Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствованная методика оценки реакции пассивной гемагглютинации для выявлении антител к туберкулезным микобактериям и ее применение в иммунодиагностике туберкулеза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствованная методика оценки реакции пассивной гемагглютинации для выявлении антител к туберкулезным микобактериям и ее применение в иммунодиагностике туберкулеза"

На правах рукописи

К А С II М О В А Татьяна Витальевна

УСОВЕРШЕНСТВОВАННАЯ МЕТОДИКА ОЦЕНКИ РЕАКЦИИ ПАССИВНОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИИ АНТИТЕЛ К ТУБЕРКУЛЕЗНЫМ МИКОБАКТЕРИЯМ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ В ИММУНОДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА

03.00.07 - микробиология

14.00.36-аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ПЕРМЬ - 1998

Работа выполнена в Пермской государственной медицинской академии

Научный руководитель - доктор медицинских наук.

профессор В.Н.Каплин

Официальные оппоненты :

доктор медицинских наук, профессор Э.С.Горовиц доктор медицинских наук, С.В.Ширшев

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

Зашита диссертации состоится 10 апреля 1998 г. в Ю"» часов на заседании диссертационного совета К 200.46.01 Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. По адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан марта 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

И.Б. Ившина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в Российском Федерации, а также со всем мире, включая и развитые страны, в последние годы значительно ухудшилась. По данным экспертов ВОЗ, заболеваемость туберкулезом сохраняется на высоком уровне и составляет 8-10 млн в год [Е.С.Овсянкина, 1996; М.В.Шилова, 1996].

Успехи терапии и профилактики туберкулеза прямо связаны со своевременной и точной диагностикой. Для диагностики туберкулеза в настоящее время используют главным образом клинико-рентгенологические. бактериологические методы и туберкулинодиагпостику. Трудности клинической диагностики связаны, прежде всего, с наличием атипичных форм заболевания и неясной рентгенологической картиной. Значимость туберку-линодиагносгики в современных условиях уменьшается в связи со снижением у больных туберкулезом чувствительности к туберкулину [В.И. Литвинов, 1996: В.Л. Фирсова и соавт.. 1994].

Среди лабораторных методов диагностики туберкулеза основным и наиболее достоверным является бактериологический метод. Однако частота кысеваемости микобактерий туберкулеза, по данным большинства авторов. не превышает 20-40%. Кроме того, бактериологический мегод позволяет установить диагноз не ранее чем через 1-1.5 месяца [В.И. Голытевская и соав1., 1995].

В настоящее время из диагностических методов значительное внимание уделяется иммунодиагностике туберкулезной инфекции. К наиболее перспективным и чувствительным истодам относят иммуноферментный анализ, позволяющий определять туберкулезные антигены и антитела к ним. Однако он не получил широкого распространения в практике фтизиатров из-за отсутствия коммерческих наборов реактивов, а также недостаточной специфичности. Из методов иммунодиагностики туберкулеза, основанных на выявлении иммунной реакции организма, привлекает внимание определение анштел к микобактериям туберкулеза (противотуберкулезных анппел) в реакции непрямой (пассивной) гемагглютпнации (РНГА. или РИГА). Среди серологических методов РПГА отводится первое место по сумме положительных качеств простоте постановки реакции, экономичности и экспрессности оценки. Учитывая наличие коммерческого эритро-цигарного диагностикума и возможность использования микрометода, РИГА можно широко применять на практике. Однако основанная на определении диагностического титра антител реакция недостаточно чувствительна и специфична [В.И. Литвинов, 1996; К.Ф. Каральник. 1989].

Существуют принципиальные возможности ранней диагностики инфекций на основе определения специфических антимикробных реакций. На кафедре патофизиологии Пермской государственной медицинской академии разработан оригинальный подход к оценке специфических реакций при инфекциях. В его основу положена закономерность корреляции у здо-

ровых людей и больных контрольных групп антимикробной активности i отношении разнородных микробов, что позволяет оценить специфически« изменения в крови по соотношению специфического и неспеиифическогс компонентов антимикробных реакций [В.Н. Каплин, 1996]. Этот новый ме тонический подход оказался эффективным при исследовании специфиче ских клеточных реакций у больных туберкулезом. Однако в отношенш РПГА возможности этого подхода при туберкулезе не изучены.

Целью работы является совершенствование диагностики туберкуле за на основе определения титров противотуберкулезных антител в РГ1ГА.

Задачи исследования

1. Усовершенствовать методику оценки РПГА на основе определени: реакции по соотношению титров противотуберкулезных и неспецифиче ских антител (Ат).

2. При использовании оригинального методического подхода иссле довать закономерности формирования РПГА у больных туберкулезом.

3. Обосновать возможность применения нового подхода к оцснк РПГА в ранней диагностике туберкулеза.

4. Изучить новые возможности оценки активности бактериальной процесса на основе оригинального методического подхода к определении титров противотуберкулезных антител.

5. Исследовать in vitro эффект взаимодействия туберкулезного анти гена (Аг) с антителами к микобактериям туберкулеза и определить воз можностн использования этого эффекта в диагностике туберкулезной ин фекции.

Научная новизна

- Разработан новый методический подход к определению РПГА п< соотношению титров противотуберкулезных и протнвошигеллезных антн тел. повышающий чувствительность и специфичность реакции;

- для оценки РПГА разработан единый унифицированный днагнс стический критерий в форме индекса специфического изменения титра ан ти гел (ИСТ);

- выявлены закономерности атшелогенеза у больных туберкуле зом. заключающиеся в специфической ингибиции противотуберкулезны антител в начальных стадиях и их нарастании в более поздних стадиях:

- у больных туберкулезом установлено in vino повышение усгойчг вости противотуберкулезных антител к ингибирующему влиянию туберк\ лезного антигена:

- предложена новая методика определения активности протпвот\ беркулезных антител по эффекту их взаимодействия с туберкулезным антг геном.

Практическая ценность и внедрение. Обоснован новый диагностич* ский подход к оценке титров противотуберкулезных антител в РПГА. тк вышагощий чувствительность и специфичность реакции, и показана во:

можность ранней диагностики туберкулеза на основе опенки титров антител. Разработан единый диагностический критерий РПГА. Установлена возможность ранней диагностики туберкулеза на основе опенки пнгпби-руюшего влияния туберкулезно!о антигена на противотуберкулезные антитела. Метод внедрен в работу лаборатории отдела эпидемиологического надзора за ириродно-очаговыми п особо опасными инфекциями центра I оссанэптщнадзора в Пермской области.

Основные положения, выносимые на защиту.

!. Новый диагностический подход к определению титров противотуберкулезных антител в РПГА по соотношению титров специфических и неспецпфических антител.

2. Два варианта формирования РПГА при туберкулезе - специфическое снижение титров в начальных стадиях 1! их увеличение в более поздние сроки.

3. Использование унифицированною диагностического критерия РПГА для оценки активности туберкулезного процесса.

4. Эффект повышения устойчивости противотуберкулезных антител к ингнбирующему влиянию антигена у больных туберкулезом и возможность применения этого теста для диагностики туберкулеза.

Апробация работы. Работа выполнена на кафедре патологической физиоло! ни Пермской 1 оеударст венной медицинской академии и является фрагментом комплексной темы: «Разработка новых методов иммунологическою исследования и ранняя иммунологическая диагностика инфекций и деструктивных процессов во внутренних органах» (.V» регистрации 01820080720).

Материалы работы доложены на кафедре патологической фпзиоло-I пи (1995). на научной сессии ПГМА (1996. 1997 гг.). Диссертация апробирована на совместном заседании кафедр патологической физиологии, микробиологии,'эпидемиологии ПГМА и лаборатории иммунолот ип Института зколопш и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 4 работы.

Объем работы. Диссертация изложена на 124 страницы машинописи. состоит нз введения, обзора литературы, описания уппериалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов н примечания. Библиографический указа!ель включает ссылки на работы 157 отечественных и 51 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 3 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Исследование титров Ат с использованием усовершенствованногс способа определения РПГА проведено у 100 человек, больных туберкуле зом (93 взрослых в возрасте от 18 до 64 лет и 7 детей в возрасте от 3 до Ь лет). Во время исследования больные находились на стационарном лечени> в областном диспансере фтизиопульмонологии. Диагноз туберкулёза ; больных был поставлен на основании клинико-рентгенологического и бак териологического исследования. Бактериологическое исследование у боль ных туберкулёзом проведено на базе центральной лаборатории Пермскогс областного диспансера фтизиопульмонологии по общепринятому методу ■ посевом материала на питательную лиофилизированную среду Левенштей на - Иенсена (Приказ МЗ СССР № 58 «Об унификации микробиологиче ских методов исследования при туберкулезе» от 8.06.78). Микобактерии ту беркулёза были выделены у 41 больного. На момент определения титро! противотуберкулезных Ат положительный бактериологический анализ бьи у 27 больных туберкулезом. У 14 больных положительный бактериологиче ский анализ был до исследования титров Ат, а на момент псследовани: титров Ат высева микобактерии не было.

Большинство взрослых больных (81 человек) страдало тяжёлыми п< течению и прогнозу формами туберкулёза лёгких (инфильтративный ту беркулёз с распадом и обсеменением, диссеминированный, фиброзно кавернозный) с осложнениями в виде экссудативных и сухих плевритов 1 деструктивных и казеозных пневмоний. У 4-х больных выявлена рання форма вторичного туберкулёза лёгких - очаговый туберкулёз лёгких. I группу исследуемых вошли больные экссудативным плевритом туберкулёз ной этиологии (4 человека) и плевритом неясной этиологии (4 человека).

Диагноз туберкулёза у детей был установлен на основании клинике рентгенологического обследования, динамики изменения реакции Мант} бактериологического высева. Все дети находились на стационарном лече нии в детском отделении диспансера фтизиопульмонологии. У 4 детей бы. диагностирован туберкулёз внутригрудных лимфатических узлов, у одног - очаговый туберкулёз, у одного - туберкулёз внутригрудных лимфатиче ских узлов и основных фалангов пятых пальцев кисти в активной фазе и одного - экссудативный плеврит туберкулёзной этиологии. Бактериологи ческое подтверждение диагноза получено только у двух детей.

Контрольные исследования проведены у 61 человека. Из них было 4 донора и 17 больных с заболеваниями нетуберкулёзной этиологии. Кров доноров получали в областной станции переливания крови.

Исследование РПГА проведено также у ограниченной группы дете! вакцинированных БЦЖ. Обследовано 20 детей в возрасте от 4 месяцев до лет, вакцинированных в период новорожденное™. Контрольную групп составили 10 детей такого же возраста,не вакцинированных БЦЖ (не иг фицированных и не болеющих туберкулезом).

Анализ клинического материала проведён по данным историй болезни.

Исследование титров Ат проводили по оригинальной методике, в основе которой лежит разработанный В.Н.Каплиным и соавт. [1996 г.] усовершенствованный способ диагностического определения РПГА по соотношению титров специфических и неспецифических антител. В настоящей работе у обследуемого больного и у контрольных лиц определяли в РПГА титры противотуберкулёзных (специфических) и противошигеллёзных (неспецифических) Ат, рассчитывали их соотношение и вычисляли индекс специфического изменения титров (ИСТ).

Для определения титров Ат кровь забирали из локтевой вены. При исследовании РПГА использовали сухие эритроцитарные антигенные ди-агностикумы С'ПбНИИВС. Титры противотуберкулёзных Ат определяли в РПГА с туберкулёзным фосфатидным эритроцитарным диагностикумом (ЭД). Противошигеллёзные Ат определяли с антнгенным ЭД из шигелл Зонне. При постановке РПГА использовали микрометод, исследуемую сыворотку или плазму разводили от 1:2 до 1:256. Одновременно ставили кон-троли ЭД с физраствором и иммунной сывороткой.

ИСТ рассчитывали по формуле:

о б

Теп / 1 иесп

ИСТ = ...........—................

к к

Ср Теп / Ср Тнесп

б б где Теп - титр Ат к специфическому Аг у больного. Тнесп - титр Ат к

к к

неспецифическому Аг у больного: Ср Теп и Ср Тнесп - средние титры антител к соответствующим антигенам у контрольных лиц. При значении индекса выше 4.0 и ниже 0,25 констатировали специфический сдвиг титра Ат.

Модельные опыты проведены с сывороткой и плазмой крови у 24 больных туберкулезом и 34 доноров и больных с нетуберкулёзными заболеваниями. Принцип методики заключался в том. что к каждому разведению раститрованной сыворотки добавляли туберкулезный Аг с заранее определенной активностью и определяли, в каком разведении произошло угаше-ние титров противотуберкулезных Ат. Туберкулезный антиген получали из вакцины БЦЖ (производство Ставропольского НИ И ВС). Для этого 3 ампулы сухой вакцины растворяли в 2 мл физраствора, центрифугировали при 3 тыс об/мин в течение 10 минут. Для реакции использовали надоса-дочную жидкость. Активность антигена в надосалочной жидкости определяли в РТПГА и выражали в антигенных единицах (АЕ). За одну АЕ принимали такую активность Аг. которая полностью ингибирует титр Ат ре-ференс-сыворотки в последнем разведении, оцениваемом на 3-4 креста. Готовили рабочий раствор Аг активностью 3-4 АЕ. При исследовании инги-бирующего влияния Аг каждую сыворотку больных туберкулезом, доноров

и контрольных больных раститровывали в двух параллельных рядах в раз ведениях от 1:2 до 1:256. В каждую лунку первого ряда добавляли по 0,01 мл туберкулезного Аг. В каждую лунку второго ряда - такой же объем физ раствора. После перемешивания планшет выдерживали при комнатно! температуре в течение одного часа. Затем в каждую лунку добавляли 0,0; мл 1%-ой взвеси туберкулёзного фосфатидного ЭД. Учёт реакции произво дили через 1,5-2 часа и через сутки. По результатам исследования произ водили расчёт индекса ингибишш специфических Ат (ИИ) путём деленш остаточного титра Ат в пробе с Аг (Таг) на титр Ат в контрольном иссле дованни ('IV).

Таг

ИИ =...........

Тк

Величина ИИ больше 0,25 является альтернативным признаком спе цифнческой реакции.

Полученные данные обработаны методом вариационной статистик! [Л.С.Каминский, 1964; Е.В.Монцевичуте-Эрингене. 1964] и по непарамет рическим критериям [Е.В.Гублер,1978].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Новый методическин подход к исследованию в РПГА титров amine.' к микобактериям туберкулеза

Исследование титров противотуберкулезных и противошигеллезны Ат выявило большой диапазон колебаний титров противотуберкулёзных i противошигеллёзных Ат. Максимальная и минимальная величина тнтро противотуберкулёзных Ат отличается в 32 раза (от 1:2 до 1:64), а противс шигеллёзных Ат - в 8 раз (от 1:8 до 1:64). Высоким оказался коэффшшен вариации величины соответствующих титров - соответственно 73.3% i 65,0%. Однако при сопоставлении титров естественных противотуберку лёзных и противошигеллёзных Ат в индивидуальных пробах отмечаете соответствие их величин. Расчё! коэффициента корреляции титров Ат двум Аг подтвердил существование высокой степени связи между значе ниями титров Ат у обследованных лиц ( г = 0.99 + 0,01 . Р < 0,01).

Сопоставление средних величин титров показало, что титры протг вотуберкулёзных Ат оказались в среднем в 2 раза ниже титров противонл: геллёзных Ат и округлённое соотношение их величин составляет 1:2. Пр расчёте ИСТ в каждой пробе в сопоставлении с отношением средних тш ров Ат величины индексов оказались в пределах 0,5 - 2.0. Противотуберку лёзные Ат в титре 1:64 выявлены у одного донора (2.2% от числа обследс ванных). Существующий подход к выбору величины диагиостическог титра допускает возможность выявления этой величины не более чем у 5е доноров. В соответствии с нашими исследованиями таковым следует сч! тать титр противотуберкулёзных Ат 1:64.

В контрольной группе обследуемых, состоящей из лиц с заболеваниями нетуберкулезной этиологии, средние титры противотуберкулёзных и противошигеллёзных Ат оказались в среднем в 1,5 раза ниже, чем в группе доноров. В остальном исследование в этой группе выявило те же закономерности, что и в группе доноров. Так же, как у доноров, отмечаются большие колебания величин титров - от 1:4 до 1:32. Их сопоставление в индивидуальных пробах также выявило большую степень связи ( г = 0,9 ± 0.03; Р < 0.01) и расхождение величин не более чем в 4 раза. Сопоставление средних титров, выявило такое же, как у доноров, округлённое соотношение их величин - 1:2. Соответственно этому вариации ИСТ при расчёте к отношению средних величин титров составляют 0,5 - 2,0. Таким образом исследование группы доноров и контрольной группы больных выявило одинаковые закономерности соотношения титров естественных противотуберкулёзных и противошигеллёзных Ат. Это даёт возможность использования единого контрольного критерия ИСТ для обеих этих групп. Очевидно, что при проведении диагностического исследования ИСТ можно рассчитывать исходя из найденного среднего отношения титров противотуберкулезных и противошигеллёзных Ат 1:2 и использовать в качестве контрольного значения ИСТ в пределах 0,25 - 2,0.

При оценке соотношения титров противотуберкулёзных и противошигеллёзных Ат отмечена зависимость величин отношения титров от абсолютной величины титров противошигеллёзных Ат. В связи с этим был разработан еще один вариант расчёта ИСТ по стандартам отношения титров Ат, составленным с учётом величины титров противошигеллёзных Ат. Стабильность отношения титров Ат у доноров и в контрольной группе больных дала возможность составить стандарты на основе совокупности всех исследований. При составлении стандартов отношения титров Ат выделены группы с одним значением титра противошигеллёзных Ат. Для каждой такой группы вычислено среднее значение соответствующих индивидуальных титров противотуберкулёзных Ат, и по соотношению средних титров противотуберкулёзных и противошигеллёзных Ат в каждом стандарте вычислены индивидуальные величины индексов. Структура таких стандартов представлена в табл.1. При расчёте но стандартам пределы колебаний контрольного значения ИСТ составляют 0,3 - 2.6.

В новом методическом подходе, где применяется унифицированный критерий оценки РПГА в форме ИСТ. условия исследования не требуют строгой стандартизации. Это позволило предположить возможность эффективного исследования РПГА при постановке реакции с нестандарт и зи-рованным ЭД. Проверка такой возможности была проведена при исследовании РПГА с длительно хранившимся туберкулезным ЭД.

Специфическая активность ЭД с истекшим сроком годности снижается, но остается стабильной. Контрольная величина ИСТ у доноров при использовании ЭД с истекшим сроком годности оказалась в пределах 1,0 - 2,0.

Таблица 1

Стандарты отношения титров противотуберкулезных и противоши-геллезных антител по материалам исследования РПГА у доноров и в кон-

Титр антител к ши-геллам Зон-не Число проб с таким титром Титры противотуберкулёзных антител при таком титре антител к ши-геллам Зонне (М и пределы колебаний) Пределы колебаний ИСТ, рассчитанного по соотношению средних титров противотуберкулёзных и противошигеллезных антител в стандарте

4 2 5,0(4-6) 0.8- 1,2

8 8 6,8(2-8) 0.3-1,2

16 25 12,2(4-32) 0,3 - 2,6

32 15 18,7(8-32) 0,4-1,7

64 11 30,5 ( 16-64) 0.5-2,1

Такие же величины ИСТ отмечены и при постановке реакции с ЭД с действующим сроком годности. Проведенное исследование позволило разработать новый критерий оценки специфической активности туберкулезного ЭД, определяемой по диапазону выявляемых им титров Ат. Этот диапазон содержит титры противотуберкулезных Ат от 1 до 128, что составляет 8 последовательных градаций титров. Такой критерий считается достаточным показателем специфической активности ЭД при определении РПГА по соотношению титров Ат (В.Н. Каплин, 1996).

Титры и соотношение титров противотуберкулезных и противошигел-лезиых антител у детей, вакцинированных БЦЖ

При исследовании РПГА у вакцинированных детей обнаружена тенденция к повышению титров противотуберкулезных Ат, а их средний уровень возрос, по сравнению с контрольной группой, более чем в два раза (табл. 2). Однако разница между специфическими Ат у вакцинированных детей и в контрольной группе недостоверна. У трех вакцинированных детей титр противотуберкулезных Ат превзошел их максимальную величину в контрольной группе и составил 1:128, а у двух детей он был на уровне верхней границы в контрольной группе - 1:64. В группе вакцинированных детей значительно реже встречаются титры противотуберкулезных Ат на уровне 1:4 - 1:8. Такие титры были у 4 из 20 человек (20%), а в контрольной группе такой титр зарегистрирован у половины обследуемых.

У вакцинированных детей обнаружено снижение титров противоши-геллезных Ат. Средний уровень этих Ат был в два раза меньше и достоверно ниже, чем в контрольной группе. У семи вакцинированных детей титр противошигеллезных Ат оказался ниже самой низкой цифры в контрольной группе (1:4). В то же время относительно высокие титры Ат (1:32 -1:64) обнаружены у трех человек (15%), а в контрольной группе антитела в таком титре выявлены у 4 детей (40%).

Таблица 2

Титры противотуберкулезных и противошигеллезных Ат и их соотношение у детей, вакцинированных БЦЖ, и детей контрольной группы

Группа обследу емых п Титры противотуберкулезных антител Титры противошигеллезных антител ИСТ

М и пределы колебаний и Р М и пределы колебаний и Р М и пределы ко-леба-ний и Р

Вакцинированные дети 20 38,8 (4-128) 62 >0,05 11,7 (0-64) 74 <0,05 18,9 (1,0-61,0) 40 <0,01

Контрольная группа 10 17,8 (4-64) 21,7 (4-64) 1.7 (0,5-4,0)

Благодаря разной направленности изменения титров специфических и неспецифических Ат установлена значительная разница между группами детей при расчете ИСТ. Средняя величина ИСТ у вакцинированных детей составляет 18,9, а это более чем в 10 раз выше, чем в контрольной группе. Значимое повышение ИСТ выше контрольного значения (4,0), выявлено у 12 вакцинированных детей (60%) при отсутствии положительных результатов в контрольной группе.

ЗАКОНОМЕРНОСТИ АНТИТЕЛООБРАЗОВАНИЯ В РПГА ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ

При исследовании РПГА у больных туберкулёзом, в сравнении с контрольной группой (табл.3), не выявилось существенной разницы в величинах и соотношении средних титров Ат к двум Аг, лишь немного расширился в обе стороны диапазон индивидуальных значений титров (титры противотуберкулёзных Ат - от 0 до 1:128, а титры противошигеллезных Ат - от 0 до 1: 256). Отношение средних титров Ат у больных не отличается от такового у лиц контрольной группы и составляет 1:1,6. Однако в индивидуальных пробах резко изменилась структура отношения титров, разница в их величинах достигла 32 раз, а пределы колебаний отношения титров Ат составляют от 32:1 до 1:32. В соответствии с этим крайне большим оказался разброс величин ИСТ - от 0,03 до 32,0 (среднее значение ИСТ составляет при этом 2,7 ± 0,05). Несмотря на то, что нет разницы в величинах средних титров и в их соотношении, среднее значение ИСТ оказалось достоверно выше у больных туберкулезом по сравнению с контрольной группой. Особенности соотношения титров Ат к туберкулезному и шигеллезному Аг у больных туберкулезом и контрольной группы демонстрирует рис. 1 из которого видно, что реакция проявляется в двух основных вариантах. Депрессивный вариант реакции вариант со снижением титров противотуберкулёз-

Таблица 3

'Гтры противотуберкулезных и лрошвошигеллсзных ангител и их соотношение у больных туберкулезом и в контрольной группе доноров и больных (М ± гп и пределы колебаний)

Отношение средних Число положитель-

титров }г пределы ных результатов

1игры антпгсл колебаний отсюшеши определения РКП"

или] мя п 'ПГфОТ; в ИСТ Всего

груши 1т;итнд\'алыгж; пробах

Противотуберку- !1рОТШК)ШШ«Л- ИСТ - 4,0 ИСТ < 0,5

_________ лезные ЛИ1ГЫС !

Контроль- 61 18,0 ± 1,!? 31,0 1-3,3 1 :2 1,Г> +. 0,1 0 0 0

ная труппл - (4 - 61 ) (2-64) (2:1 1:4 ) ( 0,5 .. 2.0 )

ЬоЛЬНМС 20,0 ± 2,6 31,7 -к 3,5 1 : 2 2.7 Л 0,05 21 зя 59

туберкуле- 100 ( 0 - 128 ) ( 0 - 256 ) ( 32 : 1 -1 : 32 ) ( 0,03 - 32.0) (21%) (38%) (59%)

зе«

_______ __________________________ _________„ _______ ____________'

Примечание: Расчет средней вачнчкны ИС"Т чротв«дсп сножснигм индексов в ннллвндуалькых лроОах.

Контрольная Больные туоеркулезнии пп^шш!

группа

Рис. 1 Соотношение титров противотуберкулезных (1) и противоши-геллезных (2) антител в контрольной группе и у больных туберкулезной инфекцией, ■ '

По оси ординат — титры антител, по оси абсцисс — индивидуальные пробы, расположенные в порядке снижения тлтроя. Горизонтальными линиями обозначены доверительные границы титров антител у доноров.

ных Ат при относительно высоких титрах Ат к шигеллам Зонне с величиной ИСТ ниже 0,5 выявлен у 38 человек (38%). Вариант позитивного реагирования с относительным преобладанием титра противотуберкулёзных Ат при величине ИСТ 4,0 и выше обнаружен у 21 больного туберкулёзом (21%). В пробах с более низким титром противотуберкулёзных Ат значимое повышение ИСТ определилось только снижением титра Ат к шигеллёзному Аг. Другие два варианта изменения антителообразования имели неспецифический характер и выявлялись либо в одновременном значительном повышении титров Ат к обоим Аг, либо в одновременном их снижении до нулевых величин. Последний вариант реакции связан, по-видимому, с депрессией антителообразования. При оценке реакции по величине ИСТ положительный результат выявлен в целом у 59 больных туберкулёзом (59%). В то же время следуег отметить, что титр противотуберкулёзных Ат достиг диагностического значения 1:64 только в 8 исследованиях (8%).

Как было отмечено выше, у лиц контрольной группы при расчёте коэффициента корреляции титров к двум Аг выявляется высокая степень прямой связи (г = 0,99). У больных туберкулёзом соотношение титров Ат приобрело характер отрицательной связи с коэффициентом корреляции г= -0,4, что кардинально отличается от характера этой связи в контрольной группе.

Из группы обследованных больных при оценке РПГА по величине диагностического титра противотуберкулезных Ат (1:64) положительный результат выявлен у 11 человек, но одновременно такой титр выявлен у одного донора. Чувствительность реакции по этому критерию составляет 11%, а специфичность - 75%. Сравнение числа диагностически значимых результатов при оценке РПГА по ИСТ (59 положительных проб) с оценкой по величине диагностического титра (8 специфических положительных проб) означает разницу в чувствительности в 7,5 раз. Если руководствоваться критерием абсолютной специфичности и принять в качестве альтернативного диагностического критерия титр противотуберкулёзных Ат 1:128, то положительная реакция выявлена только у трёх человек (3%). В этом случае при абсолютной специфичности чувствительность реакции составляет всего 3%. Таким образом при одинаковой специфичности чувствительность РПГА при оценке по ИСТ оказывается в 20 раз выше.

Интересный результат дало изучение РПГА у больных туберкулёзом в зависимости от наличия или отсутствия бактериологического подтверждения диагноза. Наличие такого подтверждения свидетельствует об активности бактериального процесса. Отсутствие бактериологического подтверждения свидетельствует, с одной стороны, о более низкой активности процесса, а, с другой стороны, среди больных этой категории могут быть лица с заболеваниями нетуберкулёзной этиологии или вызванными атипичными формами туберкулезных микобактерий. Сравнение двух групп обследуемых показало, что в группе больных с положительным бактериологическим исследованием на момент проведения РПГА отмечается более низкий титр

противотуберкулёзных Ат (М=14.2) по сравнению с группой больных,в которой бактериологическое подтверждение диагноза было зафиксировано задолго до проведения исследования РГ1ГА, а на момент определения титров Ат бактериологическое исследование стало отрицательным (М=31,1). При оценке и сравнении обеих групп больных по величине ИСТ выявляется такая же закономерность. В группе с высевом МБ туберкулёза на момент исследования РПГА среднее значение ИСТ в 2,5 раза меньше, чем среднее значение ИСТ в другой группе (Р < 0,05).

У больных туберкулёзом с бактериологически неподтверждённым диагнозом диагностическая величина титров противотуберкулезных Ат (1:64) выявлена в 7 исследованиях (11,7%), а средняя величина титров противотуберкулёзных Ат равна 1:20,1. При сравнении этой величины со средними величинами титров противотуберкулёзных Ат в группах больных с бактериологическим подтверждением диагноза выявлено, что она занимает промежуточное положение между ними. Достоверной разницы между титрами Ат в этих группах не выявлено. Однако следует отметить, что у 12 больных из 59 человек (20%) с отсутствием бактериологического подтверждения встречаются низкие титры противотуберкулёзных Ат (меньше 1:2). а в группе больных с бактериологическим подтверждением диагноза, не совпадающим с моментом исследования РПГА. только у одного человека из 14 (7%) оказался такой титр. У больных с высоким титром Ат (1:64 -1:128) выявляется обратное - в группе без бактериологического подтверждения из 59 человек высокие титры выявлены у 6 больных (10%), а в другой группе - у трёх из 14 (21,4%).

Экспериментальный анализ эффекта взаимодействия туберкулезного антигена с антителами к мпкобактериям туберкулеза у доноров и больных

туберкулезом

Исследования проведены у 24 больных туберкулезом и у 34 человек контрольной группы (доноры и больные с заболеваниями нетуберкулезной этиологии). У этих больных определение ИСТ выявило либо позитивный вариант реакции, либо отсутствие его изменений. У больных туберкулезом при исследовании выявлены более высокие, чем у доноров, титры противотуберкулезных Ат - в пределах 1:8 - 1:128 с преобладанием титров 1:16 -1:32. У доноров титры Ат колебались в пределах от 1:4 до 1:64. Если оценивать реакцию по абсолютной величине титров Ат, то у больных, по сравнению с донорами, имеется повышение тигров, связанное, по-видимому, с образованием иммунных Ат. Так как среди доноров встречается титр противотуберкулезных Ат 1:64, оценивать реакцию по величине диагностического титра затруднительно.

При исследовании в группах доноров и больных наблюдается существенное различие в характере действия Аг на антитела (рис. 2). В группе доноров установлено значительное угнетающее влияние Аг на титры естественных противотуберкулезных Ат. ИИ оказался выше 0.25 только в двух

больные туберкулезом

Рис.2. [Влияние туберкулезного антигена на противотуберкулезные антитела в контрольной группе и у больных туберкулезом Г"' - исходный титр противотуберкулезных антител ЕЗ - титр антител после добавления антигена

По оси ординат - тигр аншгсл. по оси пбсцисс - индивидуальные пробы

исследованиях, а у остальных обследуемых величина ИМ была на уровне 0,25 и ниже. У больных туберкулезом при идентичных исходных титрах Ат величина ИИ снижалась менее существенно. Лишь в двух исследованиях она достигла 0,25, а в остальных была на уровне 0.5 и выше. Следует отметить. что нейтрализующее влияние туберкулезного Аг в группе доноров с высокими титрами противотуберкулезных Ат (1:64) менее выражено, чем в группе доноров с низкими титрами противотуберкулезных Ат. V больных наблюдается обратная тенденция: чем выше титры противотуберкулезных Ат, тем сильнее они угашаются Аг. а при низких титрах Ат нейтрализующее влияние Аг выражено меньше. Этот эффект наблюдается во всех группах,выделенных с учетом исходных титров Ат, и подтверждается сравнением средней разницы величии индексов ингибишш специфических Ат (1111) у контрольных лиц н больных туберкулезом. Так, в группах обследованных больных туберкулезом с титром противотуберкулезных Ат 1:64 - 1:128 средняя величина ИИ в два раза выше, чем в аналогичной группе доноров. При исходном титре 1:32 средняя величина ИИ в три раза выше, при исходном титре 1:16 - в четыре раза выше, при исходном штре 1:8 - в пять раз выше. Таким образом обнаруживается неоднозначный эффект действия туберкулезного А г. Высокое нейтрализующее действие Аг обнаруживается в зоне высоких исходных титров противотуберкулезных Ат. а в зоне низких значений исходных титров у больных эффект низкий или наблюдается тенденция к стимулирующему влиянию Аг на титры прошвотуберкулезных Ат. Анализ полученных материалов выявил положительную реакцию у 22 человек из 24 обследуемых больных туберкулезом. Суммарно по данным исследования, специфичность реакции составила 97.0%. а чувствительность - 91,7%. Учитывая полученные результаты, можно заключить, что при использовании в качестве критерия РПГА индекса ингибиции увеличиваются диагностические возможности реакции.

ВЫВОДЫ

1.Для оценки титров противотуберкулезных антител в РПГА разработан оригинальный методический подход с оценкой реакции по соотношению титров специфических (противотуберкулезных) и неспецифических (противошигеллезных) антител. Метод технически прост и дает возможность использовать для ее оценки унифицированный количественный критерий. В сравнении с оценкой по диагностическому титру новый способ определения РПГА повышает ее чувствительность в 7.5 раз при сохранении абсолютной специфичности. Новая методика позволяет эффективно использовать эритроци т арные диагностикумы с разным уровнем специфической активности.

2. При исследовании РПГА у детей, вакцинированных ВЦЖ. обнаружена 1енденцня к повышению титров противотуберкулезных Ат и достоверное снижение титров противошигеллезных Ат в сравнении с показате-

1Ь

лями контрольной группы детей. При расчете ИСТ обнаружено 10-кратное возрастание его значения по сравнению с контрольной группой и альтернативное повышение величины индекса у 60% вакцинированных детей.

3. У больных с впервые выявленным активным туберкулезом легких не обнаружено существенной разницы средних титров антител к микобак-териям туберкулеза в сравнении с титрами антител в контрольной группе доноров и лиц с заболеваниями нетуберкулезной этнологии, но у больных туберкулезом определяется резкое изменение соотношения титров противотуберкулезных и противошигеллезных антител, которое выявляется либо в форме относительного преобладания титра противотуберкулезных антител (21% положительных результатов), либо в форме их специфического снижения при относительно высоких титрах противошигеллезных антител (38% положительных результатов).

4. Характер РПГА у больных туберкулезом зависит от активности бактериального процесса. В период выделения микобактерий выявляются более низкие титры противотуберкулезных антител, а в период прекращения выделения микобактерий они существенно выше. У больных туберкулезом без бактериологического подтверждения диагноза РПГА носит такой же характер, как у больных туберкулезом в период прекращения выделения микобактерий.

5. У больных туберкулезом при исследовании взаимодействия in vitro сыворотки или плазмы крови с туберкулезным антигеном наблюдается менее существенное тормозящее влияние антигена на титры противотуберкулезных антител в сравнении с группой доноров и больных с заболеваниями нетуберкулезнон этиологии. Этот эффект может быть использован для повышения эффективности диагностики туберкулеза. Он позволяет получить положительный результат у 92" « больных туберкулезной инфекцией.

Практические рекомендации

1.Для диагностики туберкулеза рекомендуется оценивать РПГА по соотношению титров противотуберкулезных и противошигеллезных Ат. Диагностическим критерием реакции является сдвиг соотношения титров антител в 4 раза в ту или в другую сторону по сравнению с контрольной группой.

2. Эффективная диагностика туберкулеза может быть произведена при использовании в РПГА эритроцитарных диагностикумов с истекшим сроком годности до 5 лет. при условии сохранения специфической активности диагностику.ма и референс-сывороткн.

3. Для повышения эффективности диагностики туберкулеза рекомендуется определять in vitro устойчивость противотуберкулезных Ат к нейтрализующему действию туберкулезного антигена. У контрольной группы больных и здоровых доноров туберкулезный антиген снижает титр противотуберкулезных антител в 4 и более раз. у больных туберкулезом, при идентичных исходных титрах, снижение их не более чем в 2 раза или полностью отсутствует.