Получение рекомбинантных и синтетических антигенов Mycobacterium tuberculosis и перспективы их использования для серодиагностики туберкулеза

Дятлова, Варвара Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение рекомбинантных и синтетических антигенов Mycobacterium tuberculosis и перспективы их использования для серодиагностики туберкулеза
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантных и синтетических антигенов Mycobacterium tuberculosis и перспективы их использования для серодиагностики туберкулеза"

На правах рукописи

ДЯТЛОВА ВАРВАРА ИВАНОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 АПР 2015

005566418

Оболенск - 2015

005566418

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ)

Научный руководитель: Бикетов Сергей Федорович

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты: Литвинов Виталий Ильич

доктор медицинских наук, профессор, Академик РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, Государственное казённое учреждение здравоохранения «Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулёзом Департамента здравоохранения города Москвы», научный руководитель Тутельян Алексей Викторович

доктор медицинских наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лаборатория инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, заведующий лабораторией

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А. Н. Баха Российской академии наук (ФГБУН ИНБИ РАН)

Защита состоится «■/(/» 2015 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального бюджетного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, http://www.gabrich.ru

Автореферат разослан «ЛЦ » ^£^£3^.2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, доктор медицинских наук

Борисова Ольга Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Одной из приоритетных задач отечественного здравоохранения является улучшение эпидемиологической ситуации по туберкулезу. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), Российская Федерация входит в список 22 стран с высоким бременем туберкулеза, на которые приходится около 80% случаев данного заболевания в мире. Согласно ее оценке, до 20% новых случаев туберкулеза в России остаются недиагностированными (WHO/HTM/TB/2013.11). При этом каждый невыявленный больной активной формой туберкулеза ежегодно может заразить до 15 человек, а риск возникновения заболевания у тубинфицированных лиц составляет до 50% уже в течение первых двух лет после контакта с больным (Palomino J. С. et al., 2007). Своевременное применение эффективных методов диагностики туберкулеза может способствовать снижению темпов распространения данного заболевания (Хоменко А. Г., 1998).

Традиционные методы диагностики туберкулеза обладают рядом недостатков: длительность культурального цикла Mycobacterium tuberculosis, недостаточная чувствительность анализа мазков, неспецифичность радиологического анализа и туберкулиновых проб, трудности диагностики внелегочного туберкулеза и другие (Palomino J. С. et al., 2007). Методы диагностики туберкулеза, основанные на детекции реакций иммунитета, могут стать привлекательной альтернативой традиционным методам, так как позволяют в ранние сроки выявлять заболевание вне зависимости от локализации очага и распространенности инфекции (Abebe F. et al., 2009; Gennaro M. L., 2000).

Одним из перспективных методов иммунодиагностики туберкулеза является серодиагностика. Она в отличие, например, от туберкулинодиагностики обладает способностью дифференцировать активный туберкулез от латентной инфекции или предшествующей вакцинации бациллой Кальметта-Герена (БЦЖ). К ее преимуществам можно также отнести простоту, воспроизводимость, малую инвазивность, скорость исполнения анализов. Серодиагностические тест-системы, выполненные в формате иммунохроматографических тестов, за счет невысокой цены и возможности их применения без специализированных лабораторий и медицинского персонала, могут быть особенно востребованы для скрининга населения на туберкулез в странах с низким уровнем жизни (Abebe F. et al., 2009).

При разработке новых серодиагностических тест-систем по выявлению туберкулеза необходим аргументированный выбор антигенных препаратов. Эффективность данных тестов также в значительной степени определяется качеством антигенов, входящих в их состав, что обусловлено, прежде всего, способом их получения. Например, применение дрожжевой системы экспрессии Pichia pastoris, в отличие от традиционно используемой бактериальной системы Escherichia coli, позволяет получать рекомбинантные белки М tuberculosis в гликозилированной форме, что сближает их по структуре с нативными антигенами и обеспечивает эффективное взаимодействие данных антигенов со

специфическими антителами в иммунологических анализах (Cereghino G. P. L. et al., 1999; Ireton G. С. et al., 2010; Liu C. F. et al., 2013).

Важной задачей при конструировании новых антигенов для серотестов является оптимизация композиции эпитопов для компенсации индивидуальной и региональной гетерогенности гуморального ответа больных туберкулезом (Zhang S. L. et al., 2009). Перспективными подходами для объединения нужных эпитопов из различных антигенов являются получение химерных белков, кодируемых слитными генами, а также химическая конъюгация белков с углеводными молекулами, например, с гексаарабинофуранозидом (Ага/б) - основным эпитопом липоарабиноманнана (ЛАМ) (Gennaro М. L., 2000; Hamasur В. et al., 2003; Houghton R. L. et al., 2002; Lyashchenko K. et al., 1998).

Таким образом, наиболее актуальной задачей развития серодиагностики туберкулеза является создание новых антигенов, которые смогут обеспечить чувствительность и специфичность серотестов, требуемые для их применения в качестве первичного дополнительного метода обследования на туберкулез.

Степень разработанности темы исследования

Впервые серодиагностика туберкулеза была применена в конце 19 века С. Арлоингом, но показала низкую эффективность (Arloing S., 1898). Интерес к разработке серологических тестов на туберкулез возобновился после внедрения в научную практику иммуноферментного анализа (ИФА) (Engvall Е. et al.,1971; Nassau Е. et al., 1976). Однако использование в ИФА грубых антигенных препаратов из культуры М. tuberculosis приводило к возникновению перекрестных реакций с сыворотками здоровых людей и, следовательно, низкой специфичности анализов (Laal S. et al., 1997). Современные серотесты включают преимущественно хорошо очищенные нативные или рекомбинантные белковые, а также гликолипидные антигены М. tuberculosis (Banerjee S., 2003; Tiwari R. P., 2005). В настоящее время на рынке представлено более 70 серодиагностических тестов на туберкулез, но в связи с недостаточными показателями их чувствительности и специфичности ни один из тестов не рекомендован ВОЗ для применения без учета результатов традиционных методов диагностики туберкулеза (Anderson В. L., 2008; Steingart К. R., 2012; WHO/HTM/TB/2011.5).

Цель исследования - получение рекомбинантных и синтетических антигенов Mycobacterium tuberculosis и оценка их потенциала для применения в серодиагностике туберкулеза.

Задачи исследования

1. Сформулировать критерии выбора антигенов Mycobacterium tuberculosis, пригодных для серодиагностики туберкулеза.

2. Применить системы экспрессии Escherichia coli, Pichia pastoris, а также методы химического синтеза и конъюгации для получения антигенов Mycobacterium tuberculosis.

3. Сформировать панели сывороток здоровых доноров и пациентов с диагнозом туберкулез из одного региона Российской Федерации.

4. Провести сравнительный анализ чувствительности и специфичности взаимодействия полученных антигенов Mycobacterium tuberculosis с сыворотками

здоровых доноров и туберкулезных больных с помощью иммуноферментного анализа.

5. Установить перспективные комбинации рекомбинантных и синтетических антигенов Mycobacterium tuberculosis для серодиагностики туберкулеза с учетом данных об индивидуальной вариабельности антительного ответа при туберкулезной инфекции.

Научная новизна

Впервые показана возможность получения ряда антигенов Mycobacterium tuberculosis, а именно Rv0040c, Rvl837c, Rvl860, Rv2873, Rvl636 - Rv2185c и Rv2875, в экспрессионной системе Pichia pastoris с целью дальнейшего использования их в качестве основного компонента серодиагностического теста на туберкулез.

Установлено, что серодиагностический потенциал белков, экспрессированных в дрожжевой системе Pichia pastoris, выше, чем у аналогичных белков, экспрессированных в системе Escherichia coli, что свидетельствует о том, что применение системы Pichia pastoris для получения антигенов Mycobacterium tuberculosis может повысить эффективность серодиагностики туберкулеза.

Получены новые данные о конъюгатах рекомбинантных белков с углеводными молекулами, а именно показано, что химическое конъюгирование ряда белков Mycobacterium tuberculosis, экспрессированных в системе Escherichia coli, с синтетическим гексаарабинофуранозидом липоарабиноманнана приводит к повышению чувствительности ИФА с сыворотками больных туберкулезом.

Результаты тестирования 24 антигенов Mycobacterium tuberculosis с сыворотками, полученными из Саратовской области, позволили выявить наиболее перспективные антигены для применения в серодиагностике туберкулеза на территории данного региона.

Определены перспективные комбинации рекомбинантных и синтетических антигенов Mycobacterium tuberculosis для эффективного выявления туберкулеза с помощью серодиагностики в конкретном регионе (Саратовской области).

Теоретическая и практическая значимость работы

Разработана научно обоснованная концепция получения рекомбинантных антигенов Mycobacterium tuberculosis, пригодных для использования в серодиагностике туберкулеза.

Определена значимость различных способов гликозилирования (микробиологического и химического) белковых антигенов Mycobacterium tuberculosis для их иммунореактивности в серологических тестах, что расширяет представления о роли углеводных молекул в иммунном ответе при туберкулезе.

Показана возможность использования дрожжевой системы экспрессии Pichia pastoris для получения рекомбинантных белков Mycobacterium tuberculosis, пригодных для серодиагностики туберкулеза. Установлено, что антигены, экспрессированные в Pichia pastoris, имеют более высокую иммунореактивность с сыворотками больных туберкулезом, чем антигены, экспрессированные в системе Escherichia coli.

Применяемые в работе лабораторные методы для получения ряда антигенов Mycobacterium tuberculosis в дрожжевой системе экспрессии Pichia pastoris могут быть легко масштабированы, что создает основу для массового производства недорогих и эффективных туберкулезных серотестов.

Установлено, что химическое конъюгирование рекомбинантных белков Mycobacterium tuberculosis с синтетическим гексаарабинофуранозидом липоарабиноманнана является перспективным методом повышения эффективности серодиагностики туберкулеза.

Полученные данные о серодиагностическом потенциале различных рекомбинантных и синтетических антигенов Mycobacterium tuberculosis могут учитываться при разработке новых серотестов на туберкулез.

Подобрана мультиантигенная композиция из рекомбинантных и синтетических антигенов Mycobacterium tuberculosis, обладающая высокой прогностической эффективностью, для выявления больных туберкулезом в Саратовской области.

Результаты работы были использованы при разработке иммунохроматографических тестов для серодиагностики микобактериозов, в частности, туберкулеза и лепры (акт внедрения от 1.12.2014 г.).

Методология и методы исследования

Методологию исследования определили соответственно поставленной цели. Предметом исследования явились проблемы, связанные с получением антигенов М. tuberculosis разными способами и оценкой их потенциала для использования в серодиагностике туберкулеза.

Объекты исследования. Основными объектами исследования явились сыворотки крови 100 больных туберкулезом легких, полученные из Государственного учреждения здравоохранения «Областной клинический противотуберкулезный диспансер» г. Саратова, с подтвержденным диагнозом, и 30 здоровых БЦЖ-вакцинированных доноров Саратовской области из Медицинского учреждения здравоохранения «1-ая городская клиническая больница им. Ю. Я. Гордеева» г. Саратова. Кроме того, в работе использовали: хромосому М. tuberculosis штамма H37Rv; плазмиды рЕТ32Ь(+), рР1С9 (Invitrogen, США), pPMClfopL-ag85B-esat-6 (ФБУН ГНЦ ПМБ); штаммы Е. coli BL21 -CodonPlus(DE3)-RP (Novagen, Inc., США), E. coli TOPIO'F, E. coli DH5a, P. pastoris KM71 и GS115 (Invitrogen, США), белки eRv0040c, eRv2376c, eRv3874, eRv3881c (ФБУН ГНЦ ПМБ).

Методы исследования. В работе применяли методы молекулярной биологии (полимеразная цепная реакция (ПЦР), электрофорез, клонирование, методы трансформации, выделения ДНК), микробиологии (культивирование Е. coli, Р. pastoris), биохимии (электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ), аффинная хроматография, определение концентрации белка, высаливание, диализ,), иммунохимии (иммуноблот, ИФА), химии (химический синтез, конъюгация), статистики (анализ кривых операционной характеристики (ROC), параметрические и непараметрические методы статистического анализа).

ПЦР. Гены rv0040c, rv0222, rvl860, rv!636, rvl837c, rv2185c, rv2873, rv2875, rv3425, rv3872, rv3875 амплифицировали с хромосомы M. tuberculosis штамма H37Rv, а последовательность rvl886c-rv3875 - с плазмиды pPMClfopL-ag85B-esat-6 (ФБУН ГНЦ ПМБ) методом ПЦР со специфическими праймерами (Синтол, Москва). Реакционная смесь для ПЦР (25 мкл) включала 10 мМ Трис-НС1 (рН=8,3), 1,5 мМ MgC12, 50 мМ KCL, 0,2 мМ дНТФ, 400 нМ олигонуклеотидов, 5% ДМСО, 1 ед. Taq ДНК - полимеразы (Fermentas, Литва). Хромосомную ДНК М. tuberculosis штамма H37Rv добавляли из расчета 10 нг на 25 мкл реакционной смеси. Параметры ПЦР реакций: начальная денатурация 95°С-Змин, 30 циклов: денатурация 95°С - 30с, отжиг 50 - 64°С - 30с, элонгация 72°С - от 30с до Змин , завершающая элонгация 72°С - Юмин. Анализ соответствия длин полученных фрагментов размерам амплифицируемых генов проводили посредством электрофореза в 1% агарозном геле. Для выделения и очистки ДНК использовали коммерческие наборы AxyPrep DNA kit (Axygen bioscience, США).

Молекулярное клонирование и трансформация клеток. Ампликоны генов rv0222, rvl860, rvl837c, rv2875, rv3425, rv3872, rv3875 и последовательности rvl886c-rv3875 клонировали в плазмиду pET32b(+) в открытую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью шести гистидинов по сайтам рестрикции Ndel/Xhol или Ndel/Hindlll. Рекомбинантными плазмидами, которые нарабатывали в штамме Е. coli TOPIO'F, трансформировали химически компетентные клетки E.coli штамма BL21-CodonPlus(DE3)-RP методом «теплового шока» нагреванием до 42°С в течение 45с и последующим охлаждением до 4°С.

Ампликоны генов rv!636, rv!837c, rv2185c, rv2873, rv0040c, rvl860, rv2875, содержащие нуклеотидные последовательности 6 гистидинов (внесенные при амплификации с помощью праймеров с 5'- конца), клонировали в плазмиду рР1С9 по сайтам рестрикции EcoRI/Notl. Ген rv2185c вносили в плазмиду pPIC9Rvl636 после гена rvl636 между сайтами рестрикции Avrll и Notl. Рекомбинантные плазмиды наращивали в штамме Е. coli DH5a. Клетки штаммов P. pastoris GS115 (для плазмид pPIC9Rvl636-Rv2185c и pPIC9Rvl837c) и КМ71 (для остальных плазмид) трансформировали линеаризованными (ферментом SacI или Sail) рекомбинантными плазмидами методом электропорации на приборе MicroPulser (Bio-Rad, США).

Экспрессия антигенов М. tuberculosis в системе Е. coli и их очистка.

Экспрессию белка проводили в штамме BL21-CodonPlus(DE3)-RP под индукцией 1мМ ИПТГ и селективным давлением антибиотиков (ампициллин - 100 мкг/мл, хлорамфеникол — 34 мкг/мл). Культуру клеток собирали после 4 часов индукции при 37°С, центрифугировали 2800g в течение 15 мин, осадок ресуспендировали в буфере нанесения (50 мМ Трис-HCl, рН=8,0, 500 мМ NaCl, 8 М мочевина, 10 мМ имидазол), и озвучивали на дезинтеграторе. Супернатант дезинтеграта клеток после его центрифугирования при 37000g в течение 15мин наносили на колонку с иминодиуксусной сефарозой (Iminodiacetic acid Sepharose, Sigma-Aldridge, Германия), предварительно насыщенной ионами никеля и уравновешенной буфером нанесения. Элюировали белки с колонки элюирующим буфером (50 мМ

Трис-HCl, 500 мМ NaCl, 8 М мочевина, 300 мМ имидазол, рН=8,0). Фракции анализировали методом электрофореза в 10-12% ПААГ и иммуноблотом.

Экспрессия антигенов М. tuberculosis в системе P. pastoris и их очистка. После электропорации селекцию трансформантов проводили на чашках с MD-агаром (1,34% YNB, 0,04% биотин, 2% глюкоза, 1,5% агар) - по росту без гистидина, затем на чашках с ММ-агаром (1,34% YNB, 0,04% биотин, 1% метанол, 1,5% агар) - по росту на минимальной среде с метанолом. Отобранные клоны растили 48 ч при 30°С и 250 об/мин в среде BMGY (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 100 мМ калий-фосфатный буфер, рН=6,0, 1,34% YNB, 0,04% биотин, 1% глицерин), затем клетки переносили в среду BMMY (состав аналогичен BMGY, но глицерин заменен на 1% метанол) до OD60o=l- В качестве ингибитора протеаз вносили в среду казаминовые кислоты (Becton Dickinson, США) до 1%. Культуру инкубировали в течение 100 ч при 30°С и 250 об/мин, поддерживая содержание метанола в среде 1%. На пятые сутки индукции клетки осаждали центрифугированием при 3000g в течение 15мин. Выделяли белки из супернатанта высаливанием, добавляя сульфат аммония до насыщения раствора 70%, полученный раствор центрифугировали при 33000g в течение 30 мин, осадок растворяли в буфере нанесения (50 мМ Трис-НС1, 500 мМ КС1, 10 мМ имидазол, рН=8,0) и наносили на колонку с иминодиуксусной сефарозой, предварительно насыщенной ионами никеля и уравновешенной буфером нанесения. Элюировали белки элюирующим буфером (50 мМ Трис-HCl, 500 мМ КС1, 300 мМ имидазол, рН=8,0). Полученные фракции анализировали методом электрофореза в 10% ПААГ, а также иммуноблотом.

Конъюгирование рекомбинантных белков М. tuberculosis с Ara/б ЛАМ. На рисунке 1 представлено схематическое изображение строения конъюгата рекомбинантного белка М. tuberculosis с Ага/5 ЛАМ.

он H0\!bi

Н0 НО о ОН OCHjCH2NHCOCH2(OCH2CH2)6NH N-(S"ok)

он

Рисунок 1 — Строение гликоконъюгата белка с гексаарабинофуранозидом ЛАМ. Примечания: 1 - гексаарабинофуранозид, 2 - агликон-спейсер, 3 -квадратная кислота.

Белки eRv0222, eRv2376c, eRv2875, eRv3875, eRv3881c, eRvl886c-Rv3875, полученные в системе E. coli, ковалентно конъюгировали с синтетическим Ага/5

ЛАМ методом химической конъюгации в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте органической химии им. Н. Д. Зелинского Российской академии наук (ФГБУН ИОХ РАН). Гексасахарид Ага/5 в структуре гликоконъюгата пространственно удален от молекулы белка посредством агликона-спейсера для целей эффективного связывания данного эпитопа со специфическими антителами.

Иммуноферментный анализ. Белки иммобилизовали в планшетах средней сорбции (Greiner bio-one, Германия) в концентрации 0,1-1,0 мкг/лунку в 50 мМ карбонатном буфере (35 мМ NaHC03j 15 мМ Na2C03, рН=9,6) при 4°С в течение 16 ч. После однократного отмывания лунок отмывочным буфером (50 мМ фосфатный буфер (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ Na2HP04, 1,4 мМ КН2Р04, рН=7,4), 0,025% твин-20) в них вносили 5% обезжиренное молоко (Sigma-Aldridge, Германия) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Отмывали планшеты 2 раза, затем в них вносили образцы сывороток, разведенные 1:100 в 50 мМ фосфатном буфере, и инкубировали в течение 1 ч при 37°С, отмывали планшеты 4 раза. В каждую лунку вносили пероксидазный конъюгат антител против IgG человека (Sigma-Aldridge, Германия) в разведении 1:10000, инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Отмывали планшеты 5 раз. Детекцию проводили с помощью субстрата, содержащего тетраметилбензидин (ФГУП ГНЦ «НИОПИК»), регистрируя оптическую плотность при 450 нм после остановки реакции IM H2SO4.

Статистический анализ данных. Статистический анализ данных проводили с помощью стандартных методов с применением специализированных компьютерных программ: MedCalc (MedCalc Software, Бельгия) и Microsoft Office Exel (Microsoft, США). Статистическая достоверность анализа (значимость различий между средними значениями OD450 для групп здоровых и больных пациентов) принимали при р<0,05. Вычисление показателей чувствительности, специфичности и диагностической достоверности анализов (ДЦ) - процентного отношения истинных результатов в анализе к общему объему выборки -осуществляли тремя методами: посредством расчета трех видов «отсекающих значений» (cutoff): критериев, применяемых в эндемичных (cutoff] = среднее OD45o3a<,poBbix+2SD) и неэндемичных (cutoff2 = среднее OD4503flOp0BbIX+3SD) регионах по туберкулезу, а также с помощью «оптимального критерия» (К), определяемого в ROC анализе. ROC анализ позволил визуально, благодаря построению кривых, а также количественно, с помощью показателя «площадь под кривой ROC» (ППК), сравнить эффективность выявления туберкулеза с помощью ИФА с разными рекомбинантными белками М. tuberculosis.

Личное участие автора в получении результатов

Соискатель составила план исследования, выполнила аналитический обзор литературы, получила 14 рекомбинантных белков М. tuberculosis в экспрессионных системах Е. coli и P. pastoris, сформировала панели сывороток больных туберкулезом и здоровых доноров, провела ИФА и статистическую обработку экспериментальных данных. Конъюгаты рекомбинантных белков М. tuberculosis с синтетическим гексаарабинофуранозидом ЛАМ получила

совместно с Л. О. Кононовым, Н. М. Подвальным, П. И. Аброниной и Т. М. Мельниковой (ФБГУН ИОХ РАН). Секвенирование фрагментов рекомбинантных плазмид, а также хромосом рекомбинантных штаммов P. pastoris, несущих целевые гены, проводила совместно с А. Г. Богуном (ФБУН ГНЦ ПМБ).

Положения, выносимые на защиту:

1. Использование бактериальной (Escherichia coli) и дрожжевой (Pichia pastoris) систем экспрессии, а также химическое конъюгирование рекомбинантных белков с гексаарабинофуранозидом липоарабиноманнана позволяет получить антигены Mycobacterium tuberculosis, взаимодействующие с сыворотками больных туберкулезом.

2. Рекомбинантные антигены Mycobacterium tuberculosis, полученные в экспрессионной системе Pichia pastoris, обладают большей чувствительностью в ИФА с сыворотками больных туберкулезом, по сравнению с аналогичными антигенами, полученными в экспрессионной системе Escherichia coli.

3. Химическое конъюгирование ряда рекомбинантных белковых антигенов Mycobacterium tuberculosis, полученных в экспрессионной системе Escherichia coli, с синтетическим гексаарабинофуранозидом липоарабиноманнана приводит к повышению чувствительности ИФА с сыворотками больных туберкулезом.

Степень достоверности результатов и апробация работы

Достоверность результатов исследования обусловлена использованием в ней большого объема фактического материала, полученного с использованием методов молекулярной биологии, микробиологии, иммунологии и органической химии на современном сертифицированном оборудовании. Экспериментальные данные были статистически обработаны с помощью специализированных компьютерных программ и представлены в виде графиков и таблиц.

Диссертация апробирована на заседании межлабораторного семинара ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол № 38 от 14 ноября 2014 г.).

Результаты работы доложены и обсуждены на Научно-практической школе-конференции молодых учёных и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации «Биологическая безопасность в современном мире» 21-22 апреля

2009 г., Оболенск) и на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (24-26 ноября

2010 г., Москва).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 3 статьи опубликованы в рецензируемых научных изданиях и 2 тезиса - в материалах конференций.

Объем и структура диссертации. Основной текст диссертации изложен на 209 страницах машинописного текста и состоит из введения, основной части, включающей обзор литературы и собственные исследования, заключения и 5 приложений. Список литературы содержит 351 источник, в том числе 29 -отечественных и 322 - зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 14 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Получение рекомбинантных и синтетических антигенов М. tuberculosis

В данной работе получили 8 рекомбинантных белков М. tuberculosis в экспрессионной системе Е. coli (eRv0222, eRvl837c, eRvl860, eRv2875, eRv3425, eRv3872, eRv3875, eRvl886c-Rv3875) и 6 белков - в дрожжевой системе Р. pastoris (pRv0040c, pRvl837c, pRvl860, pRv2873, pRv2875, pRvl636-Rv2185c). На рисунке 2 представлена электрофореграмма белков М. tuberculosis, использованных в работе.

mi i ¡ i < ! « ш

10 11 12 и 1-»

17 1.4 19

íl М2

Рисунок 2 - Электрофореграмма рекомбинантных белков М. tuberculosis, экспрессированных в Е. coli и Р. pastoris (10% ПААГ). Примечания: 1 - eRv!837c, 2 - eRvl886c-Rv3875, 3 - eRv3875, 4 - eRv3872, 5 - eRv3425, 6 - eRv0222, 7 - eRv3881c, 8 - eRv3874, 9 - eRv2376c, 10 - eRv0040c, 11 - eRv0934, 12 - eRvl980, 13 - pRvl636-Rv2185c, 14 - PRv2873, 15 - pRv2875, 16 - eRv2875, 17 - pRvl860, 18 - eRvl860, 19 - pRvl837c, 20 - eRvl837c, 21-pRv0040c. Спектры молекулярных масс маркеров: Ml (SM1811 (Fermentas, Литва)) - 11, 17, 28, 36, 55, 72, 95, 130, 250 кДа, и М2 (SM0661 (Fermentas, Литва)) -10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 85, 100, 120, 150, 200 кДа.

Белки в системе Е. coli экспрессировались в тельцах включения, а в Р. pastoris — секретировались в среду. Молекулярные массы белков, определяемые в электрофорезе в 10% ПААГ, для белков, экспрессированных в Е. coli, в большинстве случаев соответствовали значениям, рассчитанным, исходя из их аминокислотного состава. Для белков, экспрессированных в Р. pastoris, они превышали расчетные значения на 2-8 кДа, что совпадало с массой маннозных остатков (8-14 на один сайт), которые могли быть связаны сайтами N-гликозилирования в соответствующих белках. Белки eRv3875 и pRv2873 формировали как мономерные, так и димерные структуры. При анализе белков eRv2875, eRvl860, eRv0040c методами электрофореза и иммуноблота обнаруживали по две полосы на каждый белок, различающихся по молекулярной массе на 4-6 кДа, что соответствовало размерам их сигнальных пептидов. Вероятно, нарушения процессинга микобактериальных белков в Е. coli привели к образованию двух форм белка - с сигнальным пептидом и без него. Антитела к сигнальным пептидам белков, как правило, не образуются, поэтому их сохранение

не должно было повлиять на результаты ИФА. Для eRvl860 (45/55 кДа) и pRvl860 (55 кДа) наблюдали замедление миграции в ПААГ, по сравнению с расчетными значениями, вероятно, обусловленное присутствием в структуре полипептидной цепи ригидных терминальных участков, богатых пролином (Lara М. et al, 2004). Концентрации белков, полученные в Е. coli, составили 0,05-1 г/л, а в P. pastoris - 0,05-0,8 г/л. В ФГБУН ИОХ РАН были получены конъюгаты белков с синтетическим Ara/б ЛАМ (eRv0222Ar, eRv2376cAr, eRv2875Ar, eRv3875Ar, eRv3881cAr, eRvl886c-Rv3875Ar) в концентрациях 0,15 - 0,6 г/л. Их молекулярные массы превышали значения для соответствующих неконъюгированных форм на 1-2 кДа.

Сравнение серодиагностического потенциала различных рекомбинантных антигенов М. tuberculosis

Диагностический потенциал 24 рекомбинантных и синтетических антигенов М. tuberculosis оценивали методом непрямого ИФА с сыворотками больных туберкулезом и здоровых жителей Саратовской области. На рисунке 3 (А, Б) представлены диаграммы распределения данных, полученных в ИФА с антигенами М. tuberculosis. Согласно результатам статистического анализа, все использованные в исследовании антигены М. tuberculosis позволяли достоверно выявлять туберкулез в ИФА (различия между средними значениями OD450 для групп здоровых и больных были статистически значимы (р<0,05)). Результаты статистической обработки данных представлены в таблице 1. Чувствительность анализов со всеми исследованными антигенами варьировала от 19 до 60% (расчет по cutoff]) или от 5% до 46% (cutoff2). Специфичность анализов при расчете по cutoff2 во всех случаях составляла 100%, а по cutoffi - была в пределах 86,7-100%. Значения диагностической достоверности варьировали от 37,7% до 69,2% (cutoffi) или от 26,9% до 58,5% (cutoff2).

Наименьшие значения показателей чувствительности и диагностической достоверности при обоих вариантах расчета получили для pRv2873, наибольшие -для pRv2875. Интересно, что в последние десятилетия серодиагностический потенциал белков Rv2873 и Rv2875 изучали, главным образом, в отношении бычьего туберкулеза, что было связано с данными о низкой экспрессии указанных белков М. tuberculosis (показано in vitro), и вследствие этого предполагаемым слабо выраженным гуморальным ответом на них при туберкулезе (Colangeli R. et al., 1999). Однако результаты нашей работы, а также других авторов ставят под сомнение эти предположения (Ireton G. С. et al., 2010; Zhang L. et al., 2011). Кроме того, в недавних исследованиях было выявлено, что, несмотря на низкий базальный уровень активации генов rv2873 и rv2875, для М. tuberculosis характерно индуцирование их экспрессии при инфицировании им макрофага (Veyrier F. et al., 2008). Выраженные различия в чувствительности анализов с белками, имеющими высокую степень гомологии, можно объяснить как разной доступностью антигенов для клеток иммунной системы (Rv2875 — секретируемый, a Rv2873 - поверхностный белки), динамикой антител, а также нарушением процессов связывания специфических антител с эпитопами pRv2873 из-за структурных отличий рекомбинантного белка от нативного антигена.

о Контрольная группа ♦ Больные туберкулезом лепшх

2500

2000 -

1500 -

1000 -

Рисунок 3 (А, Б) - Точечные диаграммы результатов ИФА с антигенами М. tuberculosis. Примечания: красной чертой обозначены значения cutoffi, синей -выборочные средние для групп больных и здоровых.

По данным ROC анализа, чувствительность ИФА варьировала от 31% (pRv2873) до 69% (eRvl886c - Rv3875Ar), специфичность от 70% (eRv0040c) до 100% (eRv2875Ar). Диагностическая достоверность анализов, определенная по данным анализа, была от 46,9% (pRv2873) до 73,8% (pRv2875). Наиболее высокое значение ППК было для ROC-кривой, построенной на основании данных анализа, с белком pRvl860 (0,855), низкое - с pRv2873 (0,635), что свидетельствует о том, что наибольшей диагностической точностью среди всех анализов обладал тест с белком pRvl860.

Таблица 1 - Результаты статистического анализа данных ИФА

Аншгены Среднее OD45o±SD Расчетпо cutoff, (%) Расчет по cutoff2(%) ROC анализ (%)

здоровые больные Ч С дд Ч С дд Ч С ДЦ ППК

eRv0040c 0,451±0,137 0,595+029 27 86,7 40,7 19 100 37,6 58 70 60,7 0,657

pRv0040c 0,952+0,177 1272+0283 47 96,7 58,5 26 100 43 65 90 70,7 0,823

eRvQ222 0304+0,079 0,486Щ235 47 933 57,7 28 100 44,6 52 90 60,7 0,779

eRv0222Ar 0,56+Д125 0,894+0349 52 96,7 62,3 42 100 55,4 59 933 66,9 0,813

eRvl837c 0366+0,093 0,554+026 42 90 53 20 100 38,4 43 90 Я6 0,802

pRvl837c 0,744+0221 1,122+0332 45 96,7 56,9 23 100 40,7 54 90 623 0,841

eRvl860 0399*0,098 0,75+0,476 47 933 57,7 38 100 523 54 933 63 0,763

pRvl860 0,613+0,196 1,084+0,42 55 933 63,8 42 100 55,4 68 86,7 723 0,855

eRv2376c 0,54±0,13 0,673+0235 31 90 44,6 16 100 35,4 39 90 50,8 0,673

eRv2376cAr 0,627±0,153 0,9+0317 41 933 53 21 100 392 49 933 592 0,782

pRv2873 0,986+0217 1,129+0317 19 100 37,7 5 100 26,9 31 96,7 46,9 0,635

eRv2875 0,376+0,105 0,64+0372 43 100 562 24 100 41,5 48 96,7 592 0,768

eRv2875Ar 0,496t0,104 0,871+0,499 52 100 63 43 100 56^1 52 100 63 0,745

pRv2875 0,543±0,14 0,96±0369 60 100 692 46 100 58,5 68 933 73,8 0,832

eRv3425 0335+0,082 0,503+0^25 43 90 53,9 28 100 44,6 59 76,7 623 0,781

eRv3872 0Д 18+0,053 036&ШД37 37 933 50 31 100 46,9 40 933 53 0,785

eRv3874 0,493±0,116 0,852+0,435 53 933 623 41 100 54,6 68 86,7 723 0,807

eRv3875 0,18&±0,056 0,335+0232 36 96,7 50 25 100 423 47 90 57 0,782

eRv3875Ar 0,403+0,097 0,817+0,505 52 96,7 623 39 100 53 56 96,7 65,4 0,817

eRv3881c 0,29+0,069 0399+0,165 39 933 51,5 23 100 40,7 39 96,7 523 0,728

eRv3881cAr 0,429+0,1 0,654+0224 50 90 592 34 100 492 50 96,7 60,7 0,84

pRvl636— Rv2185c 0,808+0205 1,174+0374 44 933 55,4 23 100 40,7 56 90 63,8 0,807

eRv1886c-Rv3875 0279+0,089 0,45+0248 48 90 57,7 26 100 43 58 833 63,8 0,721

eRvl886o Rv3875Ar 1 0,42±0,111 0,702+0287 59 90 661 42 100 55,4 69 80 71,5 0,836

С помощью ИФА нами был оценен серодиагностический потенциал 12 антигенов М. tuberculosis, полученных в экспрессионной системе Е. coli. Среди них было 3 антигена (eRv3872, eRv3874, eRv3875), относящихся к группе «RDI белков», гены которых располагаются в участке RDI хромосомы М. tuberculosis, удаленном во всех субштаммах М. bovis BCG во время аттенуации. Преимуществом использования «RDI белков» в серодиагностике туберкулеза является сниженная вероятность возникновения ложноположительных реакций, обусловленных перекрестным реагированием на антигены М. bovis BCG, у здоровых БЦЖ - вакцинированных людей (Brusasca Р. N. et al., 2001). Тем не менее, в проведенном исследовании специфичность анализов с «RDI белками» варьировала по разным расчетам от 86,7 до 100%.

Сравнение серодиагностического потенциала eRv3875 и слитого белка eRvl886c-Rv3875, а также eRv3875Ar и eRvl886c-Rv3875Ar выявило незначительный прирост диагностической достоверности для анализов с химерными молекулами, по сравнению с единичными белками. Это было обусловлено как снижением специфичности анализа за счет перекрестно-реагирующих эпитопов Rvl886c, так и, вероятно, присутствием в большинстве сывороток, реагирующих с eRv3875, также и aHTH-Rvl886c антител.

Сравнение серодиагностического потенциала белков М. tuberculosis, полученных в системе Е. coli, и их химических конъюгатов с Ara/б ЛАМ

Парное сравнение серодиагностического потенциала 6 рекомбинантных белков М. tuberculosis (eRv0222, eRv2376c, eRv2875, eRv3875, eRv3881c, eRvl886c-Rv3875), полученных в системе E. coli, и их конъюгатов с синтетическим Ara/б ЛАМ выявило возрастание значений чувствительности (на 5-16% (cutoff]) или 5-19% (cutoff2)) и диагностической достоверности (на 4,611,5% (cutoff]) или 3,8-14,6% (cutoff2)) анализов с конъюгатами, по сравнению с неконъюгированными белками. Наибольший прирост значений данных показателей наблюдали для анализов с белками eRv3875Ar (cutoff]) и eRv2875Ar (cutoff2). Специфичность анализов с конъюгатами оставалась в пределах ± 3,3%, по сравнению с показателями для неконъюгированных белков.

При проведении ROC анализа также отмечали увеличение чувствительности (на 4-11%) и диагностической достоверности (на 3,8-8,4%) анализов для конъюгированных белков. Возрастание ППК наблюдалось в большинстве случаев (на 0,034-0,115) (рисунок 4 (А, Б, В)). Сравнение результатов анализов с eRvl886c-Rv3875 и eRvl886c-Rv3875Ar показало, что химическое конъюгирование гибридных белков с эпитопом ЛАМ также приводит к повышению эффективности выявления туберкулеза, как и в случае с единичными белками.

Сравнение серодиагностического потенциала белков М. tuberculosis, полученных в разных экспрессионных системах

При парном сравнении результатов статистической обработки данных ИФА с аналогичными антигенами М. tuberculosis (Rv0040c, Rvl837c, Rvl860, Rv2875), полученными в двух экспрессионных системах, выявили повышение чувствительности анализов (на 3-20% (cutoff,) или 3-22% (cutoff2)) и диагностической достоверности (на 4-17,8% (cutoff]) или 2,3-17% (cutoff2)) без снижения специфичности для всех белков, полученных в P. pastoris, по сравнению с белками, полученными в Е. coli.

ROC анализ также показал возрастание значений чувствительности (на 414%) и диагностической достоверности (на 7,7-14,6%) для рекомбинантных белков, экспрессированных в P. pastoris, по сравнению с белками, экспрессированными в Е. coli. Значение ППК для ROC-кривых в случае белков, полученных в Р. pastoris, было выше (на 0,039-0,166), чем для аналогичных белков, полученных в Е. coli (рисунок 5 (А, Б)).

О 20 40 60 80 100 1 ОО-Спецнфичность, %

20 40 60 80 100 1 ОО-Спецнфичность, %

20 40 60 80 100 1 ОО-Спецнфичность, % 100

-eRv2875(0,76S)

-eRv2875Ar(0,745)

-eRv3875(0,782)

-eRv3875Ar(0,817)

-eRv 18S6c-Rv3875(0,721 )

—-eRvlSSóc Rv3875Ar(0,836)

eRvl837c(0,802) eRv 1860(0,763) 781) eRv3 872(0,785)

-eRv0222(0.779) -çRv0222Ar(0.813) eRv2376c(0,673) -•eRv2376cAr(0,782) ~eRv3881c(0.728) -eRv3881cAl(0.84)

Рисунок 4 (А, Б, В) — ROC - кривые анализов с белками М. tuberculosis, полученными в экспрессионной системе E.coli, и их конъюгатами с Ага/5 ЛАМ. Примечание: в скобках указаны значения ППК.

eRv0<H0c (0.657) pRvOMOc (0.823) eRv 1860 (0.763) pRvl860 (0.855) pRv!636-Rv2185c (0.807)

20 40 60 8 1 ОО-СпсцпфпчнОС тъ. %

cRvl837c(0.802)

pRv]837c(0.S41)

pRv2873(0,635)

cRv2875(0,768)

Rv2875Al<0,745)

pRv2875(0.834)

20 40 60 80 1 ОО-Опецнфнчность. %

Рисунок 5 (А, Б) - ROC - кривые анализов с белками М. tuberculosis, полученными в экспрессионных системах Е. coli и P. pastoris. Примечание: в скобках указаны значения ППК.

Наиболее заметное возрастание чувствительности (на 20% (cutoff])) и значения ППК (на 0,166) выявили для анализа с белком pRv0040c (по сравнению с eRv0040c), что может быть обусловлено формированием при фолдинге белка в P. pastoris нативных конформационных эпитопов, связывающих дополнительные антимикобактериальные антитела. Возрастание чувствительности ИФА с eRv2875 после его конъюгирования с Ara/б было менее значительным, чем после «смены» системы экспрессии на P. pastoris. На основании результатов сопоставления наборов сывороток, которые реагировали в ИФА с различными вариантами антигена Rv2875, можно предположить, что конъюгация белка pRv2875 с гексасахаридом ЛАМ будет способствовать дополнительному повышению чувствительности анализа с указанным белком (согласно расчетам на 16% (cutoff]) или 18% (cutoff?)). Однако эти предположения требуют их экспериментального подтверждения.

Определение перспективной мультиантигенной композиции для целей серодиагностики туберкулеза

В данной работе, несмотря на то, что все сыворотки больных туберкулезом «распознавали» в ИФА те или иные антигены М. tuberculosis, ни один из 24 анализов не позволил с помощью только одного антигена выявить более 60% больных туберкулезом (рисунок 6). Вероятно, это было обусловлено индивидуальной гетерогенностью гуморального ответа при туберкулезе, так как в зависимости от стадии и формы туберкулеза, а также иммуногенетических особенностей организма набор антигенов, на которые формируется антительный ответ, варьирует от пациента к пациенту (Lyashchenko К. et al., 1998).

Рисунок 6 - Гетерогенность распознавания антигенов М. tuberculosis сыворотками больных туберкулезом. Примечания: красным цветом обозначены ячейки с OD45o> cutoff2 оранжевым - с OD450 > cutoff], но < cutoff2, не окрашены ячейки со значением OD450 < cutoff,

Комбинация из нескольких иммунодоминантных антигенов М. tuberculosis в составе одного серодиагностического теста может позволить компенсировать различия в антительном ответе при туберкулезе у разных людей. На основании данных, представленных на рисунке 6, расчетным путем (по cutoff]) установили оптимальные сочетания антигенов М. tuberculosis, позволяющие при совместном их использовании в одном тесте с высокой эффективностью выявлять туберкулез у жителей Саратовской области (таблица 2). Лучшие значения чувствительности (92%) были получены для композиций из трех антигенов pRv2875+eRv3875Ar+eRv3874 и pRv2875+eRv3875Ar+eRv3425. Однако специфичность анализа для последнего варианта (90%) была ниже, чем для первого (93,3%). Таким образом, наиболее высокой диагностической достоверностью (92,3%), а значит и эффективностью в серодиагностике туберкулеза может обладать тест, основанный на сочетании трех антигенов: pRv2875, eRv3875Ar и eRv3874.

Таблица 2 - Расчетная эффективность применения различных мультиантигенных композиций в серодиагностике туберкулеза

Мультиантигенная композиция Чувствительность Специфичность Диагностическая достоверность

pRv2875 + eRv3874+ eRv3875Ar 92% 93,3% 92,3%

pRv2875 + eRv3425+ eRv3875Ar 92% 90% 91,5%

eRv0222Ar + pRv2875 + eRv3874 91% 93,3% 91,5%

pRv2875 + eRv3875Ar + eRv3881cAr 91% 90% 90,8%

pRv2875+eRv3874+eRvl886c-Rv3875Ar 91% 90% 90,8%

pRv2875 + eRv3872+ eRv3875Ar 90% 93,3% 90,8%

eRv0222Ar +pRvl860+ eRv3874 89% 93,3% 90%

pRv0040c + pRv2875 + eRv3875Ar 88% 96,7% 90%

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В связи с актуальностью проблемы туберкулеза для нашей страны и необходимостью повышения выявляемости данного заболевания на ранних этапах диагностического поиска, была сформулирована задача - оценить возможности применения серодиагностики для скрининга туберкулеза на примере одного из регионов Российской Федерации. С целью реализации поставленной задачи в проведенном исследовании измерили уровни антител к полученным разными методами 24 рекомбинантным и синтетическим антигенам М. tuberculosis у больных туберкулезом и здоровых доноров из Саратовской области. Статистическая обработка результатов ИФА позволила определить наиболее эффективные для серотестирования антигены М. tuberculosis. Согласно полученным данным, наиболее высокие показатели чувствительности и специфичности в серодиагностике туберкулеза в Саратовской области может обеспечить мультиантигенный тест, включающий композицию из трех исследованных антигенов: eRv3874, eRv3875Ar и pRv2875.

Выводы

1. Определены основные критерии выбора диагностически значимых антигенов Mycobacterium tuberculosis для серодиагностики, которые включают: специфичность антигена для возбудителя туберкулеза, способность индуцировать высокую продукцию антител на этапе активации туберкулеза, отсутствие или низкий уровень антител, специфичных к антигену у здоровых БЦЖ-вакцинированных людей.

2. Создано 14 штаммов-продуцентов белков Mycobacterium tuberculosis, из которых 8 являются штаммами Escherichia coli, экспрессирующими белки Rv0222, Rvl837c, Rvl860, Rv2875, Rv3425, Rv3872, Rv3875 и Rvl886c-Rv3875, и 6 - штаммами дрожжей Pichiapastoris, синтезирующими белки Rv0040c, Rvl837c, Rvl860, Rv2873, Rv2875 и Rvl636-Rv2185c.

3. Из всех использованных в работе антигенов Mycobacterium tuberculosis наибольшим потенциалом для применения в серодиагностике туберкулеза в формате ИФА обладает белок pRv2875, экспрессированный в Pichia pastoris (обеспечивает диагностическую достоверность анализа - 69,2%), а также белок eRv3874, экспрессированный в Escherichia coli (обеспечивает диагностическую достоверность анализа - 62,3%) и конъюгат белка eRvl886c-Rv3875, экспрессированного в Escherichia coli, с синтетическим гексаарабинофуранозидом липоарабиноманнана (обеспечивает диагностическую достоверность анализа — 66,1%).

4. Продукция рекомбинантных антигенов Mycobacterium tuberculosis в дрожжевой системе экспрессии Pichia pastoris, по сравнению с традиционно применяемой бактериальной системой экспрессии Escherichia coli, способствует повышению чувствительности ИФА с сыворотками больных туберкулезом до 20%.

5. Химическое конъюгирование ряда рекомбинантных белковых антигенов Mycobacterium tuberculosis с синтетическим гексаарабинофуранозидом липоарабиноманнана приводит к повышению чувствительности ИФА с сыворотками больных туберкулезом до 16%.

6. Согласно расчетам, основанным на данных об уровне сероконверсии больных туберкулезом на различные антигены Mycobacterium tuberculosis, наиболее высокой эффективностью (обеспечивает диагностическую достоверность анализа - 92,3%) в серодиагностике может обладать мультиантигенный тест, включающий композицию из трех белков: eRv3874, eRv3875Ar и pRv2875.

Практические рекомендации

Для получения белков М. tuberculosis, пригодных для серодиагностики туберкулеза, целесообразно применение дрожжевой системы экспрессии P. pastoris.

Для увеличения иммунореактивности рекомбинантных белков М. tuberculosis с сыворотками больных туберкулезом обосновано использование химической конъюгации антигенов с синтетическим гексаарабинофуранозидом ЛАМ.

Для повышения эффективности статистической обработки данных, получаемых в ИФА при тестировании антигенов М. tuberculosis с сыворотками здоровых и больных туберкулезом доноров, рекомендовано применение ROC анализа.

Перспективные направления дальнейшей разработки темы

Изучение влияния различных способов получения антигенов М. tuberculosis на эффективность их применения в серодиагностике туберкулеза.

Исследование серодиагностического потенциала изученных в работе, а также других антигенов М. tuberculosis с сыворотками больных туберкулезом и здоровых людей из различных регионов Российской Федерации.

Оценка возможности выявления туберкулеза с помощью серодиагностики при внелегочной локализации туберкулезного процесса, а также у детей и ВИЧ-инфицированных людей.

Определение новых композиций из антигенов М. tuberculosis, обладающих высоким потенциалом для применения в серодиагностике туберкулеза, и экспериментальное подтверждение их эффективности.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дятлова, В. И. Исследование диагностического потенциала рекомбинантных и синтетических антигенов Mycobacterium tuberculosis / В. И. Дятлова, Е. В. Баранова, Е. А. Панферцев, С. Ф. Бикетов // Материалы конференции Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Биологическая безопасность в современном мире». -Оболенск, 2009,- С. 120-121.

2. Подвальный, Н. М. Синтез ковалентных конъюгатов гексаарабинофуранозида с белками с целью получения антигенов для серодиагностики туберкулеза / Н. М. Подвальный, Т. М. Мельникова, П. И. Абронина, А. И. Зинин, Л. О. Кононов, Е. А. Панфёрцев, Е. В. Баранова, В. В. Мочалов, В. И. Дятлова, С. Ф. Бикетов // Сб. тезисов конференции «Молекулярная диагностика-2010». - Москва, 2010. — т. 3. - С. 105-106.

3. Абронина, П. И. Синтез ковалентных конъюгатов гексаарабинофуранозида с белками и их тестирование в качестве антигенов для серодиагностики туберкулеза / П. И. Абронина, Н. М. Подвальный, Т. М. Мельникова, А. И. Зинин, К. Г. Федина, В. В. Качала, В. И. Торгов, Л. О. Кононов, Е. А. Панфёрцев, Е. В. Баранова, В. В. Мочалов, В. И. Дятлова, С. Ф. Бикетов // Известия академии наук. Серия химическая. — 2010. - № 12. -С. 2276-2280.

4. Дятлова, В. И. Оценка серодиагностического потенциала 18 рекомбинантных и синтетически модифицированных антигенов Mycobacterium tuberculosis / В. И. Дятлова, П. И. Абронина, А. Г. Богун, Л. О. Кононов, Т. М. Мельникова, В. В. Мочалов, Е. А. Панферцев, Н. М. Подвальный, С. Ф. Бикетов//Биотехнология. - 2013. - №6. - С. 78-86.

5. Дятлова, В. И. Оценка серодиагностического потенциала рекомбинантных антигенов Mycobacterium tuberculosis, полученных в разных экспрессионных системах / В. И. Дятлова, А. Г. Богун, С. Ф. Бикетов // Биотехнология. - 2014. - № 1. - С. 72-78.

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

БЦЖ - (бацилла Кальметта-Герена) вакцина из М. bovis BCG;

ВАК - Высшая аттестационная комиссия;

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения;

ДЦ - диагностическая достоверность;

ДСН - додецилсульфат натрия;

ДМСО - диметилсульфоксид;

дНТФ - дезоксирибонуклеозидтрифосфат;

ИПТГ - изопропил-Р-О-галактопиранозид;

ИФА - нммуноферментный анализ;

ИХ - иммунохроматографический

К - (критерий) «оптимальное отсекающее значение» в ROC

анализе; кДа - килодальтон;

ЛАМ - липоарабиноманнан;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ППК - площадь под кривой ROC

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

С - специфичность;

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан;

ФГБУНИОХРАН - Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической химии им. Н. Д. Зелинского Российской академии наук; Ч - чувствительность;

Ага/5 - гексаарабинофуранозид;

Ar - обозначены химические конъюгаты белков с Ara/б ЛАМ;

BCG - Bacillus Calmette—Guerin;

BMGY - (buffered glycerol-complex medium) буферизированная среда с

глицерином;

BMMY - (buffered methanol-complex medium) буферизированная среда с

метанолом; Cutoff - «отсекающее» значение;

е - обозначены белки, полученные в Е. coli;

J - индекс Юдена;

MD - (minimal dextrose) минимальная среда с декстрозой;

ММ - (minimal methanol) минимальная среда с метанолом;

OD450 - (optical density) оптическая плотность при 450 нм;