Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунобиологические свойства рекомбинантного антигена ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологические свойства рекомбинантного антигена ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis"

На правах рукописи

Носарева Олеся Валерьевна

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА ESAT-6 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

03 00 03—молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003162062

Кольцове - 2007

003162062

Работа выполнена во ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научный руководитель

кандидат химических наук С И Татьков

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Л Ф Гуляева кандидат биологических наук С В Серегин

Ведущая организация

Научно-исследовательский институт туберкулеза, г Новосибирск

Защита состоится 9 ноября 2007 г в 13 30 часов на заседании диссертационного совета Д 208 020 01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559,тел (383)336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан « Л » октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Э Г Малыгин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

С туберкулезом (ТБ) человечество знакомо очень давно Однако мы до оих пор очень мало знаем о механизмах, позволяющих микобактериям в обход защитных сил организма длительное время сосуществовать в виде латентной инфекции у одной трети мирового населения и поджидать подходящего случая для разития заболевания (Stewart et al, 2003, Tufanello et al, 2003) Несмотря на предпринимаемые мировым сообществом меры неуклонно продолжает возрастать распространение лекарственно-устойчивого ТБ В октябре 2006 г ВОЗ декларировала появление форм о широкой лекарственной устойчивостью, для лечения которых отсутствуют эффективные лекарственные средства Поэтому возрастает роль иммунопрофилактики и ранней диагностики заболевания В настоящее время для вакцинопрофилактики ТБ применяется живой аггенуированный штамм Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guenn (BCG), однако, индуцируемый им протектявный эффект варьирует от 0 до 80 % (Aronson et al, 2004) Для скринингового выявления инфицированных ТБ лиц применяется кожный тест, основанный на использовании грубого экстракта фильтрата культур M tuberculosis — туберкулина, или PPD (purified protein derivative), для определения реакций клеточного иммунитета, вызываемых микобактериями Специфичность туберкулиновых тестов ограничена невозможностью дифференцировать заболевание от поствакцинального состояния либо от инфицирования невирулентными микобактериями Точный диагноз ТБ предусматривает обнаружение M tuberculosis в материале от пациента, но микроскопические исследования не позволяют выявлять абациллярных больных и больных нелегочными формами ТБ, а культуральные методы еще требуют длительного времени для постановки диагноза В настоящее время активно исследуется возможность использования новых высокоиммуногенных видоспецифичных антигенов в диагностике ТБ Однако и здесь остаются проблемы, как, например, повышение чувствительности таких диагностических тестов без снижения их специфичности

С развитием современных методов исследования генома мы приблизились к разгадке проблем вирулентности микобактерий и к возможности создания более эффективных препаратов для вакцинопрофилактики ТБ В 1996 г путем сравнения геномов патогенных микобактерий M bovis и M tuberculosis и микобактерий вакцинного штамма BCG были обнаружены области, кодирующие более 100 высокоиммуногенных белков, пригодных для диагностики и создания альтернативных вакцинных конструкций Наиболее интересная область генома RDI (region of deletion) присутствует только в патогенных штаммах микобактерий и делетирована из генома вакцинного штамма M bovis BCG, а значит белки, кодируемые этой областью, могут оказаться ценными для дифференциальной диагностики Кроме того, эти белки могут стать вакцинными кандидатами, так как отвечают за вирулентность микобактерий и, возможно, будут индуцировать протективный иммунитет С их использованием открываются возможности для создания субъединичных и ДНК-вакцин, однако, до сих пор до практики не доведена ни одна альтернатива существующей вакцины BCG, которая бы превосходила ее по своим протектавным свойствам Одним из возможных направлений совершенствования субъединичных и ДНК-вакцин является поиск более эффективных способов их доставки в организм Ранее было показано, что при введении в организм мышей полисахаридных частиц, в оболочке которых находятся суммарные антигены BCG, индуцируется клеточный иммунный ответ, а рибонуклеиновая кислота, находящаяся в их ядре, устойчива к действию рибонуклеаз Такие конструкции были названы искусственными микобактериальными частицами (МБЧ) Оставалось неясным, будет ли их введение животным приводить к формированию протективного иммунитета против M tuberculosis, возможно ли их использование для доставки в организм животных ДНК, обеспечивающих синтез m vivo микобактериальных антигенов, а также будет ли формироваться иммунный

ответ на эти антигены и каким он будет - преимущественно гуморальным или клеточным'

Цель настоящей работы заключалась в изучении возможности использования рекомбинантного белка ESAT-6 для диагностики туберкулёза и изучении особенностей иммунного ответа у лабораторных животных, вызываемого ДНК-конструкцией, обеспечивающей синтез т vivo антигена esxA М tuberculosis, с применением полисахаридной системы доставки

Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:

1 Получить рекомбинантный штамм Е coli, опособный продуцировать микобактериальный антиген ESAT-6, и оценить диагностический потенциал рекомбинантного белка ESAT-6

2 Оценить возможность формирования протекгивного иммунного ответа к заражению М bovis морских свинок, иммунизированных искусственными микобактериальными частицами на основе полисахаридной системы доставки

3 Создать экспериментальный препарат на основе рекомбинантной ДНК, кодирующей антиген ESAT-б, и полисахаридной системы доставки

• сконструировать рекомбинантную плазмиду, обеспечивающую синтез антигена ESAT-б в эукариотической системе,

• получить конъюгат полиальдегиддекстран-спермидин,

• получить экспериментальный препарат и проверить его стабильность

4 Исследовать иммуногенные свойства экспериментального препарата на мышиной модели

5 Оценить безопасность применения экспериментального препарата для живых организмов

Положения, выносимые на защиту.

1 Плазмидная конструкция, включающая ген esxA М tuberculosis, обеспечивает синтез рекомбинантного белка GST-ESAT-6 в клетках Е coli

2 Использование рекомбинантного белка GST-ESAT-б в ИФА позволяет выявлять антитела, специфичные кМ tuberculosis

3 Использование рекомбинантного белка GST-ESAT-б в ELISA/ИФН-у анализе позволяет проводить дифференциальную диагностику активного туберкулеза и поствакцинального иммунитета

4 Искусственные микобактериальные частицы на основе полисахаридного конъюгата и экспонирующие на своей поверхности суммарные белки М bovis BCG обладают иммуногенностью и протективными свойствами на экспериментальной модели животных

5 Экспериментальный препарат на основе рекомбинантной ДНК, кодирующей антиген ESAT-б, и полисахаридной системы доставки обладает Т-клеточной иммуногенностью на мышиной модели и безопасен для животных

Научная новизна и практическая значимость работы:

Впервые получен рекомбинантный штамм Е coli, продуцировавший микобактериальный рекомбинантный белок GST-ESAT-б, который оказался пригоден для диагностики активного ТБ Важным результатом выполненной работы явилось определение чувствительности ИФА при выявлении антител класса IgG к антигену ESAT-6 М tuberculosis, которая составила 60 %, при специфичности - 95 %

В результате проделанной работы впервые был показан протективный иммунный ответ при заражении М bovis иммунизированных искусственными микобактериальными частицами морских свинок

Впервые сконструирована плазмида pONEö, содержащая ген esxA, экопрессирующая мнкобактериальный антиген ESAT-6, на основе которой создан экспериментальный препарат «KpONE6», окруженный полисахаридной оболочкой из молекул модифицированного полиглюкина и спермидина, способной защищать нуклеотидный материал от деградации нуклеазами

Впервые показано, что иммунизация экспериментальным препаратом «KpONEö» лабораторных животных приводит к формированию специфического клеточного иммунного ответа, а сам препарат не обладает «острой» токсичностью И является безопасным для применения на животных

Полученные данные настоящей работы по иммуногенности экспериментального препарата могут лечь в основу дальнейшего исследования его протективных свойств на лабораторных животных

Апробация работы и публикации:

Полученные результаты исследований были доложены на международном симпозиуме «Интегративная Медицина в XXI веке» (Судак, Украина, 2004), международном Кейстоуновском симпозиуме «Интеграция хозяина и патология патогена» (Вистлер, Канада, 2005), VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, Россия, 2005), интернациональном конгрессе «Новые подходы в вакцинных разработках» (Берлин, Германия, 2005), международной школе-конференции «Системная биология и биоинженерия» (Москва, Россия, 2005), международном междисциплинарном семинаре «Новые технологии в интегративной медицине и биологии» (Бангкок-Патайя, Тайланд, 2006), П интернациональной конференции «ТБ вакцины в мире» (Вена, Австрия, 2006), международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» в рамках Международного Симпозиума «ЕС—Россия перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной программе» (Санкт-Петербург, Россия, 2006), VI Всероссийской конференции молодых ученых в рамках 13 Международного конгресса по приполярной медицине (Новосибирск, Россия, 2006), III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006), XVI ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Общества (Мюнхен, Германия, 2006), I летней международной школе по инфекционным заболеваниям «Кох-Мечниковскнй форум» (Берлин, Германия, 2006), 37-ом союзе международных конференций по патологии легких (Париж, Франция, 2006), 3-ей международной конференции по вакцинам «Перспективы вакцинных разработок медицинская необходимость и социальное значение» (Баден, Австрия, 2007), Российско-Германской конференции Форума Коха- Мечникова (Томск, Россия, 2007)

По материалам диссертации было опубликовано четыре статьи, 3 из них в журналах, рекомендованных ВАК для кандидатских диссертаций

Настоящая работа была выполнена в лаборатории разработки новых методов диагностики заболеваний человека ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» - эксперименты по клонированию, получению и исследованию рекомбинантных белков, получению экспериментальных препаратов для иммунизации животных и исследованию их иммуногенных и токсических свойств, на базе ГНУ Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН - эксперименты по заражению М bovis иммунизированных морских свинок и оценке протективных свойств микобактериальных частиц

Выражаю глубокую благодарность за неоценимую помощь и поддержку в планировании и проведении экспериментов, обсуждении полученных результатов и подготовке диссертации Андрею Егоровичу Нестерову

HcKpejiifc признательна профессору Георгию Михайловичу Игнатьеву за ценные советы в подготовке экспериментов, терпение н помощь в осмыслении результатов

Благодарна всем сотрудникам лаборатории разработки новых методов диагностики заболеваний человека ФГУН ПгЩ ВБ «Вектор»: А.Н. Болдыреву за возможность ежедневных обсуждений результатов экспериментов, к б н. О.Ю. Смирновой ча обучение методикам клонирования и человеческую поддержку, к.б.н. Агафонову А.П., к б.н. М.Ш. Азаеву, к.х.н. Ю.В. Туманову и к.вет.и. А.Н.. Донченко за удачное совместное проведение экспериментов.

Особую благодарность выражаю своему научному руководнтешо к.х.н. Сергею Ивановичу Татькову за поддержку, участие в обсуждении результатов и предоставленную свободу действий для совместного выполнения части экспериментов с нашими коллегами ФГУН ПЩ ВБ «Вектор«.

Благодарю моих родителей, брата и моих друзей, оказывавших мне всестороннюю поддержку, как при проведении экспериментов, так и при написании диссертации.

Структура II объем работы

Диссертация изложена на 149 сграницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 235 работ: 27 - отечественных авторов и 208 - зарубежных. Работа иллюстрирована IS рисунками и включает б таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1, Получение И исследование гибридного fic-itca GST-ESAT-6 В настоящее время большое внимание уде;шегся изучению специфичных микобактернальных антигенов, так как одной из главных задач разработки новых препаратов вакцинопрофилакписи ТЕ является выделение компонентов микобактерий, преимущественно активирующих макрофаги, и устранение продуктов, усиливающих

данных литературы по антигенному cncKipy микобактсриальиых белков показал, что среди них Наиболее интересными и перспективными кандидатами для создания на их основе диагностических реагентов и вакцин являются а!ггигены ES AT-5 и CFF10 (Berthe i et al., 199S; Brodm et al., 2005).

liSAT-6 (early secreted antigen target) и CFP10 (culture filtrate protein) - белки, гены которых находятся в RD1 области, отсутствующей во всех вакцинных штаммах BCG, производимых в разных странах, так как именно этот участок генома был декретирован из патогенного штамма М. bovis в ходе получения аттенуированного вакцинного штамма (Flint et al., 2004)

тканевую деструкцию. Анализ

Рис. 1. Математическая модель комплекса CFPI0-ESAT-6.

Гекы esxA и esxB. кодирующие бедки ESAT-6 и CFP10, ко-fpaнскрибируюте я, после чего с каждой мРМК происходит трансляции с образованием белков, секретирующихся и окружающую среду в виде совместного комплекса (рис.1) в соотношении 1.1 с помощью не изученного пока механизма (Rensliaw et al., 2002).

Эти белки ставилизируют друг друга, а при взаимодействии с клеточным рецептором хозяина комплекс распадается (Mcher et al., 2006). В настоящее время комплексу белков отводится некая сигнальная роль, которая проявляется при взаимодействии его о рецептором на АПК, что в дальнейшем определяет функционирование иммунных клеток хозяина (Hsu et al., 2003). По литературным данным эти белки ЯВЛЯЮТСЯ сильными Т- и B-клеточными иммуногенами, обнаруживаемыми на ранней фазе инфекции. Т-кле точные эпигоны ES AT-6 узнаются как CD4+, так и CDS* Т-лф (Mustafa, Shaban, 2006). Однако функции белков ESAT-6 и CFP20 in vivo до сих пор плохо изучены.

Таким образом, одной иэ задач нашзй работы стало получение рекомбннангного белка ESAT-6.

Ген кодирующий белок I SA'!-6, клонировали и составе экспресс и руюшей

Прокариотнческой плазмиды pGEX-2T в клетках Е. coli. Для этого ПЦР-фрагменг длиной 368 н.п. был »строен в вектор pGEX-2T по сайтам рестрикции БатШ-EcoRl. Полученную конструкцию назвали pGEX-2T^ESAT-6r Правильность встраивания клонированного фрагмента была подтверждена рестрикпионным анализом и секветщронанием.

Рекомбннантной »яазмндой трансформировали компетентные клет-ки рсциинентно1"о штамма Е. colt BL21, рекомендуемого руководством но использованию вектора pGEX-2T для получения белков, поскольку он обладает пониженной внутриклеточной протеазной акгивностыо. Индукцию синтеза целевого белка проводили добавлением в среду ИПГГ, который в данной системе обеспечивает высокий уровень синтеза белка G3T. При элсктрофоретическом анализе лнзатов клеток Е. coli, трансформированных плазмидой pGEX-2T/ESAT-б, было выявлено наличие дополнительного белка с молекулярной массой около 30 кДа, что соответствует расчётной массе белка GST-ESAT-6 (рис, 2А). Уровень продукции этого белка по данным денситомстрни составлял более 20 %. Очистка белка GST-ESAT-6 была проведена с использованием аффинной хроматографии на глугатион-сефарозе согласно рекомендациям фирмы Pharmacia Biotech, а степень его очистки составила примерно 95 %.

I J I ( 1 j з ( i : i

t'vu. 1. Сиит« гибридных бфЛКЮ HO данным электрофореза н имиуноблотинга

А - электрофорез в 12 % ПА.АГ В денатурирующих условиях (0,1 % додецнлсульфа.та натрия) клеточных та и В - иммуноблоттинг соответствующих лнзатов с моиоклональными антителами к GST:

1 - лизат Е. coh, 2 - лизат S. coh/pGEX-2T, 3 -лизат Е. соli/pGEX-2T/CFP10, 4 - лнзэг ■Е coWpGEX-2 T/ES АТ-6, С - иммуноблоттинг лизата Е colifpGEX-2T/ESAT-6 е различными сыворотками: 1 -сыворотка здорового Донора (1; 100), 2 " сыворотка больного с легочным заболеванием нетуберкулезной этиологии (1:100), 3 * сыворотка больного с активным туберкулезом (1:100).

Аналогичным способом нами был клонирован и получен другой специфичный белок GST-CFP10, который использовался в наших исследованиях в качестве белка-сравнения (Татьков С.И. и др., 2006).

Антигенные свойства рекомбинантных белков оценивали с помощью иммуноблога. ИммуиоблоттинГ с моноклональными антителами 2Ю-19 против GST (:побезно предоставленными Порываевой В. А. ЗАО "Вектор-Бест") (рис. 2В) подтверждает наличие в лизате клеток рекомбинанпюто белка GST-ESAT-6.

Для оценки иммунореактнвносги полученных рекомбинантных белков мы провели иммублоттинг с сыворотками от здоровых и больных ТЕ людей (рис. 2С). Исследования проводили с сыворотками в различных разведениях, но наиболее специфичные результаты получили при использовании сывороток в разведении 1:100. Полученные данные иммуноблотз позволяют заключить, что обработка мембраны с фракционированными белками £, cali/pGEX-2T7BSAT-6 сывороткой от больного ТЕ в разведении 1:100 Позволяет идентифицировать антиген ESAT-б (рис. 2С).

Таким образом, был подучен продуцент гибридного белка GST-ESAT-6, который сохраняет нммунохнмические (по результатам иммуноблоттинга) свойства природного антигена Л Y tuberculosis и может бьпъ использован в дальнейших исследованиях в качестве диагностического агента для подтверждения наличия иммунитета к ТЕ, а так же как компонент вакцин для создания иммунитета к ТЕ.

Получив аффинно-очищенный препарат рекомбиЕ1антного белка GST-I N-V!-o, мы провели исследование его диагностического потенциала методой МФЛ е использован нем сывороток пациентов больных ТЕ. В данной работе полученный и очи (ценный рекомбннантный белок GST-ESAT-б использовали в качестве антигена Для иммобилизации на твердой подложке в иммуноферментной системе, предназначенной для выявления в идо специфических антител класса IgG к М. tuberculosis в сыворотке крови человека методом непрямого ИФА. Были обследованы панели отрицательных сывороток (470 образцов), подученных от здоровых доноров, и положительных, выделенных от бо.тьных туберкулезом с клинически подтвержденным диагнозом (34 образца). Чувствительность ИФА при определении антител класса IgG для G5T-ESAT-6 составила 60 % (рис. 3) с довольно высокой специфичностью (95%).

Основываясь на литературных данных оценки разработанных коммерческих тест-систем серодиагностики ТБ с использованием различных антигенов М. ЫЬегсиЬ.г и, можно отметить, что чувствительность таких тестов варьирует от 10 до 90 %, а специфичность от 47 до 100 % (Ат1СОвап1е ег а!., 1999; Вапе^ее й а!., 2003, 31е^аг1 е! а!, 2007). Тем не менее, такой разброс показателей не отрицает возможное™ широкого

Vi

Рис. 3. Частота (в %) выявлений антител класса IgG х- GST ц рекомбииантпому белку GST-ESAT-6 М. tuberculosis в различных исследуемых группах: 1 - здоровые доноры, 2 - лица с активным ТБ.

ccst-^AI-Í П (¿ST

S

применения метода ИФА в будущем о условием повышения чувствительности, специфичности и снижения стоимости исследований данным методом

При обследовании контрольной группы здоровых доноров уровень IgG-антител к гибридному белку был определен на низком уровне для большинства исследованных сывороток, однако в небольшом числе олучаев (4,6 % для GST-ESAT6), сыворотки были определены как положительные (рис 3) Уровень вьивления антител к GST не превышал 1,3 % среди воех обследуемых сывороток (рис 3)

Отдельно нами были проанализированы титры антител к гибридным антигенам в сыворотках лиц с такими заболеваниями как гепатит А, В и С, хламидиозная, пневмонийная и стафилококковая инфекции Было установлено, что сыворотки от доноров с указанными патологиями не имели статистичеоки значимых отличий по уровню антител от сывороток здоровых,доноров Следовательно, возбудители данных заболеваний не реагируют перекрестно с гибридным антигеном GST-ESAT-6

Таким образом, полученные нами данные об иммунореактивноста гибридного белка GST-ESAT-б в серологических исследованиях позволяют сделать вывод о том, что данный белок можно использовать для диагностики активного ТБ Высокая специфичность гибридного рекомбинантного белка ESAT-6 (95 %) при выявлении активного процесса на начальных стадиях заболевания ТБ позволяет использовать его в скрининговых исследованиях

В иммунном ответе при ТБ доминируют клеточные медиаторы иммунного ответа, в частости Т-лф являются чувствительными к антигенам М tuberculosis Для оценки их функционального состояния мы использовали ELISA/ИФН-у, сущность которого заключается в in vitro детекции ИФН-у клеточных медиаторов иммунного ответа при стимуляции видоспецифическими антигенами (в нашем случае GST-ESAT-6) цельной крови с последующим измерением уровня ИФН-у в плазме крови методом ИФА Высокий уровень ИФН-у в цельной крови пациентов и здоровых доноров в ответ на стимуляцию Т-клеточными митогенами (ФГА и КонА), свидетельствует об отсутствии иммуносупрессивного состояния Т-клеточного звена иммунной системы обследуемых лиц Таким образом, в данном тесте секреция ИФН-у связана с реактивностью Т-клеток в ответ на специфический антиген (Aiend et al, 2000), так как уровень ИФН-у в цельной крови у здоровых доноров существенно ниже Позитивные результаты ИФН-у теста указывают на наличие активной туберкулезной инфекции (Sodhi et al, 1997) При анализе данных чувствительность данного метода с использованием в качестве стимулирующего антигена GST-ESAT-6 на имеющейся выборке лиц с активным ТБ составила 72±11 % при специфичности более 94 % При использовании же в качестве антигена PPD на той же выборке пациентов чувствительность метода составила 94±6 % при специфичности 33±11 % Низкая специфичность при использовании PPD объясняется тем, что PPD представляет ообой смесь белков, которые так же продуцируются и вакцинным штаммом BCG, который используется в нашей стране повсеместно Поэтому целесообразно в качестве антигена в данном тесте использовать ESAT-б, который отсутствует в вакцинных штаммах BCG, и таким образом позволяет проводить дифференцирование между BCG-вакцинированными и инфицированными пациентами

2. Исследование иммуногенных свойств антигена ESAT-б

2.1. Клонирование последовательности ДНК, содержащей ген esxA В настоящее время ведутся активные работы, посвященные исследованию антигена ESAT-б в качестве основного компонента субъединичных вакцин (Derrick et al, 2004, Marei et al, 2005, Mmion et al, 2003) Представлялось весьма интересным исследовать антигенные и иммуногенные свойства белка ESAT-б, синтезируемого в эукариотической клетке Одним из самых простых способов решения поставленной задачи является

использование технологии ДНК-вакцин, которая позволяет осуществить экспрессию целевого гена непосредственно в организме млекопитающих (Fynan et al, 1993)

Для изучения иммуногенных свойств антигена ESAT-6 ген esxA был клонирован с использованием нереплицирующегооя эукариотического вектора pcDNA3 lmyohislacZ(-), который является одним из наиболее широко используемых векторов, обеспечивающих высокую эффективность экспрессии целевых генов Первичная нуклеотадная последовательность клонируемого гена в составе рекомбинантной плазмиды была подтверждена секвенированием района встройки с использованием праймеров (F4 и R4) по методу Сенгера она полностью соответствовала опубликованной ранее в литературе (http //genohst pasteur fr/TubercuList/1 Полученная рекомбинантная плазмида названа pONE6 и использовалась в дальнейшем для получения ДНК-конструкций

2 2. Оценка полисахаридного конъюгата в качестве системы доставки на примере МБЧ

Одной из главных проблем ДНК-иммунизации является быстрая деградация плазмидной ДНК нуклеазами макроорганизма (Gurunathan et al, 2000) Известно, что эффективность прямой инъекции плазмидной ДНК непосредственно в ткань очень низка (менее 1%) (Gurunathan et al, 2000) Судьба генетического материала, используемого при ДНК-вакцинации, разнообразна Основная его масса сорбируется на поверхности клеточных стенок и разрушается нуклеазами макроорганизма, и лишь незначительная часть проникает в клетки-мишени Поэтому для индукции иммунного ответа, способного проявлять протективные свойства, не только на мышиных моделях ТБ, но и у крупных животных необходимо использовать достаточно большие дозы ДНК-вакцины и многократные иммунизации, что, конечно, является недостатком данного подхода (Barry et al, 1999) Использование больших иммунизирующих доз может привести к индукции иммунного ответа по гуморальному типу (O'Hagan et al, 2001), а для обеспечения протектавного противотуберкулезного иммунитета ключевым является именно клеточное звено (Schaible, Kaufmann, 2000) Кроме увеличения иммунизирующей дозы существует еще один подход, который заключается в использовании адьювантов В качестве адьювантов часто применяются цитокины (Palendira et al, 2002) Однако применение любых цитокинов должно быть крайне осторожным, так как они являются тонкими регуляторами иммунной системы и любой дисбалано, вызванный неправильно подобранными дозами иммунорегуляторов, может привести к нежелательным последствиям Наиболее оптимальным подходом является использование эффективных систем доставки, которые не только могут снизить иммунизирующую дозу, но и способствовать направленной (адресной) доставки нуклеотидного материала в клетки (Dupuis et al, 2000) Таким образом, необходимо создание и исследование не только альтернативных BCG ДНК-вакцин, но и усовершенствование способов их защиты от деградации с целью эффективной доставки в иммунизируемый организм Для выполнения поставленных задач данной работы нами была выбрана полисахаридная система доставки, на основе которой ранее нашими коллегами были получены многообещающие конструкции вирусоподобные частицы (ВПЧ) и искусственные микобактериальные частицы (МБЧ) ВПЧ показали свою эффективность при стимуляции как Т-клеточного, так и гуморального иммунитета у мышей на рекомбинантные ДНК-вакцины и субъединичные белковые вакцины (Karpenko et al, 2003) В экспериментах на мышах МБЧ показали свою иммуногенность для Т- и B-клеточных звеньев иммунитета (Азаев, M Ш и др , 2004) Однако протективные свойства МБЧ до сих пор не были исоледованы Для оценки перспективности использования полисахаридного конъюгата в качестве системы доставки ДНК-конструкций на следующем этапе работы было проведено исследование протективных свойств МБЧ

Искусственные микобактериалъные частицы были получены Лебедевым ЛР по предложенной им с соавт методике (Lebedev et al, 2002) МБЧ представляют собой молекулярные конструкции, в качестве "центрального ядра" которых использовали двуспиральную РНК дрожжей штамма Saccharomyces cerevisiae М437 Y116 (дсРНК), а на поверхности - белки-антигены из вакцинного штамма BCG Известно, что синтетические и природные двуспиральные полирибонуклеотидные комплексы усиливают иммунный ответ при иммунизации, а используемая для получения МБЧ дсРНК является основным компонентом лекарственного препарата "Ридостин", который разрешен к применению в медицинской практике в качестве стимулятора неспецифической резистентности (ВФС 42-2457-94 Ридостин для инъекций) Белки-антигены из вакцинного штамма М bovis BCG были связаны с дсРНК за счет ионного взаимодействия

При электронной микроскопии МБЧ имеют шарообразный вид с диаметром около 10-25 нм Микрочастицы в полученном препарате сохраняют свою компактную структуру и способны противостоять дейотвию РНКаз При иммунизации мышей МБЧ способны вызывать повышенный синтез специфических антител и активировать клеточные факторы иммунного ответа (фагоцитарную активность и бласттрансформацию лф) (Азаев, М Ш и др , 2004) Однако эффективная иммуногенность не всегда коррелирует с протективными свойствами полученных конструкций Поэтому одной из задач данной работы стала оценка протективности МБЧ на животной модели ТБ

В работе для определения иммунопротективного эффекта МБЧ при туберкулезной инфекции использовали аутобредных морских свинок весом 250-300 г (по 20 животных в каждой группе), что позволило в сравнительно короткие сроки получить достоверные результаты об иммунопротекгивных свойствах созданных конструкций Известно, что эти животные настолько чувствительны к микобактериям, что даже очень небольшое число жизнеспособных бацилл вызывает развитие прогрессирующего ТБ, выявляющегося при микроскопии через несколько недель после заражения (Dannenberg, Jr, 1989) Работа проводилась на базе ГНУ Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока с участием кветн АН Донченко

Для однократной внутрикожной иммунизации использовали следующие препараты BCG, МБЧ и физиологический раствор

Внутрибрюшинное заражение 3-х групп животных проводили на 30 сут после иммунизации возбудителем бычьего туберкулеза М bovis, штамм 14х ВНИИБТЖ (103 микробных клеток в 0,5 мл физиологического раствора)

В иммунопрофилактике ТБ основным компонентом иммунологической перестройки являетоя активация клеточных факторов специфической защиты, прежде всего Т-лф и мф, а также их регуляторов, цитокинов (Визель А А и др, 1999) Фагоцитоз М bovis лейкоцитами иммунизированных животных изучали на 35-е сут после иммунизации Фагоцитарная активность определялась процентом фагоцитирующих клеток и количеством захваченных частиц на один фагоцит Из данных, представленных на рис 4, видно, что фагоцитарная активность лейкоцитарных клеток в группе животных, иммунизированных микобактериальными частицами достоверно выше, чем в группе животных, иммунизированных вакциной BCG и в контрольной группе Известно, что чем выше фагоцитарная активность, тем более подготовленной является иммунная система к встрече с патогенами, так как процессы разрушения микобактерий протекают более активно (Dannenberg, Jr, 1989, Flynn, 2004) Есть определенные основания полагать, что синтетичеокие частицы могут индуцировать усиление пролиферации CD8+ клеток Во-первых, возможна преимущественная презентация их по типу апоптозных везикул Кауфмана, обусловленная размером частиц (10-25 нм) Такие везикулы могут захватываться дендритными клетками и содержащиеся в них антигены vjuen презентироваться ГКГС I и CD1 системами, приводя к стимуляции CD8+ Т-клеток и, рестриктированных по CD1, Т-клеток (Kaufmann, 2001) Во-вторых, в состав МБЧ входит дсРНК, которая также стимулирует пролиферацию CD8+ Т-клеток (Kaipenko et al, 2003)

2 3

Группы ЖИВОТНЫХ

Рис. 4. Фагоцитарная

активность м он о ну еа рн ых клеток на 35-е сутки noc.ie вакцинации препаратами

(р<0,05): 1. ВС С; 2. МКЧ; 3. Физиологический раствор.

Анализируя результаты сравнительного изучения протектавных свойств испытуемых препаратов (табл. 1) было показано,, что протективная способность вакцины Ы. bovis BCG, выраженная процентом снижения риска инфекции п результате вакцинации, составляет 30 %, а для МБЧ она составила 50 %, При макроскопическом исследовании павших после заражения М bovis животных отмечались поражении бронхиальных, брыжсечньгл, иредло л «точных лимфатических узлов. Наиболее высокая частоте патологических изменений отмечалась в легких н в печени. При оценка резистентности при внутрнбргошиином заражении К4. bovis установлено, что иммунизация Животных МКЧ приводит к достоверному увеличению (р<0,05) СПЖ особей, погибших до окончания зкл ери мента. Гибель животных (из контрольной (+) группь:) наступала на 71+7 сутки (табл 1). Причинами смерти животных во время проведения эксперимента были, но данным вскрытия, прогрессирование лёгочной патологии и дыхательная недостаточность. В контрольной (-) группе нн такта ьи морских свинок в течений всего срока наблюдения (200 Сут) псгибших: или заболевших животных не было

Таблица 1

Чувствительность морских свинок, иммунизированных различными препаратами, к внутрнбрюшинному заражению М. bovis

Вид прел Прага Количество животных Б группе СПЖ Животных, сут Количество животных с туберкулезными изменениями Протективная способность, %

1.BCG 20 94±13 14 30

2. МКЧ 20 135+5 10 50

3. Физиологи Чески й раствор 10 71+7 10 0

Из представленных данных видно, что иммунизация МБЧ экспериментальных животиьгс способствует формированию противотуберкулезного иммунитета. Немалый вклад в его формирование вносит усиление фагоцитарной активности П олн морф неядерных клеток крови у иммунизированных животных, а также влияние деРНК на макрофаги и МК-клетки (неспецифические клетки-киллеры), приводящее к Индукции синтеза ИФН-у. Таким образом, было показано, что МБЧ не только обладают нммуногенностыо, но и про те кти вн остыо на животной модели ТЕ, а, следовательно,

являются перспективной моделью для исследования иммуногенных свойств различных высокоспецифичных антигенов, и в частности антигена ЕЭАТ-б

2.3. Получение препарата «Кр<ЖЕ6» на основе рекомбинантной плазмиды,

кодирующей антиген ЕвАТ-б, и полисахаридной системы доставки

Для получения экспериментального препарата «КрОМЕб» мы использовали плазмиду рОЫЕб и модифицированный полисахаридный конъюгат, аналог которого (в ВПЧ и МБЧ) продемонстрировал свою способность защищать нуклеотидный материал от нуклеазной деградации, а также способность индуцировать эффективный иммунный ответ против инфекционного агента (1,еЬес1еу е1 а1, 2002, Азаев М Ш и др , 2004)

Конъюгат из модифицированного полиальдегиддекстрана (МП) со спермидином получали из веществ, которые применяются в медицинской практике Так, например, хорошо зарекомендовали себя различные фракции, полученные при гидролитическом расщеплении декстрана в качестве плазмозамещающих препаратов, такие как полиглюкин (60±10 кДа) Способность к биодеградации позволяет применять его в качестве носителя белков и лекарственных веществ (ТвиЫиуа Й а1, 1952) Модификация полиглюкина периодатом на1рия позволяет вводить в его полимерные молекулы альдегидные группы, весьма активные в функциональном отношении Реакция протекает случайным образом с расщеплением глюкозного звена, содержащего свободные вицинальные гидроксильные группы

Для экспресс-контроля процесса активации декстрана (образования альдегидных групп) мы использовали в качестве хромофора бромистый этидий (ЕШг) Известно, что полисахариды не поглощают свет в ультрафиолетовой и видимой областях спектра (Сойев! еЛ а1, 1999), но в окисленном состоянии при наличии альдегидных групп в полимерной молекуле опособны связываться о ЕШг, образуя ковалентную овязь между альдегидной и аминогруппой Несвязавшийся хромофор удаляли экстракцией изоамиловым спиртом и измеряли интенсивность флуоресценции водного раствора полиглюкина при длине волны 540 нм Контроль за наличием альдегидных групп в очищенном растворе полиглюкина и в ходе сборки конъюгата (промежуточного и конечного) осуществляли в смеси по относительному изменению интенсивности флуоресценции (по уменьшению) Использование метода флуоресценции позволяет оценить только относительное увеличение концентрации альдегидных групп по возрастающей интенсивности флуоресценции в ходе протекания реакции и уменьшение концентрации альдегидных групп по уменьшению интенсивности флуоресценции, наблюдаемой в ходе сборки конъюгата При проведении экспериментов нами было установлено, что, несмотря на высокую реакционную способность альдегидных групп, полученные активированные препараты можно длительно сохранять в неизменном виде в водном растворе (в течение нескольких месяцев) без потери активности или в течение 3-х лет в лиофилизированном состоянии В нашем работе концентрация получаемых активированных препаратов МП в пересчете на альдегидную группу составляла 0,2 М

Предлагаемая методика активации полиглюкина позволяет получать активированный полиглюкин в препаративных количествах, достаточных для сборки конъюгатов в разных условиях (соотношение компонентов конъюгата, рН, использование различных буферов для сборки и т п)

Весьма важным моментом, на наш взгляд, является порядок сборки такого рода конъюгатов, которая должна осуществляться последовательно Первый этап сборки заключается в образовании ковалентной связи между конъюгатом МП и спермидином Второй этап - получение конечного конъюгата - МП-спермидин-ДНК рОКЕб, основанный на электростатическом взаимодействии положительно заряженных

аминогрупп спермидина (вторая свободная аминогруппа) в слабокислой среде с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК (Braunlm et al, 1982)

Спермидин относится к природным полиаминам, а его комплекс с ДНК обладает повышенной устойчивостью к действию нуклеаз (Dunlap et al, 1997) Прочность конъюгата, если принимать во внимание результаты, полученные ранее в работе (Raspaud et al, 1998), в значительной степени зависит от концентрации добавленного к ДНК спермидина, а также наличия моновалентных катионов Не менее важной составляющей процесса конденсации (осаждения из раствора) является первоначальная концентрация ДНК (Pelta et al, 1996) Таким образом, прежде чем образовать конечный конъюгат, необходимо обратить внимание на степень модификации полиглюкина чем она выше, тем выше вероятность образования устойчивого конечного конъюгата благодаря созданию в составе первичного конъюгата — МП-спермидин — высокой концентрации спермидина

Степень связывания (т)) альдегидных групп со спермидином в первичном конъюгате (после осуществления 1-го этапа сборки) оценивали по отношению разности интенсивностей флуоресценции (ИФ) конъюгата полиглюкина с бромистым этидием (МП-EtBr) до присоединения спермидина и после его присоединения (МП-спермидин-Effir) к исходной интенсивности флуоресценции по формуле

т] (%) = [ИФСМП-EtBr) - ИФ(МП-спермидин-ЕШг)] х 100 % / ИФ(МП-Е1Вг) В нашем эксперименте она составила 90 %

Концентрацию ДНК по окончании сборки в конечном конъюгате оценивали спектрофотометрически - измеряли оптическую плотность раствора при 260 нм Отношение плазмидной ДНК к МП в конечном препарате составило 0,6 мг плазмиды на 1 мгМП

Таким образом, нами были получены экспериментальный препарат «KpONE6», представляющий собой рекомбинантную ДНК pONE6 с полиглюкин-спермидиновым конъюгатом, и контрольный препарат «KpcDNA», представляющий собой нативную плазмидную ДНК pcDNA с полиглюкин-спермидиновым конъюгатом

Для проверки полноты упаковки нуклеотидного материала в собранной конструкции проводили ее обработку ДНКазой Было показано, что исходная плазмидная ДНК pcDNA3/lmychislacZ(-), взятая в качестве контроля в той же концентрации, что и при использовании препарата-конъюгата, полностью деградировала уже через 30 мин инкубации при 37 С, а в собранной конструкции нуклеотидный материал сохранялся в течение 9 ч при тех же условиях нуклеазной обработки На основании полученных результатов в этом эксперименте от vitro мы предположили, что полисахаридная оболочка позволигзащитить генетический материал от деградации и в живом организме

2 4 Изучение иммуиогенных свойств экспериментального препарата «KpONE6» и

безопасности его применения на животной модели

На данном этапе исследования животные модели необходимы для изучения иммунного ответа т vivo, а также для оценки эффективности и безопасности разрабатываемых экспериментальных препаратов Нами была выбрана мышиная модель, которая является относительно экономичной и удобной, т к отвечает требованию схожести ключевых иммунных реакций на инфекцию с таковыми у человека Известно, что и у человека, и у мышей защита от ТБ опосредована действием CD4+ и CD8+ Т-клеток, раньше всего развиваются реакции типа Thl, опосредующие протективный иммунитет путём высвобождения ИФН-у и других цитокинов Лишь в последующем разворачиваются протективные реакции ТЪ2-типа, сопровождающиеся привлечением Th и продукцией AT, вызванных накоплением антигенов уже погибших микобактерий (Hemandez-Pando et al, 1997)

Исследование иммуногенных свойств препарата «КрОЫЕб» проводили после трехкратной внутримышечной иммунизации мышей линии ВАЬВ/о В качестве контроля использовали 2 группы животных одну группу иммунизировали контрольным препаратом «КрсВИА», вторую - физиологическим раствором Оценку показателей иммунитета проводили на 7,14, 21, 28,35 и 45 сутки после иммунизации

При исследовании экспериментальных препаратов на животных моделях важно не только оценить их иммуногенность, но и проверить безопасность их применения для живого организма, так как безопасность придает смысл дальнейшим исследованиям препаратов, предназначенных для применения в живых системах Важным показателем безопасности препаратов является отсутствие «острой» токсичности при иммунизации ими лабораторных животных Поэтому на следующем этапе нашей работы мы уделили внимание оценке этого показателя Для этого после иммунизации мышей различными препаратами в течение 10 оуток проводили ежедневную регистрацию - гибели животных, - веса, - наличия или отсутствия возможных клинических симптомов интоксикации (снижение веса, подвижность животных, внешний вид), - повреждений в месте инъекции

Результаты исследования показали, что испытуемая генетическая конструкция в выбранной форме, дозе и способе применения не вызывает снижения веса и каких-либо симптомов расстройства здоровья у используемых животных и не обладает «острой» токсичностью Также не было найдено достоверных отличий между опытной и контрольными группами

При изучении безопасности препаратов проводилась также оценка гематологических показателей лабораторных животных (лейкоцитарная формула, количество эритроцитов, ретикулоцитов, лейкоцитов, тромбоцитов) до иммунизации, через 24 ч и на 7 сутки после каждого введения исследуемого препарата по общепринятой методике клинического анализа крови (Козловская ЛВ, Николаев АЮ, 1984) Исследование крови является важным этапом в оценке безопасности изучаемого препарата, так как кроветворные органы чрезвычайно чувствительны к различным физиологическим и особенно патологическим воздействиям на организм Полученные данные свидетельствуют об отсутствии достоверно значимых различий показателей периферической крови иммунизированных групп лабораторных животных Экспериментальный препарат «КрОЫЕб» не оказывал оущеотвенного влияния на гематологические показатели (табл 2)

Анализируя данные, представленные в табл 2, можно отметить, что иммунизация животных препаратами «КрОМЕб», «КрсБКА», а также физиологическим раствором не приводила к существенным изменениям лейкоцитарной формулы крови, а варьирование данных показателей находилось в пределах физиологической нормы

Таблица 2

Гематологические показатели крови мышей в разные сроки после иммунизации различными препаратами

Срок, сут Гемоглобин, г/л Эритроциты, 1012/л Ретикуло-циггы,% Тромбоциты, Ю'/л Лейкоциты, Ю'/л Нейтрофилы п/я,Ю'/л Нейтрофилы с/я,Ю'/л Эозинофилы, Ю'/л Моноциггы, Ю'/л Лимфоциты, Ю'/л

«КрОЫЕб»

1 156,6±6,35 8,964±0,27 5,18±2,34 569,96±23,44 14,08*0,55 0,16±0,05 4,12*0,28 0,24*0,05 0,54*0,05 9,04*0,34

7 154,4±3,78 8,98±0,16 5,18*2,28 584,46*20,47 13,86*0,55 0,16*0,05 3,94*0,38 0,28±0,04 0,5±0,1 8,94*0,36

15 159,2±6,83 8,774±0,18 5,18±1,33 607,34*35,71 13,82*0,41 0,12*0,04 3,86*0,24 0,32*0,04 0,5*0,1 9*0,23

21 162,2±6,94 8,934±0,28 6,14±2,49 593,18±32,05 14,24*0,51 0,2*0,04 4,02*0,26 0,36±0,05 0,46*0,05 9,22±0,3

29 157,6±7,8 9,054±0,23 4,16±1,36 587,9*11,20 13,6±0,29 0,18*0,04 3,78*0,15 0,3±0,07 0,5±0,07 8,84±0,21

35 160,8±4,44 8,69б±0,24 6,86±1,82 603,72*34,39 13,86*0,33 0,18*0,04 3,92*0,16 0,28*0,11 0,48*0,04 8,94±0,36

«КрсША»

1 159,4±7,09 9,Ю4±0,34 6,26±2,63 593,22*34,63 14,14*0,21 0,18*0,04 4,1*0,22 0,32*0,04 0,5±0,07 9,02*0,2

7 156,2±6,38 9,098±0,32 7,54±1,52 617,08*28,13 13,76*,32 0,16±0,05 3,86*0,21 0,28±0,08 0,5±0,1 8,96*0,25

15 1б2±6,24 8,8б±0,36 6,48±3,04 618,14±7,63 14,24±0,44 0,14*0,05 4,14*0,15 0,28±0,08 0,52±0,04 9,16*0,38

21 157,4±7,57 9,132±0,39 6,58*2,55 590,2*32,41 13,72*0,16 0,14*0,05 3,92*0,34 0,3±0,07 0,48*0,08 8,86±0,26

29 159,8±6,06 9,06±0,29 6,36±1,9 579,06*27,57 13,94±0,48 0,16*0,05 4,04*0,33 0,3±0,1 0,4б±0,09 8,96*0,18

35 162,4±5,9 8,934±0,28 4,42±2,48 620,98±25,85 13,92±,56 0,2*0,03 3,88*0,31 0,28±0,08 0,48±0,08 9,08*0,43

Физиологический раствор

1 153,8±5,76 9,13±0,32 4,92±2,27 596,98*27,7 14,08*0,54 0,16*0,05 4,2±0,29 0,28±0,04 0,52±0,08 8,9±0,29

7 160,4±4,93 8,854±0,05 5,52±2,71 601,26*23,92 13,8*0,58 0,18*0,04 3,86*0,36 0,3±0 0,52*0,08 8,94*0,39

15 159±4,74 8,904±0,45 6,6±2,67 615,72±31,8 13,68*0,37 0,18*0,04 3,9*0,34 0,26*0,05 0,48*0,08 8,84±0,24

Примечание п/я -палочкоядерные, с/я сегментоядерные

Одним из важных моментов изучения иммуногенности экспериментальных препаратов является оценка содержания ключевых медиаторов иммуногенеза

Анализ продукции ИФН-у у животных, иммунизированных экспериментальным препаратом «КрОЫЕб», свидетельствует о том, что его концентрация возрастала на 14 и 35 сут (рис 5) При этом на 21 сут его концентрация снижалась и начинала нарастать концентрация ИЛ-10 и достигала своего максимума на 28 сут (рис 5)

14 21 28 35

Сутки пооле 1-й иммунизации

—□— «КрСХЫЕб» —•— Контроль

— «KpcDNA» —О— Контроль - <<KpONE6» - -Ar - «KpcDNA»

Рис. 5 Динамика продукции ИФН-у (сплошная линия) и ИЛ-10 (прерывистая линия) при иммунизации мышей препаратом <<KpONE6>> - квадратный маркер, препаратом «KpcDNA» - треугольный маркер, физиологическим раствором (контроль) -круглый маркер

Известно, что выбор типа хелперов происходит на ранней стадии формирования иммунного ответа и часто является селективным То есть, при формировании Thl происходит подавление предшественников Th2, и наоборот В регуляции важную роль играют определенные цитокины В процессе развития иммунных реакций на специфические антигены Thl и ТЬ2-клетки проявляют признаки перекрестной регуляции, способствующей доминированию одной из этих субпопуляций Продукция ИФН-у Thl-клетками ингибирует пролиферацию ТЬ2-клеток В свою очередь вырабатываемый Th2-клетками ИЛ-10 угнетает функцию Thl-клеток, а ИЛ-4 подавляет размножение Thl-клеток (Maggi et al, 1992)

На экспериментальных моделях также показано, что протективный ответ при туберкулезе ассоциирован с активацией Thl (Sugawara et al, 2004), (Cliff et al, 2004) ИЛ-10 регулирует переключение от Thl-иммунного ответа к Th2 и тем самым благоприятствует В-клеточной активации С подъемом концентрации ИЛ-10 на 28 сутки можно связать состояние иммунодепрессии у иммунизированных животных, которое выражалось в снижении концентрации ИФН-у и снижении пролифератавной активности спленоцитов в РБТЛ на 28 сутки (рис б) Активация Thl фенотипа лф и возможное влияние на баланс Thl/Th2 клеток в сторону уменьшения активности последних позволяет объяснить полученные результаты повышения уровня цитокина - ИФН-у Повторное увеличение концентрации ИФН-у на 35 сутки восстанавливает баланс между Thl и Th2, подавляет продукцию ИЛ-10 и тем оамым способствует выходу из состояния иммунодепрессии

При оценке специфической активности экспериментального препарата в отношении показателей иммунной системы необходимо исследовать ее действие не только на уровень секретируемых иммунокомпетентными клетками растворимых медиаторов

декретируемых иммунокомпетентными клетками растворимых медиаторов иммуногенеза, ко и исследовать следствия изменения продукции цитокинов, то есть изучать клеточный и гуморальный ответ.

Гуморальный иммунный ответ оценивали по обнаружению специфических AT в сыворотке иммунизированных животных в реакции непрямого иммуноферментного анализа путём сравнения значений оптической плотности, полученной при анализе сывороток животных экспериментальной и контрольной групп. Иммунизация животных экспериментальным препаратом «KpONE6» не приводила к выработке специфических AT у иммунизированных животных в концентрациях, детектируемых методом ИФА. Сыворотка животных контрольных групп так же не реагировала с антигеном GST-ESAT-6 на протяжении всего эксперимента. Известно, что ДНК-иммунизация стимулирует в основном клеточное звено иммунного ответа, а гуморальный иммунный ответ активируется опосредованно за счет действия медиаторов со стороны активированных Th и цитотоксических лф (Donnelly et aL, 2005). По этой причине при ДНК-вакцинации обычно не удается достичь высокого уровня гуморального иммунного ответа. Очевидно, что вызванная иммунизацией активация Thl-лф приводит к подавлению активности Th2-клеток и, соответственно, угнетению продукции AT (Nicholson, Kucliroo, 1997).

Качественную оценку клеточного иммунитета проводили с использованием реакции бласттрансформации лимфоцитов по индексу стимуляции (ИС), который характеризует отношение пролиферации спленоцитов, индуцированных специфическими антигенами к спонтанной пролиферации спленоцитов. В качестве специфического антигена выступал рекомбннантный белок GST-ESAT-6, а в качестве неспецифического контроля - GST-CFP10. Было показано, что иммунизация препаратом «KpONEö», вызывает достоверное увеличение ИС на 14 и 35 сут после иммунизации (рис, б). При этом не наблюдалась пролиферация спленоцитов иммунизированных животных при использовании для стимуляции in vitro гетерологичного антигена - GST-CFP10: ИС на протяжении всего эксперимента варьировал в пределах от 0,98±0,04 до 1,09±0,08 (данные не представлены). В контрольных группах мышей, иммунизированных контрольным препаратом «KpcDNA» или физиологическим раствором, не отмечается выраженной пролиферативной активности в ответ на стимуляцию специфическими антигенами. Таким образом, результаты исследования, представленные на рис. б, свидетельствуют о том, что иммунизация мышей препаратом «КрОЫЕб» вызывала формирование клопа клеток памяти, реагирующих выраженной пролиферацией при стимуляции in vitro

Рис. 6. Динамика пролиферативной активности (ИС) спленоцитов животных, имиун игар ованвых

«KpONEö» (тёмные столбики), «KpcDNA» (столбики си штриховкой), физ. раствором (светлые столбики) при стимуляции рекомбннантный белком GST-ESAT-6.

специфическим антигеном GST-ESAT-6.

7 11 21 IS 3S 4S Сутки после 1-Й иынуниз&цки

■ nKpONE6' О "KpcDNA' □ фнз. раствор

(ФГА, КонА, ЛПС - липополисахарид) Следует отметить, что спленоциты иммунизированных животных отвечали повышенной пролиферацией при использовании Т-клеточных митогенов (КонА и ФГА) на всем сроке наблюдения Это достоверная характеристика того, что иммунизация не вызывала супрессивного действия на организм животных При использовании В-клеточного митогена (ЛПС) ИС не показал высоких значений ни в одной из исоледуемых групп животных, что можно объяснить его некоторым общим супрессивным действием на клетки Иммунизация достоверно не изменяла пролиферативный ответ Т- и В-лимфоцитов селезенки на митогенные стимулы -ФГА, КонА и ЛПС

Важным показателем индукции Т-клеточного иммунного ответа является формирование клона специфических лимфоцитов, образующихся в ответ на введение иммуногена и отвечающих продукцией цитокинов Поэтому следующим этапом нашей работы было исследование способности препарата «КрОИЕб» индуцировать клеточный цитотоксический ответ, который оценивали по выявлению ИФН-у-продуцирующих лимфоцитов в реакции ЕЫЭРОТ Мы остановили свой выбор на обнаружении ИФН-у-продуцирующих клеток, поскольку данный цитокин образуется в ооновном в цитотокоических лимфоцитах и является важным медиатором противотуберкулезного иммунитета (8Ьа1а й а1, 2002) Полученные данные анализа Е1Л8РОТ (табл 3) показывают увеличение числа клеток, продуцирующих ИФН-у в ответ на стимуляцию ОЭТ-ЕБАТ-б на 14 и 28 сут, что свидетельствует о формировании специфического клеточного иммунитета Ранее уже было показано, что антиген ЕвАТ-6 является сильным Т-клеточным иммуногеном, индуцирующим синтез ИФН-у (Я1до1 е! а1, 2000)

При использовании в качестве неспецифического стимулятора ФГА количество ИФН-у-продуцирующих клеток составляло порядка 400-600 клеток/10'спленоцитов Специфичность данных анализа РБТЛ и ЕЫБРОТ подтверждена отсутствием выраженной пролиферации при стимуляции гетерогенным иммуногеном (ОБТ-СИРЮ)

Таблица 3

Количество ИФН-у-продуцирующих спленоцитов у животных, иммунизированных раздичными препаратами, после стимуляции т уЧго рекомбинантным антигеном ОвТ-ЕвАТ-б в Е1ЛвРОТ

Вид препарата Количество ИФН-у - секретирующих антигенспецифичных клеток в пробе в разные точки ы

14-е сутки 28-е сутки

«KpONE6» 86,3 ±7,4 313,3 ±26,7

«KpcDNA» Я —-______....______ 15,6 ±3,5 225 ±20,1

В таблице предотавлены средние значения количества ИФН-у-продуцирующих клеток ± стандартное

Таким образом, на основании изложенных результатов можно сделать вывод, что полученный экспериментальный препарат «KpONE6», содержащий рекомбинантную плазмидаую ДНК, кодирующую микобактериальный антиген ESAT-6 и окруженную полисахаридной оболочкой, в результате трехкратной внутримышечной иммунизации индуцирует специфический клеточный иммунный ответ у мышей, а значит, способен обеспечить защиту ДНК от воздействия дезоксирибонуклеаз не только т vitro, но и т

VIVO

Заключение

Нарастание угрозы ТЕ на фоне недостаточной эффективности вакцины В CG и несовершенной диагностики этого заболевания приводит к очевидной необходимости более глубокого и внимательного изучения микобактерий Треть населения нашей планеты инфицирована микобактериями ТБ и подвержена опасности развития этого заболевания

Применение специфических микобактериальных антигенов позволяет создать и разработать более эффективные противотуберкулезные вакцины и эффективные высокоспецифичные методы диагностики ТБ Одним из наиболее перспективных агентов является антиген ESAT-6, кодируемый делегированной из вакцинных штаммов BCG, но присутствующей в патогенных микобактериальных штаммах генной областью RDI

В результате проделанной работы было проведено конструирование рекомбинантной плазмиды, несущей микобактериальный антиген ESAT-6, и клонирование ее в штамм Е coli С помощью ИФА, используя панели сывороток здоровых и больных ТБ лиц, были изучены антигенные свойства полученного рекомбинантного белка Показано, что данный рекомбинантный антиген способен выявлять ТБ-специфичные IgG в сыворотках пациентов, о уровнем чувствительности 60 % и уровнем специфичности 95 % Было так же показано, что рекомбинантный антиген GST-ESAT-б пригоден для дифференциальной диагностики инфицирования ТБ от поствакцинального иммунитета с использованием проб цельной крови в ELISA/ИФН-у анализе

Кроме того, антиген ESAT-6 был встроен в эукариотическую экспрессионную плазмиду и клонирован в клетках Е coli Полученная рекомбинантная плазмида легла в основу экспериментального препарата «KpONEô» - кандидатной ДНК-вакцины с использованием полисахаридной системы доставки В данной работе была проведена предварительная оценка перспективности применения полисахаридной системы доставки экспериментальных препаратов на примере микобактериальных частиц при иммунизации ими морских свинок Оказалось, что система МБЧ способствует формированию эффективного протективного иммунного ответа у животных против ТБ В дальнейшем была проведена оценка иммуногенных свойств экспериментального препарата «KpONEô» при иммунизации мышей, и было показано, что антиген ESAT-б индуцирует специфичный Т-клеточный иммунный ответ, а используемая полисахаридная система доставки не обладет токсичностью и защищает нуклеотидный материал от нуклеазной деградации

Таким образом, антиген ESAT-6 является перспективным кандидатом в вакцинопрофилактике ТБ, а рекомбинантный белок GST-ESAT-6 может применяться для дифференциальной диагностики ТБ

Выводы

1 Сконструирована плазмида pGEX-2T/ESAT-6, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка GST-ESAT-б в клетках Е coli, способного выявлять туберкулезоспецифичные IgG в сыворотках пациентов с уровнем чувствительности 60 % и уровнем специфичности 95 % в ИФА

2 Показана возможность использования рекомбинантного белка GST-ESAT-6 для дифференциальной диагностики активного туберкулеза и поствакцинального иммунитета с помощью ELISA/ИФН-у анализа Чувствительность данного метода с использованием в качестве стимулирующего антигена GST-ESAT-6 составила 72±11 % при специфичности более 94 % При использовании же в качестве антигена PPD чувствительность метода составила 94±6 % при специфичности 33±11 %

3 Показано, что искусственные микобактериальные частицы на основе полисахаридного коньюгата и экспонирующие на своей поверхности суммарные белки М bovis BCG, обладают иммуногенностью и протективными свойствами на экспериментальной модели животных Протективная способность МБЧ составляет 50 %, а для вакцины М bovis BCG - 30 % Иммунизация животных МБЧ приводит к достоверному увеличению (р<0,05) СПЖ особей до 135±5 суток по сравнению с контрольной группой (71+7 суток)

4 Создан экспериментальный препарат «KpONEö», содержащий в центральной части плазмидную ДНК pONE6, кодирующую антиген ESAT-6, и окруженный полисахаридной оболочкой из молекул модифицированного полиглюкина и спермидина, способной защищать нуклеотидный материал от деградации под действием нуклеаз

5 Показано, что трехкратная внутримышечная иммунизация с интервалом 14 суток препаратом «KpONE6» в дозе 12 мкг на животное приводит к формированию специфического клеточного иммунитета у мышей линии BALB/c При этом экспериментальный препарат «KpONE6» не оказывает значимого влияния на гематологические показатели иммунизированных животных и не обладает «острой» токсичностью

Основные результаты опубликованы в следующих работах

1 Татьков С И, Туманов Ю В , Носарева О В, Болдырев А Н, Смирнова О Ю, Лебедев ДР, Порываева В А, Ивлев-Дунтау А П, Ткаченко С Б, Стрелис А К, Новицкий В В , Уразова О И, Воронкова О В Применение рекомбинантных видоопецифических белков микобактерий туберкулеза для серологической диагностики инфекции // Эпидемиология и вакцинопрофилактика -2006 - №4 (29) -С 42-47

2 Татьков СИ, Носарева ОВ, Болдырев А, Н, Смирнова ОЮ, Туманов ЮВ, Лебедев ДР, Порываева В А, Ивлев-Дунтау А П, Аутеншлюе А И, Ткаченко С Б, Стрелис А К, Новицкий В В , Уразова О И, Воронкова О В Применение рекомбинантных видоопецифических белков М tuberculosis для серологичеохой диагностики туберкулёза // Клиническая и лабораторная диагностика -2006 -№12 -С 23-34

3 Туманов Ю В, Смирнова О Ю, Болдырев А Н, Носарева О В, Варакоин Н А, Татьков СИ Рекомбинанише белки Мtuberculosis в диагностике туберкулеза легких II Мед иммунология -2006 2-3 -С 294-295

4 Азаев М Ш, Лебедев Л Р, Кузьмичева Г А, Туманов Ю В , Донченко Н А, Татьков С И, Носарева О.В, Ильичев А А Исследование роли искусственных микобактериальных частиц в реализации иммунологических процессов при экспериментальном туберкулезе животных // Проблемы туберкулеза и болезней легких -2007 -№2 -С 38-48

Тезисы конференций:

1 Носарева О В, Смирнова О Ю, Болдырев А Н, Туманов Ю В , Татьков С И Использование рекомбинантных белков в диагностике ТБ // Сборник трудов Международного симпозиума «Интегративная Медицина в XXI веке», Судак, Украина -2004 -С 23

2 Nosareva О., Smimova О, Boldyrev А, Tumanov Yu Azaev М , Lebedev L, Tatkov S Construction of artificial virus-like particles exposing Mycobacterial ESAT-6, and the study of their immunogenic properties // Abstract book Keystone Symposia "Tuberculosis Integrating Host and Pathogen Biology" Whistler, British Columbia, Canada -2005 -P 94

3 Носарева OB Конструирование микрочастиц, содержащих рекомбинантный антиген ESAT-б для получения экспериментальной вакцины против туберкулеза Науки о человеке материалы VI конгресса молодых ученых и специалистов // Под ред ЛМ Огородовой, Л В Капилевича - Томск СибГМУ -2005 -С 25

4 Nosareva О , Nesterov А , Ignatyev G, Smimova О , Boldyrev А , Tumanov Yu , Tatkov S Investigation of the Virus Like Particles as the delivery system for presenting DNA-vaccme against ТВ to immune system" // International Congress "New Approaches to Vaccine Development From the bench to the field", Berlin, Germany -2005

5 Носарева О В, Нестеров А Е, Смирнова О Ю, Болдырев А Н, Туманов Ю В , Татьков СИ Конструирование частиц на основе ПАД и исследование их свойств в качестве системы доотавки ДНК-вакцин против туберкулёза // Международная школа-конференция «Системная биология и биоинженерия» -Москва -2005 -С 198

6 Туманов Ю В , Смирнова О Ю, Болдырев А Н, Носарева О В , Татьков С И, Ивлев-Дунтау А П Рекомбинантные белки М tuberculosis в диагностике ТБ легких Н «Новые технологии в интегративной медицине и биологии», «Стресс и экстремальные состояния» Международный Междисциплинарный семинар, Бангкок-Патайя, Тайланд Труды Семинара и Научного Дискуссионного Клуба/Под ред И В Тимофеева, Н Г Перминовой-Новосибирск, Типография НИИ Катализа СО РАН -2006 -С 74-75

7 Азаев М Ш, Королев С А, Лебедев Л Р, Кузьмичева Г А, Туманов Ю В , Носарева О В, Татьков С И Микобактериальные частицы как новое средство иммунопрофилактики туберкулезной инфекции // «Новые технологии в интегративной медицине и биологии», Бангкок-Патайя, Тайланд Труды Семинара и Научного Дискуссионного Клуба/Под ред И В Тимофеева, Н Г Перминовой - Новосибирск, Типография НИИ Катализа СО РАН -2006 -С 6-7

8 О Nosareva, A Nesterov, A Boldyrev, О Smirnova, Yu Tumanov, S Tatkov Immunological studies DNA-vaccme enooded ESAT6 antigen The Second International Conference on ТВ Vaccines for the World, The Austrian Industrial Association, Vienna, Austria,19-21 April 2006

9 Носарева О В, Нестеров А Е, Болдырев А Н, Смирнова О Ю, Туманов Ю В, Татьков С И. Исследование экспериментального препарата на основе микобактериального антигена ESAT6 Международная школа-конференция молодых ученых «Биотехнология будущего» в рамках Международного Симпозиума «ЕС—Россия перспективы сотрудничества в облаете биотехнологии в 7-ой Рамочной программе» - Санкт-Петербург -2006 -С 72

10 Носарева О В, Нестеров АЕ, Татьков СИ Конструирование экспериментального препарата на основе полиальдегиддекстрана и исследование его свойств в качестве системы доставки ДНК-вакцины против туберкулеза Проблемы фундаментальной и прикладной медицины Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых в рамках 13 Международного конгресса по приполярной медицине, Новосибирск ООО «РИЦ» -2006 -С 39

11 Болдырев АН, Носарева ОВ, Смирнова ОЮ, Туманов ЮВ, Татьков СИ Применение рекомбинантных видоспецифических белков М tuberculosis для серологической диагностики ТБ Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера Ш Российская научная конференция с международным участием, Новосибирск ЦЭРИС -2006 -С 134

12 Туманов Ю В , Болдырев А Н, Смирнова О Ю, Лебедев ЛР, Азаев МIII, Носарева О В, Ивлев-Дунтау А П, Татьков С И Выявление маркеров Т-клеточного иммунитета в видоспецифической диагностике туберкулеза Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера Ш Российская научная конференция с международным участием -Новосибирск ЦЭРИС -2006 -С 166

13 Nosareva О., Nesterov A, Boldyrev A, Smimova О, Tumanov Yu, Tatkov S Immunological responses after immunization of mice with DNA plasmid encoded ESAT6 antigen with polysaccharide matrix // Abstract book 16th ERS Annual Congress, Munich, Germany -2006 -P 342

14 Nosareva О, Nesterov A, Ignatyev G, Smimova О, Boldyrev A, Tumanov Yu, Tatkov S The Mycobacterium antigen ESAT6 as the DNA-vaccme and diagnostic targets // First Summer School on Infectious diseases — affecting civil societies", Berlm, Germany -2006

15 Nosareva О, Nesterov A , Ignatyev G, Smimova О , Boldyrev A, Tumanov Yu, Tatkov S Immunological studies DNA-vaccme encoded antigen ESAT6 // Strengthening Human Resources for better lung health 37th Union World Conference on Lung Health Pans, France, 31 October - 4 November 2006

16 Nosareva О, Nesterov A, Boldyrev A, Smimova О , Tumanov Yu, Tatkov S The Mycobacterium antigen ESAT-6 as the DNA-vaccme and diagnostic targets // 3rd Vienna Vaccmes Conference, «Challenges for Vaccme Development Medical Need and Social Implications», Baden near Vienna-2007-P 72

17 Туманов Ю В , Болдырев A H, Носарева О В, Смирнова О Ю, Татьков С И Использование рекомбинантных микобактериальных антигенов в диагностике ТБ легких//ТВ, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении Тезисы ПРоссийско-Германской конференции Форума Коха-МечниковаДомск.-

18 Туманов Ю В , Болдырев А Н, Смирнова О Ю , Лебедев ЛР , Азаев М.Ш, Носарева ОВ, Ивлев-Дунтау АП, Татьков СИ Видоспецифическая диагностика ТБ по маркерам Т-клеточного иммунитета //ТБ, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении Тезисы П Российско-Германской конференции Форума Коха-Мечникова, Томск.-2007 -С 36

19 Носарева ОВ, Нестеров АЕ, Смирнова ОЮ, Болдырев АН, Татьков СИ. Изучение иммунного ответа на противотуберкулезную ДНК-вакцину, модифицированную полисахаридом.//ТБ, СПИД вирусные гепатита, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении Тезисы ПРоссийско-Германской конференции Форума Коха-Мечникова, Томск. -2007 -С 76

2007 -С 34

ФГУНГНЦВБ "ВЕКТОР" 3 т 100 2007г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Носарева, Олеся Валерьевна

Список принятых сокращений.

Введение.

Научно-практическая значимость работы.

Положения, выносимые на защиту.

Структура диссертации.

Апробация работы и публикации.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эпидемиология туберкулёза.

1.2. Особенности противотуберкулёзного иммунитета.

1.2.1. Врождённый иммунитет.

1.2.2.Приобретённый иммунитет.

1.2.2.1. Клеточный иммунитет.

1.2.2.2. Гуморальный иммунитет.

1.3. Диагностика туберкулёза.

1.4. Вакцинопрофилактика туберкулёза.

1.4.1. Вакцина BCG.

1.4.2. Новые вакцины.

1.4.3. Системы доставки для рекомбинантных белков и ДНК-вакцин.

1.5. Роль изучения генома в борьбе против туберкулёза.

1.5.1. Область RD1.

1.5.2. Антигены ESAT-6 и CFP10.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Молекулярно-биологические методы.

2.2.2. Иммунологические методы.

2.2.3. Статистическая обработка полученных результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Получение и исследование свойств гибридного белка GST-ESAT-6.

3.1.1. Получение гибридного бежа GST-ESAT-б.

3.1.2. Анализ антигенных свойств гибридного белка GST-ESAT-6.

3.1.2.1. Использование гибридного белка GST-ESAT-6 в ИФА.

3.1.2.2. Использование гибридного белка GST-ESAT-6 в ELISA/HOH-y.9() 3.2. Получение и исследование иммуногенных свойств препарата «КрОЫЕб» на основе рекомбинантной ДНК, кодирующей микобактериальный антиген ESAT-6, и полисахаридного конъюгата.

3.2.1. Клонирование последовательности ДНК, содержащей ген esxA.

3.2.2. Оценка полисахаридного конъюгата в качестве системы доставки на примере МБЧ.

3.2.3. Получение препаратов «КрОЫЕб» и «KpcDNA».

3.2.4. Оценка степени защиты ДНК в составе экспериментального препарата при воздействии нуклеаз.

3.2.5. Схема проведения эксперимента.

3.2.6. Оценка «острой» токсичности экспериментальных препаратов.

3.2.7. Оценка гематологических показателей лабораторных мышей.

3.2.8. Определение концентрации цитокинов в сыворотке крови иммунизированных животных.

3.2.9. Индукция гуморального иммунного ответа иммунизированных мышей на антиген ESAT-6.

3.2.10. Индукция клеточного иммунного ответа иммунизированных мышей на антиген ESAT-6.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунобиологические свойства рекомбинантного антигена ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis"

С туберкулёзом (ТБ) человечество знакомо очень давно. Однако мы до сих пор очень мало знаем о механизмах, позволяющих микобактериям в обход защитных сил организма длительное время сосуществовать в виде латентной инфекции и поджидать подходящего случая для поражения своего хозяина (Stewart et al., 2003; Tufariello et al., 2003). В настоящее время одна треть мирового населения имеет латентную форму ТБ и сталкивается с риском перехода этой болезни в открытую форму. Несмотря на предпринимаемые мировым сообществом меры неуклонно продолжает возрастать распространение лекарственно-устойчивого ТБ. В октябре 2006 г ВОЗ декларировала появление форм с широкой лекарственной устойчивостью, для лечения которых отсутствуют эффективные лекарственные средства. Поэтому возрастает роль иммунопрофилактики и ранней диагностики заболевания. В настоящее время для вакцинопрофилактики ТБ применяется живой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG), однако, индуцируемый им протективный эффект варьирует от 0 до 80 % (Aronson et al., 2004).

Исторически сложилось так, что для скринингового выявления инфицированных ТБ лиц применяется кожный тест, основанный на использовании грубого экстракта фильтрата культур М. tuberculosis — туберкулина, или PPD (purified protein derivative), для определения реакций клеточного иммунитета, вызываемых микобактериями. Специфичность туберкулиновых тестов ограничена невозможностью дифференцировать заболевание от поствакцинального состояния либо от инфицирования невирулентными микобактериями. Точный диагноз ТБ предусматривает обнаружение М. tuberculosis в материале от пациента, но микроскопические исследования не позволяют выявлять абациллярных больных и больных нелёгочными формами ТБ, а культуральные методы ещё требуют длительного времени для постановки диагноза. В настоящее время активно исследуется возможность использования новых высокоиммуногенных видоспецифичных антигенов в диагностике ТБ. Однако и здесь остаются проблемы, как, например, повышение чувствительности таких диагностических тестов без снижения их специфичности.

С развитием современных методов исследования генома мы приблизились к разгадке проблем вирулентности микобактерий и к возможности создания более эффективных препаратов вакцинопрофилактики ТБ. В 1996 г путём сравнения геномов патогенных микобактерий М. bovis и М. tuberculosis и микобактерий вакцинного штамма BCG были обнаружены области, кодирующие более 100 высокоиммуногенных белков, пригодных для диагностики и создания альтернативных вакцинных конструкций. Наиболее интересная область генома RD1 (region of deletion) присутствует только в патогенных штаммах микобактерий и делетирована из генома вакцинного штаммаМ bovis BCG, значит белки, кодируемые этой областью, могут оказаться ценными для дифференциальной диагностики. Кроме того, эти белки могут стать вакцинными кандидатами, так как отвечают за вирулентность микобактерий и, возможно, будут индуцировать протективный иммунитет.

С их использованием открываются возможности для создания субъединичных и ДНК-вакцин, однако, до сих пор до практики не доведена ни одна альтернатива существующей вакцины BCG, которая бы превосходила её по своим протективным свойствам. Одним из возможных направлений совершенствования субъединичных и ДНК-вакцин является поиск более эффективных способов их доставки в организм. Ранее было показано, что при введении в организм мышей полисахаридных частиц, в оболочке которых находятся суммарные антигены BCG, индуцируется клеточный иммунный ответ, а рибонуклеиновая кислота, находящаяся в их ядре, устойчива к действию рибонуклеаз. Такие конструкции были названы искусственными микобактериальными частицами (МБЧ).

Оставалось неясным, будет ли их введение животным приводить к формированию протективного иммунитета против М. tuberculosis, возможно ли их использование для доставки в организм животных ДНК, обеспечивающих синтез in vivo микобактериальных антигенов, а также будет ли формироваться иммунный ответ на эти антигены и каким он будет - преимущественно гуморальным или клеточным?

Цель настоящей работы заключалась в изучении возможности использования рекомбинантного белка ESAT-6 для диагностики туберкулёза и изучении особенностей иммунного ответа у лабораторных животных, вызываемого ДНК-конструкцией, обеспечивающей синтез in vivo антигена ESAT-6 М. tuberculosis, с применением полисахаридной системы доставки.

Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:

1. Получить рекомбинантный штамм Е. coli, способный продуцировать микобактериальный антиген ESAT-6, и оценить диагностический потенциал рекомбинантного белка ESAT-6.

2. Оценить возможность формирования протективного иммунного ответа к заражению М. bovis морских свинок, иммунизированных искусственными микобактериальными частицами на основе полисахаридной системы доставки.

3. Создать экспериментальный препарат на основе рекомбинантной ДНК, кодирующей антиген ESAT-6, и полисахаридной системы доставки:

• сконструировать рекомбинантную плазмиду, обеспечивающую синтез антигена ESAT-6 в эукариотической системе;

• получить конъюгат полиальдегиддекстран-спермидин;

• получить экспериментальный препарат и проверить его стабильность.

4. Исследовать иммуногенные свойства экспериментального препарата на мышиной модели.

5. Оценить безопасность применения экспериментального препарата для живых организмов.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Впервые получен рекомбинантный штамм Е. coli, продуцировавший микобактериальный рекомбинантный белок GST-ESAT-6, который оказался пригоден для диагностики активного ТБ. Важным результатом выполненной работы явилось определение чувствительности ИФА при выявлении антител класса IgG к антигену ESAT-6 М. tuberculosis, которая составила 60 %, при специфичности - 95 %.

В результате проделанной работы впервые был показан протективный иммунный ответ при заражении М. bovis иммунизированных искусственными микобактериальными частицами морских свинок.

Впервые сконструирована плазмида pONE6, содержащая ген esxA, экспрессирующий микобактериальный антиген ESAT-6, на основе которой создан экспериментальный препарат «КрОЫЕб», окруженный полисахаридной оболочкой из молекул модифицированного полиглюкина и спермидина, способной защищать нуклеотидный материал от деградации нуклеазами.

Впервые показано, что иммунизация экспериментальным препаратом «КрОЫЕб» лабораторных животных приводит к формированию специфического клеточного иммунного ответа, а сам препарат не обладает «острой» токсичностью и является безопасным для применения на животных.

Полученные данные настоящей работы по иммуногенности экспериментального препарата могут лечь в основу дальнейшего исследования его протективных свойств на лабораторных животных.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Плазмидная конструкция, включающая ген esxA M.tuberculosis, обеспечивает синтез рекомбинантного белка GST-ESAT-6 в клетках Е. coli.

2. Использование рекомбинантного бежа GST-ESAT-6 в ИФА позволяет выявлять антитела, специфичные кМ. tuberculosis.

3. Использование рекомбинантного бежа GST-ESAT-6 в ELISA/ИФН-у анализе позволяет проводить дифференциальную диагностику активного туберкулёза и поствакцинального иммунитета.

4. Искусственные микобактериальные частицы на основе пожсахаридного конъюгата и экспонирующие на своей поверхности суммарные белки М. bovis BCG обладают иммуногенностью и протективными свойствами на экспериментальной модели животных.

5. Экспериментальный препарат на основе рекомбинантной ДНК, кодирующей антиген ESAT-6, и полисахаридной системы доставки обладает Т-клеточной иммуногенностью на мышиной модели и безопасен для животных.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка жтературы. Библиография включает 235 работ: 27 - отечественных авторов и 208 - зарубежных. Работа иллюстрирована 18 рисунками и включает 6 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Носарева, Олеся Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Сконструирована плазмида pGEX-2T/ESAT-6, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка GST-ESAT-6 в клетках Е. coli, способного выявлять туберкулезоспецифичные IgG в сыворотках пациентов с уровнем чувствительности 60 % и уровнем специфичности 95 % в ИФА.

2. Показана возможность использования рекомбинантного белка

GST-ESAT-б для дифференциальной диагностики активного туберкулёза и поствакцинального иммунитета с помощью ELISA/ИФН-у анализа. Чувствительность данного метода с использованием в качестве стимулирующего антигена GST-ESAT-6 составила 72±11 % при специфичности более 94 %. При использовании же в качестве антигена PPD чувствительность метода составила 94±6 % при специфичности 33±11 %.

3. Показано, что искусственные микобактериальные частицы на основе полисахаридного конъюгата и экспонирующие на своей поверхности суммарные белки М. bovis BCG, обладают иммуногенностью и протективными свойствами на экспериментальной модели животных. Протективная способность МБЧ составляет 50 %, а для вакцины М. bovis BCG - 30 %. Иммунизация животных МБЧ приводит к достоверному увеличению (р<0,05) СПЖ особей до 135±5 суток по сравнению с контрольной группой (71±7 суток).

4. Создан экспериментальный препарат «КрОЫЕб», содержащий в центральной части плазмидную ДНК pONE6, кодирующую антиген ESAT-6, и окруженный полисахаридной оболочкой из молекул модифицированного полиглюкина и спермидина, способной защищать нуклеотидный материал от деградации под действием нуклеаз.

5. Показано, что трёхкратная внутримышечная иммунизация с интервалом 14 суток препаратом «КрОЫЕб» в дозе 12 мкг на животное приводит к формированию специфического клеточного иммунитета у мышей линии BALB/c. При этом экспериментальный препарат «КрОЫЕб» не оказывает значимого влияния на гематологические показатели иммунизированных животных и не обладает «острой» токсичностью.

Список статей, опубликованных по теме диссертации:

1. Татьков С.И, Туманов Ю.В, Носа ре в а О.В, Болдырев А.Н, Смирнова О.Ю, Лебедев Л.Р, Порываева В. А, Ивлев-Дунтау А.П, Ткаченко С.Б, Стрелис А.К, Новицкий В.В, Уразова О.И, Воронкова О.В. Применение рекомбинантных видоспецифических белков микобактерий туберкулеза для серологической диагностики инфекции. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика.-2006.- №4 (29).-С.42-47.

2. Татьков С.И, Носарева О.В, Болдырев А, Н, Смирнова О.Ю, Туманов Ю.В, Лебедев Л.Р, Порываева В.А, Ивлев-Дунтау А.П, Аутеншлюс А.И,. Ткаченко С.Б, Стрелис А.К, Новицкий В.В, Уразова О.И, Воронкова О.В. Применение рекомбинантных видоспецифических белков M.tuberculosis для серологической диагностики туберкулёза. // Клиническая и лабораторная диагностика.-2006.-№12.-С.23-34.

3. Туманов Ю.В, Смирнова О.Ю, Болдырев А.Н, Носарева О.В., Вараксин Н.А, Татьков С.И. Рекомбинантные белки М.tuberculosis в диагностике туберкулеза легких. // К1ед. иммунология.-2006.-№ 2-3.-С.294-295.

4. Азаев М.Ш, Лебедев Л.Р, Кузьмичёва Г.А, Туманов Ю.В, Донченко Н.А, Татьков С.И, Носарева О.В, Ильичёв А.А. Исследование роли искусственных микобактериальных частиц в реализации иммунологических процессов при экспериментальном туберкулёзе животных. //Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.-2007.-№2.-С.38-48.

Доклады и тезисы конференций:

1. Носарева О.В., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Использование рекомбинантных белков в диагностике туберкулёза. // Сборник трудов Международного симпозиума «Интегративная Медицина в XXI веке», Судак, Украина.-2004.-С.23.

2. Nosareva О., Smirnova О., Boldyrev A., Tumanov Yu. Azaev М., Lebedev L., Tatkov S. Construction of artificial virus-like particles exposing Mycobacterial ESAT-6, and the study of their immunogenic properties. // Abstract book Keystone Symposia "Tuberculosis: Integrating Host and Pathogen Biology". Whistler, British Columbia, Canada.-2005.-P.94.

3. Носарева O.B. Конструирование микрочастиц, содержащих рекомбинантный антиген ESAT-6 для получения экспериментальной вакцины против туберкулёза. Науки о человеке: материалы VI конгресса молодых ученых и специалистов. // Под ред. JI.M. Огородовой, JI.B. Капилевича. - Томск: СибГМУ.-2005.-С.25.

4. Nosareva О., Nesterov A., Ignatyev G., Smirnova О., Boldyrev А., Tumanov Yu., Tatkov S. Investigation of the Virus Like Particles as the delivery system for presenting DNA-vaccine against tuberculosis to immune system". // International Congress "New Approaches to Vaccine Development: From the bench to the field", Berlin, Germany.-2005.

5. Носарева O.B., Нестеров A.E., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Конструирование частиц на основе ПАД и исследование их свойств в качестве системы доставки ДНК-вакцин против туберкулёза. // Международная школа-конференция «Системная биология и биоинженерия», г.Москва.-2005.

6. Туманов Ю.В., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Носарева О.В., Татьков С.И., Ивлев-Дунтау А.П, Рекомбинантные белки М.tuberculosis в диагностике туберкулёза лёгких. // «Новые технологии в интегративной медицине и биологии», «Стресс и экстремальные состояния»:

Международный Междисциплинарный семинар, Бангкок-Патайя, Тайланд: Труды Семинара и Научного Дискуссионного Клуба/Под.ред. И.В.Тимофеева, Н.Г. Перминовой - Новосибирск, Типография НИИ Катализа СО РАН.-2006.-С.74-75.

7. Азаев М.Ш, Королёв С.А, Лебедев Л.Р, Кузьмичёва Г.А, Туманов Ю.В, Носарева О.В., Татьков С.И. Микобактериальные частицы как новое средство иммунопрофилактики туберкулёзной инфекции. // «Новые технологии в интегративной медицине и биологии», «Стресс и экстремальные состояния»: Международный Междисциплинарный семинар, Бангкок-Патайя, Тайланд: Труды Семинара и Научного Дискуссионного Клуба/Под.ред. ИВ.Тимофеева, Н.Г. Перминовой - Новосибирск, Типография НИИ Катализа СО РАН.-2006.-С.6-7.

8. O.Nosareva; A.Nesterov; A.Boldyrev; O.Smirnova; Yu.Tumanov; S.Tatkov. Immunological studies DNA-vaccine encoded ESAT6 antigen. The Second International Conference on ТВ Vaccines for the World, The Austrian Industrial Association, Vienna, Austria,19-21 April 2006.

9. Носарева О.В, Нестеров A.E, Болдырев А.Н, Смирнова О.Ю, Туманов Ю.В, Татьков С.И. Исследование экспериментального препарата на основе микобактериального антигена ESAT6. Международная школа-конференция молодых ученых «Биотехнология будущего» в рамках Международного Симпозиума «ЕС—Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной программе», С-П, 5-9 июня 2006г.

10. Носарева О.В, Нестеров А.Е, Татьков С.И. Конструирование экспериментального препарата на основе полиальдегиддекстрана и исследование его свойств в качестве системы доставки ДНК-вакцины против туберкулёза. Проблемы фундаментальной и прикладной медицины:Материалы VI Всероссийской конференции молодых учёных в рамках 13 Международного конгресса по приполярной медицине. 12-16 июня 2006г.- НовосибирскЮОО «РИЦ».-2006.-с.39.

11. Болдырев А.Н., Носарева О.В., Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Применение рекомбинантных видоспецифических белков M.tuberculosis для серологической диагностики туберкулеза. Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера:Ш Российская научная конференция с международным участием (2729 сентября 2006г.,Новосибирск).-Новосибирск:ЦЭРИС,2006.-с.134.

12. Туманов Ю.В., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Лебедев Л.Р., Азаев М.Ш., Носарева О.В., Ивлев-Дунтау А.П., Татьков С.И. Выявление маркёров Т-клеточного иммунитета в видоспецифической диагностике туберкулёза. Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера:Ш Российская научная конференция с международным участием.-Новосибирск:ЦЭРИС,2006.-е. 166.

13. Nosareva О., Nesterov A., Boldyrev A., Smirnova О., Tumanov Yu., Tatkov S. Immunological responses after immunization of mice with DNA plasmid encoded ESAT6 antigen with polysaccharide matrix. // Abstract book 16th ERS Annual Congress, Munich, Germany.-2006.-P.342.

14. Nosareva O., Nesterov A., Ignatyev G., Smirnova O., Boldyrev A., Tumanov Yu., Tatkov S. The Mycobacterium antigen ESAT6 as the DNA-vaccine and diagnostic targets. // First Summer School on Infectious diseases - affecting civil societies", Berlin, Germany.-2006.

15. Nosareva O., Nesterov A., Ignatyev G., Smirnova O., Boldyrev A., Tumanov Yu., Tatkov S. Immunological studies DNA-vaccine encoded antigen ESAT6. // Strengthening Human Resources for better lung health. 37th Union World Conference on Lung Health Paris, France, 31 October - 4 November 2006.

16. Nosareva O., Nesterov A., Boldyrev A., Smirnova O., Tumanov Yu., Tatkov S. The Mycobacterium antigen ESAT-6 as the DNA-vaccine and diagnostic targets. // 3rd Vienna Vaccines Conference, «Challenges for Vaccine Development: Medical Need and Social Implications», Baden near Vienna.-2007.-P.72.

17. Туманов Ю.В, Болдырев А.Н, Носарева О.В, Смирнова О.Ю, Татьков С.И. Использование рекомбинантных микобактериальных антигенов в диагностике туберкулёза лёгких. // Туберкулёз, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении: Тезисы II Российско-Германской конференции Форума Коха- Мечникова, Томск.-2007.-С.34.

18. Туманов Ю.В, Болдырев А.Н, Смирнова О.Ю, Лебедев Л.Р, Азаев М.Ш, Носарева О.В, Ивлев-Дунтау А.П, Татьков С.И. Видоспецифическая диагностика туберкулёза по маркёрам Т-клеточного иммунитета. // Туберкулёз, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении: Тезисы II Российско-Германской конференции Форума Коха- Мечникова, Томск.-2007.-С.36.

19. Носарева О.В, Нестеров А.Е, Смирнова О.Ю, Болдырев А.Н, Татьков С.И. Изучение иммунного ответа на противотуберкулёзную ДНК-вакцину, модифицированную полисахаридом. // Туберкулёз, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении: Тезисы II Российско-Германской конференции Форума Коха- Мечникова, Томск.-2007.-С.76.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нарастание угрозы ТБ на фоне недостаточной эффективности вакцины BCG и несовершенной диагностики этого заболевания приводит к очевидной необходимости более глубокого и внимательного изучения микобактерий. Треть населения нашей планеты инфицирована микобактериями ТБ и подвержена опасности развития этого заболевания.

Применение специфических антигенов М. tuberculosis позволяет создать и разработать более эффективные препараты вакцинопрофилактики ТБ и эффективные высокоспецифичные методы диагностики ТБ. Одним из наиболее перспективных является антиген ESAT-6, кодируемый делегированной из вакцинных штаммов BCG, но присутствующей в патогенных микобактериальных штаммах генной областью RD1.

В результате проделанной работы было проведено конструирование рекомбинантной плазмиды, несущей микобактериальный антиген ESAT-6, и клонирование её в штамм Е. coli. С помощью ИФА, используя панели сывороток здоровых и больных ТБ лиц, были изучены антигенные свойства полученного рекомбинантного белка GST-ESAT-6. Показано, что данный рекомбинантный антиген способен выявлять ТБ-специфичные IgG в сыворотках пациентов, с уровнем чувствительности 60 % и уровнем специфичности 95 %. Было так же показано, что рекомбинантный антиген GST-ESAT-6 пригоден для дифференциальной диагностики инфицирования ТБ от поствакцинального иммунитета с использованием проб цельной крови в ELISA/ИФН-у анализе.

Кроме того, антиген ESAT-6 был встроен в эукариотическую экспрессионную плазмиду и клонирован в клетках Е. coli. Полученная рекомбинантная плазмида легла в основу экспериментального препарата «КрОЫЕб» - ДНК-конструкции с использованием полисахаридной системы доставки. В данной работе была проведена предварительная оценка перспективности применения полисахаридной системы доставки экспериментальных препаратов на примере микобактериальных частиц при иммунизации ими морских свинок. Оказалось, что система МБЧ способствует формированию эффективного протективного иммунного ответа у животных против ТБ. В дальнейшем было проведено изучение иммунного ответа у мышей, индуцируемого экспериментальным препаратом «КрОЫЕб», и было показано, что антиген ESAT-6 индуцирует специфичный Т-клеточный иммунный ответ, а используемая полисахаридная система доставки не обладает токсичностью и защищает нуклеотидный материал от нуклеазной деградации.

Таким образом, антиген ESAT-6 является перспективным кандидатом в вакцинопрофилактике ТБ, а рекомбинантный белок GST-ESAT-6 может применяться для дифференциальной диагностики ТБ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Носарева, Олеся Валерьевна, Кольцово

1. Азаев М. Ш., и др. Получение искусственных микобактериальных частиц и исследование их иммунногенных свойств. // Биотехнология.-2004.-№4.-С.34-37.

2. Ашмарин И. П., Воробьёв А. А. // Статистические методы в микробиологических исследованиях.-Л.: Медгиз.-1962.-С.182.

3. Борисов Л.Б. // Медицинская микробиология, вирусология, иммунология.-М.-2002.-С.437-441.

4. Визель А. А., Гурылева М. Э. // Туберкулёз.-М.:ГЭОТАР Медицина.-1999.-С.485.

5. Генес B.C. // Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. М.:Наука.-1967.-С.208,

6. Журавлёв М. В., Арсенина Л. В., Виноградова И. Л., Проваторова Л. В. Эпидемиология и некоторые аспекты лабораторной диагностики туберкулёза. // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней.М.-2002.-Вып.4.-С. 194-197.

7. Ильина Т.Я., и др. Распространенность рецидивов туберкулеза органов дыхания при напряженной эпидемической ситуации. // Проблемы туберкулеза и болезней легких.-2005.-№7.-С.32.

8. Карпенко Л. И. и др. Иммунный ответ при оральной и ректальной иммунизации аттенуированным штаммом сальмонеллы, несущим ВИЧ-1 ДНК вакцину. //Вопр. вирусологии.-2003.-Т.48, №4.-С.16-20.

9. Кетлинский С. А., Калинина Н. М. // Иммунология для врача. С.-Петербург-1998.-С. 142.

10. Козловская Л. В. Николаев А. Ю. // Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования.-М.:Медицина.-1984.-С.138.

11. Комогорова Е. Э. и др. Особенности иммунологических показателей у больных с различными формами туберкулёза лёгких. // Иммунология.-2005.-№1.-С.45-50.

12. Кулаков Ю. К. и др. Высокочувствительная неизотопная система гибридизации ДНК с применением амплификации (ПЦР для идентификации бруцелл). // Молекуляр. генетика, микробиол. и вирусол.-М.-1992.-№7-8,-С.23.

13. Куличенко А.Н. и др. // Методические указания по детекции патогенной микрофлоры в клиническом материале, пищевых продуктах, объектах внешне среды и выполнению генетической идентификации клеток с помощью полимеразной цепной реакции.-М.-199б.-С.11.

14. Ларионова Е. Е, Кузьмин А. В, Васильева И. А. Сравнительная характеристика молекулярных и микробиологических методов контроля химиотерапии у впервые выявленных больных туберкулёзом лёгких. // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.-2004.-№6.-С.31-34.

15. Лебедев Л.Р. и др. Конструирование вирусоподобных частиц, экспонирующих эпитопы ВИЧ-1. // Молекул, биология.-2000.-Т. 34.-N3.-С.480-485.

16. Маниатис Т, Фрич Э, Сэмбрук Дж. // Молекулярное клонирование. М.:Мир.-1984.-С.480.

17. Медведев С. Ю, Перельман М. И. // Туберкулез в России// Туберкулёз и вакцинопрофилактика.-2002.-№1.-С.19.

18. Остерман Л. А. // Методы исследований белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.:Наука.-1981.-С.288.

19. Порядок и методы контроля иммунологической безопасности вакцин. Общие методические принципы. МЗ СССР. РД 42-28-1090. М.:1989.

20. Пшеничнов В. А., Семенов Б. Ф., Зезеров Е. Г. // Стандартизация методов вирусологических исследований.-М.:Медицина.-1974.-С.168.

21. Татьков С. И. и др. Применение рекомбинантных видоспецифических белков M.tuberculosis для серологической диагностики туберкулёза. // Клиническая лабораторная диагностика.-2006.-№12.-С.23-34.

22. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль: Пер. с анг./ Под ред. Барри Р. Блума. М.:Медицина.-2002.С.696.

23. Фролова Ф. Н., Кулаков И. М., Зайнутдинова Н. Г., Фатыхова Р. X. О заболеваемости туберкулёзом в г. Казань. // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней.-2002.-Вып.5.-С.144-14б.

24. Шешуков П. Ф., Готовский Ю. В. Некоторые аспекты современной диагностики туберкулёза. // Материалы 8-й международной конференции «Теоретические и клинические аспекты применения биорезонансной и мультирезонансной терапии».М.-2002.-Ч.1.-С.167-169.

25. Abbas АК, Williams ME, Burstein HJ, Chang TL, Bossu P, Lichtman AH. Activation and functions of CD4+ T-cell subsets. // Immunol Rev.- 1991.-Vol.123.-P.5-22.

26. Abel B, Thieblemont N, Quesniaux VJ et al. Toll-like receptor 4 expression is required to control chronic Mycobacterium tuberculosis infection in mice. // J Immunol.-2002.-Vol.l69.-P.3155-62.

27. Ahmad S, Amoudy HA, Thole JE, Young DB, Mustafa AS. Identification of a novel protein antigen encoded by a Mycobacterium tuberculosis-specific RD1 region gene. // Scand J Immunol.-1999.-Vol.49.-P.515-22.

28. Aleman M, Garcia A, Saab MA et al. Mycobacterium tuberculosis-induced activation accelerates apoptosis in peripheral blood neutrophils from patients with active tuberculosis. // Am J Respir Cell Mol Biol.-2002.-VoI.-27.-P.583-92.

29. Amicosante M, Houde M, Guaraldi G, Saltini C. Sensitivity and specificity of a multi-antigen ELISA test for the serological diagnosis of tuberculosis. // Int J Tuberc Lung Dis.-1999.-Vol.3.-P.736-40.

30. Ando S, Putnam D, Pack DW, Langer R. PLGA microspheres containing plasmid DNA: preservation of supercoiled DNA via cryopreparation and carbohydrate stabilization. // JPharm Sci.-1999.-Vol.88.-P.126-30.

31. Araujo Z, Waard JH, Fernandez dL et al. Study of the antibody response against Mycobacterium tuberculosis antigens in Warao Amerindian children in Venezuela. //Mem Inst Oswaldo Cruz.-2004.-Vol.99.-P.517-24.

32. Aronson NE, Santosham M, Comstock GW et al. Long-term efficacy of BCG vaccine in American Indians and Alaska Natives: A 60-year follow-up study. // JAMA.-2004.-Vol.291 .-P.2086-91.

33. Badak FZ, Goksel S, Sertoz R et al. Use of nucleic acid probes for identification of Mycobacterium tuberculosis directly from MB/BacT bottles. // J Clin Microbiol.-1999.-Vol.37.-P.l 602-5.

34. Barnes PF. Rapid diagnostic tests for tuberculosis: progress but no gold standard. // Am JRespir Crit Care Med.-1997.-Vol.l55.-P.1497-8.

35. Barnes PF, Abrams JS, Lu S, Sieling PA, Rea TH, Modlin RL. Patterns of cytokine production by mycobacterium-reactive human T-cell clones. // Infect Immun.-l993.-Vol. 61 .-P. 197-203.

36. Barnes PF, Chatteijee D, Abrams JS et al. Cytokine production induced by Mycobacterium tuberculosis lipoarabinomannan. Relationship to chemical structure. // J Immunol.-1992.-Vol.l49.-P.541-7.

37. Barry ME, Pinto-Gonzalez D, Orson FM, McKenzie GJ, Petry GR, Barry MA. Role of endogenous endonucleases and tissue site in transfection and CpG-mediated immune activation after naked DNA injection. // Hum Gene Ther.-1999.-Vol.10.-P.2461-80.

38. Bellocchio S, Moretti S, Perruccio К et al. TLRs govern neutrophil activity in aspergillosis. // J Immunol.-2004.-Vol.l73.-P.7406-15.

39. Benoit MA, Baras B, Gillard J. Preparation and characterization of protein-loaded poly(epsilon-caprolactone) microparticles for oral vaccine delivery. // International Journal of Pharmaceutics.-1999.-Vol.l84.-P.73-84.

40. Berthet FX, Rasmussen PB, Rosenkrands I, Andersen P, Gicquel В. A Mycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT-6 and a novel low-molecular-mass culture filtrate protein (CFP-10)//Microbiology.-1998.-Vol.l44.-P.3195-203.

41. Bloomfield VA. DNA condensation. // Curr Opin Struct Biol.-1996.-Vol.6.-P.334-41.

42. Boom WH, Canaday DH, Fulton SA, Gehring AJ, Rojas RE, Torres M. Human immunity to M. tuberculosis: T cell subsets and antigen processing. // Tuberculosis (Edinb).-2003.-Vol.83.-P.98-106.

43. Borchard G. Chitosans for gene delivery. // Adv Drug Deliv Rev.-2001.-Vol.52.-P.145-50.

44. Braunlin WH, Strick TJ, Record MT, Jr. Equilibrium dialysis studies of poly amine binding to DNA. // Biopolymers.-1982.-Vol.21.-P.1301-14.

45. Briones M, Singh M, Ugozzoli M et al. The preparation, characterization, and evaluation of cationic microparticles for DNA vaccine delivery. //Pharm Res.-2001.-Vol.l8.-P.709-12.

46. Britton WJ, Palendira U. Improving vaccines against tuberculosis. // Immunol Cell Biol.-2003.-Vol.81.-P.34-45.

47. Brock I, Weldingh K, Lillebaek T, Follmann F, Andersen P. Comparison of tuberculin skin test and new specific blood test in tuberculosis contacts. // Am J Respir Crit Care Med.-2004.-Vol.170.-P.65-9.

48. Brodin P, Rosenkrands I, Andersen P, Cole ST, Brosch R. ESAT-6 proteins: protective antigens and virulence factors?// Trends Microbiol.-2004.-Vol.l2.-P.500-8.

49. Butler WR, O'Connor SP, Yakrus MA, Gross WM. Cross-reactivity of genetic probe for detection of Mycobacterium tuberculosis with newly described species Mycobacterium celatum. // J Clin Microbiol.-1994.-Vol.32.-P.536-8.

50. Caminero JA, Rodriguez dC, Carrillo T, Cabrera P. Antimycobacterial antibodies in tuberculous pleural effusions: reliability of antigen 60. //Chest. -1991.-Vol.99.-P.1315-6.

51. Camus JC, Pryor MJ, Medigue C, Cole ST. Re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. // Microbiology.-2002.-Vol.l48.-P.2967-73.

52. Caragol I, Raspall M, Fieschi С et al. Clinical ТВ in 2 of 3 siblings with IL-12 receptor betal deficiency. // Clin Infect Dis.-2003.-Vol.37.-P.302-6.

53. Cha Y, Pitt CG. The biodegradability of polyester blends. // Biomaterials .-1990.-Vol. 11 .-P. 10 8-12.

54. Champion PA, Stanley SA, Champion MM, Brown EJ, Cox JS. C-terminal signal sequence promotes virulence factor secretion in Mycobacterium tuberculosis. // Science.-2006.-Vol.313.-P.1632-6.

55. Chan CM, Woo PC, Leung AS et al. Detection of antibodies specific to an antigenic cell wall galactomannoprotein for serodiagnosis of Aspergillus fiimigatus aspergillosis. // J Clin Microbiol.-2002.-Vol.40.-P.2041-5.

56. Chandrasekhar S, Mukherjee MK. Intracellular tubercle bacilli-alveolar macrophage lysosomal enzymes interaction in experimental tuberculosis. //Clin Immunol Immunopathol.-1990.-Vol.56.-P.185-201.

57. Chapman AL, Munkanta M, Wilkinson KA et al. Rapid detection of active and latent tuberculosis infection in HIV-positive individuals by enumeration of Mycobacterium tuberculosis-specific T cells. // AIDS.-2002.-Vol.l6.-P.2285-93.

58. Clemons KV, Calich VL, Burger E et al. Pathogenesis I: interactions of host cells and fungi. //MedMycol.-2000.-Vol.38, Suppl 1.-P.99-111.

59. Cliff JM, Andrade IN, Mistry R et al. Differential gene expression identifies novel markers of CD4+ and CD8+ T cell activation following stimulation by Mycobacterium tuberculosis//J Immunol.-2004.-Vol.l73.-P.485-93.

60. Co DO, Hogan LH, Kim SI, Sandor M. Mycobacterial granulomas: keys to a long-lasting host-pathogen relationship. // Clin Immunol.-2004.-Vol.ll3.-P.130-6.

61. Cole ST, Barrell BG. Analysis of the genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. //Novartis Found Symp.-1998.-Vol.217.-P. 160-72.

62. Collins FM, Wayne LG, Montalbine. The effect of cultural conditions on the distribution of Mycobacterium tuberculosis in the spleens and lungs of specific pathogen-free mice//Am Rev Respir Dis.-1974.-Vol.ll0.-P.147-56.

63. Cooper AM, Magram J, Ferrante J, Orme IM. Interleukin 12 (IL-12) is crucial to the development of protective immunity in mice intravenously infected with mycobacterium tuberculosis. // J Exp Med.-1997.-Vol.l86.-P,39-45.

64. Cortesi R, Esposito E, Osti M et al. Dextran cross-linked gelatin microspheres as a drug delivery system. //Eur J Pharm Biopharm.-1999.-Vol.47.-P.153-60.

65. Cui Z, Mumper RJ. Microparticles and nanoparticles as delivery systems for DNA vaccines. // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.-2003.-Vol.20.-P. 103-37.

66. D'Souza S, Rosseels V, Denis О et al. Improved tuberculosis DNA vaccines by formulation in cationic lipids//Infect Immun.-2002.-Vol.70.-P.3681-8.

67. Daniel TM. The history of tuberculosis. // Respir Med.-2006.-Vol.100.-P. 1862-70.

68. Dannenberg AM, Jr. Immune mechanisms in the pathogenesis of pulmonary tuberculosis. //Rev InfectDis.-1989.-Vol.11, Suppl 2.-P.369-378.

69. Denis-Mize KS, Dupuis M, MacKichan ML et al. Plasmid DNA adsorbed onto cationic microparticles mediates target gene expression and antigen presentation by dendritic cells. // Gene Ther.-2000.-Vol.7.-P.2105-12.

70. Derrick SC, Yang AL, Morris SL. A polyvalent DNA vaccine expressing an ESAT6-Ag85B fusion protein protects mice against a primary infection with Mycobacterium tuberculosis and boosts BCG-induced protective immunity. // Vaccine.-2004.-Vol.23.-P.780-8.

71. Dietrich G, Bubert A, Gentschev I et al. Delivery of antigen-encoding plasmid DNA into the cytosol of macrophages by attenuated suicide Listeria monocytogenes.//Nat Biotechnol.-1998.-Vol.l6.-P.181-5.

72. Doe B, Selby M, Barnett S, Baenziger J, Walker CM. Induction of cytotoxic T lymphocytes by intramuscular immunization with plasmid DNA is facilitated by bone marrow-derived cells. // Proc Natl Acad Sci U S A.-1996.-Vol.93.-P.8578-83.

73. Doetsch RN. Benjamin Marten and his "New Theory of Consumptions". //Microbiol Rev.-1978.-Vol.42.-P.521-8.

74. Doffinger R, Dupuis S, Picard С et al. Inherited disorders of IL-12-and IFNgamma-mediated immunity: a molecular genetics update. // Mol Immunol.-2002.-Vol.38.-P.903-9.

75. Dolin PJ, Raviglione MC, Kochi A. Global tuberculosis incidence and mortality during 1990-2000. // Bull World Health Organ.-1994.-Vol.72.-P.213-20.

76. Donnelly JJ, Liu MA, Ulmer JB. Antigen presentation and DNA vaccines. // Am J Respir Crit Care Med.-2000.-Vol.162.-P. 190-193.

77. Donnelly JJ, Wahren B, Liu MA. DNA vaccines: progress and challenges. // JImmunol.-2005.-Vol.l75.-P.633-9.

78. Dunlap DD, Maggi A, Soria MR, Monaco L. Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery//Nucleic Acids Res.-1997.-Vol.25.-P.3095-101.

79. Dupuis M, Denis-Mize K, Woo С et al. Distribution of DNA vaccines determines their immunogenicity after intramuscular injection in mice. // J Immunol.-2000.-Vol.l65.-P.2850-8.

80. Esser D, Amanuma H, Yoshiki A, Kusakabe M, Rudolph R, Bohm G. A hyperthermostable bacterial histone-like protein as an efficient mediator for transfection of eukaryotic cells. // Nat Biotechnol.-2000.-Vol. 18.-P.1211-3.

81. Feng CG, Demangel C, Kamath AT, Macdonald M, Britton WJ. Dendritic cells infected with Mycobacterium bovis bacillus Calmette Guerin activate CD8(+) T cells with specificity for a novel mycobacterial epitope. // Int Immunol.-2001.-Vol.l3.-P.451-8.

82. Ficapal A, Alonso-Urmeneta B, Velasco J, Moriyon I, Blasco JM. Diagnosis of Brucella ovis infection of rams with an ELISA using protein G as conjugate. // Vet Rec.-1995.-Vol.l37.-P.145-7.

83. Flint JL, Kowalski JC, Karnati PK, Derbyshire KM. The RD1 virulence locus of M. tuberculosis regulates DNA transfer in Mycobacterium smegmatis//Proc Natl Acad Sci USA.-2004.-Vol.l01.-P.12598-603.

84. Flynn JL. Immunology of tuberculosis and implications in vaccine development. //Tuberculosis (Edinb).-2004.-Vol.84.-P.93-101.

85. Flynn JL, Chan J. Tuberculosis: latency and reactivation. // Infect Immun.-2001.-Vol.69.-P.4195-201.

86. Flynn JL, Chan J, Triebold KJ, Dalton DK, Stewart ТА, Bloom BR. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. //JExpMed.-1993.-Vol.l78.-P.2249-54.

87. Foulds J, OBrien R. New tools for the diagnosis of tuberculosis: the perspective of developing countries. //Int J Tuberc Lung Dis.-1998.-V.2.-P.778-83.

88. Fremond CM, Yeremeev V, Nicolle DM, Jacobs M, Quesniaux VF, Ryffel B. Fatal Mycobacterium tuberculosis infection despite adaptive immune response in the absence of MyD88. // J Clin Invest.-2004.-Vol.114.-P. 1790-9.

89. Fynan EF, Webster RG, Fuller DH, Haynes JR, Santoro JC, Robinson HL. DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations. // Proc Natl Acad Sci U S A.-1993.-Vol.90.-P.l 1478-82.

90. Gangadharam PR. BCG vaccination and non-tuberculous Mycobacteria. // Tubercle.-1981.-Vol.62.-P.223-4.

91. Garlanda C, Hirsch E, Bozza S et al. Non-redundant role of the long pentraxin PTX3 in anti-fungal innate immune response. // Nature.-2002.Vol.420.-P. 182-6.

92. Gey Van Pittius NC, Gamieldien J, Hide W, Brown GD, Siezen RJ, Beyers AD. The ESAT-6 gene cluster of Mycobacterium tuberculosis and other high G+C Gram-positive bacteria. // Genome Biol.-2001.-Vol.2.-P.233-245.

93. Gillespie SH, McHugh TD. Monitoring the therapy of pulmonary tuberculosis by nested polymerase chain reaction//J Infect.-1997.-Vol.35.-P.324-5.

94. Global tuberculosis control: WHO Report 2004. WHO/HTM/TB/2004.331.

95. Gonzalez-Juarrero M, Orme IM. Characterization of murine lung dendritic cells infected with Mycobacterium tuberculosis. // Infect Immun.-2001.-Vol.69.-P. 1127-33.

96. Granucci F, Zanoni I, Feau S, Ricciardi-Castagnoli P. Dendritic cell regulation of immune responses: a new role for interleukin 2 at the intersection of innate and adaptive immunity. // EMBO J.-2003.-Vol.22.-P.2546-51.

97. Griese M, Essl R, Schmidt R et al. Pulmonary surfactant, lung function, and endobronchial inflammation in cystic fibrosis. // Am J Respir Crit Care Med.-2004.-Vol. 170.-P. 1000-5.

98. Griffin JP, Harshan KV, Born WK, Onne IM. Kinetics of accumulation of gamma delta receptor-bearing T lymphocytes in mice infected with live mycobacteria. // Infect Immun.-1991.-Vol.59.-P.4263-5.

99. Guinn KM, Hickey MJ, Mathur SK et al. Individual RD1-region genes are required for export of ESAT-6/CFP-10 and for virulence of Mycobacterium tuberculosis. // Mol Microbiol.-2004.-Vol.51.-P.359-70.

100. Gurunathan S, Klinman DM, Seder RA. DNA vaccines: immunology, application, and optimization. //Annu Rev Immunol.- 2000a.-Vol.8.-P.927-74.

101. Gurunathan S, Prussin C, Sacks DL, Seder RA. Vaccine requirements for sustained cellular immunity to an intracellular parasitic infection. // Nat Med.-1998.-Vol.4.-P. 1409-15.

102. Gurunathan S, Stobie L, Prussin С et al. Requirements for the maintenance of Thl immunity in vivo following DNA vaccination: a potential immunoregulatory role for CD8+ T cells. // J Immunol.-2000.-Vol.l65.-P.915-24.

103. Havlir DV, van der KF, Duffy E, Marshall R, Horn D, Ellner JJ. A 19-year follow-up of tuberculin reactors. Assessment of skin test reactivity and in vitro lymphocyte responses. // Chest.-1991.-Vol.99.-P.l 172-6.

104. Hayashi F, Means TK, Luster AD. Toll-like receptors stimulate human neutrophil function. // Blood.-2003.-Vol.l02.-P.2660-9.

105. Hedley ML, Curley J, Urban R. Microspheres containing plasmid-encoded antigens elicit cytotoxic T-cell responses//Nat Med.-1998.-Vol.4.-P.365-8.

106. Hellyer TJ, Fletcher TW, Bates JH et al. Strand displacement amplification and the PCR for monitoring response to treatment in patients with pulmonary tuberculosis. // J Infect Dis.-1996.-Vol.l73.-P.934-41.

107. Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. //Nature.-2000.-Vol.408.-P.740-5.

108. Hernandez-Pando R, Pavon L, Arriaga K, Orozco H, Madrid-Marina V, Rook G. Pathogenesis of tuberculosis in mice exposed to low and high doses of an environmental mycobacterial saprophyte before infection. // Infect Immun.-1997.-Vol.65.-P.3317-27.

109. Hill PC, Fox A, Jeffries DJ et al. Quantitative T cell assay reflects infectious load of Mycobacterium tuberculosis in an endemic case contact model. // Clin Infect Dis.-2005.-Vol.40.-P.273-8.

110. Hirano T, Akira S, Taga T, Kishimoto T. Biological and clinical aspects of interleukin 6. // Immunol Today.-1990.-Vol.ll.-P.443-9.

111. Hoag H. New vaccines enter fray in fight against tuberculosis. // Nat Med.-2004.-Vol. 10.-P.6.

112. Horwitz MA, Harth G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. // Infect Immun.-2003.-Vol.71.-P. 1672-9.

113. Hsu T, Hingley-Wilson SM, Chen В et al. The primary mechanism of attenuation of BCG is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. // Proc Natl Acad Sci USA.-2003.-Vol.l00.-P.12420-5.

114. Huygen К, Content J, Denis О et al. Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine. // Nat Med.-1996.-Vol.2.-P.893-8.

115. Ibanga HB, Brookes RH, Hill PC et al. Early clinical trials with a new tuberculosis vaccine, MVA85A, in tuberculosis-endemic countries: issues in study design. // Lancet Infect Dis.-2006.-Vol.6.-P.522-8.

116. Iwasaki A, Torres CA, Ohashi PS, Robinson HL, Barber ВН. The dominant role of bone marrow-derived cells in CTL induction following plasmid DNA immunization at different sites. // J ImmunoI.-I997.-VoI.159.-P.11-4.

117. Kamath AT, Feng CG, Macdonald M, Briscoe H, Britton WJ. Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis. // Infect Immun.-1999.-Vol.67.-P.1702-7.

118. Karpenko LI, Lebedev LR, Ignatyev GM et al. Construction of artificial virus-like particles exposing HIV epitopes, and the study of their immunogenic properties. // Vaccine.-2003.-Vol.21.-P.386-92.

119. Kato T, Sakamoto E, Kutsuna H, Kimura-Eto A, Hato F, Kitagawa S. Proteolytic conversion of STAT3alpha to STAT3gamma in human neutrophils: role of granule-derived serine proteases//JBiol Chem.-2004.-Vol.279.-P.31076-80.

120. Kaufmann SH. Is the development of a new tuberculosis vaccine possible? // Nat Med.-2000.-Vol.6.-P.955-60.

121. Kaufmann SH. How can immunology contribute to the control of tuberculosis? // Nat Rev Immunol.-2001.-Vol.l.-P.20-30.

122. Kaufmann SH, Hess J. Immune response against M. tuberculosis: implications for vaccine development. // JBiotechnol.-2000.-Vol.83.-P.13-7.

123. Kent L, McHugh TD, Billington O, Dale JW, Gillespie SH. Demonstration of homology between IS6110 of Mycobacterium tuberculosis and DNAs of other Mycobacterium spp.? // J Clin Microbiol.-1995.-Vol.33.-P.2290-3.

124. Krauzewicz N, Stokrova J, Jenkins C, Elliott M, Higgins CF, Griffin BE. Virus-like gene transfer into cells mediated by polyoma virus pseudocapsids. // Gene Ther.-2000.-Vol.7.-P.2122-31.

125. Kurup VP. Immunology of allergic bronchopulmonary aspergillosis. // Indian J Chest Dis Allied Sci.-2000.-Vol.42.-P.225-37.

126. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature.-1970.-Vol.227.-P.680-5.

127. Lalvani A, Pathan AA, Durkan H et al. Enhanced contact tracing and spatial tracking of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells. //Lancet.-2001.-Vol.357.-P.2017-21.

128. Lawn SD, Frimpong EH, Nyarko E. Evaluation of a commercial immunodiagnostic kit incorporating lipoarabinomannan in the serodiagnosis of pulmonary tuberculosis in Ghana. // Trop Med Int Health.-1997.-Vol.2.-P.978-81.

129. Lebedev LR, Azaev MS, Tumanov Y, Sizov AA, Il'ychev AA, Tat'kov SI. Artificial mycobacterial particles for immunization against tuberculosis. // Dokl Biol Sci.-2002.-Vol.387.-P.488-90.

130. Levitz SM, Diamond RD. Mechanisms of resistance of A. fumigatus Conidia to killing by neutrophils in vitro. // J Infect Dis.-1985.-Vol.l52.-P.33-42.

131. Lewis KN, Liao R, Guinn KM et al. Deletion of RD1 from M. tuberculosis mimics BCG attenuation. // J Infect Dis.-2003.-Vol.l87.-P.117-23.

132. Liang L, Sha WC. The right place at the right time: novel B7 family members regulate effector T cell responses//Curr Opin Immunol.-2002.-Vol. 14.-P.3 84-90.

133. Lindemose S, Nielsen PE, Mollegaard NE. Polyamines preferentially interact with bent adenine tracts in double-stranded DNA. // Nucleic Acids Res.-2005.-Vol.33.-P. 1790-803.

134. Livingston BD, Newman M, Crimi C, McKinney D, Chesnut R, Sette A. Optimization of epitope processing enhances immunogenicity of multiepitope DNA vaccines. // Vaccine.-2001.-Vol.l9.-P.4652-60.

135. Lowrie DB, Silva CL, Colston MJ, Ragno S, Tascon RE. Protection against tuberculosis by a plasmid DNA vaccine. //Vaccine.-1997.-Vol.l5.-P.834-8.

136. Maeda J, Ueki N, Ohkawa T et al. Local production and localization of transforming growth factor-beta in tuberculous pleurisy. // Clin Exp Immunol.-1993.-Vol.92.-P.32-8.

137. Maggi E, Parronchi P, Manetti R et al. Reciprocal regulatory effects of IFN-gamma and IL-4 on the in vitro development of human Thl and Th2 clones. // JImmunol.-1992.-Vol.l48.-P.2142-7.

138. Mahairas GG, Sabo PJ, Hickey MJ, Singh DC, Stover CK. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis. // JBacteriol.-1996.-Vol.l78.-P.1274-82.

139. Maloy KJ, Donachie AM, O'Hagan DT, Mowat AM. Induction of mucosal and systemic immune responses by immunization with ovalbumin entrapped in PLL microparticles. // Immunology.-1994.-Vol.81.-P.661-7.

140. Manca C, Reed MB, Freeman S et al. Differential monocyte activation underlies strain-specific Mycobacterium tuberculosis pathogenesis. // Infect hnmun.-2004.-Vol.72.-P.5511-4.

141. Marei A, Ghaemmaghami A, Renshaw P et al. Superior T cell activation by ESAT-6 as compared with the ESAT-6-CFP-10 complex. // Int Immunol.-2005.-Vol. 17.-P. 1439-46.

142. Mastroeni P. Immunity to systemic Salmonella infections. // Curr Mol Med.-2002.-VoL2.-P,393-406.

143. Medina E, North RJ. Evidence inconsistent with a role for the Beg gene (Nrampl) in resistance of mice to infection with virulent Mycobacterium tuberculosis. // J Exp Med.-l996.-Vol. 183.-P. 1045-51.

144. Meher AK, Bal NC, Chary KV, Arora A. Mycobacterium tuberculosis H37Rv ESAT-6-CFP-10 complex formation confers thermodynamic and biochemical stability. //FEBS J.-2006.-Vol.273.-P.1445-62.

145. Minion FC, Menon SA, Mahairas GG, Wannemuehler MJ. Enhanced murine antigen-specific y-IFN and immunoglobulin G2a responses by usingmycobacterial ESAT-6 sequences in DNA vaccines. // Infect Immun.-2003.-Vol.71.-P.2239-43.

146. Mollenkopf HJ, Dietrich G, Fensterle J et al. Enhanced protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine by adsorption onto cationic PLG microparticles. // Vaccine.-2004.-Vol.22.-P.2690-5.

147. Montgomery DL, Huygen K, Yawman AM et al. Induction of humoral and cellular immune responses by vaccination with M. tuberculosis antigen 85 DNA. // Cell Mol Biol (Noisy -le-grand).-1997.-Vol.43.-P.285-92.

148. Moore A, McGuirk P, Adams S et al. Immunization with a soluble recombinant HTV protein entrapped in biodegradable microparticles induces HIV-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes and CD4+ Thl cells. // Vaccine.-1995.-Vol.l3.-P.1741-9.

149. Mori T, Sakatani M, Yamagishi F et al. Specific detection of tuberculosis infection: an interferon-gamma-based assay using new antigens. // Am J Respir Crit Care Med.-2004.-Vol.l70.-P.59-64.

150. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. // J Immunol Methods.-1983.-Vol.65.-P.55-63.

151. Mostov KE. Transepithelial transport of immunoglobulins. // Annu Rev Immunol.-1994.-Vol. 12.-P.63-84.

152. Mustafa AS. Development of new vaccines and diagnostic reagents against tuberculosis. //Mol Immunol.-2002.Vol.39.P.113-9.

153. Mustafa AS, Shaban FA. ProPred analysis and experimental evaluation of promiscuous T-cell epitopes of three major secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis. //Tuberculosis (Edinb).-2006.-Vol.86.-P.115-24.

154. Nicholson LB, Kuchroo VK. T cell recognition of self and altered self antigens. // Crit Rev Immunol.-1997.-Vol.l7.-P.449-62.

155. O'Hagan D, Singh M, Ugozzoli M et al. Induction of potent immune responses by cationic microparticles with adsorbed human immunodeficiency virus DNA vaccines. // J Virol.-2001.-Vol.75.-P.9037-43.

156. O'Hagan DT, Rahman D, McGee JP et al. Biodegradable microparticles as controlled release antigen delivery systems. // Immunology.-1991.-Vol.73.-P.239-42.

157. O'Hagan DT, Rappuoli R. Novel approaches to pediatric vaccine delivery. // Adv Drug Deliv Rev.-2006.-Vol.5 8.-P.29-51.

158. O'Reilly LM, Daborn С J. The epidemiology of M. bovis infections in animals and man: a review. // Tuber Lung Dis.-1995.-Vol.76, Suppl 1.-P.1-46.

159. Ohara N, Yamada T. Recombinant BCG vaccines. // Vaccine.-2001.-Vol.19.-P.4089-98.

160. Osland A, Kleppe K. Polyamine induced aggregation of DNA. // Nucleic Acids Res.-1977.-Vol.4.-P.685-95.

161. Panyam J, Labhasetwar V.-Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. // Adv Drug Deliv Rev.-2003.-Vol.55.-P.329-47.

162. Park TG, Jeong JH, Kim SW. Current status of polymeric gene delivery systems. // Adv Drug Deliv Rev.-2006.-Vol.58.-P.467-86.

163. Parker LC, Whyte MK, Vogel SN, Dower SK, Sabroe I. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 agonists regulate CCR expression in human monocytic cells. // J Immunol.-2004.-Vol.l72.-P.4977-86.

164. Pedroza-Gonzalez A, Garcia-Romo GS, Aguilar-Leon D et al. In situ analysis of lung antigen-presenting cells during murine pulmonary infection with virulent Mycobacterium tuberculosis. // Int J Exp Pathol.-2004.-Vol.85.-P.135-45.

165. Pelta J, Livolant F, Sikorav JL. DNA aggregation induced by polyamines and cobalthexamine. //J Biol Chem.-1996.-Vol.271.-P.5656-62.

166. Proud D, Sanders SP, Wiehler S. Human rhinovirus infection induces airway epithelial cell production of human beta-defensin 2 both in vitro and in vivo. // J Immunol.-2004.-Vol.l72.-P.4637-45.

167. Pym AS, Brodin P, Majlessi L et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against ТВ// Nat Med.-2003.-Vol.9.-P.533-9.

168. Raju PA, McSloy N, Truong NK, Kendall MA. Assessment of epidermal cell viability by near infrared multi-photon microscopy following ballistic delivery of gold micro-particles. //Vaccine.-2006.-Vol.24.-P.4644-7.

169. Raspaud E, Olvera dlC, Sikorav JL, Livolant F. Precipitation of DNA by polyamines: a polyelectrolyte behavior. // Biophys J.-1998.-Vol.74.-P.381-93.

170. Raviglione MC, Snider DE, Jr., Kochi A. Global epidemiology of ТВ. Morbidity and mortality of a worldwide epidemic//JAMA.-1995.-V.273.-P.220-6.

171. Reed SG, Alderson MR, Dalemans W, Lobet Y, Skeiky YA. Prospects for a better vaccine against tuberculosis. // Tuberculosis (Edinb).-2003.-Vol.83.-P.213-9.

172. Renshaw PS, Lightbody KL, Veverka V et al. Structure and function of the complex formed by the tuberculosis virulence factors CFP-10 and ESAT-6. //EMBO J.-2005.-Vol.24.-P.2491-8.

173. Rook GA, al Attiyah R. Cytokines and the Koch phenomenon. // Tubercle.-1991.-Vol.72.-P. 13-20.

174. Rook GA, Seah G, Ustianowski A. M. tuberculosis: immunology and vaccination. // Eur Respir J.-2001.-Vol.l7.-P.537-57.

175. Saporito-Irwin SM, Geist RT, Gutmann DH. Ammonium acetate protocol for the preparation of plasmid DNA suitable for mammalian cell transfections. // Biotechniques.-1997.-Vol.23.-P.424-7.

176. Sato T, Ishii T, Okahata Y. In vitro gene delivery mediated by chitosan. effect of pH, serum, and molecular mass of chitosan on the transfection efficiency. //Biomaterials.-2001.-Vol.22.-P.2075-80.

177. Sato Y, Roman M, Tighe H et al. Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective i/d gene immunization. // Science.-1996.-Vol.273.-P.352-4.

178. Schaible UE, Kaufmann SH. CD1 molecules and CDl-dependent T cells in bacterial infections: a link from innate to acquired immunity? // Semin Immunol.-2000.-Vol.l2.-P.527-35.

179. Scheerlinck JY. Genetic adjuvants for DNA vaccines. // Vaccine.-2001 .-Vol. 19.-P.2647-56.

180. Schwendeman SP, Costantino HR, Gupta RK et al. Strategies for stabilising tetanus toxoid towards the development of a single-dose tetanus vaccine. // Dev Biol Stand.-1996.-Vol.87.-P.293-306.

181. Seaman MS, Peyerl FW, Jackson SS et al. Subsets of memory cytotoxic T lymphocytes elicited by vaccination influence the efficiency of secondary expansion in vivo. // J Virol.-2004.-Vol.78.-P.206-15.

182. Shams H, Klucar P, Weis SE et al. Characterization of a M. tuberculosis peptide that is recognized by human CD4+ and CD8+ T cells in the context of multiple HLA alleles. // J Immunol.-2004.-Vol.l73.-P.1966-77.

183. Shata MT, Anthony DD, Carlson NL et al. Characterization of the immune response against hepatitis С infection in recovered, and chronically infected chimpanzees. // J Viral Hepat.-2002.-Vol.9.-P.400-10.

184. Sirinavin S, Chotpitayasunondh T, Suwanjutha S, Sunakorn P, Chantarojanasiri T. Protective efficacy of neonatal Bacillus Calmette-Guerin vaccination against tuberculosis. // Pediatr Infect Dis J.-1991.-Vol.l0.-P.359-65.

185. Sizemore DR, Branstrom AA, Sadoff JC. Attenuated bacteria as a DNA delivery vehicle for DNA-mediated immunization. // Vaccine.-1997.-Vol.l5.-P.804-7.

186. Skinner MA, Yuan S, Prestidge R, Chuk D, Watson JD, Tan PL. Immunization with heat-killed M. vaccae stimulates CD8+ cytotoxic T cells specific for macrophages infected with M. tuberculosis. I I Infect Immun.-1997.-Vol.65.-P.4525-30.

187. Skjot RL, Oettinger T, Rosenkrands I et al. Comparative evaluation of low-molecular-mass proteins from M. tuberculosis identifies members of the ESAT-6 family as immunodominant T-cell antigens. // Infect Immun.-2000.-Vol.68.-P.214-20.

188. Smith I. Mycobacterium tuberculosis pathogenesis and molecular determinants of virulence. // Clin Microbiol Rev.-2003.-Vol.l6.-P.463-96.

189. Sodhi A, Gong J, Silva C, Qian D, Barnes PF. Clinical correlates of interferon gamma production in patients with tuberculosis. // Clin Infect Dis.-1997.-Vol.25 .-P. 617-20.

190. Somoskovi A, Hotaling JE, Fitzgerald M et al. False-positive results for M. celatum with the AccuProbe M. tuberculosis complex assay. //J Clin Microbiol.-2000.-Vol.38.-P.2743-5.

191. Steingart KR, Ramsay A, Pai M. Commercial serological tests for the diagnosis of tuberculosis: do they work? // Future Microbiol.-2007.-Vol.2.-P.55-9.

192. Stenger S, Mazzaccaro RJ, Uyemura К et al. Differential effects of cytolytic Tcell subsets on intracellular infection//Science.-1997.-V.276.-P.1684-7.

193. Stewart GR, Robertson BD, Young DB. Tuberculosis: a problem with persistence. // Nat Rev Microbiol.-2003.-Vol.l.-P.97-105.

194. Strieter RM, Belperio JA, Keane MP. Cytokines in innate host defense in the lung. // J Clin Invest.-2002.-Vol.l09.-P.699-705.

195. Sugawara I, Udagawa T, Yamada H. Rat neutrophils prevent the development of tuberculosis. // Infect Immun.-2004.-Vol.72.-P. 1804-6.

196. Tabata Y, Ikada Y. Drug delivery systems for antitumor activation of macrophages. // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.-1990.-Vol.7.-P.121-48.

197. Tanghe A, D'Souza S, Rosseels V et al. Improved immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding Ag85 by protein boosting. //Infect Immun.-2001.-Vol.69.-P.3041-7.

198. Tascon RE, Colston MJ, Ragno S, Stavropoulos E, Gregory D, Lowrie DB. Vaccination against ТВ by DNA injection.// Nat Med.-1996.-Vol.2.-P.888-92.

199. Tasneem S, Islam N, Ali R. Crossreactivity of SLE autoantibodies with 70 kDa hsp of M. tuberculosis. //Microbiol Immunol.-2001.-Vol.45.-P.841-6.

200. Theilmann L, Meyer U, Kommerell B, Dierkesmann R, Moller A. Alpha tumor necrosis factor in the serum of patients with sarcoidosis, tuberculosis or bronchial cancer. //Pneumologie.-1990.-Vol.44.-P.735-8.

201. Towbin H, Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding— current status and outlook. // J Immunol Methods.-1984.-Vol.72.-P.313-40.

202. Tsuchiya HM, Jeanes A, Bricker HM, Wilham CA. Dextran-degrading enzymes from molds. // JBacteriol.-1952.-Vol.64.-P.513-9.

203. Tsuyuguchi I, Kawasumi H, Ueta C, Yano I, Kishimoto S. Increase of TCR y/8-bearing Tcells in cord blood of newborn babies obtained by in vitro stimulation with mycobacterial cord factor//Infect Immun.-1991.-V.59.-P.3053-9.

204. Tufariello JM, Chan J, Flynn JL. Latent tuberculosis: mechanisms of host and bacillus that contribute to persistent infection. // Lancet Infect Dis.-2003.-Vol.3.-P. 578-90.

205. Ulmer JB. Tuberculosis DNA vaccines. // Scand J Infect Dis.-2001.-Vol.33.-P.246-8.

206. Ulmer JB, Deck RR, DeWitt CM, Donnhly Л, Liu MA. Generation of MHC class I-restricted cytotoxic T lymphocytes by expression of a viral protein in muscle cells: antigen presentation by non-muscle cells. // Immunology.-1996.-Vol.89.-P.59-67.

207. Vassallo R, Thomas CF, Jr., Vuk-Pavlovic Z, Limper AH. Mechanisms of defence in the lung: lessons from Pneumocystis carinii pneumonia. // Sarcoidosis Vase Diffuse Lung Dis.-2000.-Vol.17.-P. 130-9.

208. Verbon A, Juffennans N, Van Deventer SJ, Speelman P, Van Deutekom H, Van Der PT. Serum concentrations of cytokines in patients with active ТВ and after treatment. // Clin Exp Immunol.-1999.-Vol.ll5.-P.110-3.

209. Verbon A, Kuijper S, Jansen HM, Speelman P, Kolk AH. Antigens in culture supernatant of Mycobacterium tuberculosis: epitopes defined by monoclonal and human antibodies. // J Gen Microbiol.-1990.-Vol.l36.-P.955-64.

210. Wang J, Takeuchi T, Tanaka S et al. A mutation in the insulin 2 gene induces diabetes with severe pancreatic beta-cell dysfunction in the Mody mouse. // J Clin Invest.-1999.-Vol.l03.-P.27-37.

211. Weintraub H, Cheng PF, Conrad K. Expression of tiansfected DNA depends on DNA topology. // Cell.-1986.-Vol.46.-P.l 15-22.

212. Wesa AK, Galy A. IL-1 beta induces dendritic cells to produce IL-12. // Int Immunol.-2001 .-Vol. 13.-P. 1053-61.

213. Wise R, Andrews JM, Bedford KA. LY127935, a novel oxa-beta-lactam: an in vitro comparison with other beta-lactam antibiotics. // Antimicrob Agents Chemother.-1979.-Vol,16.-P.341-5.

214. Wolff JA, Ludtke JJ, Acsadi G, Williams P, Jani A. Long-term persistence of plasmid DNA and foreign gene expression in mouse muscle. // Hum Mol Genet.-1992.-Vol. 1 .-P.363-9.

215. Zinkemagel RM. Immunity, immunopathology and vaccines against HIV? // Vaccine.-2002.-Vol.20.-P. 1913-7.