Конструирование вакцинных штаммов Francisella tularensis, экспрессирующих протективные антигены Ag85B и ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis, и изучение их иммунобиологических свойств

Кравченко, Татьяна Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Конструирование вакцинных штаммов Francisella tularensis, экспрессирующих протективные антигены Ag85B и ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis, и изучение их иммунобиологических свойств
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование вакцинных штаммов Francisella tularensis, экспрессирующих протективные антигены Ag85B и ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis, и изучение их иммунобиологических свойств"

На правах рукописи

КРАВЧЕНКО Татьяна Борисовна

КОНСТРУИРОВАНИЕ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ FRANCISELLA TULARENSIS, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ПРОТЕКТИВНЫЕ АНТИГЕНЫ Ag85B И ESAT-6 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕКИХ СВОЙСТВ

03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□ОЗ 1~? 12 АО

Москва-2008

003171240

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и безопасности человека Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук Павлов Виталий Михайлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Денисов Александр Александрович доктор медицинских наук Степанов Алексей Вячеславович

Ведущая организация ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н Ф Гамалеи РАМН

Защита состоится «_» _ 2008 года в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 001 035 01 при ГУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им И И Мечникова» РАМН по адресу г Москва, Малый Казенный пер , 5 а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Научно-исследовательский инстшут вакцин и сывороток им И И Мечникова» РАМН

Автореферат разослан"_"_2008 г

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

И В Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Повышенное внимание к проблеме туберкулеза в последние годы обусловлено увеличением заболеваемости этой инфекцией не только в развивающихся странах, но и в благополучных государствах При неблагополучных социально-экономических условиях жизни и организации противотуберкулезной помощи населению в России прогнозируется продолжение ухудшения эпидемической обстановки и увеличение заболеваемости к 2010 г более чем в 2 раза (Шилова, 2001)

Для специфической профилактики туберкулеза в России и за рубежом используются препараты единственной живой вакцины BCG, приготовленной па основе аттенуированного штамма Mycobacterium bovis (Митинская, 2001) Эффективность вакцинации препаратами BCG варьирует от 0 % до 80 % и в среднем составляет 50 % (Colditz et al, 1994, Roche et al, 1995) Создание новой улучшенной туберкулезной вакцины становится приоритетом национальных исследований (Castro, 1998) Работы последних лет позволили определить последовательность генома Mycobacterium tuberculosis, а также определить детерминанты протективного иммунитета (Horwitz et al, 1995, Kanyoneeia/, 1999) Использование технологии рекомби-нантных ДНК, синтетических пептидов, антиген-специфических антител, Т-клеток и т д позволило идентифицировать несколько основных антигенов М tuberculosis, таких, как белки теплового шока Hsp 60 и Hsp 70 (Huygen, 2003, Карягина и др , 2004), белки комплекса Ag85 (Wiker, Harboe, 1992), ESAT-6 (Sarensen et al, 1995), CFP-10 (Skjot et al, 2000) и др Экспрессия этих белков в гетерологичных векторах и их иммунологическая оценка обеспечила бы возможность выявления антигенов М tuberculosis, наиболее важных для разработки новых вакцин и специфических диагностических препаратов

Поскольку активация клеточного иммунитета является основой для формирования противотуберкулезного иммунитета (Cooper, Flynn, 1995, Воробьев, Медуни-цын, 1995, Ярилин, 1999, Lazarevic, Flynn, 2002, Flynn, 2004), соответствующим образом подобранные адьюванты и системы доставки антигенов способствовали бы решению проблем, связанных с недостатками, присущими вакцине BCG Одним из наиболее перспективных подходов является создание генно-инженерными методами вакцинных штаммов для защиты от нескольких инфекций одновременно на основе

штаммов, полученных путем встраивания в их геном генетических конструкций, контролирующих чужеродные антигены, важные для активации клеточного иммунитета В качестве вакцииных векторов используют живые аттенуированные штаммы M tuberculosis (Ellner, 1998, Senaratne et al, 2007, Henao-Tamayo et al, 2007) и сальмонелл (Mollenkopf<?( al, 2001), а также близкородственные микобактерии (Abou-Zeid et al.f 1997), ряд вирусов (Malin et al, 2000; McShane et al 2005, Fattorim, 2007) и другие микроорганизмы (Miki et al, 2004)

Известно, что живая туляремийная вакцина, созданная на основе штамма Francisella tularensis 15/10, способна вызывать интенсивную перестройку гуморального и клеточного звеньев иммунной системы, обеспечивая создание длительного напряженного иммунитета при умеренной реактогенности вакцины (Олсуфьев и др, 1975) Кроме специфического иммунитета, этот штамм индуцирует кратковременную неспецифическую защиту против других внутриклеточных патогенов, таких как листерии и легионеллы (Belyi et al, 1996J Клетки вакцинного штамма туляремийно-го микроба способны размножаться в организме экспериментального животного, иммунизированного вакциной BCG, позволяя повысить иммунный ответ наэкспрес-сируемые рекомбинантными штаммами протективные антигены M tuberculosis Вышеперечисленные характеристики штамма F tularensis 15/10 дают возможность считать оптимальным использование его в качестве бактериального вектора для конструирования живых туберкулезных вакцин

Вопрос о выборе антигенов для конструирования туберкулезной вакцины достаточно сложен Ранее изучены иммунологические свойства широкого спектра белков M tuberculosis Одним из наиболее иммуногенных считается секретируемый активно размножающимися микобактериями белок Ag85B - один из трех компонентов комплекса Ag85 (Kariyone et al, 1999) Белки этого комплекса являются ферментами миколил-трансферазами, играющими существенную роль в синтезе клеточной стенки бактерии Однако функция комплекса и его значение в патогенезе туберкулеза еще не выяснены Другой белок - ESAT-6, секретируемый M tuberculosis на ранней стадии роста (Sorensen et al, 1995), представляет собой важный Т-клеточный антиген, распознаваемый протективными Т-клетками на моделях экспериментального туберкулеза Данные антигены выбраны как модель для изучения возможности их экспрессии в клетках F tularensis 15/10 и изучения перспектив использования туля-

ремиймой вакцины в качестве бактериального вектора при создании вакцинных штаммов для профилактики туберкулеза

Цель работы - конструирование вакцинных штаммов Francisella tularensis с экспрессией протективных антигенов Ag85B и ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis и изучение их иммунобиологических свойств

Задачи исследования

1 Конструирование штаммов Escherichia coli, экспрессирующих реком-бинантные белки Ag85B-(His)6 и ESAT-6-(His)6

2 Выделение и очистка антигенов Ag85B-(I Iis)6 и ESAT-6-(I hs)6 из ре-комбинантных штаммов Е coli, получение антисывороток к ним и оценка их иммунологической специфичности

3 Конструирование на основе вакцинного штамма F tularensis 15/10 ре-комбинантных штаммов RVpl7 и RVpl8 с генами, кодирующими синтез слитных белков FL-Ag85B и FL-Ag85B-ESAT-6, и определение уровня экспрессии этих белков

4 Оценка стабильности вакцинных штаммов F tularensis RVpl7 и RVpl8

in vivo

5 Определение уровня активации гуморального и клеточного звеньев иммунитета мышей, иммунизированных штаммами F tularensis RVpl7 и RVpl8

6 Изучение протективности полученных штаммов F tularensis RVpl7 и RVpl8 на модели легочной формы экспериментальной туберкулезной инфекции мышей

Научная новизна

Впервые получены вакцинные штаммы F tularensis 15/10, экспрессирующие гены протективных микобактериальных антигенов Ag85B и ESAT-6

Впервые охарактеризован иммунный ответ у мышей, иммунизированных вакцинными штаммами F tularensis 15/10, экспрсссирующими антигены Ag85B и Ag85B-ESAT-6

Впервые показана протективность сконструированных вакцинных штаммов F tularensis 15/10, экспрессирующих антигены микобактерий Ag85B и Ag85B-ESAT-6, на мышиной модели легочной формы экспериментальной туберкулезной инфекции

Практическая значимость работы.

Создана модельная система для изучения вакцинных свойств протективных антигенов Ag85B и ESAT-6 с использованием в качестве живого бактериального вектора вакцинного штамма F tularensis 15/10 Сконструированные штаммы на основе вакцинного штамма F tularensis 15/10, экспрессирующие протективные антигены микобактерий, дают возможность получить новую информацию, необходимую для создания живых туберкулезных рекомбинантных вакцин Микобактериальные рекомбинаитные антигены Ag85B-(His)6 и ESAT6-(His)6, экспрессируемые бактериальными клетками Е coli, и полученные к ним специфические антитела могут быть использованы для совершенствования систем диагностики туберкулеза.

Внедрение результатов работы

В коллекции живых культур ФГУН "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" депонированы два авторских штамма-Е coli - продуценты рекомбинантных микобактериальных белков Ag85B-(His)6 и ESAT6-(His)6, и три авторских штамма F tularensis pPMCl, F tularensis RVp17 и F tularensis RVp 18, использованные для изучения перспективности применения ту-ляремийной вакцины в качестве бактериального вектора при создании живых туберкулезных вакцин

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного университета

Депонированы в GenBank нуклеотидные последовательности двух генов, кодирующих слитные белки FL-Ag85B и FL-Ag85B-ESAT6, которые экспрессиру-ются вакцинными штаммами F tularensis RVp 17 и F tularensis RVp IX [http //www nebí nlm nih gov/sites/entrez]

Положения, выносимые на защиту:

1 Антитела к рекомбинантным белкам Ag85B-(His)6 и ESAT-6-(His)6 распознают иммунологические эпитопы в микобактериальных белках Ag85B и ESAT-6

2 Созданы рекомбинаитные плазмиды для эффективной экспрессии микобактериальных протективных антигенов Ag85B и ESAT-6 в клетках туляре-мийного микроба

3 Иммунизация мышей вакцинными штаммами F tularensis RVpl7 и RVpl8, экспрессирующими микобактериальные белки Ag85B и ESAT-6, приводит к индукции специфического клеточного иммунного ответа как к туляремий-ным, так и к микобактериальным антигенам

4 Рекомбинантные штаммы F tularensisRVpl7 и RVpl8 защищают мышей от легочной формы экспериментального туберкулеза с эффективностью, сопоставимой с эффективностью вакцины BCG

5 Сконструированные вакцинные штаммы F tularensis KVpll и RVpl8 можно рассматривать в качестве прототипов перспективной живой туберкулезной вакцины

Апробация работы Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ 2 апреля 2008 года. Материалы диссертации доложены и представлены на 6 научных конференциях 4th International Conference on Tularemia (City of Bath, UK, 2003), 1st International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology "BioMicroWorld-2005" (Badajoz, Spain, March 1518,2005), 3-м Московском международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2005 г), VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5 октября 2006 г, Обо-ленск, Московская обл), NIAID Research Conference (Opatia, Croatia, June 24-30, 2006), 5th International Conference on Tularemia Manne Biological Labs (Woods Hole, MA, USA, November 1-4,2006)

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 7 научных работах

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и их обсуждение, выводов и списка литературы, включающего 30 работ отечественных и 248 работ зарубежных авторов Работа иллюстрирована 21 рисунком и 4 таблицами

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследования проведены на 11 лабораторных штаммах, из которых штаммы F tularensis 15/10, М tuberculosis H37Rv, М tuberculosis H37Ra, М bovis BCG,

E coli BL21(DE3), E coli JM83 получены из Коллекции живых культур ФГУН ГНЦ ПМБ (Оболенск, Московская обл), а 4 штамма Е coli BL21(pET23-85B), Е coli BL21 (pET24-ES), F tularensis pPMCl, F tularensis RVpl7 и F tularensis RVpl8 - в настоящем исследовании Экспрессирующиеся векторы pET23b(+), pET24b(+) и плазмида pBlu2SKM приобретены в фирме «Novagen» (США) Плазмиды pFNLlO, рС194 и pUC57 получены из Коллекции живых культур ФГУН ГНЦ ПМБ

Мышиные макрофагоподобные клетки линии J774 Al получены из Российской коллекции культур клеток позвоночных Института цитологии РАН (РККК ИЦ РАН, г. С -Петербург, Россия)

Праймеры для клонирования синтезированы биотехнологической компанией «Синтол» (г Москва, Россия)

Штаммы Е coli BL21(DE3) и JM83 культивировали при температуре 37 °С на жидкой или плотной питательной среде Лурье-Бертани (LB) (Himedia, Индия) с добавлением соответствующих антибиотиков Штаммы F tularensis культивировали при температуре 37 °С на плотной среде Эритрит-агар с добавлением высушенной крови крупного рогатого скота (ФГУН ГНЦ ПМБ) В среды вносили антибиотики полимиксин - 50 мкг/мл и хлорамфеникол - 3 мкг/мл

Штаммы М bovis BCG и М tuberculosis H37Ra культивировали на глицерин-альбуминовой среде без добавления Tween-20 при температуре 37 °С в течение 20 дней в атмосфере 5 % С02 до достижения оптической плотности (ОПбоо)~0,5 Штамм М tuberculosis H37Rv культивировали на жидкой питательной среде Middlebrook 7Н9 Medium или на плотной агаризованной среде Middlebrook 7Н11 Agar Base (Himedia, Индия) при температуре 37 °С в течение 20 дней в атмосфере 5 % С02 до достижения ОГ1«ю~0,5

Мышиные макрофагоподобные клетки линии J774 Al культивировали в 24-луночных планшетах для культуры ткани со средой Игла в модификации Дульбекко (DMEM, Sigma, США) с добавлением 10 % инактивированной фетальной сыворотки теленка и 2 мМ глутамина при температуре 37 °С и атмосфере 5 % С02 Лимфоциты экспериментальных животных культивировали в 96-луночных планшетах для культуры ткани в полной среде RPMI-1640 (Sigma, США) с добавлением 5 % фетальной

сыворотки, 2 мМ глутамипа, 100 мкг/мл гентамицина при температуре 37 °С и атмосфере 5 % С02

Выделение ДНК и трансформацию клеток Е coli проводили по руководству MaHHaTHcf и др , [1984] Трансформацию клеток F tularensis плазмидной ДНК выполняли методом электропорации (Pomerantsev et al, 2001) Рестрикцию, дотирование, выделение фрагментов из агарозного геля осуществляли в соответствии с руководством Маниатиса и др, [1984] и инструкций производителей Ферменты для рестрикции и лигирования приобретены в фирме «Ферментас» (Латвия) ПЦР проводили с использованием термоциклера Gene Amp PCR System 2700 (Applied Biosystems, США) Сиквенс ДНК осуществляли на секвенаторе ALF express II (Am-ersham Pharmacia Biotech, США) Расчет праймеров и молекулярных масс клонированных белков выполняли с использованием компьютерной программы Vector NTI Suite 8 InforMax, Inc (США)

Количество белка оценивали по методу Lowry et al [ 1951 ] с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина Электрофоретическое разделение белков проводили в денатурирующих условиях в 12,5 % или 15 % полиакри-ламидном геле (Ds-Na ПА А Г) по методу Laemmli [1970] Для электрофоретического анализа рекомбинантных штаммов применяли суспензии бактериальных клеток, стандартизованные по ОПМо Дополнительную очистку белка для использования в качестве антигена при постановке реакции бласттранформации лимфоцитов (РБТЛ) проводили элюцией из Ds-Na-ПААГ Вестерн-блотгинг осуществляли по методу Towbin et al, [1979] поликпональными мышиными антисыворотками к рекомби-нантным белкам Ag85B-(His)6 или ESAT-6-(His)¿ в рабочих разведениях, 1 ч при температуре 37 °С Для выявления антител мембрану инкубировали с конъюгатом овечьих антимышиных антител с пероксидазой хрена (Amersham Bioscience, США) в течение 1 ч при температуре 37 °С, затем окрашивали в растворе субстрата для пе-роксидазы хрена 3,3'-диаминобензидин тетрагидрохлорида (Sigma, США)

Экспрессию и очистку рекомбинантных белков проводили согласно инструкции производителя векторов рЕТ23Ь(+) и pET24b(+) (Novagen, США) Синтез рекомбинантных белков индуцировали добавлением в культуральную среду изопро-пил-Р-Б-галактопиранозида (ИПТГ) (Amersham Pharmacia Biotech Inc, США) до конечной концентрации 2 мМ с последующим культивированием в течение 2,5 ч Ре-

комбинантные белки очищали аффинной хроматографией на хелатирущем носителе Ni2+NTAHisBind® SuperfIow™(Pharmacia Biotech, Швеция) по протоколу фирмы-производителя Белок Ag85B-(His)6 элюировали линейным градиентом имидазола 5 мМ-0,5 М, а белок ESAT-6-(His)6 - ступенчатым снижением рН буфера до 6,0, 5,3, 4,0, 3,5 и 3,0 Полученные фракции анализировали 12,5 % или 15 % Ds-Na-ПААГ-электрофорезом

Секретируемые белки микобактерий выделяли по методу Horwitz etal [1995] Суммарный антиген туляремийного микроба для постановки реакции бласт-трансформации получали обработкой ультразвуком суспензии бактериальных клеток 1 109 КОЕ/мл в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) на дезинтеграторе СР501 (Cole-Parmer, США) Суммарный растворимый антиген туляремийного микроба для постановки иммуноферментного твердофазного анализа (ИФА) готовили аналогично, клеточный дебрис удаляли центрифугированием

ИФА проводили согласно руководству (Enzyme-mediated immunoassay, 1988) В качестве адсорбированных антигенов были использованы суммарный растворимый антиген туляремийного микроба, препарат белка Ag85B-(His)6, дополнительно очищенный электроэлюцией из Ds-Na-ПААГ, и очищенный белок ESAT-6-(His)6

Антисыворотку к белку Ag85B-(His)6 получали после двукратной подкожной иммунизации нелинейных мышей (по 5 животных в группе) 20 мкг белка в сроки 0 и 21 день с отбором сывороток через 7 дней после второй иммунизации Антисыворотку к белку ESAT6-(His)6 получали трехкратной подкожной иммунизацией нелинейных мышей (по 5 в группе) 30 мкг в сроки 0, 14 и 28 день, с отбором сывороток через 14 дней после третьей иммунизации Титры специфических антител в сыворотках животных определяли с помощью твердофазного ИФА

Размножение штаммов F tularensis в культурах эукариотических клеток оценивали на мышиных макрофагоподобных клетках линии J774 А1

Остаточную вирулентность рекомбинантных штаммов F tularensis определяли инфицированием конвенциональных мышей линии C57BL/6 (по 5 в группе, возраст 6-8 недель) подкожно штаммами F tularensis в дозах 10, 102, 103 и 104 КОЕ/мышь LD50 определяли по методу Кербера (Ашмарин, Воробьев, 1962)

Диссеминацию рекомбинантных штаммов F tularensis в организме экспериментальных животных оценивали после иммунизации конвенциональных мышей

линии C57BL/6 (по 12 в группе, возраст 6-8 недель) подкожно штаммами F tularensis в дозе 20 КОЕ/мышь На 3, 5, 7 и 10 сутки по 3 мыши из каждой группы были эвтаназированы ингаляцией С02 с последующей некропсией печени и селезенки и высевами гомогенатов органов

Стабильность наследования плазмид в штаммах F tularensis in vivo оценивали при иммунизации конвенциональных мышей линии C57BL/6 (по 5 в группе) подкожно однократно штаммами F tularensis в дозе 20 КОЕ/мышь Через 7 дней мышей из каждой группы эвтаназировали ингаляцией С02 и проводили некропсию селезенок с последующим высевом гомогенатов органов Для анализа отбирали не менее 10 изолированных клонов, в которых с помощью имуноблоттинга оценивали наличие экспрессии микобактериальных белков FL-Ag85B и FL-Ag85B-ESAT-6

Активацию гуморального звена иммунитета на 28 сутки после иммунизации определяли методом ИФА по титрам антител к рекомбинантным белкам в сыворотках мышей линии C57BL/6 категории SPF (свободных от специфических патоге-нов)(по 5 в группе), иммунизированных подкожно штаммами F tularensis в дозе 20 КОЕ/мышь

Активацию клеточного звена иммунитета оценивали методом РБТЛ (Mishell, Shngi, 1980) и оценкой уровня экспрессии IFN-y спленоцитами иммунных мышей Мышей линии C57BL/6 категории SPF (по 5 в группе) иммунизировали однократно подкожно штаммами F tularensis в дозе 20 КОЕ/мышь На 28 сутки после иммунизации мышей эвтаназировали ингаляцией С02, проводили некропсию селезенок и выделяли спленоциты по методике (Andersen et al, 1991) Пролиферацию спленоци-тов в ответ на стимуляцию антигенами оценивали по включению Н3-тимидина Результаты представлены в виде индексов стимуляции клеток (ИСК)

Для определения уровня синтеза IFN-y спленоцитами предварительно готовили антиген-презентирующие клетки (АПК) из костно-мозговых макрофагов (КММ) неиммунных мышей C57BL6 (категории SPF), полученных по методике (Bosio, Е1-kins, 2001) Монослой КММ использовали в качестве антиген-презентирующих клеток Группы мышей линии C57BL/6 категории SPF (по 5 в группе) иммунизировали подкожно штаммами F tularensis в дозе 20 КОЕ/мышь На 28-й день после иммунизации из селезенок выделяли спленоциты В подготовленный монослой АПК вносили объединенный в группе пул мышиных спленоцитов в концентрации 5 106кл/мл

и инкубировали 72 ч при 37 °С и атмосфере 5 % С02 Уровень экспрессии IFN-y в супернатантах спленоцитов иммунных мышей оценивали с помощью набора Interferon gamma [(mlNFy], Mouse ELISA BiotrakTM System] по методике фирмы-производителя (Amersham Biosciences, Великобритания)

Протективность рекомбинантных штаммов F tularensis оценивали на мышиной модели аэрозольного экспериментального туберкулеза на установке Glas-Col Inhalation Exposure System 099C (Terre Haute, США, модель 4224), которая обеспечивала введение 100-300 КОЕ в легкие мыши при экспозиции 30 мин Мышей линии C57BL/6 категории SPF (по 5 в группе) иммунизировали штаммами F tularensis подкожно в дозе 20 КОЕ/мышь Контрольную группу мышей иммунизировали штаммом M bovis BCG подкожно в дозе 106 КОЕ/мышь На 28 сутки после иммунизации проводили аэрозольное заражение животных всех групп штаммом M tuberculosis H37Rv Через 28 суток после заражения животных эвтаназировали ингаляцией СО2 с некропсией легких и селезенки и определяли число бактерий после высева гомогенатов органов Результаты экспериментов представлены как среднее значение (X) с указанием величины стандартного отклонения (5) Достоверность отличий определяли по /-критерию Стьюдента (р<0,05) с помощью статистических программ Windows Excel

Результаты исследования

Конструирование рекомбинантных плазмид и экспрессия рекомбинантных белков Ag85B-(His)6 и ESAT-6-(His)6 в клетках Е. coli. С помощью ПЦР-мутагенеза, использования ДНК штамма M tuberculosis H37Rv в качестве матрицы и соответствующих праймеров был синтезирован ген, кодирующий синтез зрелого белка Ag85B В результате встраивания структурной части гена белка Ag85B в плаз-мидный вектор рЕТ23Ь(+) получен гибридный ген, кодирующий белок с рассчитанной молекулярной массой 33 428 Да (308 аминокислот), состоящий из 17 аминокислот вектора рЕТ23Ь(+), 285 аминокислот зрелого белка Ag85B и последовательности из 6 His на С-конце молекулы Рекомбинантную плазмиду рЕТ-85В передали в клетки Е coli BL21(DE3) методом электропорации и получили штамм Е coli BL2](pET23-85B) Нуклеотидная последовательность клонированного в векторе рЕТ23Ь(+) фрагмента соответствовала последовательности гибридного гена

Экспрессию и очистку рекомбинантных белков проводили согласно инструкции производителя векторов рЕТ23Ь(+) и рЕТ24Ь(+) с небольшими изменениями. После индукции ИПТГ была выявлена основная полоса белка, находящегося в клетках Е. coli (рЕТ23-85В) в виде телец включений (рис 1, А). С помощью аффинной хроматографии на хелатирующем сорбенте был получен электрофоретически гомогенный препарат белка Ag85B-(His)6 с чистотой около 80 % (рис. 1, Б).

116,0 66,2

И-

45,0 35,0

25,0 18,4 14,2

ШР

12 3 4 12

А Б

Рис. 1. Экспрессия (А) и очистка рекомбинантного белка Ag85B-(H¡s)6 (Б)(12,5 % Ds-Na-ПААГ). А:1 - лизат клеток Е. coli BL21pET23b(+)85B до индукции; 2 -набор стандартных белков Sigma (66,0; 45,0; 36,0; 29,0; 24,0; 20,0 и 14,2 кДа); 3 - лизат клеток Е. coli BL21pET23b(+)85B после индукции; 4 - отмытые тельца включения. Б: 1 -набор стандартных белков Fermentas (Латвия); 2 - ренатурированный белок Ag85B-(His)ö.

Кажущаяся молекулярная масса белковой полосы рекомбинантного белка 32,7±0,6 кДа была близка к расчетному значению, следовательно, экспрессирован-ный в клетках штамма Е. coli BL21pET2b(+)85B белок соответствует рекомбинант-ному белку Ag85B-(His)6.

С помощью ПЦР-мутагенеза, использования ДНК штамма М. tuberculosis H37Rv в качестве матрицы и соответствующих праймеров синтезировали ген, кодирующий зрелый белок ESAT-6. В результате встраивания ПЦР-продукта в плазмидный вектор рЕТ24Ь(+)получили гибридный ген, кодирующий белок с расчетной молекулярной массой 10940 Да (103 аминокислоты), состоящий из 95 аминокислот зрелого белка ESAT-6, двух дополнительных аминокислот Leu и Glu и последовательности из 6 His на С-конце молекулы. Полученной рекомбинантной плазмидой pET24-ES трансформировали клетки Е. coli BL21(DE3) и в результате по-

лучили штамм Е. соИ ВЬ21(рЕТ24-Е8). Нуклеотидная последовательность клонированного в рЕТ24Ь(+) фрагмента соответствовала последовательности гибридного гена. После индукции ИПТГ в лизате штамма Е. соН ВЕ21рЕТ24Ь(+)Е5АТ-6 выявили полосу белка с молекулярной массой около 6 кДа (рис. 2, А). Проведение очистки белка с помощью аффинной хроматографии на хелатирующем сорбенте позволило получить электрофоретически гомогенный препарат белка Е8АТ-6-(Шэ)б с чистотой около 80 %.

97,0 - ► 66,0 * 45,0 —>

30.0 —► —

20.1 —► 14,4 —►

1 2 3 4 12 3

А Б

Рис. 2. Экспрессия (А) и очистка рекомбинантного белка ESAT-6-(His)6 (Б)(15 % Ds-Na-ПААГ). А: 1 - набор стандартных белков LMW Sigma, 2 - апротинин | (6,5 кДа); 3,4 -лизаты клеток Е. coli BL21pET24b(+)ESAT-6 после индукции. Б: 1 - набор стандартных белков Sigma LMW, 2 - апротинин (6,5 кДа); 3 - ренатурированный белок ESAT-6-(His)6.

Кажущаяся молекулярная масса рекомбинантного белка ESAT-6-(His)6 составила 6,0±0,5 кДа и оказалась почти на 4 кДа меньше расчетного значения, равного 10940 Да, что согласуется с данными Sorensen et al., [1995] о нативном белке ESAT-6, выделенном из штамма М. tuberculosis H37Rv, с рассчитанной молекулярной массой 9975 Да. Препараты очищенных белков Ag85B-(His)6 и ESAT-6-(His)6 использованы для получения мышиных специфических антител.

Получение специфических антител к рекомбинантным белкам Ag85B-(His)g и ESAT-6-(His)6 и их характеристика. Иммунизация рекомбинантным белком Ag85B-(His)6 привела к формированию в антисыворотках мышей высоких титров к антигену Ag85B-(His)6 в диапазоне 1 : 10240-1 :20480. Иммунизация рекомбинантным белком ESAT-6-(His)6 индуцировала невысокие значения титров антител в диапазоне 1 : 640-1 : 1280. Специфичность полученных мышиных антисывороток

была оценена иммуноблоттингом. В качестве источника нативных белков были использованы препараты культуральных жидкостей штаммов М. tuberculosis H37Ra и М. bovis BCG. Результаты иммуноблоттингов свидетельствуют (рис. 3), что антисыворотка к белку Ag85B-(His),í выявила одну основную полосу в препарате белка Ag85B-(His)6, а в каждом из микобактериальных препаратов - две белковые полосы, по молекулярной массе меньше массы рекомбинантного белка.

Ф':

116,0 66,2 45,0 35,0 25,0

18,4

14,4

12 12 12 3

А Б В

Рис.3. Специфичность антисыворотки к белку Ag85B-(His)6. (А) электрофоре-грамма (12,5 % Ds-Na-ПААГ) и (Б, В) иммуноблоттинги: А, Б: 1 - набор стандартных белков для электрофореза Fermentas (Латвия), 2 -Ag85B-(His)<,. В: 1 - культуральная среда М. bovis BCG (60 % насыщения сульфата аммония); 2 - культуральная среда М. tuberculosis H37Ra (60 % насыщения сульфата аммония), 3 -белок Ag85B-(His)6.

Поскольку полученные к Ag85B-(His)6 антитела распознают иммунологические эпитопы в нативном микобактериальном белке Ag85B, то рекомбинантный белок иммунологически идентичен микобактериальному антигену Ag85B.

Результаты иммуноблоттинга свидетельствуют (рис. 4), что полученная антисыворотка к ESAT-6-(His)6 выявляет в нем одну основную полосу на уровне 6 кДа и дополнительную более слабо окрашенную полосу на уровне 4,5 кДа, являющуюся, вероятно, продуктом гидролиза белка ESAT-6-(His)6.

Иммунологическое соответствие рекомбинантного белка ESAT-6-(His)6 ранней антигенной мишени ESAT-6 из М. tuberculosis иммуноблоттингом с антисывороткой к белку ESAT-6-(His)6 подтвердить не удалось из-за невысокого уровня экспрессии белка ESAT-6 штаммом М. tuberculosis H37Ra и низких титров антисыворотки к белку ESAT-6-(His)(i.

Рис. 4. Специфичность.антисыворотки к рекомбинантному белку ESAT-6-(His)i. А - электрофореграмма (15 %Ds-Na-ПААГ) и (Б) - контрастированный иммуноблоттинг: А, Б: 1 - набор стандартных белков Fermentas (Лавия)(116,0; 66,0; 45,0; 35,0; 25,0; 18,4; 14,4), 2 -ESAT-6-(His)<¡; 3- набор стандартных белков для иммуноблоттинга LMW Rainbow (Amersham,CUIA)(45,0; 30,0; 20,1; 14,3; 6,5; 3,5; 2,5).

Оценка перекрестной специфичности антисывороток при иммуноблоттинге с использованием двух гелей с идентичным набором антигенов (рис. 5) показала, что антисыворотка к А§85В-(Н1з)б высоко специфична и в ее составе отсутствуют антитела, перекрестно реагирующие с белком Е8АТ-6-(Ш8)6. Антисыворотка к ЕЭАТ-6-(Шз)6 слабо распознавала эпитопы в самом антигене и содержала антитела, перекрестно реагирующие с Ag85B-(His)6 и распознающие, как было показано имму-ноблоттингом с рекомбинантными неродственными белками (компонентами сибиреязвенного токсина) С-концевую последовательность -(Шз)6

т»

«ВТ I

12 3 1 2 3

А Б В

Рис. 5. Перекрестная специфичность антисывороток к рекомбинантным белкам Ag85B-(His)6 и ESAT-6-(His)6. А - электрофореграмма (15 % ПААГ), Б - иммуноблоттинг с антисывороткой к Ag85B-(His)6, В - иммуноблоттинг с антисывороткой к ESAT-6-(His)(>: 1 - набор стандартных белков для блота Fermentas (118; 86,0; 47,0; 34,0; 26,0; 19 кДа); 2 - белок Ag85B-(His)6; 3 - белок ESAT-6-(His)6.

1 2 3 А

ti»

1 2 3 Б

«¡Иг. ■ . ■ • -' 1 2 3

Конструирование рекомбинантных плазмид и экспрессия рекомбинант-ных белков FL-Ag85B и FL-Ag85B-ESAT-6 в клетках К Ш1агет1$. Основой для создания плазмидного вектора рРМС1 для клонирования созданных генетических конструкций и экспрессии генов рекомбинантных белков в клетках туляремийного микроба послужила гшазмида рПМЫО, выделенная из штамма Р. иотгс/с/а-Пке Е6168 и способная стабильно реплицироваться в клетках Р. /м/ятгяи. Для селекции плазмидосодержащих клонов в вектор рРМС1 был встроен са/-ген плазмиды рС194. В качестве структуры для инициации транскрипции-трансляции рекомбинантных генов был использован промотор и участок инициации трансляции groES-оперона Р. Ги/агеяз/я. Плазмида рРМС1 является ТОАТО вектором, в котором использован эффект трансляционного слияния для эффективной экспрессии клонированных генов. Структурная карта плазмиды рРМС1 представлена на рис. 6.

ОгЛп (2)

рРМС1

_дгос5

&в4 11358)

рис- 6. Структурная карта п>рА у ЬптапаЮг ПЛЭЗМИДЫ рРМС1.

герВ

ЗрМ (1'}Ю)

Ранее показано (РЫопоу его/., 2003), что присоединение лидерной части ЕЕ белка внешней мембраны ЕорА Г. ш/агеп$1.ч к клонируемому гену микобактериаль-ной супероксиддисмутазы (ЗоёА) приводит к значительному увеличению уровня его экспрессии, поэтому при создании рекомбинантных генов слитых белков ЕЬ-А§85В и FL-Ag85B-ESAT-6 к 1Ч-концевой части зрелого полипептида Ag85В присоединили ЕЕ лидерную часть белка внешней мембраны ЕорА Р. Ш1агепя1з.

Гибридный ген FL-Ag85B встроили в вектор рРМС1 и трансформировали в Р. ш1агетчз 15/10. В результате получили клон Р. Ыагепя^ 11Ур 17 с плазмидой рРМС-ЕЬ-85В. Структура плазмиды рРМС1-ЕЕ-85В представлена на рис. 7. Рассчитанная молекулярная масса продукта рекомбинантного гена FL-Ag85B составила 33146 Да.

orfm

doc

phd

pPMC l-FL-ag85B

agB58

groES-overlappon

repA

Рис. 7. Структурные карты плазмид pPMCI-FL-85B и pPMCI -Fl wVg85B- ESAT-6.

Для расширения спектра экспрессируемых микобактериальных антигенов в F. tularensis был создан рекомбинантный ген, включающий в себя фрагмент ДНК, кодирующий лидерную часть FL, фрагмент со структурной частью гена зрелого белка Ag85B и фрагмент ДНК, кодирующий зрелый белок ESAT-6. Между генами белков Ag85B и ESAT-6 в результате генно-инженерных манипуляций появилась дополнительная аминокислота - Ser. Гибридный ген встроили в вектор pPMCl и трансформировали в F. tularensis 15/10. В результате отобрали клон F. tularensis RVpl8 с плазмидой pPMC-FL-85B-ESAT-6. Структура плазмиды pPMCl-FL-85B-ESAT-6 представлена на рис. 7. Рассчитанная молекулярная масса рекомбинантно-го белка FL- Ag 85B-ESAT-6 (405 аминокислот) равна 42 988 Да.

В иммуноблоттинге со специфичной антисывороткой к Ag85B-(His)e, в лиза-те F. tularensis RVpl7 (рис. 8) выявили две полосы, меньшая из которых по интенсивности соответствовала молекулярной массе слитного белка FL-Ag85B (33,1 кДа), а большая - его процессированной форме с отщепленной FL лидерной последовательностью (-30,6, кДа).

Рис.8. Электрофореграмма (А) и иммуноблот-тинг (Б) клопа Г. 1и1агеп5и К\'р17 с антисывороткой к белку Ag85B-(His)6.

1 - клон /•'. /и/агами 15/10(рРМС1); 2 -клон Р. ш1агеп$и ЯУр17; 3 - белок Ая85В-(№8)«.

12 3 12 3 А Б

При анализе полученных ПЦР-положительных клонов И. ш1агеп.ч15К\р18 в иммуноблоттинге с антисывороткой к Ag85B-(His)6 выявлена полоса, соответствующая белку с молекулярной массой 40±3 кДа. Белок FL-Ag85B-ESAT-6 находился в клетках, по-видимому, в непроцессированной форме с неотщепленным ли-дерным пептидом РЬ (рис. 9, А). Аналогичные результаты получены при использовании антисыворотки к Е8АТ-6-(Н1з)б (рис. 9, Б), которая выявила полосу белка FL-Ag 85В-ЕЗАТ-6 в клоне штамма Р. /и/аге/шя ЯУр18 на уровне полосы, выявляемой антисывороткой к Ag85B-(His)6. Следовательно, в штамме К ЯУр18 клонирована созданная генетическая конструкция и экспрессирован ген слитного белка, содержащего в своем составе оба белка Ag85B и ЕЗАТ-6.

1 2 3 12 3 4 5

А Б

Рис.9. Иммуноблоттинг с антисыворотками к рекомбинантному белку Ag85B-(His)6 (А) и белку ESAT-6-(His)6 (Б). А: 1 - лизат клона F. tularensis RVp 18; 2 - лизат клона F. tularensis 15/10(рРМС1); 3 -белок Ag85B-(His)6; Б: 1 - лизат клона F. tularensis RVp 17; 2 - лизат клона F. tularensis RVp 18; 3 - набор стандартных белков для блота Fermentas (112; 82,0; 47,0; 34,0; 26,1; 19,0 кДа); 4 - белок Ag85B-(His)<;; 5 - белок ESAT-6-(His)6.

Уровень экспрессии рекомбинантного белка FL-Ag85B в пробах, стандартизованных по количеству бактериальных клеток штаммов F tularensis RVpl7 и RVpl8, оценивали полуколичественно с использованием известного количества нанесенного на гель белка Ag85B-(His)6 В составе проб клеточных лизатов штамма F tularensis RVpI7, содержащих 5 10s КОЕ, иммуноблотгангом выявили белковые полосы, по интенсивности соответствующие не менее 50 нг Ag85B-(His)6 Сходные результаты получены для штамма F tularensis RVp 18 Следовательно, можно ожидать, тго каждая бактериальная клетка обоих рекомбинантных штаммов экспрес-сирует около 103-104 молекул рекомбинантных белков FL-Ag85B и FL-Ag85B-ESAT6, что считается достаточным для индукции В- и Т-клеточно-опосредованного звена иммунитета (Abomoelak et al, 1999)

В результате проведенной работы нами впервые показана экспрессия основных внеклеточных белков Ag85B и ESAT-6 М tuberculosis в вакцинном штамме F tularensis 15/10 Созданный плазмидный вектор pPMCl включал все элементы плазмиды pFNLlO, необходимые для стабильной репликации в клетках F tularensis 15/10 В соответствии с данными о высоком уровне экспрессии туля-ремийных белков, находящихся под контролем GroE-промотора (Platonov et al, 2003), рекомбинантные микобактериальные белки также синтезировались в клетках F tularensis на достаточно высоком уровне

Характеристика иммунобиологических свойств рекомбинантных штаммов F. tularensis RVpl7 и RVpl8. Важной биологической характеристикой штаммов является способность стабильно экспрессировать рекомбинантный белок При пассировании штаммов F tularensis RVp 17 и RVp 18 через организм мышей во всех клонах, выделенных из селезенки, иммуноблотгангом были выявлены полосы рекомбинантных белков, интенсивность которых была близка к интенсивности полос белков исходных штаммов

Одной из важных характеристик созданных нами вакцинных штаммов является оценка их способности к выживанию и размножению в мышиных макрофаго-подобных клетках J774 1А т vitro Сконструированные нами штаммы F tularensis pPMCl, RVp 17 и RVp 18 способны к размножению внутри макрофагов линии J774 Al так же хорошо, как и родительский штамм F tularensis 15/10 (таблица 1)

Таблица 1. Размножение штаммов Р. 1и1агеп$1в в макрофагах линии Л774.А1(Х±5).__

Показатель Время фагоцитоза Штаммы

15/10 рРМС1 ЯУр17 ИУр18

КОЕ/мл 3 ч 3,2±0,08 3,2±0,23 3,3±0,18 3,4±0,07

24 ч 5,9±0,11 5,9±0,20 6,1±0,17 6,1 ±0,25

разница Ьой 2,7±0,09 2,7±0,21 2,8±0,17 2,7±0,16

Известно, что вакцинный штамм К й/Лзтим 15/10 обладает остаточной вирулентностью для мышей. Остаточная вирулентность полученных рекомбинант-ных штаммов, включая р. шЬгепям рРМС1, не отличалась от исходного штамма 15/10 и 1^50 была равна 31,6 КОЕ/мышь (7,9 125,9) для штамма ЯУр17 и 68,1 КОЕ/мышь (17,1 -г- 271,2) для штаммов ЯУр18 и рРМС1, соответственно. Для получения стабильных результатов в дальнейшем для всех штаммов /*'. ш1агеп.Ч1.'; была выбрана доза иммунизации - 20 КОЕ/мышь.

Длительность персистирования бактерий в организме животного, в частности, в селезенке, позволяет предварительно оценить перспективы развития процесса вакцинации. Определение количества бактерий в селезенке в различные периоды после вакцинации (рис. 10) показало, что достоверных отличий в процессе дис-семинации между штаммами не отмечается и введение дополнительного генетического материала в составе плазмиды рРМС1 или ее производных не ведет к существенному изменению биологических свойств клеток К Ш1агепз1з.

Рис. 10. Динамика размножения штаммов К 7и/яггпхк в селезенке мышей.

Определение уровня активации гуморального звена иммунитета. Методом ИФА в сыворотках мышей на 28 сутки после однократной иммунизации штаммами К в дозе 20 КОЕ/мышь определили титры антител к антиге-

нам Ag85B-(His)6, Е8АТ-6-(Шз)б и суммарному растворимому туляремийному ан-

тигену. Средние значения титров антител к суммарному туляремийному антигену представлены в таблице 2.

Таблица 2. Реципрокные титры к суммарному растворимому туляремийному антигену в сыворотках иммунизированных мышей

Штаммы F. tularensis Средний титр (разброс значений титров в группе)

15/10 1365 (20-5120)

pPMCl 2620 (80-5120)

RVpl 7 170(40- 320)

RVpl8 528 (80- 1280)

Несмотря на то, что процесс диссеминации этих штаммов в селезенке имел сходный характер, способность индуцировать антительный ответ оказалась различной. Штамм, несущий векторную плазмиду рРМС1, по иммуногенным свойствам был близок к родительскому штамму, а оба рекомбинантных штамма оказались менее иммуногенны. Титры антител к соответствующим антигенам Ag85B-(His)6 и Е8АТ-6-(Н1з)6 у мышей, иммунизированных штаммами К \ularensis ЯУр17 и ЯУр^, не превышали 1 : 20. Следовательно, иммунизация дозой 20 КОЕ/мышь этих штаммов не приводила к выработке антител к микобактериапьным белкам.

Определение уровня активации клеточного звена иммунитета. Степень активации Т-клеточного иммунитета рекомбинантными и контрольными штаммами определяли в реакции бласттрансформации спленоцитов иммунных мышей в ответ на рестимуляцию Ag85B-(His)6 и Е8АТ-6-(Н18)6 и суммарным туляремийным антигеном, а также оценкой уровня секреции ШТЧ-у в супернатантах активированных спленоцитов. Индексы стимуляции спленоцитов приведены на рис. 11.

Рис. 11. Индексы стимуляции спленоцитов иммунных мышей в реакции бласттрансформации.

il X

ÎT

5 -

h3« J5 m ta

□ суммарный антиген

□ Ag85B

□ ESAT-6

Приведенные данные показывают, что иммунизация всеми штаммами F tularensis приводила к выраженной индукции Т-клеточного ответа на суммарный туляремийный антиген Индексы стимуляции сгшеноцитов во всех группах вакцинированных мышей были близки и находились в пределах значений 8,2-11,3 У животных, иммунизированных штаммами F tularensis RVpl7 и RVpl8, отмечали выраженный специфический иммунный ответ на белок Ag85B-(His)6 Индексы стимуляции составили 8,6 ± 1,24 и 4,2 ± 0,95, соответственно, достоверно (р<0,05) отличаясь от индексов интактных мышей (1,2 ±0,28) и родительского штамма F tularensis 15/10 - 1,8 ± 0,56

Специфический иммунный ответ на очищенный антиген ESAT-6-(His)6 спленоцитов иммунных мышей был выражен слабо Индекс стимуляции в ответ на ESAT-6-(His)6 для штамма RVpl8 не превышал 1,9 ±0,18, достоверно (р<0,05) отличаясь от интактных мышей - 0,8 ± 0,42, но не отличаясь от индекса стимуляции для штамма с контрольным вектором F tularensis pPMCl - 1,2 ±0,68 Таким образом, однократная иммунизация мышей низкой дозой штаммов F tularensis RVpl7 и RVpl8 была способна активировать звено иммунитета, опосредуемого Т-клетками Показано, что выраженный иммунный ответ формировался не только на суммарный антиген туляремийного микроба, но и на микобактериальный антиген Ag85B, экспрессируемый штаммами F tularensis RVpl7 и RVpl8 Иммунный ответ на микобактериальный антиген ESAT-6, экспрессируемый штаммом F lularensis RVpl8 в составе слитного белка FL-Ag85B-ESAT-6, был выражен незначительно

Защита от инфицирования М tuberculosis, в основном, обусловлена клеточными иммунными механизмами, главную роль в реализации которых играет IFN-y Методом ИФА в супернатанте спленоцитов был определен уровень экспрессии IFN-y в ответ на рестимуляцию туляремийным и микобактериальными антигенами Данные, приведенные в таблице 3, показывают, что иммунизация всеми штаммами F tularensis приводила к индукции высокого уровня IFN-y в ответ на суммарный туляремийный антиген, свидетельствуя о высокой степени активации звена иммунитета, опосредованного Т-клетками

Уровни синтеза IFN-y для всех штаммов были близки и колебались в пределах 73,7-83,8 нг/мл, достоверно (р<0,05) отличаясь от аналогичных показателей для неиммунных мышей

Таблица 3. Уровни синтеза IFN-7 спленоцитами иммунных и неиммунных мышей (Х±5)

Штаммы F tularensis IFN-y, нг/мл

Суммарный туляре-мийный антиген Ag85B-(His)6 2 мкг/мл ECAT-6-(His)6 2 мкг/мл

15/10 75,8 ±5 ,3 10,2 ±0,7 0,1 ±0,1

pPMCl 83,8 ± 3,8 15,0 ± 1,0 0,8 ± 0,3

RVpl7 82,5 ± 1,2 31,9 ±0,7 0,2 ±0,1

RVpl8 73,7 ±8,1 20,3 ± 0,7 4,8 ±0,2

контроль 6,5 ± 0,8 0,2 ± 0,3 0,3 ±0,1

У животных, иммунизированных штаммами RVpl7 и RVpl8, отмечали также выраженный иммунный ответ на микобактериальный антиген Ag85B-(His)6, достоверно (р<0,05) отличающийся от остальных групп Ответ на антиген ESAT-6-(His)ó у мышей, иммунизированных штаммом RVpl8, по сравнению с ответом на антиген Ag85B-(His)6 оказался слабее, тем не менее, он достоверно (р<0,05) отличался от соответствующего показателя в других группах Следовательно, однократная иммунизация мышей низкой дозой штаммов RVpl7 и RVpl8 способна индуцировать синтез IFN-y спленоцитами, свидетельствуя об активации IFN-y-продуцирующих CD4+ и CD8+ Т клеток

Оценка протективности штаммов F. tularensis RVpl7 и RVpl8. Для оценки способности штаммов F tularensis RVpl7 и RVpl8 индуцировать протек-тивный иммунный ответ при аэрозольном заражении микобактериями мышей однократно вакцинировали полученными штаммами F tularensis в дозе 20 КОЕ/мышь и на 28 сутки после иммунизации инфицировали вирулентным штаммом М tuberculosis H37Rv В качестве контролей использованы штаммы F tularensis pPMCl и М bovis BCG ГГротективность оценивали по разнице между обсемененностью органов иммунных и контрольных животных (таблица 4) Достоверное отличие от контроля с уровнем значимости р<0,05 обозначено звездочкой (*) Таблица 4. Протективность штаммов F. tularensis и М. bovis BCG (X±ö).

Штаммы LogioKOE/легкие Защита легких LogioKOE/ce-лезенка Защита селезенки

Контроль 7,28 ±0,18 5,64 ±0,16

F tularensis рРМС 1 6,82 ±0,11 -0,40* 5,58 ± 0,33 -0,06

F tularensis RVp 17 6,34 ± 0,07 -0,94 * 4,43 ±0,13 -1,21 *

F tularensis RVp 18 6,46 ±0,18 -0,82* 4,58 ± 0,20 -1,06 *

M bovis BCG 5,92 ± 0,26 -1,36* 4,12 ±0,13 -1,52 *

Анализ данных показывает, что иммунизация штаммами F titlaren<¡is RVpl7 и RVpl8 приводила к индукции протективного иммунного ответа на мышиной модели легочного туберкулеза Снижение бактериальной нагрузки органов мышей, иммунизированных штаммами F tularensis RVpl7 и RVpl8, достоверно (р<0,05) отличалось не только от неиммунных мышей, но и от штамма с контрольным вектором F tularensis pPMCl Штаммы F tularensis RVp 17 и RVpl8 проявит сходную протективность, обеспечивая близкие уровни защиты в легких (-0,94 и -0,82) и селезенке (-1,21 и -1,06, соответственно) Очевидно, что клеточный иммунный ответ, индуцированный вакцинацией штаммами F tularensis RVp 17 и RVp 18, формировал защиту, которая сопоставима с протективностыо вакцины А/ bovis BCG Следовательно, созданные нами рекомбинантные штаммы F tularensis RVpl7 и RVpl8 на основе вакцинного туляремийного штамма F tularensis 15/10, способные стабильно экспрессировать микобактериальиые антигены и индуцировать протек-тивный противотуберкулезный иммунный ответ, можно рассматривать в качестве перспективных прототипов живой туберкулезной вакцины

Выводы

• Созданные рекомбинантные штаммы Е coli экспрессируют гены ми-кобактериальных белков Ag85B-(I Iis)6 и ESAT-6-(His)6, клонированные в составе плазмид рЕТ23Ь(+) и рЕТ24Ь(+), соответственно

• Иммунизация мышей рекомбинантными микобактерильными белками Ag85B-(His)e и ESAT-6-(His)6 индуцирует образование антител, реагирующих с соответствующими антигенами А/ tuberculosis

• Клетки вакцинного штамма F tularensis 15/10 при трансформации в них рекомбинантных плазмид pPMCl-FL-85B и pPMCl-FL-Ag85B-ESAT-6 приобретают способность стабильно экспрессировать антигены Ag85B и ESAT-6 М tuberculosis

• Полученные рекомбинантные вакцинные штаммы F tularensis RVpl7 и RVpl8, экспрессирующие микобактериальиые антигены Ag85B и ESAT-6, при введении мышам индуцируют специфический противотуберкулезный Т-клеточный иммунный ответ

• Однократная подкожная иммунизация мышей рекомбинантными вакцинными штаммами F tularensis RVpl7 и RVpl8 в дозе 20 КОЕ /мышь обеспе-

чивает эффективную защиту мышей от аэрозольного заражения вирулентным штаммом М tuberculosis Н37 Rv

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 М Platonov, A Mokrievich, Т. Kravchenko, N Shishkova, V Pavlov Cloning of iron-dependent superoxide dismutase (SOD A) of Mycobacterium tuberculosis in Francisella tu-larensis 15/10// Abstracts of 4th Intern Conference on Tularemia, City of Bath, UK, 2003, P 50

2 Т. B. Kravchenko, A N Mokrievich, M E Platonov, G M Vakhrameeva, V A Bannov, T Yu Kudruyavtseva, V M Pavlov Development of recombinant Francisella tularensis vaccine strains carrying additional protective antigens// Abstracts of 1st Intematiomal Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld-2005), Badajoz, Spain, March 15-18,2005 P 861

3 Платонов M E , Мокриевич A H , Кравченко Т. Б, Вахрамеева Г М , Шишкова Н А , Павлов В М Экспрессия генов протективных антигенов туберкулезного микроба в вакцинном штамме Francisella tularensis 15/10// Материалы 3-го Московского международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития», Москва, 14-18 марта 2005 г , С 85

4 Кравченко Т.Б , Мокриевич А Н, Платонов М Е , Вахрамеева Г М , Кудрявцева Т Ю , Баннов В А , Миронова Р И, Комбарова Т И , Потапов В Д , Бахтеева И В , Титаре-ва Г М , Ганина Е А, Павлов В М Вакцинный штамм Francisella tularensis - новый бактериальный вектор для протективных антигенов Mycobacterium tuberculosis// Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств Материалы VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5 октября 2006 г, Оболенск, Московская обл) Под ред Г Г Онищенко, В В Ку-тырева, И А Дятлова. Протвино Изд-во А-ПРИНТ ЗАО, 2006, С 147-148

5 Kravchenko Т., Mokrievich А , Platonov М , Vakhrameeva G , Kudruyavtseva Т , Bannov V, Mironova R, Kombarova T, Potapov V, Bahteeva I, Titareva G, Pavlov V Vaccine strain of Francisella tularensis - a new bacterial vector for protective antigens of Mycobacterium tuberculosis// Abstracts 5th International Conference on Tularemia Manne Biological Labs, Woods Hole, MA, USA, November 1-4, 2006, P 245C

6 Pavlov V, Mokrievich A , Platonov M , Kravchenko Т., Vakhrameeva G , Titareva G , Bahteeva I, Mironova R, Parra M , Elkins К L, Brennan M J New bacterial vector for Mycobacterium tuberculosis protective antigens// Abstracts of 2006 NIAID Research Conference,Opatia, Croatia, June 24-30, 2006), P 43

7 Кравченко Т.Б., Платонов M E , Вахрамеева Г М, Баннов В А , Кудрявцева Т Ю , Мокриевич А Н, Павлов В М Клонирование и экспрессия протективных антигенов Mycobacterium tuberculosis Ag85 и ESAT-6 в клетках Francisella tularensis 15/10// Биохимия, 2007-Т 72 -№7 -С 905-914

Подписано в печать 22 05 2008 Формат 60x88 1/16 Объем 1 75 п л Тираж 50 экз Заказ № 718 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кравченко, Татьяна Борисовна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ТУБЕРКУЛЕЗНЫЕ ВАКЦИНЫ - 16 ПРИОРИТЕТНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.2. ОСОБЕННОСТИ ИММУНИТЕТА ПРИ 20 ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ

1.3. ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВ - КАНДИДАТОВ 31 ДЛЯ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ ВАКЦИН

1.3.1. БЕЛКИ КОМПЛЕКСА AG

1.3.2. БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА ESAT

1.3.3. SOD И ДРУГИЕ БЕЛКИ

1.4. ОСНОВНЫЕ ФОРМЫ РАЗРАБАТЫВАЕМЫХ 3 8 ВАКЦИН

1.4.1. АТТЕНУИРОВАННЫЕ И 40 РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВАКЦИНЫ

1.4.2. СУБЪЕДИНИЧНЫЕ, 45 КОНЪЮГИРОВАННЫЕ, ДНК-ВАКЦИНЫ

1.5. ОСОБЕННОСТИ ИММУНИТЕТА ПРИ 53 ВАКЦИНАЦИИ ТУЛЯРЕМИЙНОЙ ВАКЦИНОЙ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конструирование вакцинных штаммов Francisella tularensis, экспрессирующих протективные антигены Ag85B и ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis, и изучение их иммунобиологических свойств"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Повышенное внимание к проблеме туберкулеза в последние годы обусловлено увеличением заболеваемости этой инфекцией не только в развивающихся странах, но и в благополучных государствах. При условии сохранения современных тенденций социально-экономических условий жизни и организации противотуберкулезной помощи населению в России прогнозируется продолжение ухудшения эпидемической обстановки и увеличение заболеваемости к 2010 г. более чем в 2 раза (Шилова, 2001).

Для специфической профилактики туберкулеза в России и за рубежом используются препараты единственной живой вакцины BCG, приготовленной на основе аттенуированного штамма Mycobacterium bovis (Митинская, 2001). Эффективность вакцинации препаратами BCG варьирует от 0 % до 80 % и в среднем составляет 50% (Colditz etaL, 1994; Roche et al., 1995). Создание новой улучшенной туберкулезной вакцины становится приоритетом национальных исследований (Castro, 1998). Работы последних лет позволили определить последовательность генома Mycobacterium tuberculosis, а также определить детерминанты протективного иммунитета (Horwitz et al., 1995; Kariyoneetal., 1999). Использование технологии рекомбинантных ДНК, синтетических пептидов, антиген-специфических антител, Т-клеток и т.д. позволило идентифицировать несколько основных антигенов М. tuberculosis, таких, как белки теплового шока hsp 60 и hsp 70 (Huygen, 2003; Карягина и др., 2004), белки комплекса Ag85 (Wiker, Harboe, 1992), ESAT-6 (Sorensen et al., 1995), CFP-10 (Skjot et al., 2000) и др. Экспрессия этих белков в гетерологичных векторах и их иммунологическая оценка обеспечила бы возможность идентификации антигенов М. tuberculosis, наиболее важных для разработки новых вакцин и специфических диагностических препаратов.

Поскольку активация клеточного иммунитета является основой для формирования противотуберкулезного иммунитета (Cooper, Flynn, 1995; Воробьев, Медуницын, 1995; Ярилин, 1999; Lazarevic, Flynn, 2002; Flynn, 2004), соответствующим образом подобранные адьюванты и системы доставки антигенов способствовали бы решению проблем, связанных с недостатками, присущими вакцине BCG. Одним из наиболее перспективных подходов является генетическое конструирование вакцин для защиты от нескольких инфекций одновременно на основе штаммов, полученных путем встраивания в их геном чужеродных антигенов, важных для активации клеточного иммунитета. В качестве вакцинных векторов используют живые аттенуированные штаммы М. tuberculosis (Ellner, 1998; Senaratneetal., 2007; Henao-Tamayo et al., 2007) и сальмонелл (Mollenkopf et al., 2001), а также близкородственные микобактерии (Abou-Zeid et al., 1997), ряд вирусов (Malin et al., 2000; McShane et al., 2005; Fattorini, 2007) и некоторые другие микроорганизмы (Miki et al., 2004).

Известно, что живая туляремийная вакцина, созданная на основе штамма Francisella tularensis 15/10, способна вызывать интенсивную перестройку гуморального и клеточного звеньев иммунной системы, обеспечивая создание длительного напряженного иммунитета при умеренной реактогенности вакцины (Олсуфьев и др., 1975). Кроме специфического иммунитета, этот штамм индуцирует кратковременную неспецифическую защиту против других внутриклеточных патогенов, таких как листерии и легионеллы (Belyi et al.,1996). Важно отметить, что клетки вакцинного штамма туляремийного микроба способны размножаться в организме экспериментального животного, иммунизированного живой вакциной BCG, что дает принципиальную возможность повысить иммунный ответ на экспрессируемые протективные антигены М. tuberculosis.

Вышеперечисленные характеристики штамма F. tularensis 15/10 позволяют считать оптимальным использование его в качестве бактериального вектора для конструирования живых противотуберкулезных вакцин.

Вопрос о выборе антигенов для конструирования противотуберкулезной вакцины достаточно сложен. Уже изучены иммунологические свойства широкого спектра белков М. tuberculosis. Одним из наиболее иммуногенных белков является секретируемый активно размножающимися микобактериями белок Ag85B - белок трехкомпонентного комплекса Ag85 (Kariyone et al, 1999). Белки этого комплекса являются ферментами миколил-трансферазами, играющими существенную роль в процессе синтеза клеточной стенки бактерии, однако функция комплекса и его роль в патогенезе туберкулеза до конца не выяснены. Другой белок - ESAT-6, секретируемый М. tuberculosis на ранней стадии роста (Sorensen et al., 1995), представляет собой важный Т-клеточный антиген, распознаваемый протективными Т-клетками на моделях экспериментального туберкулеза. Данные антигены были выбраны в качестве модельных антигенов для изучения возможности их экспрессии в клетках F. tularensis 15/10 и изучения перспектив использования туляремийной вакцины в качестве бактериального вектора для создания вакцинных штаммов для профилактики туберкулеза. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Конструирование вакцинных штаммов Francisella tularensis с экспрессией протективных антигенов Ag85B и ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis и изучение их иммунобиологических свойств. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

• Создание штаммов Е. coli, экспрессирующих рекомбинантные белки Ag85B-(His)6 и ESAT-6-(His)6.

• Выделение и очистка антигенов Ag85B-(His)6 и ESAT-6-(His)6 из рекомбинантных штаммов Е. coli, получение антисывороток к рекомбинантным белкам и оценка их иммунологической специфичности.

• Создание на основе вакцинного штамма F. tularensis 15/10 рекомбинантных штаммов RVpl7 и RVpl8, кодирующих гены слитных белков FL-Ag85B и FL -Ag85B-ESAT-6, и определение уровня их экспрессии.

• Оценка стабильности рекомбинантных штаммов F. tularensis RVpl7 и RVp 18 in vivo.

• Оценка уровня активации гуморального и клеточного звеньев иммунитета мышей, иммунизированных штаммами F, tularensis RVp 17 и RVp 18.

• Изучение протективности полученных штаммов F. tularensis RVp 17 и RVp 18 на модели легочной формы экспериментальной туберкулезной инфекции мышей.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Получены впервые вакцинные штаммы F tularensis 15/10, экспрессирующие протективные микобактериальные антигены Ag85B и ESAT-6.

Впервые охарактеризован иммунный ответ у мышей, иммунизированных вакцинными штаммами F. tularensis 15/10, экспрессирующими антигены Ag85B и Ag85B-ESAT-6.

Впервые показана протективность сконструированных рекомбинантных штаммов F. tularensis 15/10, экспрессирующих антигены микобактерий Ag85B и Ag85B-ESAT-6, на модели легочной формы экспериментальной туберкулезной инфекции мышей. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Создана модельная система для изучения вакцинных свойств протективных антигенов с использованием в качестве живого бактериального вектора вакцинного штамма F. tularensis 15/10,

Созданные рекомбинантные штаммы на основе вакцинного штамма F. tularensis 15/10, экспрессирующие протективные антигены микобактерий, дают возможность получить новую информацию, необходимую для создания живых противотуберкулезных рекомбинантных вакцин.

Микобактериальные рекомбинантные антигены Ag85B-(His)6 и ESAT6-(His)6, экспрессируемые бактериальными клетками Е. coli, и полученные к ним специфические антитела могут быть использованы для совершенствования систем диагностики туберкулеза. ВНЕДРЕНИЕ

В коллекции живых культур ФГУН "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" депонированы два авторских штамма Е. coli, использованные для получения рекомбинантных микобактериальных белков Ag85B-(His)6 и ESAT6-(His)6, и два авторских штамма F. tularensis RVpl7 и F. tularensis RVpl8, использованные для изучения перспективности использования туляремийной вакцины в качестве бактериального вектора при создании живых противотуберкулезных вакцин (федеральный уровень внедрения).

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного университета.

Депонированы в GenBank нуклеотидные последовательности двух генов, кодирующих слитные белки FL-Ag85B и FL-Ag85B-ESAT6, которые экспрессируются вакцинными штаммами F. tularensis RVpl7 и F. tularensis RVpl8 [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez].

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

Антитела к рекомбинантным белкам Ag85B-(His)6 и ESAT-6-(His)6 распознают иммунологические эпитопы в природных микобактериальных белках Ag85B и ESAT-6.

Созданы рекомбинантные плазмиды для эффективной экспрессии микобактериальных протективных антигенов Ag85B и ESAT-6 в клетках туляремийного микроба.

Иммунизация мышей вакцинными штаммами F. tularensis RVpl7 и RVpl8, экспрессирующими микобактериальные белки Ag85B и ESAT-6, приводит к индукции специфического клеточного иммунного ответа как к туляремийным, так и к микобактериальным антигенам. Штаммы F. tularensis RVpl7 и RVpl8 защищают мышей от легочной формы экспериментальной туберкулезной инфекции с эффективностью, сопоставимой с эффективностью вакцины BCG.

Вакцинные штаммы F. tularensis RVp 17 и RVpl8 можно рассматривать в качестве прототипов для создания живой противотуберкулезной вакцины РАБОТА ВЫПОЛНЕНА в отделе ООИ ГНЦ ПМБ по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: "Изучение молекулярных основ патогенности возбудителей особо опасных и социально значимых инфекций" (2003 г.)(руководитель темы д.м.н. Анисимов А.П); "Разработка новых бактериальных векторов на основе вакцинных или аттенуированных штаммов F. tularensis для конструирования живых вакцин» (2004 г.)(руководитель темы к.ф.-.м.н. Павлов В.М.) Данная работа получила финансовую поддержку Международного научно-технического центра (проект МНТЦ #2237(2002-2005г.г., научный руководитель проекта к.ф-.м.н. Павлов В.М.), а также проекта ВТЕР#7. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУН ГНЦ ПМБ 2 апреля 2008 г. Материалы диссертации th доложены и представлены на 6 научных конференциях: 4 Intern Conference onTularemia, City of Bath,UK, 2003; 1st Internatiomal Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld-2005), Badajoz (Spain), March 15-18, 2005; 3-й Московский международный конгресс

Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005 г.; VII-й Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.; NIAID Research Conference (Opatia, Croatia, June 24-30, 2006); 5th International Conference on Tularemia Marine Biological Labs, Woods Hole, MA, USA, November 1-4, 2006.

ПУБЛИКАЦИИ. Материалы диссертации опубликованы в 7 научных работах

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кравченко, Татьяна Борисовна

ВЫВОДЫ

• Созданные рекомбинантные штаммы Е. coli экспрессируют гены микобактериальных белков Ag85B-(His)6 и ESAT-6-(His)6, клонированные в составе плазмид рЕТ23Ь(+) и рЕТ24Ь(+), соответственно.

• Иммунизация мышей рекомбинантными микобактерильными белками Ag85B-(His)6 и ESAT-6-(His)6 индуцирует образование антител, реагирующих с соответствующими антигенами М. tuberculosis.

• Клетки вакцинного штамма F. tularensis 15/10 при трансформации в них рекомбинантных плазмид pPMCl-FL-85B и pPMCl-FL-Ag85B-ESAT-6 приобретают способность стабильно экспрессировать антигены Ag85B и ESAT-6 М. tuberculosis.

• Полученные рекомбинантные вакцинные штаммы F. tularensis RVpl7 и RVpl8, экспрессирующие микобактериальные антигены Ag85B и ESAT-6, при введении мышам индуцируют специфический противотуберкулезный Т-клеточный иммунный ответ.

• Однократная подкожная иммунизация мышей рекомбинантными вакцинными штаммами F. tularensis RVpl7 и RVpl8 в дозе 20 КОЕ /мышь обеспечивает эффективную защиту мышей от аэрозольного заражения вирулентным штаммом М. tuberculosis Н37 Rv. .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Туберкулез является «возрождающейся» инфекцией, сохраняющей лидирующее положение в мире по заболеваемости и смерности людей и по-прежнему представляющей собой основную проблему здравоохранения во многих странах (Anon., 2002). И, хотя к настоящему моменту уже более 3 млрд. человек провакцинировано вакциной BCG, тем не менее, эта вакцина обладает рядом недостатков, ограничивающих ее применение. Поэтому необходимость создания эффективной профилактической противотуберкулезной вацины второго поколения очевидна.

К настоящему моменту уже определен основной спектр наиболее перспективных протективных микобактериальных антигенов и создан целый ряд вакцин-кандидатов, которые находятся на разных стадиях клинических испытаний.

На первом этапе из наиболее часто используемых при конструировании новых вакцин антигенов нами были выбраны два протективных микобактериальных антигена - Ag85B и ESAT-6. В качестве системы доставки антигенов был использован вакцинный штамм туляремийного микроба, способный индуцировать длительный и напряженный иммунитет. Для клонирования и экспрессии микобактериальных белков в клетках F. tularensis на базе криптической плазмиды pFNLlO был создан вектор pPMCl, включающий все необходимые элементы для стабильной репликации в клетках F. tularensis 15/10.

Использование лидерной последовательности FL белка внешних мембран FopA в качестве стартового полипептида позволило преодолеть проблему, связанную с экспрессией гетерогенных белков в клетках F. tularensis, и обеспечить стабильную экспрессию микобактериальных антигенов, клонированных в составе слитных белков FL-Ag85B и FL-Ag85B-ESAT-6 и экспрессируемых созданными нами рекомбинантными штаммами F. tularensis RVp 17 и RVp 18. Уровень экспрессии клонированных белков был достаточно высоким. Основная часть микобактериальных белков выявлялась в мембранной фракции клеток.

Изучение иммунобиологических характеристик созданных рекомбинантных штаммов F. tularensis RVp 17 и RVp 18 было начато с определения остаточной вирулентности и способности бактериальных клеток преодолевать фагоцитарный барьер по параметру размножения в макрофагоподобных клетках линии J774 А.1. Введение вектора pPMCl, кодирующего дополнительный генетический материал, в клетки вакцинного штамма F. tularensis 15/10 не привело к существенному изменению их биологических свойств, поскольку созданные рекомбинантные штаммы были способны так же эффективно размножаться в эукариотических макрофагоподобных клетках.

Способность созданных рекомбинантных штаммов индуцировать специфический иммунный ответ была оценена по активации В- и Т-клеточного звеньев иммунитета. Рекомбинантные штаммы индуцировали выработку специфических антител только к туляремийным антигенам. Активация Т-клеточного звена иммунного ответа была более эффективной. Иммунизация рекомбинантными штаммами стимулировала выработку эффекторных Т-клеток, специфичных как к антигенам туляремийного микроба, так и к микобактериальному антигену Ag85B, обладающему собственной высокой иммуногенностью. Использование дополнительного теста для оценки активации опосредованного Т-клетками иммунного ответа по уровню синтеза IFN-y спленоцитами иммунных животных позволило не только подтвердить специфическую активацию IFN-у-синтезирующих Т-клеток белком Ag85B, но и выявить специфический иммунный ответ и на белок ESAT-6.

Основным параметром оценки эффективности вакцин является их способность ограничивать рост бактерий в органах после инфицирования, выражающаяся в снижении их обсемененности. Для оценки эффективности созданных нами вакцинных штаммов была использована мышиная модель туберкулезной инфекции при аэрозольном заражении вирулентным штаммом микобактерий. Оба штамма показали сходный уровень протективности, достоверно отличавшийся не только от неиммунных контрольных животных, но и от контрольного векторного штамма. Протективность обоих штаммов при использованной нами схеме иммунизации с учетом разницы в дозах иммунизации была сопоставима с протективностью стандартной туберкулезной вакцины BCG.

Следовательно, созданные нами рекомбинантные штаммы на основе вакцинного туляремийного штамма способны индуцировать протективный иммунный ответ против инфицирования вирулентным штаммом М. tuberculosis и их можно рассматривать в качестве перспективных прототипов живой туберкулезной вакцины.

Очевидно, что данные рекомбинантные штаммы можно рассматривать только в качестве прототипов вакцины, поскольку экспрессируемые микобактериальные антигены кодированы на плазмидном векторе и, следовательно, созданные нами рекомбинантные штаммы несут маркер антибиотикоустойчивости. Следующим этапом исследований, направленных на создание бивалентной живой вакцины, будет перенос генов клонированных микобактериальных белков в хромосомную ДНК туляремийного микроба для стабилизации их экспрессии, что позволит, соответственно, удалить маркер антибиотикоустойчивости.

Безусловно, без глубокого понимания иммунных механизмов, ответственных за создание протективного иммунитета, проблему создания нового поколения вакцин не решить. Кроме того, существуют определенные трудности в идентификации защитных механизмов макроорганизма при туберкулезе, которые пока являются большим тормозом в достижении прогресса в области создания эффективной противотуберкулезной вакцины. Поэтому данная работа является только первым этапом на сложном пути поиска и создания эффективных живых противотуберкулезных вакцин с использованием в качестве «живого» вектора бактериальных клеток F. tularensis.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кравченко, Татьяна Борисовна, Москва

1. Азаев М.Ш., Лебедев Л. Р., Туманов Ю. В., Смирнова О. Ю., Кузмичева Г. А., Боднев С. А., Донченко Н. А., Татьков С. И. Получение искусственных микобактериальных частиц и исследование их иммуногенных свойств// Биотехнология — 2004. № 4. — С. 34-40.

2. Волкова К. И., Кокосов А. Н., Браженко Н. А. Туберкулез в период ВИЧ/СПИДа и наркомании// Проблемы туберкулеза. 2001. -№ 2. -С. 61-65.

3. Воробьев А. А., Медуницын Н. В. Клеточная теория иммунитета И.И. Мечникова и концепция антиинфекционной резистентности// Журн. микробиол. 1995. - № 3. - С. 36-42.

4. Еремеев В. В. Новая противотуберкулезная вакцина: мечта или реальность?// Пробл. туб.-2001.-№ 1.-С. 53-55.

5. Карачунский М. А. Туберкулез при ВИЧ-инфекции// Проблемы туберкулеза. 2000. - № 1. - С. 47-52

6. Карягина А. С. Капрягин А. С., Народицкий Б. С., Апт А. С., Гинцбург А. Л .Геномика и генная инженерия: рациональные подходы для разработки новых средств борьбы с туберкулезом// Ж. микробиол. -2004.-№4.-С. 94-101.

7. Лазаренко В. Н., Махлай А. А., Хоменко А. Г. Перспективы разработки рекомбинантных вакцин на основе микобактерий// Вестн. РАМН. -1993.-№2.-С. 37-39.

8. Леви Д. Т., Аксенова В. А., Закирова Н. Р., Александрова Н. В. Вакцинация БЦЖ: характеристика препаратов и причины поствакцинальых осложнений.// Пробл.туб. 1999. - № 4. - С. 4-7.

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. -М.: Мир, 1984-479 с.

10. Маянский А. Н. Туберкулез (микробиологические и иммунопатогенетические аспекты)// Иммунология. 2001. - № 2. — С. 53-63

11. Медуницын Н. В. Вакцинология. М.: «Триада-Х», 1999. - 272 с.

12. Медуницын Н. В. Вакцины календаря, зарегистрированные в Российской Федерации// Бюлл. «Вакцинация» Электрон, ресурс. -2002. Том 2 № 20 (март-апр.): http://medi.ru/doc/15b2002.htm

13. Митинская Л. А. 80 лет применения вакцины БЦЖ// Пробл.туб. 2001. -№3.-С. 51-53.

14. Мишин В., Чуканов В., Наумов В. Лекарственно-устойчивый туберкулез легких// Медицинская газета. 2000. - № 58. - С. 8-9.

15. Олсуфьев, Н. Г. 1958. Современное состояние изученияпрофилактических свойств туляремийной вакцины. Вестн. Акад. Наук СССР. № 11 - С. 63-72. 18.0нищенко Г. Г.// Проблемы туберкулеза. - 2003. - № 11. - С. 4-9.

16. Павлов В. М., Родионова И. В., Мокриевич А. Н., Мещерякова И. С. Выделение и молекулярная-генетическая характеристика криптической плазмиды из Francisella novicida like F6168// Мол. Генет. Микробиол. Вирусол. 1994.-№3.-С. 39-40.

17. Петровская С. Н., Рубакова Э. И., Апт А. С., Кондратьева Т. К. Индукция иммунного ответа к микобактериальным антигенам с помощью дентритных клеток// Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2004. - № 8.-С. 61-63

18. Померанцев А. П., Домарадский И. В., Доронин И. П. Фурсов В. В. Изучение экспрессии cat гена плазмид Sa и рС194 в клетках Escherichia coli, Francisella tularensis и Bacillus subtilisll Мол. Генет. Микробиол. Вирусол. 1991. -№ 9. - С. 21-24.

19. Приймак А. А. Размышления о туберкулезе // Пульмонология. 2005. -N5.-С. 35-38.

20. Семенов Б. Ф. Новые вакцины XXI века// Провизор Электрон.ресурс. 1998. -7 декабря:http://provisor.kharkov.ua/archive/N23/new va.htm?rated

21. Спирин А.С., Белозерский А.Н., Шугаева И.В., Ванюшин Б.Ф.// Биохимия. 1957. - № 22. - С. 774-753.

22. Чернушенко Е. Ф., Кадан Л. П., Круглова И. Ф., Подгайная Е. А. Поиск путей повышения эффективности противотуберкулезной ревакцинации детей с иммунологической недостаточностью// Проблемы туберкулеза. — 1996. — № 1. С. 29-32.

23. Шевченко Ю. Л., Онищенко Г. Г. Микроорганизмы и человек, некоторые особенности их взаимосуществования на современном этапе// Ж. Микробиол. -2001. -№ 2. С. 94-104.

24. Шилова М. В. Туберкулез в России в конце XX века// Пробл. туб. -2001.-№5.-С. 8-13.

25. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медгиз, 1999. - 608 с.

26. Aldwell F. E, Dicker B. L., Da Silva Tatley F. M., Cross M. F., Liggett S., Mackintosh C. G., Griffin F. T. Mycobacterium &ovw-infected cervine alveolar macrophages secrete lymphoreactive lipid antigens //Infect Immun. 2000. - V. 68. - P. 7003-7009.

27. Andersen P., Askgaard D., Ljungqvist L., Bentzon M.W., Heron I. T-cell proliferative response to antigens secreted by Mycobacterium tuberculosis!I Infect Immun. 1991.-V. 59.-N.4.-P. 1558-1563.

28. Andersen P. Effective vaccination of mice against Mycobacterium tuberculosis infection with a solublie mixture of secreted mycobacterial proteins// Infect, immune. 1994. - V. 62. - P. 2536-2544.

29. Andersen P. Host responses and antigens involved in protective immunity to Mycobacterium tuberculosis!I Scand. J. Immunol. — 1997. V. 45. - N. 2. -P. 115-131.

30. Anon., 2002. Global Tuberculosis Control. WHO Report 2002 ( Geneva, Switzerland, World Health Organization), p. 181.

31. Anthony L. D., Burke R. D., and F. E. Nano. Growth of Francisella spp. in rodent macrophages// Infect. Immun. 1991. - V.59: - P.3291-3296.

32. Armstrong J. A., and P. D. A. Hart. Phagosome-lysosome Interactions in cultured macrophages infected with virulent tubercle bacilli// J. Exp. Med. -1975.-V.142.-P. 1-16.

33. Barletta R. G., Snapper В., Cirillo J. D., Connell N. D., Kim D. D., Jacobs W. R., Bloom B. R. Recombinant BCG as a candidate oral vaccine vector//Res. Microbiol. 1990.-V. 141.-P. 931-939.

34. Barnes P. F., Modlin R. L., EllnerJ. J. T-cell responses and cytokines. In: Bloom В R. , editor. Tuberculosis: pathogenesis, protection, and control. Washington, D.C.: American Society for Microbiology; 1994. P. 417-435.

35. Barnes P. F., Abrams J. S., Lu S., Sieling P. A., Rea Т. H., and R. L. Modlin. Patterns of cytokine production by mycobacterium-reactive human T-cell clones// Infect. Immun. 1993. - V. 61. - P. 197-203.

36. Baulard A., KremerL., Supply P., Vidaud D., BidartJ.-M., BelletD., Locht C.A new series of mycobacterial expression vectors for the development of live recombinant vaccines// Gene. 1996. - V. 176 - N.l-2. -P. 149-154.

37. Baumler A. J., Heffron F. //Virulence mechanisms of bacterial Pathogens/Eds.J.A.Roth et al Washington, 1997. - P. 115-131.

38. Beatty W. L., Rhoades E. R., Ullrich H. J., Chatterjee D., Heuser J. E., Russell D. G. Trafficking and release of mycobacterial lipids from infected macrophages. //Traffic. 2000. - V. 1. - P. 235-247.

39. Behar S. M., Dascher С. C., Grusby D. G., Wang C. R., and Brenner M. B. Suseptibility of mice deficient in CD ID or TAP1 to infection with Mycobacterium tuberculosis.// J. Exp. Med. 1999. - V. 189. - P. 19731980.

40. Beyer W., J. Imlay, and I. Fridovich. Superoxide dismutases// Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1991. - V. 40.-P. 221-253.

41. BermudezL. E., and J. Goodman. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells/Anfect. Immun. 1996. - V. 64. -P. 1400-1406.

42. Berthet F. X., P. B. Rasmussen, I. Rosenkrands, P. Andersen, and B. Gicquel. A Mycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT-6 and a novel low-molecular-mass culture filtrate protein (CFP-10)// Microbiology. 1998.-V. 144.-P. 3195-3203.

43. Bhatnagar N., E. Getachew, S. Straley, J.Williams, M. Meltzer, and A. Fortier. Reduced virulence of rifampicin-resistant mutants of Francisella tularensis. //J. Infect. Dis. -1994. V. 170. - P. 841-847.

44. Bloom В. R., and С. J. Murray. Tuberculosis: commentary on a reemergent killer// Science. 1992. - V. 257. - P. 1055-1064.

45. Brandt L, T. Oettinger, A. Holm, A.B.Andersen and P.Andersen. Key epitopes on the ESAT-6 antigen recognized in mice during the recall of protective immunity to Mycobacterium tuberculosis/'/ The Journal of Immunology. 1996.-V. 157.-N. 8.-P. 3527-3533.

46. Brandt L., Elhay M., Rosenkrands I., Lindblad E. В., Andersen P. ESAT-6 subunit vaccination against with Mycobacterium tuberculosis Жп&сИттпп. 2000. - V. 68. - N. 2. - P. 791-795.

47. Bodnar K. A., N. V. Serbina, and J. L. Flynn. Fate of Mycobacterium tuberculosis within murine dendritic cells// Infect. Immun. 2001. — V. 69. -P. 800-809.

48. Braunstein M., and J. Belisle. 2000. Genetics of protein secretion /In G. F. Hatfull and J. W. R. Jacobs (ed.), Molecular genetics of mycobacteria. American Society for Microbiology, Washington, D.C., P. 203-220.

49. Braunstein M., B. J. Espinosa, J. Chan, J. T. Belisle, and W. R. Jacobs, Jr. SecA2 functions in the secretion of superoxide dismutase A and in the virulence of Mycobacterium tuberculosisII Mol. Microbiol. 2003. - V. 48. -P. 453-464.

50. Brennan P. J., and H. Nikaido. The envelope of mycobacteria// Annu. Rev. Biochem. 1995. - V. 64. - P. 29-63.

51. Bretsher P. A. A strategy to improve the efficacy of vaccination against tuberculosis and leprosy// Immunol.Today. 1992. - V. 13. - P. 342-345.

52. Bosio С. M., Gardner D., and Elkins K. L. Infection of В cell-deficient mice with CDC 1551, a clinical isolate of Mycobacterium tuberculosis: delay in dissemination and development of lung pathology// J.Immunol. 2000. -V. 164. - P. 6417-6425.

53. Burke D. S. Immunization against tularemia: analysis of the effectiveness of live Francisella tularensis vaccine in prevention of laboratory acquired tularemia//J. Infect. Dis. 1977. - V. 135.-P. 55-60.

54. Castanon-Arreola M., and Y. Lopez-Vidal. A second-generation anti ТВ vaccine is long overdue// Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 2004. - V. 3.-P. 10.

55. Castro K. G. Global tuberculosis challenges// Emerg.Infect.Dis. 1998. -V. 4. - N. 3. - P. 408-409.

56. Caruso A. M., SerbinaN., Klein E., TrieboldK., Bloom B. R., and Flynn J. L. Mice deficient in CD4 T cells have only transiently diminished levels of IFN-y, yet succumb to tuberculosis// J. Immunol. 1999. - V. 162. -P. 5407-5416.

57. Carlsson H. E., A. A. Lindberg, G. Lindberg, B. Hederstedt, K.-A. Karisson, and B. Agell. Enzyme-linked immuno-sorbent assay for immunological diagnosis of human tularemia// J. Clin. Microbiol. -1979. -V. 10. P. 615621.

58. Centers for Disease Control and Prevention. (1991). Nosocomial transmission of multidrug-resistant tuberculosis among HIV infected persons: Florida and New York, 1988-1991. Morb. Mortal. Wkly Rep. -V. 40.-P. 585-591.

59. Colditz G. A., Brewer T. F., Berkey C. S., Wilson M. E., BurdickE., Fineberg H. V, Mosteller F. Efficacy of BCG vaccine in the prevention of tuberculosis. Meta-analysis of the published literature// JAMA. 1994. -V. 271.-P. 698-702.

60. Collins D. M., Gicquel B. Genetics of mycobacterial virulence. /In: Hafful G.F., Jacobs Jr.W.R., editors. Molecular genetics of mycobacteria. Washington DC: ASM Press; 2000. - P. 265-78.

61. Corbett E. L., Watt С J., Walker N., MaherD., Williams B. G., Raviglione M. C., Dye C. The growing burden of tuberculosis: Global trends and interactions with the HIV epidemic// Arch. Intern. Med. 2003. -V. 163.-P. 1009-1021.

62. Crowle A. J., R. Dahl, E.Ross, and M.H.May. Evidence that vesicles containing living, virulent Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium avium in cultured human macrophages are not acidic// Infect. Immun. -1991.-V. 59. P. 1823-1831.

63. Cooper A. M., Flynn J. L. The protective immune response to Mycobacterium tuberculosis// Curr. Opinion Immunol. 1995. - V. 7. — N. 4.-P. 512-516.

64. Curtiss R3rd. Bacterial infectious disease control by vaccine development// J. Clin. Invest. -2002.-V. 110-N. 8.-P. 1061-1066.

65. Daffe M, Draper P. The envelope layers of mycobacteria with reference to their pathogenicity// Adv. Microb. Physiol. 1998. - V. 39. - P. 131-203.

66. Dale J. W., and A. Patki. (1990) in Molecular biology of the mycobacteria, (McFadden, J., ed.), Surrey University Press, London, United Kingdom, P. 173-198.

67. Davis M. M., and Bjorkman P. J. T-cell antigen receptor gene and T-cell recognition//Nature. 1988. -V. 334. - P. 395-402.

68. Dennehy M., Williamson A.-M. Factors influencing the immune response to foreign antigen expressed in recombinant BCG vaccines// Vaccine. — 2005. -V. 23.-N. 10.-P. 1209-1224.

69. Derrick S. C., Yang A. L., Morris S. L. Vaccination with a Sindbis virus-based DNA vaccine expressing antigen 85B induces protective immunity against mycobacterium tuberculosis//Inf. Immun. — 2005. V. 73. - N. 11.— P. 7727-7735.

70. DharN., Rao V., Tyagi A. K. Recombinant BCG approach for development of vaccines:cloning and expression of immunodominant antigens of M. tuberculosis//FEMS Microbiol Lett. 2000. - V. 190.-N. 2.-P. 309-316.

71. Doherty Т. M., Andersen P. Vaccines for tuberculosis: novel concepts and recent progress// Clinical Microbiology Rewiews, 2005. - V. 18. — N. 4. — P. 687-702.

72. Dussurget 0., G. Stewart, О. Neyrolles, P. Pescher, D. Young, and

73. G. Marchal. Role of Mycobacterium tuberculosis copper-zinc superoxide dismutase// Infect Immun. 2001. - V. 69. - P. 529-533.

74. Eigelsbach H. Т., and С. M. Downs. Prophylactic effectiveness of live and killed tularemia vaccines. I. Production of vaccine and evaluation in the white mouse and guinea pig// J. Immunol. 1961. - V. 87. - P. 415-425.

75. Eigelsbach H. Т., and V. G. McGann. Genus Francisella Dorofe'ev 1947, 1 76al. P. 394-399. In N. R. Krieg and J. G. Holt (ed.), Bergey's manual of systematic bacteriology, 1984. - V. 1. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md.

76. EllnerJ. J. Необходимость новых научных достижений для контроля за туберкулезом. // The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 1998. - V. 2. - N. 9, -suppl. 1. - P. 124-126. (Реф.: Проблемытубер. - 1999.-№ 5.-С. 55-56.)

77. Enzyme-mediated immunoassay. 1988. Ed. by Т. T. Ngo and

78. H. M. Lenhoff. Plenum Press, New York and London, 444 p.

79. Engelberg-Kulka H., and G. Glaser. Addiction modules and programmed cell death and antideath in bacterial cultures// Annu. Rev. Microbiol. 1999,-V. 53.-P. 4370.

80. Espinal M. A. The global situation of MDR-TB// Tuberculosis. -2003.-V. 83.-N. 1-3.-P. 44-51.

81. Fattorini L. Strategies for the development of new tuberculosis vaccines// Minerva Med. 2007. - V. 98 - N. 2. - P. 109-119.

82. FentonM. J., and M. W. Vermeulen. Immunopathology of tuberculosis: roles of macrophages and monocytes// Infect. Immun. 1996. V. 64. -P. 683-690.

83. Feng C. G., Bean A. G. D., Hooi H., Briscoe H„ Britton W J. Increase in gamma interferon-secreting CD8+, as well as CD4+, T cells in lungsfollowing aerosol infection with Mycobacterium tuberculosis// Infect Immun. 1999. - V. 67. - P. 3242-3247.

84. Flynn J. L. Immunology of tuberculosis and implications in vaccine development//Tuberculosis. 2004. - V. 84.-N. 1-2.-P. 93-101.

85. Fournie J. F., Adams E., Mullins R J, Basten A. Inhibition of human lymphoproliferative responses by mycobacterial phenolic glycolipids// Infect Immun. 1989. - V. 57. - P. 3653-3659.

86. Fridovich I. Fundamental aspects of reactive oxygen species, or what's the matter with oxygen?//Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999. - V. 893. -P. 13-18.

87. Gasser A., Most J. Generation of multinucleated giant cells in vitro by culture of human monocytes with Mycobacterium bovis BCG in combination with cytokine-containing supernatants// Infect. Immun. 1999. -V. 67.-P. 395-402.

88. Glatman-Freedman A. Advances in antibody-mediated immunity against Mycobacterium tuberculosis: implications for a novel vaccinestrategy// FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003. - V. 39. - N. 1. - P. 916.

89. Golovliov I., G. Sandstrom, M. Ericsson, A. Sjostedt, and A. Tarnvik. Cytokine expression in the liver during the early phase of murine tularemia// Infect. Immun. 1995. -V. 63. - P. 534-538.

90. Golovliov I., V. Baranov, Z. Krocova, H. Kovarova, and A. Sjostedt. An attenuated strain of facultative intracellular bacterium Francisella tularensis can escape the phagosome of monocytic cells// Infect. Immun. -2003.-V. 71.-P. 5940-5950.

91. Gomes M.S., Paul S., MoreiraA. I. Appelberg R., Rabinovitch M., and Kaplan G. Survival of Mycobacterium avium and Mycobacterium tuberculosis in acidified vacuoles of murine macrophages// Infect. Immun. -1999.-V. 67.-P. 3199-3206.

92. Gonzalez-Juarrero M., and I. M. Orme. Characterization of murine lung dendritic cells infected with Mycobacterium tuberculosis// Infect. Immun.-2001.-V. 69.-P. 1127-1133.

93. Gu6rin N. BCG policies in Europe// Pediat. Pulmonol. 1995. -Suppl.N. ll.-P. 18-19.

94. HarboeM., Malin A. S., Dockrell H. S., Wiker H. G., Ulvund G., Holm A., Jorgensen M. C., Andersen P. B-cell epitopes and quantification of the ESAT-6 protein of Mycobacterium tuberculosis// Infect. Immun. 1998. -V. 66.-N. 2.-P. 717-23.

95. Hayes F. Toxins-antitoxins: plasmid maintenance, programmed cell death, and cell cycle arrest// Science 2003. - V. 301. - P. 1496-1499.

96. Hetzel C., Janssen R., Ely S. J., Kristensen N. M., Bunting K., Cooper J. В., Lamb J. R., Young D. В., Thole J. E. R. An epitope delivery system for use with recombinant mycobacteria// Infect. Immun. 1998. -V. 66.-N. 8. -P. 3643-3548.

97. Hondalus M. K., Bardarov S., Russell R., Chan J., Jacobs W. R. Jr., Bloom B. R. Attenuation of and protection induced by a leucine auxotroph of Mycobacterium tuberculosis/У Infect. Immun. 2000. - V. 68. — N. 5. — P. 2888-2898.

98. HorwitzM. A., LeeB. W., Dillon B. J., and G. Harth. Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination with major extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis!7 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995. - V. 92. - P. 1530-1534.

99. Huygen K. DNA vaccines: application to tuberculosis// Int. J. Tuberc. Lung Dis.- 1998.-V. 2.-P. 893-898.

100. Huygen K. On the use of DNA vaccines for the prophylaxis of mycobacterial diseases// Infect. Immun. 2003. - V. 71. - N. 4. - P. 16131621.

101. Jackson M, Phalen S. W., Lagranderie M., Ensergueix D., Chavarot P., Marchal G.a McMurray D.N., Gicquel B. Persistence and protective efficacy of a Mycobacter.ium tuberculosis auxotroph vaccine// Infect. Immun. 1999. - V 7. - P. 2867-2873.

102. Jacobs G. G., Jonson J. L., Boom W. H., Wallis R. S., Whalen С. C., Ginsberg A. M. Tuberculosis vaccines: how close to human testing // Tuber. Lung Dis. 1997.-V. 78.-P. 159-169.

103. Johnson С. M., Cooper A. M., Frank A. A., Bonorino С. В., Wysoki L. J., and Orme I. M. Mycobacterium tuberculosis aerogenic rechallenge infections in В cell-deficient mice// Tuber. Lung Dis. 1997. -78.-P. 257-261.

104. KamathA. Т., Feng С. G., Macdonald M., Briscoe H., Britton W. J. Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis// Infect. Immun. 1999. - V. 67. -N.4.-P. 1702-1707.

105. Kaplan G., Gandhi R. R., Weinstein D. E., Levis W. R., Patarroyo M. E., Brennan P. J., Cohn Z. A. Mycobacterium leprae antigen-induced suppression of T cell proliferation in vitro// J. Immunol. 1987. -V. 138.-P. 3028-3034.

106. Kaufmann S. H. E. Immune response to tuberculosis: experimental animal models// Tuberculosis (Edinb.) 2003. - V. 83. - P. 107-111.

107. Kaufmann S. H. E. Heat shock proteins and the immune response// Immunol. Today 1990.-V. 11.-P. 129-136.

108. Khatenever L. M. The allergic diagnosis, specific prophylaxis and vacci therapy of tularemia. In E. B. Balsky, I. G. Kochergin, and V. V. Porined.), Microbiology and epidemiology. Medical Publications Ltd., London, United Kingdom. 1943. - P. 62-79.

109. KindlerV., Sappino A P., Grau G. E., PiguetP. F., and Vassalli P. The inducing role of tumor necrosis factor in the development of bactericidal granulomas during BCG infection// Cell. 1989. - V. 56. -P. 731-740.

110. KoskelaP., and E. Herva. Cell-mediated and humoral immunity induced by a live Francisella tularensis vaccine// Infect. Immun. — 1982. — V. 36.-P. 983-989.

111. Krahenbuhl J. L. In'. Virulence mechanisms of bacterial pathogens/Eds.J.A. Roth et al. Washington, - 1995. - P. 97-114.

112. Kravchenko Т. В., Titareva G. M., Bachteeva I. V., Mironova R. I., Noskov A. N. Efficacy of Protection against Anthrax by the associative domain of the lethal factor// Abstracts of 4th Intern. Conference on Anthrax, Annapolis, USA-2001.-P. 40.

113. Kusunose E., IchiharaK., NodaY., and M. Kusunose. Superoxide dismutase from Mycobacterium tuberculosis/I J. Biochem. (Tokyo) 1976. -V.80.-P. 1343-1352.

114. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4// Nature (London). 1970. - V. 227. - P. 680685.

115. LazarevicV., Flynn J. CD8+ T cells in tuberculosis// Am. J. Respir. Crit. Care Med. -2002. V. 2002,-N. 8.-P. 1116-1121.

116. Leao S. C., Lopes J. D., Patarroyo M. E. Immunological and functional characterization of proteins of the Mycobacterium tuberculosis antigen 85 complex using synthetic peptides// J.General.Microbiol. 1993. -V. 139.-P. 1543-1549.

117. LiZ., Howard A., Kelley C., Delogu J., Collins F., Morris S. Immunogenicity of DNA vaccines expressiing tuberculosis proteins fused to tissue plasminogen activator signal sequences// Inf. Immun. 1999. - V. 67. -P. 4780-4786.

118. Lowry О. H., Rosenbrough N. R., Farr A. L. and Randall R J. Protein measurement with the folin phenol// J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. -P. 115-119.

119. Mahairas G. G., P. J. Sabo, M. J. Hickey, D.C.Singh, and С. K. Stover. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis// J. Bacteriol. 1996. -V. 178.-P. 1274-1282.

120. MaierT. M., Havig A., Casey M., Nano F. E.,. Frank D. W, and Т. C. Zahrt. Construction and characterization of a highly efficient Francisella shuttle plasmid// Applied and Environmental Microbiology.2004. V. 70, - N. 12 - P. 7511-7519.

121. MancaC., Paul S., Barry С. E. Ill, Freedman V. H., Kaplan G. Mycobacterium tuberculosis catalase and peroxidase activities and resistance to oxidative killing in human monocytes in vitro// Infect. Immun. 1999.-V. 67.-P. 74-79.

122. Marei A., Ghaemmaghami A., RenshawP., WiselkaM., Barer M., Carr M., Ziegler-Heitbrock L. Superior T cell activation by ESAT-6 as compared with the ESAT-6-CFP-10 complex// International Immunology2005.-V. 17.-N. 11.-P. 1439-1446.

123. McShane H., Pathan A. A., Sander C. R., Goonetilleke N. P., Fletcher H. A., Hill A. V. Boosting BCG with MVA85A: the first candidate subunit vaccine for tuberculosis in clinical trials// Tuberculosis (Edinb). -2005. V. 85. - N. 1-2. - P. 47-52.

124. MehtaP. K., King С. H., White E. H., Murtagh J. J. Jr., and F. D. Quinn. Comparison of in vitro models for the study of Mycobacterium tuberculosis invasion and intracellular replication// Infect. Immun. 1996. -V. 64.-P. 2673-2679.

125. Menon S. A., Wannemuehler M. J., Mahairas G. G., Minion F. C. Mycobacterial ESAT-6 protein enhances mouse IFN-gamma responses to Mycoplasma hyopneumoniae P71 protein// J. Interferon Cytokine Res. — 2002.-V. 22.-N. 7.-P. 807-813.

126. Mishell В. B. & Shiigi S. M. (1980) In Selected Methods in Cellular Immunology, (Mishell, В. B. & Shiigi, S. M., eds.), W. H. Freeman, San Francisco, C. 486.

127. Molloy A, Gaudernack G, Levis W. R, Cohn Z. A., Kaplan G. Suppression of T-cell proliferation by Mycobacterium leprae and its products: the role of Lipopolysaccharide// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1990. V. 87. - N. 3. - P. 973-977.

128. Moreno C, Mehlert A, Lamb J. The inhibitory effects of mycobacterial lipoarabinomannan and polysaccharides upon polyclonal and monoclonal human T cell proliferation// Clin. Exp. Immunol. 1988. -V. 74.-P. 206-210.

129. Muller I., Cobbold S. P., Waldmann H., and Kaufmann S. H. Impaired resistance to Mycobacterium tuberculosis infection after selective in vivo depletion of L3T4+ and Lyt-2+ T cells// Infect. Immun. 1987. - V. 55. -P. 2037-2041.

130. Neurenberger E., Bishai W. R., Grosse J. H. Латентная туберкулезная инфекция/ Пер.иностран. публ. М.А.Карачунского// Проблемы туб. и болезни легких. 2005. - № 2. - С. 45-51.

131. NorN. М., MusaM. Approaches towards the development of a vaccine against tuberculosis: recombinant BCG and DNA vaccine// Tuberculosis. 2004. - V. 84.-N. 1-2.-P. 102-109.

132. North R.J. Nature of "memory" in T-cell-mediated antibacterial immunity: anamnestic production of mediator T cells// Infect. Immun. -1975.-V. 12.-P. 754-760.

133. OddoM., RennoT., AttingerA., BakkerT., MacDonald H. R., and Meylan P. R. Fas ligand induced apoptosis of infected human macrophages reduces the viability of intracellular Mycobacterium tuberculosis!/ J. Immunol. 1998. - V. 160 - P. 5448-5454.

134. OlsenA. W., van Pinxteren L. A., Okkels M. L., Rasmussen P. В., Andersen P. Protection of mice with a tuberculosis subunit vaccine based on a fusion protein of antigen 85B and esat-6// Infect. Immun. 2001. - V. 69. -N. 5.-P. 2773-2778.

135. OlsenA. W., Williams A., Okkels M. L., Hatch G., Andersen P. Protective effect of a tuberculosis subunit vaccine based on a fusion of antigen 85B and ESAT-6 in the aerosol guinea pig model// Inf. Immun. -2004.-V. 72.-N. 10. P.6148-6150.

136. OlsuijevN. G., and I. S. Meshcheryakova. Subspecific taxonomy of Francisella tularensis McCoy and Chapin 1912// Int. J. Syst. Bacteriol. -1983.-V. 33-P. 872-874.

137. Orme I. M., and Collins F. M. Adoptive protection of the mycobacterium tuberculosis-infected lung// Cell. Immunol. 1984. -V. 84.-P. 113-120.

138. Ormel.M. The kinetics of emergence and loss of mediator T lymphocytes acquired in response to infection with Mycobacterium tuberculosis//J. Immunol. 1987. - V. 138. - P. 293-298.

139. Ormel.M., Andersen P., Boom W. H. T cell response to Mycobacterium tuberculosis// J. Infect. Dis. 1993. - V. 167. - P. 14811497.

140. Ormel.M. Prospects for new vaccines against tuberculosis// Trends Microbiol. 1995. - V. 3. - P. 401-404.

141. Ormel.M., and Cooper A.M. Cytokine/chemokine cascades in immunity to tuberculosis// Immunol. Today 1999. - V. 20 - P. 307-312.

142. Ottenhof Т. H., Kumararatne D, and Casanova J. L. Novel human immunodeficiencies reveal the essential role of type-1 cytokines in immunity to intracellular bacteria// Immunol. Today 1998. - V. 19. -P. 491-494.

143. Palendira U., Spratt J. M., Britton W. J., Triccas J. A. Expanding the antigenic repertoire of BCG improves protective efficacy against aerosol

144. Mycobacterium tuberculosis infection// Vaccine. 2005. - V. 23. - N. 14. -P. 1680-1685.

145. PanY., CaiH., Li S. X., Tian X., Li Т., Zhu Y. X. Combined recombinant DNA vaccine results in significant protection against Mycobacterium tuberculosis I I Sheng Wu Hua XueYu Sheng Wu Li Xue Bao (Shanghai). -2003. -V. 35. N. 1. - P. 71-76.

146. Paterson R. Human trials start for new tuberculosis vaccine// The Lancet Infectious Diseases. 2001. - V. 1 - N. 5. - P. 291.

147. Pavlov V. M, Rodionova I. V, Mokrievich A. N, Meshcheriakova I. S. Isolation and molecular-genetic characteristic of a cryptic plasmid from the Francisella novicida like F6168 strain// Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. -1994.-V.3-P. 39-40.

148. Pavlov V. M., Mokrievich A. N., and K. Volkovoy. Cryptic plasmid pFNLlO from Francisella novicida-like F6168: the base of plasmid vectors for Francisella tularensis// FEMS Immunol. Med. Microbiol. — 1996. — V. 13.-P. 253-256.

149. Pavelka M. S. Jr., Chen В., Kelley C. L., Collins F. M., and Jacobs W. R. Jr. Vaccine efficacy of a lysine auxotroph of Mycobacterium tuberculosis// Infect Immun. 2003. - V. 71. -N. 7. - P. 4190^1192.

150. Pelicic V., Jackson M., Reyrat J.-M., Jacobs W. R., Gicquel В., Guilhot C. Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis in Mycobacterium tuberculosis// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. -P. 10955-10960.

151. Pollitzer R. History and incidence of tularemia in the Soviet Union. A review. The Institute of Contemporary Russian Studies, Fordham University, New York, N.Y., 1967.

152. Pollock J. M., Andersen P. Predominant recognition of the ESAT-6 protein in the first phase of interferon with Mycobacterium bovis in catle// Infect. Immun. 1997. - V. 65. - N. 7. - P. 2587-2592

153. Pomerantsev A. P., M. Obuchi, and Y. Ohara. Nucleotide sequence, structural organization, and functional characterization of the small recombinant plasmid pOMl that is specific for Francisella tularensis// Plasmid 2001. - V. 46. - P. 86-94.

154. Pomerantsev A. P., Golovliov I. R., OharaY., Mokrievich A. N., Obuchi M., Norqvist A., Kuoppa K., and V. M. Pavlov. Genetic organization of the Francisella plasmid pFNL 10.//Genetic Plasmid 2001a. -V. 46.-P. 210-222.

155. Powell K. DNA vaccines-back in the saddle again?// Nat. Biotechnol. — 2004. — V, 22.-P. 799-801.

156. PugsleyA. P. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria// Microbiol. Rev. 1993. - V. 57. - P. 50-108.

157. PymA. S., BrodinP., Majlessi L., Brosch R., Cemangel C., Williams A., Griffiths К. E., Marchal G., Leclerc C., Cole S. T. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis//Nat. Med. 2003. - V. 9.-N. 5.-P. 533-539.

158. Rathman M., Sjaastad M. D., and Falkow S. Acidification of phagosomes containing Salmonella typhimirhim in murine macrophages// Infect. Immun. 1996. -V. 64. - P. 2765-2773.

159. Roche P. W., Peake P. W., Billman-Jacobe H., Doran Т., Britton W. J. T-cell determinants and antibody binding sites on the major mycobacterial secretory protein MPB 59 of Mycobacterium bovis// Infect. Immun. 1994. -V. 62.-P. 5319-5326.

160. Roche P. W., Triccas J. A., Winter N. BCG vaccintion against tuberculosis: past disappointments and future hopes// Trends in Microbiol.1995. VI. 3 -N. 10.-P. 397-401.

161. Roche P. W., Feng C. G., Britton W. J. Human T-cell epitopes on the Mycobacterium tuberculosis secreted protein MPT64// Scand. J. Immunol.1996.-V. 43.-P. 662-670

162. Ronning D. R., Vissa V., Besra G. S., Belisle J. Т., Sacchettini J. C. Mycobacterium tuberculosis antigen 85A and 85C structures confirm binding orientation and conserved substrate specificity// J. Biol. Chem.2004. V. 279. - N. 35. - P. 36771-36777.

163. Rosenkrands I., Agger E. M., Olsen A. W., Korsholm K. S., Andersen C. S. Jensen К. Т., P. Andersen. Cationic liposomes containing mycobacterial lipids: a new powerful Thl adjuvant system// Inf. Immun.2005.-V. 73.-N. 9. P. 5817-5826.

164. Sable S. В., Vermal., BeheraD., Khuller G. K. Human immune recognition-based multicomponent subunit vaccines against tuberculosis// Eur. Respir. J. 2005. - V. 25 - N. 5. - P. 902-910.

165. Sandstrom G., A. Tarnvik, and H. Wolf-Watz. Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis!! J. Clin. Microbiol. 1987. - V. 25. - P. 641-644.

166. Sandstrom G. The tularemia vaccine// J. Chem. Tech. Biotech. 1994 -V. 59.-P. 315-320.

167. Sansonetti P. J., RyterA., ClercP., Maurelli А. Т., and MounierJ. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocyticvacuole and plamid-mediated contact hemolysis// Infect. Immun. 1986. -V.51-P. 461-469.

168. Saslaw S., Eigelsbach H. Т., Prior J. A., Wilson H. E., and S. Carhart. Tularemia vaccine study. II. Respiratory challenge// Arch. Intern. Med. -1961.-V. 107.-P. 702-714.

169. Schlesinger L. S. Macrophage phagocytosis of virulent but not attenuatedstrains of Mycobacterium tuberculosis is mediated by mannosereceptors in addition to complement receptors// J. Immunol. 1993 -V. 150-P. 2920-2930.

170. Senaratne R. H., Mougous J. D., Reader J. R., Williams S. J., Zhang Т., Bertozzi C. R,. Riley L. W. Vaccine efficacy of an attenuated but persistent Mycobacterium tuberculosis cysH mutant// J. Med. Microbiol. -2007. V. 56. - Pt 4. - P. 454-458.

171. Shi С. H., Xu Z. K., Zhu D. S., Li D. S., Bai Y. L., Xue Y. Screening and construction of recombinant BCG strains expressing the Ag85B-ESAT6 fusion protein// Chin J Tuberc Respir Dis (Chin). 2005. - V. 28. - P. 254257.

172. ShiC. H., XuZ. K., ZhuD. S., Li D. S., Bai Y. L.3 Xue Y. Mycobacterium tuberculosis secreting protein Ag85B-ESAT6 fused expression and purification// Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi (Chin). -2004.-V. 27.-N. 2. 89-92.

173. ShiC. H., WangX. W., ZhuD. S., Xu Z. K., Bai Y. L., Xue Y. Immunity characteristics induced by a genetic vaccine expressing Ag85B-ESAT6 fusion protein // Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. (Chin). 2005. -V. 11. P. 777-780.

174. Sjostedt A., Sandstrom G., Tarnvik A., and B. Jaurin. Nucleotide sequence and T-cell epitopes of a membrane protein of Francisella tularensis!I J. Immunol. 1990. - V. 145. - P. 311-317.

175. Sjostedt A., Tarnvik A., and G. Sandstrom . Francisella tularensis: host-parasite interaction// FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - V. 13 -P. 181-184.

176. Smith D. A., Parish Т., Stoker N. G., Bancroft G. J. Characterization of auxotrophic mutants of Mycobacterium tuberculosis and their potential as vaccine candidates/ Infect. Immun. 2001. - V. 69. - N. 2. - P. 1142-1150.

177. Smith S. M., and Dockrell H. M. Role of CD8 T cells in mycobacterial infections// Immunol. Cell Biol. 2000. - V. 78. - P. 325333.

178. Smith J. A., and R. D. Magnuson. Modular organization of the Phd repressor/antitoxin protein. //J. Bacteriol. 2004. - V. 186 - P. 2692-2698.

179. Sorensen A. L., Nagai S., Houen G., Andersen P., and A. B. Andersen. Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis!I Infect. Immun. —1995.-V. 63.-P. 1710-1717.

180. Stenger S., Mazzaccaro R., UyemuraK., Cho S., Barnes P., Rosat J., SetteA., Brenner M., Porcelli S., Bloom B, and Modlin R. Differential effects of cytolytic T cell subsets on intracellular infection// Science 1997. -V.276.-P. 1684-1687.

181. Sterne J. A., Rodrigues L. C., and Guedes I. N. Does the efficacy of BCG decline with time since vaccination was given?// Int. Tuberc. Lung Dis.- 1998.-V. 2. —N. 3.-P. 200-207.

182. SudreP., Hirschel B. J., Gatell J. M., Schwander S., VellaS., Katlama C. Tuberculosis among European patients with the acqured immune deficiency syndrome/ ТВ in the foreign born and migration// ТВ and HIV1996. -N. 10.-P. 11.

183. Surcel H.-M. Diversity of Francisella tularensis antigens recognized by human lymphocytes// Infect. Immun. 1990. - V. 58. - P. 2664-2668.

184. Tarnvik A. Nature of protective immunity to Francisella tularensis!'/ Rev. Infect. Dis. 1989. - V. 11. - P. 440-451.

185. Tarnvik A., Lofgren M.-L., Lofgren S., Sandstrom G. and H. Wolf-watz. Long-lasting cell-mediated immunity induced by a live francisella tularensis vaccine/J. Clin. Microb. 1985. - V. 22. - N. 4. - P. 527-530.

186. Tascon R. E., Colston M. J., Ragno S., Stavropoulos E., Gregor D., Lowrie D. B. Vaccination against tuberculosis by DNA injection// Nat. Med. 1996.-V. 2 .-P. 888-892.

187. Tascon R. E., Soares C. S., Ragno S., Stavropoulos E., Hirst E. M., and M. J. Colston. Mycobacterium tuberculosis-activated dendritic cellsinduce protective immunity in mice// Immunology. 2000. - V. 99. -P. 473-480.

188. TekaiaF., Gordon S. V., Gamier Т., BroschR., Barrell B. G., and S. T. Cole. Analysis of the proteome of Mycobacterium tuberculosis in silico// Tuberc. Lung Dis. 1999. - V. 79. - P. 329-342.

189. Tigertt W. D. Soviet viable Pasteurella tularensis vaccines: a review of selected articles// Bacteriol. Rev. 1962. - V. 26 - P. 354-373.

190. Towbin H., Staenelin N., Gordon J. Electroforetic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76. - P. 4350-4354.

191. Tuberculogia// WHO Fact Sheet. 2000. - No. 104, April (по реф. в Пробл.туб. - 2002. - № 6. - С. 61.

192. Vanham G., Toossi Z., Hirsch C. S., Wallis R. S., Schwander S. K., Rich E. A., Ellner J. J. Examining a paradox in the pathogenesis of human pulmonary tuberculosis: immune activation and suppression/anergy// Tuberc. Lung Dis. 1997.-V. 78,-P. 145-158.

193. Vordermeier H. M., Venkataprasad N., Harris D. P., and Ivanyi J. Increase of tuberculosis infection in the organs of В cell-deficient mice// Clin. Exp. Immunol. 1996.-V. 106,-P. 312-316.

194. Waag D. M., G. Sandstrom, M. J. England, and J. C. Williams. Immunogenicity of a new lot of Francisella tularensis live vaccine strain in human volunteers// FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - V. 13. -P. 205-209.

195. Wiker H. G., and M. Harboe. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis// Microbiol. Rev. — 1992. -V. 56.-P. 648-661.

196. Worsaae A., Ljungqvist L., Heron I. Monoclonal antibodies prodused in BALB.B10 mice define new antigenic determinants in culture filtrate preparations of Mycobacterium tuberculosis// J. Clin. Microbial. 1988. -V. 26.-P. 2608-2614.

197. WuC.H., Tsai-Wu J. J., Huang Y. Т., Lin С. Y., LiouaG. G., and F. J. Lee. Identification and subcellular localization of a novel Cu,Zn superoxide dismutase of Mycobacterium tubercidosisll FEBS Lett. 1998. — V. 439.-P. 192-196.

198. Zhang Y., Lathigra R., Garbe Т., Catty D., and D. Young. Genetic analysis of superoxide dismutase, the 23 kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis!7 Mol. Microbiol. 1991. - V. 5. - P. 381-391.

199. ZhongmingL., Howard A., Kelley C., Delogu G., Collins F., and S. Morris. Immunogenicity of DNA Vaccines Expressing Tuberculosis Proteins Fused to Tissue Plasminogen Activator Signal Sequences.//Infect. Immun. 1999. -V. 67. -P. 4780-4786.

200. Zhu X., Venkataprasad N., Thangaraj H. S., Hill M., Singh M., Ivanyi J., Vordermeier H.M. Function ans specificity of T cells following nucleic acid vaccination of mice against Mycobacterium tuberculosis// J. Immunol. 1997. - V. 158. - P. 5921-5926.

201. Yee D., T.R. Rhinehart-Jones, and K.L. Elkins. Loss of either CD4+ or CD8+ T cells does not affect the magnitude of protective immunity to an intracellular pathogen, Francisella tularensis strain LVS// J. Immunol. -1996. V. 157. - P. 5042-5048.

Информация о работе

Кравченко, Татьяна Борисовна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Конструирование вакцинных штаммов Francisella tularensis, экспрессирующих протективные антигены Ag85B и ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis, и изучение их иммунобиологических свойств - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы