Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические основы диагностики вирусных и бактериальных инфекций человека и животных

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические основы диагностики вирусных и бактериальных инфекций человека и животных"

На правах рукописи

Туманов Юрий Васильевич

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

' 8 СЕН 2011

Кольцово-2011

4852708

Работа выполнена в ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Аутеншлюс Александр Исаевич Татьков Сергей Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Беклемишев Анатолий Борисович Загребельный Станислав Николаевич Толстикова Татьяна Генриховна

Ведущая организация:

ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва

Защита состоится «7» октября 2011 года в 900 часов на заседании диссертационного совета Д. 208.020.01 при ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: 630559, р. п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, тел.: (383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Автореферат разослан С^у 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор. Г.П. Трошкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Распространенность инфекционно-воспалительных заболеваний вирусной и бактериальной этиологии, трудности их специфической индикации (диагностики) обусловливают необходимость поиска и разработки новых методов, позволяющих выявить возбудитель и активность процесса. Среди заболеваний инфекционной природы туберкулез и вирусные гепатиты устойчиво занимают доминирующее положение (Онищенко Г.Г., 2010). По оценке ВОЗ, в мире ежегодно отмечается 1,5 миллионов клинических случаев гепатита А. [www.who.int/immunization (HebA_Rus.pdf)]. Гепатит А, проявляющийся нарастанием симптомов с начала заболевания, сейчас встречается в более позднем возрасте. Больные с бессимптомной формой заболевания, оставаясь нераспознанными, являются основным источником заболевания. В связи с тем, что они поступают в медицинские учреждения в более поздние сроки развития инфекции, антиген ВГА не всегда выявляется, поэтому наиболее достоверным маркером для постановки диагноза гепатита А является выявление иммуноглобулинов класса М (IgM). Разработка и внедрение в практику здравоохранения методов диагностики гепатита А является одним из актуальных направлений профилактики и лечения этой широко распространенной инфекции.

Около трети населения в мире инфицировано преимущественно микобактериями вида М. tuberculosis, в России инфицированность превышает 80 %, а по заболеваемости и числу больных туберкулезом Россия, по-прежнему, входит в число стран с самой неблагоприятной ситуацией по туберкулезу (WHO, 2008). Заболеваемость туберкулезом не зависит от социальной принадлежности и охватывает все слои современного общества. В общей системе мер борьбы с туберкулезом является современная и достоверная диагностика. Имеющиеся в настоящее время диагностические тесты не всегда отвечают предъявляемым требованиям. Многие из них весьма трудоемки и не всегда отличаются достоверностью. Особенностью туберкулеза, как одной из хронических инфекций, является преобладание латентных форм и случаев бактерионосительства. Традиционные методы диагностики туберкулеза, такие как рентгенография и бактериологический анализ мокроты, туберкулинодиагностика не всегда эффективны. Нередко для постановки окончательного диагноза требуется сравнение результатов, полученных разными методами. Развитие методов определения клеточного иммунитета напрямую связано с разработкой новых методов идентификации Т-клеточных компонентов крови (Pai М., 2006; Lalvani А., 2007,2001; Bellete В., 2002; Clark S.A., 2007). Высокая разрешающая способность этих методов позволяет оценивать антиген-стимулированную продукцию цитокинов, что очень важно для оценки специфического иммунного ответа.

Таким образом, разработка новых технологий, в том числе на основе выявления Т-клеточных маркеров, является крайне важной для нашей страны и в настоящее время входит в разряд наиболее актуальных проблем современной медицины.

Лейкоз крупного рогатого скота широко распространен по всему миру (Murakami К. et al., 2011; Acaite J. et al., 2007; Храмцов B.B. с соавт., 2005; Смирнов П.Н., 2007). В РФ, по данным Прихватиловой Л.Б. с соавт. (1998); Гулюкиной М.И. и соавт., (2003), лейкоз крупного рогатого скота занимает лидирующее место и составляет 57 % от других нозологий. 60 % инфицированных животных не имеют клинических признаков инфекции (Kettmann R. et al., 1994), и только выявление специфических антител серологическими методами или выявление провирусной ДНК с использованием молекулярно-биологических методов позволяет идентифицировать заболевание. Большинство структурных белков вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) проявляет иммуногенность, что позволяет с достаточной достоверностью выявлять антитела у инфицированных животных. С середины 70-х годов активно разрабатывались различные тест-системы для диагностики лейкоза крупного рогатого скота посредством ферментов с использованием цитопатогенных свойств вируса, а также для непосредственного обнаружения вирусного генома (Graves D.C. et al., 1977); с помощью полимеразной цепной реакции (Fechner Н. et al., 1996; Бусол В .А. и др., 1999; Mullís К.В. et al., 1986; Naif Н.М. et al., 1992; Kuckleb urg C.J. et al., 2003). В ГНЦ ВБ «Вектор» создание диагностических средств для выявления вирусных и бактериальных инфекций включает фундаментальные исследования вирусных белков и составляет одно из ведущих направлений деятельности центра. Высокая значимость для общественного здравоохранения и ветеринарии создания новых эффективных средств диагностики явилось основанием для проведения данной работы.

Цель исследования: разработка наборов и тест-систем, основанных на определении клеточного и гуморального иммунного ответа на антигены вирусного гепатита А, туберкулеза легких и вируса лейкоза для выявления этих заболеваний у человека и крупного рогатого скота. Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать биоконъюгаты моноклональных антител к нативному антигену вируса гепатита А. Разработать и стандартизовать диагностические иммуноферментные тест-системы для выявления маркеров вирусного гепатита А.

2. Сконструировать рекомбинантные молекулы, несущие гены, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки М. tuberculosis. Провести оценку полученных полипептидов на пригодность их для использования в диагностике туберкулеза у человека.

3. Разработать и стандартизовать диагностические тесты с использованием гибридных полипептидов и с применением методов определения способности клеток крови продуцировать IFN-y для выявления туберкулеза человека.

4. На основе использования рекомбинантного белка р24 разработать диагностический набор для выявления вируса лейкоза КРС. Сравнить

результаты анализа, полученные с использованием разработанного набора, с референс-тест-системами. Научная новизна

Впервые были получены и охарактеризованы биоконъюгаты крысиных моноклональных антител к нативному антигену вируса гепатита А. Разработаны и стандартизованы иммуноферментные тест-системы для выявления и дифференциальной диагностики вирусного гепатита А, обладающие высокой чувствительностью (85-95 %) и специфичностью (90100 %).

Впервые на основе плазмиды pGEX-2T сконструированы рекомбинантные плазмиды, несущие гены, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки М. tuberculosis, такие как rESAT-6, rCFPIO и гДМРТ64. Введение новых плазмид в экспрессирующий штамм Е. coli BL21 позволило получить штаммы-продуценты рекомбинантных белков, несущих в N-концевой части аминокислотную последовательность глутатионтрансферазы (GST) в качестве белка-носителя. Полученные штаммы-продуценты обеспечивали продукцию слитных белков в растворимой форме.

Впервые полученные рекомбинантные белки - rESAT-6, rCFPIO и гДМРТ64 - можно использовать при разработке тест-систем нового поколения для диагностики туберкулеза.

При проведении иммуноферментного и функционального анализа (IFN-у-анализа, IFN-y-ELISPOT-теста) для выявления туберкулеза и подтверждения (опровержения) диагноза использованы рекомбинантные белки, содержащие на N-конце аминокислотную последовательность глутатионтрансферазы в качестве вспомогательного белка.

Сравнение с помощью расчетных программ, предсказывающих В-клеточные эпитопы антигенов, показало хорошее совпадение вторичных структур соответствующих районов природных и рекомбинантных белков, что позволило прийти к заключению о полноценном взаимодействии последних со специфическими иммуноглобулинами без отщепления GST-последовательности.

Впервые разработана схема диагностики лейкоза крупного рогатого скота на основе серологических методов — ИФА и РИД — с применением рекомбинантного антигена р24, которые использованы в ветеринарии на завершающих этапах оздоровления животных от лейкоза и в хозяйствах, где регистрируются единичные случаи инфекции BJIKPC. Практическая значимость работы

Получены и сконструированы опытные и экспериментально-производственные серии тест-систем, которые были аттестованы в отделе биологического и технического контроля НПО «Вектор» и испытаны в ГИСК им. JI.A. Тарасевича в 1990-1991 гг. На разработанную диагностическую тест-систему утверждена научно-техническая документация (ВФС 42-331ВС-92), эксперименально-производственный регламент (ЭПР) 373-92. «Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса М к

вирусу гепатита А «Вектогеп-A-IgM». Инструкция по применению «Тест-системы иммуноферментной для выявления иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита А «Вектогеп-A-IgM».

Разработана экспериментальная коммерческая тест-система для выявления ВГА двухстадийным вариантом, которая обладает 100 % чувствительностью и специфичностью и позволяет определять вирусный антиген в природных биологических объектах, в лизате инфицированных клеток. Применение крысиных моноклональных антител в диагностике позволяет значительно увеличить специфичность и чувствительность тест-систем.

Разработана и запатентована технология получения рекомбинантных видоспецифических белков rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64 М. tuberculosis для диагностики туберкулеза.

Разработанные методы иммунологического мониторинга туберкулезной инфекции, использующие Т-клеточные технологии, позволяют усовершенствовать диагностику туберкулеза.

Создана схема комплексной диагностики ВЛКРС в хозяйствах на завершающих этапах оздоровления животных от лейкоза и в хозяйствах, где регистрируются единичные случаи инфекции ВЛКРС на основе иммуноферментного анализа (ИФА) и радиальной иммунодиффузии (РИД). Положения, выносимые на защиту

1. Разработанные и стандартизованные компоненты диагностических иммуноферментных наборов для выявления маркеров вирусного гепатита А позволили создать высокоэффективные диагностические тест-системы.

2. Плазмиды pTSEó, рТВ232 и рТВ323 содержат гены, кодирующие рекомбинантные видоспецифичные высокоиммуногенные белки М. tuberculosis. При введении этих плазмид в клетки Е. coli (BL21) обеспечивается продукция рекомбинантных белков rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64 в растворимой форме в количествах, достаточных для проведения диагностики туберкулеза.

3. Разработанная методика получения, выделения и очистки рекомбинантных белков rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64 в растворимой форме из штаммов-продуцентов, а также полученные рекомбинантные генетические конструкции на основе плазмиды pGEX-2T, включающие гены, кодирующие секретируемые белки М. tuberculosis, и экспрессирующий штамм BL21, могут быть представлены в виде технологической схемы для разработки лабораторного регламента по производству этих белков.

4. Рекомбинантные белки rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64 применимы в качестве компонентов в иммуноферментном анализе, у-интерфероновом анализе и в у-интерфероновом ELISPOT-Тесте при диагностике туберкулеза без проведения протеолитического отщепления аминокислотной последовательности белка-носителя от аминокислотной последовательности целевого белка. Исследование клинического

материала позволило оценить возможности гибридных белков в диагностике туберкулеза. 5. Комплексная диагностика вируса лейкоза крупного рогатого скота с использованием серологических тестов (РИД, ИФА) позволяет с большей эффективностью проводить обследование хозяйств с различной степенью инфицированности лейкозом крупного рогатого скота. Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 365 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 545 работ. Работа иллюстрирована 59 рисунками и включает 39 таблиц. Апробация работы и публикации

Материалы, изложенные в диссертационной работе, были представлены на следующих международных и научно-практических конференциях: «Инфекционной службе г. Новосибирска — 90 лет». Научно-практическая конференция Новосибирск, 1994; конференция «Проблемы биологической и экологической безопасности», Оболенск, 2000 г.; 8-я международная конференция «СПИД, рак и родственные проблемы» Санкт-Петербург, 2000 г.; International Conference American Thoracic Society San Francisco, California, 2001; IIth ERS Annual Congress Berlin, Germany, 2001; Всероссийская научно-практическая конференция, г. Иркутск, 2002; «VII Российский съезд фтизиатров», Москва, 2003 г.; Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний», Новосибирск, 2004 г.; «Актуальные вопросы ветеринарии: Сибирская, международная научно-практическая конференция», Новосибирск, 2004; Keystone Symposia "Tuberculosis: Integrating Host and Pathogen Biology"; Whistler, British Columbia, Canada, 2005; Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: III Российская научная конференция с международным участием, Новосибирск, 2006 г. ; The International Simposium "EU-Russia: Prospects for Cooperation in Biotechnology in the Seventh Framework Programme", St-Petersburg, Russia, 2006; Четвертый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2007 г.; II Российско-германская конференция форума Коха — Мечникова. «Туберкулез, спид, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении», Томск, 2007 г.; Vaccine Congress, Amsterdam, the Netherlands, 2007; Международная научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней», Минск, 2007; «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России», Научно-практическая конференция, Ставрополь, 2007; "New Technology in medicine and experimental biology", Pattaya-Bangkok, Thailand, 2007.

Работа выполнена в 1989-2009 гг. в рамках научных тем организации и международных проектов: грант МНТЦ № 1983р; грант МНТЦ № 2019р;

грант МНТЦ № 1980р; проект МНТЦ № 2311; проект МНТЦ № 2641.

По теме диссертации опубликовано 18 научных статей, из них 12 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК, 40 тезисов докладов, монография, 1 методическое указание. Получено 2 патента Российской Федерации, один из которых удостоен диплома в номинации «100 лучших изобретений России». Личный вклад соискателя

В диссертации обобщены результаты экспериментальных исследований, проведенных в 1989-2009 гг. соискателем в ВНИИ МБ, ГНЦ ВБ «Вектор», ЗАО «Вектор-Бест». Автор принимал активное участие в развитии и внедрении новых технологий в диагностике социально-значимых вирусных и бактериальных инфекций в СССР и РФ. Автор принимал личное участие в планировании и проведении основного комплекса исследований, результаты которых представлены в диссертационной работе. За помощь, оказанную в проведении диссертационных исследований, автор выражает благодарность Тюнникову Г.И., Майданюку А.Г., Аммосову А.Д., Болдыреву А.Н., Смирновой О.Ю., Разумову И.А., Локтеву В.Б., Азаеву М.Ш., Носаревой О.В., Лебедеву Л.Р., Двоеглазову Н.Г., Храмцову В.В., Смирнову П.Н. Вклад в работу других авторов отражен в совместных публикациях по теме диссертации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вирус гепатита А, штаммы МБ-7 и HAS-15, адаптированные к клеточной культуре 4647, а также моноклональные антитела наработаны и охарактеризованы в НПО «Вектор». Биоконъюгаты крысиных моноклональных антител, меченные пероксидазой хрена, получены по методу Накане (Nakane Р.К., 1974).

При постановке иммуноферментного анализа использовали ОСО анти-ВГА IgM+ (ОСО 28-42/62-88) и ОСО анти-ВГА IgM- (ОСО 28-42/63-89) и стандартный набор сывороток (ОСО суммарных антител к ВГА - ОСО 42-2858-88) и аналогичный международный стандарт ВОЗ (МСО).

В качестве референс-диагностических наборов для выявления маркеров вирусного гепатита А использовали коммерческие наборы: HAVAB-MEIA (Abbott, США); Anti-HAV-IgM EIA (La Roche, Швейцария); «Диагнагеп» (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Россия).

В работе использовали питательные среды RPMI-1640, производства ГНЦ ВБ «Вектор». Вакцину BCG, полученную из НИИ вакцин и сывороток (Ставрополь), и штамм H37Rv из коллекции микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича использовали для получения антигенов микобактерий. В качестве нуклеотидной матрицы использовали ДНК М. tuberculosis H37Rv при проведении ПЦР. В качестве референс-диагностических наборов для выявления антител к микобактериальным антигенам применяли коммерческие тест-системы «Анти-Туб-IgG» (НИИЭМ им. Пастера, СПб) и «АТ-Туб-БЕСТ-стрип» (Вектор-Бест, Новосибирская область, п. Кольцово).

Выделение геномной микобактериальной ДНК проводили согласно методике (van Embden J.D. et al., 1993). Геномную ДНК анализировали ЭФ в 1 % агарозном геле. Концентрацию геномной ДНК измеряли на спектрофотометре Gene Quant pro (Amersham Bioscience, США) при 260 нм.

Выделение плазмидной ДНК проводили по методике, адаптированной нами для мини-варианта, с последующей депротеинизацией (Маниатис Т. и др., 1984).

Электрофорез белков проводили в денатурирующих условиях но Лэммли (Laemmly W.K., 1970). Гель окрашивали раствором Кумасси (Reisner А.Н. et al., 1975 или Reisner А.Н., 1984), затем отмывали 10% раствором уксусной кислоты.

Иммуноблотинг белков. Белки лизатов Е. coli BL21, разделенные ЭФ в SDS-ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм (Amersham, США), согласно процедуре (Towbin H. et al., 1979) в модификации. Перенос белков осуществляли в БПБ1 при напряжении 100 В в течение 1 ч. Контроль переноса белков осуществляли окрашиванием полоски мембраны 0,3 % раствором пунцовым С в течение 1 мин и отмывкой красителя дистиллированной водой до видимого исчезновения белковых полос.

Образование иммунных комплексов выявляли в буферном растворе, содержащим 2 красителя (BCIP и NTB). Ферментативную реакцию останавливали перенесением мембраны в дистиллированную воду.

Секвенирование клонированной нуклеотидной последовательности. Секвенирование клонированных генов в составе рекомбинантных ДНК проводили с использованием набора для секвенирования CEQ2000 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, согласно прописи изготовителя, за исключением того, что в секвенирующей реакции (V = 5 мкл) были использованы оба прайм ера (в каждой из секвенирующих реакций для одной плазмиды — или прямой Fpgex, или обратный Rpgex), не входящие в набор и предназначенные специально для секвенирования клонированных НП в плазмиды серии pGEX. ТВП секвенирующей реакции — 1х [94 °С — 2 мин], ЗОх [96 °С - 20 с, 44 °С - 20 с, 60 °С - 4 мин]. Секвенирующие реакции выполняли на амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) или Mastercycler gradient (Eppendorf), а разделение продуктов реакции проводили в автоматическом секвенаторе Beckman CEQ 2000 (Beckman Coulter).

Выделение рекомбинантных GST-P-белков проводили с использованием аффинной хроматографии в микроколонке путем многократного центрифугирования при 600 g . Белок GST-P анализировали ЭФ и иммуноблотингом. Концентрацию общего белка после элюции определяли по формуле Варбурга (Warburg С.):

С = l,55-A2so - 0,76-А2бо, где С - концентрация белка в мг/мл, А -оптическая плотность раствора при длине волны, указанной в нижнем индексе, и длине оптического пути кюветы 1 см (http://www.kisker-biotech.com/deutsch/nano-photometer-methods.htm).

Определение IFN-y (IFN-y-анализ) в супернатантных клетках цельной крови проводили с использованием коммерческих наборов (BD OptEIA Reagent), согласно инструкции производителя.

IFN^y-ELISPOT-анализ проводили с использованием набора IFN-y BD™ ELISPOT Set (BD Biosciences, CIIIA). Пятна, различающиеся по размеру, после высыхания лунок подсчитывали с помощью автоматического ELISPOT-ридера (KS Immunospot analyzer, Карл-Цейс, Германия) или визуально с помощью стереомикроскопа.

Образцы сывороток, крови и мокрот. В настоящей работе были использованы образцы крови, полученные от различных групп пациентов и собранные за период с 2001 по 2007 гг. Первая группа включала больных с активным неспецифическим процессом в легких со следующими формами: очаговый туберкулез легких (12 человек), фиброзно-кавернозный (14 человек), диссеминированный туберкулез (22 пациента), инфильтративный (19 человек), больные ТБ (290 человек). Вторая группа - лица, у которых туберкулез легких был выявлен при профосмотрах (нелеченые АБП, 101 человек). Третья группа - ВИЧ-ассоциированный туберкулез (27 человек). Четвертая группа - условно здоровые лица (650 человек) -доноры. Возраст пациентов составлял 24-45 лет, находящихся на лечении в городском противотуберкулезном диспансере. Диагноз туберкулез легких устанавливался врачами противотуберкулезных учреждений на основании клинико-лабораторных данных.

В другой выборке обследовано 66 больных туберкулезом легких, из них мужчин - 49, женщин - 17 в возрасте 25-65 лет, госпитализированных для лечения в городскую специализированную легочно-хирургическую больницу № 1 г. Новосибирска в 2000-2005 гг.

Клинические изоляты культур клеток М. tuberculosis. В работе использованы клинические изоляты М. tuberculosis, предоставленные НИИ туберкулеза (г. Новосибирск) и ОГУЗ «Клинический центр специализированных видов медицинской помощи «Фтизиатрия» (г. Новосибирск) в рамках выполнения совместного проекта МНТЦ № 1980. Всего получено 1350 изолятов культур клеток микобактерий. Проведение проекта № 1980 было одобрено этическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор» 28 мая 2001 г. (протокол № 2 от 28 мая 2001 г.).

Клинический материал был получен из областной клинической туберкулезной больницы г. Томска. Из этой же клиники получены изоляты мокрот, соответствующие образцам крови от пациентов с подозрением на туберкулез легких (всего 38 изолятов). Исследование одобрено этическим комитетом ГОУ ВПО СибГМУ (протокол № 24 от 06.12.2004). Клинический материал цельной крови получен в ГБУЗ НСО «Центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями». У больных туберкулез и ВИЧ были диагностированы лабораторным анализом. Наличие микобактерий туберкулеза в мокроте было определено методом посева и подтверждено рентгеноскопией. При анализе данных в случае сочетанной инфекции ВИЧ и туберкулеза преобладала инфильтративная форма туберкулеза, фиброзно-

кавернозный туберкулез диагностирован у 2 пациентов (16,7 %). Развитие ВИЧ-инфекции проходило на фоне клинически леченого туберкулеза у 5 (42%) больных. У 3 больных диагностирован, кроме ВИЧ/ТБ, вирусные гепатиты В и С, хламидийная инфекция. Забор материала для исследований проводили в соответствии с этическими нормами при обязательном получении согласия испытуемых. При проведении работ по диагностике туберкулеза руководствовались нормативным документом, регламентирующим деятельность противотуберкулезной службы РФ (Приказ Минздрава РФ от 21 марта 2003 г. № 109 «О совершенствовании про тивотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»),

Статистическую обработку полученных данных проводили используя пакет программ статистической обработки данных Microsoft Excel 2007 и www.biometrica.tomsk.ru. Результаты исследования обрабатывались статисти чески с использованием критериев Стьюдента (t), Вилкинсона-Манна-Уитни (U) и коэффициента корреляции по программе StatGraphicsPlus.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител IgM к вирусу гепатита А. Разработка тест-системы основана на использовании культивируемого ВГА на культуре клеток 4647, выделении вируса, иммунизации животных вирусной суспензией, выделении иммуноглобулинов из гипериммунной сыворотки к ВГА, получении конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой хрена, сорбции антител против имл<уноглобулинов класса M человека на планшете с оптимизацией всех стадий проведения иммунохимического анализа. Получение и очистку поликлональных антител из морских свинок против очищенного антигена ВГА для использования их в ИФА проводили после 3-кратной иммунизации морских свинок очищенным антигеном ВГА с полным адъювантом Фрейнда с последующим забором крови, выделением суммарной фракции иммуноглобулинов и очисткой их на сефадексе ДЭАЭ-А-25, согласно разработанной нами инструкции (М 123.21.011-90). Фракции, соответствующие пику иммуноглобулинов G, объединяли и диализовали против 2- смен фосфатного буфера (pH 7,5 ±0,1) в течение 18 ч. Концентрацию белка после проведения диализа определяли при Х=280 нм спектрофотометрически и доводили ФСБ до концентрации 1 г/л.

Получение конъюгатов антител анти-ВГА с пероксидазой хрена осуществляли периодатным методом. Рабочий титр полученных конъюгатов составил 1/3200. Активность конъюгата сохраняется не менее 12 месяцев при хранении при температуре 2-4 °С. Нами были получены конъюгаты МКА с пероксидазой хрена (табл. 1). Сравнение конъюгатов проводили согласно следующим критериям: их чувствительность и специфичность в иммуноанализе. После отбора моноклональных конъюгатов собирали экспериментальные серии тест-систем «Вектогеп-A-IgM-MKA» и проводили оценку их специфичности и чувствительности. Для этого использовали панель положительных сывороток от переболевших гепатитом А людей, а

также набор сывороток от пациентов, не имевших в анамнезе заболевание гепатитом А. Отсутствие ложноположительных результатов свидетельствова ло о высокой специфичности тест-системы (табл. 2).

Сравнение набора экспериментальной серии «Вектогеп-А-1§М» на основе конъюгата МКА и пероксидазы хрена проводили с коммерческими тест-системами. В табл. 3 представлены результаты сравнения основных характеристик тест-систем отечественного и зарубежного производства при выявлении 1дМ к ВГА. Тест-система «Вектогеп-А-^М-МКА» по своим

Таблица 1

Характеристика конъюгатов поликлональных и моноклональных антител против ВГА __. __

№ п/п Конъюгаты Вид конъюгата Рабочее разведение Источник

1 Серия 1 Жидкий 800 НСО, Россия

2 Серия 2 Лиофилизованный 800 Средняя Азия, Таджикистан

3 Серия 3 Жидкий 1600 Россия

4 Серия 4 Жидкий 6400 Россия

5 Серия 5 Жидкий-МКА9В12 3200 Россия

6 Серия 6 Жидкий-МКА4С7 1600 Россия

7 Серия 7 Жидкий-МКАбНб 400 Россия

8 Серия 8 Жидкий-МКА5А11 800 Россия

9 «Диаплюс» Жидкий, МКА 800 Швейцария

Таблица 2 Определение антител 1§М, специфичных к ВГА (проверка кросс-реактивности тест-системы)

Панели сывороток Количество образцов «Вектогеп-A-IgM» (поликлональные/МКА конъюгаты)

IgM(+) IgM(-) Ложнопложительные IgM(±)

ВГА 100 96/98 2/1 2/1

Антигены ВГВ

HBsAg 23 0 23/23 0

HBcAg 9 0 9/9 0

ВИЧ-1 11 0 11/11 0

ВИЧ-1 9 0 9/9 0

ЦМВ 7 0 7/7 0

ВПГ-1 иВПГ-2 8 0 8/8 0

Краснуха 7 0 7/7 0

Сифилис 27 0 27/27 0

показателям (чувствительности и специфичности) практически ничем не отличалась от референс-тест-системы Abbott (США) и набора La Roche (Швейцария).

Таким образом, модифицированная «Вектогеп-A-IgM-MKA» отличалась от исходной более высокой чувствительностью и специфичностью при выявлении антител класса М к ВГА в сыворотках человека. Опытные и экспериментально-производственные серии тест-систем были аттестованы в ОБТК НПО «Вектор» и испытаны в ГИСК им. Л.А. Тарасевича в 1990-1991 гг. По результатам испытаний тест-система для выявления IgM к ВГА соответствовала проекту ВФС. В результате проведенных исследований три серии тест-систем «Вектогеп-A-IgM» были рекомендованы к проведению государственных испытаний на базе ГИСК им. Л.А.Тарасевича, согласно утвержденным программам испытаний. В качестве референс-тест-системы при проведении испытаний использовали иммуноферментную тест-систему для выявления антител к вирусу гепатита А класса М «Анти-ВГА IgM ИФА ДИА-плюс» (СП СССР - Швейцария). Качественные характеристики референтной тест-системы по специфичности и чувствительности были предварительно установлены с применением стандартов ОСО «Анти-ВГА IgM ДИАГНАГЕП» отечественного производства. При проведении государственных испытаний были сформированы две группы панелей сывороток. Основную опытную группу составили сыворотки больных с различными формами гепатита А (взрослые и дети), сыворотки лиц, находившихся в контакте с больными вирусным гепатитом А (всего было представлено 101 сыворотка). Сыворотки здоровых взрослых и детей, не болевших гепатитом А в течение 2 лет перед обследованием (всего 59 сывороток), составили первую контрольную группу. Вторая контрольная группа (выборка 77 человек) сформирована из больных вирусным гепатитом А, другие нозологические формы заболевания (болезнь Жильбера,

Таблица 3

Сравнительные характеристики диагностических тест-систем для выявления анти- IgM к ВГА_

№ п/п Фирма, тест-система Время анализа, ч Количество образцов Чувствительность тест-систем

1 Abbott (США), HAVAB-MEIA 20-25 100 99 ± 1

2 La Roche (Швейцария), "Anti-HAV-IgM EIA" 3-3,5 52 98 ± 1

3 «Вектор-Бест» (Россия), «Вектогеп-A-IgM-МКА» 4,5-5 96 98 ± 1

4 «Вектор-Бест» (Россия), «Вектогеп-A-IgM» 4,5-5 96 97 ± 1

5 Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов (Россия), «Диагнагеп» 25-35 96 97 ± 1

механическая желтуха, ОРВИ, иерсиниоз, пищевая токсикоинфекция, грипп и ряд других инфекций) — всего 33 человека. При проведении государственных испытаний были использованы 270 образцов сывороток, которые были зашифрованы и хранились в замороженном виде при минус (20 ± 2) °С. В процессе проведенных испытаний было установлено, что из 101 образца сывороток от больных ВГА с подтвержденным клиническим диагнозом наличия антител класса М к ВГА и подтвержденной в референс-тест-системе «Анти-ВГА IgM ИФА ДИА-плюс» тест-система «Вектогеп-А-IgM» выявила 96, а «Анти-ВГА IgM ДИАГНАГЕП» — 63 сыворотки, что составило соответственно 95,4 % и 62,3 %. При этом процент положительных результатов при использовании разработанной нами тест-системы «Вектогеп-A-IgM» практически не отличался от референтной тест-системы «Анти-ВГА IgM ИФА ДИА-плюс». Диагностический набор «Анти-ВГА IgM ДИАГНАГЕП» выявил 7 ложноположительных сывороток в группе больных вирусным гепатитом А, тогда как разработанная нами тест-система «Вектогеп-A-IgM» не выявила ни одной ложноположительной сыворотки. Совпадение результатов референс-тест-системы и «Вектогеп-A-IgM» составила 98,1 %. Значение коэффициента корреляции тест-системы «Вектогеп-A-IgM», находящегося в пределах от 0,96 до 0,98, свидетельствует о высокой степени сопоставимости результатов по отношению к референс-тест-системе. Таким образом, результаты проведения госиспытаний тест-системы «Вектогеп-A-IgM» для ранней диагностики ВГА показали диагностическую эффективность вновь разработанной тест-системы и сопоставимость полученных результатов с данными референтной тест-системы. Тест-система «Вектогеп-A-IgM» была использована в клинико-диагностических лабораториях при выявлении антител IgM на территории СССР. Тест-система сохраняла свою специфическую активность в течение 6 месяцев при температуре хранения не выше минус 8 °С. Время проведения анализа 2-4,5 часов.

Таким образом, на основании результатов проведения госиспытаний тест-система «Вектогеп-A-IgM» для ранней диагностики ВГА была рекомендована для внедрения в практику здравоохранения. На разработанную диагностическую тест-систему была утверждена НТД (ВФС 42-331ВС-92), экспериментально-производственный регламент (ЭПР) 373-92. Разработка тест-системы иммуноферментной для выявления антител IgG к вирусу гепатита А

Определение IgG к ВГА может быть использовано для оценки эпидемиологической ситуации по гепатиту А, для оценки эффективности вакцинации, а также при проведении специфической гамма-глобулиновой профилактики в школьных и дошкольных учреждениях среди детей, имевших контакт с больными гепатитом А. Этапами исследования являлось изучение и определение чувствительности разрабатываемой тест-системы «Вектогеп-А-антитела», сравнение с референс-тест-системой «ИФА анти-ВГА». При проведении титрования стандартных образцов сывороток, содержащих антитела к ВГА (ОСО 42-28-151-89), откалиброванного в

международных единицах, была определена аналитическая чувствительность тест-системы «Вектогеп-А-антитела», которая составила 9,8 ±1,2 мМЕ/мл, при этом аналитическая чувствительность референс-тест-системы «ИФА анти-ВГА» составила 11,8 ± 1,6 мМЕ/мл. Аналогичные показатели зарубежных тест-систем соответствовали 10 — 20 мМЕ/мл. Диагностические характеристики разработанной тест-системы «Вектогеп-А-антитела», такие как специфичность и чувствительность, составили - 82 % и 98-99 % соответственно, а вероятность получения положительного диагноза - 9596 %, вероятность установления отрицательного диагноза — 98 %. Общий показатель совпадения результатов составил 96 %. Специфичность при проверке отрицательных сывороток стандартной панели предприятия, не содержащих иммуноглобулины класса О к ВГА, составила 100%. Чувствительность при проверке положительных сывороток стандартной панели предприятия, содержащих иммуноглобулины класса в к ВГА, составила 100 %. Контрольные образцы готовы к использованию и не требуют дополнительного разведения. Неспецифические компоненты тест-системы (РПРС, ФСБ-Т, СБР, ОФД, стоп-реагент), взаимозаменяемы во всех выпускаемых наборах ЗАО «Вектор-Бест». Роль МКА в диагностике маркеров ВГА

Представленные выше результаты при определении антител ^М к ВГА показали высокую эффективность применения крысиных моноклональных антител в качестве противовирусных конъюгатов. Следующий этап работы включал использование очищенных МКА-анти-ВГА в коммерческих тест-системах «Вектогеп-А-антиген» производства «Вектор-Бест» при выявлении ВГА в различных образцах. В качестве подложки для захвата антигена были использованы МКА, представленные в табл. 4.

Таблица 4

Характеристика МКА к ВГА, применяемых в коммерческих тест-системах

«ВекторБест»

№ п/п МКА Титр МКА (обратные величины) Концентрация иммуноглобулинов, мг/мл

Культур альная среда Асцитическая жидкость Очищенные МКА

1 4С6 800 64000 64000 1,57

2 9В12 16000 1024000 1024000 3,98

3 1D9 400 64000 64000 2,1

4 5Е1 20 4000 Но. Но.

5 5А11 1280 128000 128000 1,85

6 6Н6 640 64000 64000 1,17

7 4А9 20 2000 Но. Но.

8 6С7 800 128000 128000 1,12

Но — не определяли

На рис. 1 показано, что МКА 6С7 и 4С6 при сорбции на планшеты в концентрации 1,25 мкг/мл обеспечивают более высокую реакционную емкость подложки при минимальном уровне фонового сигнала, чем поликлональные иммуноглобулины, полученные от иммунизированных

on 492 нм ',6 ■

>,г !

Qä

0,6 Off

о,г о

o,ts as

as

t, 25

,q С, мкг/мл

Рис. 1. Результаты титрования очищенных МКА, используемых в качестве подложки для захвата антигена в тест-системе «Вектогеп А-антиген». По оси абсцисс - концентрация иммуноглобулинов (мкг/мл), сорбированных на планшетах; по оси ординат — значения ИФА (ОП 492 нм). Образцы антител: 1 - МКА 4С6; 2 - МКА 6С7; 3 - МКА 5Е1; 4 - МКА 6Н6; 5 - 1D8; 6 — иммуноглобулины морских свинок, иммунизированных ВГА; 7 -иммуноглобулины нормальной крысиной сыворотки (отрицательный контроль)

ОП 492 нм

Рис. 2. Результаты титрования ВГА в различных модификациях тест-системы «Вектогеп А-антиген». По оси абсцисс - обратная величина титра антигена ВГА; по оси ординат значения ИФА (ОП 492 нм). 1 - подложка - МКА анти-ВГА и поликлональный конъюгат против ВГА; 2 - подложка - поликлональный ^С-анти-ВГА и поликлональный конъюгат против ВГА (тест-система «Вектогеп-А-антиген»); 3 — подложка - МКА анти-ВГА и моноклональный конъюгат 9В12-ПХ против ВГА; 4 — подложка - поликлональный анти-ВГА и моноклональный конъюгат 9В12-ПХ против ВГА

животных. Титрование антигена ВГА проводили с применением МКА- и поликлонального конъюгатов, а также очищенных препаратов моноклональных и поликлональных антител, используемых в качестве подложки. Титр вируса определяли по наибольшему разведению

положительных образцов, ОП которых в 2,1 раза превышала ОП фона (не более 0,2). МКА, сорбированные на поверхности планшет, при выявлении антигена и биоконъюгаты на основе МКА с пероксидазой хрена повышают чувствительность иммуноанализа в 8-16 раз (рис.2). Нами были приготовлены экспериментально-производственные серии тест-систем для выявления ВГА на основе противовирусного конъюгата МКА с пероксидазой (МКА9В12-ПХ) и поликлональных антител, используемых в качестве подложки.

Таблица 5

Результаты выявления ВГА в положительных и отрицательных образцах в

тест-системе «Вектогеп А-антиген»

Показатель Исследовательские образцы

Клеточный лизат Фекалии Сточные воды

Специфичность* 12/12 22/22 5/5

Чувствительность* * 11/11 63/63 22/22

* - Отношение общего количества отрицательных проб к числу отрицательных проб, выявляемых данной тест-системой. ** - Отношение общего количества положительных проб к числу положительных проб, выявляемых данной тест-системой.

Специфичность иммуноанализа в экспериментальной серии наборов оценивали по результатам взаимодействия полученного конъюгата с контрольными материалами, в которых отсутствовали специфические антигены. Неспецифическое связывание отсутствовало в исследованных образцах, содержащих гетерологичные антигены вирусов осповакцины, клещевого энцефалита, вируса простого герпеса (ВПГ-1, ВПГ-2), гепатита В, ЦМВ человека. В табл. 5 представлены результаты определения чувствительности экспериментальной серии «Вектогеп А-антиген», которая составила 100%. Рабочее разведение вируса, определяемого в позитивных образцах, составило 1/64—1/256 и 1/512-1/4096 при использовании коммерческой и экспериментальной серий тест-системы. При этом чувствительность экспериментальной серии «Вектогеп-А-антиген» при использовании биоконъюгата на основе МКА была в 8 раз выше чувствительности исходной тест-системы. В качестве подложки применяли поликлональные антитела к ВГА. Показано, что разработанная тест-система обладает 100 %-й чувствительностью и специфичностью и позволяет определять вирусный антиген в природных биологических объектах и лизате инфицированных клеток. Разработка компонентов диагностического набора непосредственно связана с применением консервантов. Среди разнообразия описанных в литературе и широко используемых антимикробных соединений интерес представляли биоциды (рис. 3 А и В). Дитиазолы, входящие в состав биоцидов, нашли широкое применение в качестве противовирусных и антибактериальных соединений (Affatato Б., 2004). Эти консерванты (5-хлор-2-метил-2,3-дигидроизотиазол-3-он и 2-метил-2,3-дигидроизотиазол-3-он) являются бактерицидами и обладают высокой антимикробной активностью (Биреко РгоСПп, 1996), что позволило

применить их в качестве консервантов компонентов диагностических наборов: буферных растворов, содержащих антитела, антигены и меченные ферментом конъюгаты антител и ряда других биоконъюгатов. Растворы биоконъюгатов на основе МКА или их биотинилированных производных,

+№"0

ы—сн.

Б "3'

А ВС

Рис. 3. Химическая структура биоцидов, применяемых в качестве консервантов в диагностических наборах. А - 5-хлор-2-метил-4-изотиазолин -3-он, В - 2-метил-4-изотиазолин-3-он, С —тимеросал

содержащих ферментативную метку (пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза), в присутствии консервантов показали высокую стабильность при хранении и функциональную активность в ИФА в течение 2 лет при рН 6,87,4 (рис. 4) при температуре 4 °С. Поликлональные козьи антитела, направленные против ^А, ^М человека, конъюгированные с щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена, были стабилизированы протеиновым раствором. В качестве консерванта растворов конъюгатов с ферментативной меткой нами были использованы 0,01 % раствор метилизотиазолона или 0,01 % раствор бромнитродиоксана. При этом срок хранения компонентов набора составлял не менее 30 месяцев в виде раствора._

% активности

120

100

80

60

2 3 4

Буферные растворы

Рис. 4. Результаты определения активности конъюгатов в ИФА в различных буферных растворах, содержащих стабилизатор РгоС'Пп 300. 1 - Трис (рН 8,2); 2 - ФСБ-Т, рН 7,4, 3 -ФСБ, рН 7,4; 4 - контроль, концентрат ФСБ с аминокислотами и БСА

Разработка методов диагностики туберкулеза с использованием рекомбинантных белков М. tuberculosis. Выбор высокоспецифичных белков для серологической диагностики туберкулеза

Из всего многообразия антигенов М. tuberculosis, применяющихся в серологической диагностике туберкулеза, необходимо выбрать белки, удовлетворяющие следующим требованиям:

1. Высокой специфичностью при проведении лабораторного анализа;

2. Высокой чувствительностью при выявлении туберкулеза.

Данная работа была разделена на 2 этапа. На первом проводили создание генетических конструкций, каждая из которых, будучи введенной в клетки бактерий Е. coli, обеспечивала возможность клеткам продуцировать рекомбинантный видоспецифичный белок (рис. 5), содержащий в С-концевой части аминокислотную последовательность целевого белка М. tuberculosis — ESAT-6, CFP10 или МРТ64 (полный и не содержащий лидерного пептида белок). На втором этапе использовали эти белки в ИФА и IFN-y-анализе на образцах клинических изолятов, полученных от больных туберкулезом. Первые два белка уникальны тем, что гены, кодирующие эти белки, присутствуют в геноме патогенных микобактерий, вызывающих туберкулез у человека, и отсутствуют во всех вакцинных штаммах М. bovis BCG (Harboe М. et al., 1998; Sorensen A.L. et al., 1995). Третий, несмотря на высокую иммуногенность, как и у первых двух, кодируется геном, который отсутствует лишь в нескольких вакцинных штаммах (BehrM.A. et al., 1999). Предполагалось, что комбинация третьего с одним из первых или с обоими белками позволит дифференцировать больных туберкулезом от вакцинированных лиц.

Дизайн последовательности олигодезоксирибонуклеотидов для синтеза ампликонов, содержащих гены, кодирующие интересуемые белки, проводили по программе на сайте http: //www.basic.northwestern.edu/biotools/oIigocalc. html, используя НП генов, найденные на сайте http: //genolist.pasteur.fr/Tuber cuList. Белку ESAT-6 соответствует ген esxA, CFP10 - esxB и ДМРТ64 -mpt64. Синтез олигонуклеотидов, содержащих, кроме видоспецифичной НП, дополнительную — для сайтов эндонуклеаз рестрикции (ЭР) ВатШ (в прямом праймере) и EcoRl (в обратном праймере), был выполнен научным сотрудником Центра Ю.А. Горбуновым. В качестве матрицы для синтеза ампликонов с помощью ПЦР использовали геномную ДНК штамма М. tuberculosis H37Rv и Гад-полимеразу производства «Сибэнзим» (г. Новосибирск). Для амплификации интересуемых генов были использованы праймеры: для ESAT-6:

Fesat - 5/-GAGGATCCATGACAGAGCAGCAGTGG-3/, Resgt - S'-GCGAATTCTAAACACGAGAAAGGGCG-S'; для CFP10:

Fcfp - S'-GAGGATCCATGGCAGAGATGAAGACC-S', Ясф - S'-GCGAATTCTATTAGCGGGTCAGAAGC-S'; для ДМРТ64 и MPT64:

FAmpt64 - 5-CGGGATCCGCGCCCAAGACCTACTG-3/, Fmpt64-5-CGGGATCCGTGCGCATCAAGATCTT-3/, Rmpt64-5'-CGGAATTCGTCCTCGCGAGTCTAGG-3' - общий для двух ампликонов.

pTSEö рТВ232

PtU

рТВ323

Рис. 5. Кольцевые рестрикционные карты полученных рекомбинантных плазмид. pTSE6 обеспечивает синтез rESAT-6, рТВ232 - rCFPIO и рТВ323 - синтез ГДМРТ64 (гМРТ64 без лидерного пептида длиною 23 N-концевых а.о.). Толстой стрелкой на карте отмечено положение гена, кодирующего рекомбинантный белок. Карта плазмиды pTSM64 не приводится, так как рекомбинантный белок не был обнаружен в растворимой форме (для построения использована программа, размещенная на сайте http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)

Ампликоны (рис. 6) обрабатывали одновременно рестриктазами ВатШ и ЕсоШ и клонировали в составе вектора по ВатН\- и EcoRI-сайтам. Эффективность протекания лигазной реакции контролировали с помощью ПЦР. Обнаружение ампликона в геле агарозы размером, большим на 160 п.н., чем длина искомого клонируемого гена, являлось основанием для использования лигазной смеси для трансформации компетентных клеток Е. coli. Особенность этой реакции в том, что праймеры гибридизуются с нуклеотидной последовательностью векторной молекулы по разные стороны от нуклеотидной последовательности полилинкера (рис. 7). Поэтому образование ожидаемого ампликона в ПЦР возможно только после объединения нуклеотидной последовательности вектора и клонируемого ДНК-фрагмента. Поиск интересуемых клонов проводили непосредственно из колоний, внесением небольшого количества клеток в реакционную смесь (colony PCR), содержащую те же праймеры, что и для контроля лигазной реакции, - FpGEX и RpGEX. Такой подход облегчает скрининг большого числа клонов, минуя операцию выделения рекомбинантной ДНК, необходимую для обнаружения вставки с помощью ПЦР или рестрикционного анализа. С помощью электрофореза по Лэммли анализа

лизатов, полученных из этих культур, выбирали клон, обеспечивающий максимальный выход белка. Аналогичным способом отбирали клоны для продукции остальных белков. В качестве маркерных белков на начальном

1 -К 2

Рис. 6. Результаты электрофоретического разделения в 1,2 % агарозном геле амплификатов генов 1А - esxB, ЗА - esxA и 1Б - Ampt64, полученных с помощью ПЦР. 2А и 2Б - МФ (маркеры длины фрагментов ДНК в п.н.), Пр - не использованные в реакции праймеры

841 ccascaasta tatascatss cctttgcagg gctggcaagc cacgtttggt ggtggcgacc FpGEX Smal

901 atcctccaaa atcggatctg gttccgcgtG GATCCCCGGG AATTCatcgt gactgactga

В am HI EcoRJ

961 cgatctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccss

RcpGEX

1021 agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt

Рис. 7. Участок нуклеотидной последовательности векторной плазмиды pGEX-2T, прилегающий к полилинкеру (выделен прописными буквами). Курсивом с подчеркиванием выделены нуклеотидные последовательности праймера FpGEX и комплементарной последовательности обратного праймера, RcpGEX. Нумерация нуклеотидов соответствует нумерации в плазмиде pGEX-2T (U13850)

этапе для определения местоположения искомого белка использовали смесь двух стандартных белков — овальбумина (44 kDa) и химотрипсиногена А (24 kDa) (рис. 8). Далее в большинстве случаев ориентировались по расположению клеточных белков конкретного штамма Е. coli. Секвенированием по Сэнгеру определяли нуклеотидную последовательность клонированного гена на соответствие природной, используя в качестве матрицы плазмидную ДНК, выделенную из соответствующего клона. Все рекомбинантные плазмиды, выделенные из отобранных штаммов-продуцентов, содержали нуклеотидную последовательность клонированных генов, идентичных нуклеотидной последовательности этих генов из штамма М. tuberculosis H37Rv.

Уровень синтеза рекомбинантного белка существенно зависел от времени и температуры культивирования индуцированной культуры (см.

рис. 8Б). Рекомбинантные белки гСБРЮ и гДМРТ64 синтезировали в Е. соИ в условиях, незначительно отличающихся от условий для гЕБАТ-б. Отличие было во времени культивирования, увеличенное до проведения индукции

МБ вьл ВЫ1/рПЗЕб

BL21/pGEX-2T BL21-1 BL21/pTSE6

TT1 3 4 5 6 1 8 9 ю'

rESAT-6 (9)

^ 32 кДа GSX (3 - 6)

26 кДа

Рис. 8. А. Положение rESAT-6 в геле: Овальбум - овальбумин, Химотрип -химотрипсиноген А. Б. Оптимизация продукции белка rESAT-6 в штамме Е. coli BL21 (исследуемые параметры - время и температура культивирования индуцированной культуры). На дорожках 12% ПАА-геля (денатурирующие условия) слева направо показаны белки лизатов: 1,2 - исходного штамма BL21 (бесплазмидный вариант); 3-6 - он же, содержащий векторную плазмиду pGEX-2T; 7-10 - он же, содержащий рекомбинантную плазмиду pTSE6. Лизаты, полученные из клеток, индуцированной ИПТГ культуры, после их культивирования в течение различного времени и при разных температурах. BL21: 1 - 3 ч; 2 - 6 ч без индукции; BL21/pGEX-2T: 3 - 3 ч, 28 °С; 4 - 6 ч, 28 °С; 5 - 3 ч, 37 °С; 6 - 6 ч, 37 °С; ВЬ21/клон № 1: 7 - 3 ч, 28 °С; 8 - 6 ч, 28 °С; 9 - 3 ч, 37 °С; 10 — 6 ч, 37 °С. Подобранные оптимальные условия для культивирования -подчеркнуты

(для достижения средней логарифмической фазы роста требовалось ~ 2,53 ч) и после - до 5-6 ч. В ходе электрофоретического анализа лизатов штаммов, несущих плазмиды рТВ232 (rCFPlO) и рТВ323 (гДМРТ64), не было замечено видимой деградации рекомбинантных белков. Последние нарабатывались с высоким выходом: положение их на электрофореграммах

соответствовало расчетным значениям м.м. (см. рис. 9А и 10А). Перенесение этих белков из геля на фильтр и проведение иммуноблотинга с МКА 2НЗ-19 к GST выявило дополнительно несколько минорных полос, которые (рис. 9Б и 10Б) соответствовали белкам с м.м. большей, чем м.м. GST, но меньшей, чем м.м. рекомбинантного белка. По-видимому, ограниченной протеолитической деградации, хотя и в незначительной степени, подвергается только С-концевая часть рекомбинантных белков rCFPIO и гДМРТ64, и только rESAT-6 деградирует значительно сильнее (рис. 9Б).

По результатам электрофоретического анализа молекулярные массы исходного и целевых рекомбинантных белков (GST и rESAT-6, rCFPIO, гДМРТ64) соответствовали расчетным значениям — 26, 32, 40 и 48,8 kDa. Уровень их синтеза в клетках штамма Е. coli BL21, за исключением rESAT-6, составил около 20 % суммарного клеточного белка, что позволило получать до 2,5 мг рекомбинантного антигена с 1 л культуральной среды. Уровень продукции rESAT-6 составил 2-А % суммарного клеточного белка. Что касается рекомбинантного белка гМРТ64, то он не был обнаружен в достаточном количестве в цитоплазматической фракции, т.е. в растворимом состоянии. По этой причине его не использовали в исследованиях и место локализации также не устанавливалось. Можно предположить, что из-за наличия в нем лидерного пептида полноразмерный МРТ64 накапливался преимущественно в мембранной фракции. Если бы в конечном препарате каждого рекомбинантного белка присутствовали только продукты его ограниченного протеолиза, то на электрофореграмме они располагались бы в виде дискретных полос так же, как и на одном из блотов (см. рис. 9 Б и 10 Б),

12 3 4

2 3 4 40 кДа

i-CFPlO (3)

rESAT-6 (4)

GST (2) 26 кДа

rESAT-6 (4)

rCFPIO (3) 40 кДа

Рис. 9. Детекция рекомбинантных продуктов экспрессии клонированных генов esxA (белок rESAT-6) и esxB (белок rCFPIO) М. tuberculosis в штамме Е. coli, BL21. А - электрофорез в 12% ДСН-ПААГ клеточных лизатов штамма: 1 - BL21, 2 -BL21/pGEX-2T (GST), 3 -BL21/pTB232 (rCFPIO), 4 - BL21/pTSE6 (rESAT-6). Б - иммуноблотинг лизатов соответствующих штаммов с моноклональными антителами к белку-носителю GST: 1 - BL21, 2 - BL21/pGEX-2T (GST), 3 - BL21/pTB232 (rCFPIO), 4 -BL21/pTSE6 (rESAT-6)

чего нами не наблюдалось. Электрофорез в SDS-полиакриламидном-геле гибридных белков, показал, что молекулярная масса неочищенных белков составила для ESAT-6 - 32 kDa и CFP10 - 40 kDa, т.е. отличалась от нативных белков наличием GST (рис. 13). Согласно денситометрии, чистота

Рис. 10. Детекция рекомбинантных продуктов экспрессии клонированных генов esxB (белок rCFPIO) и укороченного mpl64 (белок гДМРТ64) М. tuberculosis в штамме Е. coli BL21. А - электрофорез в 12 % ДСН-ПААГ клеточных лизатов штамма: 1 - BL21, 2 -BL21/pGEX-2T (GST), 3 - BL21/pTB232 (rCFPIO), 4 - BL21/pTB323 (гДМРТ64). Б -иммуноблотинг лизатов соответствующих штаммов с моноклональными антителами к белку-носителю GST: 1 - BL21, 2 - BL21/pGEX-2T (GST), 3 - BL21/pTB232 (rCFPIO), 4 -BL21/pTB323 (гДМРТ64)

антигенного препарата не менее 95-98 % после одностадийной аффинной хроматографии. После первой элюции с колонки смывается не менее 66 % адсорбированного белка, после второй - 27 %, третьей — 7 % (рис. 11 и 12)

1 2 3 4 5

rESAT-6 щ rESAT-6

1У . GST ü»«

Рис. 11. Дробная элюция рекомбинантного белка гЕБАТ-б с глутатионсефарозы. Электрофореграмма ПААГ, показывающая этапы выделения белка: 1-осветленный соникат ВЬ21/рТ8Е6 до нанесения на сорбент глутатионсефарозы, рекомбинантный белок после п-й элюции с 1-й (2), 2-й (3), 3-й (4), и 4-й (5) колонки.

На рис. 14 и 15 представлена электрофореграмма гибридных, слитных с С-концевой последовательностью GST-белков, полученных в работе. На рис. 16 представлена технологическая схема получения, выделения и очистки такого типа белков. В качестве микобактериальных антигенов для исследований были использованы туберкулин (PPD), культуральные фильтраты (CF) М. tuberculosis H37Rv были выделены из месячных культур

12 3 4 5 6 7 8

rCFPIO

Рис. 12. Дробная элюция 2-х партий (1-я, дорожки 1-4, и 2-я, дорожки 5-8) рекомбинантного белка гСРРЮ с глутатионсефарозы. Электрофореграмма ПААГ, показывающая этапы выделения белка: рекомбинантный белок после п-й элюции с одной колонки: дорожки 1,5- после 1-й, 2, 6 - 2-й, 3, 7 - 3-й, 4, 8 - 4-й.

1.BL21

2.BL21/pGEX-2T

3 BL21ipGEX-CFP10

4.BL2WpGEX-ESAT6

5.BL21/pGEX-mpt64

Рис. 13. Электрофореграмма лизатов клеток штамма Е. coli BL21 (исходного и несущего плазмиды), продуцирующих нативную глутатион-S-трансферазу и рекомбинантные белки, после эл.фореза в 12 % ДСН-ПААГ: 1 - исходный штамм-реципиент; продукция белков: 2 - GST; 3 - rCFPIO; 4 — rESAT-6; 5-ГДМРТ64

Рис. 14. Детекция продуктов экспрессии клонированных генов esxB и mpt64 М. tuberculosis в Е. coli BL21. А - электрофорез по Лэммли клеточных лизатов: 1 - лизат Е. coli BL21, 2 - лизат Е. coli!pGEX-2Т, 3 - лизат Е. co/¡/pGEX-2T/CFP10, 4 - лизат Е. coli/ pGEX-2T/AMPT64. Б - иммуноблот лизатов с МКА к белку носителю GST: 1 - лизат Е. coli BL21, 2 - лизат Е. coli!pGEX-2T, 3 - лизат Е. co/¡/pGEX-2T/CFP10, 4 -лизат Е. coli! pGEX-2T/ÄMPT64. С-электрофореграмма аффинно очищенного гибридного белка GST-AMPT64: 1 - лизат Е. coli BL21; 2 - лизат Е. co///pGEX-2T; 3 - лизат Е. coft/pGEX2T/AMPT64; 4 - аффинно очищенный белок GST/AMPT64 - 1-я элюция; 5 - аффинно-очищенный белок GST/AMPT64 -2-я элюция; 6 — белок GST/AMPT64 - 3-я элюция.

1-1

rCFPIO

Рис. 15. Электрофореграмма аффинно очищенного рекомбинантного белка гДМРТ64. 1 — лизат ВЬ21/рТВ323 (гДМРТ64); аффинно очищенный белок гДМРТ64: 2 - 1-я элюция; 3 - 2-я элюция; 4 - 3-я элюция. Согласно денситометрии, чистота препарата не менее 95-98 % после одностадийной аффинной хроматографии. После первой элюции с колонки смывается не менее 66 % адсорбированного белка, после второй — 27 %, третьей - 7 %.

НК Е. cali BL21/pGST-P (1 : 100)

1 i

среды LB (YT) I Ар

| Дезинтегратор|

Ферментёр (п*160 мл)

1 I -

культивирование до ОПеоо 0,3-0,8 37°С 200 об<мин 1,5-3 м

0T60D пробы N

р-р ИПТГ -

культивирование ИК 37°С 200 об/мин 3-6 ч

т

охлаждение до 0-4 °С

~5Г

НЖ (слив)

<Г--

| Центрифуга 1 |

цемтрифугирование 40003 15 мин 4 °С

7 i осадок клеток

Встряхиватель (в о рте кс)

Гпромывание| |Центрифуга 2 |

центрифугирование 4000д 5 мин 4 °С

f PMSF 10

обработка ультразвуком 3 х 30 с_.

соникат

инкубирование 30 мин О °С

зш

\ Центрифуга 2 |

центрифугирование 16ОООд 5 мин ОТ

. р-рТХ-100 (ДО 1 %)

дебрис —Г.-*

! нж

ЁМКОСТ

(бюкс) i"

0.2 мл суспензия ГС

[перемешивание 30 мин[

16 i | Колонка!^

-Б2 -Б1

|промывание|

4

[злюцйя]^-

р-рГ

19

рекомбинантныи белок

п - количество колб на 0,7-1.0 л Т Х-100 — тритон Х-100

НК- ночная культура ГС - глутатионсефароза

ИК-индуцированная культура Б-буфер

НЖ-надосадочная жидкость Г - глутатион

Рис. 16. Принципиальная технологическая схема получения и очистки рекомбинантного белка GST-P

микобактерий, выращенных на средах Сотона и Мидцлбрука. Из наработанной суспензии клеток микобактерий М. tuberculosis H37Rv или ее биомассы, суспендированной в буфере, при озвучивании получали ультразвуковые дезинтеграты (УЗД) белковых антигенов. После осветления не разрушенной ультразвуком клеточной массы с помощью ультрацентрифугирования получали соникаты. Цельноклеточные суспензии вакцинного штамма BCG и УЗД BCG в концентрации 8 мкг/мл были

использованы для сенсибилизации на иммунологических планшетах. В качестве вторых антител в нашей работе использованы видоспецифические моноклональные конъюгаты против IgG, IgM и IgA человека, меченные пероксидазой хрена.

Испытание рекомбинантных видосиецифичных белков М. tuberculosis в ИФА, IFN-y-анализе на клинических образцах

В данном блоке работы необходимо было оценить возможности использования гибридных белков ESAT-6 и CFP10 М. tuberculosis в серологической диагностике туберкулеза. Исследование включало в себя использование рекомбинантных белков в иммунодиагностике туберкулеза на образцах крови, полученных от больных туберкулезом. Была проведена оценка рекомбинантных белков rESAT-б и rCFPlO в ИФА на панели из 34 сывороток, собранных от пациентов, больных туберкулезом. Контрольная группа включала сыворотки 470 пациентов, не болеющих туберкулезом и не имевших туберкулез в анамнезе. Рекомбинантный белок ГДМРТ64 проверяли на выборке из 147 сывороток.

Забор крови проводили у больных туберкулезом пациентов (114 образцов) и здоровых доноров (149 образцов). Для определения чувствительности и специфичности рекомбинантных белков rESAT-б и rCFPlO с помощью IFN-y-анализа при выявлении туберкулеза легких были получены образцы крови от 67 пациентов с установленной формой заболевания.

Для испытания рекомбинантных белков в IFN-y-анализе от пациентов с подозрением на туберкулез были получены: 20 образцов цельной крови (табл. 11) и 18 образцов цельной крови (для выделения мононуклеарных клеток) (табл. 12) и 18 проб цельной крови от здоровых доноров. 38 изолятов мокрот, соответствующих образцам крови от пациентов с подозрением на туберкулез легких, были получены для подтверждения туберкулеза с помощью ПЦР. Возраст обследуемых первой выборки составлял 24-45 лет. Все сыворотки предварительно были проанализированы с помощью референс-тест-систем «Анти-Туб-lgG» (СПб) и «АТ-Туб-БЕСТ-стрип»

□ Esat-6 ■ Cfp-10

□ Esat-6+Cfp-10 □H37Rv ■BCGсон

1 2 3

Рис. 17. Результаты выявления 1§С-антител к антигенам микобактерий среди различных групп. 1 - здоровые доноры, 2 - пациенты с активным туберкулезом. 1 подозрением на туберкулез

Рис. 18. Частота (%) выявления антител класса IgG к GST и к рекомбинантному белку

М. tuberculosis GST-ESAT-6 в различных исследуемых группах: I -здоровые доноры, 2 - больные туберкулезом легких

1 2 3GST-ESAT-6 GST

(г. Новосибирск). Исследование наличия антител к GST в сыворотке здоровых доноров и больных туберкулезом проводили двумя методами. В первом варианте GST сорбировали непосредственно на поверхности лунок. Во втором - на поверхность лунки сначала наносили МКА к GST. Очищенные антигены проверяли с помощью ИФА и IFN-y-анализа. Иммуноферментным анализом в крови больных туберкулезом выявляли иммуноглобулины, а с помощью IFN-y-анализа определяли концентрацию IFN-y, который секретируется Т-лимфоцитами в результате стимуляции их рекомбинантными белками.

Выявление антител к гибридным белкам в изучаемых сыворотках на подложке из гибридных белков rESAT-6 и rCFPIO проводили с помощью ИФА (рис. 17-18)

С использованием антигенов rESAT-6 и rCFPIO выявляли содержание антител классов IgM, IgG IgA. При этом наиболее высокое содержание антител - 70 % - наблюдалось при определении антител IgG уровень антител IgA составил 31,4 %, а антител IgM - 11,8 %. Однако диагностическая значимость и эффективность анализа повышается при одновременном выявлении антител разных классов (IgM, IgG IgA). Наличие антител IgG к М. tuberculosis в сыворотках было установлено в референс-тест-системе. 2 сыворотки из 60 образцов были отрицательны: ОП 0,167 и ОП 0,192 при ОП крит. 0,280. Таким образом, чувствительность анализа с использованием испытуемых белков гДМРТ64 по отношению к референс-тест-системе составила 76,7 %.

В современных условиях, характеризующихся увеличением частоты остропрогрессирующих и полирезистентных к химиотерапии форм туберкулеза легких, сохраняет актуальность изучение состояния иммунного ответа организма на туберкулезную инфекцию (Владимирский М.А., 1993; Салина Т.Ю., 2000; Стаханов В.А., 2001). Лабораторные критерии оценки состояния специфического процесса позволяют оценить не только степень активности туберкулеза легких на данный момент времени, но и, определяя уровень антител в динамике, дают возможность оценить эффективность лечебной терапии, что, в частности, имеет большое значение при решении вопроса о выборе срока оперативного вмешательства. Из обследованных 66 больных туберкулезом легких, кроме больных туберкулезом легких, уровни

антител к микобактериальным антигенам М. tuberculosis определялись у 11 здоровых лиц (доноров). Содержание антител к антигенам вакцины БЦЖ и штамма H37Rv в сыворотке крови определяли твердофазным иммуноферментным методом. В качестве антигена использовали ультразвуковой дезинтеграт (соникат) клеток вакцины БЦЖ и штамма H37R.V, а также очищенную из сониката белковую фракцию с применением методов ионообменной хроматографии. Белковые фракции анализировали с помощью электрофореза в 10 % ПААГ. Молекулярная масса использованных в работе белков Е-БЦЖ, E-H37R.V находилась в диапазоне 40-70 kDa. В зависимости от степени выраженности туберкулезного процесса пациенты были разделены на группы по активности заболевания. 1 группа - с низкой степенью - 20 (30,3 %) человек, 2 группа - с умеренной - 27 (40,9 %) и 3 группа - с высокой степенью активности заболевания - 19 (28,8 %).

Полученные значения содержания антител были разделены на низкие и высокие. По морфологическим признакам, которым была дана балльная оценка, определены 3 степени активности специфического воспаления: I -низкая, II - умеренная, III - высокая. Больные с низкой степенью активности имели средний бал 3,60 ±0,35 (1-6), с умеренной - 9,70 ±0,35 (7-12) и с высокой степенью активности процесса имели средний показатель - 15,64 ± 0,36 (14—20). Показатели уровней антител сопоставлены с данными патоморфологического исследования операционного материала, выполненного у 24 прооперированных больных. Гистологическим признакам, отражающим степень активности специфического процесса в легких (казеозный некроз, инфильтрация легочной ткани, полостные изменения, очаговые образования, фиброзно-склеротические процессы), также была дана балльная оценка согласно значимости того или иного признака. Низкая степень активности - 12,8 ± 0,1 балла (12-14), умеренная -16,0 ±0,2 балла (15-17), высокая степень активности - 20,2 ±0,3 балла (1824). Это позволило судить об объективности предложенных балльных критериев клинических и рентгенологических лабораторных признаков заболевания. Установлена зависимость между характером морфологических изменений в легких и уровнями AT к АГ МБТ. У лиц с I и II степенями активности процесса высокие уровни AT встречались у 25 %, а при III степени активности у 75 % больных уровни AT к соникату и протеину были высокими. Низкие значения уровней AT имели прямую корреляционную связь с I и II степенями морфологической активности заболевания, что отражало адекватный гуморальный иммунный ответ на патологический процесс. При высокой степени активности туберкулезного воспаления низкие уровни AT, встречающиеся в 25 % случаев, свидетельствовали о более глубоких нарушениях в иммунной системе, что, возможно, явилось следствием значительного экссудативно-некротического поражения легочной ткани. Таким образом, показатели гуморального иммунного ответа на соникат H37R.V и особенно на его протеин могут быть использованы в качестве дополнительного объективного критерия, отражающего степень активности туберкулезного процесса в легких.

Содержание антител к антигенам вакцины БЦЖ и штамма H37Rv у больных с различными формами туберкулеза легких в сравнении со здоровыми лицами представлены в табл. 7. Как видно из табл. 7, общая тенденция характеризуется тем, что у больных инфильтративной и фиброзно-кавернозной формами туберкулеза легких антитела класса G были достоверно выше по сравнению с таковыми у здоровых лиц ко всем изучаемым антигенам. Уровни антител класса М при инфильтративном туберкулезе также были достоверно более высокими по сравнению с аналогичными показателями здоровых лиц. Что же касается больных фиброзно-кавернозным туберкулезом легких, то только при сравнении уровней антител класса М к C-H37Rv были получены достоверные различия с донорами. Кроме того, у больных 1-й группы по сравнению со 2-й уровни антител класса G к БЦЖ и E-H37Rv были достоверно ниже. Таким образом, анализ полученных показателей гуморального иммунного ответа на различные антигены микобактерий позволил прийти к заключению о том, что отличительной особенностью больных инфильтративным туберкулезом легких и фиброзно-кавернозным туберкулезом легких являются достоверно высокие уровни антител класса G по сравнению с донорами. У больных инфильтративным туберкулезом легких содержание антител классам были достоверно высокими, тогда как при фиброзно-кавернозном туберкулезе достоверно высокие уровни антител класса М (по сравнению с донорами) отмечались к одному антигену.

Результаты сравнительного выявления антител к антигенам М. tuberculosis у больных туберкулезом легких с различной степенью активности процесса и у здоровых лиц показали, что по мере возрастания степени активности туберкулеза легких, а значит, и тяжести заболевания различия становятся достоверными. Достоверные различия показателей гуморального иммунного ответа выявляли между больными с низкой и высокой степенью активности — по уровню антител класса G, а по уровню антител класса М только - Е-БЦЖ и C-H37Rv, причем в последнем случае были выявлены достоверные различия при сравнении показателей больных с умеренной и высокой степенью активности.

Достоверные различия коэффициента корреляции отмечались между активностью процесса (выраженной в баллах) и уровнями антител класса G у больных туберкулезом легких независимо от формы процесса к Е-БЦЖ (>=0,367, р=0,002), к С-БЦЖ (г=0,430, р=0,003), к E-H37RV (г=0,427, р=0,003), к C-H37Rv (>-=0,415, р=0,005), и только при фиброзно-кавернозном туберкулезе легких отмечалась достоверная корреляция между уровнями, антител класса М к E-H37Rv (г=0,446, ¿>=0,043) и C-H37RV (/-=0,535, />=0,013) и степенью активности процесса.

Сравнительный анализ гуморального иммунного ответа больных на использованные антигены с результатами патолого-гистологического

Таблица 7

Уровни антител к антигенам вакцины БЦЖ и штамма Н37Ыу у больных с различными формами туберкулеза легких и у здоровых лиц (М±т)

Группа обследованных Активность процесса, баллы Число обследованных Уровни антител

Класс О Класс М

Антигены

Е-БЦЖ С-БЦЖ Е-Н37ЯУ с- Н37ЕУ Е-БЦЖ С-БЦЖ Е-1137Я\' С- Н37Яу

1 - больные инфильтративным туберкулезом легких 9,08±0,67 35 2,48±0,14 Р]-3 =0,001 2,46±0,13 Рю =0,001 Р.-2=0,03 3,95±0/19 Р.-з =0,038 Рь 2=0,013 3,69±0,19 Рьз =0,001 1,44±0.15 Рьз =0,011 2,14±0,19 Р|.з=0,01 1,73±0,15 Р.-з =0,033 1,72±0,15 Р|-3 =0,007

2 - больные фиброзно-кавернозным туберкулезом легких 13,32±0,75 21 2,81 ±0,19 Р2- з=0,001 2,97±0,25 Р 2-3=0,001 4,82±0,33 Р2- з=0,001 3,96±0,26 Р2-3=0,001 1,40±0,21 1,98±0,32 1,55±0,24 1,84±0,2б Рг-з=0,034

3 - здоровые лица - 11 1,78±0,09 1,81±0,12 3,16±0,3б 2,58±0,24 1,04±0,03 1,60±0,08 1,37±0,08 1,27±0,07

Где: Е-Ш711у и Е-БЦЖ представляют собой очищенные фракции белков с применением методов ионообменной хроматографии; С-БЦЖ и С-113711V — ультразвуковой дезинтеграт (соникат) клеток вакцины БЦЖ и штамма Н37Ку. Различия между группами считали достоверными при уровне значимости р < 0,05

исследования выявил достоверные коэффициенты корреляции между уровнями антител класса G к С-БЦЖ (>=0,476, р<0,04), E-H37Rv (г=0,495, р<0,03) и уровнями антител класса М к С-БЦЖ (^0,448, р<0,04).

Кроме того, была обнаружена высокая корреляционная связь между морфологическими признаками и ведущими клиническими признаками патологического процесса, выраженного в баллах (г=0,788, р<0,001).

Таким образом, достоверная корреляция как между показателями содержания антител и клинико-рентгенологическими признаками заболевания, так и между уровнями антител и патолого-гистологической картиной заболевания позволили конкретизировать диагностическую значимость антител того или иного класса к определенным антигенам М. tuberculosis. Недостаточная эффективность гибридных белков при серологических исследованиях, связанная с перекрестной реактивностью, легла в основу разработки новых схем использования этих белков в функциональном анализе.

Технология IFN-y- анализа в диагностике туберкулеза легких. Рекомбинантные белки в IFN^y-анализе

Прогностическим цитокиновым маркером среди нескольких десятков цитокинов явился гамма-интерферон, продуцируемый клетками при стимуляции их антигенами М. tuberculosis. Примечателен он тем, что, используя синтетические пептиды или рекомбинантные белки, произведенные в бактериальной системе Е. coli, позволяет диагностировать не только больных туберкулезом, но и тех, у которых это заболевание клинически не проявляется, или иначе находящихся на латентной стадии развития туберкулезного процесса, т.е. формировать группы риска. Быстрый путь раннего выявления инфекции с использованием рекомбинантных белков является альтернативным кожному тесту (Mustafa A.S. et al., 2000, Lalvani A., Pathan A.A. et al., 2001; Mori Т. et al., 2004, Brock I. et al., 2004). В табл. 8 и 9 представлены результаты сравнительного изучения специфичности и чувствительности IFN-y-теста, проводимого при стимуляции цельной клеточной культуры крови рекомбинантным белком rESAT-6 и PPD-туберкулином. Как видно из таблиц специфичность рекомбинантного белка rESAT-6 в IFN-y-ИФА при туберкулезе оказывается выше, чем при использовании PPD (туберкулина).

Функциональный анализ проводили с использованием образцов гепаринизированной крови, полученных от больных туберкулезом. Диагноз туберкулез был подтвержден клинико-рентгенологическими и лабораторными исследованиями. Определение пригодности рекомбинантных белков в диагностике туберкулеза проводили с помощью IFN-y-анализа на двух выборках: первая включала 20 образцов цельной гепаринизированной крови (пациенты под №1-20) (табл. 10), вторая - 18 образцов крови, из которых выделяли МКПК (пациенты под №21-38) (табл. 11). Первичный материал по обеим выборкам получали от больных с подозрением на туберкулез до верификации диагноза. В качестве контрольных образцов

Таблица 8

Сравнение чувствительности и специфичности 1ИЧ-у-анализа с использованием в качестве индукторов РРБ и гЕБАТ-б при

использовании образцов крови ТБ-пациентов и здоровых доноров

Количество пг/мл Антиген Количество пациентов с положительным результатом Чувствитель ность, % * (С1)**** Специфич ность, % ** (С1)****

Больные туберкулезом Здоровые ***

300-1000 РГО 5/6 7/7 83 41,7 (46,249,5) 0(53,8-94,4)

гЕБАТ-б 4/6 4/14 73 (21,1-70,0) 71 (55,182,7)

1000-3000 гЕБАТ-б 9/10 3/21 90 (79,697,6) 85,7 (79,499,7)

РРО 7/9 13/14 78,7 (57,791,4) 7

>3000 гЕвАТ-б 17/21 2/19 80,9 89,5

* — Позитивный ответ среди ТБ-инфицированных * * — Негативный ответ среди неинфицированных пациентов *** -ВСв-вакцинированные и невакцинированные пациенты С1**** - Границы 95 % доверительного интервала (нижняя и верхняя)

Таблица 9

Сравнение чувствительности и специфичности ШЧ-у-теста с применением в качестве индукторов РРБ и гСГРЮ при

использовании образцов крови ТБ-пациентов и здоровых доноров

Количество 1Ш-у, пг/мл Антиген Количество пациентов с положительным результатом Чувствитель ность, % * (С1)**** Специфич ность, % *♦ (С1)****

Больные туберкулезом Здоровые ***

300-1000 РРО 10/11 14/14 91 (79,697,6) 41,7(46,2-49,5) 0 (53,894,4)

гСРРЮ 12/13 4/21 92,3 (85,599,5) 81,0 (77,299,7)

> 1000 РРЭ 14/17 13/14 82(61,9-93,7) 85,7 (67,396,0)

гСБРЮ 18/21 4/25 87,5 (65,791,1) 84 (72,796,0)

* - Позитивный ответ среди ТБ-инфицированных ** — Негативный ответ среди неинфицированНых пациентов *** - ВСв-вакцинированные и невакцинированные пациенты С1**** - Границы 95 % доверительного интервала (нижняя и верхняя)

белков использовали PPD и митогены конканавалин А (СопА) и фитогемагглютинин (РНА). Значение «cut-off» - пограничное значение концентрации IFN-y, разделяющее здоровых доноров и лиц, попадающих в группы риска и с диагнозом туберкулез, — > 300 пг/мл (или > 1,2-1,7 МЕ/мл), согласно литературным данным, считали положительными. Для другой группы пациентов с туберкулезной инфекцией результаты продукции IFN-y выражали в МЕ/мл с применением калибровочного графика. Аналитическая чувствительность теста составила 1,2-1,7 МЕ/мл IFN-y для отрицательного (нулевого) контрольного образца из плазмы крови исследуемых. Для проверки полученных нами рекомбинантных антигенов М. tuberculosis проводили исследование панели сывороток от лиц до верификации диагноза с помощью IFN-y-ИФА. В 20 образцах из этой панели уровень индуцированного IFN-y выявляли с помощью реагентов BD Biosciences (пациенты под № 1-20), в 18 — с помощью набора реагентов «IFN-y-ИФА-БЕСТ» (пациенты под №21-38). Используя калибровочный график зависимости концентрации IFN-y (в пг/мл и МЕ/мл) от значения оптической плотности, концентрацию IFN-y определяли в каждой лунке.

В табл. 10 для демонстрации пригодности выделенных рекомбинантных белков (каждого в отдельности) для диагностики туберкулеза представлены результаты, полученные на образцах цельной крови от исследуемых лиц, в табл. 11 - результаты, полученные на образцах мононуклеарных клеток, выделенных предварительно из образцов цельной крови с помощью системы Histopaque 1119. Секреция IFN-y (МЕ/мл) при стимуляции секреторными белками достоверно выше у больных туберкулезом (18,21 ± 9,39 МЕ/мл), чем в контроле (0,95 ± 0,7 МЕ/мл) (Р < 0,001) или в контрольной группе 1,201,47 МЕ/мл IFN-y. IFN-y-ответ к PPD сравнивали с IFN-y-ответом к индивидуальным антигенам М. tuberculosis (rESAT-6, rCFPIO и rAMPT64). Детектируемый уровень IFN-y определялся производителем тест-системы и составил >20 пг/мл или 1,2 МЕ/мл. На основе анализа, представленного в табл. 10, можно сделать вывод, что у пациентов под № 9-11 при испытании всех трех рекомбинантных белков результаты были отрицательные. Пациенты под № 6 и 15 по уровню IFN-y располагаются практически на пограничной линии — на верхней границе при использовании rESAT-б и нижней - при использовании rCFPIO. Результат с такими значениями IFN-y требует повторения анализа и в случае совпадения с предыдущим результатом его следует оценивать как положительный. Пациента под № 8 так же следует присоединить к группе пациентов с сомнительным результатом (№ 6 и 15), хотя уровень IFN-y соответствует пограничному значению, полученному только при использовании rCFPIO (по результату, полученному с помощью белка rESAT-б, пациента под № 8 следовало бы отнести к лицам с неподтвержденным диагнозом туберкулез). Этот пример показывает, что далеко не всегда достаточно проведения анализа по одному белку. Для полного анализа табличных данных также интересен результат, полученный для пациента под № 14: по белку rESAT-б — пациент с подтвержденным диагнозом туберкулез, тогда как по белку rCFPIO — диагноз

Таблица 10

Результаты ГРК-у-анализа при туберкулезе легких при стимуляции гибридными белками

Па-ци-ен-ты IFN-y (МЕ/мл)

PPD rESAT-6 rCFPlO гДМРТ-64 Митоген % ответа на стимуляцию антигеном

СопА РИА PPD rESAT-6 rCFPlO

1 54,3 2,34 3,21 4,23 56,7 63,5 85,5 3,68 5,05

2 27,0 3,1 2,3 4,1 32,1 47,6 56,72 6,51 4,83

3 59,2 5,7 4,3 3,1 148,4 123,0 48,13 4,63 3,49

4 73,0 3,2 2,7 1,3 129,2 117,0 62,39 2,73 2,3

5 24,8 2,7 2,2 1,9 49,7 43,2 57,4 7,4 5,09

6 11,7 1,73 1,34 0,98 19,7 23,1 50,65 7,49 5,8

7 4,7 0,87 2,1 1Д2 139,7 126,8 3,7 0,68 1,66

8 2,9 0,81 1,7 1,2 24,6 21,3 13,61 3,8 7,98

9 5,3 0,73 0,56 0,57 44,7 53,1 9,98 1,37 1,05

10 27,6 0,83 0,46 0,23 163,1 143,9 19,18 0,58 0,32

11 57,2 0,23 0,1 0,12 68,7 65,3 87,59 0,35 0,15

12 10,9 6,4 5,6 3,7 56,9 72,1 15,12 8,88 7,77

13 62,3 7,2 6,25 6,1 67,2 57,4 108,54 12,54 10,89

14 1,7 2,1 1,4 0,3 23,8 19,7 8,63 10,66 7,1

15 33,4 1,7 1,2 0,78 36,0 34,5 96,81 4,93 3,48

16 7,2 13,2 10,7 9,75 77,8 67,3 10,7 19,61 15,9

17 98,7 12,4 11,7 8,9 72,2 78,1 126,38 15,88 14,98

18 74,6 19,3 12,8 11,7 23,5 32,3 230,96 59,75 39,63

19 43,1 132,2 132,8 111,2 184,? 179,3 24,04 73,73 74,06

20 67,3 147,5 132,0 103,4 154,7 165,7 40,61 89,02 79,66

сомнительный. Таким образом, полученные результаты по какому-то одному выбранному из двух определяющих белков (rESAT-6 и rCFPlO) могут оказаться неоднозначными.

Из табл. 11 видно, что у пациентов под № 23, 33 и 35 при испытании всех трех рекомбинантных белков диагноз туберкулез не подтверждается, несмотря на положительный результат, полученный с помощью классического культурального метода. Однако если исходить из значений IFN-y при стимуляции PPD, то этих пациентов, за исключением № 35, следовало бы отнести к больным туберкулезом. Повышенное содержание IFN-y в анализируемой пробе при использовании PPD можно объяснить тем, что выделение IFN-y стимулируется не только видоспецифичными к туберкулезу белками, присутствующими в составе PPD и среди которых имеются, кстати, нативные ESAT-6 и CFP10, но — и за счет неспецифичных, дающих перекрестные иммунологические реакции и имеющих отношение к белкам других видов микобактерий. Индивидуальный IFN-y-ответ к PPD сравнивали с IFN-y-ответом к другим антигенам М. tuberculosis (rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64). Крайне низкий уровень IFN-y при использовании в качестве индуктора PPD у пациента под № 35, который сравним с

Таблица 11

Результаты 1ПЧ-у-анализа при использовании мононуклеарных клеток периферической крови при стимуляции их рекомбинантными белками гЕвАТ-б, гСГРЮ, гДМРТ64

Пациенты IFN-y (пг/мл)

PPD rESAT-6 rCFPlO ГДМРТ64 Митоген rESAT-б/ rCFPlO

СопА РНА

21 4100 1750 845 736 6700 4782 2830

22 3650 2360 1985 1740 7324 5421 2740

23 2850 110 55 43 4530 3218 198

24 4870 4475 3200 2760 7300 6710 4640

25 5110 1320 2755 2300 9650 8971 3200

26 6200 27 2849 1430 7861 8764 3100

27 17320 4210 5780 3210 12344 14230 5890

28 3980 760 67 43 4851 4352 1240

29 5830 3240 4210 2750 19870 21340 5460

30 10350 3420 7400 6325 18300 17235 6840

31 21200 2290 415 328 16540 14530 2870

32 5730 1318 2065 2650 12347 13247 2655

33 670 64 57 32 23450 32410 112

34 15340 5640 3875 5130 17650 18930 5930

35 23 17 19 14 640 985 21

36 7458 64 2190 330 23410 28750 3310

37 10480 3340 6240 4320 19340 18745 7380

38 6130 1680 1745 1330 34500 29560 2130

M(s) 7722 (5539) п=17 2754 (1445) п=13 3254 (2047) п=14 2524 (1780) п=14 4014 (1859) п=15

M+m 7722+13 43 п=17 2754+401 п=13 3254+54 7 п=14 2524±476 п=14 — — 4014±480 п=15

M(s) к - 56(37) 50(21) 33(14) п=4 — — 110(89)

М±тк - 56±16 п=5 50±11 п=4 33+7 п=4 — — 110+51 п=3

здоровые доноры, (п=18) <300 <300 <300 <300

Концентрацию №N-7 > 300 пг/мл считали положительными, результаты подсчитывали из среднего значения концентрации ШЫ-у в трех лунках (р < 0, 01) и выражали в пг/мл, используя калибровочный график.

концентрацией IFN-y, полученной в результате стимуляции смесью рекомбинантных белков rESAT-б и rCFPlO, может свидетельствовать не только об отсутствии туберкулезного процесса, более того, — об отсутствии инфицированное™ организма пациента микобактерией вида М. tuberculosis. Стимуляция мононуклеарных клеток PPD свидетельствует о весьма низкой специфичности туберкулина при использовании его как суммарного антигена при диагностировании туберкулеза с помощью IFN-y-ИФА. Она также

подтверждается сравнением концентрации IFN-y при стимуляции PPD с содержанием IFN-y, полученного при стимуляции известными митогенами -конканавалином А и фитогемагглютинином, которые, как известно, вызывают неспецифическую активацию Т-лимфоцитов, не обусловленную связыванием с антиген-распознающими рецепторами. Пациенты под № 26, 28 и 36, как и остальные, являются больными туберкулезом, хотя туберкулез у 26- и 36-го выявляются однозначно только по гибридному белку rCFPlO, а у 28-го - только по гибридному белку rESAT-б и одновременно при использовании смеси рекомбинантных белков rESAT-6 + rCFPlO. Значение концентрации IFN-y, полученное при испытании в качестве индуктора гДМРТ64, не является определяющим, поскольку, как уже отмечалось ранее, ген, кодирующий этот белок, присутствует как в патогенном, так и в вакцинном штамме, применяемом в России. Таким образом, полученные результаты по какому-то одному выбранному из двух определяющих белков (rESAT-б и rCFPlO) могут оказаться неоднозначными. Для интерпретации результатов рекомендуется использовать процент специфического ответа (табл. 10 и рис. 18). Процент специфического ответа для применяемого антигена рассчитывали по формуле:

- М)

% ответа на стимуляцию антигеном = ——— х 100.

где: N= IFN-y (МЕ/мл) для нулевого (отрицательного) контроля;

Ag= IFN-y (МЕ/мл) для применяемого антигена;

М = IFN-y (МЕ/мл) для митогенного контроля.

% специфического иммунного ответа

250 200 15(1 км 50

о

Рис. 18. Гистограмма специфического иммунного ответа мононуклеарных клеток из образцов периферической крови, стимулированных PPD (синий цвет), ESAT6 (красный цвет), CFP10 (желтый цвет)

1гП „1 JJ

1-1, И-1 ti n . IVi П_ .: Пп Г rtn

I 2 Л 4 5 I, 7 к ') 10 И 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Используемый метод позволяет определять количество IFN-y в диапазоне 0,10-150 ME/мл с точностью ±10%. (внешний и внутренний коэффициент вариации не превышает 10 %).

Продукция IFN-y пРи стимуляции периферической крови среди пациентов с туберкулезом легких в процессе противотуберкулезной терапии

Был изучен иммунный ответ при туберкулезе на разных этапах антибиотиковой химиотерапии при использовании комплекса микобактериальных белков (М bovis BCG, белки культурального фильтрата (ST-CF) и очищенных рекомбинантных антигенов (rESAT-6, rCFPIO, ГДМРТ64). Клинико-рентгенрлогические и лабораторные исследования проводили после применения курса интенсивной химиотерапии через 2 и б месяцев. Эффективность лечения препаратами оценивали в Т-клеточном ответе при стимуляции видоспецифическими антигенами и белками культурального фильтрата по продукции IFN-y. Процент позитивного ответа после проведенной терапии через 2 месяца составил 51,5% для антигена rESAT-6 и 48,4 % для белка rCFPIO. В 5 случаях для больных туберкулезом (диссеминированный туберкулез, инфильтративная форма туберкулеза) и Ш84 наблюдали расхождения по результатам теста между двумя антигенами. Эти данные вызывают необходимость дополнительного проведения анализа с использованием альтернативных методов и повторной постановки теста. Все больные имели положительные показатели по данным культурального и микроскопического тестов до проведения антитуберкулезной терапии. У 14 пациентов после курса проведенной терапии наблюдалась выраженная положительная динамика процесса. У больных с генерализованной инфекцией и диссеминированным туберкулезом практически отсутствовала секреция IFN-y, что связано с иммуносупрессией. Согласно литературным данным, у подобного рода пациентов продукция IFN-y может не происходить вообще или проходить на низком уровне (Bua A. et al., 2004; Kobashi Y. et al., 2008).

Применение технологии ELISPOT для оценки специфического иммунного ответа на туберкулезную инфекцию

ELISPOT-анализ в настоящее время является одним из эффективных методов для детекции и подсчета индивидуальных клеток, секретирующих специфические цитокины в результате стимуляции специфическими белковыми антигенами или синтетическими пептидами in vitro. Технология ELISPOT-анализа применяется для мониторинга ВИЧ-вакцинированных пациентов, онкологических заболеваний, вирусных гепатитов В и С, аутоиммунных заболеваний, для оценки Thl/Th2-hmmyиного ответа, при разработке вакцин и лекарственных препаратов, выявлении специфического иммунного статуса, для эпитопного картирования и определения гуморального иммунитета (Gaines H., Andersson L. 1996; Pathan A.A., 2001; Chee C., 1997; Arien P., 2000; Mashishi T., 2002). ELISPOT-анализ включал

3 4

А

В

С D

э 3

3 * . • ■ , •

■». -

3 щ__- " I : : »

Рис. 19. ELISPOT-анализ различных образцов крови. A-D (1-2) - контрольные отрицательные образцы; А - свежеприготвленная кровь при стимуляции антигеном ESAT-6 здоровых доноров (буферный раствор, нулевой контроль); В (3-4) - стимуляция антигеном ESAT-6 больного туберкулезом (свежеприготовленная кровь), 2,0x105 IFN-y SFC; С (3-4) - стимуляция антигеном ESAT-6 больного туберкулезом (криоконсервированная кровь) с добавлением IL-7 10 мкг/мл, 2,5х105 IFN-y SFC; D (3-4) -стимуляция антигеном ESAT-6 больного туберкулезом (криоконсервированная кровь), 2,0x105 IFN-y SFC

3 4 5 6

10

•1Ф1С шсюмжод

H I 899 1109 1097 716 1361 798 1051 1170 1227 823 1028 796

Рис. 20. Митогенная стимуляция образцов свежей крови и криоконсервированной у пациентов с активным туберкулезом. 2, 3, 5, 7, 9, 11 - стимуляция свежей цельной крови ФГА; 1, 4, 6, 8, 10, 12 - стимуляция криоконсервированной цельной крови ФГА

использование в качестве твердой фазы 96-луночных планшет, имеющих дно лунок из нитроцеллюлозы. Из периферической крови человека выделяли центрифугированием на смеси фиколл-гепака мононуклеарные клетки. Суспензию мононуклеарных клеток крови, содержащей полную среду RPMI-1640 с 5% FCS, с концентрацией 2,0x106, 2.5x106 или 2.5x105 в мл раскапывали по лункам, вносили антигены rESAT-6 и rCFPIO М. tuberculosis, митогены и инкубировали 12-24 ч при 37 °С в присутствии 5 % ССЬ. После инкубации клетки удаляли промыванием лунок PBS с 0,05 % Tween 20. Затем вносили в каждую лунку биотинилированные поликлональные антитела (вторичные антитела), специфические к выбранному цитокину. После

1Г\-гяммя ЧРГ/1т1П6

т

— - —

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Количество образцов

Рис. 21. Гистограмма стимуляции митогенами образцов крови, представленных на рис. 20

Рис. 22. Типичная картина выявления туберкулезной инфекции 1РЫ-у-ЕЫ8РОТ-анализом. 1 (А—В) - положительный контроль (митогенная стимуляция, 48 ч, 2,0х106 клеток/мл), 1(0—Н) - отрицательный контроль (стимуляция, 48 ч). Положительные образцы, п=27

отмывки от несвязавшихся биотииилированных антител добавляли конъюгат пероксидазы хрена (щелочной фосфатазы) и стрептавидина. Несвязавшийся фермент удаляли промыванием и вносили хромогенный субстрат BCIP/NTB. В ходе ферментативной реакции образовывался окрашенный преципитат в виде сине-черных пятен в местах локализации антигена, где каждое отдельное пятно представлено индивидуальной клеткой, секретирующей цитокиновую продукцию в процессе стимуляции. Пятна, различающиеся по размеру, после высыхания лунок подсчитывали с помощью автоматического ELISPOT-ридера или визуально с помощью микроскопа. Реакцию считали положительной, если на 106 МКПК насчитывается не менее 10 формирующих пятен. Было установлено, что около 70 % жизнеспособных клеток способны продуцировать IFN-y при стимуляции антигенами М. tuberculosis. Оставшиеся после первичной стимуляции клетки способны секретировать IFN-y при проведении вторичного ELISPOT-анализа из тех же самых образцов. Жизнеспособность клеток после выделения определяли с использованием стандартной процедуры с окрашиванием Trypan Blue в течение 1 ч до проведения ELISPOT-анализа и затем использовали их при проведении анализа на туберкулезную инфекцию (рис. 19 и 20). Клетки культивировали в присутствии IL-7 (10 иг/мл) или IL-I5 (20 нг/мл) в течение 4—7 дней. Жизнеспособность клеток > 70 % рассматривали в качестве положительного контроля при проведении теста. Коммерческие тесты с использованием рекомбинантных антигенов ESAT-6 и CFP10 и синтетических пептидов М. tuberculosis (например, SPOT-TB-тест) также позволяют выявлять М. tuberculosis со специфичностью 99,8-100 %. При этом чувствительность ELISPOT-IFN-y-анализа с использованием ESAT-6 и CFP10 антигенов превышает IFN-y-анализ и составляет 95,7 % при исследовании туберкулеза (Lalvani A. et al., 2001,2007).

Диагностика BJIKPC

Изучение диагностической ценности разных коммерческих наборов и разработанных нами методов позволило применить их в диагностике вируса лейкоза крупного рогатого скота (BJIKPC). Работа была выполнена на базе лаборатории лейкозов ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН и лаборатории биоинженерии ГНЦ ВБ «Вектор». Рекомбинантный антиген р24 к BJIKPC и специфические моноклональные антитела получены в лаборатории лейкозов (Файззулин Р.З., Чекишев В.М., 1993). Исследования проводили на материале от 120 коров в возрасте 3—7 лет: интактных, инфицированных BJIKPC и больных лейкозом. Животные принадлежали хозяйствам Новосибирской области. Получение сыворотки проводили по общепринятой методике. По результатам реакции иммунодиффузии (РИД) в агарозном геле и гематологических исследований животных разделили на 3 группы: больные (в эту группу вошли гематологически больные животные и реагирующие на антиген р24 в РИД), РИД(+) и РИД(-) - табл. 12. Антитела к BJIKPC выявляли с помощью РИД, используя набор для серологической диагностики

лейкоза КРС производства Курской биофабрики, согласно наставлению производителя, а также методом ИФА в соответствии с временным наставлением по применению набора для выявления антител к ВЛКРС производства НПО "Нарвак" (Россия).

Таблица 12

Результаты сравнительных серологических, гематологических и ПЦР-методов исследования крови коров__

Группы животных Кол-во коров ИФА ПЦР

Кол-во коров % Кол-во коров % Кол-во коров % Кол-во коров %

Больные 13 13 100 - - 13 100 - -

РИД(+) 51 51 100 - - 32 62,7 19 37,3

РИД(-) 56 6 10,7 50 89,3 5 8,9 51 91,1

Представленные результаты (рис. 23) выявления антител IgG с использованием разных по природе антигенов и с различной степенью очистки показывают, что выявление антител к ВЛКРС зависит от чистоты антигена (очищенный антиген р24 - 1) и способа нанесения белкового антигена на иммунопланшет (МКА/очищенный рекомбинантный антиген р24 - 4). Так, при использовании рекомбинантных белков с МКА процент выявления позитивных сывороток был наиболее высоким (80-92 %), тогда как коммерческий антиген позволял выявлять антитела к ВЛКРС с низкой эффективностью (54-67 %). Уровень антител в ИФА с использованием разных по природе антигенов соответствовал следующему ряду: 4 > 5 > 1 > 2 > 6 > 3 (см. рис. 23). Как показывают результаты анализов, оба метода, и РИД и ИФА, позволяют эффективно диагностировать антитела к ВЛКРС. Диагностическая чувствительность и специфичность ИФА для рекомбинантных белков разной степени очистки по сравнению с РИД составила 70-93 %. Суммарная реактивность антигенов, используемых в работе, составила 90 % от общего числа тестируемых сывороток.

Образцы ДНК исследовали в ПЦР при помощи набора для экспресс-индикации ДНК профага вируса лейкоза КРС методом ПЦР, согласно инструкции по применению производства «ЛАГИС» (Россия). Праймерная пара env (envelope), используемая в наборе, фланкирует фрагмент оболочечного гена длиной 346 п.н. и предназначена для скрининговой детекции всех вариантов ДНК ВЛКРС, являясь маркером профага. Амплификацию проводили в реакционной смеси, содержащей 0,5 мкг ДНК, 9 мкл буфера, 1 мкл раствора MgCl2, 1 мкл смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и праймеров и 0,3 мкл Taq-полимеразы под 20 мкл минерального масла в пластиковых пробирках объемом 0,5 мл. Смесь помещали в амплификатор «Терцик» с заданной программой температурно-временных циклов. Как видно из табл. 12, при исследовании больных лейкозом коров (первая группа) и в ИФА, и в ПЦР были получены положительные результаты в 100 % случаев, что подтверждает наличие

вируса и антител против него в сыворотке и крови животных. По литературным данным, с помощью ИФА можно выявлять антитела в разведении более чем 1:131000-1:220000 (Trono K.G., 2001).

о

1П

■ч

С 0.5 О

А ri PI

1 й rít ■ i 1 1

1 2 3 ¿ 5 6 7-1

□ РИД» СЫЕОЭОТ<к НРИЦХСЫВСфОТНИ

Рис. 23. Результаты выявления антител к ВЛКРС методом ИФА среди РИД(+) и РИД(-) сывороток с использованием разных по природе антигенов. Цифрами по оси абсцисс обозначены разные по природе и степени очистки антигены (АГ): 1 - рекомбинантный очищенный АГ р24; 2 - рекомбинантный АГ р24; 3 - коммерческий АГ (из набора для постановки РИД); 4 -МКА/рекомбинантный очищенный АГ р24; 5 -МКА/рекомбинантный АГ р24; 6 -МКА/коммерческий АГ; 7 - контроль (т/с НПО «Нарвак»), По оси ординат - оптическая плотность при длине волны 450 нм.

Из 51 животного второй группы только 32 дали положительные результаты в ПЦР. При рутинном использовании ПЦР-диагностики возникают сложности в интерпретации результатов, так как совпадение данных ИФА, РИД и ПЦР-анализа по выявлению ДНК ВЛКРС составляет 60-100 %, а для РНК - 60 %, (БиЬе Э. ег а1., 1997; КиЫэ Р. ег а1., 1996). Компьютерный анализ тест-систем для выявления ВЛКРС посредством ПЦР показал, что применяемые в разных лабораториях праймеры характеризуются различной степенью гомологии. Использование праймеров с невысокой степенью гомологии (90 % и менее) может существенно понижать чувствительность и специфичность ПЦР-анализа и приводить к появлению ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Теми же причинами, по-видимому, можно объяснить несовпадение результатов сравнительного анализа ИФА и ПЦР-диагностики ВЛКРС, проведенного на большом экспериментальном материале (КиЫв Р. е! а1., 1996). Однако в ПЦР нами были довыявлены 5 коров-вирусоносителей, которых ни с помощью РИД, ни ИФА не выявили. На рис. 24 представлена электрофореграмма продуктов ПЦР. Многочисленные данные, свидетельствующие о преимуществах ПЦР в сравнении с серологическими методами (более раннее выявление вируса, чем антител против антигенов ВЛКРС в РИД и ИФА на 1-8 недель, и выявление животных в случае скрытого вирусоносительства), а также данные,

2 3 4 5 6 7 8

Рис. 24. Электрофореграмма продуктов

ПЦР в 1,5 % агарозном геле:

1 — отрицательный контроль;

2 — положительный контроль,

3,4 — (+)-пробы; 5 — маркер ЬрЮО; 6—8 — (-)-пробы.

1000 п.н.

500 п.н.

346 п.н.

полученные нами, характеризуют ПЦР как эффективный метод диагностики ВЛКРС. Напротив, ИФА зарекомендовал себя как высокоэффективный альтернативный или дополняющий РИД серологический метод, который можно, на наш взгляд, успешно использовать для диагностики лейкоза уже сегодня, особенно в хозяйствах на завершающих этапах оздоровления от лейкоза и в хозяйствах, где регистрируются единичные случаи ВЛКРС-инфекции. Сравнительное выявление маркеров гуморального иммунного ответа у животных, инфицированных ВЛКРС, и молекулярных маркеров лейкозной инфекции приведено в табл. 13. Как показывают результаты, приведенные в табл. 13, 64 животных были диагностированы как позитивные по результатам нескольких тестов. Нами не было идентифицировано ни одного случая ложноположительного животного. Из 64 инфицированных ВЛКРС животных у 6 (9,4 %) не подтвердился диагноз ни одним из методов. ИФА с использованием рекомбинантных антигенов подтвердил позитивный результат у 56 животных. Из 39 негативных было выявлено 10 с диагнозом заболевания ВЛКРС с применением ИФА и ПЦР, 3 животных оказались позитивными при использовании трех методов (ИФА с рекомбинантными белками и серологических и референсных методов - РИД и ИФА), однако дали отрицательный ответ в ПЦР. Процент выявления позитивных животных с помощью ПЦР и ИФА оказался существенно выше, чем при использовании методов ИФА и РИД. Чувствительность и специфичность ИФА составила 87,4 % и 93,5 % соответственно, что сравнимо с результатами ПЦР-теста. Удовлетворительные результаты были получены нами при диагностике ВЛКРС на разных стадиях развития патологического процесса. Необходимость новых подтверждающих тестов для выявления инфицированных и больных животных ВЛКРС, выявление маркеров гуморального иммунного ответа с целью профилактики, позволяет с более высокой достоверностью осуществлять контроль племенных стад КРС. И это является одним из путей в развитии диагностики ВЛКРС. Полученные результаты послужили основой для исследований по созданию диагностических тест-систем, в которых основным элементом являются

рекомбинантные или нативные антигены, содержащие иммунодоминантные эпитопы в своей структуре. Использование рекомбинантного антигена р24

Таблица 13

Сравнение результатов, характеризующих клинический статус и иммунореактивность животных в диагностике ВЛКРС_

Тест Результаты анализа Общее количество

ИФА (р24 рек.белки) + — + + + + — — — + + — — + + 56

ИФА (референс-тесты) + + + + + + + + + 46

ПЦР + - + + + - + + + - - + + 56

РИД - - • - - - + - + - + + 24

ВЛКРС (+) 10 0 7 2 0 12 1 2 1 3 5 2 3 12 4 64

ВЛКРС (-) 10 5 0 0 3 0 14 7 0 0 0 0 0 0 0 39

Общее кол-во 20 5 7 2 3 12 15 9 1 3 5 2 3 12 4 103

позволяет применять его для оценки параметров гуморального иммунного ответа на стадии природного инфицирования животных, а также после проведения вакцинирования. При этом чувствительность антигена р24 BJIKPC в ИФА к чувствительности белка р53 составляет 97 %, что согласуется с литературными данными (Molloy J. et al., 1990). Что касается РИД, этот показатель составил 96 %. Таким образом, открываются перспективы совершенствования новых направлений в диагностике инфекционных заболеваний и их практического применения. Как видно из приведенных результатов, новые методы, применяемые в диагностике инфекционных заболеваний, могут эффективно дополнять друг друга, развивая, таким образом, систему доказательной ветеринарии в диагностике инфекционных заболеваний животных.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана диагностическая тест-система «Вектогеп-A-IgM» для выявления антител класса М к вирусу гепатита А методом ИФА. По аналитическим характеристикам (чувствительности - 98-97 %, специфичности — 100 %, времени проведения анализа - 2-2,5 ч) тест-система сопоставима с тест-системами зарубежных фирм Abbott (США) и La Roche (Швейцария). Тест-система по результатам проведения Госиспытаний, рекомендована Ученым советом ГИСК им. JI.A. Тарасевича и Комитетом по производству иммунобиологических препаратов (МИБП) к регистрации.

2. Разработан набор компонентов «Вектогеп-А-антитела» для выявления IgG-антител к ВГА с чувствительностью и специфичностью соответственно 98-99 % и 82 %. Аналитическая чувствительность диагностического набора составила 9,8 ± 1,2 мМЕ/мл, при этом чувствительность референс-тест-системы «ИФА-анти-ВГА» составила 11,8 ± 1,6 мМЕ/мл.

3. Получены рекомбинантные штаммы Е. coli — продуценты химерных белков rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64 М. tuberculosis, которые депонированы в коллекции культур микроорганизмов ГНЦ ВБ «Вектор». Предложена технологическая схема для наработки и очистки рекомбинантных белков rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64 в растворимой форме.

4. На примере rESAT-6 и rCFPlO установлено, что с использованием рекомбинантных белков возможно выявлять антитела классов G, А и М среди разных групп обследуемых, но наиболее высокий показатель выявляемое™ иммуноглобулинов определен для антител класса G, который составил 70 % (для IgA - 31,4 %, IgM - 11,8 %).

5. Чувствительность и специфичность выявления IgG-антител методом иммуноферментного анализа к рекомбинантным антигенам rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64, оцененные по образцам сывороток от больных туберкулезом и здоровых доноров, составила 79 %, 65 %, 81 % и 92-98 %, 95-98 % и 76 % соответственно.

6. Определена корреляция между содержанием антител к антигенам микобактерий и активностью процесса. Показаны достоверные различия коэффициента корреляции между активностью процесса (выраженной в баллах) и уровнями антител класса G у больных туберкулезом легких независимо от формы процесса к Е-БЦЖ, к С-БЦЖ (соникат клеток), к Е-H37R.V, к C-H37R.V (соникат клеток), и только при фиброзно-кавернозном туберкулезе легких отмечалась достоверная корреляция между уровнями антител класса М к E-H37R.V и C-H37Rv и степенью активности процесса.

7. Сравнительный анализ гуморального иммунного ответа больных на микобактериальные антигены с результатами патолого-гистологического исследования выявил достоверные коэффициенты корреляции между уровнями антител класса G к С-БЦЖ (r=0,476, р<0,04), E-H37Rv (г=0,495, р<0,03) и уровнями антител класса М к С-БЦЖ (г=0,448, р<0,04).

7.1. Достоверная корреляция между показателями содержания антител и клинико-рентгенологическими признаками заболевания, и между уровнями антител и патолого-гистологической картиной заболевания позволили конкретизировать диагностическую значимость уровней антител того или иного класса к определенным антигенам М. tuberculosis.

8. Чувствительность функционального анализа при выявлении маркеров Т-клеточного иммунного ответа (IFN-y), определявшаяся при стимуляции мононуклеаров цельной крови рекомбинантными белками, rESAT-6, rCFPlO и ГДМРТ64 составила 84-100%, 80-95%, 60-78% соответственно, специфичность - 86-100 %, 82-100 % и 76-97 % соответственно. При использовании пула одновременно трех рекомбинантных белков — rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64 — специфичность составила 96,2 %, а чувствительность -

89,1 %. Разработаны диагностические компоненты наборов, позволяющие эффективно оценивать состояние клеточного иммунитета при туберкулезной инфекции.

9. Разработан алгоритм использования серологических тестов (РИД, ИФА) и молекулярно-биологических методов (ПЦР, «nestecb-ПЦР) для обследования хозяйств с различной степенью инфицированности по лейкозу крупного рогатого скота (неблагополучные и благополучные):

- иммуноферментные методы определения антител к BJIKPC позволяют дополнительно к РИД выявлять до 15,3 % животных, инфицированных ВЛКРС, в зависимости от эпизоотической ситуации по инфекции BJIKPC. Установлено, что 71 % сомнительных в РИД проб по результатам ИФА содержат антитела к ВЛКРС. С целью рационального использования иммуноферментного теста рекомендуется применять его при первичном разделении неблагополучного стада и на завершающей стадии оздоровления, -доля животных, инфицированных ВЛКРС и выявленных разными методами, составила: для РИД - 76,1 %, для ИФА - 83,3 %, для ПЦР- 58,3 %, для «nestecb-ПЦР — 72,6 %. Для максимального выявления всех инфицированных ВЛКРС животных необходимо комбинированное использование серологических (РИД, ИФА) и молекулярно-биологических (ПЦР, «nestecb-ПЦР) методов диагностики.

— у гематологически больных лейкозом животных наличие ВЛКРС было подтверждено методами РИД, ИФА и ПЦР в 100 % случаев.

Список патентов, оформленных по теме диссертации

1. Туманов Ю.В., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Татьков С.И. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTSE6, кодирующая гибридный полипептид GST-ESAT-6 со свойствами видоспецифичного микобактериального антигена ESAT-6, рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli - продуцент гибридного полипептида GST-ESAT-6 и рекомбинантный полипептид GST-ESAT-6. Патент RU № 2282661 С2 от 16.08.2004.

2. Туманов Ю.В., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Татьков С.И. Рекомбинантная плазмидная ДНК рТВ232, кодирующая гибридный полипептид GST-CFP10 со свойствами видоспецифичного микобактериального антигена CFP10, рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli - продуцент гибридного полипептида GST-CFP10 и рекомбинантный полипептид GST-CFP10. Патент RU №2381274 от 26.02.2008.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Аммосов А.Д., Гришаев М.П., Туманов Ю.В., Рукавишников М.Ю. Разработка иммуноферментных и зондовых тест-систем для выявления маркеров вирусных гепатитов, врожденных инфекций и клещевого энцефалита. Сборник матер. Научно-практической конф. «Инфекционной службе г. Новосибирска - 90 лет». Новосибирск. 5-7 октября 1994 г. С. 77-79.

2. Разумов И.А., Туманов Ю.В., Казачинская Е.И., Тюнников Г.Н., Локтев В.Б. Изучение возможности использования крысиных моноклональных антител для конструирования диагностических тест-систем к вирусу гепатита А. «Актуальные вопросы современной медицины». Новосибирск. - 1995. — Т. 2. - С. 221—223.

3. Разумов И.А., Туманов Ю.В., Казачинская Е.И., Тюнников Г.И., Локтев В.Б. Моноклональные антитела в иммуноферментной диагностике вируса гепатита А // Вестник РАМН. - 1998. - № 3. - С. 9-13. (Список ВАК).

4. Лебедев Л.Р., Азаев М.Ш., Туманов Ю.В., Сизов A.A., Ильичев A.A., Татьков С.И. Искусственные микобактериальные частицы для иммунизации против туберкулеза // ДАН. - 2002. - Т. 387. - № 2. - С. 272-275. (Список ВАК).

5. Кузнецова Т.Н., Воевода М.И., Подколодная O.A., Куликов И.В., Кобзев В.Ф., Устинов С.Н., Малютина С.К., Логвиненко Н.И., Журавская Э.Я., Чердынцева Н.В., Туманов Ю.В., Морозова O.A., Баум В.А., Ромащенко А.Г. Делеционный полиморфизм 11-го интрона гена c-fms человека: частоты аллелей в некоторых популяциях России и возможная функциональная значимость // Генетика. - 2004. -Т. 40. -№ 1. - С. 102-112. (Список ВАК).

6. Азаев М.Ш., Лебедев Л.Р.. Туманов Ю.В., Смирнова О.Ю., Кузьмичева Г.А., Боднев С.А., Донченко H.A., Татьков С.И. Получение искусственных микобактериальных частиц и исследование их иммунногенных свойств // Биотехнология. - 2004. - № 4. - С. 32-34. (Список ВАК).

7. Аутеншлюс А.И., Шкунов А.Н., Туманов Ю.В., Кузнецова Н.Б., Михайлова Е.С., Седова Ю.В., Огиренко Н.П. Антитела к антигенам микобактерий у больных туберкулезом легких // Проблемы туберкулеза. - 2004. - № 11. - С. 37-40. (Список ВАК).

8. Двоеглазов. Н.Г., Туманов Ю.В. Сравнительный анализ разных коммерческих тест-систем и методов в диагностике ВЛКРС. «Актуальные вопросы ветеринарии»: матер. Сиб. междунар. науч.-практ. конф. - Новосибирск. 2004. - С. 304-308.

9. Мокеева A.B., Орешкова С.Ф., Попова А.Г., Сивков А.Ю., Туманов Ю.В., Азаев М.Ш., Татьков С.И., Ильичев A.A. Генетический полиморфизм клинических штаммов микобактерий туберкулеза, циркулирующих на территории Новосибирской области // Вестник РАМН. - 2005. - № 1. - С. 20-24. (Список ВАК).

10. Туманов Ю.В., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Вараксин H.A., Татьков С.И. Рекомбинантные белки М. tuberculosis в диагностике туберкулеза легких // Медицинская иммунология. - 2006. - № 2/3. - С. 294-295. (Список ВАК).

11. Татьков С.И., Носарева О.В., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Лебедев Л.Р., Порываева В.А., Ивлев-Дунтау А.П., Аутеншлюс А.И., Ткаченко С.Б., Стрелис А.К., Новицкий В.В., Уразова О.И., Воронкова О.В. Применение рекомбинантных видоспецифических белков М. tuberculosis для серологической диагностики туберкулеза // Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. — № 12.

- С. 23-34. (Список ВАК).

12. Татьков С.И., Туманов Ю.В., Носарева О.В., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Лебедев Л.Р., Порываева В.А., Ивлев-Дунтау А.П., Ткаченко С.Б., Стрелис А.К., Новицкий В.В., Уразова О.И., Воронкова О.В. Применение рекомбинантных видоспецифических белков микобактерий туберкулеза для серологической диагностики инфекции // Эпидемиология и вакцинопрофилактика.

- 2006. - № 4(29). - С. 42^17. (Список ВАК).

13. Двоеглазов Н.Г., Туманов Ю.В., Храмцов В.В., Таслицкий С.Я. Использование различных по природе антигенов для диагностики инфекции ВЛКРС. // Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения животноводства Сибири: сб. науч. тр. / РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 2006. - С. 73-76.

14. Татьков С.И., Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Медведева Е.В., Ивлев-Дунтау А.П., Стрелис А.К., Новицкий В.В., Уразова О.И., Воронкова О.В. Результаты применения биочипов для определения лекарственной устойчивости М. tuberculosis в Новосибирской и Томской областях // Мол. Ген. Микробиол. Вирусол. - 2007. - № 4. - С. 9-15. (Список ВАК).

15. Азаев М.Ш., Лебедев Л.Р., Кузьмичева Г.А., Туманов Ю.В., Донченко H.A., Татьков С.И., Носарева О.В., Ильичев A.A. Исследование роли искусственных микобактериальных частиц в реализации иммунологических процессов при экспериментальном туберкулезе животных // Пробл. туберкулеза и болезней легких. - 2007. - № 2. - С. 38^18. (Список ВАК).

16. Двоеглазов Н.Г., Туманов Ю.В., Храмцов В.В. Сравнительный анализ антигенов при выявлении антител к вирусу лейкоза методом иммуноферментного анализа у инфицированного крупного рогатого скота // Сибирский Вестник сельскохозяйственной науки. - 2007. - № 8. - С. 91-94. (Список ВАК).

17. Nosareva O.V., Nesterov A.N, Boldyrev A.N., Smimova O.Y., Tumanov Yu.V., Tatkov S.I. Using a polysaccharide matrix for DNA-vaccine based on ESAT-6 // Biological Chemistry.-2008.-V. 389,-N5.-P. 579-583. (СписокВАК).

18. Nosareva О.V., Nesterov A.E., Boldyrev A.N., Smimova O.Y., Tumanov Yu.V., Tatkov S.I. Detection of ESAT-6 specific T-cell responses induced by vaccination mice with the preparation «KpONE6» // Clinical Microbiology and Infection. May - 2008. -V. 14s7.-P. 570.

19. Туманов Ю.В. «Мониторинг туберкулезной инфекции с использованием методов функционального анализа». ЕЖЕГОДНИК МЕДИЦИНСКИХ ИННОВАЦИЙ. Hannover. 2009, Европейское научное общество (ЕНО), Европейская академия естественных наук (ЕАЕН). - С. 186-187.

Доклады и тезисы конференций с международным участием

1. Дунтау А. П., Федорова М.В., Кожина Е.М., Липский К.А., Никитина О.Г., Жилина С.А., Челышева Л.Б., Астапова H.A., Татьков С.И., Туманов Ю.В., Ильичев A.A. Анализ лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза по данным ГДТ№1, Новосибирск. Тез. Докл. VII Международной конф. и дискуссионный научный клуб «Новые информационные технологии в медицине и экологии». Украина. Гурзуф, июнь 2000 г. - С. 110.

2. Туманов Ю. В., Дунтау А. П., Кожина Е. М., Федорова М. В., Липский К. А., Никитина О. Г., Жилина С. А., Челышева Л. Б., Астапова Н. А., Татьков С. И., Рассадкин Ю. Н, Шестопалов А. М., Ильичев А. А. Создание и характеризация коллекции штаммов М. tuberculosis, полученных от больных туберкулезом г. Новосибирск. Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы (Мат. 8-й международной конф. «СПИД, рак и родственные проблемы». Санкт-Петербург). -2000.-Т. 4.-N1.-C.38.

3. Туманов Ю.В., Дунтау А. П., Федорова М.В., Кожина Е.М., Липский К.А., Никитина О.Г., Жилин С.А., Челышева Л.Б., Астапова H.A., Татьков С. И., Рассадкин Ю.Н., Шестопалов A.M., Ильичев A.A. Эпидемиологическая ситуация по распространенности туберкулеза с первичной лекарственной устойчивостью в г. Новосибирске в 1999 году. Тез. Докл. Конф. «Проблемы биологической и экологической безопасности». Оболенск. - 2000. - С. 269.

4. Duntau E.M., Fedorova M.V., Tumanov Y.V., Tatkov C.I., Ilychev A.A. Primary Drug Resistant tuberculosis in Novosibirsk in 1999 Year. International Conference. May 18-23. 2001. San Francisco, California, American Thoracic Society.

5. Tatkov S.I., Kozhina E.M., Smirnova O.Y., Tumanov Y.V. et al. Additional region rpoB (202-206) for rapid detection of rifampicine-resistantce of M. tuberculosis by PCR-SSCP. 11th ERS Annual Congress Berlin, Germany. 2001. September 22-26.

6. Двоеглазов Н.Г., Туманов Ю.В., Белявская B.A, Храмцов B.B. Смирнов П.Н. Сравнительный анализ ПЦР и серологических методов выявления антител к BJIKPC. Тез. Докл. Всероссийской научно-практ. конф. г. Иркутск 2002. С. 23-24.

7. Двоеглазов Н.А., Туманов Ю.В., Храмцов В.В. Рекомбинантные антигены BJIKPC при выявлении антител к BJIKPC. Тез.докл. Всероссийской конф.

г. Иркутск. 2002. С. 17-18.

8. Двоеглазов Н.Г., Туманов Ю.В., Файзулин Р.З., Белявская В.А, Храмцов В.В. Создание стандартной лабораторной панели сывороток для выявления антител к BJIKPC. Матер, научно-практ. конф., посвящ. 70-летию Иркутской НИВС. - Иркутск, 2002. С. 21-23.

9. Татьков С.И., Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Азаев М.Ш., Кожина Е.М., Дунтау А.П., Медведева Е.В., Баранова О.И., Гришаева О.Н. Исследование генетических причин устойчивости к рифампицину штаммов М. tuberculosis, циркулирующих в г. Новосибирске. «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». Вторая научная конф. с международным участием. Новосибирск. Россия. 29-30 мая. 2002. С.212.

10. Болдырев А.Н., Сивков А.Ю., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Использование полимеразной цепной реакции для одновременного определения инфицированное™ пациента туберкулезом и устойчивости к рифампицину. Труды конф. «Межрегиональная научная конф., посвященная 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова», 7-10 октября 2003 г. - Томск. С. 169-170.

11. Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Азаев М.Ш., Медведева Е.В., Дунтау А.П., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Оценка эффективности применения биочипа для определения изолятов, устойчивых к рифампицину. «Межрегиональная научная конф., посвященная 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С. П. Карпова», 7-10 октября, 2003, С. 170-171.

12. Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Туманов Ю.В., Боднев С.А., Аутеншлюс А.И., Татьков С.И. Рекомбинантные белки M.tuberculosis в серологической диагностике туберкулеза. «Межрегиональная научная конф., посвященная 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С. П. Карпова», 7-10 октября, 2003, С. 171-172.

13. Аутеншлюс А.И., Шкунов А.Н., Туманов Ю.В., Кузнецова Н.Б., Михайлова Е.С., Седова Ю.В. Антитела к антигенам M.tuberculosis и патоморфологическая картина при туберкулезном воспалении в легких. «VII Российский съезд фтизиатров» 3-5 июня 2003 года Москва. С. 6-7.

14. Nosareva О., Smirnova О., Boldyrev A., Tumanov Y., Azaev М., Lebedev L. et al. Construction of artificial virus-like particles exposing Micobacterial ESAT-6, and the study of their immunogenic properties. Keystone Symposia "Tuberculosis: Integrating Host and Pathogen Biology". Whistler, British Columbia, Canada 2-7. April 2005. P. 94.

15. Nosareva,O.V, Nesterov A.E., Boldyrev A.N., Smirnova, O.J., Tumanov Y.V., Tatkov S.I. Investigation of the experimental preparation on the basis mycobacterium antigen ESAT-6. The International Simposium "EU-Russia: Prospects for Cooperation in

Biotechnology in the Seventh Framwork Programme", St-Petersburg, Rossia. June 5-9 2006. P. 72.

16. Болдырев A.H., Носарева O.B., Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Применение рекомбинантных видоспецифических белков М. tuberculosis для серологической диагностики туберкулеза. III Российская научная конф. с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». - Новосибирск. - Россия. - 27-29 сентября 2006 г. - С. 134-135.

17. Туманов Ю.В., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Лебедев Л.Р., Азаев М.Ш., Носарева О.В., Ивлев-Дунтау А.П., Татьков С.И. Выявление маркеров Т-клеточного иммунитета в видоспецифической диагностике туберкулеза. // III Российская научная конф. с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». -Новосибирск. - Россия. - 27-29 сентября 2006 г. - С. 166-167.

18. Туманов Ю.В., Рапута В.Ф., Рагино Ю.И., Воевода М.И. Оценка серологических маркеров вирусных и бактериальных инфекций среди населения, проживающего в техногенных зонах г. Новосибирска. «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера»: Тез. докл. III Росс. науч. конф. с междунар. участием (Новосибирск, 27-29 сент. 2006 г.) Новосибирск: ЦЭРИС, 2006. С.281-282.

19. Азаев М.Ш., Лебедев Л.Р., Туманов Ю.В., Донченко Н.А., Кузьмичева Г.А., Татьков С.И., Ильичев А.А. Создание искусственных микобактериальных частиц и исследование их роли в реализации иммунологических процессов при экспериментальном туберкулезе животных. «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера»: Тез. докл. III Росс. науч. конф. с междунар. участием (Новосибирск, 27-29 сент. 2006 г.) Новосибирск: ЦЭРИС, 2006. С. 132-133.

20. Татьков С.И., Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В. Результаты применения биочипов для определения лекарственной устойчивости M.Tuberculosis в Новосибирской и Томской областях. «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера»: Тез. докл. III Росс. науч. конф. с междунар. участием (Новосибирск, 27-29 сент. 2006 г.) Новосибирск: ЦЭРИС, 2006. С.163-164.

21. Туманов Ю. В. Экспресс-тесты в диагностике вирусных и бактериальных инфекций. Международный Междисциплинарный Симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», Судак, Крым, Украина, 17-27 сентября 2006 г. С. 73-75.

22. Носарева О.В., Нестеров А.Е., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Туманов Ю. В Татьков С.И. Исследование экспериментального препарата на основе микобактериального антигена ESAT6. Международная Школа-конференция молодых ученых «Биотехнология будущего» в рамках Симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-й Рамочной Программе». 2006. С. 72-73. Москва, ОАО «Авиаиздат».

23. Туманов Ю.В., Болдырев А.Н., Носарева О.В., Смирнова О.Ю., Татьков С.И. Использование рекомбинантных микобактериальных антигенов в диагностике туберкулеза легких. Сб. тез. II Российско-Германской конф. форума Коха-Мечникова 9-12 сентября 2007 г. - Томск. - Россия. - С. 34-35.

24. Туманов Ю.В., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Лебедев JI.P., Азаев М.Ш., Носарева О.В., Ивлев-Дунтау А.П., Татьков С.И. Видоспецифическая диагностика туберкулеза по маркерам Т-клеточного иммунитета. Сб. тез. II Российско-Германской конф. форума Коха-Мечникова 9-12 сентября 2007 г. - Томск. — Россия.-С. 36-37.

25. Туманов Ю.В., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Татьков С.И. Иммунологический мониторинг туберкулезной инфекции с использованием рекомбинантных белков rESAT-6 и rCFPIO М. tuberculosis. Четвертый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», секция 1 «Биотехнология и медицина»12-16 марта 2007 г. с. 147.

26. Коробова Е.В., Курская О.Г., Сметанникова H.A., Максимов В.Н., Туманов Ю.В., Воевода М.И., Белявская В. А. Распространенность инфекционных агентов и однонуклеотидных полиморфных (ОНП) маркеров генов подверженности к социально значимым заболеваниям у населения г. Новосибирска. Четвертый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», секция 1 «Биотехнология и медицина» 12-16 марта 2007 г. С. 81.

27. Туманов Ю.В., Сергеев А.Н. Экспресс-технологии в диагностике вирусных и бактериальных инфекций. «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России»: мат. научно-практ. конф. (21-22 марта 2007, Ставрополь). - Ставрополь, 2007. - Ч. II. - С. 149151.

28. Сивков А. Ю., Болдырев А. Н., Смирнова О.Ю., Туманов Ю. В., Татьков С. И. Результаты применения биочипов для определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis в Новосибирской и Томской областях. II Российско-Германская конф. форума Коха-Мечникова, «Туберкулез, Спид, Вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении». Тез. Томск 9-12 сентября 2007 г., С. 12-13.

29. Белявская В.И., Курская О.Г., Коробова Е.В., Максимов В.Н., Туманов Ю.В., Воевода М.И., Дроздов И.Г. Интегральные исследования в оценке риска развития гриппозной инфекции особой интенсивности (пандемии) у населения Новосибирска. «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ»: мат. VIII Межгосударственной научно-практ. конф. государств-участников СНГ - Саратов 2007. С. 18-20.

30. Коробова Е.В., Курская ОГ., Туманов Ю.В. Максимов В.Н., Сметанникова H.A., Икракинбек Р., Воевода М.И., Белявская В.А. Исследование маркеров инфекционных агентов и SNP (simple nucleotide polymorphism) генов р53 и CCR5 у мужского населения г. Новосибирска. III Российская конф. по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2007», Санкт-Петербург, 20 апреля 2007 года, С.15

31. Нестеров А.Е., Носарева О.В., Липкина Е.Е., Пасаженникова И.К., Витенков Е.И., Полтавченко А.Г., Болдырев А.Н, Туманов Ю.В., Смирнова О.Ю., Татьков С.И. Перспективы применения рекомбинантного белка ESAT6 для ранней диагностики туберкулеза. Мат. междунар. научно-практ. конф. «Молекулярная диагностика инфекционных болезней», г. Минск, 17-18 мая 2007 г., С. 109.

32. Nosareva О. V., Nesterov A. N., Boldyrev A.N., Smirnova О. Y., Tumanov Y.V., Tatkov S.I. Immune response generated by DNA-vaccine with ESAT-6 and

polysaccharide matrix in mice. Vaccine Congress, Amsterdam, the Netherlandsm 9-11 December 2007. P.47.

33. Носарева O.B., Нестеров A.E., Липкина E.E., Пасаженникова И.К., Витенков Е.И., Болдырев А.Н, Туманов Ю.В., Смирнова О.Ю., Татьков С.И. Перспективы применения ПЦР для выявления гена, кодирующего специфический микобактериальный антиген ESAT-6 в мононуклеарах периферической крови. Мат. междунар. научно-практ. конф. «Молекулярная диагностика инфекционных болезней», г. Минск, 17-18 мая 2007 г. С. 110.

34. Туманов Ю.В., Технологии "point-of-care tests" в современной диагностике вирусных и бактериальных инфекций. Международный междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине». Судак. 17-28 сентября 2007. С.116-117.

35. Nosareva О., Nesterov A., Boldyrev A., Smirnova О., Tumanov Y., Tatkov S. Influence genetic construction Based DNA encoding ESAT-6 M. tuberculosis on immune system in mice Abstract book of the Keystone Symposia "Tuberculosis: Biology, Pathology and Therapy". Colorado, U.S.A. 25-30 January 2009. P. 123.

Учебные и методические пособия

Щербакова С.А., Красовская Т.Ю., Шарова И.Н., Агафонов А.П., Туманов Ю.В., Щелкунов С.Н., Рябчикова Е.И., Яшина Л.Н., Терновой В.А., Полтавченко А.Г., Петров B.C., Локтев В.Б., Кузубов В.И., Сергеев А.Н., Нетесов С.В., Дроздов И.Г. Лабораторная диагностика опасных инфекционных заболеваний. Практическое руководство. // под ред. Онищенко Г.Г., — М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006, - 288 с. Научно-техническая документация

1. Экспериментально-производственный регламент (ЭПР) 373-92. «Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита А «Вектогеп-A-IgM».

2. Временная фармакопейная статья (ВФС 42-331ВС-92) на «Тест-систему иммуноферментную для выявления иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита А «Вектогеп-A-IgM».

3. Инструкция по применению «Тест-системы иммуноферментной для выявления иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита А «Вектогеп-А- IgM».

Подписано к печати 15 августа 2011г. Тираж 120 экз. Заказ № 054. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Туманов, Юрий Васильевич

Список принятых сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы. Горизонты современной науки в системе доказательной медицины.

1.1. Проблемы и методы диагностики вирусного гепатита А.

1.2. Проблемы диагностики туберкулеза.

1.2.1. Туберкулинодиагностика.

1.2.2. Иммунохимические методы анализа.

1.2.3. Моноклональные антитела в диагностике туберкулеза. ч/ 1.2.4. Маркеры туберкулезной инфекции, используемые в дифференциальной диагностике туберкулеза.

1.2.4.1. Критерии оценки пригодности антигенов М. tuberculosis для серологической диагностики туберкулезной инфекции.

1.2.5. Методы получения и изучения антигенов М. tuberculosis.

1.2.6. Характеристика белковых антигенов М. tuberculosis.

1.2.7. Цитокиновый статус при туберкулезной инфекции.

1.2.8. Биохимические маркеры, отражающие локальный иммунный ответ к туберкулезу.

1.2.9. Цитокиновые маркеры при активном туберкулезе.

1.2.10. Роль IL-12 при характеристике Т-клеточного иммунитета туберкулезной инфекции.

1.3". Технология иммунного мониторинга туберкулезной инфекции.

1.3.1. Иммунологические маркеры туберкулезной инфекции.

1.3.2. ELISPOT-технология в диагностике микобактериальных инфекций.

1.3.3. Разработка и применение granzyme B-ELISPOT-анализа.

1.4. Антигены в специфической диагностике туберкулеза.

1.4.1. Белки культурального фильтратаМ tuberculosis.

1.4.2. Клеточные (морфологические) тесты в диагностике туберкулеза.

1.5. Коммерческие тесты на выявление туберкулезной инфекции.

1.6. Клеточный иммунитет при туберкулезной инфекции.

1.6.1. Генетические основы различий в резистентности к туберкулезной инфекции.

1.6.2. Клеточные медиаторы иммунного ответа.

1.6.3. Применение цитокиновых костимуляторов.

1.7. Методы структурного анализа. 1.7.1. Модель антиген-специфического тетрамерного комплекса с антиген презентирующими клетками.

1.8! Тёхнология ¡T-SP0T.

1.8;1. .Современные тенденции в диагностике туберкулеза.

1.8;2; Клиническое использование тестов.

1.8:2.1. Новые Т-клеточные тесты при диагностике латентного туберкул еза100 1.8-3. Чувствительность новых тестов при исследовании активного туберкулеза с коинфекцией;.V.109

Глава 2£. Материалы и методы.11Г

Глава 3; Результаты и их обсуждение;.

3 ; 11 Разработка'методов лабораторной диагностики гепатита А. 1'41>.

3.1.1. Диагностическая тест-система для выявления lgM-ангител к вирусу гепатита А.

3.1.2. Разработка тест-системы иммуноферментной для выявления

IgG-антител к вирусу гепатита А-.!.15#

3.1.2.1. Аналитические и диагностические характеристики разработанной тест-системы.

3.2; Роль МКА в диагностике маркеров ВГА.

3.3. Консерванты.

3.4. Разработка методов диагностики туберкулеза с использованием рекомбинантных белков М' tuberculosis.

3.4.1. Выбор высокоспецифичных белков для серологической диагностики туберкулеза;.

3.4.2. Выбор видоспецифичных антигенов М. tuberculosis для тестирования в ИФА и IFN-y-анализе.i.

3.4.3. Выбор экспрессирующего вектора для конструирования рекомбинантной молекулы, несущей ген^ кодирующий аминокислотную последовательность целевогобелка.

3.4.4. Конструирование рекомбинантных молекул, несущих гены, кодирующие видоспецифичные белки М tuberculosis.

3.4.5. Информационный поиск генов esxA, esxB и mpt64, и дизайн праймеров для синтеза ампликонов, включающих эти гены.

3.4.6. Оптимизация условий для наработки рекомбинантных белков.

3.4.7. Оценка рекомбинантных видоспецифичных белков М. tuberculosis в

ИФА, IFN-y-анализе на клинических изолятах.181?

3:47.1 . Описание структуры^гибридных белков ESАТ-6 и GFP10.

3.4:7^2. Оптимизация условий для выделения и очистки рекомбинантных белков.;.„.;.

3.5. Клинико-диагностические исследования рекомбинантных белков

Mí tuberculosis;.:. .v.;.

3.6; Выбор конъюгата.'.'.'.

3.6.1. Синтез биотинилированных конъюгатов.

3:7. Подтверждающие тесты на туберкулезную инфекцию иммуноблот-анализ);.

3:7.1. ПЦР в качестве подтверждающего теста. i. .215г

3.8; Функциональный анализ.;.219i

3.8. И Технология IFN-y-анализа и IFN-y-ELISPOT-анализа в диагностике туберкулеза легких.

3.8:2. Клинические аспекты применения IFN-y-анализа.

3.8.3; IFN-y ответ прихтимуляции периферической крови среди больных туберкулезом легких в процессе антитуберкулезной терапии.

3.9/ EbISPOT-анализ.

3.9.1. Применение технологии ELISPOT для оценки специфического иммунного ответа на^беркулезную инфекцию.:.

3.9:21 Набор компонентов для выявления туберкулеза.

3.9:2; 1. Технологическая схема'проведения IFN-y анализа с применением видоспецифических антигенов М. tuberculosis rESAT-6 и rCFPlOl.

3.9.3. ВИЧ-ассоциированный туберкулез.

ЗЛО. Диагностика ВЛКРС.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнологические основы диагностики вирусных и бактериальных инфекций человека и животных"

Актуальность проблемы. Распространенность инфекционно-воспалительных заболеваний вирусной или бактериальной этиологии, трудности их специфической индикации (диагностики) обусловливают необходимость поиска и разработки новых методов, позволяющих выявить возбудитель и активность процесса. Среди заболеваний инфекционной природы, такие как туберкулез и вирусные гепатиты, устойчиво занимают доминирующее положение (Онищенко Г.Г., 2010). Частота заболеваний вирусным гепатитом А в нашей стране и в мире- составляет в структуре регистрируемых вирусных гепатитов.в последние годы не менее-50 %, а< в 20091 году в России! достигла 55 %. Разработка и* внедрение в- практику здравоохранения методов* диагностики* гепатита А является; одним из актуальных направлений профилактики и лечения этой широко распространенной инфекции.

Около трети населения- в мире инфицировано преимущественно-микобактериями вида М. tuberculosis' (WHO," 2008), в России инфицированность превышает 80 %. По заболеваемости и числу больных туберкулезом Россия, по-прежнему, входит в' число стран с самой, неблагоприятной^ ситуацией по" туберкулезу. По данным ВОЗ за 2007 г., число впервые заболевших туберкулезом в нашей стране составило* 157 тыс. (заболеваемость 110 на 100000 населения). Распространение ВИЧ-инфекции», становится отягощающим- фактором, для активизации туберкулезной инфекции: Особенностью туберкулеза, как одной-из. хронических инфекций, является преобладание случаев'латентной, абациллярной форм и бактерионосительства. Традиционные методы диагностики, такие как рентгенография и бактериоскопия мокроты, туберкулинодиагностика не всегда эффективны. ПЦР; один из самых чувствительных современных методов молекулярной диагностики, не позволяет выявить всех больных. Существенным недостатком ПЦР также является невозможность оценить активность туберкулезного процесса. Наряду с этими методами основная роль принадлежит, несомненно, методам серологической диагностики, направленным на определение антител, а также антигенов возбудителя в крови и других биологических жидкостях организма. Ее основной проблемой остается низкая специфичность и чувствительность применяемых антигенов. Для постановки окончательного диагноза туберкулез требуется сравнение результатов, полученных разными методами; Развитие методов определения клеточного иммунитета напрямую связано с разработкой новых методов идентификации Т-клеточных компонентов крови, имеющих прямое отношение к иммунной системе (Pai М., 2006; Lalvani А. 2007, 2001; Bellete В., 2002; Clark S.A., 2007). Высокая^ разрешающая способность этих методов позволяет оценивать i антигенстимулированную продукцию цитокинов, что очень важно» для; оценки специфического иммунного ответа. Разработка новых технологий, в том. числе на» основе выявления Т-клеточньдх маркеров,- является крайне важной! для: нашей! страны ив настоящее время г входит в разряд наиболее актуальных проблем? современной медицины. ' :

Лейкоз крупного рогатого скота заболевание опухолевой, природы, широко распространенное по всему миру (МигакашкК. et aU, 2011; Acaite Jtet al., 2007; Храмцов B.B. с соавт., 2005; Смирнов П.Н., 2007). В* РФ, согласно* данным Прихватиловой Л.Б. с соавт. (1998); Еулюкина М.И. и соавт. (2003), лейкоз крупного рогатого скота занимает лидирующее место и составляет 57 % от других нозологий. 60 % инфицированных животных, не имеет клинических признаков; инфекции (Keitmann R. et al., 1994), и только выявление специфических антител серологическими методами; или выявление провирусной ДНК с использованием молекулярно-биологических методов позволяет идентифицировать заболевание. Большинство структурных белков BJIKPC проявляет иммуиогенность, . что позволяет с достаточной достоверностью выявлять антитела у инфицированных животных. Образование антител является первоначальным ответом животного на ВЛКРС-инфекцию (Wittmann W., 1993). С середины 70-х, годов активно разрабатывались различные тест-системы для ¡ диагностики ВЛКРС посредством» ферментов с использованием цитопатогенных свойств вируса, а также для непосредственного обнаружения вирусного генома (Graves D.C. et al., 1977); с помощью полимеразной цепношреакции(EechnerHí et'al., .1996; Бусол В;А. и др., 1999; Mullís K.B. et al., 1986; Naif H.M. et al., 1992; Kuckleburg C.J. et al., 2003). В ГНЦ ВБ «Вектор» создание диагностических средств для выявления вирусных и бактериальных инфекций включает фундаментальные исследования вирусных белков и составляет одно из ведущих направлений деятельности центра. Высокая значимость для общественного здравоохранения и ветеринарии создания новых эффективных средств диагностики явилось основанием для проведения данной работы.

Цель исследования: разработка тест-систем, основанных на определении клеточного и гуморального иммунного ответа на антигены вирусного гепатита А, туберкулеза легких и вируса лейкоза крупного рогатого скота. Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать биоконъюгаты моноклональных антител к нативному антигену вируса гепатита А. Разработать и стандартизовать диагностические иммуноферментные наборы для выявления маркеров вирусного гепатита А.

2. Сконструировать рекомбинантные молекулы, несущие гены, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки М. tuberculosis. Провести предварительную оценку полученных полипептидов на пригодность их для использования в диагностике туберкулеза у человека.

3. Разработать и стандартизовать диагностические тесты с использованием гибридных полипептидов и с применением методов определения способности клеток крови продуцировать IFN-y для выявления туберкулеза человека.

4. На основе использования рекомбинантного белка р24 разработать тест-систему для выявления вируса лейкоза КРС. Сравнить результаты анализа, полученные с использованием разработанной тест-системы, с референс-тест-системами. Научная новизна

Впервые были получены и охарактеризованы биоконъюгаты крысиных моноклональных антител к нативному антигену вируса гепатита А. Разработаны и стандартизованы иммуноферментные тест-системы для выявления и дифференциальной диагностики вирусного гепатита А, обладающие высокой чувствительностью (85-95 %) и специфичностью (90-100 %).

Впервые на основе плазмиды pGEX-2T сконструированы рекомбинантные плазмиды, несущие гены, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки М tuberculosis, такие как rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64. Введение новых плазмид в экспрессирующий штамм Е. coli BL21 позволило получить штаммы-продуценты рекомбинантных белков, несущих в N-концевой части аминокислотную последовательность глутатионтрансферазы (GST) в качестве белка-носителя. Полученные штаммы-продуценты обеспечивали продукцию слитных белков в растворимой форме.

Впервые полученные рекомбинантные белки - rESAT-6, rCFPlO и гАМРТ64 -можно использовать при разработке тест-систем нового поколения для диагностики туберкулеза.

При проведении иммуноферментного и функционального анализа (IFN-y-анализа, IFN-y-ELISPOT-теста) для выявления туберкулеза и подтверждения (опровержения) диагноза использованы рекомбинантные белки, содержащие, на N-конце аминокислотную последовательность глутатионтрансферазы в качестве-вспомогательного белка:

Сравнение с помощью расчетных программ, предсказывающих В-клеточные эпитопы антигенов, показало хорошее совпадение вторичных структур соответствующих районов в рекомбинантных белках и природными, что позволило прийти к заключению о полноценном взаимодействии последних со специфическими иммуноглобулинами без отщепления GST-последовательности.

Впервые разработана схема диагностики лейкоза крупного рогатого скота, на основе серологических методов - ИФА и РИД - с применением рекомбинантного антигена р24, которые использованы в ветеринарии на завершающих этапах оздоровления животных от лейкоза и в хозяйствах, где регистрируются единичные случаи инфекции ВЛКРС. Практическая значимость работы

Получены и сконструированы опытные и экспериментально-производственные серии тест-систем, которые были аттестованы в отделе биологического и технического контроля НПО «Вектор» и испытаны,в ГИСК им. JI.A. Тарасевича в 1990-1991 гг. На разработанную диагностическую тест-систему была утверждена научно-техническая документация. (ВФС 42-331ВС-92), эксперименально-производственный регламент (ЭПР) 373-92. «Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита А «Вектогеп-A-IgM», инструкция по применению тест-системы «Вектогеп-A-IgM».

Разработан двухстадийный вариант экспериментальной коммерческой тест-системы для выявления ВГА, который обладает 100 % чувствительностью и специфичностью и позволяет определять вирусный антиген в природных биологических объектах и лизате инфицированных клеток. Применение крысиных моноклональных антител в диагностике позволяет значительно увеличить специфичность и чувствительность тест-систем.

Разработана и запатентована технология получения рекомбинантных видоспецифических белков rESAT-6, rCFPlO и rAMPT64 М. tuberculosis для диагностики туберкулеза.

Разработанные методы иммунологического мониторинга туберкулезной инфекции, использующие Т-клеточные технологии, позволяют усовершенствовать диагностику туберкулеза.

Создана схема комплексной диагностики ВЛКРС в хозяйствах на завершающих этапах оздоровления животных от лейкоза' и в хозяйствах, где регистрируются единичные случаи, инфекции ВЛКРС на основе иммуноферментного анализа (ИФА) и радиальной иммунодиффузии (РИД). Положения, выносимые на защиту.

1. Разработанные и стандартизованные компоненты диагностических иммуноферментных наборов для выявления маркеров вирусного гепатита А позволили создать высокоэффективные диагностические тест-системы.

2*. Плазмиды pTSE6, рТВ232 и рТВ323 содержат гены, кодирующие рекомбинантные видоспецифичные высокоиммуногенные белки; М. tuberculosis. При введении этих плазмид в клетки Е. coli (BL21) обеспечивается, продукция рекомбинантных белков rESAT-6, rCFPlO и гАМРТ64 в растворимой' форме в количествах, достаточных для проведения диагностики туберкулеза.

3. Разработанная методика получения, выделения и очистки рекомбинантных белков rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64 в растворимой форме из штаммов-продуцентов, а также полученные рекомбинантные генетические конструкции на основе плазмиды pGEX-2T, включающие гены, кодирующие секретируемые белки М. tuberculosis, и экспрессирующий штамм BL21, могут быть представлены в виде технологической схемы для разработки лабораторного регламента по производству этих белков.

4. Рекомбинантные белки rESAT-6, rCFPlO и гАМРТ64 применимы в качестве компонентов в иммуноферментном анализе, у-интерфероновом анализе и в у-интерфероновом ELISPOT-тесте при диагностике туберкулеза без проведения протеолитического отщепления аминокислотной последовательности белка-носителя от аминокислотной последовательности целевого белка. Исследование клинического материала позволило оценить возможности гибридных белков в диагностике туберкулеза.

5. Комплексная диагностика вируса лейкоза крупного рогатого скота с использованием серологических тестов (РИД, ИФА) позволяет с большей эффективностью проводить обследование хозяйств с различной степенью инфицированности^лейкозом крупного рогатого скота. Структура и объем диссертации'

Диссертация изложена на 365 страницах машинописного текста,и состоит из, введения; обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы. «Результаты, m обсуждение», заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 545 работ. Работа иллюстрирована,59 рисунками.и включает 39 таблиц. Апробация работы и публикации

Материалы, изложенные в диссертационной работе, были представлены« на следующих международных и научно-практических конференциях: «Инфекционной службе г. Новосибирска - 90 лет». Научно-практическая конференция Новосибирск, 1994; конференция «Проблемы биологической и экологической безопасности»,. Оболенск, 2000 г.; 8-я.международная конференция «СПИД, рак и родственные проблемы» Санкт-Петербург, 2000 г.; International Conference American Thoracic Society San Francisco; California, 2001; IIth ERS Annual Congress Berlin, Germany, 2001; Всероссийская научно-практическая конференция, г. Иркутск, 2002; «VII Российский съезд фтизиатров», Москва, 2003 г.; Международная' конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний», ГНЦ ВБ «Вектор», 2004 г.; «Актуальные вопросы ветеринарии: Сибирская, международная научно-практическая конференция», Новосибирск, 2004; Keystone Symposia. "Tuberculosis: Integrating Host and Pathogen Biology"; Whistler, British Columbia, Canada, 2005; «Проблемы, инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера»: III Российская научная конференция с международным участием, Новосибирск, 2006 г.; The International Simposium "EU-Russia: Prospects for Cooperation in Biotechnology in the Seventh Framework Programme", St-Petersburg,

Russia, 2006; Четвертый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2007 г.; II Российско-германская конференция форума Коха - Мечникова. «Туберкулез, спид, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении», Томск, 2007 г.; Vaccine Congress, Amsterdam, the Netherlands, 2007; Международная' научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней», Минск, 2007; «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными! инфекционными заболеваниями на юге России», Научно-практическая конференция,' Ставрополь, 2007; "New Technology in medicine and experimental biology", Pattaya - Bangkok, Thailand, 2007.

Работа выполнена в 1989-2009 гг. в рамках научных тем организации' и* международных проектов: грант МНТЦ № 1983р; грант МНТЦ №2019р; грант МНТЦ № 1980р; проект МНТЦ № 2311; проект МНТЦ № 2641.

По теме диссертации опубликовано 18 научных статей, из них 12 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК, 40 тезисов докладов, монография, 1 методическое указание. Получено 2 патента Российской Федерации, один из которых удостоен диплома в номинации «100 лучших изобретений» России».

Личный вклад соискателя

В диссертации обобщены результаты экспериментальных исследований, проведенных в 1989-2009'гг. соискателем в ВНИИ МБ, ГНЦ ВБ «Вектор» и ЗАО «Вектор-Бест». Автор принимал активное участие в развитии и внедрении новых технологий в диагностике социально-значимых вирусных и бактериальных инфекций в СССР и РФ. Автор принимал личное участие в планировании и проведении основного комплекса исследований, результаты которых представлены в диссертационной работе. За помощь, оказанную в проведении диссертационных исследований, автор выражает благодарность Тюнникову Г.И., Майданюку А.Г., Амосову А.Д., Болдыреву А.Н., который под руководством соискателя защитил кандидатскую диссертацию и Смирновой О.Ю. (молекулярно-биологические исследования), Разумову И.А., Локтеву В.Б., Азаеву М.Ш., Носаревой 0:В., Лебедеву Л.Р., а также Двоеглазову Н.Г., Храмцову В.В., Смирнову П.Н. Вклад в работу других авторов отражен в совместных публикациях по теме диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Туманов, Юрий Васильевич

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана диагностическая тест-система «Вектогеп-A-IgM» для выявления антител класса M к вирусу гепатита А методом ИФА. По аналитическим характеристикам (чувствительности - 98-97 %, специфичности - 100 %, времени проведения анализа - 2-2,5 ч); тест-система сопоставима с тест-системами зарубежных- фирм Abbott (США) и La Roche (Швейцария). Тест-система по результатам проведения Госиспытаний, рекомендована Ученым* советом ТИСК. им. JI.A. Тарасевича и Комитетом по производству иммунобиологических препаратов (МИБП) к регистрации.

2. Разработан набор компонентов: «Вектогеп.А-антитела» для выявления IgG-антител к ВГА с чувствительностью^ специфичностью соответственно 98-99 % и 82 %. Аналитическая чувствительность. диагностического набора* «Вектогеп-А-антитела» составила 9,8 ±1,2 мМЕ/мл, принтом? чувствительность референс-тест-системы «ИФА" анти-ВЕА» составила 11,8 ± 1,6 мМЕ/мл.

3. Получены рекомбинантные штаммы Е. coli - продуценты химерных белков-rESAT-6, rCFPIO и гАМРТ64 М. tuberculosis, которые депонированы в коллекции культур-микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ» «Вектор». Предложена технологическая схема» для наработки и; очистки- рекомбинантных белков» rESAT-6, rCFPIO' и гЛМРТ64 в растворимой форме.

4. На примере rESAT-6 и rCFPIO' установлено,- что с использованием рекомбинантных белков возможно выявлять антитела классов G, А и<-М среди разных групп обследуемых, но наиболее высокий показатель выявляемости иммуноглобулинов определен для антител класса G, который составилЛ0 ± 11 % (для IgA - 31,4 %, IgM - 11,8 %).

5. Чувствительность и специфичность выявления IgG антител методом иммуноферментного анализам к рекомбинантным антигенам rESAT-6,. rCFPIO и гАМРТ64, оцененные по образцам сывороток от больных туберкулезом-и здоровых доноров, составила-79 %, 65 %, 81 % и 92-98 %, 95-98 % и 76 % соответственно.

6. Определена корреляция между содержанием1 антител к антигенам микобактерий и активностью процесса. Показаны достоверные различия коэффициента корреляции между активностью процесса (выраженной в баллах) и уровнями антител класса G у больных туберкулезом легких независимо от формы процесса к Е-БЦЖ, к С-БЦЖ (соникат клеток), к E-H37R.v, к C-H37RV (соникат клеток), и только при фиброзно-кавернозном туберкулезе легких отмечалась достоверная корреляция между уровнями антител класса М к E-H37R.v и C-H37Rv и степенью активности процесса.

7. Сравнительный анализ гуморального иммунного ответа больных • на использованные антигены с результатами патолого-гистологического исследования выявил достоверные коэффициенты корреляции между уровнями антител класса G к С-БЦЖ (г=0,476, р<0;04), Е- H37Rv ((г=0,495, р<0,03) и уровнями антител класса М к С-БЦЖ (г=0,448, р<0,04).

7.1. Достоверная» корреляция- между показателями содержания1 антител и» клинико-рентгенологическими признаками- заболевания, и между уровнями антител И' патолого-гистологической картиной заболевания позволили конкретизировать диагностическую значимость уровней антител того или иного класса к определенным антигенам М. tuberculosis.

8. Чувствительность функционального анализа при выявлении маркеров Т-клеточного иммунного ответа (IFN-y), определявшаяся при1 стимуляции мононуклеаров > цельной крови рекомбинантными белками,1 rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64 составила 84-100 %,.80-95 %, 60-78 % соответственно, специфичность -86-100 %, 82-100% и 76-97% соответственно. При использовании пула одновременно трех рекомбинантных белков-- rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64 -специфичность составила! 96,2%, а чувствительность - 89,1%. Разработаны диагностические компоненты^ наборов, позволяющие эффективно оценивать состояние клеточного иммунитета при туберкулезной инфекции.

9. Разработан алгоритм использования серологических тестов* (РИД, ИФА) и молекулярно-биологических методов4 (ПЦР, «nested»-Enj,P) для обследования хозяйств с различной степенью инфицированности по лейкозу крупного рогатого скота (неблагополучные и благополучные):

- иммуноферментные методы определения антител к BJIKPC позволяют дополнительно к РИД выявлять до 15,3 % животных, инфицированных BJIKPC, в зависимости от эпизоотической ситуации по инфекции BJIKPC. Установлено, что 71 % сомнительных в РИД проб по результатам ИФА содержат антитела к BJIKPC. С целью рационального использования иммуноферментного теста рекомендуется применять его при первичном разделении неблагополучного стада и на завершающей стадии оздоровления.

- доля животных, инфицированных ВЛКРС и выявленных разными методами, составила: для РИД - 76,1 %, для ИФА - 83,3 %, для ПЦР - 58,3 %, для «г^ес!»-ПЦР - 72,6 %. Для максимального выявления всех инфицированных ВЛКРС животных необходимо комбинированное использование серологических (РИД, ИФА) и молекулярно-биологических (ПЦР, «пе81е<3»-ПЦР) методов диагностики.

- у гематологически больных лейкозом животных наличие ВЛКРС было подтверждено методами РИД, ИФА и ПЦР в 100 % случаев.

Как видно из приведенных результатов, новые методологии, применяемые в диагностике инфекционных заболеваний, могут эффективно дополнять друг друга, развивая, таким образом, систему доказательной медицины и ветеринарии, в диагностике инфекционных заболеваний человека и животных. 3.11. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мониторинг туберкулезной инфекции с использованием методов функционального анализа

Лабораторная диагностика туберкулеза включает в себя методы- выявления инфекционной этиологии заболевания и методы- определения патологических изменений в органах, вызванных- инфекционным процессом. Диагностическая' ценность каждого из используемых тестов различна и зависит как от особенностей самого' теста, так и- от применения его в» определенные периоды заболевания. Молекулярно-биологические методы позволяют достаточно быстро с высокой специфичностью и чувствительностью проводить выявление и типирование микобактерий в различных клинических образцах. Чувствительность технологии ПЦР составляет 10-100 клеток на пробу. Однако существенным недостатком ПЦР-анализа является невозможность оценить активность туберкулезного процесса. В литературе известно порядка 1500 белков М. tuberculosis комплекса- Функционально исследовано* около 200 белков. Большинство антигенов, проявляющих высокую иммунологическую реактивность, не удовлетворяет диагностическим критериям из-за низкой чувствительности и специфичности. Пулы культуральных фильтратов белков М. tuberculosis содержат посторонние белки с перекрестной реактивностью, что снижает диагностические параметры при диагностике туберкулеза. Исходя из анализа литературных данных, нами были выбраны два белка, проявляющие наиболее высокую специфичность в диагностике туберкулеза - это белки ESAT-6 и CFP10. Мы применяли гибридные белки ESAT-6 и CFP10, содержащие в составе белковый носитель глутатион-S-трансферазу. Данный подход в получении гибридных белков является наиболее доступным в практической реализации, т.к. не требует предварительной работы по очистке и выделению промежуточных фракций, а конечный продую1 выделяется с использованием аффинной хроматографии на колонке. В качестве микобактериальных антигенов для исследований были также использованы? культуральные фильтраты» М. tuberculosis H37Rv, туберкулин (PED). Туберкулин-был открыт в конце XIX, века немецким врачом Робертом* Кохом и» впервые применен для диагностики, в. 1907 г. Пирке. Реакция* Манту (кожная пробам с туберкулином) применяется для- исследования напряженности иммунитета к М. tuberculosis в' реакции на, туберкулин. Развитие новых методов Т-клеточнои иммунологии напрямую связано с разработкой новых методов идентификации Т-клеточных компонентов крови (табл. 39). Некоторые формы туберкулеза (остро прогрессирующие) не могут быть выявлены методом профилактических обследований из-за схожести рентгенологической картины- с неспецифцческими заболеваниями легких. Единственным методом достоверной диагностики в таких случаях является прямая бактериоскопия мокроты или методы Т-ютсточной технологии (IFN-y-анализ, IFN-y-ELISPOT-анализ). Сущность IFN-y анализа заключается« в in vitro - детекции клеточных медиаторов иммунного ответа при стимуляции видоспецифическими антигенами цельной клеточной культуры крови с образованием в плазме крови продукции IFN-y. Выявление уровня секреций IFN-у, но не других цитокинов (а их известно несколько десятков), коррелйрУет со стадией и степенью туберкулезной инфекции, уровнем иммунного ответа и вероятностью прогрессирования активной- формы туберкулеза по схеме, инфицирование - латентная стадия- - активизация процесса. Уровень IFN-Y среди здорового контингента не превышает предельные значения (> 300 пг/мл IFIST-Y или 1,2-1,7 МЕ/мл IFN-y), соответствующие группе риска или больных туберку-*16301*1' Специфичность рекомбинантных белков в IFN-y-анализе туберкулеза оказЫ^ается выше, чем PPD-туберкулина. Около 70 % жизнеспособных клеток способны .давать иммунный ответ при стимуляции видоспецифическими антигенами М. tuberculosis.

Кроме того, они являются значительным жизнеспособным ресурсом ДНК, необходимым для проведения НЬА-типирования и ПЦР-анализа. Культурально подтвержденная чувствительность метода при активном туберкулезе для гЕ8АТ-6 и гСБРЮ - 85-94 %. При этом чувствительность кожной пробы составила 54-71 %. Специфичность исследованных антигенов в функциональном анализе составила^ для гЕБАТ-б - 92-98 %, для гСРР10 - 89-98 %. Другие диагностические тесты -флюорографические, микробиологические, микроскопические способны выявить

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Туманов, Юрий Васильевич, Кольцово

1. Азаренок К.С., Семенов В.М. Способ обнаружения антигенов и антител с помощью белка А стафилококка. // Лабор. дело. 1987. - № 4. - С. 304-307.

2. Акатов А.К. Белок А золотистого стафилококка. // ЖМЭИ. 1977. - № 5. -С. 5-10.

3. Андросова М.В., Владимирский М.А., Алексеева Г.И. Иммунологический метод идентификации Mycobacterium tuberculosis и M.bovis BCG на основе применения моноклональных антител. // Пробл. туберкулеза. 1989 - № 6. - С! 1216.

4. Аутеншлюс А.И., Столярова В.М., ГавриловаЛ.О: Критерии лабораторной-диагностики бактериальных инфекций и токсоплазмоза у новорожденных и детей раннего возраста. Новосибирск, 1994. 132с.

5. Бурба Л.Г. Лейкозы, и злокачественные опухоли животных. // Под ред. Шишкова В.П., Бурбы Л.Г.- М.: Агропромиздат, 1988. -,5971с.

6. Сергеев В. А., Орлянкин Б. Г. Структура и биология вирусов животных. М.: Колос, 1983. 336 с.

7. Бусол В.А., Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Цымбал В.И. Тест-система для выявления ВЛКРС полимеразной цепной реакцией. // Ветеринария. 1999. -№. 6. - С. 27-30.

8. Визель А.А., Гурылева М.Э. Туберкулез. // Под ред. М.И. Перельмана. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. - 208 с.

9. Вирусные гепатиты. Жданов В.М. и др., АМН России М: Медицина, 1986 г.

10. Владимирский М.А. Иммунологические и биотехнологические методы повышения эффективности диагностики и лечения туберкулеза: Автореф. дис. д-ра мед. наук. — М., 1993.

11. Гладкова С.Е., Решетников С.С., Пряхина В.Н. Опыт применения тест-системы "АТ-Туб-Бест" для диагностики туберкулеза. // Новости "Вектор-Бест". -2006. -№ 4(42). С. 3-7.

12. Донченко А.С., Донченко В.Н. Туберкулез крупного рогатого, скота, верблюдов, яков, овец и пантовых оленей. М.: Новосибирск, 1994. 353 с.

13. Жданов В.М. Нерешенные вопросы вирусных гепатитов. Вирусные гепатиты / Под ред. В.М. Жданова и Е.С. Кетиладзе. М., 1984:7-11.

14. Ильницкий Р.И., Сахарчук И.И., Дудка П.Ф. Синдром плеврального выпота: дифференциальная диагностика и лечебная тактика. // Український пульмонологічний журнал. 2004. - №. 3. - С. 64-68.

15. Линникова М.А., Лямда-Геллер Б.А. Получение высокоочищенной фракции очищенного сухого туберкулина, ее химическая и биологическая характеристика. // Пробл. туберкулеза. 1963. - № 89. - С. 67.

16. Карпов A.B., Задубровская Н.Д., Евдокимов В:Н. Возможности иммунохроматографического метода выявления туберкулеза.- //Пробл. туберкулеза. 2000. - №. 4. - С. 8-10.

17. Карпов A.B. Экономическая целесообразность и медицинская эффективность методов активного выявления туберкулеза. // Пробл. туберкулеза. -2000. С. 3-5.

18. Классификация и номенклатура вирусов позвоночных: учебное пособие. // Пер. и ред. В:Ю.Луговцева,.Д.А.Васильева. Ульяновск, -2002. 268с.

19. Малюченко Н.В., Агапов И.И., Тоневицкий А.Г., Мойсенович М.М., Савватеев М.Н., Тоневицкий Е.А., Быков В.А., Кирпичников М.П. Детекция иммунных комплексов с помощью атомно-силовой микроскопии. // Биофизика. -2004. Т. 49(6). - С. 1008-1014.

20. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - 480 с.

21. Милькаманович В.К. Диагностика и лечение болезней органов дыхания. Минск: Полифакг-Альфа, 1997. 360 с.

22. Мирлина Е.Д., Ланцов В.А. Диагностические возможности метода ПЦР при генитальном туберкулезе у женщин. // Пробл. туберкулеза. 1998. - №1. - С. 2226.

23. Москалик Р.С Ускоренный метод ликвидации лейкоза крупного рогатого скота на племпредприятиях. Москалик P.C. Прионные и ретровирусные инфекции животных. Бюлл. ВНИИЭВ.- М., 1996. - Вып. 77.

24. Поспелов Л.Е., Серова Л.Д., Маленко А.Ф. и др: Изучение связи распределения, антигенов локуса HLA-DR и туберкулеза в различных популяциях. // Пробл. туб. 1987. - №. 10. - С. 54-56.

25. Поспелов Л.Е., Серова Л.Д., Калинина Н.М. HLA-DR-антигены у больных туберкулезом и. здоровых ревакцинированных БЦЖ лиц. // Проблемы туберкулеза и болезни легких. 2003. - №. 2. - С. 82-83.

26. Прихватилова Л.Б., Ломакин А.И., Колосов С.Н., Дрыгин В.В., Рыбаков С.С., Гусев A.A. Диагностика лейкоза! КРС методом' полимеразно-цепной реакции. // Вестник РАСХН. -1998i №. 5. - С. 65-6S.

27. Решетников С.С., Гладкова С.Е., Офицеров В.И. Новая тест-система для серодиагностики туберкулеза. // Новости «Векгор-Бест». 1998. - №. (9). - С. 3-7.

28. Решетников С.С. Применение набора реагентов «АТ-Туб-Бест» для диагностики туберкулеза (вопросы и ответы). // Новости «Вектор-Бест». 2007. -№. (46). - С. 8-9.

29. Салина Т.Ю., Морозова Т.И. Интерферон g и ИГГ -а\т к М. tuberculosis в сыворотке крови больных активным туберкулезом легких. // Пробл. туб. 2004. -№. 11.-С. 43-45.

30. Стародуб Н.Ф., Стародуб В.Н. Инфекционный лейкоз крупного рогатого скота и его диагностика. // Бюшшмери i клггина. 2003. - Т. 19. - №. 4. - С. 307316.

31. Смирнов П.Н., Смирнова В.В., Левашева А.Т. и др. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота: метод, рекоменд. Новосибирск. 1989. 46с.

32. Смирнов П.Н. Болезнь века лейкоз крупного рогатого скота: Новосибирск, 2007. 302с.

33. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В:, Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней-животных. М.: Агропромиздат, 1991. - С.38-50.38.' Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я, Соловьев B.Bi, Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. М: 1998. 928с.

34. Титаренко О.Т., Дьякова М.Е., Перова Т.Л., Ряснянская Т.Б. Активность аденозиндезаминазы и ее изоферментов у больных с различными формами туберкулеза. // Пробл. туберкулеза. 2002. - №. 3. - С. 43-45.

35. Файзулин Р.З., Чекишев В.М. Универсальные реагенты для диагностики инфекционных болезней- животных в иммуноферментном анализе. // Диагностика инфекционных болезней животных: Сб. науч. тр. РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. Новосибирск, - 1993. - С. 55-63.

36. Харитонов М.В., Гамиров Р.Г., Хамитова С.А. Неспецифические реакции на туберкулин и факторы, обуславливающие их. // Ветеринарный» врач. 2003. - №. 4 (12). -С. 34-37.

37. Хоменко А.Г., Литвинов В.И., Чуканова В.П. и др. Антигены комплекса HLA у больных туберкулезом и здоровых лиц в различных популяциях. // Иммунология. 1985. -№. 1.-С. 22-24.

38. Acaite J:, Tamosiunas V., Lukauskas K., Miliüs» J:, Pieskus Ji. The* eradication* experience of enzootic bovine leukosis from Lithuaniá; // Preventive Veterinary Medicine- 2007. V. 82. - N. 1-2. - P. 83-89.

39. Adjei A.A., Armah H., Duah O.A., Adiku T., Hesse I.F. Evaluation of a rapid serological chromatographic immunoassay for the diagnosis of pulmonary tuberculosis in Accra, Ghana. Jpn. // J. Infect. Dis. 2003. - V. 56. - P. 161-164.

40. Affatato S., Bersaglia G., Emiliani D., Foltran I., Ton A. Sodium-azide versus ProClin 300: influence on the morphology of UHMWPE particles generated in laboratory tests. // Biomaterials. February. 2004. - V. 25. - N 5. - P. 835-842.

41. Alastair Gracie J., Robertson S.E. Mclnnes I.B; Interleukin-18: // J. Leuk. Biol: -2003.-V. 73.-P. 213-224.

42. Al-Attiyah R„ Shaban F.A., Wiker H.G., Oftung F., Mustafa A.S. Synthetic peptides identify promiscuous human Thl cell epitopes of the secreted mycobacterial antigen MPB70. //Infect. Immun. 2003. - V. 71. - P. 1953-1960.

43. Al-Attiyah R., Mustafa A.S. Characterization of human cellular immune responses to novel Mycobacterium-tuberculosis antigens encoded'by genomic regions absent in Mycobacterium bovis BCG. // Infect: Immun: 2008. - V. 76. - P. 4190-4198.

44. Altman J.D., Moss P.A. H1., Guolder P.J: R., Barouch.D.H., McHeyzer-Williams M.G., Bell J.I., McMichael A.J'., Davis M.M. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. // Science. 1996. - V. 274. - P. 94-96.

45. Andersen P., Munk M.E., Pollock J.M., Doherty T.M. Specific immune- based diagnosis of tuberculosis. // Lancet. 2000. - V. 356. - P. 1099-1104.

46. Andersen A.B., Hansen E.B. Structure and mapping of antigenic domains of protein antigen b, a 38,000-molecular-weight protein of Mycobacterium tuberculosis. // Infect. Immun. 1989. -V. 57. -N 8. - P. 2481-2488.

47. Anderson B.L., Welch- R.J., Litwin C.M." Assessment of three commercially available serologic assays for detection of antibodies to Mycobacterium tuberculosis and' identification of active tuberculosis. // CVI. -2008. V. 15. - P. 1644-1649:

48. Archna.Sharma, Abhik Saha, Surajit Bhattacharjee, Subrata Majumdar, Sujoy K. Das gupta specific and randomly derived immunoactive peptide mimotopes of mycobacterial antigens. // CVI. 2006. - V. 13. -N. 10. - P. 1143-1154.

49. Arend S.M., Engelhard A.C.F., Groot G., DeBoer K., Anderson P., Ottenhoff T.H.M., van Dissel J.T. Tuberculin skin testing compared to T-cell response to

50. Mycobacterium tuberculosis-specific antigens for detection of latent infection on persons with recent tuberculosis contact. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001. - V. 8. - P. 10891096.

51. Ballagi-Pordany A., KlintevalLK, Merza M., Klingeborn B., Belak S. Direct detection' of bovine leukemia virus infection: Practical applicability of a double polymerase chain reaction. // J. Vet. Med. 1992. - V. 39B. - P. 69-77.

52. Ballas Z.K., Krieg A.M., Warren T., Rasmussen W., Davis H.L., Waldschmidt M., Weiner G.J. Divergent therapeutic and immunologic effects of oligodeoxynucleotides with distinct CpG motifs. // J. Immunol 2001. - V. 167. - P. 4878-4886.

53. Barnes P.F., WizeliB! Type 1 Cytokines and the pathogenesis of tuberculosis. // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. -2000.-V. 161.-Pi 1773-1774.

54. Bause E. Structural requirements of N-glycosylation of proteins. Studies with proline peptides as conformational probes. //Biochem. J. 1983. - V. 209; - PI 331-336.

55. Bayer E.A., Wilchek M. The use of avidin-biotin complex as a tool in molecular biology. // Meths. Biochem.Anal. 1980. - V. 261. - P. 1-45.

56. Beatty W.E., RhoadesiE.E:, Ullrich HJ;, Chatteijee D;, Heuser JiE., Russell :D:G. Trafficking and release of mycobacterial lipids from infected.macrophages. // Traffic. -2000. -V. 1.-P. 235-247.

57. Beck S.T., Leite O.M., Arruda R.S, Ferreira A.W. Combined use of Western blot/ELISA to improve the serological diagnosis of human tuberculosis. // Braz. J. Infect. Dis.-2005. V. 9. - P: 35-43.

58. Behr M.A., Wilson M.A., Gill W.P., Salamon H., Schoolnik G.K., Rane S., Small P.M. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. // Science. -1999. -V. 284. 5419. P. 1520-1523.

59. Betts J.C., Dodson P., Quan S., Lewis A.P., Thomas P. J., Duncan K., McAdam R.i

60. A. Comparison- of the proteome of Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv with clinical isolate CDC 1551. // Microbiol. 2000. - V. 146. - Pi 3205-3216.

61. Bhattacharyya S., Singla' R., Dey A.B., Prasad H.K. Dichotomy of cytokine profiles in patients and high-risk healthy subjects exposed to tuberculosis. // Infect. Immun. 1999. -V. 67. -N. 11. - P. 5597-5603:

62. Bhaskar S., Khanna S.P., Mukherjee R. Isolation, purification and immunological characterization of novel low molecular weight protein antigen CFP 6 from culture filtrate of M. tuberculosis. I I Vaccine. 2000. - V. 18. - N. 25. - P. 2856-2866.

63. Bloom B.R., Mehra V., Young R.A. Genes for the protein antigens of the tuberculosis and leprosy bacilli. // Bioscience Reports. 1985. - V. 5. - N. 10-11. - P. 839-845.

64. Bock N., Reichman L.B. Tuberculosis and HIV/AIDS: epidemiological and clinical aspects (world perspective). // Semin. Respir. Crit. Care Med. 2004. - V. 25. -P.337-344.

65. Bothamley G.H. Serological diagnosis of tuberculosis. // Eur. Respir. J. 1995. -V. 8 (Suppl. 20). - P. 676-688.

66. Bower W.A., Nainan O.V., Han X., Margolis H.S. Duration of viremia in hepatitis A virus infection. // J.Infect.Dis. 2000. - V. 182 - P. - 12-17.

67. Brock I., Munk M.E., Kok-Jensen A., Andersen P: Performance of whole blood IFN-gamma test for tuberculosis diagnosis based on PPD ou the specific antigens ESAT-6 and CFP-10. // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2001. - V. 5. - P. 462-467.

68. Brock I., Weldingh K., Leyten E. M., Arend S.M., Ravn P, Andersen P. Specific T-cell epitopes, for immunoassay-based diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. // J. Clin. Microbiol. 2004. - V. 42. - P. 2379-2387.

69. Brown F. The classification and nomenclature of viruses: summary of results of meetings of the International Committee on Taxonomy of Viruses in Edmonton, Canada 1987. // Intervirology. 1989. -V. 30(4). - P. 181-186.

70. Bua A., Molicotti P., Delogu G., Pirina P., Mura M.S., Madeddu G. et al. QuantiFERON TB Gold: a new method for latent tuberculosis infection. // New Microbiol. -2007. V. 30. - P. 477^180.

71. Bukhary Z.A. Evaluation of anti-A60 antigen IgG enzyme-linked immunosorbent assay for serodiagnosis of pulmonary tuberculosis. // Ann. Thorac. Med. 2007. — V. 2. -P. 47-51.

72. Burgess L.J., Maritz F.J., Le Roux I., Taljaard J.J. Use of adenosine deaminase as a diagnostic tool for tuberculous pleurisy. // Thorax 1995. - V. 50. - P. 672-674.

73. Burgess L.J., Maritz F.J., Le Roux I., Taljaard J.J. Combined use of pleural adenosine deaminase with lymphocyte/neutrophil ratio: increased specificity for the diagnosis of tuberculous pleuritis. // Chest 1996. - V. 109. - P. 414-419.

74. Burridge M. Fall in antibody titer to bovine leukemia virus in the periparyturient period. // Can. J. Med. 1982. - V. 46. - P. 270-271.

75. Butler W.R., Guthertz L.S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of Mycobacterium species. // Clin. Microbiol. Rev. -2001.-V. 14.-P. 704-726.

76. Carli K.T., Batmaz H., Sen A., Minbay A. Comparison of serum, milk and urine as samples in an enzyme-immunoassay for bovine leukemia virus infection. // Res.Vet.Sci. 1993. - V. 55.-N.3.-P. 394-395.

77. Carli K.T., Sen A., Batmaz H., Kennerman E. Detection of IgG antibody to bovine leukaemia virus in urine and serum by two enzyme immunoassays. // Lett. Appl. Microbiolt- 1999. V. 28. -P. 416-418.

78. Cassone A., Chiani PI, Quinti. I., Torosantucci. A.A possible* participation of polymorphonuclear cells stimulated by microbial immunomodulators in cytokine dysregulated patterns of AIDS patients. // J. Leukocyte Biol-. 1997. - V. 62. - P. 60-66.

79. Chackerian A.A., Perera T.V., Behar S.M. Gamma Interferon-Producing CD4+ T lymphocytes in. the lung correlate with resistance to infection with Mycobacterium tuberculosis. II Infect. Immun. 2001. - V. 69. - N. 4. - P. 2666-2674.

80. Chakravorty S., Tyagi J.S. Novel multipurpose methodology for detection of mycobacteria in pulmonary and extrapulmonary specimens by smear microscopy, culture, and PCR. // Ji Clin. Microbiol. 2005. - V. 43. - N 6. - P. 2697-2702.

81. Chan E.D., Reves R., Belisle J.T., Brennan P.J., Hahn W.E. Diagnosis of tuberculosis by a visually detectable immunoassay for lipoarabinomannan. II Am. J. Respir. Crit. Care Med. -2000. -V. 161. P. 1713-1719.

82. Chehimi J., Marshall J.D., Salvucci O., Frank I., Chehimi S., Kawecki S., Bacheller D., Rifat S., Chouaib S. IL-15 enhances immune functions during HIV infection. // J. Immunol. -1997. V. 158. - P. 5978-5987.

83. Chiang EH., Suo J., Bai K.J., Lin T.P. et al. Serodiagnosis of tuberculosis. A study comparing three specific mycobacterial, antigens // Am.J.Respir Crit. Care Med. Sep. -1997.-V. 156(3ptl).-P. 906-911.

84. Cho S.N. Current issues on molecular and. immunological diagnosis of tuberculosis. // Yonsei Med. J. 2007. - V. 48. -N 3. - P. 347-359. '

85. Chun T., Serbina N.V., NoltD:, Wang B., Chiu N.M., Flynn J.L., Wang C.R. Induction of M3-restricted cytotoxic T lymphocyte responses by N-formylated peptides derived from Mycobacterium tuberculosis. II J. Exp. Med. 2001. - V. 193. - P. 12131220.

86. Clarridge J.E., Shawar R.M., Shinnick T.M., Plikaytis B.B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. // J-. Clin. Microbiol. 1993. - V. 31. - P. 2049-2056.

87. Clark M.F., Adams A.N. Characteristics of the micro-plate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. // J. Gen. Virol. 1977. -V. 34:-P. 475-483.

88. Cleveland M:G., Gorham J.D:, Murphy T.L., Tuomanen E., Murphy K.M. Lipoteichoic acid preparations of gram-positive bacteria induce interleukin-12 through a CD 14-dependent pathway. // Infect. Immun. 1996. - V. 64. - P. 1906-1912:

89. Desem N., Jones S.L. Development of a human gamma interferon enzyme immunoassay and comparison with tuberculin skin testing for detection of Mycobacterium tuberculosis infection. // Clin. Diagn. Lab: Immunol. 1998. -V. 5. - N. 4.-P. 531-536.

90. Diagbouga S., Fumoux F., Zoubga A., Sanou P.T., Marchal G. Immunoblot analysis for serodiagnosis of tuberculosis using a, 45/47-kilodalton antigen complex of Mycobacterium tuberculosis. II Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1997. - V. 4. - P. 334-338.

91. Djelouadji Z., Raoult D., Daffé M., Drancourt M.A Single-step sequencing method 3. for the identification of Mycobacterium tuberculosis complex species. // PLoS Negl. Trop. Dis. 2008. - V. 2. - N. 6i e253. - P: 1-8.

92. Dolz G., Moreno E. Comparison of agar gel immunodiffusion test, enzyme-linked immunosorbent assay and western blotting for the detection of BLV antibodies. // Zentralbl. Veterinarmed. 1999. - V. 46B. - P. 551- 558.

93. Dorokhov Y.L., Sheveleva A.A., Frolova O.Y., Komarova T.V., Zvereva A.S., Ivanov P.A., Atabekov J.G. Superexpression of tuberculosis antigens in plant leaves. // Tuberculosis (Edinb). 2007. - V. 87. - N. 3. - P. 218-224.

94. Dosanjh N.S., Rawat M., Chung Ji-Hae, Av-Gay Y. Thiol specific oxidative stress response in Mycobacteria. // FEMS Microbiology Letters. 2005. - V. 249. - P. 87-94

95. Drancourt M., Carrieri P., Gevaudan M.J., Raoult D. Blood agar and: Mycobacterium tuberculosis: the end of a dogmai // J. Clin.' MicrobioL 2003. - V. 41. -N. 4*.-P. 1710-1711.

96. Drancourt M., Raoult D. Cost-effectiveness of blood1 agar for isolation of mycobacteria. // PLoS Negl. Trop. Dis. 2007. - V. 1. -N. 2\ e83. - P. 1-5.

97. Eaves F.W., Molloy B.Y, Dimmock C.K, Eaves L.E. A, field evaluation of the polymerase chain reaction procedure for the detection of bovine leukemia virus proviral DNA in cattle. // Vet. Microbiol. 1994. - V. 39. - P. 313-321.

98. Ekerfelt C., Ermerudh J., Jenmalm M.C. Detection of spontaneous and antigen-induced» human' interleukin-4 responses in vitro: comparison of ELISPOT, a novel'ELISA and real-time RT-PCR. // J. Immunol. Meths. 2002. - V. 260. -N. 1-2. - P. 55-67.

99. Elhay M. J., Oettinger T., Andersen P. Delayed-Type Hypersensitivity Responses to ESAT-6 and MPT64 from Mycobacterium tuberculosis in the guinea pig. // Infect. Immun. -1998. V. 66. - N. 7. - P. 3454-3456.

100. Ellner J.J., Hirsch C.S., Whalen C.C. Correlates of protective immunity to M tuberculosis in humans. // Clin. Infect. Dis. 2000. - V. 30 (Suppl 3). - P. 279-282.

101. Ewer K., Millington K.A., Deeks J.J., Alvarez L., Bryant G., Lalvani A. Dynamic antigen-specific T-cell responses after point-source exposure to Mycobacterium tuberculosis. // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 2006. - V. 174. - P. 831-839:

102. Fayolle C., Ladant D., Karimova G., Ullmann A., Leclerc C. Therapy» of murine tumors with recombinant Bordetella pertussis adenylate cyclase carrying a cytotoxic T cell epitope. // J. Immunol. 1999. - V. 162. - P: 4157-4162.

103. Ferrand R.A., Bothamley G.H., Whelan A., Dockrell H.M. Interferon-gamma responses to ESAT-6 in tuberculosis patients early into and after anti-tuberculosis treatment. // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2005. - V. 9(9). - P. 1034-1039.

104. Ferrara G., Losi M., D'Amico R., Roversi P., Piro R., Meacci M., Meccugni B., Dori I.M., Andreani A., Bergamini B.M., Mussini C., Rumpianesi F., Fabbri L.M.,

105. Richeldi L. Use in routine clinical practice of two commercial blood tests for diagnosis of infection with Mycobacterium tuberculosis: a prospective study. // Lancet. 2006. - V. 367.-P. 1328-1334.

106. French G.A., Tech R., Chan C.Y., Humphires M.J., Cheung S.W., O'Mahoney G. Diagnosis of tuberculous meningitis by detection of tuberculostearic acid in cerebrospinal fluid. // Lancet. 1987. - V. II. - P. 117-119.

107. Fridman W.H, Tartour E. Cytokines and cell regulation: // Mol. Aspects. Med. -1997.-V. 18(1).-P. 3-90.

108. Gaines H., Andersson L., Biberfeld G. A new method* for measuring lymphoproliferation at the single-cell level in whole blood cultures by flow cytometry. // J. Immunol. Meths. 1996. -V. 195. - P. 63.

109. Gomez M., Johnson S., Gennaro M.L. Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach. // Infect. Immun. 2000. — V. 68.-N. 4.-P. 2323-2327.

110. Goto M., Noguchi Y., Koyama H., Hira K., Shimbo T., Fukui T. Diagnostic value of adenosine deaminase in tuberculous pleural effusion: a metaanalysis. // Ann. Clin. Biochem. 2003. - V. 40. - P. 374-381.

111. Graves D.C., Diglio C.A., Eerber. J.F. A reverse transcriptase assay for detection of the bovine leukemia virus. // Ami J. Vet: Res. 1977. - V. 38. - P. 1739-1744.

112. Greco S., Girardi E., Masciangelo R., Capoccetta G.B., Saltini C. Adenosine deaminase and interferon gamma measurements for the diagnosis of tuberculous pleurisy: a meta-analysis. // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2003. - V. 7. - P. 777-786.

113. Guermonprez P., Fayolle C., Karimova G., Ullmann A., Leclerc C., Ladant. D. Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin: a vehicle to deliver CD8-positive T-cellepitopes into antigen-presenting cells. // Methods Enzymol. 2000. - V. 326. - P. 527542.

114. Guermonprez P., Fayolle C., Rojas M.J., Rescigno M., Ladant D., Leclerc C. In vivo receptor-mediated delivery of a recombinant invasive bacterial toxoid to CDllc+ CD8alpha-CDllb high dendritic cells. // Eur. J. Immunol. 2002. - V. 32. - P. 30713081.

115. Gutiérrez G., Alvarez I., Fondevila N., Politzki R., Lomónaco M., Rodríguez S., Dus Santos M.J., Trono K. Detection of bovine leukemia virus specific antibodies using recombinant p24-ELISA. // Vet. Microbiol. 2009. - V. 137 - N: 3-4. - P. 224-2341

116. Haley B.E. Mercury toxicity: Genetic susceptibility and synergistic effects. // Medical Veritas. 2005. - V. 2. - P. 535-542.

117. Halpern M.D., Kurlander R.J., Pisetsky D.S. Bacterial DNA induces murine interferon-g production by stimulation« of interleukin-12 and tumor necrosis factor-a. // Cell. Immunol. -1996. -V. 167. P. 72-78.

118. Harboe M., Whelan A.O, Alvund G., Nair M.C., Pollock J.M., Hewinson R.G., Wiker FI: G. Generation of antibodies to the signal peptide of the MPT83 lipoprotein of Mycobacterium tuberculosis. H Scand. J. Immunol. 2002. - V. 55. — P. 82-87.

119. Harboe M., Malin A.S., Dockrell H.S., Wiker H.G., Ulvund G., Holm A., Jorgensen M.C., Andersen P. B-cell epitopes and quantification of the ESAT-6 protein of Mycobacterium tuberculosis. II Infect. Immun. 1998. - V. 66. -N. 2. - P. 717—723.

120. He X.Y., Zhuang Y.H., Zhang X.G., Li G.L. Comparative proteome analysis of culture supernatant proteins of Mycobacterium tuberculosis H37Rv and H37Ra. // Microbes. Infect. -2003. -V. 5. -N. 10. P. 851-856.

121. Hendrickson R.C., Douglass J.F., Reynolds L.D.,. McNeill P.D, Garter D.,. Reed S.G, Houghton R.L. Mass spectrometric identification of Mtb81, a novel, serologiealt marker for tuberculosis. // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. - P. 2354-2361.

122. Heym B., Zhang Y., Pulet S., Young D., Cole S.T. Characterization of the katG gene encoding a catalase-peroxidase required for the isoniazid susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. // J. Bacteriol. 1993. - V.175. - P. 4255-4259:

123. Hewinson R.G., Michell S.L., Russell W.P., McAdam R.A., Jacobs W.R. Jr. Molecular characterization of MPT83: a seroreactive antigen1 of Mycobacterium tuberculosis with homology to MPT70. // Scand. J. Immunol. 1996. - V. 43. - P. 490499.

124. Hoff-Jorgensen R. An international comparison of different'laboratory tests for the diagnosis of bovine leukosis: suggestion for international* standardization // Vet. Immunol, Immunopathol. 1989. - V. 22. - P. 293-297.

125. Horn C., Pescher P., Romain F., Marchai G. Characterization of murine monoclonal antibodies specific for the 45/47 kDa antigen (APA) of Mycobacterium tuberculosis> M. bovis and BGG. // J. Immunol. Meths . 1996. - V. 197. - P. 151-1591

126. Hortin G.L. The MALDI-TOF mass spectrometric view of the plasma proteome and peptidome. // Clin. Chem. 2006. - V. 52. - P. 1223-1237.

127. Huang S.N., Lorenz D., Gerety R.J. Electron and immunoelectron microscopic study on liver tissues of marmosets infected with' hepatitis A virus. // Lab. Investig. -1979.-V. 41.-P. 63-71.

128. HuntD.F., Henderson R.A., Shabnowitz J.,. Sakaguchi K, Michel H., Selilir N. Cox A., Apella E., Engelhard V. H. Characterization of peptides bound to the class I MHC molecule HLA-A2. 1 by mass spectrometry. // Science. 1992. - V. 255. - P. 1261.

129. Hurni W.M., Laufer D., Miller W.J., Ryan J., Watson B. Anti-hepatitis A in the general population and in hepatitis A vaccinees using saliva and serum as diagnostic media. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1993. - V. 694. - P. 289-292.

130. Ichiyama S., Shimokata K., Tsukamura M. The isolation of Mycobacterium avium complex from soil, water and dusts. // Microbiol. Immunol. 1988. - V. 32. - P. 733739.

131. Imaz M.S., Zerbini E. Antibody response to culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis during and after treatment of tuberculosis patients. // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. -2000. V. 4(6). - P. 562-569;

132. Jackett'P.S., Bothamley G.H., Batra H.V., Mistry A., Young D.B., Ivanyi J. II Specificity of antibodies to immunodominant' mycobacterial antigens in pulmonary tuberculosis. II J. Clin. Microbiol. 1988. - V. 26. - N. 11. -P. 2313-2318:

133. Jiang J., Shi H.Z., Liang Q.L., QinS.M., Qin X.J. Diagnostic value of interferon-y in tuberculous pleurisy: a metaanalysis. II Chest 2007. - V. 131. - Pi 1133-1141.

134. Jungblut P.R., Müller E.C., Mattow J., Kaufmann' S.H. Proteomics reveals open reading frames in Mycobacterium tuberculosis H37Rv not predicted by genomics. // Infect. Immun. -2001. V 69. - N. 9. - P. 5905-5907. ■

135. Kadival G. V., Telesforo B. M., Mazarelo O S., Chaparas S. D. Sensitivity and specificity of enzyme-linked immunosorbent assay in the detection of antigen in tuberculous meningitis cerebrospinal fluids. // J. Clin. Microbiol. 1986. - P. 901-904.

136. Kaech S.M., Hemby S., Kersh E., Ahmed R. Molecular and functional profiling of memory CD8 T cell differentiation. // Cell. 2002. - V. 111. - P. 837.

137. Katial R. K., Sachanandani D., Pinney G., LiebermanM. M.' Cytokine production, in cell culture by peripheral1 bloodi mononuclear cells from immunocompetent'hosts. // Clin. Diagrn Labor. Immunol. 1998. - V. 5. -N. 1. - P. 78-81.

138. Katial R. K., Hershey J., Purohit-Seth T., Belisle J. T., Brennan P." J., Spencer J. S.,

139. Engler.R'. Ji Mi Cell-mediated.immune response to tuberculosis antigens: comparison of skin testing and measurement of in vitro* gamma interferon production in whole-blood, culture: // Clin.Diagn. Labor. Immunol. 2001. - V. 8. -N. 2: - P. 339^345.

140. Kintevall K A., Ballagi-Pordany A., Naslund K, Belak S. Bovine lcukemia virus: rapid detection of proviral DNA by nested PCR in blood and organs of experimentally infected calves. // Vet. Microbiol. 1994. - V. 42. - P. 191-201.

141. Kobashi Y., Mouri K., Yagi S., Obase Y., Fukuda M., Miyashita N., et al. Usefulness of the QuantiFERON TB-2G test for the differential diagnosis of pulmonary tuberculosis. // Intern. Med. 2008. - V. 47. - P. 237-243.

142. Kochi A., Vareldzis B., Styblo K. Multi-drug-resistant tuberculosis and its control: // Res. Microbiol. 1993. - V. 144. - P. 104-110.

143. Krieg A. M. CPG motifes in bacterial DNA and their immune effects. // Annu. Rev. Immunol. 2002. - V. 20. - P. 709- 760.

144. Krieg A. M. The role of CpG motifs in innate immunity. // Gurr. Opin. Immunol: -2000.-V.12.-P. 35-43.

145. Kubis P., Rulka J:, Kur J., Dabrowski S. PCR in, the. diagnosis of bovine leukaemia virus infection. // Bull. Vet. Inst. Pulawy. 1996. - V. 40. - P: 85- 89:

146. Kuckleburg C. J., Chase C. C., Nelson E.A., Marras S.A., Dämmen M: A.,

147. Christopher-Hennings J'. Detection of bovine leukemia virus in, blood and milk by nestediand real-time polymerase chain reactions. // J. Vet. Diagn. Invest. 2003. - V. 15. - N 1. -P. 72-76.

148. Kutlu A., Bozkanat E., Cift<?i F., Bozkurt B., Gorur R., Ardi? N., Taskapan O. Effect of active tuberculosis on skin prick allergy tests and serum IgE levels. // J. Investig. Allergol. Clin. Immunol.-2008. V. 18. -N2. -P. 113-118.

149. Laidlaw M. (1989) in Practical Medical Microbiology, eds. Colle, J. G., Duguid, J. P., Fraser, A. G. & Marimon, B, P. (Churchill Livingstone, New York), pp. 399-416.

150. Lalvani A., Brookes R., Hambleton S., Britton W. J:, Hill A. V., McMichaeLA. J. Rapid effector function in CD8+ memory T cells. // J. Exp: Med. 1997a. - V. 186. - P. 859-865.

151. Lalvani A. Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century: new tools to tackle an old enemy. // Chest. 2007. - V. 131. - N 6. - P. 1898-1906.

152. Lau DT, Hewlett AT.Screening for hepatitis A and B antibodies in patients with chronic liver disease. II Am. J. Med. 2005. - V. 118 Suppl 10A. - P. :28S-33S.

153. Lee J.Y., Choi H.J, Park I.N., Hong S.B., Oh Y.M., Lim C.M., et al. Comparison of two commercial interferon-gamma assays for diagnosing Mycobacterium tuberculosis infection. II Eur. Respir. J. 2006. - V. 28. - P. 24-30.

154. Lemus D., Martin A., Montoro E., Portaels F., Palomino J.C. Rapid alternative methods for detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis. // J. Antimicrob. Chemother. -2004. -V. 54. -N 1. P. 130-133.

155. Leung C.C., Yam W.C., Yew W.W., Ho P.L., Tam C.M., Law W.S., Wong M.Y., Leung M., Tsui D. Comparison of T-Spot.TB and tuberculin skin test among silicotic patients. // Eur. Respir J. 2007. - Oct. 24.

156. Lewinsohn D.M:, Briden A.L., Reed S.G., Grabstein K.H., Alderson' M.R. Mycobacterium tuberculosis-reactive* CD8+ T lymphocytes: the relative contribution of classical versus nonclassical HLA restriction. // J. Immunol. 2000. - V. 165. - P. 925930.

157. Licursi M., Inoshima Y., Wu D., Yokoyama T., Gonzales T., Sentsui H. Genetic heterogeneity bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts. // Virus Research. 2002. - V. 86 - P. 101- lilO.

158. Lim R.L., Tan L.K., Lau W.F., Ming M.C., Dunn R„ Too H.P., Chan L. Cloning and Expression of Immunoreactive Antigens from Mycobacterium tuberculosis. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. - V. 7. - N. 4. - P. 600-606.

159. Litwin C.M. // In vitro gamma interferon tests for the detection' of tuberculosis infection: // J: Immunotoxicol: 2007. - V. 4: -N. 3. - P. 219-224.

160. Llames L., Goyache J., Domenech A., de Avila A., Suarez G., Gomez-Lucia E. Rapid» detection of specific polyclonal and monoclonal antibodies, against bovine leukemia,virus. // J. Virol. Meth. 1999. -V. 82. - P. 129-136.

161. Lorenz H.-M., Hieronymus T., Grunke M., Manger B., Kalden J.R. Differential role for IL-2 and IL-15 in the inhibition of apoptosis in short term activated human lymphocytes. // Scand. J. Immunol. 1997. - V. 45. - P. 660.

162. Luca Richeldi An update on the diagnosis of tuberculosis infection. // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 2006. - V. 174. - P. 736-742.

163. Lyashchenkof K., Colangeli R'., Houde M., A. Jahdali H., Menzies D., Gennaro M.L. Heterogenous antibody responses in tuberculosis. // Infect. Immun. 1998. - V. 66. -P. 3936-3940.

164. Lyashenko K.P., Pollock J.M., Colangeli R., Gennaro M.L. Diversity of antigen recognition by serum antibodies in experimental bovine tuberculosis. // Infect. Immun. -1998.-V. 66. — N. 11.-P. 5344-5349.

165. Mackiewicz V., Dussaix E., Le Petitcorps M.-F., Roque-Afonso» A.M. Detection of hepatitis A virus RNA in saliva. // J. Clin. Microbiol. 2004. - V.42. - P. 4329-4331.

166. Ma Y., Seiler K.P., Tai K.-F., Yang L., Woods M. Outer surface lipoproteins of Borrelia burgdorferi stimulate nitric oxide production by the cytokine-inducible pathway. // Infect. Immun. 1994. - V. 62. - P. 3663-3671.

167. Mahairas G.G., Sabo P.J., Hickey M.J., Singh D.C., Stover C.K. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis. //J. Bacteriol. 1996. - V. 178.-N 5.-P. 1274-1282.

168. Manca C., Lyashchenko K., Colangeli R., Gennaro M. L. MTC28; a novel 28-kilodalton proline-rich secreted antigen specific for the Mycobacterium tuberculosis complex. // Infect. Immun. 1997. - V. 65. - P. 4951- 4957.

169. Mannen T., Yamaguchi S., Honda J., Sugimoto S., Kitayama A., Nagamune T. Observation of charge state and- conformational change in immobilized protein using surface plasmon resonance sensor. // Anal Biochem. 2001. - V. 15. - N. 293(2). - P. 185-193.

170. Mashishi T., Gray C.M. The ELISPOT assay: an easily transferable method for measuring cellular responses and identifying T cell epitopes. // Clin. Chem. Lab. Med. -2002.-V. 40.-P. 903-910.

171. Miguel G., Madariaga M.D., Ziba Jalali M.D., Susan Swindells Clinical utility of interferon gamma assay in the diagnosis of tuberculosis: ELISA-IGRA in Patients with Immune dysfunction. // J. Am. Board. Fam. Med. 2007. - V. 20(6). - P. 540-547.

172. Miller J.M., van der Maaten M.J. Serogical detection of bovine leukemia virus infection. // Vet. Microbiol 1976. - V. 1. - P. 195-202.

173. Miller J.M., Van Der Maaten M.J. Use of glycoprotein antigen in the immunodiffusion test for bovine leukemia virus antibodies. // Eur. J. Cancer. — 1977. -13.-P. 1369-1375.

174. Miyahira Y., Murata K., Rodriguez D., Rodriguez J: R., Esteban M., Rodrigues M. Mi, Zavala F. Quantification* of antigen specific CD8+ T cells using an ELISPOT assay. // J. Immunol. Meths. 1995. - V. 181. - P. 45-54.

175. Molloy J., Walker P J., Chris Baldock F., Rodwell'B. J., Cowley J. A. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of bovine leukaemia virus p24 antibody in cattle. // J. Virol Meths. 1990. - V. 28. - N 1. - P. 47-57.

176. Mukamolova G.V., Kaprelyants A.S., Young D.I., Young M., Kell D.B; A bacterial cytokine. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998: - V. 95. - P. 8916-8921.

177. Mullis K., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G., Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1986. -V. 51. - P. 263-273.

178. Munk M.E., Arend S.M., Brock I., Ottenhoff T.H., Andersen P. Use of ESAT-6 and CFP-10 antigens for diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. // J. Infect. Dis. -2001.-V. 183.-P. 175-176.

179. Murakami K., Kobayashi S., Konishi M., Kameyama Ken-ichiro, Yamamoto T. Tsutsui T. The recent prevalence of bovine leukemia virus (BLV) infection among Japanese cattle. // Veterinary Microbiology. 2011. - V. 148. - N. 1. - P. 84-88

180. Murali-Krishna K., Altman J.D., Suresh M., Sourdive D. J., Zajac A. J., Miller J. D.s Slansky J., Ahmed R. Counting antigen-specific CD8 T cells: a réévaluation of bystander activation during viral infection. // Immunity. 1998: - V. 8. T PI 177-187.

181. Nagai S., Wiker H.G., Harboe M., Kinomoto M. Isolation and partial! characterization' of major protein? antigens in the culture fluid of Mycobacterium tuberculosis. II Infect. Immun. 1991. - V. 59. - N 1. - P. 372-382.

182. Naif H.M., Brandon R.R., Daniel C.W., Lavin M.F. Bovine leukaemia proviral DNA detection in cattle using the polymerase chain reaction. // Vet. Microbiol. 1990. -V. 25.-P. 117-129.

183. Nainan O.V., Xia G., Vaughan G., Margolis H.S. Diagnosis of hepatitis A virus infection: a molecular approach. II Clin: Microbiol: Rev. 2006. - V. 19. - P. 63-79.

184. Nakamura R.M., Einck L., Velmonte M.A., Kawajiri K., Ang C.F., Delasllagas C.E., Nacy C.A. Detection of active tuberculosis by an MPB64 transdermal'patch: a field-study. // Scandi J. Infect. Dis. 200F. - V. 33. -N. 6. - P. 405^*07.

185. Narain J. P., Raviglione M. C., Kochi A. HIV-associated tuberculosis in developing countries: epidemiology and strategies for prevention. // Tubercle. Lung. Dis. 1992. -V. 73.-P. 311-321.

186. Neonakis I.K., Gitti Z., Krambovitis E., Spandidos D.A. Molecular diagnostic tools in mycobacteriology. // J. Microbiol. Meths. 2008. - V. 75. - P. 1-11.

187. Nepom G. T., Lewinsohn D. M. et al. Characterization of a Mycobacterium tuberculosis peptide that is recognized by human CD4+ and CD8+ T cells in the context of multiple HLA alleles. // J. Immunol. 2004. - V. 173(3). - P.' 1966- 1977.

188. News M.D. ESAT-6 in ELISpot-assay tuberculosis. New assay more accurately identification individuals at high risk for tuberculosis infection. // Practice Medicine. -2001.-V. 22.

189. Nguyen V.K., Maes R.F. Evaluation» of am enzyme-linked immunosorbent' assay for detection! of antibodies to bovine leukemia'virusi in serum and milk. // Clin: Microbiol. -1993.-V. 31.-P.1979 — 981.

190. NollA., Autenrieth. I.BI Immunity against Yersinia enterocolitica by vaccination with Yersinia HSP60 immunostimulating complexes or Yersinia'HSP60 plus interleukin-12. // Infect. Immun. - 1996. - V. 64. - P. 2955-2961.

191. Ogg G.S., Jin X., Bonhoeffer S. Quantitation* of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. // Science. 1998. - V. 279. — P. 21032106.

192. Olsen A.W., van Pinxteren L.A. H., Okkels L.M., Rasmussen P.B., Andersen Pi Protection of mice with a tuberculosis subunit vaccine based on a fusion protein of antigen 85B and ESAT-6. // Infect. Immun. 2001. - V. 69.-N. 5. - P. 2773-2778.

193. Pai M., Kalantri S., Dheda K. New tools and emerging technologies for the diagnosis of tuberculosis: Part II. Active tuberculosis and drug resistance: // Expert Rev. Mol. Diagn. -2006. V. 6. -N 3.-P. 423-432.

194. Pai Mi, Dheda K., Cunningham Ji, Scano F., O'Brien R. T-celli assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: moving the research agenda forward. // Lancet Infect. Dis. — 2007^ — V. 7. — Pi 428M38.

195. Piessens W.F., Nardell' E.A. Pathogenesis of tuberculosis. In: Hershfield E., Delker M. Eds. Tuberculosis. Lung Biology Series. New York. Marcel Dekker Inc. -2000.-P. 241-260.

196. Pina-Vaz C., Costa-de-Oliveira S., Rodrigues A.G. Safe susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by flow cytometry with the fluorescent nucleic acid stain SYTO 16. // J. Med. Microbiol. 2005. - V. 54. - N 1. - P. 77-81.

197. Pitarque S., Larrouy-Maumus G., Payre B., Jackson M., Puzo G., Nigou J. The immunomodulatory lipoglycans, lipoarabinomannan and' lipomannan, are exposed at the mycobacterial cell surface. // Tuberculosis. 2008. - P. 1-6.

198. Platzer C., Siakkou H., Kraus G., Grobel C., Rosenthal S. Use of monoclonal antibody against major internal protein p24 of bovine leukemia virus in capture ELISA. // Arch. Exper. Vet. Med. 1990. - V. 44. - P. 917-923.

199. Pollock J.M., Andersen P. The potential of the ESAT-6 antigen secreted by virulent mycobacteria for specific diagnosis of tuberculosis. // J. Infect. Dis. 1997. - V. 175.-P. 1251- 1254.

200. Pollock J.M., Andersen. P. Predominant recognition of the ESAT-6 protein in the first phase of infection with Mycobacterium bovis in cattle. // Infect. Immun. 1997. - V. 5.-P. 2587-2592.

201. Pottumarthy S., Wells V.C., Morris A.J. Comparison of seven tests for serological diagnosis of tuberculosis. // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. - P. 2227-2231.

202. Purcell* A.W/., Gorman J.J. Immunoproteomics. Mass spectrometry-based methods to study the targets of the immune response. // Mol.Cell: Proteomics. 2004. - V. 3. - P.* 193-208:

203. Pramoolsinsap C. Acute hepatitis A superinfection* in HBV carriers, or chronic liver disease related to HBV or HCV. //Ann. Trop. Med. Parasitol. 1999. - V.93 (7). -P.1745-751.

204. Rattam A., Gupta S. K., Singh S., et all Detection of antigens of mycobacterium tuberculosis in patients of infertility by monoclonal antibody based sandwiched enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). II Tuber Lung Dis 1993. - V. 74. - P. 200-203.

205. Raz E. Immunostimulatory DNA sequences. // Springer-Verlag. Heidelberg. Germany. 2000.

206. Reisner B.S., Gatson A.M., Woods G.L. Evaluation of mycobacteria) growth indicator, tubes for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid andf rifampin. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1995. - V. 22. - N. 4. - PI 325-3291

207. Reuter H., Burgess L., van Vuuren W., Doubell A. Diagnosing tuberculous pericarditis. // Quarterly journal of medicine (QJM). 2006. - V. 99. - №. 12. - P.827-839.

208. Rezwan M., Laneelle M.A., Sander P., Daffe M. Breaking down the wall: fractionation of mycobacteria. // J. Microbiol. Meth. 2007. - V. 68. - P. 32-39.

209. Riantawan P., Chaowalit Pi, Wongsangiem M., Rojanaraweewong P. Diagnostic value of pleural fluid adenosine deaminase in tuberculous pleuritis with reference to HIV coinfection and a Bayesian analysis. // Chest. 1999. - V. 116. - P. 97-103.

210. Ribeiro S., Dooley K., Hackman J., Loredo C., Efron A., Chaisson R.E., Conde M.B., Boechat N., Dorman S.E. T-SPOT. TB responses during treatment of pulmonary tuberculosis. // BMC Infectious Diseases. 2009. - V. 9. - P. 23-28.

211. Richeldi L. An update on the diagnosis of tuberculosis infection. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2006. - V. 174. - N. 7. - P. 736-742.

212. Richeldi L., Ewer K., Losi M., Bergamini B. M., Roversi P., Deeks J., Fabbri L.M., Lalvani A. T cell-based tracking of multidrug resistant tuberculosis infection after brief exposure. // Am J Respir Grit Care Med. 2004. - V. 170(3). - P. 288-295.

213. Richeldi L, Ewer K, Losi M, Hansell DM, Roversi P, Fabbri LM, Lalvani A. Early diagnosis of subclinical multidrug-resistant tuberculosis. // Ann. Intern. Med. 2004. -V. 140(9).-P. 709-713.

214. Richeldi L.s Losi M., D'Amico R., Luppi M., Ferrari A., Mussini C., Codeluppi M., Cocchi S., Prati F., Paci V., Meacci M., Meccugni B., Rumpianesi F., Roversi P.,

215. Cerri S., Luppi F., Ferrara G., Latorre I., Gerunda G. E., Torelli G., Esposito R., Fabbri L.M. Performance of tests for latent tuberculosis in different groups of immunocompromised patients. // Chest. 2009. - V. 136. - P. 198-204.

216. Rininsland F.H., Helms T., Asaad R.J., Boehm B.O., Tary-Lehmann M. Granzyme B ELISPOT assay for ex vivo measurements of T cell immunity. // J Immunol Meths. -2000 V. 240(1-2). - P. 143-55.

217. Roche P.W1., Feng' G.G., Britton« W.J. Human T-cell epitopes on the Mycobacterium tuberculosis secreted protein MPT64. // Scand: J. Immunol. 1996; - V. 43.-N6.-P. 662-670.

218. Rhodes S.G., Gavier-Widen D., Buddle B.M., Whelan A.O., Singh M., Hewinson R.G., Vordermeier HIM; Antigen specificity in experimental, bovine tuberculosis. // Infect. Immun. 2000: - V. 68. - N. 5. - P: 2573-2578:

219. Romani.L., Puccetti P.', Bistoni F. Interleukin-12 in infectious diseases. // Clinical. Microbiol. Rev. 1997. - V. 10(4). - P. 611-636.

220. Romani N., Gruner S., Brang D., Kampgen E., Lenz A., Trockenbacher B., Konwalinka G., Fritsch P.O., Steinman.R.M., Schuler G. 1994. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. // J. Exp. Med. 1994. - V. 180. - P. 83-93.

221. Rothel J., Andersen P. Diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection: is the demise of the Mantoux test imminent? // Expert Rev Anti Infect Ther. 2005. - V. 3.-N. 6.-P. 981-993.

222. Sada E., Ruiz-Palacios G.M>.*, Lopezvidal Y., Ponce De Leon S. Detection of mycobacterial antigens in CSF of patients with tuberculous meningitis by EEISA. // Lancet 1984.-P. 651-652.

223. Sánchez F.O, Rodriguez J.I., Agudelo G., Garcia L.F. Immune responsiveness and lymphokine production in patients with tuberculosis and healthy controls. // Infect. Immun. 1994. - V. 62. - P. 5673-5678.

224. Sanchez G., Populaire S., Butot S., Putallaz T., Joosten H. Detection and differentiation of human hepatitis A strains by commercial quantitative real-time RT-PCR tests. II J. Virol. Methods. 2006. - V. 132. - P. 160-165.

225. Scarpellini P., Tasca S., Galli L., Beretta A., Lazzarin A., Fortis G. Selected pool of peptides from ESAT-6 and CFP-10 proteins for detection of Mycobacterium tuberculosis infection. // J1 Clin: Microbiol., 2004: - V. 42(8)1 - P: 3469-3474.

226. Schluger N.W., Rom W.N. The host immune response to tuberculosis. // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 1998. - V. 157. - P. 679-691.

227. Senol G., Erer O. F., Yalcin Y. A., Coskun M., Gunduz A.T., Bicmen C., Ertas M., Ozkan S.A. Humoral immune response against 38-kDa and 16-kDa mycobacterial antigens in tuberculosis. // Eur. Respir. J. 2007. - V. 29. - P. 143-148.

228. Shafer-Weaver K., Sayers T., Strobl S., Derby E., Ulderich T., Baseler M., Malyguine A. The Granzyme B EEISPOT assay: an*alternative to the 51Cr-release.assay for monitoring cell-mediated cytotoxicity. // J. Transit Med. 2003; - V. 1. - P. 1-14

229. Sharma A., Saha A., Bhattacharjee S., Majumdar S., Das Gupta S.K. Specific and randomly derived immunoactive peptide mimotopes of mycobacterial antigens. // Clin. Vaccine Immunol.- 2006. -V. 13.-№. 10.-P. 1143-1154.

230. Shirota H., Sano K., Hirasawa N. Terui T., Ohuchi K., Hattori T., Tamura G. B cells capturing antigen conjugated with GpG Oligodeoxynucleotides induce Thl cells by elaborating IL-12. // J. Immunol. 2002. - V. 169. - P. 787-794.

231. Shresta S., Pham C.T.M., Thomas D:A., Graubert T.A. Ley T. How do cytotoxic lymphocytes kill their targets? // Curr. Opin. Immunol. 1998. - V. 10. - P. 581.

232. Silva V.M.C., Kanaujia G., Gennaro M.L., Menzies D. Factors associated with humoral response to ESAT-6, 38 kDa and 14 kDa in patients with a spectrum of tuberculosis. // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2003. - V. 7. - P. 478- 484.

233. Skeen M.J., Miller M.A., Shinnick T.M., Ziegler H.K. Regulation of murine macrophage IL-12 production. Activation of macrophages in vivo, restimulation in vitro, and modulation by other cytokines. // J. Immunol. 1996. - V. 156. - P.* 1196-1206.

234. Sopp P, Kwong L.S, Howard C.J. Cross-reactivity with bovine cells of monoclonal antibodies, submitted to the 6th International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens. // Vet. Immunol. Immunopathol. 2001. - V. 78. -P. 197-206.

235. Sorensen A.L., Nagai S., Houen G., Andersen P., Andersen A.B. Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted" by Mycobacterium tuberculosis. // Infect. Immun. 1995. - V. 63. -N 5. - P. 1710-1717.

236. Soysal A., Torun T., Efe S., Gencer H., Tahaoglu K., Bakir M. Evaluation of cutoff values of interferon-gamma-based assays in the diagnosis of M. tuberculosis infection. // Int. J. Tuberc. Lung: Dis. 2008. - V. 12. - P. 50-56.

237. Srivastava N., Manaktala. U., Baveja C.P. Role of ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) in genital tuberculosis. // Intern. J. Gynecol. Obstetrics. 1997. -V. 57. -N. 2.-P. 205-206.

238. Stapleton J.T. Host Immune Response to Hepatitis A Virus. // J. Infect. Diseases. -1995.-V. 171.-P. 9-14.

239. Steingart K, Ramsay A, Pai M. Optimizing sputum smear microscopy for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. // Exp Rev Anti Infect Ther. 2007. - V. 5(3). - P. 327-331.

240. Streeton. J.A, Desem N., Jones S.L. Sensitivity and specificity of a gamma interferon blood test for tuberculosis infection. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1998. -V. 2. -P. 443-449.

241. Supelco Bulletin 903'. ProClin® 300 Preservative for» diagnostic reagents. USA . Sigma-Aldrich. P. 1-8.

242. Swaminathan S., Umadevi P., Shantha S., Radhakrishnan A., Datta 0. Serodiagnosis of tuberculosis in children using two ELISA kits. // Indian J Pediatr. -1999:-V. 66.-P. 837-884.

243. Sznol M., Marineóla F.M. Principles of immune monitoring in cancer vaccine trials. S.A. Rosenberg, ed. Principles and Practice of the Biologic Therapy of Cancer 3rd Ed.617. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia. 2000.

244. Taha R.A., Kotsimbos J.C., Song Y.L., Menzies D., Hamid Q. IFN-gamma and IL-12 are increased in active compared with inactive tuberculosis. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1997. - V. 155. - P. 1135-1139.

245. Tobias HJ., Schafer M.P., Pitesky M., Fergenson D.P., Horn J., Frank M., Gard E.E. Bioaerosol mass spectrometry for rapid detection of individual airborne

246. Mycobacterium tuberculosis H37Ra particles. // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71.-P. 6086-6095.

247. Tortoli E., Cichero P., Piersimoni C., Simonetti M.T., Gesu G., Nista D. Use of BACTEC MGIT 960 for recovery of mycobacteria from».clinical specimens: multicenter study. //J. Clin. Microbiol. 1999. -V. 37. -Nil. -P. 3578-35821 '

248. Tost J., Gut I.G. Genotyping single nucleotide polymorphisms by MALDI massispectrometry in clinical applications. // Clin. Biochem. 2005. - V. 38. - P. 335-350»

249. Trajman A'., Pai Mi, Dheda K., van Zyl Smit R., Zwerling A.A., Joshi R., Kalantri 1 S., Daleye P., Menzies D. Novel tests for diagnosing tuberculous- pleural effusion: what works and what does not? // Eur. Respir. J: 2008. - V. 31. - Pi 10981106.

250. Trinchieri G., Scott: P. The role of interleukin' 12 in the immune response, disease and therapy. // Immunol. Today. 1994. - V. 15. - P. 460^163.

251. Van Pinxteren L.A.H., Ravn P:, Agger E.M., Pollock J., Anderson P: Diagnosis of tuberculosis based on the two specific antigens ESAT-6 and CFP-10. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. - V. 7. - P. 155-160.

252. Veenstra H., Crous I., Brahmbhatt S., Lukey P., Beyers N., van Helden P.D.,. Walzl G. Changes in the kinetics of intracellular IFN-gamma production in TB patients during treatment. // Clin. Immunol. 2007. - V. 124: - №. 3. - P. 336-344.

253. Vento S., Garofano T., Renzini C. et al. Fulminant hepatitis associated with hepatitis A virus superinfection in patients with chronic hepatitis C. // N. Engl. J. Med. -1998. V. 338 (5). - P. 286-290.

254. Verbon A., Weverling G.J., Kuijper S., Speelman P., Jansen H.M., Kolk A.H.J. Evaluation of different tests for the serodiagnosis of tuberculosis and the use of likelihood ratios in serology. II Am. Rev. Respir. Dis. 1993. - V. 148. - P. 378-384.

255. Verthelyi D., Ishii K. J., Gursel M., Takeshita F., Klinman D.M. Human peripheral blood cells differentially recognize and respond to two distinct CpG motifs. // J. Immunol. 2001. - V. 166. - P. 2372-2377.

256. Vignali DA. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. Ill Immunol Meths. 2000: - V. 243(1-2). P. 243-255.

257. Villegas M.V., Labroda L.A., Seravia N.G., Evoluation of polymerase chain* reaction, adenosine, deaminase and-interferon-gamma in pleural fluid, for the diferantial. diagnosis of pleural' tub erculosis. // Chest. 2000. - V. 118(5). - P. 1355-1364.

258. Vordermeier H.M., Whelan A., Cockle P.J:, Farrant L., Palmer N., Hewinson R.G. Use of synthetic peptides derived from the antigens ESAT-6 and CFP-10 for differential diagnosis of bovine tuberculosis in cattle. // CVI. 2001. - V.8. - P: 571- 578.

259. Wagner H. Immunology of bacterial CpG-DNA. II Springer-Verlag- Heidelberg. Germany. 2000.

260. Wallis R.S., Aide S.L., Havlir D.V., Amir-Tahmasseb M;H., Daniel T.M., Ellner J:J. Identification' of antigens of Mycobacterium tuberculosis using human monoclonal antibodies. IIJ. Clin. Invest. 1989. -V. 84. - N. 1. - P. 214-219.

261. Wang B.L., Xu Y., Wu C.Q., Xu Y.M., Wang H.H. Cloning, expression, and refolding of a secretory protein ESAT-6 of Mycobacterium tuberculosis. II Protein Expr. Purif. -2005. V. 39. -N. 2. - P. 184-188.

262. Wang A., Clapper J., Guderian J.A., Foy T.M., Fanger G.R., Retter M.W., Skeiky Y.A. A novel method for increasing the expression level of recombinant proteins. // Protein Expr. Purif. 2003. - V. 30. -N. 1. - P. 124-133.

263. Wang C.H., Tschen S.Y., Heinricy U., Weber M., Flehmig B. Immune response to hepatitis A virus capsid proteins after infection. // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34. - P. 707-713.

264. Weldingh K., Dodson P., Quan S., Lewis A.P., Thomas P.J., Duncan K., McAdam R.A. Comparison of the proteome of Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv with clinical isolate CDC 1551. // Microbiology. 2000. - V. 146. - N. 12. - P. 3205-3216.

265. Weinberg A., Zhang L., Brown D., Erice A., Polsky B., Hirsch M.S., Owens S., Lamb K. Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. - V 7. - P: 714- 716.

266. West N.P., Wozniak T.M., Valenzuela J., Feng C.G., Sher A., Ribeiro J.M., Britton W.J. Immunological diversity within a family of cutinase-like proteins of Mycobacterium tuberculosis. //Vaccine. -2008. -V. 26. -N. 31. -P. 3853-3859.

267. Wilkins E.G.L., Ivanyi J; Potential! value of serology for diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. // Lancet. 1990. - V. 336. - P.' 641-644.

268. Wittmann; 1993 In: W. Wittmann; Editors* Leukosen der Wiederkäuer, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1993. P. 173-180.

269. Williams-Bouyer N., Yorke R., Lee H.I., Woods G.L. Comparison of the BACTEC MGIT 960 and ESP culture system II for growth and detection ofmycobacteria. // Diagnostic microbiology and infectious disease. 2000. - V. 38. - N. 11.-P. 4167-4170.

270. Wongtim S. Interferon gamma for diagnosing tuberculous effusions. // Thorax. -1999. - V. 54(10). - P. 921-924.

271. Wu X., Yang Y., Zhang J., Li B., Liang Y., Zhang C., Dong M., Cheng HI, He J. Humoral immune responses against the Mycobacterium tuberculosis 38-kilodalton, MTB48, and CFP-10/ESAT-6»antigens in tuberculosis. // CVI. 2010. -V. 17. -N. 3. -P: 372-375.

272. Wu X, Yang Y, Zhang J, Li B; Liang Y, Zhang C, Dong' M. Comparison of antibody responses to seventeen antigens from * Mycobacterium tuberculosis. // Clin. Chim. Acta. 2010 - V. 9. -N. 411(19-20). - P. 1520-1528.

273. Wu.M! C, Shanks R. D., Lewin H. A. Milk and fat production in dairly cattle influenced by advanced subclinical bovine leukemia virus infection. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 993- 996.

274. Yamada G., Shijubo N., Shigehara K., Okamura H., Kurimoto M., Abe S. Increased levels of circulating Interleukin-18 in patients with advanced tuberculosis Am. II J. Respir. Crit. Care Med. 2000. - V. 161. - №. 6. - P. 1786-1789.

275. Yamaguchi S., Mannen T., Nagamune T. Evaluation of surface hydrophobicity of immobilized protein with a surface plasmon resonance sensor. // Biotechnol. Lett. -2004.-V. 26(13).-P. 1081-1086.

276. Yang Z., Barnes P.F., Chaves F., Eisenach K.D., Weis S.E., Bates J.H., Cave MID. Diversity of DNA fingerprints of Mycobacterium tuberculosis isolates in the United States. //J. Clin. Microbiol. 1998. -V. 36. -N. 4. - P. 1003-1007.

277. Yang J., Lemas V. M., Flinn I. W., Krone C., Ambinder R. F. Application of the ELISPOT assay to the characterization of CD8+ responses to Epstein-Barr virus antigens. //Blood.-2000.-V. 95.-N. l.-P. 241-248.

278. Yen-Peng Ho, Reddy P.M. Identification of pathogens by mass spectrometry. // Clin. Ghem. 2010. - V. 56. - P. 525- 536.

279. Yu.D., Kandimalla E.R., Zhao Q., Cong Y., Agrawal S. Immunostimulatory properties of phosphorothioate CpG DNA containing both 3-5 and 2'-5'-internucleotide linkages. // Nucleic Acids Research. - 2002. - V. 30. - N. 7. - P. 1613-1619.

280. Yuce A., Yiicesoy M., Gen? S., Sayan M., U9an E.S. Serodiagnosis of tuberculosis by enzyme immunoassay using A60 antigen. // Clin. Microbiol. Infect. -2001. V. 7. - №. 7. - P. 372-376.

281. Zhang M., Gately M.K., Wang E„ Gong J., WolfS. F., Lu S., Modlin R. L., Barnes P.F. Interleukin 12 at the site of disease in tuberculosis. // J. Clin. Invest. 1994. - V. 93. -P. 1733-1739.

282. Zhong W., Reche P.A., Lai C.C., Reinhold B., Reinherz E.L. Geno№e"wlde characterization of a viral cytotoxic T lymphocyte epitope repertoire. // J. Biol- Chem. 2003. -V. 278. -N. 46. P. 45135-45144.