Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение возможности применения рекомбинантного белка HSP70 туберкулезной микобактерии в профилактике туберкулеза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение возможности применения рекомбинантного белка HSP70 туберкулезной микобактерии в профилактике туберкулеза"

На правах рукописи

КАЛКЖИНА АРИНА СЕРГЕЕВ?

ииоиЬ275Б

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ШР70 ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ МИКОБАКТЕРИИ В ПРОФИЛАКТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА.

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2007

003052756

Работа выполнена на кафедре биологической химии Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова и во Всероссийском Научном Центре молекулярной диагностики и лечения.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Северин Евгений Сергеевич кандидат биологических наук Федоров Алексей Николаевич доктор биологических наук Соколов Николай Николаевич кандидат биологических наук Савватеева Мария Владимировна

Ведущая организация

Центральный Научно-исследовательский Институт Туберкулеза РАМН

Защита состоится «Ци » 200 ^ г. в \ЬЬ0 часов на заседании

Диссертационного Совета Д 001.010.01 при ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, Погодинская ул., д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, Погодинская ул., д.Ю.

Автореферат разослан «Х^э »

200

к

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

В.С. Былинкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ t

V-

Актуальность проблемы.

Туберкулез - болезнь, являющаяся одной из самых актуальных проблем мирового здравоохранения, ежегодно уносит жизни более 1 млн. человек [Dye С. et. al., 2005]. В нашей стране туберкулез продолжает оставаться одной из наиболее распространенных инфекций и представляет огромную опасность для здоровья населения. В последние годы туберкулез стал характеризоваться высокой тенденцией к прогрессированию, быстрым развитием каверн, полирезистентностью возбудителя болезни к противотуберкулезным лекарствам [Попович В.К., 2005; Соловьева И.П., 1998].

Следовательно, одной из важнейших задач, стоящих перед современной медициной, является разработка новых методов предупреждения заболевания туберкулезом.

За последние годы был сделан ряд значительных открытий в области изучения патогенеза заболевания, особенностей его возбудителя. В частности одним из значимых достижений науки последних двух десятилетий явилось открытие и изучение функций белков теплового шока. Данные несколько групп белков присутствуют в клетках любого организма и являются необходимыми в целом ряде процессов. Так, эти белки исполняют роль молекулярных шаперонов (т.е. являются белками - дуэньями), которые необходимы для приобретения биологически активных конформаций вновь синтезированными белками. У позвоночных белки теплового шока выполняют важные роли в иммунной системе, связываясь с антигенами патогенных микроорганизмов и антигенами, специфическими для злокачественных опухолей [Pierce S.K., 1994]. Клетки иммунной системы имеют рецепторы к белкам теплового шока, в результате чего эти комплексы вызывают сильный иммунный ответ [Wang Y. et al., 2001]. Кроме этого, сами по себе, белки теплового шока патогенных микроорганизмов являются одними из наиболее сильных антигенов [Heikema A. et al., 1997; Zügel U. et al., 2001]. Одним из наиболее перспективных направлений создания новых генно-инженерных вакцин является использование белков теплового шока либо как иммуногенов, либо носителей белков-иммуногенов.

Основным средством профилактики туберкулеза является вакцина БЦЖ -живые микобактерии штамма М. bovis БЦЖ (бацилла Calmett-Guerren), лиофильно высушенные в 1,5% растворе глутамата натрия. Вакцина вызывает Т-клеточный иммунный ответ. Принцип защитного действия прививки против туберкулеза заключается в ограничении распространения возбудителя из места первичной инфекции гематогенным путем, что снижает риск развития заболевания и реактивации процесса. Вакцина БЦЖ обеспечивает защиту от форм первичного туберкулеза, она наиболее эффективна при введении до момента инфицирования. Эффективность защитного действия вакцины БЦЖ значительно варьирует, от высоких процентов предупреждения развития туберкулеза у детей (92-100%) [Митинская Л.А, 2001], у взрослого населения она не подтверждается (0 - 80%) [Grange J.M., 2000]. Определенную проблему при применении вакцины БЦЖ составляет, во-первых, гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ), индуцируемая вакцинацией, которую сложно отличить от ГЗТ, вызванной М. tuberculosis и, следовательно, использование туберкулина (комплекса белков туберкулезной микобактерии) в кожных тестах для диагностических и эпидемиологических целей, влечет за собой сложности, связанные с дифференциальной диагностикой собственно туберкулезной инфекции и поствакцинальной аллергии [Lowrie, D.B. et al., 1995]. Во-вторых, поскольку БЦЖ является живой вакциной, ее применение противопоказано при иммунодефицитных состояниях (в т.ч. ВИЧ-инфекции), так как возможно развитие туберкулеза [Mustafa A.S., 2001].

Основные направления поиска новой противотуберкулезной вакцины лежат в сфере создания субъединичных вакцин в сочетании с разрешенными для применения у человека адьювантами. Субъединичными называют вакцины, которые содержат только отдельные компоненты патогенного микроорганизма - рекомбинантные белки или синтетические пептиды, содержащие основные эпитопы антигенов, активно распознаваемые иммунной системой хозяина. Достоинства субъединичных вакцин заключаются в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызвать нежелательные эффекты в организме-хозяине. В качестве основного компонента для прототипа противотуберкулезной вакцины был выбран белок теплового шока

M. tuberculosis, принадлежащий к семейству HSP70 (heat shock protein, молекулярная масса 70 кД).

Исходя из этого, целью данного исследования является изучение возможности применения рекомбинантного белка Mycobacterium tuberculosis HSP70 для профилактики туберкулеза в качестве компонента прототипа противотуберкулезной вакцины.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

• разработка методов получения рекомбинантного белка М tuberculosis HSP70;

• получение рекомбинантного белка HSP70 в форме, пригодной для проведения доклинических исследований (чистота, отсутствие деградации, минимальное содержание эндотоксинов);

• изучение физико-химических свойств рекомбинантного белка HSP70, важных для последующей конъюгации с адьювантом;

• изучение влияния рекомбинантного белка HSP70 на иммунный ответ на мышах;

• повышение антигенных свойств рекомбинантного белка HSP70 за счет конъюгации с полиоксидонием;

• изучение влияния изучение влияния рекомбинантного белка HSP70 и его конъюгата с полиоксидонием на гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ.

Научная новизна работы.

Получен рекомбинантный белок туберкулезной микобактерии HSP70 в форме, позволяющей осуществить дальнейшие доклинические исследования. Изучены его физико-химические и свойства, важные для конъюгации с адьювантом. Охарактеризована способность рекомбинантного белка туберкулезной микобактерии HSP70 к стимулирующему влиянию на Т-клеточный иммунный ответ. Впервые получен конъюгат рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 и полиоксидония, изучены его параметры. Антигенные свойства конъюгата изучены in vivo (на мышах).

Практическая значимость исследования.

Экспериментально было показано, что рекомбинантный белок М. tuberculosis HSP70 и его конъюгат с полиоксидонием являются сильными стимуляторами как Т-клеточного,- так и гуморального иммунного ответа, причем конъюгация белка с полиоксидонием значительно усиливает этот ответ. Полученные результаты позволяют

рассматривать данный конъюгат в качестве прототипа субъединичной противотуберкулезной вакцины.

Результаты экспериментальных исследований прототипа конъюгированной субъединичной противотуберкулезной вакцины на основе рекомбинантного бежа HSP70 и адьюванта полиоксидония представляют практический интерес при дальнейших исследованиях в этой области. Обнаруженный потенциал прототипа конъюгированной субъединичной противотуберкулезной вакцины можно охарактеризовать как высокий, что делает возможным развитие этого направления в области создания новых препаратов, предназначенных для профилактики туберкулеза.

Апробация работы.

Результаты исследования были доложены на Клинической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической медицины» (декабрь 2003, Москва), ХП1 Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (апрель 2005, Москва), Международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (ноябрь 2005, Москва), Международной конференции «Basic Science for Biotechnology and Medicine» (сентябрь 2006, Новосибирск), Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (ноябрь 2006, Москва-Пущино), а также научных семинарах Всероссийского Научного Центра молекулярной диагностики и лечения и научных семинарах кафедры биохимии ММА им. И.М. Сеченова. Апробация работы состоялась на совместном заседании научно-методической конференции кафедры биохимии ММА им. И.М. Сеченова и лаборатории генных технологий ВНЦМДЛ 6 декабря 2006г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы, заключение, список цитированной литературы, включающий 138 источников. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 2 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Культуры микроорганизмов

Для получения рекомбинантного белка туберкулезной микобактерии HSP70 использовался штамм Е. coli BL21/DE3.

Генно-инженерные процедуры

В работе использовались стандартные методы генетики Е. coli Для осуществления экспрессии HSP70 была сконструирована плазмидная ДНК, содержащая ген, кодирующий белок HSP70 туберкулезной микобактерии и нуклеотидную последовательность, кодирующую шесть остатков гистидина (т.н. гистидиновый таг, 6 х His-tag). В качестве источника гена белка HSP70 была использована геномная ДНК М. tuberculosis. Ген был выделен методом амплификации. Нуклеотидная последовательность, соответствующая гену HSP70 по сайтам рестрикции Ndel и Xhol была вставлена в вектор pQE30. Плазмида любезно предоставлена Н. В. Гороховец (МНИИМЭ). Для целей данной работы ген HSP70, также несущий последовательность шести остатков гистидина, был переклонирован в вектор pETUc joy по сайтам рестрикции Ndel и Xhol. Манипуляции с ДНК осуществлялись в соответствии со стандартными протоколами [Маниатис Т. и др., 1984].

Очистка рекомбинантного белка из биомассы

Очистку осуществляли с помощью металло-хелатной хроматографии на никелевой смоле. Использовали никельсодержащую смолу (Amersham Biosciences, Швеция).

Анализ белка

Анализ белка проводили с помощью электрофореза в полиакриамидном геле в денатурирующих условиях [Laemmli, 1970]. Олигомерное состояние рекомбинантного белка HSP70 в растворе изучалось методами гель-фильтрации [Остерман JI.A., 1985] в хроматографической колонке 1,2x30 см с носителем «Сефакрил S-300» и электрофореза в нативных условиях [Остерман Л.А.,1981].

Определение концентрации полученного рекомбинантного белка

Концентрация полученного белка определялась по методу ВСА (Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination, Sigma, USA) [Авдеев В.Г., 1977].

Очистка полученного белка от эндотоксина осуществлялась с использованием Detoxi-Gel™ (Endotoxin Removing Gel), содержащим полимиксин В, иммобилизированный на агарозе. Процедура очистки проводилась согласно рекомендациям производителя (Pierce, USA).

Определение содержания эндотоксина

Для определения соответствия полученного продукта требованиям, предъявляемым препаратам, проходящим доклинические испытания, рекомбинантный белок HSP70 был проверен на содержание эндотоксина методом JIAJI-тест по стандартной методике для данного теста [Ситникова А.Г. и др., 1994].

Лиофилизация

Высушивание путем замораживания в вакууме проводили из буфера PBS на установке фирмы «Lyovac» (Германия) в течение 36-48 часов.

Анализ иммунного ответа на рекомбинантный белок HSP70 на мышах

Животные. Мыши линии BALB/c, самки, массой 18-22 г, содержались на стандартном рационе в условиях вивария. В каждой опытной группе находилось по 3 животных.

Иммунизация. Животные иммунизировались 100 мкг белка HSP70 в 100 мкл стерильного фосфатного буфера - опытная группа, 100 мкл стерильного фосфатного буфера - контрольная группа, внутрибрюшинно. Через 4 недели проводилась повторная иммунизация. Через 2 недели после повторной иммунизации животных забивали для получения клеточной культуры лимфоцитов селезенки.

Иммуноферментный анализ. Изучение антительного иммунного ответа проводили методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) сывороток иммунизированных мышей, используя 96-луночные планшеты (Corning-Costar) с адсорбированным на них антигеном (рекомбинантным белком HSP70) в количестве 1 мкг в 100 мкл фосфатного буфера, pH 7,4, в лунке. Разведение антител 1: 500-1:16000.

Культура клеток. Получали культуру клеток лимфоцитов селезенки. Клетки отмывали и ресуспендировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки телят, 1% L-глутамина, 50 мМ ß-меркаптоэтанола и 1% пенициллин-стрептомицина. Клетки культивировали в 96-луночных плашках (7x105 клеток в лунке) в трех параллелях, в присутствии или отсутствии HSP70, при 37° С, во влажной атмосфере с 5% содержанием С02 в течение 72 ч. За 6 ч до окончания инкубации в

опытные и контрольные лунки вносили по 1 pCi 3Н-тимидина (ГНЦ Курчатовский центр, Москва, Россия). Клетки собирали на стекловолокнистые фильтры и измеряли включение радиоактивного тимидина. Проводилась оценка индекса стимуляции (ИС) пролиферации (ИС = О/К, где О - среднее количество импульсов в минуту в трех параллелях с антигеном, К - среднее количество импульсов в минуту в трех параллелях без антигена). В качестве стандартного положительного контроля стимуляции пролиферации использовался фитогемагглютинин (ФГА).

Конъюгация рекомбинантного белка HSP70 и полиоксидония Основные этапы конъюгации соответствовали ранее отработанной методике [Пинегин Б.В., Сараф A.C., 2001]. Анализ полученного конъюгата проводили методом ситовой хроматографии высокого давления с использованием детектора малоуглового рассеяния лазерного света (Low angle laser light scattering (LALLS) detector).

Изучение влияния рекомбинантного белка HSP70 и его конъюгата с полиоксидонием на Т-клеточный и гуморальный иммунный ответ на мышах

Животные. Мыши линии BALB/c, самки, массой 18-22 г, содержались на стандартном рационе в условиях вивария.

Иммунизация. Животные иммунизировались 100 мкг белка HSP70 в 100 мкл стерильного фосфатного буфера - 1-я опытная группа, 250 мкг конъюгата (содержал 20% рекомбинантного белка HSP70) в 100 мкл стерильного фосфатного буфера - 2-я опытная группа, 100 мкл стерильного фосфатного буфера - контрольная группа, внутрибрюшинно. Каждая группа состояла из 3 животных. Через 4 недели проводилась повторная иммунизация. Через 2 недели после повторной иммунизации животных забивали для получения клеточной культуры лимфоцитов селезенки и сыворотки периферической крови.

Иммуноферментный анализ Изучение антительного иммунного ответа проводили методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) сывороток иммунизированных мышей, используя 96-луночные планшеты (Corning-Costar) с адсорбированным на них антигеном (рекомбинантным белком HSP70) в количестве 1 мкг в 100 мкл фосфатного буфера, pH 7,4, в лунке. Разведение антител: для сыворотки мышей, иммунизированных HSP70 1: 500 - 1:16000; для сыворотки мышей, иммунизированных конъюгатом HSP70 с полиоксидонием 1: 10000 - 1: 320000. Адсорбцию проводили в течение ночи при 4°С, после чего плашки трижды промывали

фосфатным буфером и блокировали 2 часа в растворе 2% сухого обезжиренного молока в фосфатном буфере, затем плашки снова трижды промывали фосфатным буфером. В подготовленные таким образом плашки вносили тестируемые антитела в 2% молоке на фосфатном буфере, рН 7,4, с 0,1% неионным детергентом Твин-20 (PBST) и инкубировали не менее 2 часов. Затем плашки промывали трижды буфером PBST. Образующиеся иммунные комплексы детектировали с помощью моноклональных антител против IgG мыши, меченных пероксидазой хрена. Образовавшиеся меченные ферментом иммунные комплексы проявляли с использованием субстрата, содержащего орто-фенилендиамин (ОФД) и перекись водорода. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 1М H2SO4, оптическое поглощение измеряли при длине волны 492 нм.

Культура клеток. Получали культуру клеток лимфоцитов селезенки. Клетки отмывали и ресуспендировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки телят, 1% L-глутамина, 50 мМ p-меркаптоэтанола и 1% пенициллин-стрептомицина. Клетки культивировали в 96-луночных плашках (7х105 клеток в лунке) в трех параллелях в присутствии или отсутствии HSP70 при 37е С во влажной атмосфере с 5% содержанием СОг в течение 72 ч. За 6 ч до окончания инкубации в опытные и контрольные лунки вносили по 1 цС1 3Н-тимидина. Клетки собирали на стекловолокнистые фильтры и измеряли включение радиоактивного тимидина. Проводилась оценка индекса стимуляции (ИС) пролиферации (ИС = О/К, где О -среднее количество импульсов в минуту в трех параллелях с антигеном, К - среднее количество импульсов в минуту в трех параллелях без антигена). В качестве стандартного положительного контроля стимуляции пролиферации использовался фитогемагглютинин (ФГА).

Проточная цитометрия. Проводилась по стандартной методике [M.G.Ormerod, 1990; Laff S.A., Langolis R.J., 1990]. Получали гомогенную суспензию изолированных лимфоцитов мыши из селезенки. Для идентификации лимфоцитов и определения их субпопуляционного состава использовали набор моноклональных антител Mouse BD Fc Block™. Детекцию проводили на приборе EPICS-C («Coulter Electronics», USA).

Результаты и и* обсуждение Поучение рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70

На первом этапе работы нами были протестированы различные условия экспрессии белка HSP70 (различная температура роста культур, варьирование количеств индуктора /ос-промотора изопропил- ß-D-тио галактоп и ран ознда (ИПТГ). продолжительность индукции). Оптимальными условиями экспрессии оказались: выращивание культур при37°С, индукция ИПТГ' (до концентрации 1 мМ), продолжительность индукции - 3 часа.

Уровень экспрессии целевого белка составлял от 40 до 50% от общего клеточного белка (рис.1., дорожка 4). Общий выход целевого белка при экспрессии составлял около 200 мг с литра культуры (слеток, что соответствует 100 мг с грамма биомассы. Белок находился в растворимой фракции цитоплазмы. Белок полностью адсорбировался на носитель при очистке методом металл о-хе латной хроматографии, за счет аффинного связывания шести гастидиновых остатков с ионами никеля. Чистота выделенного белка составляла не менее 95% (рис.1.) Концентрация белка составляла 1,33 мг/мл (по методу ВСА).

Рис, 1. Электре фореграмма

рекомбинантного белка М, ¡иЬегсиЬяк НЗР70 в 12% полиакриламидном геле с добавлением додеци л сульфата натрия (ДДС-№). 1- маркер (Регшепш); 2,3 -очищенный белок Н5Р70, 4 - белок Н8Р70 в лизате клеток Е.соН.

Общий выход очищенного белка составлял не менее 100 мг с литра бактериальной культуры.

Изучение физико-химических свойств рекомбинантного белка HSP70, важных для последующей конъюгации с адъювантом

Как известно, конформация рекомбинантного белка может отличаться от той, которую он имеет в клетке (в данном случае, в составе М. tuberculosis), что может приводить к изменению его свойств.

Было изучено олигомерное состояние полученного рекомбинантного белка в растворе. Для этого белок подвергали гель-фильтрации и электрофорезу в нативных условиях. Гель-фильтрация в хроматографической колонке 1,2x30 см с носителем «Сефакрил S-300» показала, что белок выходит единым гомогенным пиком, при этом подвижность HSP70 соответствует его мономерной форме, в сравнении с использовавшимися стандартными белками и компонентами с известными молекулярными массами (рис.2.).

С гвадЛой АМегрои)

10 го 30 «О «мящкш

Рис.2. Гель-фильтрация рекомбинантного белка НБР70.

Электрофоретический анализ бежа в нативных условиях (без добавления ДЦС-Ыа) может использоваться для определения олигомерного и информационного состояния белков, так как условия анализа позволяют сохранить пространственную структуру большинства белков. Такой электрофоретический анализ белка НБР70 показывает присутствие только одной полосы, соответствующей мономеру и полное отсутствие каких-либо других олигомерных форм и агрегатов с меньшей электрофоретической подвижностью (рис.3.).

Рис.3.

Электроф ореграмм а рекомби f tanTHoro белка теплового шока М. tuberculosis HSP70 в нагивных условиях. 1,2-белок HSP70

Таким образом, согласно проведенным двум независимым гестам, выделенный HSP70 является мономером.

Хотя проведенные тесты не свидетельствуют о сохранении нативной конформации белка, известно, что для неправильно свернутых и денатурированных белков характерна тенденция к агрегации. Отсутствие агрегации свидетельствует о сохранении основных конформационных свойств белка. Принципиальным для нашей работы является сохранение растворимости рекомбинантного белка и его стабильность в растворе как мономера, что важно для дальнейшего использования данного рекомбинантного белка в качестве основы для субъединичной вакцины.

Очистка полученного рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 от эндотоксина

Белок, получаемый в системе экспрессии в клетках кишечной палочки, содержит эндотоксин - липополисахарид клеточной стенки грамотрицательных бактерий, который вызывает нежелательные побочные эффекты в организме человека. Освободить получаемый продукт от эндотоксина позволяет использование аффинного сорбента, содержащего полимиксин В, который обладает высоким сродством к эндотоксину [Issekutz A.C., 1983]. Для этого проводили хроматографию полученного препарата белка на указанном носителе. При этом эндотоксин остается сорбированным на носителе, а белок проходит через него, яе задерживаясь.

Для определения соответствия полученного продукта требованиям, предъявляемым препаратам, проходящим доклинические испытания, рекомбинантный белок HSP70 после очистки на полимиксине В был проверен на содержание эндотоксина методом ЛАЛ-тест по стандартной методике.

Количественно определение содержания бактериальных эндотоксинов в испытуемом препарате возможно путем анализа серии его разведений. Расчет основных показателей для данного препарата белка: допустимая норма введения - 5 ЕЭ/кг * час; концентрация препарата белка Н8Р70 (определена методом ВСА) - 1,33мг/мл; доза препарата, вводимая в течение 1 часа на человека - 0,05 мг (для препаратов вводимых парентерально); доза препарата, вводимая в течение 1 часа на 1 кг массы - 0,05мг / 70кг = -0,7x10"3 мг; максимально допустимая концентрация эндотоксина - 7000ЕЭ/мг (9310ЕЭ/мл); максимально допустимая степень разведения (отношение максимально допустимой концентрации эндотоксина, ЕЭ/мл к заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива ) - 310 333 раз; заявленная чувствительность ЛАЛ-реактива - 0,03 ЕЭ/мл. Для расчета концентрации бактериальных эндотоксинов в испытуемом образце умножают чувствительность ЛАЛ-реактива (X.) на значение фактора разведения, являющегося результатом реакции (таблица 1.).

Таблица 1. Результаты ЛАЛ-теста для разведений препарата белка ШР70

повторность Разведение препарата бежа ЛАЛ-вода («-» контроль) 0,06 ЕЭ/мл («+» контроль)

1:500 1:600 1:700 1:800 1:900 1:1000 1: 10 000

1 + + + + + • +

2 + + + + + ■ +

«+» - образование твердого геля, положительный результат; «-» - гель не образуется, отрицательный результат.

Для результатов, полученных для нескольких повторностей, рассчитывают среднее геометрическое значение.

Концентрация бактериальных эндотоксинов в исследуемом образце рекомбинантного белка НБР70 составила ~27 ЕЭ/мл.

Содержание эндотоксина 27 ЕЭ/мл значительно ниже максимально допустимой концентрации эндотоксина 9310 ЕЭ/мл, определенной для данного препарата. В настоящее время мы не можем указать точную дозировку препарата, но можно сказать, что при данной чистоте препарата по эндотоксинам его можно вводить парентерально

до 1 мл (1,33 мг), что явно превышает ожидаемое содержание белка в одной дозе вакцины.

Для изучения условий хранения белка его подвергали лиофилизации из буфера PBS. После одного месяца его хранения в лиофилизованном состоянии препарат рекомбинантного белка HSP70 подвергали анализу.

Полностью отсутствует его деградация по результатам электрофореза с добавлением ДДС-Na (рис.4.). После растворения белок сохраняет свою мономерную форму по результатам электрофоретического анализа в нативных условиях (данные не представлены).

1 2

MaecftKfl 116

HSP70

ш,

25

тяг**

Рис.4. Электрофореграмма очищенного белка HSP70 после хранения в лиофилизованном виде в течение месяца. 1 - белок HSP7Q; 2 - маркер (Fermentas)

Таким образом, процесс лиофилгоашш и хранение белка а течение

продолжительного периода времени не влияют на интактность и олигомерное состояние

выделенного белка.

Изучение влияния рекомбинантного белка HSP70 на иммунный ответ на мышах

Белок М. tuberculosis HSP70 является сильным антигеном, что было подтверждено рядом исследований. При получении рекомбинантного белка его конформация может отличаться от той, что он имеет в составе туберкулезной микобактерии, что может приводить к изменению его антигенных свойств. Влияние HSP70 на гуморальный иммунный ответ

Методом непрямого твердофазного ИФА были проанализированы сыворотки мышей, иммунизированных рекомбинантным белкам HSP7Ü (рис.5.).

|<ШО!||вОО 1.МОО 1,4000 »<»00 1:ШЮО 133000

разведения сывороток

Рис.5. Влияние рекомбинантного белка Н8Р70 на гуморальный иммунный ответ.

1 - отрицательный контроль, 2 иммунизация Н8Р70

Титр антител к белку составляет 1:4000, следовательно, Н8Р70 можно охарактеризовать, как достаточно сильный антиген.

Влияние НБРЮ на Т-клеточный иммунный ответ

Клеточный иммунитет является самым важным компонентом ответа иммунной системы на туберкулезную инфекцию. От нормального взаимодействия клеток иммунной системы зависит уничтожение и удаление микобактерий, попавших в организм. Т-лимфоциты играют в этом взаимодействии одну из наиболее значительных ролей.

В ходе эксперимента была показана индуцированная рекомбинантным белком ШР70 пролиферация Т-лимфоцитов (рис.6.).

§ 1400

в. 1200

| 1000

х 800 й

I 600 400 ^ 200 0

и

0

1 #

«П319

4894

4550

4161

1 2 3

разведения

Рис.6. Влияние Н8Р70 на Т-клеточный иммунный ответ. По оси абсцисс - разведения антигена, по оси ординат - % относительно отрицательного контроля.

Стимуляция пролиферации, в сравнении с отрицательным контролем, составляла 1329% для HSP70. Стандартный положительный контроль стимуляции пролиферации ФГА в тех же условиях показывал 618% стимуляции пролиферации. Таким образом, HSP70 является более сильным активатором пролиферации, чем ФГА, что позволяет охарактеризовать белок HSP70 как сильный стимулятор Т-клеточного ответа.

Полученные результаты подтверждают, что рекомбинантный HSP70 является сильным антигеном и вызывает Т-клеточный иммунный ответ. Механизм действия вакцины БЦЖ состоит в активации именно Т-клеточного иммунного ответа, и тот факт, что HSP70 вызывает данный тип иммунной реакции позволяет рассматривать его в качестве кандидата для создания субъединичной противотуберкулезной вакцины.

Получение конъюгата рекомбинантиого белка HSP70 и полиоксидония

Следующим этапом работы была конъюгация полученного рекомбинантиого белка HSP70 и полиоксидония - сополимера N-окиси 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида с молекулярной массой 100 Кд, относящегося к классу водорастворимых производных гетероцепных алифатических полиаминов, физиологически активного высокомолекулярного соединения, обладающего выраженной иммуномодулирующей активностью. Полиоксидоний успешно применяется в качестве адъюванта в субъединичных вакцинах [Пинегин Б.В., Сараф A.C., 2001; Петров Р.В. и др., 2002]. Применение полиоксидония в качестве адъюванта в субъединичных вакцинах основано на образовании ковалентной связи между функциональными группами в составе полиоксидония и белками-иммуногенами.

Данный этап работы осуществлялся совместно с ГНЦ Институт иммунологии.

Активированную (гидразидную) форму полиоксидония растворяли в смеси воды и 37% HCl, охлаждали до 0 - 4 "С, далее вводили порциями при перемешивании за 30 мин нитрит натрия, перемешивали при той же температуре 1,5 часа, температуру увеличивали до 20 °С, раствор нейтрализовали добавлением порциями карбоната калия до pH 6,5 - 7,0. Далее к полученному раствору добавляли растворенный в воде рекомбинантный белок HSP70 и полученную смесь оставляли на ночь при 37 °С. Анализ методом ВЭЖХ на ситовой колонке (см. ниже) показывает полное вхождение исходного белка в высокомолекулярную фракцию. Конъюгат выделяли диализом полученного раствора против воды с последующей лиофильной сушкой. Выход препарата составил 8 - 9 мг. Анализ проводили методом ситовой хроматографии

высокого давления с использованием детектора малоуглового рассеяния лазерного света (Low angle laser light scattering (LALLS) detector). Молекулярная масса конъюгата составляет 1300 кДа (рис. 7.).

650 850 1050 1250 1450 1650 1850

Бремя, с

Рис.7. Хроматография коньюгата белка ЖР70 и полиоксидония. 1 - конъюгат белка теплового шока ШР70 и полиоксидония; 2 - полиоксидоний; 3 -белок теплового шока НБР70. Мж (конъюгата) = 1,3х106; М№ (полиоксидония) = 75х103; М„ (белка ШР70) = 70х103

Комбинация ЬАЬЬв и второго детектора, чувствительного к концентрации вещества, дает возможность прямого определения молекулярной массы (Ми), не прибегая к калибровке хромагографической системы. Данный метод обеспечивает корректное определение М«. даже в тех случаях, когда молекулярно-массовые характеристики объектов выходят за пределы разделяющей способности хромагографической колонки или когда имеет место неспецифическое взаимодействие вещества и неподвижной фазы колонки.

Были отработаны адекватные условия для конъюгации. Получен препарат с содержанием белка 20% (0,2 мг белка в 1 мг вещества).

Изучение влияния рекомбинантного белка Н8Р70 и его конъюгата с полиоксидонием на Т-клеточный и гуморальный иммунный ответ на мышах

Иммунизация мышей рекомбинантным бежом Н8Р70 и его коньюгатом с полиоксидонием вызывает комплексные изменения в организме иммунизированных животных. Прежде всего, эти изменения затрагивают клеточное звено иммунитета. Наблюдается значительное увеличение количества Т-клеток (С04+ и Сй8+) с сохранением нормального иммунорегуляторного индекса (соотношения СЭ4+/ С08+).

При изучении гуморального иммунитета выявлено увеличение содержания в сыворотки крови иммуноглобулинов класса Вполне вероятно, что усиление антигенных свойств прототипа субъедничной вакцины путем конъюгации рекомбинантного бежа Н8Р70 с полиоксидонием позволит уменьшить дозу бактериального антигена в составе вакцины, одновременно с этим повысив эффективность вакцинации, а также приведет к большей экономичности. Примером может служить использование полиоксидония в качестве адъюванта в противогриппозной субъединичной вакцине Гриппол. Полиоксидоний обладает выраженным адъювантным и иммуномодулирующим эффектом. Первое свойство позволило существенно снизить в составе вакцины дозы вирусных антигенов и параллельно с этим существенно повысить эффективность и напряженность противовирусного иммунитета. Со вторым свойством полиоксидония связана его способность оказывать нормализующий эффект на состояние всех компонентов иммунной системы [Петров Р.В. и др., 2003].

Оценка гуморального (антительного) ответа

Методом непрямого твердофазного ИФА был проведен сравнительный анализ антительного ответа мышей, иммунизированных рекомбинантным бежом Н8Р70 и антительного ответа мышей, иммунизированных коньюгатом.

При определении титра антител в исследуемой сыворотке за титр в ИФА к используемому антигену принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором значение её оптической плотности превышает значение оптической плотности контрольной сыворотки. Рекомбинантный белок Н8Р70 известен как достаточно сильный иммуноген, что было подтверждено экспериментально. Титр антител к

рекомбинантному белку ГОР70 составил 1:4000. Конъюгация с полиоксидонием усиливает уровень антительного ответа по сравнению с ШР70 (рис. 8.). Титр антител к конъюгату составил 1 : 160000. Таким образом, можно говорить о том, что конъюгация значительно (в 40 раз) усиливает гуморальный иммунный ответ.

1,6

1,4

ё 1 1,2

§ 1

1 0,8

и

1

Ё

о 0,4

0,2

0

иммунизация

ч мышей HSP70

\ / \ иммунизация

\ мышей конъюгатом \/

отрицательный \

контроль \

■ ■....... , j .......... ГЩ.И. ■ »1 -11ГГ ' I , _

1-ЖШОСО 13900 Ш00 1JÖD0 1;1Ю00 1:32000 1:640001'.12500012 JCOCB

Рис.8. Влияние рекомбинантного белка HSP70 М. tuberculosis и его конъюгата с полиоксидонием на гуморальный иммунный ответ.

Показано, что при вакцинном процессе БЦЖ после введения вакцины титры антител прогрессивно нарастают и достигают максимума в тот период, когда максимально выраженной является резистентность вакцинированных животных к последующему заражению [Глебович О.В. и др., 1978].

Антительный ответ не лежит в основе борьбы с микобактериями, но является важным показателем, отражающим общую активацию иммунной системы, направленную на борьбу с туберкулезом. (Vordermeier Н.М., 1996; А.М. Dannenberg, 2001).

Оценка Т-клеточного ответа

Клеточный иммунитет является центральным звеном резистентности к туберкулезу. Для активации адаптивного иммунного ответа к туберкулезной микобактерии необходимо представление белковых антигенов именно из этой бактерии. Это представление осуществляют антиген-представляющие клетки (АПК). В процессе фагоцитоза АПК представляют пептиды из туберкулезных микобактерий на собственной поверхности с помощью молекул главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, МНС) П класса. Т- клетки хелперного ряда, несущие маркер CD4+, играют важную роль в формировании противотуберкулезного иммунитета. CD4+T-лимфоциты распознают именно комплекс молекулы МНС II класса с пептидами антигенов. Активируясь, Т-лимфоциты-хелперы секретируют различные цитокины. В частности, интерлейкин-2 (IL-2), стимулирующий пролиферацию как Т-хелперов, так и цитотоксических СБ8+лимфоцитов (киллеров) и интерферон-у (IFN-y), который активирует макрофаги. Пролиферируя, CD4+T-лимфоциты играют важную роль в формировании туберкулезной гранулемы и ограничении распространения возбудителя в тканях. CDS+лимфоциты распознают молекулы МНС I класса и играют важную роль при инфекционном процессе, вызванном колонизацией туберкулезных микобактерий. Одной из основных составляющих патогенеза туберкулеза является персистенция туберкулезных микобактерий в макрофагах. Цитотоксические CDS+лимфоциты способны уничтожать инфицированные макрофаги, а также непосредственно уничтожать персистирующие внутри макрофагов туберкулезные микобактерии.

Был сравнен иммунный ответ на белок HSP70 у мышей, иммунизированных конъюгатом и мышей, иммунизированных HSP70. Было показано, что иммунизация коныогатом значительно усиливает иммунный ответ (рис.9.).

Пролиферация Т-клеток достаточно сильная в случае иммунизации только рекомбинантным белком HSP70 и еще более значительная при иммунизации конъюгатом. В обоих случаях имеются участки линейной зависимости от концентрации антигена. При иммунизации рекомбинантным белком HSP70 и при иммунизации конъюгатом пролиферация в обоих случаях превышала значение таковой для стандартного контроля стимуляции пролиферации (ФГА). ФГА известен как один из наиболее сильных стимуляторов пролиферации. Контроль использовался для каждой из групп мышей.

Рис.9. Влияние рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 и его конъюгата с

полиоксидонием на Т-клеточный иммунный ответ.

1 - иммунизация рекомбинантным белком HSP70;

2 - иммунизация конъюгатом.

Данные приведены за вычетом значения фона.

г t 4

разведение 1:4

Иммунизация рекомбинантным белком ШР70 усиливает пролиферацию в 2,1 раза по сравнению со своим стандартным положительным контролем, иммунизация конъюгатом усиливает пролиферацию в 1,7 раза. По сравнению с иммунизацией рекомбинантным белком ШР70 конъюгат усиливает пролиферацию в 2,7 раза.

Методом проточной цитометрии было установлено соотношение СБ41- и С08+Т-лимфоцитов (рис.10.). Показано, что, стимулируя Т-клеточный ответ, рекомбинантный белок и его конъюгат с полиоксидонием не нарушают соотношения СБ4+ и СБ8+Т-лимфоцитов (иммунорегуляторный индекс), который составил 1,38 для мышей, иммунизированных рекомбинантным белком Н8Р70 и 1,39 для группы, иммунизированной конъюгатом (нормальное значение иммунорегуляторного индекса составляет 1,2-2,5).

! CD4 f СШ

ríMvytncíлцп'.' HSP7Ü иммунизация

КОНЪЮПТОМ

Рис. 10. Распределение

СЕМ+ и С08+Т-

лимфоцитов при

стимуляции клеточного

иммунного ответа до

результатам проточной цитометрии.

Формирование эффективной иммунологической защиты зависит от клеточного взаимодействия. Способность лимфоцитов синтезировать цитокины делает возможным активацию макрофагов и цитотоксических лимфоцитов^ Если макрофаги, захватившие туберкулезные микобактерии, активированы, возможно уничтожение и элиминация патогена, что играет важную роль при первом контакте организма с туберкулезной микобактерией. Вакцина БЦЖ эффективна в предотвращении заболевания тяжелыми формами туберкулеза, однако не предотвращает инфишрованносги микобактерией и возможности развития туберкулезного процесса в дальнейшем. Персистенция туберкулезных микобактерий в макрофагах является одним из основных составляющих патогенеза заболевания. CD8+л и мфо циты способны оказывать цитотоксическое действие на макрофаги, инфицированные туберкулезными микобакгернями.

Таким образом, введение рекомбинантного белка туберкулезной микобактерии HSP70 и его коньюгата с полноксидонием вызывает комплекс изменений в иммунной системе, затрагивающий как гуморальное, так и клеточное составляющие иммунитета. Антительный ответ не лежит н основе борьбы иммунной системы с микобактериями, но является важным показателем, отражающим общую активацию иммунной системы по отношению к возбудителю туберкулёза. В основе этой резистентности лежит активация клеточного иммунного ответа. Нами показано, что введение рекомбинантного белка М tuberculosis HSP70 и его конъюгата с полно кс идо ни ем вызывает активную пролиферацию Т-клеток, как С04+лимфоцитов (хелперов), так я цитотоксических CD8 +лимфоцитов (киллеров) с сохранением их нормальною

соотношения. Конъюгация рекомбинантного белка HSP70 с полиоксидонием в значительной мере усиливает его антигенные свойства. Представленные результаты свидетельствуют о высоком потенциале полученного прототипа конъюгированной субъединичной противотуберкулезной вакцины на основе рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70. В дальнейшем предстоит изучение вакцинного эффекта полученных препаратов (рекомбинантного белка HSP70 и его конъюгата с полиоксидонием) на модели мышей, зараженных туберкулезом.

ВЫВОДЫ:

1. Отработан метод получения рекомбинантного белка М tuberculosis HSP70 с чистотой 98%.

2. Изучены основные физико-химические параметры рекомбинантного белка М tuberculosis HSP70. Показано, что белок сохраняет растворимость и стабильность в растворе как мономер, что важно для дальнейшего использования данного рекомбинантного белка в качестве основы для субъединичной вакцины.

3. Показано, что белок HSP70 соответствует требованиям проведения доклинических испытаний (чистота, отсутствие деградации, содержание эндотоксинов).

4. Экспериментально показано на мышах, что рекомбинантный белок HSP70 является сильным стимулятором Т-клеточного иммунного ответа.

5. Впервые получен конъюгат рекомбинантного белка HSP70 и иммуномодулятора полиоксидония, изучены и охарактеризованы его свойства.

6. В экспериментах на мышах показано, что рекомбинантный белок М tuberculosis HSP70 и его конъюгат с полиоксидонием оказывают стимулирующее влияние как на Т-клеточный, так и на гуморальный иммунный ответ, причем конъюгат белка с полиоксидонием является более эффективным стимулятором гуморального и Т-клеточного ответа. Полученные результаты позволяют рассматривать данный конъюгат в качестве прототипа субъединичной противотуберкулезной вакцины.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Калюкина А.С., Позднякова Н.В. Получение рекомбинаятного белка HSP70 М. Tuberculosis с целью возможного клинического применения в качестве субъединичной вакцины против туберкулеза // Актуальные вопросы клинической медицины: материалы, клинической конференции молодых ученых (19 дек. 2003г., г. Москва). - М„ 2003. - С. 327-332.

2. Калюкина А.С. Получение рекомбинантного белка HSP70 М Tuberculosis для возможного применения в профилактике туберкулезной инфекции // Системная

. биология и биоинженерия: материалы международной школы-конференции молодых ученых (28 нояб. - 2 дек. 2005г., г. Москва). - М., 2005. - С.142-143

3. Калюкина А.С., Северин Е.С., Зыкова И.Е. Новые подходы к диагностике туберкулеза // Вопросы медицинской, биологической и фармацевтической химии. - 2005. - №3. - С.11-17.

4. Калюкина А. С. Получение рекомбинантных белков Mycobacterium tuberculosis для возможного применения в диагностике и профилактике туберкулезной инфекции // ХШ Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: сборник материалов конгресса (3-7 апр. 2006г., г. Москва). - М., 2006. - С. 156.

5. Калюкина А.С., Лауринавичюте Д.К., Юркова М.С., Федоров А.Н., Северин Е.С.

, Дзучение основных физико-химических параметров и влияния на

пролиферативную активность Т-лимфоцитов рекомбинантного белка HSP70 М tuberculosis // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2006. - № 4. - С. 37-41.

6. Kalyukina A.S., Laurinavichiute D.K., Yurkova M.S., Fedorov A.N., Severin E.S. M. tuberculosis recombinant protein HSP70 effect on the proliferative activity of T-lymphocytes // Basic Science for Biotechnology and Medicine: proceedings of International conference (sep. 3-7 2006, Novosibirsk). - Novosibirsk, 2006. - P. 79.

7. Калюкина A.C., Юркова M.C., Лауринавичюте Д.К., Федоров А.Н., Северин Е.С. Влияние рекомбинантного белка HSP70 М tuberculosis на пролиферативную активность Т-лимфоцитов // Генетика микроорганизмов и биотехнология: тезисы международной школы-конференции (28 нояб. - 1 дек. 2006г., Москва-Пущино). - Москва - Пущино, 2006. - С. 49.

Принято к исполнению 22/02/2007 Исполпено 26/02/2007

Заказ № 135 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Калюкина, Арина Сергеевна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1.Туберкулез, сведения о заболевании.

2.1.1. Определение.

2.1.2. Классификация.

2.1.3. Эпидемиология.

2.1.4. Характеристика возбудителя туберкулеза.

2.1.5. Патогенез туберкулеза.

2.1.6. Диагностика туберкулеза.

2.1.7. Профилактика туберкулеза.

2.2. Создание новых противотуберкулезных вакцин.

2.2.1.Модификация штаммов БЦЖ.

2.2.2. Создание ДНК-вакцин.

2.2.3. Субъединичные вакцины.

2.2.4. Предпосылки к созданию субъединичной вакцины на основе белков теплового шока.

2.2.5. Выбор адъюванта.

2.2.6. Теоретические предпосылки для создания конъюгированной противотуберкулезной вакцины на основе белков теплового шока и адъюванта полиоксидония.

3. Материалы и методы исследования.

4. Результаты и их обсуждение.

4.1. Получение рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70.

4.2. Изучение физико-химических свойств рекомбинантного белка HSP70, важных для последующей конъюгации с адъювантом.

4.3. Очистка полученного рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 от эндотоксина.

4.4. Изучение условий хранения белка HSP70.

4.5. Изучение влияния рекомбинантного белка HSP70 на иммунный ответ на мышах.

4.6. Повышение антигенных свойств рекомбинантного белка HSP70 за счет коньюгирования с полиоксидонием.

4.7. Изучение влияния рекомбинантного белка HSP70 и его конъюгата с полиоксидонием на Т-клеточный и гуморальный иммунный ответ на мышах.

4.7.1. Оценка гуморального (антительного) ответа.

4.7.2. Оценка Т-клеточного ответа.

5. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение возможности применения рекомбинантного белка HSP70 туберкулезной микобактерии в профилактике туберкулеза"

Туберкулез - болезнь, являющаяся одной из самых актуальных проблем мирового здравоохранения, ежегодно уносит жизни более 1 млн. человек (Dye С. et al., 2005). В нашей стране туберкулез продолжает оставаться одной из наиболее распространенных инфекций и представляет огромную опасность для здоровья населения. В последние годы туберкулез стал характеризоваться более тяжелым течением в сочетании с полирезистентностью возбудителя болезни Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным лекарствам (Попович В.К., 2005; Соловьева И.П., 1998).

Следовательно, одной из важнейших задач, стоящих перед современной медициной, является разработка новых методов предупреждения заболевания туберкулезом.

За последние годы был сделан ряд значительных открытий в области изучения патогенеза заболевания, особенностей его возбудителя.

Одним из значимых достижений науки последних двух десятилетий явилось открытие и изучение функций белков теплового шока. Данные несколько групп белков присутствуют в клетках любого организма и являются необходимыми в целом ряде процессов. Так, эти белки исполняют роль молекулярных шаперонов (т.е. являются белками -дуэньями), которые необходимы для приобретения биологически активных конформаций вновь синтезированными белками. У позвоночных белки теплового шока выполняют важные роли в иммунной системе, связываясь с антигенами патогенных микроорганизмов и антигенами, специфическими для злокачественных опухолей (Pierce S.K., 1994). Клетки иммунной системы имеют рецепторы к белкам теплового шока, в результате чего эти комплексы вызывают сильный иммунный ответ (Wang Y. et al., 2001). Кроме этого, сами по себе белки теплового шока патогенных микроорганизмов являются одними из наиболее сильных антигенов (Heikema A. et al., 1997; Zugel U. et al., 2001). Одним из наиболее перспективных направлений создания новых генно-инженерных вакцин является использование белков теплового шока либо как иммуногенов, либо носителей белков-иммуногенов.

Основным средством профилактики является вакцина БЦЖ (BCG -Bacille de Calmette et de Guerin) - живая противотуберкулезная вакцина из аттенуированного штамма микобактерий туберкулеза. Эта вакцина была создана в 1921 году французскими учеными Альбером Кальметом и Камиллом Гереном путем пассирования культуры микобактерий бычьего типа (М tuberculosis typ. bovis). До настоящего времени вакцина БЦЖ является единственным препаратом, применяемым для специфической профилактики туберкулеза. Вакцина вызывает Т-клеточный иммунный ответ. Принцип защитного действия прививки против туберкулеза заключается в ограничении распространения возбудителя из места первичной инфекции гематогенным путем, что снижает риск развития заболевания и реактивации процесса. Вакцина БЦЖ обеспечивает защиту от форм первичного туберкулеза, она наиболее эффективна при введении до момента инфицирования. Эффективность защитного действия вакцины БЦЖ значительно варьирует, от высоких процентов предупреждения развития туберкулеза у детей (92-100%) (Митинская JI.A, 2001), у взрослого населения она не подтверждается (0 - 80%) (Grange J.M., 2000). Определенную проблему при применении вакцины БЦЖ составляет, во-первых, гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ), индуцируемая вакцинацией, которую сложно отличить от ГЗТ, вызванной М. tuberculosis. Следовательно, использование туберкулина (комплекса белков туберкулезной микобактерии) в кожных тестах для диагностических и эпидемиологических целей, влечет за собой сложности, связанные с дифференциальной диагностикой собственно туберкулезной инфекции и поствакцинальной аллергии (Lowrie, D.B. et al., 1995). Во-вторых, поскольку БЦЖ является живой вакциной, ее применение противопоказано при иммунодефицитных состояниях (в т.ч. ВИЧ-инфекции), так как возможно развитие туберкулеза (Mustafa A.S., 2001).

Следовательно, перспективным является поиск новых методов профилактики туберкулеза, основанный на последних достижениях науки в области изучения возбудителя заболевания и его патогенеза.

Основные направления поиска новой противотуберкулезной вакцины лежат в сфере создания субъединичных вакцин в сочетании с разрешенными для применения у человека адъювантами. Субъединичными называют вакцины, которые содержат только отдельные компоненты патогенного микроорганизма - рекомбинантные белки или синтетические пептиды, содержащие основные эпитопы антигенов, активно распознаваемые иммунной системой хозяина. Достоинства субъединичных вакцин заключаются в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызвать нежелательные эффекты в организме-хозяине. В качестве основного компонента для прототипа противотуберкулезной вакцины был выбран белок теплового шока М. tuberculosis, принадлежащий к семейству HSP70 (heat shock protein, молекулярная масса 70 кД).

Исходя из этого, целью данного исследования являлось: изучение возможности применения рекомбинантного белка Mycobacterium tuberculosis HSP70 для профилактики туберкулеза в качестве компонента прототипа противотуберкулезной вакцины.

В соответствии с целью исследования в работе решались следующие экспериментальные задачи:

- разработка методов получения рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70;

- получение рекомбинантного белка HSP70 в форме, пригодной для проведения доклинических исследований (чистота, отсутствие деградации, минимальное содержание эндотоксинов);

- изучение физико-химических свойств рекомбинантного белка HSP70, важных для последующей конъюгации с адъювантом;

- изучение влияния рекомбинантного белка HSP70 на Т-клеточный иммунный ответ на мышах;

- повышение антигенных свойств рекомбинантного белка HSP70 за счет коньюгации с полиоксидонием;

- изучение влияния рекомбинантного белка HSP70 и его конъюгата с полиоксидонием на гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ.

Основными результатами проведенной работы явились: получение рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 в форме, пригодной для дальнейших исследований; изучение его физико-химических свойств, важных для конъюгации с адъювантом; была охарактеризована in vivo способность рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 к стимулирующему влиянию на Т-клеточный иммунный ответ; впервые был получен конъюгат рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 и адъюванта полиоксидония, изучены его параметры; было проведено изучение антигенных свойств прототипа субъединичной противотуберкулезной вакцины на основе конъюгата рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 и полиоксидония на мышах. Обнаруженый потенциал прототипа конъюгированной субъединичной противотуберкулезной вакцины можно охарактеризовать как высокий, что делает возможным развитие этого направления в области создания новых препаратов, предназначенных для профилактики туберкулеза.

Положения, выносимые на защиту.

Получение рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 в форме, пригодной для проведения предклинических испытаний (чистота, отсутствие деградации, отсутствие содержания эндотоксина).

Экспериментально подтвержденные иммуногенные свойства рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 на мышах.

Получение конъюгата рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 и адъюванта полиоксидония.

Экспериментально подтвержденное усиление иммуногенных свойств конъюгата рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 и адъюванта полиоксидония.

2. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Калюкина, Арина Сергеевна

Результаты исследования были доложены на клинической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической медицины» (декабрь 2003, Москва), XIII Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (апрель 2005, Москва), Международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (ноябрь 2005, Москва), Международной конференции «Basic Science for Biotechnology and Medicine» (сентябрь 2006, Новосибирск), международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (ноябрь 2006, Москва-Пущино), а также научных семинарах Всероссийского Научного Центра молекулярной диагностики и лечения и семинарах кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сеченова.

Апробация работы состоялась на совместном заседании научно-методической конференции кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сеченова 6 декабря 2006 г.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калюкина, Арина Сергеевна, Москва

1. Авдеев В.Г. Методы определения концентрации белка // Вопросы медицинской химии. 1977. - Т. 23, №4. - С.562-571.

2. Аксенова В.А., Леви Д.Т., Закирова Н.Р. Современные проблемы вакцинопрофилактики туберкулеза у детей // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 1999. №1. - С.3-6.

3. Барсов Б.В. Туберкулез. Профилактика и методы лечения. М.: Центрполиграф, 2006. - 127 с.

4. Вакцинопрофилактика: Руководство для врачей / Таточенко В.К., Озерецковский Н.А., Соколова А.Ф. М., 1994. - С. 45 - 47.

5. Васильева A.M., Меметов С.С., Назарец О.В. Туберкулез как медико-социальная проблема // Медико-соц. экспертиза и реабилитация. -2003. №4. С.37-40.

6. Глебович О.В. и др. Туберкулез / Глебович О.В., Володин Е.И., Зарецкий В.Ф. Ленинград, 1978. - 192 с.

7. Греймер М.С., Фейгин М.И. Раннее выявление туберкулеза легких. -Ленинград: Медицина, 1986. 144 с.

8. Дворецкий Л.И., Тихонова Г.Н., Дедова И.С. Милиарный туберкулез в старческом возрасте // Русский медицинский журнал. 1999. Т.7, №5.-С. 388-391.

9. Ерохин В.В. Клеточная и субклеточная морфология репаративных процессов при туберкулезе легких // Проблемы Туберкулеза. 1996. №6.-С. 10-14.

10. Коломиец В.М., Евглевский А.А. и др. Перспективность поиска новых биопрепаратов для профилактики туберкулеза // Проблемы туберкулеза. 2002. №10. - С.31 - 33.

11. Литвинов В.И., Мороз A.M., Гергерт В.Я. Достижения и перспективы исследований в области иммунологии и иммуногенетики туберкулеза // Проблемы Туберкулеза. 1996. № 6. -С. 14-18.

12. Ломако М.Н. Руководство по фтизиатрии / Ломако М.Н., Судник С.И., Соболь С.А. Минск: Вышейшая школа. - 1991. - 302 с.

13. Львова Л.В. Альтернатива БЦЖ // Провизор. 2001. № 18.- С. 28 -35.

14. Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование / Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. М.: Мир, 1984. - 480 с.

15. Маркелов Ю.М. Ранняя диагностика и профилактика туберкулеза: Учеб. пособие / Маркелов Ю.М., Федоровых B.C. Петрозаводск: Изд-во ПетрГУ, 2000. - 56 с.

16. Меве Е.Б. Туберкулинодиагностика. Минск, Беларусь, 1970. -152 с.

17. Медведев С.Ю. Из истории селекции вакцинного штамма для БЦЖ-вакцины // Вакцинация — 2002. № 1(19). С. 6- 10.

18. Микробиология: Учебник / Воробьев А.А., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова A.M. М.: Медицина, 1999. - С. 241-243.

19. Митинская J1.A. 80 лет применения вакцины БЦЖ // Проблемы туберкулеза. 2001. №1. - С.51 - 53.

20. Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Жербун А.Б. Возбудитель туберкулеза в современных условиях // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2003. №4. - С. 13-15.

21. Перельман М.И. Туберкулез. М.: Медицина, 1990. - 304 с.

22. Пинегин Б.В., Сараф А.С. Механизм действия и клинического применения отечественного иммуномодулятора полиоксидония. М. 2001. - С.10- 12.

23. Попович В.К. Динамика показателя смертности от туберкулеза в России. // Проблемы социальной гигиены, здравоохранения и истории медицины. 2005. № 3. - С. 14-17.

24. Попович В.К., Соловьева И.П. Эпидемия туберкулеза в морфологическом освещении // Архив патологии. 1998. №1. - С. 30 -34.

25. Путов Н.В и др. Справочник по пульмонологии / Путов Н.В., Федосеев Г.Б., Хоменко А.Г. Ленинград: Медицина, 1987. - 224 с.

26. Свирщевская Е.В., Митрофанов B.C., Шендерова Р.И., Чужова Н.М. Иммунитет при туберкулезе и аспергиллезе (обзор) // Проблемы медицинской микологии.- 2005. Т.7, №1. - С.3-13.

27. Ситников А.Г. и др. JTAJT-тест. Современные подходы к определению пирогенности / Ситников А.Г., Глазова Н.В., Травина Л.А., Багирова В.Л. — СПб., 1994. — 105 с.

28. Соловьева И.П. Эпидемия туберкулеза в морфологическом освещении // Архив патологии. 1998. №1. - С. 30 - 34.

29. Струков А.И. Морфология туберкулеза в современных условиях. -М.: Медицина, 1986. 232 с.

30. Федоровых B.C. и др. Ранняя диагностика и профилактика туберкулеза: Учебное пособие / Федоровых B.C., Маркелов Ю.М. -ПетрГУ. Петрозаводск, 2001. 70 с.

31. Хоменко А.Г. Современные представления о патогенезе туберкулеза // Русский медицинский журнал. 1998. - Т. 6., №17. - С. 810-814.

32. Хоменко А.Г. Туберкулез. М. - 1996.

33. Хоменко А.Г. Туберкулез как глобальная и национальная проблема здравоохранения // Большой целевой журнал о туберкулезе. 1998. №1.-С. 8-11.

34. Хоменко А.Г. и др. Туберкулёз органов дыхания / Хоменко А.Г., Авербах М.М., Александрова А.В. М.: Медицина, 1988. - 456 с.

35. Шилова М.В. Туберкулез в России в 1999. М., 2000. - С.48 - 49. 44.Чучалин, А.Г. Новые данные иммунных реакций при туберкулёзе //

36. Русский медицинский журнал. 2004. №2. - С.88-90.

37. Шлегель Г. Общая микробиология / Пер. с нем. М.: Мир, 1987. -566 с.

38. Щупак Н.Г. Внелегочный туберкулез в клинике внутренних заболеваний. Ленинград: Медгиз, 1962. - 192 с.

39. Abel В., Thieblemont N., Quesniaux V.J. Toll-like receptor 4 expression is required to control chronic Mycobacterium tuberculosis infection in mice // J. Immunol. 2002. - Vol. 169(6): - P. 3155-3162.

40. Allen M.J., Laederach A., Reilly P.J., Mason RJ. Polysaccharide recognition by surfactant protein D: novel interactions of a C-type lectin with nonterminal glucosyl residues // Biochemistry. 2001. - Vol. 40 (26) - P. 7789-7798.

41. Alter-Koltunoff M., Ehrlich S., Dror N. Nrampl-mediated innate resistance to intraphagosomal pathogens is regulated by IRF-8, PU.l, and Miz-1 //J. Biol. Chem.- 2003. Vol. 278(45) - P. 44025-44032.

42. Ashitani J., Mukae H., Hiratsuka T. Elevated levels of alpha-defensins in plasma and BAL fluid of patients with active pulmonary tuberculosis // Chest. 2002. - Vol. 121(2) - P. 519-26.

43. Attanasio R., Pehler K., McClure H.M. Immunogenicity and safety of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins in non-human primates // Clin. Exp. Immunol. 2000. - Vol. 119(1). - P. 84 - 91.

44. Baldwin S.L. Immunogenicity and protective efficacy of DNA vaccines encoding secreted and nonsecreted forms of Mycobacterium tuberculosis Ag85A // Tuber. Lung Dis. 1999. - Vol. 79 (4). - P. 251 - 259.

45. Baldwin S.L., D'Souza С., Roberts A.D., Kelly B.P., Frank A.A., Lui M.A., Ulmer J.B., huygen K., McMurray D.N., Orme I.M. Evaluation of new vaccines in the mouse and guinea pig model of tuberculosis // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 2951 - 2959.

46. Baron S. et al. Medical Microbiology Fourth Edition. / Baron S., Peake R.C., James D.A., Susman M., Kennedy C.A., Singleton M.J.D., Schuenke S. The University of Texas Medical Branch at Galveston, 1996-963 p.

47. Bartow R.A., McMurray D.N. Cellular and humoral immune responses to mycobacterial stress proteins in experimental pulmonary tuberculosis // Tubercle and Lung Disease. 1997. № 3 - 4. - P. 185-193.

48. Baumann S., Eddine A.N., Kaufmann S.H. Progress in tuberculosis vaccine development // Curr Opin Immunol. 2006. - Vol. 18(4). -P. 438-448.

49. Blackwell J.M., Searle S., Mohamed H., White J.K. Divalent cation transport and susceptibility to infectious and autoimmune disease: continuation of the Ity/Lsh/Bcg/Nrampl/Slcl lal gene story // Immunol. Lett. 2003. - Vol. 85(2) - P. 197-203.

50. Brandt L., Elhay M.J., Rosenkrands I., Lindblad E.B., Andersen P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. - P. 791 -795.

51. Brandt L., Oettinger Т., Holm A., Andersen A.B., Andersen P. Key epitopes on the ESAT-6 antigen recognized in mice during the recall of protective immunity to Mycobacterium tuberculosis // J. Immunol. -1996. Vol. 157(8). - P. 3527 - 3533.

52. Branger J., Leemans J.C., Florquin S. Toll-like receptor 4 plays a protective role in pulmonary tuberculosis in mice // Int. Immunol. 2004. -Vol. 16(3)-P. 509-516.

53. Chakraborty A.K. Epidemiology of tuberculosis: current status in India // Indian J. Med. Res.- 2004. Vol. 120(4). - P. 248-276.

54. Cho S., Mehra V., Thoma-Uszynski S., Stenger S., Serbina N., Mazzaccaro R., Flynn J.L., Barnes P.F., Southwood S., Celis E.

55. Antimicrobial activity of MHC class I restricted CD8+ T cells in human tuberculosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - P. 12210.

56. Cо D.O., Hogan L.H, Kim S.I., Sandor M. Mycobacterial granulomas: keys to a long-lasting host-pathogen relationship // Clin. Immunol. 2004. -Vol. 113(2)-P. 130- 136.

57. Collins R.N. Rab and ARF GTPase regulation of exocytosis // Mol. Membr. Biol. 2003. - Vol. 20(2) - P. 105 -115.

58. Dannenberg A.M. Pathogenesis of pulmonary Mycobacterium bovis infection: basic principles established by the rabbit model // Tuberculosis. -2001.-Vol. 81: (12).-P. 87-96.

59. Del Giudice G. Hsp70: a carrier molecule with built-in adjuvanticity // Experientia. 1994. № 50. - P. 1061 - 1066.

60. Dye C., Watt C.J., Bleed D.M., Hosseini S.M., Raviglione M.C. Evolution of tuberculosis control and prospects for reducing tuberculosis incidence, prevalence, and deaths globally. // JAMA. 2005. - Vol. 293, №22.-P. 2767-2775.

61. Ellis S.M. The spectrum of tuberculosis and non-tuberculous mycobacterial infection// Eur. Radiol. 2004. - Vol. 14. - Suppl. 3. - P. 34 -42.

62. Flynn, J.L., Goldstein M.M., Triebold K.J., Koller В., Bloom B.R. Major histocompatibility complex class I-restricted T cells are required for resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. // Infect Agents Dis. -1993. №2 (4).-P. 259-262.

63. Flynn, J.L., Chan J. 2001. Immunology of tuberculosis // Curr Opin Immunol. 2003. №15 (4). - P.450-455.

64. Forreiter C. Nover Lutz Heat induced stress proteins and the concept of molecular chaperones // J. Biosci. 1998. № 4. - P. 287-302.

65. Grange J.M. Effective vaccination against tuberculosis a new ray of hope // Clin, and Exp. Immunol. - 2000. № 2. - P. 232 - 234.

66. Granucci F., Zanoni I., Feau S., Ricciardi-Castagnoli P. Dendritic cell regulation of immune responses: a new role for interleukin 2 at the intersection of innate and adaptive immunity // EMBO J. 2003. -Vol. 22(11)-P. 2546-2551.

67. Govoni G., Vidal S., Gauthier S., Skamene E., Malo D., Gros P. The Bcg/Ity/Lsh locus: genetic transfer of resistance to infections in C57BL/6J mice transgenic for the Nrampl Glyl69 allele // Infect. Immunity. 1996. -Vol. 164, №8.-P. 2923-2929.

68. Gottesman S., Wickner S., Maurizi M.R. Protein quality control: Triage by chaperones and proteases // Genes and Dev. 1997. № 7. - P. 815 -823.

69. Guleria I., Teitelbaum R., McAdam R.A., Kalpana G., Jacobs W.R., Bloom B.R. Auxotrophic vaccines for tuberculosis // Nat Med. 1996. №2(3).-P. 334-337.

70. Hayashi F., Means Т.К., Luster A.D. Toll-like receptors stimulate human neutrophil function // Blood. -2003. Vol. 102(7) - P.2660-2669.

71. Heikema A., Agsteribbe E., Wiscjut J., Huckriede A. Generation of heart shock-protein-based vaccines by intracellular loading of gr96 with antigenic peptides // Immunol. Lett. 1997. - Vol. 57. - P. 69-74.

72. Higa A., Mandel M. Actinomycin sensitive mutants of Escherichia coli K-12 // Mol Gen Genet. 1970. -Vol. 108(1). - P.41-46.

73. Hirata Т., Osuga Y., Hirota Y., Koga K. Evidence for the presence of tolllike receptor 4 system in the human endometrium // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2005. - Vol.90 (1). - P.548-556.

74. Horwitz M.A., Lee B.-W. E., Dillon B.J., Harth G. Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination with major extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1995.-Vol. 92.-P. 1530-1534.

75. Jabado N. and Gros P. Tuberculosis: The genetics of vulnerability // Nature. 2005. - Vol. 434. - P. 709-711.

76. Kato Т., Sakamoto E., Kutsuna H. Proteolytic conversion of STAT3alpha to STAT3gamma in human neutrophils: role of granule-derived serine proteases // J. Biol. Chem. 2004. - Vol.279 (30) - P. 31076-3180.

77. Kiang J.G. and Tsokos G.C. Heat shock protein 70 kD: Molecular Biology, Biochemistry and Physiology Pharmacology // Therapy. 1998. -Vol. 80, №2.-P. 183-201.

78. Kobayashi К., Kaneda К., Kasama Т. Immunopathogenesis of delayed-type hypersensitivity // Microsc. Res .Tech. 2001. - Vol. 53(4) - P. 241245.

79. Kulka M., Alexopoulou L., Flavell R.A., Metcalfe D.D. Activation of mast cells by double-stranded RNA: evidence for activation through Tolllike receptor 3 // J. Allergy Clin. Immunol.- 2004. Vol.114 (1) - P. 174182.

80. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol. 227(5259). - P. 680685.

81. Laff S.A., Langolis R.J. Flow cytometry and sorting / ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L. Mendelson. 2nd edn. - New York: Wiley - Liss, 1990.-P. 249-290.

82. Lachmann H.J., Strangeways L., Vyakarmam A. and Evans G. Raising antibodies by coupling peptides PPD and immunizing BCG-sensitized animals // Ciba Found. Symp. 1986. - Vol. 119. - P. 25-27.

83. Lazarevic V., Flynn J. CD8 T cells in tuberculosis // American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2002. - Vol. 166. - P. 11161121.

84. Lewinsohn D., Alderson M., Briden A., Riddell S., Reed S., Grabstein K. Characterization of human CD8+ T cells reactive with Mycobacteriumtuberculosis-infected antigen presenting cells // J. Exp. Med. 1998. -Vol. 187(10).-P. 1633-1640.

85. Li Z. Immunogenicity of DNA vaccines expressing tuberculosis proteins fused to tissue plasminogen activator signal sequences // Infect. Immun. -1999. Vol. 67 (9). - P. 4780 - 4786.

86. Liang L., Sha W.C. The right place at the right time: novel B7 family members regulate effector T cell responses // Curr. Opin. Immunol. -2002.-Vol. 14 (3). P.384 -390.

87. Liu W., Cao W.C., Zhang C.Y. VDR and NRAMP1 gene polymorphisms in susceptibility to pulmonary tuberculosis among the Chinese Han population: a case-control study // Int. J. Tuberc. Lung Dis. -2004.-Vol. 8(4) P.428-434.

88. Lowrie D.B., Teskon R.E., Silva C.L. Vaccination against tuberculosis // Int. Arch. Allergy Immunol. 1995. - Vol. 108(4). - P.309-312.

89. Lowrie D.B. Protection against tuberculosis by a plasmid DNA vaccine // Vaccine. 1997. - Vol. 15 (8). - P. 834 - 838.

90. McCormack F.X., Gibbons R., Ward S.R. Macrophage-independent fungicidal action of the pulmonary collectins // J. Biol. Chem. 2003. -Vol. 278(38) - P. 36250-36256.

91. Mombo L.E., Lu C.Y., Ossari S., Bedjabaga I., Sica L., Krishnamoorthy R., Lapoumeroulie C. Mannose-binding lectin alleles insub-Saharan Africans and relation with susceptibility to infections // Genes Immun. -2003. Vol. 4(5). - P. 362-367.

92. Muller I., Cobbold S.P., Waldmann H., Kaufmann S.H. Impaired resistance to Mycobacterium tuberculosis infection after selective in vivo depletion of L3T4+ and Lyt-2+ T cells // Infect Immun. 2001. -Vol. 55(9).-P. 2037-2041.

93. Mustafa A.S. Biotechnology in the Development of new Vaccines and Diagnostic Reagents Against Tuberculosis // Current Pharmaceutical Biotechnology 2001. - Vol. 2. - P. 157 - 173.

94. Nogee L.M. Genetic mechanisms of surfactant deficiency // Biol. Neonate. 2004. - Vol. 85(4). - P. 314 - 318.

95. North R.J., Jung Y.J. Immunity to tuberculosis // Annu. Rev. Immunol. -2004.-Vol.22.-P. 599-623.

96. Olsen A.W., van Pinxteren L.A.H., Okkels L.M., Rasmussen P.B., Andersen P. Protection of mice with a tuberculosis subunit vaccine based on a fusion protein of antigen 85B and ESAT-6 // Infection and Immunity. 2001. - Vol. 69, №5. - P. 2773 - 2778.

97. Ormerod M.G. (ed.) Flow cytometry; A practical approach / IRL Press. -Oxford.- 1990.-P. 119-135.

98. Pedroza-Gonzalez A, Garcia-Romo G.S., Aguilar-Leon D. In situ analysis of lung antigen-presenting cells during murine pulmonaryinfection with virulent Mycobacterium tuberculosis // Int. J. Exp. Pathol. -2004.-Vol. 85(3)-P. 135-145.

99. Pehler K., Brasky K.M., Butler T.M., Attanasio R. Mycobacterium tuberculosis-secreted protein antigens: immunogenicity in baboons // J. Clin. Immunol. 2000. - Vol. 20(4). - P. 306 - 316.

100. Pierce S.K. Molecular chaperones in the processing and presentation of antigen to helper T cells // Experientia. № 50. - 1994. - P. 1026 - 1030.

101. Philpott D.J., Girardin S.E. The role of Toll-like receptors and Nod proteins in bacterial infection // Mol. Immunol. 2004. - Vol. 41(11) - P. 1099-1108.

102. Proud D., Sanders S.P., Wiehler S. Human rhinovirus infection induces airway epithelial cell production of human beta-defensin 2 both in vitro and in vivo // J. Immunol. 2004. - Vol. 172(7) - P. 4637-4645.

103. Quesniaux V., Fremond C., Jacobs M. Toll-like receptor pathways in the immune responses to mycobacteria // Microbes Infect. 2004. - Vol.6 (10)-P. 946-59.

104. Schaefer T.M., Desouza K., Fahey J.V. Toll-like receptor (TLR) expression and TLR-mediated cytokine/chemokine production by human uterine epithelial cells // Immunology. 2004. - Vol.112 (3) - P. 428-436.

105. Serbina N.V., Liu C.C., Scanga C.A., Flynn J. L. CD8+ cytotoxic T lymphocytes from lungs of Mycobacterium tuberculosis-infected miceexpress perforin in vivo and lyse infected macrophages // J. Immunol. -2000. Vol. 165(1). - P. 353-363.

106. Silva C.L. and Lowrie D.B. A single mycobacterial protein (hsp 65) expressed by a transgenic antigenpresenting cell vaccinates mice against tuberculosis // Immunology. 1994. - Vol. 8 (2). - P. 244 - 248.

107. Soborg C., Madsen H.O., Andersen A.B. Mannose-binding lectin polymorphisms in clinical tuberculosis // J. Infect. Dis. 2003. -Vol. 188(5)-P. 777-782.

108. Srivastava P.K. Interaction of heart shock proteins with peptides and antigen presenting cells: chaperoning of the innate and adaptive immune responses // Ann. Rev. Immunology. 2002. - Vol. 20. - P. 395 - 201.

109. Stenger S., Hanson D.A., Teitelbaum R., Dewan P., Niazi K.R., Froelich C. J., Ganz Т., Thoma-Uszynski S., Melian A., Bogdan C. An antimicrobial activity of cytolytic T cells mediated by granulysin // Science. 1998.-Vol. 282 (5386).-P. 121-125.

110. Tam C.M., Leung C.C., Noertjojo K., Chan S.L., Chan-Yeung M. Tuberculosis in Hong Kong-patient characteristics and treatment outcome // Hong Kong Med. J. 2003. - Vol. 9(2). - P. 83-90.

111. Tascon R.E. Vaccination against tuberculosis by DNA injection // Nat. Med. -1996. Vol. 2 (8). - P. 888 - 892.

112. Vejbaesya S., Chierakul N., Luangtrakool K., Srinak D., Stephens H.A. Associations of HLA class II alleles with pulmonary tuberculosis in Thais // Eur. J. Immunogenet. -2002. Vol. 29(5). - P. 431-434.

113. Vergne I., Chua J., Singh S.B., Deretic V. Cell biology of Mycobacterium tuberculosis phagosome // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. -2004.-Vol.20-P. 367-94.

114. Vordermeier H.M. Increase of tuberculous infection in the organs of В cell deficient mice // Clin Exp Immunol. 1996. - Vol. 106 (2). - P. 312-316.

115. Wesa A.K., Galy A. IL-1 beta induces dendritic cells to produce IL-12 // Int. Immunol. 2001. - Vol.13 (8) - P. 1053-1061.

116. Wisniewski H.G., Vilcek J. Cytokine-induced gene expression at the crossroads of innate immunity, inflammation and fertility: TSG-6 and PTX3/TSG-14 // Cytokine Growth Factor Rev. 2004. - Vol.15 (2-3) - P. 129-146.

117. Yong R. Adjuvant-free hsp70 fusion protein system elicits humoral and cellular immune responses to HIV-1 p24 // The Journal of immunology. -1996.-Vol. 156.-P. 873-879.

118. Zhu X. Functions and specificity of T cells following nucleic acid vaccination of mice against Mycobacterium tuberculosis infection // J Immunol. 1997. - Vol. 158 (12). - P. 5921 - 5926.

119. Zugel U., Sponaas A.M., Neckermann J., Schoel В., Kaufman S.H. Gp 96 peptide vaccination of mice against intracellular bacteria // Infect. Immunol. 2001. - Vol. 69 (6). - P. 4164-4167.

120. Автор выражает признательность сотрудникам кафедры биохимии Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова за содействие в выполнении работы и ценные замечания по содержанию диссертации.