Получение и характеристика рекомбинантных антигенов Mycobacterium Tuberculosis как компонентов потенциальных вакцинных препаратов

Аксенова, Екатерина Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и характеристика рекомбинантных антигенов Mycobacterium Tuberculosis как компонентов потенциальных вакцинных препаратов
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика рекомбинантных антигенов Mycobacterium Tuberculosis как компонентов потенциальных вакцинных препаратов"

Аксенова Екатерина Ивановна

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS КАК КОМПОНЕНТОВ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2011

4841871

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России)

Научные руководители:

Кандидат биологических наук Лунин Владимир Глебович Доктор биологических наук Кондратьева Татьяна Константиновна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Мещерякова Ирина Сергеевна Доктор биологических наук Лахтин Владимир Михайлович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В .А. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится «15» апреля 2011 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «/^» марта 2011

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Русакова Е.В.

Актуальность работы

В настоящее время туберкулез (ТБ) считается одной из самых опасных инфекционных болезней, распространенных повсеместно, и остается важной причиной гибели людей во всем мире. По данным Всемирной организации здравоохранения каждый год в мире регистрируется около 9 млн. новых случаев ТБ, а смертность от ТБ в среднем составляет 1,5-2 млн. человек в год. Около 80% случаев приходятся на Африку (южнее Сахары), Юго-Восточную Азию и Полинезию, однако ситуация остается сложной и в других частях Земного шара (Апт A.C., Кондратьева Т.К., 2008). Россия относится к странам с высоким уровнем заболеваемости ТБ.

Единственной разрешенной в настоящее время вакциной от ТБ является вакцина BCG (Bacillus Calmette-Guerin), которая представляет собой живой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis. Она относительно безопасна, недорога, достаточно эффективно защищает детей от диссеминированного (милиарного) ТБ (Rook G.A.W., 2001), однако не защищает взрослых от легочного ТБ, а именно эта форма болезни приводит к распространению инфекции и сохранению тяжелой эпидемической ситуации. Кроме того, использование BCG вызывает различные поствакцинальные осложнения.

Один из предлагаемых подходов повышения эффективности вакцинации -схема так называемой «prime-boost» (от англ. поддержка главного) вакцинации, когда для первичной иммунизации («prime») используется вакцина BCG, а для последующих ревакцинаций («boost»), разрабатываемые препараты нового поколения (Bersford В., 2011). Субъединичные генно-инженерные препараты, содержащие протективные антигены микобактерий, представляют большой интерес. Они обладают такими существенными преимуществами как низкая реактогенность, высокая чистота получаемого продукта, а также безопасность для людей с нарушенным иммунитетом. Однако при иммунизации отдельными антигенами для индукции достаточного иммунного ответа необходимы сильные адьюванты, большая часть из которых используется только в

экспериментальных моделях на животных, и не разрешена для клинического применения.

Mycobacterium tuberculosis - это внутриклеточный патоген, и основная роль в адаптивном иммунитете к ТБ принадлежит клеточным, а не гуморальным факторам защиты (North R.J., 2004). По мнению многих авторов, основными мишенями (иммунодоминатными антигенами) протективного иммунитета являются секреторные белки, присутствующие в культуральном фильтрате М tuberculosis. Среди них наиболее полно охарактеризованы близкородственные белки комплекса Ag85 (Ag85A, В и С), ESAT-6 (Early Secret Antigen Target) и CFP-10 (Culture-Filtrate Protein) (Mustafa A.S., 2002).

Эти белки в настоящее время проходят разные стадии испытаний в качестве кандидатных (Andersen Р., 2005). Однако получение отдельных рекомбинантных антигенов осложнено гетерологичной экспрессией, проблемами с выделением и очисткой. Поэтому разработка подхода, направленного на преодоление перечисленных сложностей при получении компонентов кандидатных субъединичных препаратов, индуцирующих сильный иммунный ответ, представляет научный и практический интерес.

Цель работы: разработка технологии получения рекомбинантных антигенов М. tuberculosis и создание на их основе препаратов, сохраняющих антигенные, иммуногенные и протективные свойства белков.

Задачи:

1. Получить рекомбинантные плазмиды, кодирующие последовательности полноразмерных белков CFP-10, ESAT-6, Ag85A М. tuberculosis, и создать штаммы-продуценты на основе Escherichia coli, обеспечивающие высокий уровень экспрессии целевых продуктов.

2. Разработать методику выделения, очистки и концентрирования рекомбинантных белков микобактерий на полисахаридном носителе.

3. Исследовать антигенные свойства полученных препаратов рекомбинантных белков in vitro.

4. Изучить иммуногенные свойства полученных препаратов рекомбинантных белков на полисахаридном носителе у вакцинированных мышей.

5. Оценить протективные свойства полученных препаратов в моделях экспериментального туберкулеза при разных способах заражения.

6. Исследовать эффективность рекомбинантных антигенов в тестировании туберкулезного инфицирования на основе индукции интерферона гамма. Научная новизна

Созданы рекомбинантные плазмиды, кодирующие химерные белки, включающие полноразмерные антигены CFP-10, ESAT-6, Ag85A М. tuberculosis и целлюлозосвязывающий домен (CBD) эндо-1,4-Р-глюканазы СеГО микроорганизма Anaerocellum thermophilum. На основе плазмидных конструкций получены эффективные штаммы-продуценты полноразмерных микобакгериальных антигенов в составе химерных белков с высоким уровнем синтеза в клетках Е. coli.

Разработана эффективная система выделения, очистки и формулирования препаратов рекомбинантных антигенов на целлюлозной матрице.

Исследованы антигенные свойства химерных белков и подтверждено сохранение ими нативной конформации. Проведено оригинальное многокомпонетное исследование сывороток с препаратами рекомбинантных микобактериальных белков.

Получены белково-полисахаридные композиции при иммобилизации химерных белков на аморфной целлюлозе. Изучены их иммуногенные и протективные свойства на инбредных мышах двух линий: генетически устойчивой к туберкулезной инфекции - C57BI/6 и чувствительных - I/St. Подтверждено сохранение иммуногенных свойств микобактериальных белков в составе исследуемых препаратов. Протективные свойства препаратов не уступали таковым у вакцины BCG. Практическая значимость работы

Охарактеризованные препараты рекомбинантных микобактериальных антигенов и полученных иммуногенных белково-полисахаридных комплексов

могут быть использованы при разработке субъединичных препаратов для профилактики ТБ.

При использовании смеси рекомбинантных микобактериальных антигенов ESAT-6 и CFP-10 разработана тест-система определения туберкулезного инфицирования на основе индукции in vitro интерферона гамма (ИФН-у).

Оформлены 4 заявки на патенты на созданные рекомбинантные плазмиды, штаммы продуценты и химерные белки; на способ иммобилизации, концентрирования и очистки рекомбинантных белков на целлюлозе; на способ иммобилизации рекомбинантных белков на полистирольных носителях. Положения, выносимые на защиту

1. Технология аффинных целлюлозосвязывающих доменов, позволяет повысить устойчивость антигенов М. tuberculosis (CFP-10, ESAT-6, Ag85A) к протеазам, существенно увеличить выход целевого белка, одновременно осуществлять очистку, концентрирование, иммобилизацию и рефолдинг целевых белков на поверхности целлюлозосодержащего сорбента.

2. Препараты, полученные на основе рекомбинантных антигенов М. tuberculosis, сохраняют антигенные, иммуногенные и протективные свойства (в моделях экспериментального туберкулеза на мышах) при иммобилизации на полисахаридных носителях и могут быть использованы при разработке вакцины для профилактики туберкулеза.

Апробация работы

Результаты работы доложены на международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологии в рамках Международного форума по нанотехнологиям в г. Москве 1-3 ноября 2010г.

Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции отделов генетики и молекулярной биологии бактерий и медицинской микробиологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России 18 февраля 2011г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ; 1 - в сборниках научных трудов; 1 - в материалах конференции; 4 - патента и заявок на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на //страницах машинописного текста и включает Введение и 4 главы, Выводы и Список используемой литературы источников, из которых отечественных и -f<3s иностранных. Работа содержит 21 рисунок, 7 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе использовали лабораторные штаммы Е. coli Ml 5 и Е. coli DH5a; штамм M. tuberculosis H37Rv, полученный из Института Пастера (Париж, Франция); вакцинный штамм BCG-1 Russia; инбредные линии мышей C57BI/6 и I/St, поддерживаемые в виварии ЦНИИ туберкулеза РАМН.

Генно-инженерное конструирование и микробиологические манипуляции проводили по известным методикам (Маниатис Т. 1984, Parish Т. 2001). Фрагменты ДНК секвенировали на приборе 3130 Genetic Analyzer (группа секвенирования ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России); ЭФ продуктов реакции осуществляли в капиллярах длиной 50 см с полимером РОР-7. Выделение, концентрирование и очистку рекомбинантных белков, содержащих целлюлозосвязывающий домен, проводили на целлюлозном носителе. Антигенные свойства рекомбинантных белков анализировали методом суспензивных биочипов на флуориметре Bio-Plex System посредством многофакторного иммуноанализа с флуоресцентной детекцией.

Для проведения опытов in vivo мышей иммунизировали подкожно по двум схемам: 1) однократно под кожу задних лап (50 мкл/лапа, концентрация белка 200 мкг/мл); 2) двукратно под кожу спины (0,5 мл/мышь, концентрация белка 20 мкг/мл) с 2-недельным интервалом. Через 5 недель после второй иммунизации

подопытных животных заражали вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv внутривенно (5х106 КОЕ/мышь) или аэрозольно (102 КОЕ/мышь). Антиген-специфический пролиферативный ответ клеток регионарных лимфатических узлов оценивали по включению 3Н-тимидина в делящиеся клетки. Количество Т-лимфоцитов селезенки, продуцирующих после иммунизации исследуемым препаратом ИФН-у, определяли методом ELISPOT в соответствии с рекомендациями производителя. Через 3-4 недели после заражения определяли бактериальную нагрузку в легких и селезенке подопытных мышей. Для этого готовили стерильно гомогенаты органов, которые высевали на агар Дюбо; количество макроколоний М. tuberculosis H37Rv на чашках подсчитывали на 21 день и пересчитывали их количество на орган (КОЕ/орган). Статистическую обработку полученных данных проводили в программах BioPlex Manager Software 4.1.1. User Guide, Statistica Advanced Linear/Non-Linear Models.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 Получение бактериальных штаммов-продуцентов слитных белков, состоящих из рекомбинантных антигенов М. tuberculosis и целлюлозосвязывающего домена. Одним из решений проблемы уровня экспрессии и стабильности белковых компонентов в бактериальной системе, является конструирование химерных белков (fusion-protein) за счет соединения в одной рамке трансляции двух генов - гена целевого белка и белка-носителя, приводящего к синтезу рекомбинантных белков в штамме-продуценте.

1.1 Создание плазмидных генно-инженерных конструкций, кодирующих фрагменты генов микобактериальных белков ESAT-6, CFP-10, Ag85A. На первом этапе генно-инженерной части работы клонировали гены аутентичных белков М. tuberculosis CFP-10 Qhp), ESAT-6 (esat-6), Ag85A (fbpA). Олигонуклеотиды планировали таким образом, что в результате амплификации методом ПЦР получали гены полноразмерных белков, фланкированные сайтами эндонуклаз рестрикции. Размеры полученных ампликонов соответствовали расчетным: ¡hp - 323 п.н., esat-6 - 315 п.н. и JbpA - 924 п.н. Для создания генно-

инженерных конструкций использовали экспрессионный вектор pQE6 (Арг, QIAGENE, США). Анализ первичной структуры полученных конструкций показал, что делеций и инсерций в составе всех трех клонированных генов (Ihp, esa-t6, jbpA) не было. Работа выполнена при непосредственном участии с.н.с. Сергиенко О.В.

1.2 Создание экспрессионных векторов, содержащих последовательности генов микобаюпериальных белков, Gly-Ser спейсера и целлюлозосвязывающего домена. Для получения двухкомпонентных белков использовали плазмидные конструкции ptt9, pttlO, любезно предоставленные с.н.с. Тихоновой Т.В. Конструкции содержат фрагмент гена эндо-1,4-Р-глюканазы CelD А. thermophilum, кодирующий CBD; последовательность, кодирующую спейсер из аминокислотных остатков глицина и серина (Gly-Ser), позволяющую располагать гены целевых белков в N- и С-концевой ориентации относительно фрагмента гена сеЮ, и другие важные конструктивные блоки, представленные на рисунке 1.

Т5 pro SD Ihp спейсер свЦ) ter

TJpro SD esat-6 спейсер alD ter

Рисунок 1. Схема строения бактериальных оперонов экспрессионных векторов pCFP10-CBD (4294 пл.), pESAT6-CBD (4282 пл.), pAg85A-CBD (4891 п.н.). Т5 pro -промотор бактериофага Т5; SD - последовательность Шайиа-Дальгарно; ter -terminator (терминатор транскрипции); Ihp, esat-6, fbpA - гены белков М. tuberculosis; celD - фрагмент гена эндо-1,4-/}-глюканазы CelD A. thermophilum, кодирующий CBD.

Таким образом, были созданы экспрессионные векторы, содержащие в своем составе последовательности генов белков М. tuberculosis и гена целлюлозосвязывающего домена эндо-1,4-Р-глюканазы CelD A. thermophilum, соединенные спейсером.

1.3 Создание бактериальных продуцентов слитных белков на основе штаммов Е. coli. Анализ спектра индуцируемых белков в лизатах клеток штамма-продуцента М15 Е. coli выявил присутствие дополнительных полос, мол. масса которых соответствовала расчетной, а уровень синтеза составлял 1015% для CFP10-CBD (32,8 кДа) и ESAT6-CBD (32,0 кДа), 7-10% для Ag85A-CBD (54,1 кДа) от тотального белка клетки (Рис. 2). Было отмечено, что рекомбинантные белки в клетках штамма М15 Е. coli синтезировались как в растворимой фракции клеточных белков, так и в виде телец-включений.

12 3 4 5 6 7 8

, _ ,, ч_54.0 кДа

,_32.8 кДа

•»— 32.0 кДа 22.0 Kfla

Рисунок 2. Электрофореграмма (¡2% ДСН-ПААГ ЭФ по Лэммли) спектра синтезируемых белков. ESAT6-CBD (32.0 кДа), CFP10-CBD (32,8 кДа). AgS5A-CBD (54,0 кДа). I - штамм Е. coli М15 [pREP4] после индукции; 2, 3 - штамм Е. coli М15 [pREP4, pESAT6-CBD] после индукции (клон 1, 2); 4 - контроль мол. массы 22,0 кДа и 32,0 кДа; 5, б- штамм Е. coli М15 [pREP4,pCFP10-CBD] после индукции (клон 1,2); 7, 8 - штамм Е. coli Ml5 [pREP4, Ag85A-CBDJ после индукции (клон 1, 2).

Учитывая особенности синтеза белка в клетках-продуцентах, для дальнейшей работы выбрали рекомбинантные белки, полученные на основе вектора pttlO, в которых ген целевого пептида расположен в N-концевой ориентации (Рис.1)

2 Получение препаратов рекомбииантных белков и их комплексных препаратов на полисахаридном сорбенте. Методика выделения и очистки основана на аффинном связывании рекомбииантных белков с целлюлозным сорбентом посредством CBD без нарушения свойств целевого домена. В клетках Е. coli отсутствуют белки, взаимодействующие с целлюлозой, поэтому синтезируемые в штаммах-продуцентах белки CFP10-CBD, ESAT6-CBD, Ag85A-CBD являются единственными прочно связывающимися при

взаимодействии с целлюлозным сорбентом. В результате, происходит очистка, концентрирование, стабилизация и защита рекомбинантного белка от протеаз штамма.

2.1 Выделение, концентрирование и очистка белков, содержащих CBD. Элюцию сорбированных на целлюлозном сорбенте белков проводили раствором 8 М мочевины. В свободном (неиммобилизованном) состоянии антигены представляли собой растворы белков с определенной ионной силой, свободные от примесей полисахаридов, ДНК штамма-продуцента, с чистотой не менее 92% (Рис. 3).

Для хранения полученных рекомбинантных белков CFP10-CBD, ESAT6-CBD, Ag85A-CBD были подобраны следующие условия: при 4°С с и без NaN3 - 1,5-2 месяца, при -20 °С без NaN3 около 1 года. Работа выполнена при непосредственном участии н.с. Полетаевой H.H.

1 2 3 45 67 89

ПбгДа -►

ббкДа —► 45 «Я» — 35 кД« —

25 кДа 14 кДа

54.1 кД» 32.8 гДа 32Л гДа 23.5 кДа

Рисунок 3. Электрофореграмма (12% ДСН-ПААГ ЭФ по Лэммли) препаратов белков СВй (23,5 кДа), ЕБАТб-СВИ (32 кДа), СРРЮ-СВО (32,8 кДа), А585А-СВО (54,1 кДа). 1 - белок-стандарт мол. масс (0,1 мг/мл); 2, 3 - образец ЕБАТб-СВй (2 и 5 мкл); 4, 5 -образец СРРЮ-СВО (2 и 5 мкл); 6,7- образец СВй (2 и 5 мкл); 8,9- образец Ag85A-СВй (2 и 5 мкл).

2.2 Получение комплексных препаратов рекомбинантного белка с целлюлозой. Введение чистых рекомбинантных белков в организм не вызывает эффективной стимуляции иммунного ответа. Широко распространенным способом повышения иммуногенности рекомбинантных антигенов является использование адъювантов различного происхождения, которые усиливают

иммунный ответ за счет укрупнения молекулы иммуногена, замедляют высвобождение антигена и пролонгируют иммунный ответ, выполняя таким образом функцию депо в организме.

Для проверки собственных иммуногенных свойств рекомбинантных антигенов необходим был иммунотолерантный носитель, которым по данным Гурвича А.Е. (Гурвич А.Е. 1987) является целлюлоза. Дополнительные преимущества целлюлозы составляют высокая емкость, стабильность и низкая стоимость. На этапе создания иммунологических композиций использовали препарат аморфной целлюлозы (АЦ), полученный медноаммиачным способом по методу Гурвича А.Е. с нашими модификациями. Мы предположили, что иммобилизация очищенных химерных белков на целлюлозе за счет CBD, способствующая формированию пространственной структуры антигенов, позволит эффективно презентовать белки.

Посредством иммобилизации антигенов на целлюлозе получали иммуносорбенты, которые были стабильны в виде суспензии в PBS при 4°С в течение 2 мес. Процентное содержание сорбента в препарате определяли лиофилизацией проб с последующим пересчетом значений полученных масс; концентрацию белков - спектрофотометрически по методу Брэдфорд.

3 Исследование антигенных свойств полученных препаратов рекомбинантных белков. Одним из ключевых моментов при разработке субъединичных препаратов является сохранение нативной конформации антигенов в составе рекомбинантных молекул. Определить сохранность конформации белка можно по эффективности взаимодействия его со специфическими антителами. Способность микобактериапьных антигенов CFP-10 и ESAT-6 в составе рекомбинантных белков взаимодействовать с антителами сывороток проверяли с помощью технологии суспензионных биочипов (Х-Мар Technology, Luminex, США), позволяющей самостоятельно моделировать наборы. При планировании эксперимента учитывали, что антитела к антигенам ESAT-6 и CFP-10 обнаруживают преимущественно в сыворотках больных с активной формой инфекции; у переболевших и больных хроническим ТБ

уровень антител незначительный; у вакцинированных BCG антитела к этим антигенам отсутствуют (Lyashchenko К., 1998, Wu X., 2010). Антитела к 38 кДа антигену М. tuberculosis (protein 38) синтезируются на всех стадиях инфекции, а также в ответ на вакцинацию BCG.

3.1 Иммобилизация белков на полистирольных микросферах. С помощью коммерческого набор «Amine Coupling Kit» (Bio-Rad, США) были получены 3 образца полистирольных микросфер, к которым химическим способом прикрепляли антигены: полученные в работе ESAT6-CBD, CFP10-CBD и protein 38, любезно предоставленный с.н.с. Грабко В.И. В качестве положительного контроля использовали protein 38, отрицательного - PBS буфер.

3.2 Анализ сывороток на флуориметре Bio-Plex с проточной системой детекции. В работе исследовали 56 образцов сывороток (в том числе 24 от больных ТБ), любезно предоставленных д.м.н. Владимирским М.А. (НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова). Для детекции комплекса антиген-антитело на поверхности микросфер использовали конъюгат на основе аффинно-очищенных антител козы к иммуноглобулинам человека классов IgG, IgA, IgM (ИМТЕК, РФ) с присоединенной к ним флуоресцентной меткой тетраметилкарбоксиродамин (сигнал флуоресценции при длине волны 576 нм).

PBS 1

номера сывороток

Рисунок 4. Результаты проверки сывороток (Ns 1, 5 11, 13, 14). PBS - буфер; р38, ESAT6-CBD, CFP10-CBD - молекулы мишени.

Первоначально все сыворотки анализировали по мишени protein 38. Из группы сывороток от больных были отобраны пять образцов от больных с острой формой ТБ: 1, 5, 11, 13, 14. При тестировании указанных сывороток для всех мишеней получили высокие значения флуоресценции (Рис. 4), что свидетельствует об образовании специфического комплекса антиген-антитело на поверхности микросфер. Таким образом, было подтверждено, что домены ESAT-6 и CFP-10 в составе рекомбинантных белков, сохранили свои антигенные свойства.

4. Изучение иммуногенных свойств комплексных препаратов. Важным этапом для создания иммунопрофилактических средств является проверка сохранения рекомбинантными антигенами иммуногенных свойств.

Таблица 1

Препараты, проверенные в опытах in vivo на мышах

№ Название Состав Доза

1 ESAT6-CBD-AU белок ЕБАТб-СВО на АЦ 10 мкг/мышь по ЕБАТб, 0,04% АЦ

2 CFPIO-CBD-АЦ белок СРРЮ-СВО на АЦ 10 мкг/мышь по СРР10 0,09% АЦ

3 Ag85A-CBD-AIi белок Ag85A-CBD на АЦ 10 мкг/мышь по Ag85A 0,02% АЦ

4 Ag85A-CBD белок Ag85A-CBD 10 мкг/мышь по Ag85A без сорбента

5 Ag85A-CBD с НАФ белок Ag85A-CBD с неполным адъювантом Фрэйнда (НАФ) 10 мкг/мышь по Ag85A без сорбента

6 ESAT6-CBD-AU/ Ag85A-CBD-A4 одновременно 2 белка ЕБАТб-СВО и Ag85A-СВЭ на АЦ 10 мкг/мышь по ЕБАТ6 29 мкг/мышь по Ag85A, 0,16% АЦ

7 CBD-АЦ белок СВО на АЦ 10 мкг/мышь по СВО 0,02% АЦ

8 CBD белок СВЭ 10 мкг/мышь по СВО без сорбента

9 АЦ аморфная целлюлоза 0,1% АЦ

10 контроль интактные неиммунизи-рованные животные нет нет

При туберкулезной инфекции основой адаптивного иммунитета преимущественно является клеточное звено: бактерицидная активность

макрофагов, стимулированная Т-лимфоцитами, при этом основным цитокином считается ИФН-у (Апт A.C., 2006, North R.J., 2004). Поэтому иммуногрнность препаратов оценивали по степени антиген-специфической пролиферации лимфоцитов и по количеству Т-лимфоцитов, продуцирующих ИФН-у. В опытах in vivo были проверены следующие образцы препаратов (Табл. 1).

4.1 Оценка антиген-специфического пролиферативпого ответа. Проверку антиген-специфического пролиферативного ответа проводили на мышах линии C57BI/6, устойчивых к туберкулезной инфекции. Было выбрано два рекомбинантных антигена: Ag85A, экспрессирующийся постоянно в клетках микобактерий, и ESAT-6, секретирующийся в активной фазе процесса инфицирования.

В опыте с антигеном Ag85A-CBD были проверены свободный белок, иммобилизованный на АЦ, антиген в комбинации с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ), CBD, как компонент рекомбинантного белка, CBD-АЦ и сама АЦ. Контролем служил физраствор.

24000 22000 20000 18000 16000 14000 12000 ^0000 В 8000 ■Í 6000 В 4000 » 2000

......10949.

|49

-2205-

...1001.. . X .. .

AgSSA-CBD AgSSA-CBD-АЦ Ад85А-группы

CBD-АЦ

АЦ

■ -522-.....-

контроль

Рисунок 5. Пролиферативиый ответ клеток паховых лимфатических узлов на антиген Ag85A после двукратной подкожной иммунизации препаратами Ag85A-CBD, Ag85A-CBD-All Ag85A-CBD+HA4>, CBD, CBD-АЦ, АЦ мышей линии C57BI/6. А шп./мин - разница значений имп./мин для каждой группы при добавлении и без антигена Ag85A.

При двукратной иммунизации мышей во всех группах с Ag85A-CBD наблюдали специфический пролиферативиый ответ (Рис. 5). В группе с иммобилизованным белком Ag85A-CBD-ALI отмечали усиление

пролиферативного ответа лимфоцитов почти в 5 раз по сравнению с группой Ag85A-CBD и в 20 раз по сравнению с неиммунизированными животными. В группе с иммобилизованным белком Ag85A-CBD и НАФ, отмечали наибольшую стимуляцию пролиферативного ответа. В группе, которой вводили носитель - АЦ, пролиферативного ответа лимфоцитов на исследуемый антиген не выявлено, что подтверждает иммунотолерантность целлюлозы. Следует подчеркнуть, что иммобилизация антигена на АЦ способствовала презентации антигена клеткам иммунной системы, что выразилось в усилении пролиферативного ответа лимфоцитов на Ag85A-CBD-AЦ по срвнению со свободным антигеном.

В опыте с антигеном ЕБАТб-СВБ проверяли только иммобилизованную форму препарата. При обеих схемах иммунизации в группе ЕБАТб-СВО-АЦ наблюдали усиление пролиферативного ответа в 2,7-3,7 раз в сравнении с группой СВБ-АЦ и в 15 раз в сравнении с интактными животными (Рис. 6). Более сильный пролиферативый ответ лимфоцитов наблюдали при однократном введении препарата под кожу задних лап (Рис. 6Б). Возможно, на активность клеточного ответа влияет не только кратность введения антигена, но и расположение исследуемых лимфоузлов относительно места инъекции.

10000 8000 6000 „ 4000

4753 т-1 —

..........а_____________СП.

Е5АТ6-СВО-АЦ

группы

10000 8000 6000 5 4000

Б 2000 6

Г'

2748 г-Х —

493

Е5АТ6-СВО-АЦ

группы

СВР АЦ

Рисунок 6. Пролиферативный ответ клеток паховых лимфатических узлов па антиген Е8АТ6 после двукратной (А) и однократной (Б) подкожной иммунизации препаратами ЕБАТб-СВО-АЦ, СВй-АЦ мышей линии С57В1/6. А имп./ мин - разница значений имп./мин для каждой группы при добавлении и без антигена ЕБАТб.

4.2 Определение числа Т-лимфоцитов селезенки, продуцирующих интерферон-гамма. Мышей линии I/St, сверхчувствительных к туберкулезной инфекции, иммунизировали двукратно подкожно препаратами CFPIO-CBD-АЦ, ESAT6-CBD-AIJ, Ag85A-CBD-AIJ, CBD-АЦ и однократно BCG-1 Russia. Через 5 недель в селезенке исследуемых мышей с помощью ELISPOT определяли количество Т-клеток, продуцирующих ИФН-у.

CFPIO-CBD-АЦ ESAT6-CBD-AU AgSSA-CBD-AU rpynm.i

Рисунок 7. Количество Т-клеток селезенки, продуцирующих ИФН-у in vitro в ответ па антигены ESAT-б, CFP-10, Ag85A после подкожной двукратной иммунизации препаратами CFPIO-CBD-АЦ, ESAT6-CBD-AU,, Аё85А-СВО-АЦ, CBD-АЦ и однократной BCG-1 Russia мышей линии I/St. А - в значениях для каждой группы при добавлении и без специфического антигена.

Во всех опытных группах наблюдали увеличение количества Т-клеток, синтезирующих ИФН-у (Рис.7), что было сравнимо с группой животных, однократно вакцинированных BCG - самой эффективной на сегодняшний день вакциной против туберкулеза. Таким образом, на этом этапе работы нам удалось подтвердить, что препараты на основе рекомбинантных антигенов микобактерий, конъюгированных с АЦ CBD, при подкожном введении обладали способностью индуцировать антиген-специфический иммунный ответ клеток лимфатических узлов и стимулировать продукцию ИФН-у по сравнению с контрольными группами мышей, иммунизированных только CBD-АЦ.

5. Изучение протективных свойств иммунологических композиций. Основным показателем эффективности вакцинных препаратов является их

способность защищать организм от заболевания, вызываемого вирулентным штаммом М. tuberculosis. Это проявляется, в частности, в снижении бактериальной нагрузки в органах и удлинении времени жизни зараженных животных.

5.1 Оценка микобактериальной нагрузки легких и селезенки в высевах гомогенатов на агаре Дюбо. Для исследования этого показателя мышей C57BI/6 иммунизировали подкожно двукратно препаратами рекомбинантных антигенов и через 5 недель после последней инъекции заражали внутривенно вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv.

4.50Е+08

4.00Е+08

3.50Е+08

3.00Е+08

I 2.50Е+08 С

§• 2.00Е+08 § 1.50Е+08 1.00Е+08 5.00Е+07 O.OOE+QO

3.40Е+08

ESATS-CBD-ALl физ. раствор

5Д0Е+07 I

З.ЗОЕ+07

Рисунок 8. Количество КОЕ на ср. Дюбо в высевах гомогенатов органов (легкие, селезенка) на 21 день после внутривенного заражения М tuberculosis H37Rv мышей линии С57В1/6.

r 8.00Е+07

О.ООЕ+ОО

1,10Е<08

;80ЕТ07-

■ Ag85A-CBD+HA<í>

■ AgS5A-CBD-ALl CBD-АЦ

■ физ. раствор

о 6.00Е+07

2 4.00Е+07 х 1.40ЕИ

2.00Е+07 - Í0ZE±Q7_

9Д0Е+06 2.95Е+06 5.4ОЕ+06

2.60Е+06

- - —

легкое

селезенка

Рисунок 9. Количество КОЕ на ср. Дюбо в высевах гомогенатов органов (легкие, селезенка) на 21 день после внутривенного заражения М. tuberculosis H37Rv мышей линии C57BI/6.

Через 3 недели гомогенаты тканей легких и селезенки мышей высевали на чашки Петри с агаром Дюбо; через 3 недели подсчитывали колонии. Результаты опытов показали, что вакцинация ESATó-CBD-АЦ уменьшает бактериальную нагрузку примерно в 7 раз (легкие) и в 4 раза (селезенка) в сравнении с контролем (Рис. 8). В группах, иммунизированных антигеном Ag85A-CBD-Alí, отмечали существенное уменьшение бактериальной нагрузки в легких в сравнении с контролем - в 7-9 раз. (Рис 9).

5.2 Определение динамики выживаемости вакцинированных животных при экспериментальном заражении. Состояние мышей после заражения М. tuberculosis H37Rv оценивали ежедневно, начиная с 15-го дня с момента заражения. Для выявления достоверности различий использовали критерий Гехана для кривых выживания, Р < 0,01.

При анализе динамики выживаемости мышей линии C57BI/6 после внутривенного заражения (в данном случае моделировали острую инфекцию), наиболее высокую устойчивость к М. tuberculosis H37Rv наблюдали у мышей, вакцинированных BCG-1 Russia, - половина из них погибла только на 160 сутки (Рис. 10).

Время после заражения, дни

Рисунок 10. Динамика выживаемости мышей линии С57В1/6 (двукратная иммунизация препаратами ESATó-CBD-АЦ/ Ag85A-CBD-AL¡, CBD-АЦ; однократная BCG) после внутривенного заражения М. tuberculosis H37Rv.

Половина мышей, иммунизированных преператом из 2-х антигенов pSAT6-CBD-АЦ и Ag85A-CBD-ALJ, использованных в равных соотношениях, пала на

120 сутки, тогда как в контрольных группах мышей уже на 25 сутки 50% животных не стало. Таким образом, вакцинирование мышей преператом из 2-х антигенов ESATó-CBD-ЛЦ и Ag85A-CBD-AIJ, защитило животных от развития острой фазы микобактериальной инфекции, но менее эффективно, чем классическая вакцина.

В опыте на мышах линии I/St моделировали развитие хронической формы туберкулеза при аэрозольном заражении М. tuberculosis H37Rv. Как видно из рисунка 11, выживание в группе мышей, вакцинированных препаратом CFP-CBD-АЦ, сопоставимо с группой животных, защищенных классической вакциной BCG. Препатары Ag85A-CBD-AIJ и ESAT6-CBD-AIJ защищали мышей в течение меньшего промежутка времени (Рис. 11).

Времяпосле заражени я, дн и

Рисунок 11. Динамика выживаемости мышей линии I/St (двукратная штуиизация препаратами Ag85A-CBD-AIÍ, ESATÓ-CBD-ЛЦ, CFPIO-CBD-АЦ, CBD-АЦ; однократная BCG) после аэрозольного заражения М. tuberculosis H37Rv.

Таким образом, в серии проведенных испытаний препаратов мы показали, что иммунологические композиции, содержащие рекомбинантные антигены (CFP10-CBD, ESAT6-CBD, Ag85A-CBD) в иммобилизованной форме, при подкожном введении снижают бактериальную нагрузку в легких и в селезенке по сравнению с контролями после внутривенного заражения М. tuberculosis H37Rv и увеличивают продолжительность жизни как устойчивых (C57BI/6), так и чувствительных (I/St) к туберкулезной инфекции линий животных при внутривенном и аэрозольном заражении М. tuberculosis H37Rv.

6 Применение рекомбииаитных белков ESAT6-CBD и CFP10-CBD для диагностики туберкулезного инфицирования на основе количественного анализа индукции ИФН-у клетками цельной крови in vitro. Основываясь на проверенных антигенных свойствах рекомбинантных белков ESAT6-CBD и CFP10-CBD, мы использовали их при разработке тест-системы для диагностики туберкулезного инфицирования. Работа была выполнена совместно с сотрудниками НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова под руководством Владимирского М.А.. Базой для тест-системы послужила разработанная ранее Владимирским М.А. и соавт. иммуноферментная тест-система для количественного определения ИНФ-у, индуцированного в образцах цельной крови.

Таблица 2

Индукция ИФН-у у детей и подростков в образцах крови при различных формах

№ группы Диагноз Кол-во больных Концентрация ИФН-у, пг/мл, медиана (25-75% межквартальные величины)

туберкулин Р ESAT-6 и CFP-10 • Р

1 Туберкулино-отрицательные -здоровые 31 85 (48-181) Pl-2< 0,001 0 (0-0) Pl-2< Н.Д.

2 Поствакцинальная ВСО-аллергия 40 282 (280-440) р2-3< 0,001 0(0-0) Р2-3< 0,001

3 Впервые инфицированные -«вираж» пробы Манту 52 552(338-862) Рз-«< 0,001 351 (152-537) Рз-4,5.6 <н.д.

4 Здоровые - ранее инфицированные 46 552 (294-720) РЭ-4" Н.Д. 336(182-552) Рз-4 — н.д.

5 Инфицированные, с туберкулезной пневмонией 10 820 (520-1240) Р4-5 = 0,052 525 (280-580) Р4-5- н.д.

6 ТБ внугригрудных лимфатических узлов 25 624(323-1033) Рз-б- Н.Д.* 377 (156-791) Рз-6-н.д.

7 ТБ легких 73 213 (91-374) Р7-ЗА5.6 <0,01 47 (19-161) Р7-3,4,5,6 <0,01

р - критерий Вилкоксона; н. д. - недостоверно.

Помимо рекомбинантиых антигенов для индукции синтеза ИНФ-у использовали туберкулин. С помощью тест-системы было обследовано более 270 детей и подростков в возрасте от 1 до 14 лет с установленными диагнозами.

По результатам исследования для индивидуальной оценки наличия туберкулезного инфицирования был принят пороговый критерий уровня индукции ИФН-у более 70 пг/мл. Было установлено, что чувствительность определения первичной туберкулезной инфекции у детей и подростков в цельной крови in vitro при таком пороговом значении ИФН-у составила 97,6%. Специфичность исследования при анализе у пациентов с отрицательной (сомнительной) пробой Манту и детей с поствакцинальной аллергией составила 94,4 %. Результаты представлены в Таблице 2.

Для дифференциальной диагностики «виража» туберкулиновой пробы и поствакцинальной BCG аллергии обращали внимание, прежде всего, на результаты теста с рекомбинантными антигенами. Они были отрицательными у пациентов с поствакцинальной аллергией, поскольку вакцинный штамм не содержит фрагмента генома, кодирующего белки ESAT6 и CFP10. У пациентов с конверсией туберкулиновой пробы результаты были достоверно положительными с указанными антигенами. По степени индукции ИФН-у туберкулином эти две группы проб достоверно не различались. При сопоставлении иммунного ответа на туберкулин и смесь рекомбинантиых белков у детей, ранее инфицированных (гр. 4) и инфицированных с туберкулезной пневмонией (гр. 5), значимых различий между группами выявлено не было. Уровень индукции ИФН-у у больных ТБ легких (гр. 7) в среднем был существенно ниже, чем у лиц с первичной туберкулезной инфекцией (гр. 3).

Известные в настоящее время тест-системы для определения иммунного ответа на антигены М. tuberculosis, основаны на количественном анализе индуцированного антигенами ИФН-у. QuantiFERON-TB-Gold и QuantiFERON-TB-Gold in Tube (Cellestis, Австралия), и на измерении количества Т-лимфоцитов, продуцирующих ИФН-у: T-SPOT-TB (bioMérieux, Франция). По

данным Eum S.Y. et al. 2008, специфичность количественных тестов на ИФН-у, индуцированный антигенами ESAT6-CBD и CFP10-CBD, составляет 98%. Тест был положительным при активной туберкулезной инфекции в 89% случаев.

Преимущество разрабатываемой комплексной системы заключается в том, что при отсутствии индукции ИФН-у в лунках со смесью рекомбинантных антигенов ESAT6-CBD и CFP10-CBD, но положительном тесте в лунках с туберкулином для одной и той же пробы крови можно подтвердить наличие поствакцинальной BCG-аллергии у пациента и исключить туберкулезное инфицирование.

ВЫВОДЫ

1. Созданы бактериальные штаммы-продуценты химерных белков, состоящие из последовательности полноразмерных белков CFP-10, ESAT-6, Ag85A М. tuberculosis, соединенные с целлюлозосвязывающим аффинным доменом.

2. Разработана технология выделения, очистки, иммобилизации и формулирования препаратов рекомбинантных антигенов CFP10, ESAT6, Ag85A М. tuberculosis на целлюлозном сорбенте.

3. Подтверждено сохранение антигенных свойств рекомбинантных туберкулезных антигенов CFP10, ESAT6, Ag85A М. tuberculosis в составе химерных белков с целлюлозосвязывающим доменом.

4. Препараты рекомбинантных антигенов CFP10, ESAT6, Ag85A М tuberculosis с целлюлозосвязывающим доменом, иммобилизованные на аморфной целлюлозе, активируют клеточное звено иммунитета, уменьшают микобактериальную нагрузку легких и селезенки, продлевают срок жизни мышей зараженных штаммом М. tuberculosis H37Rv и являются перспективным компонентом для разработки субъединичной противотуберкулезной вакцины.

5. Показана эффективность полученных рекомбинантных антигенов ESAT6-CBD и CFP10-CBD в тестировании туберкулезной инфекции на основе индкуции ИФН-у в образцах цельной крови.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Мордовская Л.И., Аксенова В.А., Владимирский М.А., Аксенова Е.И., Ефремов Е.Е., Власик Т.Н. Количественный анализ индукции интерферона - у клетками цельной крови in vitro в присутствии антигенов микобактерий туберкулеза. // Педиатрия. Журнал им. Г.Н. Сперанского. - 2009. - Т. 88, №5. -С.43-46.

2. Владимирский М.А., Мордовская Л.И., Аксенова В.А., Шипина Л.К., Аксенова Е.И., Сергиенко О.В., Ляшук A.M., Неретина Т.В., Карягина A.C., Лунин В. Г., Ефремов Е.Е., Игнашенкова Г.В., Власик Т.Н., Янушевская Е.В., Каширина Н.М. Разработка и применение отечественной тест-системы диагностики туберкулезного инфицирования на основе количественного анализа индукции интерферона гамма в образцах цельной крови in vitro с использованием специфических рекомбинантных антигенов. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - №1. - С.49-54.

3. Мордовская Л.И., Власик Т.Н., Ефремов Е.Е., Аксенова Е.И., Сазыкин И.М., Белоусов П.В., Недоспасов С.А., Владимирский М.А. Антиген-специфическая индукция провоспалительных цитокинов в образцах цельной крови ex vivo в диагностике и мониторинге туберкулезной инфекции. // Лаборатория. - 2010. - №2. - С.24-25.

4. Мордовская Л.И., Аксенова В.А., Шипина Л.К., Аксенова Е.И., Ефремов Е.Е., Власик Т.Н., Владимирский М.А. Антиген-специфическая индукция интерферона - у в образцах цельной крови m vitro для оценки специфического противотуберкулезного иммунитета и дифференцирования туберкулезного инфицирования и поствакцинальной аллергии. // Научные труды (К 85-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки, профессора М.М. Авербаха). Под ред. Литвинова В.И. - М.: МНПЦБТ. - 2010. - С. 48-52.

5. Аксенова Е.И., Лящук А.М., Сергиенко О.В., Полетаева H.H., Карягина A.C., Лунин В.Г., Кондратьева Т.К., Апт A.C. Разработка субъединичных вакцин против туберкулеза с применением нанотехнологических подходов. // Тез. III Международного форума по нанотехнологиям (1-3 ноября 2010) - Москва, 2010.

Патенты н заявки на патенты

6. Аксенова Е.И., Лунин В.Г., Галушкина З.М., Полетаева H.H., Грабко В.И., Гинцбург А.Л. Пат. RU(11)2378371(13)C1 РФ, МПК C12N1/21 (2006.01), C12N15/00 (2006.01). Рекомбинантная плазмида (варианты), штамм Escherichia coli (варианты) - продуцент химерных белков, химерный белок (варианты), способ иммобилизации, концентрирования и очистки рекомбинантных белков на целлюлозе, способ иммобилизации рекомбинантных белков на полистирольных носителях / № 2008145612/13; заявлено 19.11.08; опубл. 10.01.10, Бюл. № 1(Шч.). - С.713-714.

7. Аксенова Е.И., Лящук А.М, Сергиенко О.В., Галушкина З.М., Полетаева H.H., Кондратьева Т.К., Рубакова Э.И., Arrr A.C., Карягина-Жулина A.C., Лунин В.Г., Гинцбург А.Л. Заявка № 2010123883 от 15.06.2010. Рекомбинантная плазмида, штамм Escherichia coli, химерный белок и их применение.

8. Аксенова Е.И., Лящук А.М., Сергиенко О.В., Галушкина З.М., Полетаева H.H., Кондратьева Т.К., Рубакова Э.И., Апт A.C., Карягина-Жулина A.C., Лунин В.Г., Гинцбург А.Л. Заявка № 2010123879 от 15.06.2010. Рекомбинантная плазмида, штамм Escherichia coli, химерный белок и их применение.

9. Аксенова Е.И., Лящук А.М., Сергиенко О.В., Галушкина З.М., Полетаева H.H., Лаврова Н.В., Кондратьева Т.К., Рубакова Э.И;, Апт A.C., Карягина-Жулина A.C., Лунин В.Г., Гинцбург А.Л. Заявка № 2010137865 от 13.09.2010. Рекомбинантная плазмида pAg85A-CBD, штамм Escherichia coli [pREP4, pAg85A-CBD], химерный белок Ag85A-CBD и их применение.

БЛАГОДАРНОСТИ

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность научным руководителям В.Г. Лунину и Т.К. Кондратьевой за постоянное внимание, всестороннюю помощь, полученные знания и навыки.

Искренне признательна сотрудникам лаборатории иммуногенетики ЦНИИТ РАМН A.C. Апту, Э.И. Рубаковой, Е.В. Кондратьевой за решение организационных вопросов, большую помощь в проведении работ с животными, а также прочтение рукописи диссертации.

За предоставление материалов и успешную совместную работу благодарю сотрудников НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова М.А. Владимирского, Е.Е. Ефремова, Т.Н. Власика.

За оказанную помощь в работе, прочтение рукописи, критические замечания и многочисленные советы благодарю сотрудников лаборатории биологически активных наноструктур ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России: О.В. Сергиенко, Е.М. Рязанову, A.M. Лящука, H.H. Полетаеву, Т.Е. Халину, И.Н. Сняткову, З.М. Галушкину, В.И. Грабко, Н.Е. Шарапову, А.П. Котнову, А.П. Ткачука, A.C. Карягину, Т.Н. Большакову, О.Ю. Добрынину, А.М. Умярова, В.П. Гудова, Л.А. Соболеву, Н.В. Лаврову, Л.К. Павлову. Искренне признательна О.Л. Ворониной за ценные советы в работе и написании диссертации.

Выражаю глубокую благодарность администрации ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России за предоставленную возможность заниматься научной работой.

Глубокую признательность выражаю ученому секретарю диссертационного совета ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России, д.м.н. профессору Е.В. Русаковой и д.м.н. A.A. Асратян и за помощь при подготовке диссертации к защите.

Особую благодарность выражаю своим родным и близким за всестороннюю поддержку в течение всего творческого пути.

Подписано в печать 02.03.2011 г.

Заказ № 18 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. (499)152-00-16 Тираж 100 шт.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и характеристика рекомбинантных антигенов Mycobacterium Tuberculosis как компонентов потенциальных вакцинных препаратов"

Актуальность проблемы. Туберкулез (ТБ), как заболевание, поражающее людей, известно еще с древних времен. В настоящее временя ТБ считается одной из самых опасных инфекционных болезней, распространенных повсеместно, и остается важной причиной гибели людей во всем мире. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) ежегодно регистрируется около 9,0 млн. новых случаев, смертность от ТБ в среднем составляет 1,5-2 млн. человек в год; на 2010 г. в мире зарегистрировано более 3 млрд. инфицированных. Около 80% этих цифр составляет вклад Африки (южнее Сахары), Юго-Восточной Азии и Полинезии, однако ситуация в других частях Земного шара остается сложной [1, 3]. Россия относится кнам с высоким уровнем заболеваемости ТБ. Рост показателя заболеваемости в России начался с 1991 г. — 34,0 на 100 тыс. населения, в 2000 г. - 90,7 на 100 тыс., в 2010 г. - 56,35 на 100 тыс. [27, 18].

Единственной разрешенной в настоящее время вакциной от ТБ является вакцина BCG (Bacillus Calmette-Guerin), которая представляет собой живой атгенуированный штамм Mycobacterium bovis. Она безопасна, недорога, достаточно эффективно защищает детей от диссеминированного (милиарного) ТБ, однако не защищает взрослых от легочного ТБ, а именно эта форма болезни приводит к распространению инфекции и тяжелой эпидемической ситуации. Кроме того, использование BCG вызывает различные поствакцинальные осложнения [137]. Поэтому очевидна высокая актуальность совершенствования BCG и разработка новых иммунопрофилактических средств против ТБ.

Один из предлагаемых подходов повышения эффективности вакцинации — схема так называемой «prime-boost» (от англ. поддержка главного) вакцинации, когда для первичной иммунизации («prime») используется вакцина BCG, а для последующих ревакцинаций («boost») - разрабатываемые препараты нового поколения [41]. Субъединичные генно-инженерные препараты, содержащие протективные антигены микобактерий, представляют большой интерес. Они обладают такими существенными преимуществами как низкая реактогенность, высокая чистота получаемого продукта, а также безопасность для людей с нарушенным иммунитетом. Однако при иммунизации отдельными антигенами для индукции достаточного иммунного ответа необходимы сильные адъюванты, большая часть из которых используется только в экспериментальных моделях на животных, и не разрешена для клинического применения.

Mycobacterium tuberculosis - это внутриклеточный патоген, и основная роль в адаптивном иммунитете к ТБ принадлежит клеточным, а не гуморальным факторам защиты [118]. Разные группы антигенов микобактерий, например, белки теплового шока, липропротеины, секреторные белки, ферменты, изучены достаточно хорошо [59, 162]. По мнению многих авторов, основными мишенями (иммунодоминатными антигенами) протективного иммунитета являются секреторные белки, присутствующие в культуральном фильтрате М. tuberculosis. Среди них наиболее полно охарактеризованы близкородственные белки комплекса Ag85 (Ag85A, В и С), ESAT-6 (Early Secret Antigen Target) и CFP-10 (Culture-Filtrate Protein) [115].

Эти белки в настоящее время проходят разные стадии испытаний в качестве кандидатных вакцин [68]. Однако получение отдельных рекомбинантных антигенов осложнено гетерологичной экспрессией, проблемами с выделением и очисткой. Поэтому разработка подхода, направленного на преодоление перечисленных сложностей при получении компонентов субъединичных препаратов, индуцирующих сильный иммунный ответ, представляет научный и практический интерес.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

3. Исследовать антигенные свойства полученных препаратов рекомбинантных белков in vitro.

5. Оценить протективные свойства полученных препаратов в моделях экспериментального туберкулеза при-разных способах заражения.

6. Исследовать эффективность рекомбинантных антигенов в тестировании туберкулезного инфицирования на основе индукции интерферона гамма^

Научная шшизна. Созданы рекомбинантные плазмиды, кодирующие химерные белки, включающие полноразмерные антигены CFP-10, ESAT-6, Ag85A М. tuberculosis и целлюлозосвязывающий домен (CBD) эндо-1,4-Р-глюканазы CelD микроорганизма Anaerocellum thermophilum. На основе плазмидных конструкций получены эффективные штаммы-продуценты полноразмерных микобактериальных антигенов в составе химерных белков с высоким уровнем синтеза в клетках Е. coli.

Разработана эффективная система выделения, очистки и; формулирования препаратов рекомбинантных антигенов на целлюлозной матрице.

Получены белково-полисахаридные композиции при иммобилизации химерных белков на аморфной целлюлозе. Изучены их иммуногенные и протективные свойства на инбредных мышах двух линий: генетически устойчивой к туберкулезной инфекции — C57BI/6 и чувствительных - I/St. Подтверждено сохранение иммуногенных свойств микобактериальных белков в составе исследуемых препаратов. Протективные свойства препаратов не уступали таковым у вакцины BCG.

Практическая значимость работы. Охарактеризованные препараты рекомбинантных микобактериальных антигенов и полученных иммуногенных белково-полисахаридных комплексов могут быть использованы при разработке субъединичных препаратов1 для профилактики ТБ:

При использовании смеси рекомбинантных микобактериальных антигенов ESAT-6 и CFP-10 разработана' тест-система определения туберкулезного инфицирования на основе индукции in vitro интерферона гамма (ИФН-у).

Апробация работы. Результаты работы доложены на международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологии в рамках Международного форума по нанотехнологиям в г. Москве 1-3 ноября 2010г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ; 1 - в сборниках научных трудов; 1 — в материалах конференции; 4 — патента и заявок на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 114 страницах машинописного текста и включает Введение и 4 главы, Выводы и Список используемой литературы 167 источников, из которых 32 отечественных и 135 иностранных. Работа содержит 21 рисунок, 7 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Аксенова, Екатерина Ивановна

выводы

2. Разработана технология выделения, очистки, иммобилизации и формулирования препаратов рекомбинаптных антигенов CFP10, ESAT6, Ag85A М. tuberculosis на целлюлозном сорбенте.

4. Препараты рекомбинантных антигенов CFP10, ESAT6, Ag85A М. tuberculosis с целлюлозосвязывающим доменом, иммобилизованные на аморфной целлюлозе, активируют клеточное звено иммунитета, уменьшают микобактериальную нагрузку легких и селезенки, продлевают срок жизни мышей зараженных штаммом М. tuberculosis H37Rv и являются перспективным компонентом для разработки субъединичной противотуберкулезной вакцины.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы достигнут значительный прогресс в разработке нового поколения вакцин от туберкулеза. Многие препараты находятся на разных стадиях клинических и доклинических испытаний [41, 68, 115, 123, 125, 139]. В отличие от создаваемых цельноклеточных препаратов на основе модифицированных штаммов BCG, предназначенных для замены существующей вакцины, субъединичные и ДНК-препараты нацелены в первую очередь на применение среди населения уже иммунизированного BCG. Это так называемая схема «prime-boost» (от англ. поддержка главного) вакцинации, когда для первичной иммунизации («prime») используется вакцина BCG, а для последующих ревакцинаций («boost») -разрабатываемые препараты нового поколения [41]. По мнению многих исследователей, даже если действие создаваемых препаратов будет не дольше классической применяемой вакцины (менее 7 лет), их использование позволит значительно снизить уровень заболеваемости в возрастной категории людей 25-35 лет, особенно подверженных поствакцинальному заболеванию туберкулезом [68].

Субъединичные генно-инженерные препараты, содержащие протекгивные антигены М. tuberculosis представляют большой интерес и обладают такими существенными преимуществами как низкая реакгогенность, высокая чистота получаемого продукта, а также безопасность для людей с ослабленным иммунитетом. Среди кандидатных мишеней для получения первого поколения новых вакцин, разрабатываемых в поддержку BCG, наиболее перспективными считаются антигены Ag85A, Ag85B, ESAT-6, CFP-10 M. tuberculosis. Предложено их использование в виде отдельных антигенов, а также в различных сочетаниях [47, 61, 63, 65, 75,106, 111].

Использованный в настоящей работе подход для конструирования двудомепных белков, основанный на технологии рекомбинантных ДНК, позволил решить проблему гетерологичной экспрессии, выделения и очистки рекомбинатных белков. На основе непатогенных лабораторных штаммов Е. coli были созданы эффективные бактериальные продуценты. Синтезируемые в клетках химерные белки содержат последовательности полноразмерных белков CFP-10, ESAT-6, Ag85A М. tuberculosis, Gly- Ser спейсера и целлюлозосвязывающего домена эндо-1,4-р-глюканазы CelD A. thermophilum. Анализ стабильности индуцируемых белков показал, что более стабильными были двудоменные белки, в которых домен антигенов М. tuberculosis располагался в N-концевой ориентации относительно CBD. Таким образом, для получения препаративных количеств были отобраны следующие штаммы:

- Е. coli М15 [pREP4, pCFP10-CBD] - продуцент белка CFP10-CBD 32,8 кДа;

- Е. coli М15 [pREP4, pESAT6-CBD] - продуцент белка ESAT6-CBD 32,0 кДа;

- Е coli М15 [pREP4, pAg85A-CBD] - продуцент белка Ag85A-CBD 54,1 кДа.

Благодаря аффинному взаимодействию целлюлозосвязывающего домена с целлюлозной матрицей, проводили выделение, концентрирование и очистку рекомбинатных белков в одну стадию. Синтезируемые в штаммах-продуцентах белки CFP10-CBD, ESAT6-CBD, Ag85A-CBD являются единственными прочно связывающимися с целлюлозным сорбентом, поскольку в клетках Е. coli отсутствуют белки, взаимодействующие с этим полисахаридом. Из нескольких видов проверенных в работе целлюлозных сорбентов, наибольшей сорбционной емкостью обладали препараты сферической пористой целлюлозы с амофной структурой Perloza (фирма Iontosorb). Они позволяли получить высокую концентрацию белка на матрице и в тоже время, в условиях наменыпего 5 повреждающего действия для белков обеспечивали их эффективную десорбцию с сорбента. В свободном (неиммобилизованном) состоянии антигены представляли собой растворы белков с определенной ионной силой, свободные от примесей полисахаридов, ДНК штамма-продуцента, с чистотой не менее 92%. Полученные препараты рекомбинантных белков CFP10-CBD, ESAT6-CBD, Ag85A-CBD были стабильны при хранении в течение 2 месяцев при 4°С и около 1 года при -20°С.

Сохранение нативной конформации рекомбинатных молекул проверяли методом многокомпонетного иммуноанализа анализа. В частности для белков CFP10-CBD, ESAT6-CBD было показано, что смысловые домены ESAT-6 и CFP-10 в составе химерных белков сохранили свои антигенные свойства.

Рекомбинатные белки М. tuberculosis, в частности, ESAT-6 и CFP-10, имеют не только вакцинную значимость, но и представлют диагностический интерес [37, 47, 65]. Основываясь на проверенных антигенных свойствах рекомбинантных белков ESAT6-CBD и CFP10-CBD, мы использовали их для дифференциальной диагностики туберкулезного инфицирования на основе количественного анализа индукции ИФН-у клетками цельной крови in vitro. С помощью разработанной тест-системы было обследовано более 270 детей и подростков. При сравнении уровней индукции ИФН-у на специфичные антигены ESAT6-CBD, CFP10-CBD и контрольный препарат очищенного туберкулина PPD удалось дифферецировать наличие поствакцинальной аллергии и отвергнуть туберкулезное инфицирование.

Иммунизация свободными, не адсорбированными на носителе, рекомбинантными антигенами не приводит к эффективной стимуляции иммунного ответа организма. Поэтому одной из важнейших задач при получении иммнунопрофилактических препаратов является поиск путей повышения иммуногенности синтезированных бактериальных антигенов. Решение этой задачи для белковых соединений существенно продвинулось в результате иммобилизации антигенов на различных носителях или при введении их вместе с адъювантами [6, 25, 32]. Применение целлюлозных сорбентов для иммобилизации антигенов с целью повышения их иммуногенности была продемонстрирована проф. Гурвичем А. Е. с соавт. [8, 9,13, 78,121].

Полученные в данной работе белково-целлюлозные комплексы, использованные для иммунизации животных, представляют собой суспензию аморфной целлюлозы со специфически адсорбированными рекомбинатными белками. Применение полисахаридного сорбента для иммобилизации антигенов способствовало укрупнению молекул иммуногена. Аффинное взаимодействие рекомбинантных белков с сорбентом, посредством CBD, обеспечивало постепенный выход антигенов из комплекса с целлюлозой. За счет поверхностного расположения молекул иммобилизованных белков они были более доступны для клеток организма. Таким образом, используемый целлюлозный сорбент выполнял важную функцию депо для антигенов в организме, а также оказывал менее повреждающее действие на ткани, чем неполный адъювант Фрейнда.

Иммуногенные свойства белково-целлюлозных комплексов оценивали по антиген-специфической пролиферации лимфоцитов и по количеству Т-лимфоцитов, продуцирующих ИФН-у, который считается основным цитокином при развитии адаптивного иммунитета во время туберкулезной инфекции [96, 116, 118, 144]. Опыты in vivo проводили на мышах инбредных линий генетически резистентных (C57BI/6) и чувствительных (I/St) к туберкулезной инфекции [97, 129].

В серии проведенных экспериментов нам удалось показать, что препараты рекомбинантных белков обладали иммуногенными свойствами, которые усиливались при иммобилизации антигенов на целлюлозном носителе. Двукратная подкожная иммунизация белково-целлюлозными комплексами была эффективнее, чем однократная. Для препарата ESAT6-CBD-AU, было показано, что величина клеточного ответа зависила и от расположения лимфоузлов относительно места инъекции. При одновременной иммобилизации на целлюлозном сорбенте двух смысловых доменов Ag85A и ESAT6, оба сохраняли иммуногенные свойства в составе рекомбинатных антигенов, и вызывали специфическую пролиферацию лимфоцитов. Однако усиления иммунного ответа при введении иммуносорбента с двумя антигенам отмечено не было.

В опыте ELISPOT было отмечено, что после двукратного подкожно введения препаратов CFPIO-CBD-АЦ, ESAT6-CBD-AUÍ, Ag85A-CBD-AI4, CBD-АЦ и однократного введения BCG-1 Russia, во всех опытных группах наблюдали увеличение количества Т-клеток селезенки, продуцирующих ИФН-у при добавлении в культуру соответствующих рекомбинантных антигенов. Наблюдаемое увеличение количества Т-клеток селезенки в контрольной группе CBD-АЦ, было статистически не достоверно.

Протективные свойства препаратов оценивали по снижению бактериальной нагрузки в органах и увеличению времени жизни зараженных животных. Опыты in vivo проводили на мышах инбредных линий C57BI/6 и I/St при разных способах заражения.

При двукратной подкожной иммунизации мышей препаратами ESAT6-CBD-АЦ и Ag85A-CBD-AU, в высевах гомогенатов легких и селезенки наблюдали снижение бактериальной нагрузки по сравнению с контрольными животными, которым вводили физиологический раствор. В группе животных, однократно иммунизированных BCG-1 Russia, снижение бактериальной нагрузки в высевах двух органов было ниже на два порядка по сравнению с опытными группами. t

Двукратная вакцинация мышей преператом из двух антигенов ESAT6-CBD и Ag85A-CBD, одновременно иммобилизованных на целлюлозном сорбенте, защитила животных от развития острой фазы микобактериальной инфекции при внутривенном заражении М. tuberculosis H37Rv, но менее эффективно, чем классическая вакцина.

Динамика выживания мышей после аэрозольного заражения М. tuberculosis H37Rv показала, выживание группы животных, вакцинированных препаратом CFP-CBD-АЦ, сопоставимо с группой животных, защищенных классической вакциной BCG. Препатары Ag85A-CBD-AIJ и ESAT6-CBD-AU, защищали мышей в течение меньшего промежутка времени.

Таким образом, предложенный в работе подход позволяет получать инъекционные препараты на основе рекомбинантных антигенов Ag85A, ESAT6 и CFP10 М. tuberculosis, иммобилизованных на частицах аморфной целлюлозы с помощью целлюлозосвязывающего домена. Разработанные препараты белково-целлюлозных комплексов могут рассматриваться как охарактеризованные перспективные компоненты для получения кандидатной субъединичной генно-инженерной противотуберкулезной вакцины.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аксенова, Екатерина Ивановна, Москва

1. Апт, А. С. Туберкулез: потогенез, иммунный ответ и генетика хозяина / A.C. Апт, Т. К. Кондратьева // Молекулярная биология. 2008. - Том. 42, № 5. - С. 880-890.

2. Байклз, Н. Целлюлоза и ее производные. Том 2 / Под ред. Н. Байклза и др.. М.: Мир, 1974. - 513 е., ил.

3. ВОЗ, Мировая статистика здравоохранения 2010 : библ. ВОЗ / ВОЗ.2010.

4. Волков, И. Ю. Перспективы практического применения субстратсвязывающих модулей гликозилгидролаз (обзор) / И. Ю. Волков и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. - Т. 40, №5. - с. 499-504.

5. Воробьев, А. А. Микробиология и иммунология / Под ред. A.A. Воробьева и др.. М.: Медицина, 1999. - 464 е., ил.

6. Глик, Б. Молекулярная биотехнлогия. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Патернак. Мир, 2002. - 589 е., ил.

7. Гловер, Д. Клонирование ДНК. Методы / Под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1988. - 538 е., ил.

8. Гурвич, А. Е. Иммуногенность белково-целлюлозных комплексов / А. Е. Гурвич и др. // в сб. Молекулярная и клеточная регуляция инфекционного иммунитета. М., 1985. - С. 56-62.

9. Гурвич, А. Е. Получение белково-целлюлозных комплексов (иммуносорбентов) в виде суспензий, способных присоединять большие количества антител / А. Е. Гурвич и др. // Биохимия. 1961. - Т. 26, № 5. - С. 934942.

10. Гурвич, А. Е. Усиление иммуногенности белков путем их присоединения к целлюлозной матрице / А. Е. Гурвич и др. // в сб. Иммуномодуляторы. М., 1987. - С. 67-76.

11. Даренская С. Д. Значение определения интерферона-у в диагностике туберкулезного экссудативного плеврита / С. Д. Даренская и др. // Проблемы туберкулеза и болезни легких. 2008. - №2. - С. 29-31.

12. Лунин; В. Г. Изучение иммуногенных свойств рекомбйнантного целлюлозосвязывающего цомена АпаегосеПит thermophilum ih vivo / В. Г. Лунин и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2009; - №:Т. - G. 21-27.

13. Лящук, А. М. Иммунизация иммобилизированными на целлюлозе антигенами. Развитие идей А. Е.Гурвича / А. М. Лящук и др. | // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2006. - № 4. - С. 65-68.

14. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. М.: Мир, 1984. - 480 с., ил. ,

15. Медведев, G. Ю. Туберкулез в, России / С. Ю. Медведев, М. И. Перельман // Вакцинация. Новости вакцинопрофилактики. 2002. - №1.

16. Мордовская, Л. И. Иммунодиагностика и иммунотерапия туберкулезной;инфекции у детей и подростков : автореф. дис. . док. мед. наук : 14.01.16; 14.03:09 / Мордовская Лариса Ивановна. Москва, 2010. - 35 с.

17. Остерман, Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие) / Л. А. Остерман. М.: Мир, 1981. - 288 е., ил.

18. Остерман, Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л. А. Остерман. М.: Наука, 1985. - 536 е., ил.

19. Перельман, М. И. Туберкулез: Учебник / М. И. Перельман, В: А. Корякин; Н. М. Протопопова. М.: Медицина, 1990. - 304 е., ил.

20. Ройт, А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. М.: Мир, 2000. - 592 е., ил.

21. Ройтберг, Г. Е. Лабораторная и инструментальная диагностика заболеваний внутренних органов / Г. Е. Ройтберг, А. В. Струтынский. М.: Бином, 1999. - 622 е., ил.

22. РОСПОТРЕБНАДЗОР / Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях (Форма 1) за январь декабрь 2010. URL: http://rospotrebnadzor.ru/directionsofactivity/profilaktika/stats (дата обращения: 12.12.2010).

23. Хоулт, Дж. Определитель бактерий Берджи : В 2 т. / Под. ред. Дж. Хоулта, Н. Крига и др.. М.: Мир, 1997. - 368 с.

24. Шарапова, Н; Е. Получение и характеристика коллаген-связывающих доменов из фактора фон Виллебранда (vWF) человека / Н. Е. Шарапова и др. // Журнал Молекулярная генетика, микробиология,и вирусология. 2009. - № 3. - С. 31-35.

25. Эпидемиолог.ру (Epidemiolog.ru) / Национальный календарь профилактических прививок Российской Федерации. ' URL: http://www.epidemiolog.ra/calendar/detail.php?ELEMENTID=3765 (дата обращения: 20.11.10).

26. Ярилин, А. А. Основы иммунологии: Учебник / A.A. Ярилин. М.: Медицина, 1999. - 608 е., ил.

27. Aagaard, C. S. Qualityand Vaccine Efficacy of CD4+ T Gell Responses Directed to Dominantand Subdominant Epitopes in ESAT-6 from Mycobacteriumt uberculosis/ C. S. Aagaard et al. // The Journal of Immunology. 2009. - Vol. 183. - P. 2659-2668.

28. Abdallah, A. M. Type VII secretion — mycobacteria show the way / A. M. Abdallah et al. // Nature reviews microbiology. 2007. - Vol. 5. - P. 883-891.

29. Abou-Zeid, C. Characterization of Fibronectin-Binding Antigens Released by Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG / C. Abou-Zeid et al. // Infection and immunity. 1988. - Vol. 56, № 12. - P. 3046-3051.

30. Andersen, A. B. Structure and mapping of antigenic domains of protein antigen b, a 38,000-molecular-weight protein of Mycobacterium tuberculosis / A. B. Andersen, E. B. Hansen // IAI. 1989. - Vol. 57, № 8. - P. 12481-2488.

31. Arend, S. M. Detection of active tuberculosis infection by T cell Responses to Early-Secreted Antigenic Target 6-kDa Protein and Culture Filtrate Protein 10 / S.M. Arend et al. // The Journal of Infectious Diseases. 2000. - Vol. 181. - P. 1850-1854.

32. Bayer, E. A. Cellulose, cellulases and cellulosomes / E. A. Bayer et al. // Current Opinion in Structural Biology. 1998. - Vol. 8. - P. 548-557.

33. Baldwin, S. L. Evaluation of new vaccines in the mouse and guinea pig model of tuberculosis / S. L. Baldwin et al. // IAI. 1998. - Vol. 66. № 6. - P. 29512959.

34. Bao, L Virulence, immunogenicity, and protective efficacy of two recombinant Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin strains expressing the antigen ESAT-6 from Mycobacterium tuberculosis / Bao, L et al. // IAI. 2003. - Vol. 71,№4.-P. 1656-1661.

35. Beresford, B. Update on research and development pipeline: tuberculosis vaccines / B. Beresford, J. C. Sadoff // The Clinical Infectious Diseases. 2010. - Vol. 50. - P. 178-183.

36. Berthet, F.-X. A Mycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT-6 and a novel low-molecular-mass culture filtrate protein (CFP-10) / F.-X. Berthet et al. // Microbiology. 1998. - Vol. 144. - P. 3195-3203.

37. Bio-Rad Laboratories. Bio-Plex COOH Beads. Amino coupling kit. Instruction manual / Bio-Rad Laboratories, Ins. 4110012 Rev C. 2000. 37 p. illus.

38. Boehm, U. Cellular responses to interferon-y / U. Boehm et al. // Annual review of immunology. -1997. Vol. 15. - P. 749-795.

39. Boraston, A. B. Carbohydrate-binding modules: fine-tuning polysaccharide recognition / A. B. Boraston et al. // The Journal of Biochemistry. 2004. - Vol. 382. -P. 769-781.

40. Borremans, M. Cloning, sequence determination, and expression of a 32-kilodalton-protein gene of Mycobacterium tuberculosis / M. Borremans et al. // IAI. -1989. Vol. 57, № 10. - P. 3123-3130.

41. Brandt, L. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis / L. Brandt et al. // IAI. 2000. - Vol. 68, № 2. - P. 791-795.

42. Brickman, E. Sites within gene lacZ of Escherichia coli for formation-of active hybrid ß-galactosidase molecules / E. Brickman et al. // Journal of bacteriology. -1979. Vol. 139, № 1. - P. 13-18.

43. Brosch, R. Genome plasticity of BCG and impact on vaccine efficacy / R. Brosch et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2007. - Vol. 104, № 13. - P. 5596-5601.

44. Camus, J.-C. Re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv / J.-C. Camus et al. // Microbiology. 2002. - Vol. 148. - P. 29672973.

45. Carrard, G. Cellulose-binding domains promote hydrolysis of different sites on crystalline cellulose / G. Carrard et al. // PNAS. 2000. - Vol. 97, № 19. - P. 1034210347.

46. Cellestis GmbH. QuantiFERON®-TB Gold (in vitro) Тест на содержание гамма-интерферона в образцах цельной крови для определения имунного ответа на пептидные антигены ESAT-6, CFP-10 & ТВ7.7(р4) / Cellestis. 2009. - 33. p. illus.

47. Cole, S. T. Comparative and functional genomics of the Mycobacterium tuberculosis complex / S.T. Cole // Microbiology. 2002. - Vol. 148. - P. 2919-2928.

48. Cole, S. Т. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence / S.T. Cole et al. // Nature. 1998. - Vol. 393. - P. 537544.

49. Collins, H. L. The many faces of host responses to tuberculosis / H. L. Collins, S. H. E. Kaufmann // Immunology. 2001. - Vol. 103. - P. 1-9.

50. Company Luminex / Luminex's xMAP Technology, Bead-based multiplexing of up to 100 analytes per well. URL: http://www.luminexcorp.com/technology/index.html (дата обращения: 18.12.10).

51. Daniel Т. M. Janicki Mycobacterial Antigens: a Review of Their Isolation, Chemistry, and Immunological Properties / Т. M. Daniel, B. W. Janicki // Microbiological reviews. 1978. - Vol. 42, № 1. - P. 84-113.

52. De Bruyn, J. Purification, characterization and identification of a 32 kDa protein antigen of Mycobacterium bovis BCG / J. De Bruyn et al. // Microbial Pathogenesis. 1987. - Vol. 2. - P. 351-366.

53. Delogu, G. The quest for a new vaccine against tuberculosis / G. Delogu, G. Fadda // The Journal of Infection in Developing Countries. 2009. - Vol. 3, № 1. - P 515.

54. Demkow, U. Heterogeneity of antibody response to mycobacterial antigens in different clinic manifestations of pulmonary tuberculosis / U. Demkow et al. // Journal of physiology and pharmacology. 2007. - Vol. 58, № 5. - P. 117-127.

55. Derrick, S. C. Characterization of the protective T-cell response generated in CD4-deficient mice by a live attenuated Mycobacterium tuberculosis vaccine / S. C. Derrick et al. // Immunology. 2007. - Vol. 120, № 2. - P. 192-206.

56. Dietrich, J. Mucosal administration of Ag85B-ESAT-6 protects against infection with Mycobacterium tuberculosis and böosts prior Bacillus Calmette-Guerin immunity / J. Dietrich et al. // J. Immunol. 2006. - Vol. 177. - P. 6353-6360.

57. Doherty, T.M. Vaccines for Tuberculosis: Novel Concepts and Recent Progress / T.M. Doherty, P. Andersen // Clinical Microbiology Reviews. 2005. - Vol. 18; №4. - P. 687-702.

58. Doi, N. Insertional gene fusion technology / N. Doi, H. Yanagawa // FEBS Letters. 1999. - Vol. 457. - P. 1-4.

59. D'Souza, S. Improved Tuberculosis DNA Vaccines by Formulation in Cationic Lipids / S. D'Souza et al. // IAI. 2002. - Vol. 70, № 7. - P. 3681-3688. .

60. Einhauer, A. Expression and purification of homogenous proteins in Saccharomyces cerevisiae based on ubiquitin-FLAG fusion / A. Einhauer et al. // Protein Expression and Purification. 2002. - Vol. 24. - P. 497-504.

61. Elhay, M. J. Delayed-Type Hypersensitivity responses to ESAT-6 and MPT64 from Mycobacterium tuberculosis in the guinea pig / M. J. Elhay et al. // IAI. -1998. Vol. 66, № 7. - P. 3454-3456.

62. Evan, G. I. Isolation of monoclonal antibodies specific for- human c-myc proto-oncogene product / G. I. Evan et al. // Molecular and Cell Biology. 1985. - Vol. 5, № 12. - P. 3610-3616.

63. Grode, L. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin / L. Grode et al. // The Journal of Clinical Investigation. 2005. - Vol. 115, № 9. - P. 24722479.

64. Guleria, I. Auxotrophic vaccines for tuberculosis / I. Guleria, et al. // Nature medicine. 1996. - Vol. 2, № 3. - P. 334-337.

65. Gurvich A. E. High capacity immunoadsorbents based on preparations of reprecipitated cellulose / A. E. Gurvich, E. V. Lekhtzind // Molecular Immunology. -1982. Vol. 19, № 4. - P. 637-640.

66. Gurvich A. E. Induction of abundant antibody formation with a protein-cellulose complex in mice / Gurvich A. E., Korukova A // Journal of immunological methods. 1986. - Vol. 87, № 2. - P. 161-167.

67. Harboe, M. B-cell epitopes and quantification of the ESAT-6 protein of Mycobacterium tuberculosis / M. Harboe et al. // IAL 1998. - Vol. 66, № 2. - P. 717723.

68. Harboe, M. Evidence for occurrence of the ESAT-6 protein in Mycobacterium tuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its absence in Mycobacterium bovis BCG / M. Harboe et al. // IAL -1996. Vol. 64, № 1. - P. 16-22.

69. Haugland, P. Handbook of fluorescent probes and research products / Ninth edition by P. Haugland. Molecular Probes Inc., 2002. - 950 p., cm.

70. Havenga, M. Novel replication-incompetent adenoviral B-group vectors: high vector stability and yield in PER.C6 cells // M. Havenga et al. // Journal of General Virology. 2006. - Vol. 87. - P. 2135-2143.

71. Hervas-Stubbs, S. High frequency of CD4+ T cells specific for the TB10.4 protein correlates with protection against Mycobacterium tuberculosis infection / S. Hervas-Stubbs et al. // IAL 2006. - Vol. 74, № 5. - P. 3396-3407.

72. Hockney, R. C. Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli / R. C. Hockney // Trends in Biotechnology. 1994. - Vol. 12, № 11. -P. 456-463.

73. Huygen, K. Mapping of THI helper T-cell epitopes on major secreted mycobacterial antigen 85A in Mice infected with live Mycobacterium bovis BCG / K. Huygen et al. // IAI. 1994. - Vol. 62, № 2. - P. 363-370.

74. Infuso, A. European survey of BCG vaccination policies and surveillance in children, 2005 / A. Infuso, D. Falzon // Eurosurveillance. 2006. - Vol. 11, № 3. - P. 611.

75. Jindal, S. Primary structure of a human mitochondrial protein homologous to the bacterial and plant chaperonins and to the 65-kilodalton mycobacterial antigen / S. Jindal et al. // Mol Cell Biol. 1989. - Vol. 9. - P. 2279-2283.

76. Joos, T. O. Miniaturised multiplexed immunoassays / T. O. Joos et al. // . Chemical Biology. 2002. - Vol. 6, № 1 - P. 76-80.

77. Karpeisky, M. Y. Formation and properties of S-protein complex with S-peptide containing fusion protein / M. Y. Karpeisky et al. // FEBS Letters. 1994. -Vol. 339. - P. 209-212.

78. Kataeva, I. A. Genome sequence of the anaerobic, thermophilic, and > cellulolytic bacterium "Anaerocellum thermophilum" DSM 6725" / I. A. Kataeva et al.

79. Journal of bacteriology. 2009. - Vol. 191, № 11. - P. 3760-3761.

80. Kaufmann, S. H. E. Protection against tuberculosis: cytokines, T cells, and macrophages / S. H. E. Kaufmann // Annals of the Rheumatic Diseases. 2002. - Vol. 61.- P. 54-58.

81. Kondratieva, E. V. I/St Mice Hypersusceptible to Mycobacterium tuberculosis Are Resistant to M. avium / E. V. Kondratieva et al. // LAI. 2007. - Vol. 75, № 10. - P. 4762-4768.

82. Kumar, K. Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth / K. Kumar et al. // PLoS ONE. 2009. - Vol. 4, № 11. - P. 1-12.

83. Launois, P. T-cell-epitope mapping of the major secreted mycobacterial antigen Ag85A in tuberculosis and leprosy / P. Launois et al. // I AI. 1994. - Vol. 62, № 9. - P. 3679-3687.

84. Lekhtsind, E. V. Synthesis of a high-capacity immunosorbent based on a cellulose suspension / E. V. Lekhtsind, A. E. Gurvich // Biull Eksp Biol Med. 1981. -Vol. 92, № 7 - P. 68-70.

85. Levy, I. Cellulose-binding domains: Biotechnological applications / I. Levy, O. Shoseyov // Biotechnology Advances. 2002. - Vol. 20, № 3-4. - P. 191-213.

86. Li, H. X. Preparation of recombinant Mycobacterium tuberculosis ESAT6-PPE68 fusion protein / H.X. Li et al. // Journal of Soutcherm Megical Univercity. 2007.- Vol. 27, № 2 P. 131-135.

87. Li, Z. Improved humoral immunity against tuberculosis ESAT-6 antigen by chimeric DNA prime and protein boost strategy/ Z. Li et al. // DNA and cell biology. 2006. Vol. 25, № 1 - P. 25-30.

88. Linder, M The cellulose-binding domain of the major cellobiohydrolase of Trichoderma reesei exhibits true reversibility and a high exchange rate on crystalline cellulose / M. Linder, T. T Teeri // PNAS. 1996. - Vol. 93, № 22. - P. 12251-12255.

89. Lozes, E. Immunogenicity and efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding the components of the secreted antigen 85 complex / E. Lozes et al. // Vaccine. -1997. Vol. 15, № 8. - P. 830-833.

90. Lyashchenko, K. Heterogeneous antibody responses in tuberculosis/ K. Lyashchenko et al. // IAI. 1998. - Vol. 66, № 8. - P. 3939-3940.

91. Mazurek, G. H. Detection of Mycobacterium tuberculosis infection by wholeblood interferon-g release assay / G. H. Mazurek et al. // Clin Infect Dis. 2003. -Vol. 36, № 9. - P. 1207-1208.

92. Mazurek, G.H. Guidelines for using the QuantiFERON-TB test for diagnosing latent Mycobacterium tuberculosis infection / G.H. Mazurek, M.E. Villarino // Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm. 2003. - Vol.52. - P. 15-8.

93. McShane, H. Protective immunity against Mycobacterium tuberculosis induced by dendritic cells pulsed with both CD8+- and CD4+-T-cell epitopes from Antigen 85A/ H. McShane et al. // IAI. 2002. - Vol. 70, № 3. - P. 1623-1626.

94. McShane, H. Recombinant modified vaccinia virus Ankara, expressing antigen 85A boosts BCG-primed and naturally acquired antimycobacterial immunity in humans / H. McShane et al. // Nat Med. 2004. - Vol. 10, № 11. - P. 1240-1244.

95. Mori, T. Specific detection of tuberculosis infection: an interferon-gamma-based assay using new antigens/ T. Mori et al. // American journal of respiratory and critical care medicine.- 2004. Vol. 170, № 1. - P. 59-64.

96. Münk, M. E. The Mycobacterium bovis 32-kilodalton protein antigen induces human cytotoxic T-cell responses / M. E. Münk et al. // IAI. 1994. - Vol. 62, № 2. - P. 726-728.

97. Mustafa, A. S. Development of new vaccines and diagnostic reagents against tuberculosis / A. S. Mustafa // Mol. Immunol. 2002. - Vol.39. - P. 113-119.

98. Nicod, L. P. Immunology of tuberculosis / L. P. Nicod // Swiss Medical Weekly. 2007. - Vol.137. - P. 357-362.

99. Nolan, J. P. Suspension array technology: evolution of the flat-array paradigm / J. P. Nolan // Trends in Biotechnology. 2002. - Vol. 20, № 1. - P. 9-12.

100. North, R. J. Immunity» to tuberculosis / R. J. North, Y.-J. Jung // Annual Review of Immunology. 2004. - Vol. 22. - P. 599-623.

101. Ohara, N. Cloning and sequencing of the gene for the alpha antigen from Mycobacterium avium and mapping of B-cell epitopes / Ohara, N. et al. // IAI. 1993. -Vol. 61. - P. 1173-1179.

102. Oligo Calc: Oligonucleotide Properties Calculator. URL: http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html (дата обращения: 27.09.10)

103. Olovnikov, A. M. Immunization with protein-cellulose co-polymer (immunosorbent) / A. M. Olovnikov, A. E. Gurvich sen // Nature. 1966. - Vol. 209, № 5021. - P. 417-419.

104. Olsen, A. W. Protection of mice with a tuberculosis subunit vaccine based on a fusion protein of Antigen 85B and ESAT-6 / A. W. Olsen et al. // IAI. 2001. -Vol. 69, № 5. - P. 2773-2778.

105. Parida, S. K. Novel tuberculosis vaccines on the horizon / S. K. Parida and S. H. E. Kaufmann // Current Opinion in Immunology. 2010. - Vol. 22. - P. 374-384.

106. Parish, T. Mycobacterium tuberculosis protocols. Methods in molecular Medicine, vol. 54 / edited by T. Parish, N. G. Stoker. Humana Press Inc., 2001. - 418 p., cm.

107. Pereira, S. M. BCG vaccine against tuberculosis: its protective effect and vaccination policies / S. M. Pereira et al. // Revista de Saude Publica. 2007. - Vol. 41, № 1. - P. 1-7.

108. Porath, J. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation / J. Porath et al..// Nature. 1975. - Vol. 258. - P. 598-599.

109. Pym, A. S. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis / A. S. Pym et al. // Nat. Med. 2003. - Vol. 9, № 5. - P. 533-539.

110. QIAGEN Companies. The QIAexpressionist™. A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins / QIAGEN Companies. 2003. -128 p. illus.

111. Radaeva, T. K. A human-like TB in genetically susceptible mice followed by the true dormancy in a Cornell-like model / T.K. Radaeva et al. // Tuberculosis. -2008. Vol. 88, № 6. - P. 576-585.

112. Radosevic, K Protective immune responses to a recombinant Adenovirus Type 35 tuberculosis vaccine in two mouse strains: CD4 and CD8 T-Cell epitope mapping and role of Gamma Interferon / K. Radosevic et al. // IAI. 2007. - Vol. 75, № 8.-P. 4105-4115.

113. Raja, A. Immunology of tuberculosis / A. Raja // Indian Journal of Medical Research. 2004. - Vol. 213. - P. 213-232.

114. Renshaw, P. S. Structure and function of the complex formed by the tuberculosis virulence factors CFP-10 and ESAT-6 / P. S. Renshaw et al. // The EMBO Journal. 2005. - Vol. 24. - P. 2491-2498.

115. Roche, P. W. Expression of Mycobacterium tuberculosis MPT64 in recombinant Myco. smegmatis: purification, immunogenity and application to skin tests for tuberculosis/ P. W. Roche et al. // Clin Exp Immnol 1996. - Vol. 103. - P. 226-232.

116. Ronning, D. R. Mycobacterium tuberculosis antigen 85A and 85C structures confirm binding orientation and conserved substrate specificity / D. R. Ronning et al. // The journal of biological chemistry. 2004. - Vol. 279, № 35. - P. 36771-36777.

117. Rook, G.A.W. M. tuberculosis: immunology and vaccination / G.A.W. Rook et al. // European Respiratory Journal. 2001. - Vol. 17. - P. 537-557.

118. Sarhan, M. A. A. Progress in Tuberculosis Vaccines Development / M. A. A. Sarhan // Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 2007. Vol. 2, № 2. -P. 35-41.

119. Sathish, M. Identification and characterization of antigenic determinants of Mycobacterium leprae that react with antibodies in sera of leprosy patients / M. Sathish et al. //1 AI. 1990. - Vol. 58, № 5. - P. 1327-1336.

120. Schlottmann, S. A. A novel chemistry for conjugating pneumococcal polysaccharides to Luminex microspheres / S. A. Schlottmann et al. // J Immunol Methods. 2006. - Vol. 309, № 1-2. - P. 75-85.

121. Schmidot, T. G. The random peptide library assisted engineering of a C-terminal affinity peptide, useful for the detection and purification of a functional Ig Fv fragment/ T. G. Schmidt et al. // Protein Engineering. 1993. - Vol. 6, № 1. - P. 109122.

122. Schmidt, T. G. Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, streptavidin / T. G. Schmidt et al. // Journal of Molecular Biology. 1996. - Vol. 255. - P. 753-766.

123. Schroder, K. Interferon-y: an' overview of signals, mechanisms and functions / K. Schroder et. al. // Journal of Leukocyte Biology. 2004. - Vol. 75. - P. 163-189.

124. Senol, G. Humoral immune response against 38-kDa and 16-kDa mycobacterial antigens in tuberculosis / G. Senol et al. // JPP. 2007. - Vol. 29. - P. 143-148.

125. Silva, V. M. C. Factors associated with humoral response to ESAT-6, 38 kDa and 14 kDa in patients with a spectrum of tuberculosis / V. M. C. Silva et al. // The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 2003. - Vol. 7, № 5. - P. 478484.

126. Singh, M. The Mycobacterium tuberculosis 38-kDa antigen: overproduction in Escherichia coli, purification and' characterization / M. .Singh et al. // JPP. 1992. -Vol. 117. - P. 53-60.

127. Sorensen, A. L. Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis / A. L. Sorensen et al. // IAI. -1995. Vol. 63, № 5. - P. 1710-1717.

128. Stenger, S Immunological control of tuberculosis: role of tumour necrosis factor and more / S Stenger // Ann Rheum Dis. 2005. - Vol. 64. - P. 24-28.

129. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems / К Terpe // Applied Microbiology and Biotechnology. 2003. - Vol. 60. - P. 523-33.

130. The National* Center for Biotechnology Information / The Nucleotide database. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/57116681 (дата обращения: 27.01.10).

131. The National Center for Biotechnology Information / The Taxonomy database. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Tree&id=77643&l vl=3&lin=f&keep=l&srchmode=l&unlock (дата обращения: 27.09.10).

132. Thermo Fisher Scientific / NHS and Sulfo-NHS. URL: http.7/www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02040114 (дата обращения: 18.06.10).

133. Ulrichs, Т. Increased numbers of ESAT-6- and purified protein derivative-specific gamma interferon-producing cells in subclinical and active tuberculosis infection / T. Ulrichs, et al. // IAI. 2000. - Vol.' 68, № 10. - P. 6073-6076.

134. Van Crevel, R. Innate Immunity to Mycobacterium tuberculosis / R. van Crevel et al. // CMR. 2002. - Vol. 15, № 2. - P. 294-309.

135. Varki, A". Essentials of Glycobiology, 2nd edition / edited by A. Varki, R. D Cummings, J. D Esko et al.. Cold Spring Harbor Laboratory Press., 2009. - 784 p. illus.

136. Von Eschen, K. The candidate tuberculosis vaccine Mtb72F/AS02A: Tolerability and immunogenicity in humans / K. Von Eschen et al. // Human Vaccines. 2009. - Vol. 5. - P. 475-482.

137. Wiker, H. G. Evidence for Three Separate Genes Encoding the Proteins of the Mycobacterial Antigen 85 Complex / H. G. Wiker et al. // IAI. 1990. - Vol. 58, № 1. - P. 272-274.

138. Wiker H. G. The Antigen 85 Complex: a Major Secretion Product of Mycobacterium tuberculosis / H. G.Wiker, M. Harboe // Microbiol, rev. 1992. - Vol. 56, № 4. - P. 648-661.

139. Wu, X. Recombinant early secreted antigen target 6 protein as a skin test antigen for the specific detection of Mycobacterium tuberculosis infection / X. Wu et al. // Clin Exp Immnol. 2008. - Vol. 152. - P. 81-87.

140. Young, H. A. Role of interleron-y in immune cell regulation / H. A. Young, K. J. Hardyt // Journal of Leukocyte Biology. -1995. Vol. 58. - P. 373-381.

141. Young, D. Immunological Activity of a 38-Kilodalton Protein Purified from Mycobacterium tuberculosis I D. Young et al. // IAI. 1986. - Vol. 54, № 1. - P. 177183.

142. Young, D. B. Lipoprotein antigens of Mycobacterium tuberculosis / D. B. Young, T. R. Garbe // Research in Microbiology. -1991. Vol. 142. - P 55-65.

143. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

144. Патенты и заявки на патенты

145. З.М., Полетаева H.H., Грабко В.И., Гинцбург А.Л. № 2008145612/13; заявл. 19.11.08; опубл. 10.01.10, Бюл. № 1 (III ч.). - 2 с.

146. Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность научным руководителям В.Г. Лунину и Т.К. Кондратьевой за постоянное внимание, всестороннюю помощь, полученные знания и навыки.

147. Искренне признательна сотрудникам лаборатории иммуногенетики ЦНИИТ РАМН A.C. Апту, Э.И. Рубаковой, Е.В. Кондратьевой за решение организационных вопросов, большую помощь в проведении работ с животными, а также прочтение рукописи диссертации.

148. За предоставление материалов и успешную совместную работу благодарю сотрудников НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова М.А. Владимирского, Е.Е. Ефремова, Т.Н. Власика.

149. Выражаю глубокую благодарность администрации ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России за предоставленную возможность заниматься научной работой.

150. Глубокую признательность выражаю ученому секретарю диссертационного совета ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России, д.м.н. профессору Е.В. Русаковой и д.м.н. A.A. Асратян и за помощь при подготовке диссертации к защите.

151. Особую благодарность выражаю своим родным и близким за всестороннюю поддержку в течение всего творческого пути.

Информация о работе

Аксенова, Екатерина Ивановна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Получение и характеристика рекомбинантных антигенов Mycobacterium Tuberculosis как компонентов потенциальных вакцинных препаратов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы