Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологическое тестирование новых противотуберкулезных препаратов в эксперименте

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мартынова, Людмила Павловна, Москва



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТУБЕРКУЛЕЗА

МАРТЫНОВА ЛЮДМИЛА ПАВЛОВНА

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ НОВЫХ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

03.00.0?. - Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Голышевская В.И. доктор биологических наук, вед.науч.сотр. Лепеха Л.Н.

Москва 1998 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Стр,

RRF i'IFHMF 5 ГЛАВА I. Обзор литературы................................ ii

1.1. Химиотерапия туберкулеза. Состояние

проблемы на современном этапе.....................ii

1.2. Особенности метаболических процессов и концентрация противотуберкулезных препаратов

в макр о организме....................................14

1.3. Показатели обмена железа, у больных

туберкулезом легких............................ 18

1.4. Роль витамина А и его аналогов в жизнедеятельности макроорганизма и стимулировании защитных иммунных процессов.................... 20

1.5. Экспериментальный туберкулез и его

химиотерапия................................... 22

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................. 29

2.1. Характеристика материалов и методов

экспериментального исследования................ 31

ГЛАВА III. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ АЛЬДИЗОНА, ИОНИЗОНА, ФЕНАЗИДА........................................ 40

3.1. Изучение бактериостатической и бактерицидной активности новых противотуберкулезных соединений в опытах in vitro ......................... 40

3.2. Микробиологическая оценка эффективности лечения экспериментальных животных новыми противотуберкулезными соединениями на модели гемато-генно-диссеминированного туберкулеза............ 44

ГЛАВА 1и. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОРФОЛОГИЧЕСКИХ

ИЗМЕНЕНИЙ В ПАРЕНХИМАТОЗНЫХ ОРГАНАХ ЭКСПЕРИМЕН-

ТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ.................................. 65

4.1. Морфологическая характеристика паренхиматозных органов лабораторных животных, получавшие контрольный препарат сравнения изониазид......... 67

4.2. Морфологическая характеристика паренхиматозных органов лабораторных животных, получавших новый препарат ионизон................................. 70

4.3. Морфологическая характеристика паренхиматозных органов лабораторных животных, получавших новые препараты альдизон и феназид..................... 72

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................. 94

ВЫВОДЫ...................................................... 104

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ................................... 106

УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ........................................ 107

ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВНИВИ НПО "Витамины" - Всероссийский научно-исследовательский витаминный институт Научно-производственного Объединения "Витамины" .

ВНЦБАВ - Всероссийский научный центр по безо-

пасности биологически активных веществ.

ВКБ - воздушно-кровяной барьер.

ГИНК - гидразид изоникотоновой кислоты.

КОЕ - колониеобразующие единицы.

МБ - микобактерии.

МВТ - микобактерии туберкулеза.

МИК - минимальная ингибирунщая концентрация.

НАД - никотинамидадениндинуклеотид.

ПТП - противотуберкулезный/е/ препарат/ы/

ЦНИМТ РАМН - Центральный научно-исследовательский

институт туберкулеза Российской Академии Медицинских Наук.

к

- и —

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Проблема, борьбы с туберкулезом продолжает сохранять свое значение для здравоохранения России и всего мира (Хоменко А,Г., 1979,1988,1996). Совершенствование микробиологической диагностики и эффективности лечения больных туберкулезом зависит» в частности, от освоения и промышленного производства новых лекарственных средств, обладающих повышенной бактериостатической активностью в отношении микобактерий туберкулеза. Зти исследования являются частью Программы ВОЗ по борьбе с туберкулезной инфекцией. Несмотря на имеющийся в клинике набор противотуберкулезных средств, эффективность их применения снижается из-за быстрого приобретения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза к наиболее активным противотуберкулезным препаратам (Хоменко А.Г.,1980, Чу-канов В.И.,1988,Голышевская В.И.,1995). Одним из наиболее эффективных препаратов, задерживающих рост МБТ в минимальных концентрациях является изониазид, открытие которого в начале 50-х годов имело огромных положительный эффект в лечении различных форм туберкулеза. Однако к настоящему моменту накопилась многочисленная информация о значительных побочных явлениях при его применении, таких как поражение нервной системы (полиневриты), развитие ги-похромной анемии, токсико-аллергические реакции, расстройство иммунной системы (Драбкина Р.0.,1963, Рабухин А.Е., 1970, Соколова Г.Б.,1984, Кораблев В.Н.,1992). Кроме того, генетически обусловленное ацетилирование изониазида. приводит к быстрой нейтрализации препарата, что снижает эффективность терапии у больных туберкулезом.

В настоящее время достаточно известен и тот факт, что в процессе лечения туберкулеза изменяются морфологические и биохимические свойства МВТ, формируются устойчивые к химиопрепаратам штаммы. Резистентные к действию известных противотуберкулезных лекарственных средств микобактерии могут длительное время находиться в остаточных очагах инфекции, при этом сохраняя способность к размножению, что приводит к реактивации инфекционного процесса (Пузик В.И.,1975, Земскова 3.С.,1978, Филиппенко Л.Н.,1983, Голышевская В.И,,1995 ). В этой связи поиск новых противотуберкулезных препаратов, активно воздействующих непосредственно на микобактерии туберкулеза и не вызывающих побочных реакций, является не только перспективным, но и необходимым условием в борьбе с туберкулезной инфекцией. Важность этой проблемы определяет и возросшие требования к проведению отдельных этапов разработки новых лекарственных средств, в частности, к стадии экспериментальных доклинических испытаний »включающих широкий спектр исследований токсичности, канцерогенности, тератогенности и т.д.

Большое значение в этом ряду имеют микробиологические и морфологические исследования, при которых изучается эффективность лечения экспериментального туберкулеза с учетом изменения бактериальной популяции, динамики туберкулезного процесса,определения бактериостатической и бактерицидной активности новых препаратов с традиционно применяемыми (Голышевская В.И., 1995,1997).Условия эксперимента позволяют дать предварительную оценку эффективности вновь изучаемых химиотерапевтических средств и их комбинаций. Для оценки туберкулостатического действия антибактериальных препаратов применяются различные лабораторные методы, включая моделирование туберкулезной инфекции в макроорганизме у животных с различной степенью восприимчивости к туберкулезу.(Лепеха Л.Н., 1983, 1995).

Представленное исследование посвящено микробиологическому и морфологическому испытанию новых противотуберкулезных препаратов с присвоенными им названиями "Альдизон" и "Ионизон" синтезированных во ВНИВИ НПО "ВИТАМИНЫ", г.Белгород (Васильева Р.Л. с со-авт., 199Зг.), а также "Феназид", синтезированный во ВНЦБАВ, г.Купавна (Гладких С.П. с соавт., 1991г.).Эти препараты созданы на основе гидразида изоникотиновой кислоты с различными добавками: для альдизона и ионизона - это ретиноиды, для феназида - сульфат железа (II).

В настоящей работе на модели гематогенно-диссеминированного туберкулеза у морских свинок и мышей линии СБА проведены микробиологические, биологические и морфологические исследования по оценке химиотерапевтической активности новых противотуберкулезных препаратов альдизона, ионизона и феназида. Бактериологические и морфологические исследования паренхиматозных органов экспериментальных животных в процессе химиотерапии позволили оценить эффективность лечения экспериментального туберкулеза новыми препаратами в сравнении с известным и широко применяемым в клинике противотуберкулезным препаратом изониазидом.

Целью настоящего исследования явилось комплексное микробиологическое изучение бактериостатической и химиотерапевтической эффективности новых противотуберкулезных препаратов АЛЬДИЗОНА,ИОНИЗОНА, и ФЕНАЗИДА в эксперименте.

Для выполнения поставленной цели определены следующие

задачи :

1. Изучить микробиологическими методами бактериостатическую и бактерицидную активность новых противотуберкулезных препаратов

альдизона, ионизона и феназида в отношении различных видов мико-бактерий туберкулеза.

2. Определить индексы химиотерапевтической эффективности альдизона, ионизона и феназида в сравнении с эффективностью изо-ниазида на модели гематогенно-диссеминированного туберкулеза.

3. Исследовать морфологическими методами характер специфического воспаления паренхиматозных органов морских свинок и мышей линии СБА в процессе длительной химиотерапии альдизоном, ионизо-ном и феназидом.

4. Изучить побочное действие новых противотуберкулезных препаратов на ультраструктуру клеточных элементов воздушно-кровяного барьера у экспериментальных животных в процессе длительной химиотерапии.

Научная новизна.

Впервые в экспериментальных исследованиях на модели гемато-генно-диссеминированного туберкулеза изучены новые противотуберкулезные препараты альдизон, ионизон и феназид, установлены их оптимальные доза (20 мг/кг веса животного) и сроки химиотерапии (3 месяца), позволяющие абациллировать очаги поражения. Изучение бактериостатической и химиотерапевтической активности новых соединений, показало, что индексы эффективности при применении альдизона и феназида выше, чем у препарата сравнения-изониазида, а. ионизона - идентичны. Установлены особенности морфологических изменений паренхиматозных органов животных, выявленные при лечении альдизоном, ионизоном и феназидом экспериментального туберкулеза, которые характеризовались ускоренным развитием продуктивных процессов в легких, что обеспечивало более выраженный терапевтический эффект по сравнению с контрольным препаратом.

- 9 -

Практическая значимость.

Выполненные исследования позволяют обосновать проведение клинических испытаний новых противотуберкулезных препаратов аль-дизонэ. и ионизона, обладающих высокой бактериостатической активностью в отношении МБТ. Предложены оптимальные доза и срок химиотерапии для альдизона и ионизона,а также установлено, что применение новых препаратов в течение трех месяцев способствует заживлению очагов туберкулезного воспаления в паренхиматозных органах экспериментальных животных. Кроме того, проведенные исследования подтверждают высокую туберкулостатическую активность феназида, проходящего в данный момент клинические испытания в ЦНИИТ РАМН и других противотуберкулезных учреждениях г.Москвы.

Положения,вы носимые на защиту.

1. Индексы эффективности химиотерапии альдизоном и феназидом в эксперименте у морских свинок и мышей линии СВА превышают индексы эффективности при лечении препаратом сравнения Сизониазид) при применении аналогичной дозы (10 и 20 мг/'кг веса животного). При этих же условиях терапии ионизон проявляет активность, близкую по значению контрольному изониазиду.

2. Терапевтическая эффективность альдизона и феназида, применяемых в течение 3-х месяцев более выражена по сравнению с изо-ниазидом и новым препаратом ионизоном, и обеспечивает активизацию продуктивных процессов в паренхиматозных органах животных, а также стерилизацию очагов поражения от МБТ.

Публикации .

По результатам выполненных исследований опубликовано 9 научных работ. Получен патент на изобретение N 2054002 "Изоникотин-оилгидразоны, проявляющие противотуберкулезную активность" (Госу-

- 10 -

дарственный реестр изобретений, 10,02.1996 г.).

Апробация работы.

Основные результаты работы доложены и обсуждены на научных конференциях ЦНИИТ РАМН (1994, 1995, 1996гг.); на заседаниях секции микробиологии и иммунологии туберкулеза Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (1994, 1995, 1996, 1998гг.); на I научной конференции молодых специалис-тов-фтизиопульмонологов России (1995г.); на II Российском Национальном конгрессе "Человек и лекарство" (1995г.); на III съезде фтизиатров, (Екатеринбург, 1997г.).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на ilf страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов , указателя литературы,включающего 79 источников отечественных и 37 иностранных авторов, иллюстрирована 9 таблицами и 19 рисунками.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Химиотерапия туберкулеза. Состояние проблемы на современном этапе

Минуло уже более 40 лет с тех пор, как вошла в широкую практику химиотерапия больных туберкулезом, но методы и способы ее применения непрерывно совершенствуются и видоизменяются, что зависит от ряда причин. Прежде всего медицинская практика еще не располагает каким-либо препаратом или группой медикаментов, безотказно обеспечивающих излечение больных при всех формах и фазах процесса. Известно, что микобактерии туберкулеза могут изменять свою чувствительность к противотуберкулезным препаратам в процессе длительной химиотерапии (75). П.Зрлих (1911) впервые ввел в микробиологию и медицину понятие о лекарственной устойчивости микроорганизмов (88). В дальнейшем, когда в лечебной практике стали широко использовать различные антибактериальные препараты, выяснилась возможность и механизмы развития резистентности, нередко высокой почти у всех видов микроорганизмов. В связи с этим резко возросло значение данного феномена в эпидемиологии, клинике и терапии всех инфекционных заболеваний, в том числе и туберкулеза. (9,54,68,75,88).

По данным многих авторов больные, длительно страдающие активными формами туберкулеза органов дыхания, являются носителями лекарственноустойчивых микобактерий (56,68,90). Известно, что не все больные хорошо переносят различные противотуберкулезные препараты, под влиянием которых нередко возникают аллергические,

токсические и другие побочные явления (1). Зто затрудняет лечение и, нередко, активная форма патологического процесса приобретает хроническое течение (68). К тому же большинство препаратов подвергается метаболическим превращениям в организме больных при четкой генетической зависимости от индивидуальных особенностей макроорганизма, выражающейся в сильной или слабой инактивации хи-миопрепаратов (51,54).

Интенсивное ацетилирование относится в первую очередь, к базовому противотуберкулезному препарату-гидразиду изоникотиновой кислоты (53,30,7), что не позволяет обеспечить в клинике оптимальную бактериостатическую концентрацию препаратов ГИНК в очагах поражения и способствует образованию резистентных микобактерий туберкулеза (19,52,25). Легочная ткань, инфицированная типичными и резистентными микобактериями туберкулеза является резервуаром, где МБТ интенсивно размножаются и куда доступ антибактериальных препаратов до некоторой степени затруднен. Этот фактор имеет огромное значение для эпидемиологии туберкулеза у человека. Известно, что в обширных очагах поражения устойчивые микобактерии выявляются чаще, чем в мелких (инкапсулированных). Суходольская А.Е. (1967) обнаружила резистентные микобактерии в кавернах в 55,1% наблюдений, а в очагах в 41,8% случаях. В кавернах, кроме того можно часто выявить микобактерии, устойчивые к одному, двум и более лекарственным соединениям, т.е. полирезистентных, что также ограничивает терапевтические возможности лечения туберкулезной инфекции (56,32,30). По данным ряда авторов отмечается пропорциональная зависимость количественного содержания микобактерий туберкулеза чувствительных к противотуберкулезным препаратам к удельному весу лекарственнорезистентных (56,19,69,72).

По данным 1993 года микробиологическая диагностика в зонах

жесткого радиационного контроля в Гомельской области показала прямую зависимость увеличения удельного веса лекарственно-резистентных МВТ и усиление их вирулентных свойств (19,51,73).

Шевченко Н.И. и др. (73) показали, что в зонах жесткого радиационного контроля достоверно чаще, чем в областях с нормальным радиационным фоном у больных с активными формами туберкулеза легких выявляются измененные (кокковидные) микобактерии. При исследовании биологических свойств штаммов МВТ, свежевыделенных от больных туберкулезом органов дыхания, установлено повышение их вирулентных свойст. Отмечено увеличение количества больных с первичной лекарственной устойчивостью МВТ к рифампицину и изониази-ду. Так, в Гомельской области в 1996 году удельный вес первичной лекарственной устойчивости МВТ составил 36%, в Хабаровском Крае -41%, в Ивановской области - 28% (70,73).

Политические и экономические события в России и странах СНГ, произошедшие за последние годы, а именно: вооруженные национальные конфликты, миграции населения, падение уровня жизни людей -неизбежно привели к осложнению эпидемиологической ситуации по туберкулезу на территории бывшего СССР (13,22,29,55),

По да�