. 10.04.13, Бюл. № 10,- 12 с.

*Фамилия Назарова сменена на Пелик в связи с вступлением в брак

Подписано к печати 23.04.2014. Формат бумаги 60x90, 1/16. Печать оперативная. Гарнитура Times New Roman. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Издательство ООО «Вариант-Омск» 644043, г. Омск, ул. Фрунзе 1, корп. 3, оф. 13. Тел. /факс: 211- 600 E-mail: variantomsk@rambler.ru

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Пелик, Валентина Александровна, Омск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БРУЦЕЛЛЕЗА И ТУБЕРКУЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

На правах рукориси —

ПЕЛИК Валентина Александровна

ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУННЫХ РЕАКЦИЙ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ПРИВИТОГО СПЕЦИФИЧЕСКИМ ИММУНОМОДУЛЯТОРОМ, В ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ЗАЩИТЕ

06.02.02. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель - доктор биологических наук,

доцент Власенко B.C.

Омск-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................................................4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................................................8

1.1. Антигенная структура микобактерий..............................................................................................8

1.2. Общие сведения об иммунной системе..........................................................................................11

1.3. Механизм приобретенного антибактериального иммунитета................................15

1.4. Гиперчувствительность замедленного типа

в противотуберкулезном иммунитете....................................................................................................20

1.5. Иммунопрофилактика в комплексе противотуберкулезных мероприятий..............................................................................................................................................................22

1.6. Высокоиммуногенные комплексы на основе синтетических

полиионов............................................................................................................................................................................29

1.7. Заключение к обзору литературы................................................................................................34

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................................................................36

2.1. Материалы и методы исследований..........................................................................................36

2.2. Результаты исследований....................................................................................................................38

2.2.1. Разработка новых способов повышения иммуномодулирующих

свойств синтезируемых препаратов....................................................................................................38

2.2.1.1. Оценка синтезируемых препаратов на их способность восстанавливать у морских свинок иммунологическую реактивность..............................................38

2.2.1.2. Испытание иммунологической активности специфического имму-номодулятора микробного происхождения (КИМ-М2) на морских свинках 40

2.2.2. Производственное испытание специфического иммуномодулятора на

крупном рогатом скоте....................................................................................................................................44

2.2.2.1. Иммунные реакции у молодняка крупного рогатого скота на введение специфического иммуномодулятора КИМ-М2........................................................................44

2.2.2.2. Иммунные реакции у коров на введение специфического

иммуномодулятора КИМ-М2..............................................................................................................57

2.2.3. Разработка схемы специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота с применением специфического иммуномодулирую-щего средства КИМ-М2...................................................................... 69

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ..................... 74

4. ВЫВОДЫ..........................................................................................................................................................81

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ....................................................................................83

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................................84

ПРИЛОЖЕНИЕ....................................................................... 110

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Туберкулез продолжает оставаться одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии в большинстве стран мира, включая Российскую Федерацию. Значительный экономический ущерб, наносимый туберкулезной инфекцией, приводит к острой необходимости специфической защиты животных и охране здоровья людей (A.C. Донченко, 2004; Н.М. Колычев с соавт., 2007, 2010; H.A. Донченко, 2008).

В настоящее время остро стоит задача сокращения в качестве вакцин цельных микробных клеток, введение которых хотя и оказывает высокий протектив-ный эффект, но является далеко не безвредным. Вакцина БЦЖ, применяемая в настоящее время с целью профилактики туберкулеза, стимулирует одновременно естественную резистентность организма, а также используется для специфической патогенетической терапии больных туберкулезом легких. Стимулирующие свойства вакцины БЦЖ послужили основанием для приготовления из отдельных фракций разрушенной культуры БЦЖ иммуномодулирующих средств (А.Г. Хо-менко с соавт., 1998; М.А. Бажин с соавт., 2003, 2010).

Открытие генов иммунного ответа и механизмов генетического контроля иммунного ответа определили необходимость фенотипической коррекции иммунного ответа, изыскание препаратов, способных перевести животных с генетически низкой реактивностью в высокореагирующие.

Создание вакцин особого типа с включением в них стимулирующего компонента открывает такую возможность. Для осуществления фенотипической коррекции разрабатываются комплексные антигены - такие искусственные макромо-лекулярные комплексы, в состав которых входят необходимые антигенные детерминанты, и стимулирующая (адъювантная) структура, обеспечивающая феноти-пическую коррекцию. Необходимыми для этого свойствами обладают синтетические неприродные полиэлектролиты (Р.В. Петров, P.M. Хаитов, 1976, 2011).

Следовательно, для более эффективного восстановления реактивности у животных можно использовать молекулярные препараты, позитивно воздействую-

щие на систему иммунитета и не осложняющие контроль за туберкулезной инфекцией в стадах, которые могут быть созданы на основе конъюгации антигенов, выделенных из вакцинного штамма БЦЖ, с полимеразной матрицей. Включение таких препаратов в схему специфической профилактики туберкулеза животных является актуальным.

Степень разработанности проблемы. Принцип создания иммуногенов и вакцин путем химического соединения (конъюгирования) заданных антигенов с иммуностимулирующим полиэлектролитом теоретически обоснован и экспериментально разработан Р.В. Петровым, В.А. Кабановым, P.M. Хаитовым и другими (1981) в ГНЦ РФ - Институт иммунологии федерального медико-биологического агентства. Приняв за основу этот принцип создания иммуногенов, учеными ВНИИБТЖ была разработана технология изготовления специфического (противотуберкулезного) иммуномодулирующего средства (М.А. Бажин с соавт., 2009; Е.М. Шулико, 2011), которая, как показали исследования, нуждается в дальнейшем усовершенствовании.

Цель и задачи исследования. Цель исследований состояла в разработке технологии изготовления специфического иммуномодулятора и оценке эффективности иммунных реакций на его введение у крупного рогатого скота в противотуберкулезном иммунитете.

Для достижения намеченной цели были определены следующие задачи:

- разработать технологию изготовления специфического иммуномодулирующего средства на основе антигенов микобактерий вакцинного штамма БЦЖ и полиэлектролитов;

- изучить на морских свинках иммуностимулирующие и протективные свойства иммуномодулятора, изготовленного на основе антигенного комплекса разрушенной культуры БЦЖ;

- изучить иммунные реакции у крупного рогатого скота разного возраста на введение специфического иммуномодулирующего средства;

- разработать схему специфической профилактики туберкулеза и микобакте-риозов крупного рогатого скота с применением специфического иммуномодули-рующего средства.

Научная новизна. Разработана технологическая схема изготовления протек-тивных специфических средств микробного происхождения из комплекса антигенов разрушенной культуры БЦЖ и полиэлектролитов. Установлено, что наиболее эффективным конъюгатом является составленный на основе комплекса антигенов разрушенной культуры БЦЖ, инкубированный с формалином, и конъюгирован-ный с ПВП и ПЭГ в соотношении 1 мг/мл белка комплекса антигенов к 480 мг ПВП и 120 мг ПЭГ. Определены иммуномодулирующие и протективные свойства препарата на морских свинках и крупном рогатом скоте разного возраста.

Разработаны условия применения специфического иммуномодулятора микробного происхождения КИМ-М2 на крупном рогатом скоте и дана оценка иммунного статуса животных на основе взаимосвязей в системе иммунитета.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретически обоснована технология изготовления специфических экологически безопасных молекулярных препаратов и оценена эффективность иммунных реакций на их введение у крупного рогатого скота в противотуберкулезном иммунитете.

Материалы диссертации вошли в проект нормативно-технической документации на препарат, а также использованы для разработки методических рекомендаций по методам дифференциальной диагностики и профилактики туберкулеза и микобактериозов у крупного рогатого скота.

По результатам работы получен патент РФ на изобретение №2478399 от 10.04.2013 г. «Способ получения специфического иммуномодулятора».

Методология и методы исследования. Методологическая основа исследований - анализ и синтез информации по проблеме усовершенствования и создания новых средств и методов иммунной защиты на основе применения молекулярных специфических препаратов, представленной в отечественных и зарубежных источниках литературы, а также полученной в экспериментальных условиях. Для достижения поставленной цели изготовлен специфический иммуномодулятор

по новой технологии и оценена степень его влияния на иммунный статус лабораторных животных и крупного рогатого скота разного возраста.

В работе использованы следующие методы исследований: аллергические, иммунологические, фотометрические, серологические, патологоанатомические, бактериологические и биометрические.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технология изготовления специфического иммуномодулятора и степень его влияния на иммунный статус морских свинок и крупного рогатого скота;

2. Материалы по разработке схемы специфической профилактики туберкулеза и микобактериозов крупного рогатого скота с использованием специфического иммуномодулятора.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов подтверждается организацией большого количества экспериментов в лабораторных и производственных условиях с использованием комплекса современных методов исследований и статистической обработкой цифрового материала с помощью программы одно- и многофакторного корреляционного и регрессионного анализов, а также одним из вариантов регрессионного метода - дискретно-динамическим анализом. Степень достоверности полученных показателей оценена путем сравнения величин вариационных рядов с помощью критерия Стьюдента.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных (Омск, 2011-2014), на Международных научно-практических конференциях «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых» (пос. Краснообск, 2012) и «Обеспечение ветеринарного благополучия в животноводстве и птицеводстве» (Омск, 2013).

Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: к.в.н. А.Н. Новиков, к.в.н. Е.М. Шулико. Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи научному руководителю д.б.н., доценту B.C. Власенко и д.в.н., профессору М.А. Бажину.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Антигенная структура микобактерий

В современной классификации возбудителя туберкулеза относят к семейству бактерий Micobacteriacae, порядку Actunomyceta, роду Mycobacterium. Род Mycobacterium насчитывает свыше 100 видов, большинство из которых являются сапрофитными микроорганизмами, широко распространенными в окружающей среде (В.А. Кошечкин, З.А. Иванова, 2007; С.О. Thoen et al., 1981; С.О. Thoen, J.H. Steele, 1995).

С позиции клинической медицины микобактерия туберкулеза, открытая немецким ученым Робертом Кохом, является наиболее важным видом актиномице-тов, которые объединены в комплекс, включающий М. tuberculosis;M. bovis и ее вариант БЦЖ (бацилла Кальметта-Герена), М. africanum и М. microti (А.А. Воробьев, 1999; В.А. Кошечкин, З.А. Иванова, 2007).

Клеточная стенка микобактерий обеспечивает стабильность размеров и формы клетки, механическую и осмотическую защиту, участвует в регуляции важных метаболических процессов. Их типичная форма - стройные или слегка изогнутые палочки с закругленными краями. Однако встречаются изогнутые формы. По мере старения культурные микобактерий образуют кокковые формы. Микобактерии не подвижны, спор и капсул не образуют, жгутиков не имеют, по Грамму окрашиваются с трудом и приобретают темно-фиолетовый цвет. Длина клеток колеблется от 0,8 до 5 мкм, ширина от 0,2 до 0,5 мкм (Ю.К. Вейсфейлер, 1975). Болезнь у животных вызывают микобактерии туберкулеза бычьего (М. bovis), человеческого (М. tuberculosis) и птичьего (М. avium) видов.

В процессе роста культуры возбудитель туберкулеза проходит различные фазы развития, поэтому полиморфизм является одной из его особенностей. Установлена способность микобактерий в определенных условиях превращаться в L-форму (А.Г. Хоменко, Н.В. Ерохин, 1982).

Микобактериальная клетка имеет плотную клеточную оболочку, состоящую из трех слоев. Непосредственно к клеточной стенке прилегает цитоплазматиче-ская мембрана, которая также включает 3 слоя. Инвагинируясь в цитоплазму она формирует внутриплазматическую мембранную систему (мезосомы). Цитоплазма содержит гранулы, представленные в основном рибосомами, вакуолями и другими включениями. Нуклеотид микобактерий представлен ДНК-содержащим материалом в виде фибрилл, гранул и конгломератов, располагающимся в осмиофоб-ной зоне в центральной части клетки. Внутренний ригидный слой опорной мембраны содержит ацетилмурамовую кислоту с несколькими аминокислотами, в состав промежуточного и наружного слоев входят липополисахариды и липиды. Для клеточных стенок характерно присутствие прочно связанных липидов и гли-колипидов (В.В. Ерохин, 1982; А.П. Лысенко, 1984, 1987, 1991, 1992; И.П. Билько, В.Г. Матусевич, 1986; А.И. Коротяев, С.А. Бабичев, 2008; Ortalo-Magne Annick, Mari е-Ange Dupont, 1995).

Для механического разрушения микобактерий используют ультразвук, различные прессы с узкими отверстиями, дезинтеграторы, шаровые мельницы и другие методы (М.М. Авербах, 1976).

В клеточной стенке находятся видоспецифические антигены. Они вызывают в организме развитие реакций клеточного иммунитета и антителообразование. Антигенными свойствами обладают также белки, полисахариды и липиды. Белки с молекулярной массой 45 ООО и 48 ООО кДа вызывают кожные реакции и стимулируют лимфоциты в культуре ткани у зараженных микобактериями туберкулеза морских свинок. Низкомолекулярные белки с молекулярной массой 10 ООО, 28 000-30 000 кДа, полученные из фильтратов культур микобактерий туберкулеза, обладают туберкулиновой активностью. Высокомолекулярные белки с молекулярной массой до 150 000 кДа могут вызывать повышенную чувствительность (гиперчувствительность) замедленного типа (ГЗТ) и усиливать фагоцитоз макрофагов (В.Ю. Мишин с соавт., 2007).

В серологических реакциях участвуют преимущественно полисахариды микобактерий туберкулеза, главными из которых являются глюкан, маннан, араби-

номаннан и арабиногалактан. Липиды также обладают иммунологической активностью и обеспечивают в различных антигенных комплексах адъювантное действие (В.Ю. Мишин с соавт., 2007).

Химический состав микобактерий туберкулеза сложен и своеобразен. Наиболее характерным для химического состава возбудителя туберкулеза является значительное количество липидов, составляющих от 10% до 40% их веса (М.М. Пин-чук с соавт., 1982). Липиды микобактериальной клетки своеобразны по химическому составу. Они содержат в значительных количествах группы соединений, отсутствующие у других микроорганизмах, такие как некоторые фосфолипиды, миколовые кислоты. Большое содержание липидов у микобактерий объясняется тем, что они входят в структуру клеточных стенок, образуя сложные полимеры с пептидами и полисахаридами. Наличие в клетках микобактерий большого количества азотистых и фосфорных аминополисахаридов и миколовых кислот обуславливает способность микобактерий склеиваться в виде жгутов (Т.В. Коронели, 1984; Г.И. Тарасова, 1987; G.R. Gray et al., 1982).

У микобактерий установлены как специфические видовые, так межвидовые и даже межродовые антигенные связи. У отдельных штаммов микобактерий выявлены различные антигены. Все без исключения микобактерии содержат вещество, устойчивое к нагреванию и протеолитическим ферментам. Это вещество - полисахарид, который и служит общим антигеном. Кроме того, различные виды микобактерий имеют специфические антигены. В штаммах М. tuberculosis-10, в штаммах М. bovis, М. avium и атипичных микобакте�