Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка модели хронической туберкулезной инфекции и ее использование для отбора перспективных вакцинных штаммов Mycobacterium tuberculosis

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка модели хронической туберкулезной инфекции и ее использование для отбора перспективных вакцинных штаммов Mycobacterium tuberculosis"

На правах рукописи

005009870

ШРАМКО Павел Александрович

РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОТБОРА ПЕРСПЕКТИВНЫХ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Специальности: 03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

. 9 ОсЗ 1ь\1

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ОБОЛЕНСК-2012

005009870

Работа выполнена в лаборатории аэробиологических испытаний Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Научные руководители: член-корреспондент АМН,

доктор медицинских наук, профессор Дятлов И. А.

кандидат биологических наук Потапов В. Д.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Гремякова Татьяна Андреевна

доктор медицинских наук Ерусланов Борис Васильевич

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится «01» марта 2012 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Оболенск Серпуховского района Московской обласги.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан (id О у, Q li~ 2012 г.

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим отправлять по адресу: 142279, Оболенск Серпуховского района Московской области, ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, ученому секретарю совета Н.К. Фурсовой. Факс 8(4967) 36-00-10, e-mail: forsova@obolensk.org

Ученый секретарь, диссертационного совета

кандидат биологических наук

Н.К. Фурсова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Туберкулез продолжает оставаться серьезной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Ежегодно приблизительно 1 млрд. человек контактируют с носителями данной инфекции и подвергаются риску быть инфицированными туберкулезом, 8-10 млн. заболевают, и до 3 млн. человек умирают от туберкулеза. В ряде случаев заболевание и смерть являются результатом реактивации латентных форм туберкулезной инфекции. Реактивация латентного туберкулеза может произойти под воздействием неблагоприятных факторов, таких как хронический стресс, голод и другие состояния, а также заболеваний, приводящих к иммуносупрессивному эффекту, например, СПИД, системные гематологические и онкологические заболевания. Также известны случаи активации туберкулезной инфекции после применения иммунодепрессантов.

Вакцина БЦЖ, применяемая для профилактики туберкулеза во всем мире, может быть небезопасна при действии иммунодепрессирующих факторов. В ряде исследований показано, что заболевание СПИДом может провоцировать активацию вакцинного штамма и приводить даже к смертельному исходу.

Известно, что туберкулезная инфекция может протекать не только в активной форме, но и в латентной, когда возбудитель присутствует в организме в виде дормантных (спящих) форм. В последние годы были накоплены данные о молекулярных процессах перехода микобактерий из дормантных форм в состояние активного размножения, в частности, о роли лизоцимо-подобных белков Rpf микобактерий. В лаборатории молекулярной микобактериологии Национального Центра Здравоохранения ЮАР были получены мутанты штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv, в разной степени утратившие способность к продукции одного или нескольких белков Rpf (Downing et al, 2004). В экспериментах in vitro показано, что белки Rpf связаны с активацией хронической туберкулезной инфекции: выделяясь клетками микобактерий в

3

окружающую среду, они воздействуют на клеточную стенку дормантных форм и вызывают их переход в активное состояние (Kaprelyants et al., 1994, Mukamolova et al., 1998; Kell and Young, 2000, Shleeva et al, 2004).

В настоящий момент представляет интерес изучение показанного in vitro активирующего эффекта белков Rpf на более сложном уровне - в организме теплокровных животных. Поэтому актуальной является задача создания модели туберкулезной инфекции на лабораторных животных, которая позволит охарактеризовать делеционные мутанты туберкулезного микроба по генам rpf оценить их вирулентность для животных, а также особенность активации вызванной ими хронической инфекции под действием иммунодепрессантов. Представляет интерес также селекция вариантов микобактерий, не способных к активации в условиях иммунодепрессии, поскольку они могут быть использованы для создания рекомбинантных противотуберкулезных вакцин нового поколения.

Цель исследования - разработка мышиной модели хронической туберкулезной инфекции и изучение особенностей течения заболевания, вызванного делеционными мутантами М. tuberculosis по генам rpf, в условиях иммуномодуляции.

Задачи исследования:

1. Разработать мышиную модель хронической туберкулезной инфекции.

2. Исследовать вирулентные свойства нокаутных по rpf генам мутантов штамма М. tuberculosis H37Rv.

3. Изучить процессы активации туберкулезной инфекции под воздействием веществ, модулирующих иммунный ответ, на мышиной модели.

4. Разработать методические рекомендации по использованию мышиной внутрибрюшинной модели хронического туберкулеза для изучения иммуномодулирующих веществ.

5. Отобрать мутантные штаммы М. tuberculosis H37Rv, не способные к активации под воздействием иммуномодуляторов, и охарактеризовать их иммунногенные и протективные свойства.

Научная новизна

Исследованы особенности процессов течения туберкулезной инфекции, вызванной мутантными по rpf генам штаммами М. tuberculosis, на мышах с использованием двух моделей заражения: аэрогенной и внутрибрюшинной. Изучена активация туберкулезной инфекции, вызванной этими штаммами, обусловленная действием трех иммуномодуляторов (аминогуанидина, моноклональных анти-ФНОа антител и ЛПС Escherichia coli). Обнаружен протективный эффект против туберкулеза после иммунизации мышей клетками мутантного штамма М. tuberculosis H37Rv, лишенного генов rpf к, rpJB, rpfC и rpfD.

Практическая значимость

Создана мышиная внутрибрюшинная модель туберкулезной инфекции, которая позволяет изучать влияние различных факторов на течение хронического туберкулеза. Разработаны и внедрены на учрежденческом уровне методические рекомендации «Использование модели внутрибрюшинного заражения мышей для получения хронической туберкулезной инфекции», 2010 г. Депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ГКПМКК-Оболенск мутантный штамм М. tuberculosis H37Rv, лишенный генов rpf к, rpfB, rpfC и rpfD, в качестве перспективного для создания противотуберкулезной вакцины нового поколения.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработана модель внутрибрюшинного заражения мышей, приводящая к устойчивой хронической туберкулезной инфекции.

2. Мутантные штаммы М. tuberculosis H37Rv, лишенные двух-пяти генов rpf обладают пониженной вирулентностью по сравнению с исходным штаммом.

3. Хроническая туберкулезная инфекция, вызванная лабораторным штаммом М. tuberculosis H37Rv и его производными, лишенными двух генов rpf, может быть активирована под действием иммуномодуляторов, чего не наблюдается в случае инфекции, вызванной мутантными штаммами, лишенными трех-четырех генов rpf.

4. Мутантный штамм М. tuberculosis H37Rv, лишенный четырех генов rpf обладает протективными свойствами для мышей против туберкулезной инфекции, и может быть использован в качестве перспективного для создания противотуберкулезной вакцины нового поколения.

Личный вклад соискателя

Все эксперименты по низкодозовому аэрозольному заражению мышей, ПЦР-идентификация штаммов и измерение уровня ФНОа в препаратах органов, выполнены автором лично. Кроме того, автор принимал участие в планировании экспериментов, разработке внутрибрюшинной модели заражения и в определении вирулентности штаммов микобактерий при этом типе введения возбудителя, совместно с сотрудниками ФГУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» (Оболенск) и института биохимии им. А.Н. Баха РАН (Москва). Статистическая обработка, анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.

Апробация работы

Результаты работы представлены на семи международных и российских научных конференциях: научно-практической конференции молодых ученых и

специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире», Оболенск, 2009; 13-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2009; Современные проблемы инфекционной патологии - Минск, 2009; 14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2010; III Ежегодном всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 2011; 15-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2011; 12-ом международном форуме и выставке «Высокие технологии XXI века», Москва, 2011.

Диссертация апробирована на межлабораторном научном семинаре ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии - протокол № 18 от 21 ноября 2011 г.

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, в том числе одна статья в рецензируемом журнале из перечня ВАК и 8 публикаций в сборниках, трудах и материалах конференций.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 118 страницах. Список цитируемой литературы включает 169 наименований. Иллюстративный материал содержит 28 рисунков и две таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе использованы штаммы возбудителя туберкулеза: М. tuberculosis H37Rv и его нокаутные мутанты по генам rpf{ДАВ, ААС, ДАВС, ДАСБ, AABCD, AACDE, AABCDE), а также штамм Mycobacterium bovis БЦЖ.

Эксперименты по заражению животных проводили на 6-8 недельных самках мышей линии С57В1, выращенных изолированно в боксах с фильтрованным воздухом, в условиях, соответствующих уровню биологической безопасности BSL-III. Мышей заражали внутрибрюшинно, инфекционная доза микобактерий варьировала в зависимости от иммуногенности используемых штаммов и способов введения возбудителя и составляла в разных экспериментах от 103 до Ю5КОЕ в 0,2 мл суспензии на мышь. Аэрогенное заражение животных проводили по стандартной методике в в аэрозольной камере Inhalation Exposure System 099С А4224 (Glas-Col, США), которая обеспечивала начальную инфицирующую концентрацию в легких от 200 до 400 КОЕ на животное. Эвтаназию мышей осуществляли с помощью С02.

Гомогенаты органов (легкого или селезенки) животных готовили в буфере PBS, содержащем 0,05 % Твин 80, и высевали на чашки Петри с агаризованной средой Мидлбрука 7Н11 (Himedia, Индия) в серии разведений. Для каждого измерения отбирали органы 6 животных. Количество живых бактерий КОЕ определяли после 21 дня инкубации чашек Петри при температуре 37 °С. Результаты учитывали и математически обрабатывали.

Выделение хромосомной ДНК М. tuberculosis проводили из 100 мкл гомогената органа мыши методом Блина и Стафорда с использованием протеиназы К (Blin, Stafford, 1976).

ПЦР-анализ проводили на приборе Терцик (ДНК-технология, Россия). В качестве матрицы использовали образцы разведений препаратов ДНК, выделенной из гомогенатов органов животных. В качестве мишени использовали последовательность инсерционного элемента /<S"6110 размером 163 п. о. в хромосомной ДНК М. tuberculosis. Амплификацию осуществляли в

8

25 мкл реакционной смеси с использованием пары специфических праймеров: прямого - IS6-GGCTGTGGGTAGCAGACC и обратного IS7-CGGGTCCAGATGGCTTGC. Программа амплификации включала в себя: предварительную денатурацию при 95 °С, 5 мин; 32 цикла, включающих денатурацию при 95 °С, 30 с, отжиг при 67 °С, 45 с и элонгацию при 72 °С, 45 с, и завершающую элонгацию при 72 °С, 5 мин. Продукты амплификации (10 мкл) анализировали с помощью электрофореза в 2 % агарозном геле. В качестве положительного контроля использовали ПЦР-продукты, наработанные на ДНК-матрице М. tuberculosis H37Rv. Количество геномов микобактерий в органе животного оценивали визуально по результатам электрофореза, считая последнее, давшее положительный сигнал, разведение проверяемого образца соответствующим 200-250 микобактериям. Далее рассчитывали содержание микобактерий в органе, учитывая фактор разведения.

Определение количества ФНОа в сыворотке крови мышей проводили на приборе Victor ХЗ 2030 (Perkin Elmer, Сингапур) с помощью набора реактивов «Mouse TNF-a Platinum ELISA» (Bioscience, США), в соответствии с руководством производителя.

Введение иммуномодулирующих веществ в организм животного. Препараты моноклональных анти-ФНОа антител, любезно предоставленные к.б.н. Аббасовой С.Г. (Группа иммунохимии Филиала института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Пущино), вводили животным внутрибрюшинно в 2 мл физиологического раствора в течение 10 дней. Введение аминогуанидина (Fluka, Германия) осуществляли путем принудительного поения мышей водным раствором (125 мкг аминогуанидина на животное в сутки в течение 10 дней) или путем одноразового внутрибрюшинного введения водного раствора препарата. Препараты ЛПС Е. coli, любезно предоставленные к.б.н. Шайфутдиновой Р.З. (лаборатория микробиологии чумы ФГУН ГНЦ ПМБ, Оболенск), вводили животным в брюшную полость однократно по 1,5 мкг на животное.

Результаты исследования

Создание внутрибрюшинной мышиной модели хронической туберкулезной инфекции и ее характеристика по сравнению со стандартной аэрозольной мышиной моделью.

Для обоснования возможности создания мышиной модели хронической туберкулезной инфекции путем внутрибрюшинного заражения животных и оптимизации условий экспериментов была проведена серия предварительных опытов с использованием лабораторного штамма М. tuberculosis H37Rv и мышей линии С57В1. Подобрана заражающая доза (Ю3КОЕ на особь), при которой летальность не превышала 20 % и отмечалась только в течение первого месяца после заражения (острая стадия инфекции). Ежемесячные высевы бактерий из органов эвтанизированных животных показали наличие в них микобактерий. Отмечена динамика нарастания титра микобактерий в легких мышей в течение первых 60 дней после заражения и сохранение достигнутого уровня в течение нескольких, до 12, месяцев. Величина достигнутого уровня обсемененности зависела, в основном, от дозы заражения, и находилось в пределах 103-Ю4КОЕ. Динамика обсемененности селезенок при внутрибрюшинном заражении животных имела обратную картину: максимум отмечался через месяц после заражения, и в дальнейшем снижался до определенного уровня (2,7><103 КОЕ) (рис. 1а).

Анализ полученных результатов показывает, что при внутрибрюшинном способе заражения наблюдается проникновение микробов через лимфу в селезенку и далее в легкие. Следует отметить, что лимфоидный путь распространения инфекции характерен и для аэрозольного заражения, только в обратном направлении. Именно этим может быть объяснено наличие возбудителя в селезенке и печени после проникновения его через легкие.

Эксперименты по аэрозольному заражению мышей клетками штамма М. tuberculosis H37Rv в той же концентрации показали, что на 30-й день после инфицирования животных микобактерии детектировались преимущественно в легких, с максимумом на 60-й день после заражения (рис. 16). Количество КОЕ

10

микобактерий в селезенке нарастает медленнее и достигает максимума на 90-й день. К концу четвертого месяца количество КОЕ в исследуемых органах животных, зараженных обоими способами, выходит на плато. Уровень сметности животных, зараженных аэрозольно, был выше и с максимумом в период времени между 30-м и 60-м днями (8 мышей).

Рисунок ] - Анализ содержания микобактерий в легких и селезенках мышей в течение четырех месяцев после заражения штаммом М. tuberculosis H37Rv. Количество животных - 48, доза заражения -5,Зх103 КОЕ, а - внутрибрюшинное заражение, б - аэрозольное

Сравнительная характеристика развития туберкулезной инфекции, вызванной штаммом М. tuberculosis H37Rv и его мутантами, без воздействия иммуномодуляторов.

В данном разделе описаны эксперименты по изучению вирулентности двойных и тройных rpf-мутантов М. tuberculosis H37Rv для мышей линии С57В1 при заражении их высокими дозами возбудителя. Мутантные штаммы лишены возможности продукции части Rpf-белков, определяющих переход дормантных форм возбудителя туберкулеза в активную форму даже под воздействием факторов, ослабляющих иммунитет. Контрольную группу мышей заражали клетками исходного штамма М. tuberculosis H37Rv. Результаты исследования вирулентности штаммов, несущих делеции двух и трех генов rpf,

полученные на двух моделях заражения, представлены на рис. 2.

11

Из приведенного рисунка видно, что, как у исходного штамма, так и у его нокаутных мутантов, наблюдаются некоторые различия в динамике смертности мышей при высокодозовых - аэрогенной и внутрибрюшинной - способах заражения. Но, в целом, штаммы, несущие делеции генов гр/ менее вирулентны. Даже при высокой начальной дозе заражения летальность не превышала 30 %. Аттенуация мутантных штаммов наблюдалась как у двойных, так и (более значительная) у тройных и четверных мутантов. Бактерии с нокаутной мутацией всех пяти гр/генов вызывали хроническую туберкулезную инфекцию у мышей, но при этом находились полностью в дорматном состоянии, они определялись в органах животных методом ПЦР в течение года, но при этом не культивировались на плотных питательных средах.

Для исследования процессов активации туберкулеза представлялось необходимым добиться протекания инфекции в хронической форме. Этого достигали подбором доз возбудителя, введение которых животным приводило к устойчивому (в течение нескольких месяцев) показателю инфицирования, каковым являлось содержание КОЕ в легком для каждого из изучаемых

30 60 90 120 Время, дни

30 60 90 120 Время, дни

Рисунок 2 - Выживаемость мышей при заражении большими (до 10 КОЕ) дозами штаммов М. tuberculosis', (а) - внутрибрюшинный и (б) - аэрозольный способы введения возбудителя; АВ, AC, ABC, ACD - двойные и тройные мутанты по гр/генам М. tuberculosis H37Rv

—ЛАСО -»-H37Rv

ÜACD H37Rv

мутантов. Динамика изменения обсемененности легких животных, зараженных микобактериями, несущими делеции четырех генов гр/, представлена на рис. 3.

Время, дни

Рисунок 3 - Сравнительная динамика течения в легких туберкулезной инфекции, вызванной лабораторным штаммом М. tuberculosis H37Rv и четверными нокаутными мутантами по генам rpf (AABCD и AACDE), доза заражения - 1,3x104 КОЕ

Результаты экспериментов, проведенных с двойными и тройными нокаутными мутантами по генам rpf штамма М. tuberculosis H37Rv, показали, что при заражении мышей клетками этих штаммами, инфекционный процесс также протекает в менее острой форме, и показатель КОЕ стабилизируется на уровне на 1-2 порядка ниже, чем при заражении клетками исходного штамма М. tuberculosis H37Rv.

Закономерности развития туберкулезной инфекции у мышей под действием иммуномодуляторов.

Как известно, при исследовании туберкулезной инфекции большое значение уделяется исследованию процессов активации хронического туберкулеза. Для подавления иммунитета мышей мы использовали: (1) аминогуанидин, являющийся одним из блокаторов индуцибильной NO-синтазы; (2) моноклональные антитела к ФНОа, блокирующие фактор некроза опухоли; и (3) ЛПС Е. coli, вызывающий при высоких концентрациях

общее подавление иммунитета. На рис. 4-6 представлены результаты, по активации хронической туберкулезной инфекции, вызванной штаммом М. tuberculosis H37Rv (исходная доза заражения - 1,3x103 КОЕ), полученные с использованием модели внутрибрюшинного заражения мышей. Установлено, что аминогуанидин оказывал активирующее действие на течение туберкулезной инфекции, что ранее было показано другими авторами при аэрозольном способе заражения на модели мышей, зараженных штаммом М. tuberculosis Erdman. В нашем эксперименте уже через месяц после поения животных водным раствором этого иммунодепрессанта количество КОЕ микобактерий в легких мышей возрастает на порядок и продолжает увеличиваться через 60 дней после начала активации. К 90-му дню обсемененность легких микобактериями снижается, и инфекция стабилизируется на новом уровне, превышающем доактивационное значение КОЕ (рис. 4).

О 30 60 90 120

Время, дни

Рисунок 4 - Динамика изменения КОЕ в легких хронически больных мышей (шт. М. tuberculosis H37Rv) под влиянием поения аминогуанидином (125 мкг на животное в сутки в течение 10 дней)

Иммуномодуляция анти-ФНОа моноклональными антителами

хронической туберкулезной инфекции, вызванной лабораторным штаммом

М. tuberculosis H37Rv, привела к резкому возрастанию содержания

микобактерий в легких мышей через 30 дней после активации. К 90-му дню титр микобактерий, подвергнутых активации, резко снижался, и выходил на доактивационный уровень (рис. 5).

-Н37^+антиФНО

-■—H37Rv

О 30 60 90 120

Время, дни

Рисунок 5 - Динамика изменения КОЕ в легких мышей, больных хроническим туберкулезом (шт. М. tuberculosis H37Rv), после внутрибрюшинного введения анти-ФНОа моноклональных антител

Рисунок 6 - Динамика изменения КОЕ в легких хронически больных мышей (шт. М. tuberculosis H37Rv) под действием ЛПС Е. coli (1,5 мкг в 1мл физраствора внутрибрюшинно)

Введение в организм зараженных мышей ЛПС Е. coli также привело к увеличению показателя КОЕ в легких на порядок уже на 10-й день, в дальнейшем наблюдалось снижение обсемененности, и исчезновение активирующего эффекта происходило уже к 60-му дню от начала активации, что может быть объяснено быстрым разрушением ЛПС в организмах мышей (рис. 6).

Изучение действия различных иммуномодуляторов на процесс хронической туберкулезной инфекции, вызванной нокаутными мутантами М. tuberculosis H37Rv по разным rpf генам.

Активация хронической туберкулезной инфекции у мышей, вызванной нокаутными мутантами М. tuberculosis H37Rv, под действием аминогуанидина, анти-ФНОа моноклональных антител и ЛПС Е. coli показала, что ввеедние иммуномодуляторов в организм испытуемых животных не приводило к изменению течения туберкулезной инфекции у животных, зараженных тройными нокаутными мутантами по rpf генам (рис. 7-9).

Рисунок 7 - Влияние аминогуанидина на динамику КОЕ в легких мышей, хронически больных туберкулезом, вызванным тройными нокаутными мутантами по генам rpf а - М. tuberculosis H37Rv ААВС, б М. tuberculosis H37Rv AACD

Рисунок 8 - Динамика изменения КОЕ в результате активации анти-ФНОа моноклональными антителами у хронически больных животных зараженых тройными нокаутными мутантами по генам rpf а - М. tuberculosis H37Rv ДАВС, б - М. tuberculosis H37Rv AACD

Рисунок 9 - Динамика изменения КОЕ в результате активации ЛПС Е. coli у хронически больных животных зараженых тройными нокаутными мутантами по генам rpf, а - М. tuberculosis H37Rv A ABC, б - М. tuberculosis H37Rv AACD

Та же картина наблюдалась и при попытках активации хронической туберкулезной инфекции, вызванной четверными нокаутными мутантами. Штаммы с делециями двух генов rpf активировались всеми тремя исследуемыми препаратами, но эффект иммуномодуляции проявлялся менее

остро, чем при хронической инфекции, вызванной штаммом М. tuberculosis H37Rv.

Изучение течения острого туберкулезного процесса у мышей, иммунизированных штаммами М. tuberculosis H37Rv, нокаутными по разным генам rpf.

Проведено сравнение протективного эффекта штаммов М. tuberculosis H37Rv AABCD и М. bovis Б1ДЖ для мышей. Животных, иммунизированных названными штаммами аэрозольно, на 30-й день заражали высокой дозой (1,5х 106 КОЕ) вирулентного штамма М. tuberculosis H37Rv. Уровень бактериальной нагрузки в гомогенатах легких подопытных животных учитывали на 10, 30, 60, 90 и 120-й дни после вторичного заражения (рис. 10).

Время, дни

Рисунок 10 - Протективный эффект иммунизации мышей клетками штаммов М. tuberculosis AABCD и M.bovis БЦЖ (1,Зх103 КОЕ), контроль -неиммунизированные мыши

На всем протяжении эксперимента значение показателя КОЕ у неиммунизированных животных на порядок превышало аналогичное значение у иммунизированных мышей. У мышей, иммунизированных вакциной БЦЖ, на 10-й день после повторного инфицирования клетками штамма М. tuberculosis H37Rv обсемененность легких была значительно меньше, чем у

мышей, иммунизированных штаммом М. tuberculosis H37Rv AABCD, но к 30-му дню обсемененность легких в обеих группах животных сравнялась, и в дальнейшем колебалась на уровне около Iх 105 КОЕ.

Таким образом, штамм М. tuberculosis H37Rv, лишенный четырех генов -rpfA, rpfB, rpfC и rpfD, защищал мышей против туберкулезной инфекции, и может быть в дальнейшем использован в качестве перспективного для создания противотуберкулезной вакцины нового поколения

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, разработана и апробирована в эксперименте модель мышиного хронического туберкулеза, вызываемого внутрибрюшинным введением возбудителя туберкулеза. Использование данной модели позволяет изучать влияние различных факторов и веществ на течение хронической туберкулезной инфекции. Кроме того, эта модель может быть использована для сравнения разных штаммов туберкулезного микроба, в том числе - мутантных по разным генам, что позволит получить новые знания о молекулярной организации туберкулезного микроба, а также проводить тестирование новых штаммов, не способных к активации, для отбора кандидатов на создание вакцины нового поколения. В ходе проведенного исследования показана роль генов rpf, в активации латентного туберкулеза. На данной модели подтверждено, что иммуномодуляторы способны влиять на процесс активации хронического туберкулеза.

ВЫВОДЫ

1. Разработана модель внутрибрюшинного заражения мышей, приводящая к устойчивой хронической туберкулезной инфекции. Данные, полученные при внутрибрюшинном заражении, дают высокую повторяемость и близки к результатам, полученным при аэрозольном заражении. Внутрибрюшинная модель более удобна в использовании, позволяет работать с большим количеством животных и не требует дорогостоящего оборудования.

2. Показано, что мутантные штаммы М. tuberculosis H37Rv, лишенные двух-пяти генов rpf, обладают пониженной вирулентностью по сравнению с исходным штаммом. Туберкулезная инфекция, вызванная ими, протекает менее остро и характеризуется более низкими уровнями обсемененности микобактериями внутренних органов мышей.

3. Показана активация хронической туберкулезной инфекции, вызванной лабораторным штаммом М. tuberculosis H37Rv и его производными, лишенными двух генов rpf, под действием иммуномодуляторов аминогуанидина и анти-ФНОа моноклональных антител и ЛПС. Активации инфекции, вызванной мутантными штаммами М. tuberculosis H37Rv, лишенными трех-четырех генов rpf, названными иммуномодуляторами не наблюдалось.

4. Разработаны и внедрены на учрежденческом уровне методические рекомендации по использованию мышиной внутрибрюшинной модели хронического туберкулеза для изучения иммуномодулирующих веществ.

5. Показано, что мутантный штамм М. tuberculosis H37Rv, лишенный четырех генов - rpfA, rpfB, rpfC и rpfD, обладает протективными свойствами для мышей против туберкулезной инфекции, и может быть использован в качестве перспективного для создания противотуберкулезной вакцины нового поколения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации: а) статьи в реферируемых журналах

1. Моделирование хронической туберкулезной инфекции у мышей методом внутрибрюшинного заражения и анализ активации аминогуанидином мутантов штамма H37RV с делециями по генам rpf / П.А. Шрам ко, Н.С. Грищенко, Т.И. Рудницкая, В.Д. Потапов, A.C. Капрельянц, С.Ф. Бикетов // Туберкулез и болезней легких, № 4, 2010. -С. 47-50.

б) другие публикации

2. Исследование эффективности внутрибрюшинного метода заражения мышей возбудителем туберкулеза с целью получения модели хронической инфекции / П.А.Шрамко, Н.С. Грищенко, Т.И. Рудницкая,

B.Д. Потапов, А.С. Капрельянц, С.Ф. Бикетов // Биологическая безопасность в современном мире (Материалы научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора), Оболенск, 2009. - С. 209-211.

3. Воздействие иммунодепрессантов на течение хронической туберкулезной инфекции у мышей / В.Д. Потапов, П.А. Шрамко // Биология-наука XXI века (Сборник тезисов 13-й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых), Пущино, 2009. - С. 129.

4. Анализ активации аминогуанидином хронической туберкулезной инфекции у мышей зараженных нокаутными по Rpf генам мутантами штамма H37Rv / В.Д. Потапов, П.А. Шрамко // Биология-наука XXI века (Сборник тезисов 13-й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых), Пущино, 2009. - С. 216-217.

5. Воздействие иммунодепрессантов на течение хронической туберкулезной инфекции у мышей / П.А.Шрамко, С.Г. Аббасова, Н.С. Грищенко, Т.И. Рудницкая, В.Д. Потапов, А.С. Капрельянц,

C.Ф. Бикетов, И.А. Дятлов // Современные проблемы инфекционной патологии: сб. науч. тр. - Минск, 2009 г. Вып.2. - С. 482-486.

6. Анализ активации хронического туберкулеза у мышей, зараженных мутантами штамма H37Rv с делециями генов Rpf, под действием антител к ФНОа / П.А. Шрамко, В.Д.Потапов, Т.И. Рудницкая, Н.С. Грищенко // Биология-наука XXI века (Сборник тезисов 14-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых), Пущино, 2010. - С. 195196.

7. Изучение протективного эффекта штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv с делециями пяти генов rpf / П.А.Шрамко,

21

Т.И. Комбарова, Н.С. Грищенко, Т.И. Рудницкая, В.Д. Потапов // III Ежегодный всероссийский конгресс по инфекционным болезням, г. Москва, Россия, 28 - 30 марта 2011 г. - С. 412-413.

8. Исследование дормантных форм Mycobacterium tuberculosis на новой модели латентного туберкулезного процесса у мышей / П.А. Шрамко, В.Д.Потапов, Н.С. Грищенко, Т.И. Рудницкая // 15-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» г. Пущино, Россия, 18 - 22 апреля 2011 г. - С. 205.

9. Аэрогенный способ применения средств на основе липосом / В.Д. Потапов, О.И. Чубатова, П.А. Шрамко, Т.И. Комбарова // 12 международный форум и выставка «Высокие технологии XXI века», Москва, 2011.-С. 410-413.

Благодарности

Приношу свою искреннюю благодарность моим научным руководителям члену-корреспонденту РАМН, доктору медицинских наук, профессору И.А. Дятлову и кандидату биологических наук В.Д. Потапову за помощь в формировании научной концепции работы.

Считаю своим долгом выразить искреннюю благодарность моим соавторам - сотрудникам лаборатории аэробиологических исследований Грищенко Н.Г. и Рудницкой Т.И., принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации.

Благодарю ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" 2009-2013гг. (Государственный контракт N0. 14.740.11.0246) за финансовую поддержку исследований.

Приношу искреннюю признательность ведущей организации, официальным оппонентам и всем рецензентам настоящей работы за высказанные замечания, заданные вопросы и сделанные поправки, которые, по возможности, были учтены.

Подписано в печать:

22.01.2012

Заказ № 6565 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 , 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шрамко, Павел Александрович, Оболенск

61 12-3/581

Министерство з/ ^ ____иального развития

Российской Федерации

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей

и благополучия человека Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии

и биотехнологии»

На правах рукописи

ШРАМ КО

Павел Александрович

РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОТБОРА ПЕРСПЕКТИВНЫХ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Специальности: 03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: чл.-корр. РАМН, д-р мед. наук, профессор

Дятлов Иван Алексеевич

канд. биол. наук

Потапов Василий Дмитриевич

ОБОЛЕНСК-2012

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ 5

ВВЕДЕНИЕ 7

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1.1. Особенности клеточного иммунитета при туберкулезной инфекции 16

1.1.1. Макрофаги - первичное звено иммунной системы в туберкулезном процессе 17

1.1.2. Т-лимфоциты - основные эффекторные клетки в противотуберкулезном иммунитете 22

1.1.3. Радикальные окислительные процессы в фагоцитах. Роль N0 в патогенезе туберкулеза 25

1.1.4. ФНОа и его роль в воспалительном процессе при туберкулезной инфекции 30

1.2. Иммуносупрессирующие факторы, влияющие на течение инфекционного процесса 34

1.2.1. Факторы, влияющие на индуцибельную Ж)-синтазу 34

1.2.2. Иммуносупрессирующее действие анти-ФНОа антител 36

1.2.3. Иммуносупрессирующее действие ЛПС 37

1.3. Моделирование туберкулезного инфекционного процесса 40

1.3.1. Особенности течения туберкулезной инфекции у мышей 43

1.3.2. Латентное и хроническое течение туберкулезного процесса у мышей 45

1.3.3. Молекулярные механизмы, отвечающие за переход микобактерий в активное состояние 48

1.4. Использование живых вакцин для иммунопрофилактики

туберкулеза 50

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 56

Глава 2. Материалы и методы 57

Глава 3. Сравнительная характеристика внутрибрюшинной и аэрозольной модели в инфицировании мышей с целью получения хронического течения туберкулезной инфекции 66 Глава 4. Развитие туберкулезной инфекции, вызванной штаммом М tuberculosis H37Rv и его мутантами, без воздействия иммунодепрессантов 72

Глава 5. Закономерности развития туберкулезной инфекции у

мышей под действием иммунодепрессантов 75

5.1. Активация инфекционного процесса под действием аминогуанидина 75

5.2. Иммуномодуляция мышей, больных хроническим туберкулезом, моноклональными антителами, специфичными

к ФНОа 76

5.3. Воздействие ЛПС на течение туберкулезной инфекции 77

5.4. Изучение влияния иммунодепрессантов на формирование клеточного иммунного ответа в мышиной модели хронической туберкулезной инфекции 79

Глава 6. Закономерности развития у мышей туберкулезной инфекции, вызванной нокаутными вариантами штамма М. tuberculosis H37Rv, имеющими делеции rpf генов, под действием иммунодепрессантов 83

6.1. Изучение действия иммунодепрессантов на процесс хронической туберкулезной инфекции, вызванной мутантами штамма М. tuberculosis H37Rv по разным rpf генам 83

6.1.1. Активация инфекционного процесса аминогуанидином 83

6.1.2. Активация инфекционного процесса анти-ФНОа

моноклональными антителами 87

6.1.3. Активация инфекционного процесса

липополисахаридом 89

Глава 7. Изучение течения острого туберкулезного процесса у мышей, иммунизированных мутантными по генам rpf штаммами М. tuberculosis H37Rv 91

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 96

ВЫВОДЫ 97

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 98

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 117

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

АГ - аминогуанидин

БСА - бычий сывороточный альбумин

БЦЖ (BCG) - бацилла Кальметта и Герена

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ГНЦ ПМБ - Государственный научный центр прикладной

микробиологии и биотехнологии

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЛ - интерлейкин

ИФА - иммуноферментный анализ

ЗФР - забуференный физиологический раствор

К ДО 2-кето-З-дезоксиоктоновая кислота (К ДО)

КРС - крупный рогатый скот

КОЕ (cfu) - колониеобразующая единица (colony forming unit)

ЛПС - липополисахарид

МБТ - микобактерии туберкулеза

МНС (major - главный комплекс гистосовместимости

histocompatibility complex)

п.н. (bp)

ГТЧЗТ

ПЦР

ПЯЛ

СПОН

ФНО

ЯМР

7Н11

CD14

CD4+

- пара нуклеотидов (base pair)

- повышенная чувствительность замедленного типа

- полимеразная цепная реакция

- полиморфноядерные лейкоциты Синдром полиорганной недостаточности

- фактор некроза опухолей

- ядерный магнитный резонанс

- питательная среда Middelbrook

- специфический рецептор ЛПС из семейства CD на поверхности иммунокомпетентных клеток

- популяция Т-лимфоцитов, имеющих рецептор CD4

CD8+ - популяция Т-лимфоцитов, имеющих рецептор CD8

dNTP - дезоксирибонуклеотидтрифосфат

ELISA - (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) -

твердофазный иммуноферментный анализ

GTAB - гексадецилтриметиламмония бромид

in vitro - эксперимент "в пробирке", без использования

животных

in vivo - эксперимент на животных

MUF - мурамовая кислота

NAG - N-ацетил глюкозамин

NFkB - ядерный транскрипционный фактор

NKT - natural killer Т cells - естественные Т-киллеры

NOS - NO-синтаза, нитроксидсинтаза

eNOS - эндотелиальная нитроксидсинтаза

iNOS - индуцибельная нитроксидсинтаза

nNOS - нейрональная нитроксидсинтаза

R/S - R (rough)/S (smooth) формы ЛПС

RNI - реактивные нитрогенные метаболиты

Rpf - Resustitation Promoting Facto - белки, вызывающие

активацию дормантных форм микобактерий

Thl - популяция Т-лимфоцитов, имеющих рецепторы Thl

Tel - популяция Т-лимфоцитов, имеющих рецепторы Tel

UNAIDS - Объединенная программа по ВИЧ и туберкулезу

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Туберкулез продолжает оставаться серьезной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Ежегодно приблизительно 1 млрд. человек контактирует с носителями данной инфекции и подвергается риску быть инфицированным туберкулезом, 8-10 млн. человек заболевают, и до 3 млн. человек умирают от туберкулеза. В ряде случаев заболевание и смерть являются результатом реактивации латентных форм туберкулезной инфекции. Реактивация латентного туберкулеза может произойти под воздействием неблагоприятных факторов, таких как хронический стресс, голод и другие состояния, а также заболеваний, приводящих к иммуносупрессивному эффекту, таких как СПИД, системные гематологические и онкологические заболевания. Кроме того, известны случаи активации туберкулезной инфекции после применения иммунодепрессантов.

Вакцина БЦЖ, применяемая для профилактики туберкулеза во всем мире, может быть небезопасна при действии иммунодепрессирующих факторов. В ряде исследований показано, что заболевание СПИДом может спровоцировать активацию вакцинного туберкулезного штамма и привести к смертельному исходу.

Известно, что туберкулезная инфекция может протекать не только в

активной форме, но и в латентной, когда возбудитель туберкулеза

присутствует в организме в виде дормантных (спящих) форм. В

последние годы были накоплены данные о молекулярных процессах

перехода микобактерий из дормантных форм в состояние активного

размножения, в частности, о роли в этом процессе лизоцимо-подобных

белков Rpf микобактерий. В лаборатории молекулярной

микобактериологии Национального Центра Здравоохранения ЮАР были

получены мутанты штамма Mycobacterium tuberculosis НЗ 7R v, в разной

7

степени утратившие способность к продукции одного или нескольких белков Rpf [74]. В экспериментах in vitro показано, что белки Rpf связаны с активацией хронической туберкулезной инфекции: выделяясь клетками микобактерий в окружающую среду, они воздействуют на клеточную стенку дормантных форм и вызывают их переход в активное состояние.

В настоящий момент представляет интерес изучение показанного in vitro активирующего эффекта белков Rpf на более сложном уровне - в организме теплокровных животных. Поэтому актуальной является задача создания модели туберкулезной инфекции на лабораторных животных, которая позволит охарактеризовать делеционные мутанты туберкулезного микроба по генам rpf, оценить их вирулентность для животных, а также описать особенности активации вызванной ими хронической инфекции под воздействием иммунодепрессантов. Представляет интерес также селекция вариантов микобактерий, не способных к активации в условиях иммунодепрессии, поскольку они могут быть использованы для создания рекомбинантных противотуберкулезных вакцин нового поколения.

Цель исследования - разработка мышиной модели хронической туберкулезной инфекции и изучение особенностей течения заболевания, вызванного делеционными мутантами М. tuberculosis по генам rpf в условиях иммуномодуляции.

Задачи исследования:

1. Разработать мышиную модель хронической туберкулезной инфекции.

2. Исследовать вирулентные свойства нокаутных по rpf генам мутантов штаммаМ tuberculosis H37Rv.

3. Изучить процессы активации туберкулезной инфекции под воздействием веществ, модулирующих иммунный ответ, на мышиной модели.

4. Разработать методические рекомендации по использованию мышиной внутрибрюшинной модели хронического туберкулеза для изучения иммуномодулирующих веществ.

5. Отобрать мутантные штаммы М. tuberculosis H37Rv, не способные к активации под воздействием иммуномодуляторов, и охарактеризовать их иммунногенные и протективные свойства.

Научная новизна

Исследованы особенности процессов течения туберкулезной инфекции, вызванной мутантными по rpf генам штаммами М. tuberculosis, на мышах с использованием двух моделей заражения: аэрогенной и внутрибрюшинной. Изучена активация туберкулезной инфекции, вызванной этими штаммами, обусловленная действием трех иммуномодуляторов (аминогуанидина, моноклональных анти-ФНОа антител и ЛИС Escherichia coli). Обнаружен протективный эффект против туберкулеза после иммунизации мышей клетками мутантного штамма М. tuberculosis H37Rv, лишенного генов rpf A, rpfii, rpfl2 и rp/D.

Практическая значимость

Создана мышиная внутрибрюшинная модель туберкулезной инфекции, которая позволяет изучать влияние различных факторов на течение хронического туберкулеза. Разработаны и внедрены на учрежденческом уровне методические рекомендации «Использование модели внутрибрюшинного заражения мышей для получения хронической туберкулезной инфекции», 2010 г. Депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ГКПМКК-Оболенск мутантный штамм М. tuberculosis H37Rv, лишенный генов rpf A, rpfB, rpfC и rpfD, в качестве перспективного для создания противотуберкулезной вакцины нового поколения.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработана модель внутрибрюшинного заражения мышей,

приводящая к устойчивой хронической туберкулезной инфекции.

9

2. Мутантные штаммы М. tuberculosis H37Rv, лишенные двух-пяти генов rpf обладают пониженной вирулентностью по сравнению с исходным штаммом.

3. Хроническая туберкулезная инфекция, вызванная лабораторным штаммом М. tuberculosis H37Rv и его производными, лишенными двух генов rpf, может быть активирована под действием иммуномодуляторов, чего не наблюдается в случае инфекции, вызванной мутантными штаммами, лишенными трех-четырех генов

rpf

4. Мутантный штамм М. tuberculosis H37Rv, лишенный четырех генов rpf обладает протективными свойствами для мышей против туберкулезной инфекции, и может быть использован в качестве перспективного для создания противотуберкулезной вакцины нового поколения.

Личный вклад соискателя

Все эксперименты по низкодозовому аэрозольному заражению мышей, ПЦР-анализ штаммов и измерение уровня ФНОа в препаратах органов, выполнены автором лично. Кроме того, автор принимал участие в планировании экспериментов, разработке внутрибрюшинной модели заражения и в определении вирулентности штаммов микобактерий при этом типе введения возбудителя, совместно с сотрудниками ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» (Оболенск) и института биохимии им. А.Н. Баха РАН (Москва). Статистическая обработка, анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.

Апробация работы

Результаты работы представлены на семи международных и

российских научных конференциях: научно-практической конференции

молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений

Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире»,

10

Оболенск, 2009; 13-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2009; Современные проблемы инфекционной патологии - Минск, 2009; 14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2010; III Ежегодном всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 2011; 15-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2011; 12-ом международном форуме и выставке «Высокие технологии XXI века», Москва, 2011.

Диссертация апробирована на межлабораторном научном семинаре ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии -протокол № 18 от 21 ноября 2011 г.

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, в том числе одна статья в рецензируемом журнале из перечня ВАК и 8 публикаций в сборниках, трудах и материалах конференций.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 118 страницах. Список цитируемой литературы включает 169 наименований. Иллюстративный материал содержит 28 рисунков и две таблицы.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В настоящее время туберкулез продолжает оставаться серьезной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Ежегодно приблизительно 1 млрд. человек подвергаются риску инфицироваться туберкулезом, 8-10 млн. заболевают и до 3 млн. человек умирают от этой инфекции [78; 96].

Туберкулез (от лат. - tuberculum - бугорок) - это хроническое инфекционное гранулематозное заболевание, вызываемое микобактериями туберкулеза (МБТ) с определенными закономерными фазами развития. В 90-95 % случаев туберкулезные изменения локализуются в органах дыхания. Но туберкулез может поражать все органы и системы человека (периферические лимфоузлы, кожу, глаза, костно-суставную, мочеполовую, нервную системы, желудочно-кишечный тракт и др. органы) [9; 16].

Для всех локализаций туберкулеза характерны общие признаки: хроническое течение, склонность к возникновению латентных форм, полиморфизм клинических проявлений, относительность иммунитета, тенденция к внутриклеточному расположению возбудителя, периодические рецидивы болезни (в том числе при старении организма), выраженное влияние на течение болезни внешней среды [23; 9].

Возбудителями туберкулеза являются кислотоустойчивые бактерии рода Mycobacterium. Всего известно 74 вида таких микобактерий. Они широко распространены в почве, воде, в организмах млекопитающих и птиц. Однако туберкулез у человека может быть вызван бактериями, принадлежащими к группе патогенов, включающей в себя виды: М. tuberculosis (человеческий вид), М. bovis (бычий вид), М. africanum, М. bovis BCG (БЦЖ-штамм), М. microti и М. canetti. В последнее время к

этой группе отнесены также бактерии видов М. pinnipedii и М. саргае, филогенетически близкие к видам М. microti и М. bovis[32; 3].

Микобактерии относятся к прокариотам, форма клетки - слегка изогнутая или прямая палочка размером 1-10 мкм х 0,2-0,6 мкм, концы которой слегка закруглены. Обычно клетки микобактерий длинные и тонкие, но клетки вида М. bovis более толстые и короткие. По отношению к присутствию кислорода вид М. tuberculosis является аэробом, а виды М, bovis и М. africanum - аэрофилами. Все микобактерии неподвижны, не образуют микроспор и капсул [32].

В микроструктуре бактериальной клетки выделяются: 1) микрокапсула - стенка из 3-4 слоев толщиной 200-250 нм, прочно связанная с клеточной стенкой, состоящая из полисахаридов, защищающая микобактерию от воздействия внешней среды; микрокапсула не обладает антигенными свойствами, но проявляет серологическую активность; 2) клеточная стенка - ограничивает микобактерию снаружи, обеспечивает стабильность размеров и формы клетки, механическую, осмотическую и химическую защиту, включает в себя факторы вирулентности - фосфатидную фракцию липидов, с которой и связывают вирулентные свойства микобактерий;

3) бактериальная цитоплазма без видимых структур;

4) цитоплазматическая мембрана, включающая липопротеиновые комплексы и ферментные системы, которая формирует внутрицитоплазматическую мембранную систему (мезосому); 5) ядерная субстанция, включающая хромосому и плазмиды [32; 23].

Главными носителями антигенных свойств микобактерий являются белки (туберкулопротеиды), которые могут быть выявлены в макроорганизме с помощью специфической реакции повышенной

чувствительности замедленного типа (ПЧЗТ). Наиболее известным среди этих бел