Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание и экспериментальная оценка эффективности гриппозных векторов, экспрессирующих микобактериальный антиген ESAT-6

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Создание и экспериментальная оценка эффективности гриппозных векторов, экспрессирующих микобактериальный антиген ESAT-6"

На правах рукописи

СТУКОВА Марина Анатольевна

СОЗДАНИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ГРИППОЗНЫХ ВЕКТОРОВ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫЙ АНТИГЕН ЕвАТ-б

03.00.06 - Вирусология

11111111111111111111

003 16183Т

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2007

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт гриппа Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель доктор биологических наук

Егоров Андрей Юрьевич

Официальные оппоненты академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Тец Виктор Вениаминович

Защита диссертации состоится «13» ноября 2007 года в 12 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001 043 01 при ГУ НИИ гриппа РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул проф Попова, 15/17)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ НИИ гриппа РАМН

доктор медицинских наук, профессор Кузнецов Олег Константинович

Ведущая организация

ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора

Автореферат разослан «_» октября 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат медицинских наук Лобова Тамара Геннадьевна

Актуальность проблемы. Перспективным направлением разработки эффективных вакцин против инфекционных заболеваний является создание вирусных или бактериальных рекомбинантных векторов, осуществляющих доставку в организм протективных антигенов, с которыми связано формирование профилактического или лечебного эффекта вакцинации (Moorthy V S et al, 2003, Rocha CD et al, 2004)

С развитием методов обратной генетики появилась уникальная возможность использовать в качестве вектора модифицированную интраназальную гриппозную вакцину (Fodor Е et al, 1999, Neumann G et al, 1999) К преимуществам гриппозных векторов можно отнести 1) отсутствие ДНК стадии в репликативном цикле вируса, исключающей хромосомную интеграцию вирусного генома (Lamb RA and Krug RM, 2001), 2) формирование выраженного клеточного и гуморального иммунного ответа на системном уровне и во входных воротах инфекции (Alexandrova G I et al, 1984, Rudenko LG et al, 1993, Cox RJ et al, 2004), 3) существование множества антигенных подтипов вируса гриппа, что дает возможность проводить повторные иммунизации для достижения максимального профилактического или лечебного эффекта (стратегия инициация—^усиление, «pnme-boost»), 4) доказанную безопасность живых гриппозных вакцин (Alexandrova G I et al, 1986, Romanova J et al, 2004)

Одной из перспективных для генетических манипуляций мишеней при конструировании гриппозных векторов является неструктурный NS1 белок вируса гриппа, который в ходе естественной гриппозной инфекции в больших количествах синтезируется в зараженных клетках и вызывает выраженный антительный и Т-клеточный иммунный ответ (Birch-Machin I et al, 1997) В работах последних лет была показана высокая толерантность NS гена вируса гриппа к вставкам протяженных чужеродных нуклеотидных последовательностей в рамке считывания NS1 белка (Ferko В et al, 2001) При этом за счет нарушения основной функции полноразмерного NS1 белка как антагониста системы интерферонов I типа, подобные штаммы теряют способность к полноценной репликации в организме хозяина, что обеспечивает безопасность их использования в качестве вакцинных препаратов (Egorov A et al, 1998) В то же время в зоне вирусной репликации происходит выработка большого количества цитокинов, которые способствуют поляризации иммунного ответа в сторону Тх-1 звена (Stasakova J et al, 2005)

Иммунологические свойства конструкций подобного типа, а также возможность их интраназального введения определяют перспективы использования гриппозных векторов для защиты от воздушно-капельных инфекций, в контроле которых решающую роль играет развитие полноценного Тх-1 иммунного ответа, например, при туберкулезе, который является одной из основных причин смерти от инфекционных заболеваний (Левашев ЮН и др , 2005) Необходимость разработки альтернативных подходов к профилактике и лечению туберкулеза связана с недостаточной эффективностью вакцины БЦЖ в контроле над детской заболеваемостью, реактивацией латентных очагов эндогенной инфекции и экзогенной реинфекции у взрослых, а также крайне высоким уровнем лекарственной устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам (Король О И, 2003, Медуницын H В , 2005)

Значительный интерес с точки зрения разработки новых вакцинных кандидатов представляют белки культурального фильтрата микобактерий туберкулеза, в семейство которых входит ранний секреторный антиген ESAT-6 (Early Secreted Antigen Target, 6 кДа) (Andersen P et al, 1994) Данный белок кодируется RDI геномной областью микобактерий, утраченной в процессе длительного культивирования в вакцинном штамме БЦЖ, и является иммунодоминантаюй мишенью для клеточного иммунного ответа как на ранней стадии туберкулезной инфекции у человека, так и в различных моделях экспериментального туберкулеза у животных (Brodln P et al, 2004)

Результаты доклинических исследований протективных свойств ESAT-6 антигена M tuberculosis в виде пептидных и ДНК вакцин (Kamath AT et al, 1999, Brandt L et al, 2000), а также в составе бактериальных векторов на основе БЦЖ (Рут AS et al, 2003) и Salmonella typhimurium (Mollenkopf H J et al, 2001) показали, что вследствие недостаточной иммуногенности ESAT-6 белка формирование защитного эффекта иммунизации определяется способом его введения и доставки в организм Использование в качестве вектора модифицированной интраназальной гриппозной вакцины является новым подходом к разработке противотуберкулезных вакцин

Цель исследования. Получение аттенуированных рекомбинантных штаммов вируса гриппа А, экспрессирующих ранний секреторный микобактериальный антиген ESAT-6, и оценка их профилактической и терапевтической эффективности при интраназальном введении на модели экспериментальной туберкулезной инфекции

Задачи исследования

1 С помощью методов обратной генетики получить рекомбинантные штаммы вируса гриппа А различных антигенных подтипов, экспрессирующие микобактериальный антиген ESAT-6 с открытой рамки считывания NS1 белка

2 Охарактеризовать свойства рекомбинантных гриппозных векторов по следующим параметрам экспрессия туберкулезного ESAT-6 белка, репродуктивность в клеточных культурах, генетическая стабильность и безвредность для животных

3 Определить иммуногенные свойства полученных векторов по индукции клеточного CD4+ Тх-1 иммунного ответа и выработке антител к туберкулезному антигену у мышей

4 Провести сравнительную оценку протективных свойств гриппозных векторов и вакцины БЦЖ для профилактики эксперименальной туберкулезной инфекции

5 Оценить терапевтическую эффективность гриппозных векторов в сочетании с этиотропной терапией у мышей с экспериментальной туберкулезной инфекцией

Научная новизна работы. С помощью методов обратной генетики сконструированы модифицированные по гену NS рекомбинантные атгенуированные штаммы вируса гриппа А, экспрессирующие микобактериальный антиген ESAT-6 Установлено, что полученные штаммы являются эффективными векторами для доставки туберкулезного антигена в организм иммунизируемых животных Проведено исследование протективных свойств гриппозных векторов на моделях экспериментальной туберкулезной инфекции Установлено, что двукратная интраназальная иммунизация животных гриппозными векторами различных антигенных подтипов обеспечивает защиту от инфекции, по ряду показателей превышающую профилактическое действие вакцины БЦЖ Показана возможность повышения эффективности этиотропной терапии туберкулеза у мышей при введении в схему лечения иммунизации рекомбинантными гриппозными векторами

Практическая значимость работы. Использование в качестве интраназальной вакцины векторной системы на основе рекомбинантного аттенуированного вируса гриппа, экспрессирующего ранний секреторный микобактериальный антиген ESAT-6, может служить перспективным подходом в решении задач

разработки нового поколения противотуберкулезных вакцин и повышения эффективности комплексной терапии туберкулеза

Основные положения, выносимые на защиту

1 Генетически стабильные гриппозные векторы трех антигенных подтипов способны обеспечивать экспрессию раннего секреторного антигена ESAT-6 M tuberculosis с открытой рамки считывания NS1 белка

2 Рекомбинантные штаммы вирусов гриппа с инсерцией гена ESAT-6 не утрачивают репродуктивной активности и обладают при этом аттенуированным фенотипом при интраназальном введении животным

3 Двукратная интраназальная иммунизация животных приводит к индукции системного CD4+ Тх-1 иммунного ответа к ESAT-6 белку и формированию протективного противотуберкулезного иммунитета у мышей и морских свинок

4 Комбинированное применение иммунизации рекомбинантными гриппозными векторами с этиотропной антибиотикотерапией повышает эффективность лечения туберкулезной инфекции у мышей

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены на VIII Всероссийском научном форуме с международным участием им акад В И Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004), на I международной конференции "Influenza Vaccines for the World " (Лиссабон, 2004), на 14-м Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2004), на международной научно-практической конференции «International Workshop on Tuberculosis Vaccines» (Куба, 2005), на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения туберкулеза» (Санкт-Петербург, 2005), на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы туберкулеза и болезней легких» (Москва, 2006), на международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Минск, 2007), на юбилейной конференции с международным участием, посвященной 40-летию института гриппа РАМН (Санкт-Петербург, 2007) Получено положительное решение по заявке на получение патента (per № 2005129049) По результатам исследования опубликовано 11 научных работ

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах текста, включающего 8 таблиц и 30 рисунков, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3-х глав результатов

исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Список литературы содержит 178 источников на русском и английском языках

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клетки и вирусы. Клетки Vero и MDCK (American Type Culture Collection) культивировались в бессывороточной среде следующего состава питательная среда DMEM / Ham F12 (1 1) (Biochrom F4815) с добавлением 4 mM L-глютамина Инфекционный титр вирусов гриппа определяли методом бляшкообразования на клетках Vero под 0,6% агаровым покрытием, содержащим питательную среду DMEM / Ham F12, 4мМ L-глютамина, 5мкг/мл трипсина, 0,01% DEAE-декстрана (Pharmacia), и выражали в бляшкообразующих единицах (БОЕ/мл)

Конструирование плазмид. Геномная РНК вируса гриппа A/PR8/34 была экстрагирована с помощью реагента Ultraspec (Biotecx Laboratories) ДНК копия NS гена была получена с помощью обратной транскрипции с использованием праймера (5'-ACTACTTCTAGAGAAGACAAAGCAAAAGCAGGGTGACA-3') и M-MuLV обратной транскриптазы (Fermentas) Полученная кДНК использовалась для амплификации фрагмента NS гена в полимеразной цепной реакции (ПЦР) Амплифицированный фрагмент был клонирован в плазмидный вектор pQBI 25/50-fCl(Qbiogene) по тупым концам между Poll промотором и последовательностью рибозима вируса гепатита дельта (ВГД), играющего роль терминатора транскрипции (Pleschka S et al, 1996, Poomputsa К et al, 2003) Синтез нуклеотидной последовательности, кодирующей ESAT-6 белок, был осуществлен путем гибридизации эквимолярного количества шести синтетических перекрывающихся олигонуклеотидов (по 10 пкмоль/мл каждого) (CODON Genetic Systems) при нагревании до температуры 100°С в течение 4-х минут с последующим медленным охлаждением смеси до комнатной температуры Полученный ДНК-фрагмент был амплифицирован в ПЦР и клонирован по липким концам в плазмиду pPolI-NS-ВГД с использованием сайта рестрикции BsmBI, введенного в состав концевых праймеров Для постгрансляционного разделения ESAT-6 белка с N-терминальной областью NS1 белка между ними была введена синтезированная последовательность (51 нуклеотид), кодирующая участок сайта узнавания клеточными протеазами белка 2А пикорновируса Экспрессионные плазмиды для РВ1, РВ2, РА и NP белков вируса гриппа были получены путем клонирования соответствующих PR8 генов в плазмиду pTriEx-1 (Novagene) под активный промотор цыпленка

Гриппозные векторы Flu/ESAT-6 различных антигенных подтипов были получены на клетках Vero методом РНП-трансфекции (Egorov A et al ,1998) Безвредность гриппозных векторов. Мышей линии C57black/6 заражали интраназально в дозе 106 БОЕ/мышь вирусами гриппа A/PR/8/34 (H1N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2) «дикого» типов, или рекомбинантными гриппозными вирусами тех же подтипов, экспрессирующих ESAT-6 белок (Flu/ESAT-6 (H1N1), Flu/ESAT-6 (H3N2)) Титр вируса в супернатантах 10% суспензии легочной ткани определяли через 2 дня после инфекции методом предельных разведений на клетках Vero

Иммунофлуоресценция. Распределение белка в клетках Vero, зараженных рекомбинантными вирусами гриппа проводили по стандартной методике с использованием поликлональных кроличьих антител к ESAT-6 белку (Fusion Antibodies) В качестве вторых антител использовали коньюгированные с FITC антитела к иммуноглобулинам G кролика (Sigma) Визуализация флуоресценции проводилась на конфокальном УФ микроскопе (Bio-Rad) Животные. Для оценки иммуногенности гриппозных векторов и воспроизведения экспериментальной туберкулезной инфекции использовали 400 линейных мышей C57black/6 и 16 морских свинок, полученных из питомника «Рапполово», РАМН В работе использовались модели экспериментальной туберкулезной инфекции, разработанные в ФГУ "Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии Росмедтехнологий" Работу выполняли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12 08 77) Иммунизация. Иммунизацию мышей проводили двукратно интраназально, без наркоза, в дозе 10б БОЕ/мышь, с интервалом в 3 недели первую -рекомбинантным гриппозным вектором Flu/ESAT-6 подтипа H1N1, вторую -гриппозным вектором подтипа H3N2 Опытные группы морских свинок иммунизировали дважды, с интервалом в 3 недели вируссодержащими суспензиями смеси рекомбинантных гриппозных векторов, относящихся к H1N1, H3N2 и H2N2 антигенным подтипам вируса гриппа А Вакцину БЦЖ в дозе 10б КОЕ/животное вводили подкожно на первом сроке введения Flu/ESAT-6 Инфекция. При проведении профилактических исследований генерализованный туберкулезный процесс моделировали введением через 3 недели после второй иммунизации взвеси трехнедельной культуры М bovis bovinus 8 (106 КОЕ/мышь) в латеральную хвостовую вену мышей или подкожным введением 106 КОЕ М tuberculosis H37Rv в правую паховую

область морских свинок При проведении терапевтических исследований для заражения животных использовалась культура вирулентного штамма М tuberculosis Erdman в дозе 104 КОЕ/мышь Контролями служили зараженные невакцинированные животные (контроль заражения), мыши, иммунизированные вирусом гриппа A/PR/8/34 «дикого» типа или гриппозным вектором A/PR8/NS1-125, не содержащим вставки ESAT-6, в дозе 106 БОЕ/мышь

Пролиферативную активность лимфоцитов селезенки мышей оценивали в РБТЛ (Тессенов В , 1979) Культуры клеток стимулировали рекомбинантным ESAT-6 белком в концентрации 5 мкг/лунку (Fusion antibodies) или Конкановалином A (Sigma) в конечной концентрации 1 мкг/мл Определение продукции цитокинов (ИФН-у, ИЛ-4) в супернатантах трехдневных культур клеток селезенки и трахеобронхиальных лимфоузлов проводили с использованием иммуноферментных тест систем Quantikine™ (R&D Systems, Minneapolis) в соответствии с инструкцией по использованию Фагоцитарную активность макрофагов исследовали в культуре перитонеальных Мф (1x106 клеток) мышей по их отношению к клеточной взвеси дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae (lxlO7 клеток), опсонизированных сывороткой мышей

Статистическую обработку данных проводили с помощью параметрического теста Стьюдента и непараметрического критерия Вилкоксона - Манна - Уитни Достоверность различий по параметру выживаемости рассчитывали по Log Rank тесту с использованием программы Graph Pad Prism версия 3 для Windows (Graph Pad Software)

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение гриппозных векторов различных антигенных подтипов, экспрессирующпх микобактериальный белок ESAT-6

Рекомбинантные штаммы вирусов гриппа А антигенных подтипов H1N1 и H2N2, экспрессирующие микобактериальный белок ESAT-6, получены с помощью методов обратной генетики (Enami М et al, 1990, Fodor Е et al, 1999, Neumann G et al, 1999) Клетки Vero трансфецировали плазмидой, содержащей химерный NS ген, совместно с набором плазмид, экспрессирующих белки полимеразного комплекса и NP белок вируса гриппа (рис 1) Через 24 часа трансфецированные клетки заражали хелперными

вирусами гриппа A/S¡ng/deINS87 (H2N2) или A/PR/8-delNS(HlNl), которые содержали частично или полностью удаленный NS1 ген и поэтому были чувствительны к действию интерферона (Kittel С. et al., 2004). В качестве селективного препарата добавляли человеческий лейкоцитарный интерферон-альфа в концентрации 3 ед./мл культурапьной среды и инкубировали клетки в течение 48 часов при 37°С. Вирусы дважды пассировали на клетках Vero в присутствии интерферопа-альфа.

ИФН-а - чувствительный

вирус-помощник

Плазмида. экспрессирующая химерныи NS1 белок

Poll -промотор

Трансфеиция

Рекомбинантныи вирус гриппа (Flu/ESAT-6)

, Vera----Селекции ¡ИФН-а) Hl,,. <"¿,

Рибозим ВГД

4 плазмиды. экспрессирующие белки полимеразного комплекса и NP белок вируса гриппа

NS1-125-ES/ NS2INEP)

Рис. I. Схема получения рекомбпнантных гриппозных векторов Flu/ESAT-6 антигенных подтипов H1N1 и H2N2 методом рнп-трансфекции.

Конечная популяция вирусов содержала рекомбинантныи NS ген со вставкой ESAT-6, что подтверждалось секвенированием продукта ОТ-ПЦР.

Одним из преимуществ гриппозных векторов и NS рекомбинантиых штаммов, в частности, является возможность переноса модифицированного NS гена в состав генома фактически любого подтипа вируса гриппа А. В нашем исследовании гриппозный вектор антигенного подтипа H3N2 был получен путем скрещивания рекомбинантиого вируса гриппа A/PR8/NS1-125-ESAT-6 (IIINI) с вирусом гриппа A/Aichi/1/68 (H3N2) на клетках Vero в присутствии кроличьей антисыворотки к вирусу гриппа A/PR8/34 (H1N1).

В результате были получены гриппозные векторы трех антигенных подтипов, содержащие химерный NS ген со вставкой нуклеотидной последовательности, кодирующей ESAT-6 белок, введенной между позициями 400-401 в открытой рамке считывания NS1 белка перед ранним стоп кодоном (ТАА) без удаления участка гена (рис. 2а и б).

NS ген 1

i 4 «»0 и.о.

NEP МРНК i

Flu/ESAT-6

(H1N1) (H3N3) PR/8/34 M

2 1 22(* 4У/3

б.

rec NS ген Q

ns1-125-2a-esat-6 нрнк

a 4SI 73» 12)2 И.о.

202/ IbS-1 li/b

ВЭО 56»

Рис. 2. Схематическое изображение NS гена н специфических мРНК транскрнптов.

а. Вирус гриппа A/PR8/34: б. Рекомбинантный вирус гриппа А. содержащий химерный NS ген; в. Электрофореграмма продуктов амплификации продуктов ОТ-ПЦР с кДНК копий NS гена вируса гриппа дикого типа А PR/8/34/ (H1N1) и рекомбинантных вирусов Flu/ESAT-6 HIN1 и H3N2 антигенных подтипов, относительно маркера молекулярного веса (М).

С целью посттрансляционного разделения ESAT-6 белка с N-терминальной областью белка NS1, между ними была введена синтезированная последовательность, кодирующая участок сайга узнавания клеточными протеазами белка 2А (NFDLLK.LAGDVESNLGP) пикорновируса, который обладает свойством саморазрезания перед последним пролином (Percy N. et al., 1994).

В полученных вирусных конструкциях кодирующая последовательность укороченного NS гена была достаточна для экспрессии белка NEP (NS2). Вследствие наличия вставки, рекомбинангные вирусы отличались от вирусов гриппа «дикого» типа наличием увеличенного размера геномного фрагмента NS, что было подтверждено результатами электрофореза в агарозном геле продуктов амплификации кДНК копий NS гена вируса гриппа A PR/8/34/ (H1N1) «дикого» типа и гриппозных векторов Flu/ESAT-6 в ОТ-ПЦР (рис. 2в). Размер амплифицированного рекомбинантного фрагмента NS1 превышал размер фрагмента NS1 гена вируса гриппа «дикого» типа на расчетную величину.

Биологические характеристики рекомбииантных гриппозных векторов

Репликативные свойства гриппозных векторов in vitro и in vivo.

Полученные штаммы обладали высокой репродуктивной способностью в дефицитной по интерферону клеточной культуре Vero, достигая титров порядка 107-108 БОЕ/мл, и не отличались по этому параметру от вирусов гриппа «дикого» типа При этом гриппозные векторы имели несколько пониженную динамику роста в клетках MDCK и в развивающихся куриных эмбрионах

Способность полученных векторов к репродукции в интерферон-компетентных клеточных линиях предполагало, что вирусы, экспрессирующие половину NS1 белка и вставку, могут реплицироваться и в организме животных Действительно, при интраназальном заражении мышей в дозе 5,5 lg БОЕ/мышь гриппозные векторы обладали способностью к размножению в легких животных до титров 1,5 — 3,0 БОЕ/мл 10% суспензии легких, отставая на 2-4 lg от уровня репродукции родительских штаммов Несмотря на способность гриппозных векторов к репродукции в легких мышей, среди зараженных животных не наблюдалось гибели, а отсутствие патологии в легких животных и снижения массы тела подтверждали аттенуацию рекомбииантных вирусов

Молекулярно-биологические механизмы атгенуации гриппозных векторов и их безвредности для животных могут определяться нарушением функции полноразмерного NS1 белка как антагониста системы интерферонов I типа (Egorov A et al, 1998), а также отсутствием функциональных доменов в карбоксильной части NS1 белка, связанных с патогенностью вируса гриппа (Obenauer J С et al, 2006, Kiselev OI et al, 2007)

Экспрессия ESAT-6 белка in vitro. Генетическим маркером, характеризующим рекомбинантную природу полученных штаммов, является экспрессия ESAT-6 белка, которая была подтверждена методом Вестернблот и иммунофлюоресцентным анализом лизатов зараженных вирусом клеток Vero с использованием моноклональных антител к ESAT-6 белку Результаты Вестернблот-анализа выявили наличие окрашенной зоны, соответствующей белковому продукту с молекулярным весом в 26 КДа, соответствующему фьюжн NS1-125-ESAT-6 белку Таким образом, в полученных вирусных конструкциях 2А сайт посттрансляционного разделения ESAT-6 белка с N-терминапьной областью NS1 белка не был активен Иммунофлюоресцентный анализ зараженных Flu/ESAT-6 векторами клеток Vero (рис 3) выявил

внутриклеточное распределение фьюжн NS1-125-ESAT-6 белка, с преимущественной локализацией в ядре клеток, что соответствует нормальному распределению NS1 белка вируса гриппа через 12 часов после естественной гриппозной инфекции (Li S. et al., 1998).

Рис. 3. Экспрессия ESAT-6 белка в клетках Vero, зараженных рекомбинантным Flu/ESAT-6 (111N1) ........(иным вектором.

Методом иммунофлюоресцентного анализа определяется локализация белка

преимущественно в ядре зараженных клеток

Все полученные штаммы были генетически стабильны, то есть экспрессировали туберкулезный антиген в тканевых культурах после множественных пассажей (>5), что было подтверждено методом Вестернблот. Иммуногенность гриппозных векторов. Одним из основных механизмов контроля туберкулеза является развитие клеточного Гх-1 иммунного ответа. Предполагалось. что вследствие внутриклеточной локализации рекомбинантного NS1 белка полученные конструкции могут иметь преимущества в генерации CD8+ иммунного ответа через представление антигеиа с помощью молекул MI 1С I класса.

1-я ним. 2-я ими.

■ F.SAT-6

вирус гриппа A/PR/8/34

вирус гриппа A/PR/8/34

п ESAT-6 „.От, □ PBS

Flu/ESAT-6 Flu/ESAT-6

(H IN 1+H2N2+H3N2) (HINI+H2N2+H3N2)

Flu/ESAT-6 (MINI)

Flu/ESAT-6 (II3N2)

П 20 40 60 80 100 120 Рис. 4. Иммуногенность гриппозных векторов. Количество ИФН-у секретирующих клеток в ответ на стимуляцию рекомбинантным ESAT-6 белком или ESAr-6(|.20) пептидом, содержащим Н-2Ь-рестриктированный CD4+ Т-клеточпыи эпитоп (Brandt et al.. 1996. Harboe et al.. 1998) в популяции клеток, полученных из селезенки C57black/6 мышей через 10 дней после второй иммунизации Flu/ESAT-6 гриппозными векторами или вирусом гриппа A/PR/8/34 «дикого» типа.

Однако последовательная двукратная иммунизация мышей антигенно различными рекомбинантными вирусами Flu/ESAT-6 вызвала формирование существенного количества иммунореативных CD4+ (Тх-1) лимфоцитов селезенки, которые уже через 10 дней после второй иммунизации были способны отвечать на специфическую стимуляцию культур спленоцитов иммунизированных мышей продукцией ИФН-у в ELISPOT (рис 4)

При этом в популяции спленоцитов не определялось значительного количества ИЛ-4 - секретирующих клеток Результаты исследования сывороток крови иммунизированных животных в этот период методом иммуноферментного анализа показали отсутствие выработки антител к ESAT-6 белку

Таким образом, была подтверждена способность рекомбинантных гриппозных векторов индуцировать системный ESAT-6-специфичный CD4+ Тх-1 клеточный иммунный ответ при интраназальном введении, что послужило основанием исследования их профилактической и терапевтической эффективности при экспериментальной туберкулезной инфекции

Профилактический эффект иммунизации гриппозными векторами при экспериментальной туберкулезной инфекции

Сравнительное исследование протективных свойств Flu/ESAT-6 гриппозных векторов и вакцины БЦЖ проводили на двух моделях экспериментальной туберкулезной инфекции у мышей линии C57black/6 и морских свинок

Оценка профилактического протективного эффекта гриппозных векторов на модели генерализованного туберкулеза у мышей. Двукратная интраназальная иммунизация мышей Flu/ESAT-6 гриппозными векторами, проведенная за 6 и 3 недели до заражения животных вирулентным штаммом M bovis, позитивно отразилась на интегральных показателях тяжести течения туберкулеза - летальности и обсемененности органов микобактериями (МБТ) Под влиянием иммунизации отмечено более позднее начало гибели мышей (69-й против 59-го дня), увеличение средней продолжительности их жизни (129+19 против 80±8 дней, р<0,008, Log Rank test) по сравнению с группой зараженных невакцинированных животных Через 6 недель после заражения МБТ отмечено существенное уменьшение высеваемости МБТ из легких и селезенки (р<0,05), уменьшение распространенности специфического процесса в легочной ткани и повышение ее воздушности, снижение альтеративного компонента воспаления

в легочной ткани практически не обнаруживались скопления нейтрофильных гранулоцитов, участки некроза и ядерный детрит У всех иммунизированных животных зарегистрированы крупные периваскулярные и перибронхиальные лимфогистиоцитарные инфильтраты, что свидетельствовало об активации напряженности местного иммунитета ткани легкого

Оценка профилактического эффекта гриппозных векторов на модели экспериментальной туберкулезной инфекции у морских свинок.

Протективный эффект иммунизации Р1и/Е8АТ-6 гриппозными векторами был подтвержден в опытах на морских свинках, которые ввиду высокой восприимчивости к туберкулезу считаются наиболее подходящей моделью для изучения новых противотуберкулезных вакцин (НотоЦг М А й а1, 2000) Под действием иммунизации была отмечена благоприятная динамика массы тела морских свинок по сравнению с контролем заражения, что свидетельствует о снижении симптомов интоксикации, существенное снижение роста МБТ из легких и селезенки (р<0,05) через 9 недель после заражения, уменьшение степени поражения печени и селезенки, отсутствие очагов специфического воспаления в коллатеральных паховых лимфоузлах, уменьшение распространенности и снижение альтеративного компонента специфического воспаления, активация местного иммунитета ткани легкого иммунизированных морских свинок

Таким образом, двукратная интраназальная иммунизация животных (мышей и морских свинок) Ии/ЕБАТ-б гриппозными векторами в режиме инициация—»усиление (рпте-ЬоскО, проведенная за 6 и 3 недели до заражения животных вирулентными штаммами микобактерий туберкулеза, привела к задержке развития туберкулезной инфекции и снижению тяжести ее течения По ряду показателей протективный эффект гриппозных векторов превышал защитное действие вакцины БЦЖ

Формирование ЕвАТ-б — специфического Тх-1 иммунного ответа в процессе туберкулезной инфекции и иммунизации. Известно, что в формировании протективного противотуберкулезного иммунитета ключевая роль принадлежит Т-хелперам первого типа, которые осуществляют контроль над развитием инфекции посредством выработки Тх-1 цитокинов, в первую очередь интерферона гамма (Р1упп .11. й а!, 2001) В этой связи нами проведено исследование продукции ИФН-у в супернатантах культур селезенки

и трахеобронхиальпых лимфоузлов иммунизированных мышей в ходе экспериментальной туберкулезной инфекции.

Через 2 недели после заражения, когда при визуальном осмотре легких зараженных МВТ мышей еще не выявлялись выраженные очаги туберкулезного поражения, у всех животных отмечено достоверное снижение спонтанного и повышение ESAT-6 - индуцированного уровня продукции ИФН-у (р<0,001), что согласуется с данными по высокому уровню продукции цитокина Т-лимфоцитами на ранних сроках развития туберкулезной инфекции (Dlugovilzky et al., 2000; SHE Kaufmann, 2004). Через 6 недель после заражения, по мере нарастания тяжести туберкулезного процесса, у зараженных невакцинированных мышей отмечено существенное снижение выработки ИФ11-у в культуре спленоцитов и угнетение продукции цитокина в культуре трахеобонхиальных лимфоузлов (рис.5).

ИФН-гамма (селезенка)

ИНТЭКТНЫе контроль РН8/ДИК1 заражения вирус

б.

ИФН-гамма (лимфатические узлы)

а КонА [1 мкг/мл] I ESAT-6 [5 мкг/мл)

t 4

1 3 2

ингаетмые крнтроль PR8/ahkhh БЦЖ FIu/ESAT-6 заражения вирус (М1+НЗ)

гриппа

Рис. 5. Концентрации ПФН-гамма (нг/мл) в супернатантах трехдневных культур а. спленоцитов u б. трахеобронхиальных лимфоузлов через 6 недель после заражения иммунизированных мышей вирулентным штаммом А/. Bovis.

При этом во всех группах иммунизированных мышей в культурах их спленоцитов отмечен достоверно более высокий уровень продукции ИФН-у по сравнению с контрольной группой животных (р<0,001). Существенная выработка ИФП-y в супернатантах культур трахеобронхиальпых лимфатических узлов зарегистрирована только в группе мышей, интраназально иммунизированных гриппозными векторами.

Полученные данные подтверждают целесообразность интраназального способа доставки туберкулезного антигена, поскольку наиболее значимым при легочных формах туберкулеза является формирование Тх-1 иммунного ответа в

непосредственной близости от наиболее чувствительной к микобактериям легочной ткани (Lyadova I.V. et al., 2000; Goonetilleke N.P. et al., 2002).

Терапевтический эффект иммунизации гриппозными векторами при

экспериментальной туберкулезной инфекции

Эффект включения иммунизации рекомбинантными гриппозными векторами I lu/ESAT-б в терапию экспериментального туберкулеза оценивали на модели туберкулезной инфекции, вызванной внутривенным введением вирулентного штамма М. tuberculosis Erdman мышам линии C57black/6. Лечение было начато с 4-й недели после заражения МБТ па фоне обнаружения на пробном вскрытии зараженных мышей множественных субмилиарных очагов специфического воспаления. Группами сравнения служили зараженные нелеченные животные (контроль заражения); мыши, получавшие только терапию изониазидом (контроль терапии); животные, иммунизированные гриппозным вектором A/PR8/NS1-125, не содержащим вставки туберкулезного антигена ESAT-6, на фоне терапии изониазидом.

Рис. 6. Рост МБТ в легких зараженных C57BL/6 мышей через 12 недель ог начала терапии.

Индекс защиты - арифметическая разница между средними значениями числа КОЕ МБТ в группе контроля заражения и

Наибольший терапевтический эффект был выявлен при комбинировании иммунизации гриппозными векторами зараженных МБТ мышей с противотуберкулезной антибиотикотерапией изониазидом, что сопровождалось наибольшим процентом прибавки массы тела иммунизированных мышей к окончанию срока наблюдения.

Включение в схему лечения иммунизации гриппозными векторами привело к санации легочной ткани от Л/. Tuberculosis Erdman: роста МБТ в легких иммунизированных Flu/ESAT-б мышей через 12 недель от начала терапии не зарегистрировано (рис. 6).

Высеваемость МБТ через 12 недель от начала терапии (Log 10 КОЕ/легкие)

контроль заражения

Flu/ESAT-б PR8/NS1-125 +изониаэид тизоииазид

Индекс защиты:

5,5 2,85

3,18 0,53

По сравнению с группой мышей, получавших только этиотроппую терапию, под действием иммунизации отмечено уменьшение распространенности туберкулезного воспаления и исчезновение альтеративпого компонента воспаления в легких, изменение клеточного состава гранулем с преимущественно эпителиоидпого на преимущественно лимфоидный тип, что является благоприятным прогностическим фактором при туберкулезном процессе.

Пролиферативная активность лимфоцитов селезенки. Анализ динамики показателей пролиферативной активности лимфоцитов селезенки мышей (по индексу стимуляции) в ходе развития туберкулезного процесса показал, что в процессе туберкулезной инфекции, на фоне развития иммуносупрессии, связанной с нарастанием тяжести инфекционного процесса, способность лимфоцитов к пролиферации угнетается, что сопровождается существенным снижением продукции Т-клеточного ростового фактора - ИЛ-2 (рис. 7).

ИЛ-2 (пг/мл)

Пролиферативная активность лимфоцитов селезенки (индекс стимуляции)

б.

70

-контроле сражения

недели после заражения мы

□ РВ5 ■ Е5АТ-6

I

интактные Контроль Изониазид р|и/Е5АТ-6 заражения +изониазид

Рис. 7 а. Пролиферативная активность лимфоцитов селезенки зараженных МБТ мышей в динамике туберкулезного процесса, б. Концентрация ИЛ-2 (пг/мл) в супернатантах трехдневных стимулированных ЕБАТ-б белком (5 мкг/мл) культурах спленоцитов мышей через 10 недель после заражения МБТ.

В ходе этиотропной противотуберкулезной терапии восстановления способности лимфоцитов отвечать пролиферацией /'« г'пго на специфическую стимуляцию белком Е8АТ-6 не происходило, что указываег на прекращение формирования клона антиген-специфических лимфоцитов на поздних стадиях туберкулезной инфекции.

При включении в схему лечения двукратной иммунизации рекомбинантными гриппозными векторами, экспрессирующими Е8АТ-6 антиген, отмечено существенное повышение специфической пролиферативной активности лимфоцитов селезенки, которое сопровождалось активацией

продукции Т-клеточного ростового фактора ИЛ-2 Отсутствие данного эффекта при иммунизации животных РЯВЛЫБ1-125 контрольным вирусом, не содержащим ЕБАТ-6 антигена, исключало неспецифическое влияние на иммунный ответ самого гриппозного вектора без вставки туберкулезного антигена

Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов. Иммунизация животных Ни/ЕБАТ-б рекомбинантными гриппозными векторами и вектором без вставки оказала восстанавливающий эффект на поглотительную и переваривающую функцию макрофагов (по фагоцитозу клеточной взвеси дрожжей) при ее угнетении в ходе развития инфекции Через 12 недель от начала терапии по сравнению с нормализацией показателей завершенности фагоцитоза, фагоцитарного числа и фагоцитарной активности под действием этиотропной терапии, в группе иммунизированных животных наблюдалось усиление изученных показателей до уровня, достоверно более высокого, чем у интактных животных (р <0,05) Наиболее отчетливо это проявилось в группе животных, иммунизированных Р118/Ы81-125 гриппозным вектором, не экспрессирующим ЕБАТ-б антиген

Таким образом, результаты проведенного иммунологического исследования показали, что реализация терапевтического действия рекомбинантных гриппозных векторов может быть связана как со специфической активацией пролиферативной активности лимфоцитов селезенки и продукции ими Т-клеточного ростового фактора ИЛ-2, так и с иммуноадъювантными свойствами самого гриппозного вектора без вставки, оказывающего стимулирующий эффект на фагоцитарную активность макрофагов Данные эффекты относятся к одним из основных иммунологических критериев эффективной терапии туберкулеза (Гергерт В Я и др , 1995, ОюЬ Б а а!, 2000)

20

ВЫВОДЫ

1 Сконструированы генетически стабильные гриппозные векторы различных антигенных подтипов, экспрессирующие микобактериальный ESAT-6 белок с открытой рамки считывания NS1 белка вируса гриппа Рекомбинантные векторы на клеточных культурах обеспечивают высокий уровень экспрессии белкового продукта в виде фьюжн NS1-125-ESAT-6 белка с его преимущественным накоплением в ядре зараженных клеток

2 Показано, что удаление функциональных доменов в карбоксильной части NS1 белка в данных конструкциях приводит к атгенуации вирусных векторов и обеспечивает их апатогенность для животных при интраназальном введении

3 В ответ на последовательное интраназальное введение Flu/ESAT-б гриппозных векторов различных антигенных подтипов в режиме инициация—»усиление у мышей развивается выраженный системный ESAT-6-специфичный CD4+ Тх-1 клеточный иммунный ответ

4 Двукратная интраназальная иммунизация животных (мышей и морских свинок) рекомбинантными гриппозными векторами приводит к формированию протективного противотуберкулезного иммунитета, по ряду показателей, превышающего защитное действие вакцины БЦЖ

5 Терапевтическая иммунизация мышей Flu/ESAT-б гриппозными векторами на фоне этиотропной антибиотикотерапии существенно повышает эффективность лечения, что проявляется в снижении показателей тяжести течения инфекции (санация легочной ткани от микобактерий, уменьшение распространенности очагов туберкулезного воспаления, исчезновение альтеративного компонента воспаления в легких)

6 Реализация протективного эффекта рекомбинантных гриппозных векторов осуществляется как за счет ESAT-6-специфической активации клеточного звена иммунитета (пролиферативная активность лимфоцитов селезенки, продукция Т-клеточного ростового фактора ИЛ-2), так и за счет иммуноадъювантных свойств самого гриппозного вектора (без вставки), оказывающего стимулирующее влияние на фагоцитарную активность макрофагов при ее угнетении в ходе развития туберкулезного процесса

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1 Stukova М.А., Sereinig S , Zabolotnyh N V, Ferko В , Kittel С, Romanova J, Vinogradova TI, Hatinger H, Kiselev ОI, Egorov A Vaccine potential of influenza vectors expressing Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 protein // Tuberculosis (Edm) -2006 - V 86 -№(3-4) -P 236-46

2 Seremig S , Stukova M.A., Zabolotnyh N V , Ferko В , Kittel С , Romanova J, Vinogradova T I, Katinger H , Kiselev О I, Egorov A Influenza vector expressing ESAT-6 protein of Mycobacerium tuberculosis protects animals against tuberculosis //Clinical and vaccine immunology -2006 -V13 -№8 -P 898-904

3 Стукова M.A , Серайниг С , Заболотных H В , Виноградова Т И , Романова Ю Р , Катингер Г , Левашев Ю Н , Киселев О И , Егоров А Ю Перспективы использования гриппозных векторов, экспрессирующих протективный микобактериальный антиген ESAT-6, для профилактики туберкулеза // Медицинский академический журнал —2007 — Т7 — №4 — С 56-64

Тезисы докладов

1 Стукова М.А., Заболотных Н В , Виноградова Т И, Серайниг С , Катингер Г , Егоров А Иммуногенность и протективная активность гриппозных векторов, экспрессирующих ESAT-6 секреторный белок микобактерий, при генерализованном туберкулезе у мышей C57BL/6 // Медицинская иммунология -2004 -Т6 - №3-5 -С 252-253

2 Стукова М.А., Заболотных Н В , Виноградова Т И, Васильева С Н, Киселев О И, Егоров А Ю Эффективность живой рекомбинантной вакцины при генерализованном туберкулезе у мышей // 14-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания Сб резюме — Москва — 2004 — С 292

3 Seremig S , Stukova М., Ferko В , Kittel С, Romanova J , Kiselev О , Hatinger H , Egorov A Intranasal immunization with live attenuated influenza vectors expressing ESAT-6 antigen protects mice against tuberculosis // IVW-2004 Conference — 2004 - Lisbon-P 46

4 Seremig S , Stukova M., Ferko В , Kittel С , Katinger H, Kiselev ОI, Egorov A Intranasal immunization with live attenuated influenza vectors expressing ESAT-6 antigen protects mice against tuberculosis // Abstracts of «International Workschop on Tuberculosis Vaccines -2005 - Cuba -P 16

5 Заболотных H В , Стукова M.A, Виноградова T И , Киселев О И , Егоров А Ю, Витовская М Л Влияние рекомбинантного гриппозного вектора, экспрессирующего ESAT-6 антиген, на развитие генерализованного

туберкулеза у мышей // Актуальные вопросы диагностики и лечения туберкулеза Матер Всерос научн конф -Санкт-Петербург - 2005 -С 249251

6 Стукова М.А., Заболотных Н В , Виноградова Т И , Левашев Ю Н , Киселев О И , Егоров А Ю ESAT-6 белок - фактор вирулентности микобактерий и протективный антиген // Актуальные проблемы туберкулеза и болезней легких Матер Всерос научн конф - 2006 — Москва — С 66-67

7 Стукова М.А., Заболотных Н В , Виноградова Т И, Левашев Ю Н , Серайниг С , Катингер Г, Романова Ю Р , Киселев О И, Егоров А Ю Перспективы использования гриппозных векторов, экспрессирующих микобактериальный антиген ESAT-6, для профилактики туберкулеза // Молекулярная диагностика инфекционных болезней Матер научн -практ конф — 2007 - Минск - С 111

8 Stukova M.j Sereinig S, Zabolotnyh N, Ferko В, Kittel С, Romanova J , Vinogradova T , Katinger H , Kiselev О , Egorov A Influenza vectors expressing M tuberculosis ESAT-6 protein // Preparedness to Influenza Pandemic - an International Outlook Abstracts of International Conference - 2007 - St Petersburg -P 125

Благодарности. Данная работа является продолжением многолетних научных исследований в области разработки нового поколения противогриппозных вакцин и гриппозных векторов д б н Егорова Андрея Юрьевича, который является научным руководителем работы Автор выражает искреннюю благодарность за активное участие в проведении исследования сотрудникам ФГУ Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии Росмедтехнологий д м н Заболотных Наталье Вячеславовне и д м н , профессору Виноградовой Татьяне Ивановне, а также сотрудникам Института прикладной микробиологии (Вена, Австрия) Сабине Серайниг, Юлии Романовой, Борису Ферко, профессору Герману Катингеру Особая благодарность - директору ГУ НИИ гриппа РАМН академику РАМН Киселеву Олегу Ивановичу за всестороннюю поддержку работы