Трансгликозилирование природных и модифицированных нуклеозидов термостабильными нуклеозидфосфорилазами Geobacillus Stearothermophilus

Таран, Сергей Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Трансгликозилирование природных и модифицированных нуклеозидов термостабильными нуклеозидфосфорилазами Geobacillus Stearothermophilus
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Трансгликозилирование природных и модифицированных нуклеозидов термостабильными нуклеозидфосфорилазами Geobacillus Stearothermophilus"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

ТАРАН СЕРГЕЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

ТРАНСГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ ПРИРОДНЫХ И МОДИФИЦИРОВАННЫХ НУКЛЕОЗИДОВ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫМИ НУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗАМИ СЕОВАСШШ Б ТЕЛIIОТПЕЯМОРН/£

специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 6 МАЙ 2011

Москва-2011

4848025

Работа выполнена в группе технологи синтеза нуклеиновых кислот и компонентов нуклеиновых кислот Филиала учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и К).А. Овчинникова

Научные руководители: доктор химических наук, академик РАН

Мирошников Анатолий Иванович

кандидат биологических наук, с.н.с. Феофанов Сергей Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, в.н.с.

Ротанова Татьяна Васильевна

доктор химических наук, в.н.с. Сидоров Георгий Васильевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта

Защита диссертации состоится « /Г » июня 2011 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.

Автореферат разослан « /2.» мая 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физ.-мат. наук

Олейников В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Природные нуклеозиды и их модифицированные аналоги находят широкое применение в составе химиотерапевтических препаратов для лечения ряда вирусных, онкологических, аутоиммунных и других заболеваний. Кроме того, их используют для синтеза и поиска новых соединений, представляющих интерес в различных областях фармакологии, а также в качестве предшественников при синтезе олигонуклеотидов, применяемых в диагностических и терапевтических целях.

Традиционно для получения нуклеозидов и их модифицированных производных используется многостадийный химический синтез. Во многих случаях ключевой стадией процесса является формирование М-гликозидной связи. Химические способы образования этой связи дают удовлетворительные результаты в случае получения нуклеозидов рибо-ряда. Однако при синтезе 2'-дезоксирибонуклеозидов и р-£)-арабинофуранозилнуклеозидов, как правило, образуются смеси регио- и стереоизомеров разделение которых требует использования дорогостоящих носителей, больших затрат сырья и реагентов, а также утилизации токсических отходов производства, что не отвечает экологическим требованиям современной биоиндустрии. Альтернативным способом образования М-гликозидной связи при получении природных нуклеозидов и их модифицированных аналогов является биосинтетический процесс, катализируемый М-дезоксирибозилтрансферазами (КФ 2.4.2.6) или нуклеозидфосфорилазами микроорганизмов [пуриннуклезидфосфорилаза (РиИР; КФ 2.4.2.1), тимидинфосфорилаза (ТР; КФ 2.4.2.4) уридинфосфорилаза (иР; КФ 2.4.2.3)]. Из них, благодаря широкой субстратной специфичности, более подходящими биокатализаторами для промышленного применения признаны нуклеозидфосфорилазы.

В присутствии ортофосфата нуклеозидфосфорилазы катализируют обратимый фосфоролиз рибо-, арабино- и дезоксирибонуклеозидов до пентозо-1-фосфата и соответствующих оснований, а также фосфатзависимый перенос пентозы между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями или нуклеозидами (трансгликозилирование) с образованием нуклеозидов, отличных от исходных, по схеме:

Основным преимуществом биоконверсии перед химическим синтезом является абсолютная регио- и стереоспецифичность катализируемых нуклеозидфосфорилазами процессов. Кроме того, эти ферменты не требуют никаких кофакторов, и реакции могут протекать в простых экологически и технологически безопасных водных буферах.

Нуклеозид + Р1 <-> Пентозо-1-фосфат + Основание

мезофильных бактерий, но не лишены недостатков. Применение целых клеток приводит к тому, что конечный продукт может быть загрязнен бактериальным содержимым и требует тщательной очистки и мониторинга качества получаемой субстанции фармпрепарата. При том, что нуклеозидфосфорилазы мезофильных бактерий имеют температурный оптимум в районе 55-65°С, они не могут продолжительное время сохранять ферментативную активность при такой температуре вследствие низкой термостабильности. Такие функциональные ограничения биокатализаторов могут играть отрицательную роль в случаях, когда требуются особые условия реакции. Например, для обеспечения высокой концентрации малорастворимых пуриновых оснований, нуклеозидов и их модифицированных аналогов при проведении процессов трансгликозилирования в условиях повышенной температуры и/или экстремальных значений рН. Такие условия обычно приводят к дестабилизации четвертичной и третичной структур белка и, в конечном итоге, к потере ферментативной активности. Поэтому актуальной научно-практической задачей для разработки методологии синтеза нуклеозидов и их производных является изучение ферментов термофильных микроорганизмов, в том числе, стабилизированных иммобилизацией, поскольку они могут обеспечивать целый ряд преимуществ по сравнению с ферментами мезофильных микроорганизмов или их целыми клетками при использовании в качестве биокатализаторов:

• ферментативная реакция может протекать длительное время при высокой температуре;

• проведение реакции при повышенной температуре обеспечивает большую концентрацию слаборастворимых в водных буферах производных нуклеозидов и оснований;

• термостабильные рекомбинантные ферменты могут быть легко очищены от термолабильных белков штамма-хозяина простым прогреванием клеточных лизатов;

• интерферирующие ферментативные активности ингибируются высокой температурой реакции, что позволяет использовать грубые или обогащенные ферментные препараты термостабильных нуклеозидфосфорилаз;

• биореакторы, работающие на основе термостабильных ферментов, устойчивы к бактериальной контаминации.

Цели и задачи работы

Основной целью настоящего исследования являлась разработка эффективного биокаталитического процесса, основанного на ферментативном трансгликозилировании ряда природных, а также модифицированных нуклеозидов, с использованием ферментных препаратов генно-инженерных нуклеозидфосфорилаз из термофильных бактерий СеоЬасШш хГеагоМегторЬИш штамма В-2194.

Для достижения основной цели в ходе работы решались следующие задачи:

1. Клонирование генов пуриннуклеозидфосфорилазы II (PuNPII) и пиримидиннуклеозидфосфорилазы (PyNP) из G.stearothermophilus, оптимизация генетических конструкций, создание рекомбинантных штаммов-продуцентов и разработка методов получения ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз, в том числе иммобилизованных.

2. Сравнение каталитических свойств полученных ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus и родственных ферментов E.coli в реакциях трансгликозилирования и фосфоролиза нуклеозидов.

3. Разработка методов получения комбинированных ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз, подбор соотношений активностей и количества ферментов, условий иммобилизации. Изучение условий трансгликозилирования природных и модифицированных гетероциклических оснований и нуклеозидов в различных температурных режимах с использованием полученных ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilits.

4. Разработка способа синтеза (регламентов и технологических схем) 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (Кладрибина) с использованием ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз.

Научная новизна и практическая значимость работы

В работе впервые показан ряд преимуществ использования ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз по сравнению с ферментами мезофильных микроорганизмов или целых клеток, применяемых в известных технологиях получения нуклеозидов ферментативным трансгликозилированием. В ходе работы проведены исследования по клонированию генов и получению штаммов-продуцентов пуриннуклеозидфосфорилазы II и пиримидиннуклеозидфосфорилазы из G. stearothermophilus В-2194. Разработан способ получения ферментных препаратов из созданных штаммов-продуцентов и охарактеризована их активность в реакциях фосфоролиза и трансгликозилирования природных и модифицированных нуклеозидов. Показана возможность эффективного применения ферментных препаратов иммобилизованных

нуклеозидфосфорилаз для биотехнологического получения ряда фармацевтических субстанций: 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (субстанция препарата "Кладрибин"); 9-р-£)-арабинофуранозил-2-фтораденина (субстанция препарата "Флударабин"); 1 -ß-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-З-карбоксамида (субстанция препарата "Рибавирин"), а также природных нуклеозидов. Разработаны методики и технологические регламенты биотехнологического синтеза и выделения 2-хлор-2'-дезоксиаденозина из реакционной смеси ионообменной хроматографией на сорбентах отечественного и импортного производства (Dowex2x8, AB 17x2) с использованием экологически и технологически безопасных элюентов и реактивов. Наработаны опытные партии препарата 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (суммарно более 200 г) в соответствии с разработанным лабораторным регламентом и требованиями,

предъявляемыми к субстанциям фармацевтических препаратов. Создан "биотехнологический инструментарий", который может использоваться для получения широкого спектра как уже исследованных, так и новых препаратов нуклеозидной природы для нужд медицины и других целей.

Публикации и апробация работы

По результатам диссертационной работы опубликовано четыре статьи в рецензируемых научных журналах, включённых в список ВАК. Получен Патент РФ № 2230118 от 10.07.2004. Результаты исследования были представлены на российских и международных конференциях: VIII чтениях памяти академика Ю.А.Овчинникова, (Москва-Пущино, 2006), Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», (Москва, 2009), VII Всероссийской конференция "Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009" (Уфа, 2009) и Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва-Пущино, 2009).

Структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, посвященного нуклеозидфосфорилазам бактерий и их использованию, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ссылок. Работа изложена на

страницах, содержит рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Клонирование_генов,_экспрессия_и_выделение

иуриннуклеозидфосфорилазы II и пиримндиниуклеозидфосфорилазы из G. stearothermophilus В-2194

Штамм Geobacillus stearothermophilus В-2194 (DSM494, NCTC10003), был приобретен во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ, Пущино). Это типовой штамм, растущий при 60-65°С, и используемый как стандарт в контроле на стерильность питательных сред после автоклавирования. Бациллы продуцируют два типа пуриннуклеозидфосфорилаз:

пуриннуклеозидфосфорилазу I (PuNP I), которая катализирует обратимый фосфоролиз инозина и гуанозина и структурно подобна нуклеозидфосфорилазам млекопитающих; и пуриннуклеозидфосфорилазу II (PuNPII), которая катализирует обратимый фосфоролиз всех пуриновых нуклеозидов, включая аденозин и 2'-дезоксиаденозин и имеет структурное сходство с пуриннуклеозидфосфорилазой E.coli. Фермент PuNPII, ввиду своей широкой специфичности в отношении пуриновых оснований, может быть пригоден для получения различных аналогов пуриновых нуклеозидов, в том числе 2-хлор и 2-фтор производных аденозина, дезоксиаденозина и арабинозиладенина (Ага-А). Пиримидиновые нуклеозидфосфорилазы у

бактерий рода GeobaciUus в отличие от Е.coli представлены одним ферментом - пиримидиннуклеозидфосфорилазой (PyNP).

Биомассу штамма G. stearothermophilus В-2194 выращивали на средах, рекомендованных специалистами ВКМ. Выделение геномной ДНК из полученной биомассы проводили как описано [Saito и Miura, 1963]. Для клонирования генов нуклеозидфосфорилаз методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), использовали олигонуклеотидные праймеры (Таб.1), синтезированные исходя из известных нуклеотидных последовательностей нуклеозидфосфорилаз родственного штамма В .stearothermophilus ТН6-2 [Hamamoto, 1997].

Таблица 1. Праймеры для клонирования пиримидиннуклеозидфосфорилазы (PyNP) и пуриннуклеозидфосфорилазы II (PuNPII)

Название Последовательность (5'—>3')

Прямой PyNPBst3 AGAATTCATATGAGCGTTCATATTGGTGC

Обратный PyNPBst4 TGGATCCTATTATTGGCGAATCGCTGTTTCAAGAGC

Прямой PuNPBstl AGAATTCATATGAGCGTTCATATTGGTGC

Обратный PuNPBst2 TGGATCCTATTATTGGCGAATCGCTGTTTCAAGAGC

Прямой PuNPBst5 AGC(T)A(G)AAGATAAAAAGGTG(T)C(T)TG(A)TATCG

Обратный PuNPBstö GAG(A)AAGCGG(A)CAT(G)ATGCGG(A)GCT(G)GAGGC

Контрольный PuNPBst7 GCGAAATACATTGCGGAAACC

В результате оптимизации условий амплификации с соответствующими олигонуклеотидами был получен гомогенный фрагмент ДНК, содержащий ген Ру№ в. .^еагоЛегторкНт В-2194 (олигонуклеотиды Ру№Вз13 и Ру№Вз14). Ген РиИРП в клонированных фрагментах обнаружен не был (олигонуклеотиды Р^РВбИ и Ри№В512), поэтому для амплификации и клонирования гена Ри№11 были использованы новые олигонуклеотидные праймеры (РиЫРВз15 и РиНРВ51б), синтезированные на основе сравнения доступных последовательностей геномов рода СеоЬасШш и содержащие консервативные участки генов фланкирующих предполагаемое местоположение гена РиЫРП. Определение целевого продукта амплификации проводили гибридизацией по Саузерну с использованием 32Р-меченного 21-членного олигонуклеотида (РиЫРВз17), соответствующего консервативной области

пуриннуклеозидфосфорилаз бактерий (Таб.1, Рис.1).

После проведения ПЦР, выявленные гибридизацией фрагменты ДНК клонировали в векторе р1ГС19 и проверяли их последовательность секвенированием по методу Сенгера. По результатам секвенирования было установлено, что клонированный фрагмент ДНК содержит искомую последовательность РиКРП.

Маркер VHindlll

+EcoRI

2027 _

1904 1584 — 1375 —

947 _

831 —

564 —

Рис.1 Электрофоретический анализ в 1% агарозном геле продуктов амплификации гена PuNPII. а) результаты амплификации (ПЦР) геномной ДНК G.stearothermophilus В-2194 с праймерами PuNPßst5 и PuNPBstó (концентрация MgCU в ПЦР ЗмМ (1) и 1мМ (2)). Ь) выявление в продуктах амплификации целевых фрагментов гибридизацией по Саузерну с '2Р-меченным зондом (PuMPBst7) на консервативную область гена PuNPII (соответственно дорожки 3 и 4).

Однако, 5'- и 3'- концевые участки полученного гена существенно отличались от соответствующих участков гена пуриннуклеозидфосфорилазы B.stearothermophilus ТН6-2, чем объяснялось отсутствие продуктов амплификации при использовании начальной пары праймеров (PuNPBstl и PuNPBst2), основанной на указанной последовательности. В дальнейшем была установлена практически полная гомология обнаруженной последовательности гена PuNPII G.stearothermophilus В-2194 с соответствующими участками геномов G.kaustophihts НТА426 и G. thennodenitrifikans NG80-2, которые появились в открытых базах данных позднее.

Полученные гены нуклеозидфосфорилаз субклонировали в экспрессионный вектор рЕТ28а(+) (Novagen) по сайтам Nhel и Hind III. Конструкции pBstPNPIl и pBstPyNP, обеспечивающие устойчивость клеток Е.соЧ к антибиотику канамицину, анализировали рестрикционным анализом на предмет сохранения правильной рамки считывания и расположения регуляторных элементов конструкции, обеспечивающих эффективность экспрессии. Для проведения экспрессии под контролем промотора фага Т7 служил штамм Е.соЧ BL21(DE3) (F-, отрТ, hsd Sb(rb-, mb-), dem, gal, (DE3), pLysS.Cmr). Штаммы E.coli BL21(DE3)/pBstPNPH и BL21(DE3)/pBstPyNP, продуцирующие соответственно PuNPII и PyNP G.stearothermophilus BKM-2194, использовали для получения термостабильных нуклеозидфосфорилаз и исследования их свойств в реакциях фосфоролиза и трансгликозилирования природных и модифицированных нуклеозидов.

коа 1 2 3 4 5 6

__Рис.2 Электрофореграмма в 12%

БОБ-ПААТ белков тотальных клеточных лизатов штамма Е.соИ 66-2— '; ' ВЬ21 (ОЕЗУрЕЫРз/ЫР,

продуцирующего РуЫР -м» <§|р 48.8 СМеагойегторИИиз ВКМ-2194:

1 - клеточный лизат до индукции, 2,3 и 4 - клеточный лизат 35.0— т соответственно через 1, 3 и 6 часов

45.0-

25.0-

18.4-

после индукции 0.2 мМ 1РТС,

5 - маркер молекулярных масс белков,

6 - контрольный препарат очищенного РуТМР.

При культивировании продуцентов на богатой питательной среде оба фермента накапливались в клетках штамма-продуцента; выход нуклеозидфосфорилаз при индукции культуры 0.2 мМ 1РТО, по данным БОЗ-ПААГ, достигал 20-40% суммарного клеточного белка. Молекулярная масса рекомбинантных белков соответствовала теоретическим данным, выведенным из аминокислотной последовательности, и составляла около 28 и 48 кДа, для Р1ЛЧРП и Ру№ соответственно. По результатам электрофореза максимальное количество Ру№ определялось через 6 часов после индукции (Рис.2), а в случае экспрессии РЦЫРП накопление целевого фермента останавливалось уже через 1 час после добавления 1РТС (Рис.3).

1 23456 789

.«I

«н» •****•

в* ... Й»

кРа

-116.0

-66.2 -45.0

—35.0

---25.0

1Я«|:- 1 8.4

Рис.3 Электрофореграмма в 12% 805-ПААГ клеточных белков штамма ВЬ21(ОЕЗ), продуцирующего РиТМР11 (лЛейтогЛепиор/н/гы: 1- клеточный лизат до индукции, 2,3 и 4- клеточный лизат через 1, 3 и 6 часов после индукции 0.2 мМ 1РТС, 5 и 9- маркер молекулярных масс белков, 6- контрольный препарат очищенного РаЫРП,

7- нерастворимая фракция клеточных белков (тельца включений),

8- растворимая фракция клеточных белков

kDa 1 2 3 4 5

Рис.4 Электрофоретический анализ в 12% вОЗ-ПААГ белковых фракций РуЫР С.51еаго1кегтор1гИи5 ВКМ-2194 в ходе получения ферментного препарата:

1- маркер молекулярных масс белков,

2- тотальный клеточный лизат через 6 часов после индукции 0.2 мМ 1РТС,

3- нерастворимая фракция клеточных белков (осадок),

4- растворимая фракция клеточных белков (супернатант),

5- супернатант после прогревания в течение 30 мин при 70°С и последующего осаждения термолабильных агрегатов (конечный ферментный препарат РуЫР).

116 —

66.2—

/сп ЧЯг

45.U— ЩЩ

—48.8

* щ

айв

35.0—-**"

йв

25 0—

18 4— 1 -

В ходе анализа ферментативной активности нуклеозидфосфорилаз в полученной биомассе было установлено, что активность PuNPII не превышала уровней отрицательного контроля (штамм BL21(DE3) без плазмид), а практически весь белок накапливался в виде телец включений. В случае PYNP, наоборот, весь фермент после разрушения клеток ультразвуком обнаруживался в супернатанте и имел высокую активность (Рис.4).

Предполагаемая высокая температурная стабильность рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus, подтвердилась при проведении очистки ферментного препарата PyNP от белков штамма-хозяина путем прогревания клеточных лизатов в течение 30 мин при 70 °С и последующего осаждения термолабильных белковых агрегатов высокоскоростным центрифугированием. Полученный препарат имел чистоту около 80-85% по целевому белку и не содержал интерферирующих активностей. Производительность полученного штамма-продуцента PyNP составляла 283±22 мг белка ферментного препарата из 1 литра культуры. Характеристика конечного ферментного препарата PyNP представлена в табл.2.

В отношении накапливающегося в клетках в виде телец включений фермента PuNPII G.stearothermophilus ВКМ-2194, экспрессированного с клонированной природной последовательности в штамме E.coli BL21(DE3)/pBstPuNPII, возникли вопросы, связанные с его выделением в активном виде. Путем оптимизации условий культивирования (температура инкубации, pH среды), а также заменой штамма-хозяина E.coli (3 штамма) были исследованы возможности получения экспрессии белка в растворимой форме. Все эти попытки не дали удовлетворительного результата - фермент образовывал нерастворимые агрегаты. Варианты ренатурации из телец также оказались малоэффективными (процент ренатурированного белка не

превышал 10%) и, кроме того, экономически нецелесообразными для использования в биотехнологии получения модифицированных нуклеозидов.

Подробный анализ последовательности гена PuNPII G.stearothermophilus ВКМ-2194 выявил около 30 кодонов, редко представленных в пуле тРНК E.coli [Hensut and Danchin, 1996]. В том числе, по два очень редких кодона CGG и CGA (кодируют Arg), 6 кодонов GGA (Gly), 2 кодона TTG и 1 ТТА (Leu), 2 кодона АСА (Thr) и ряд других. Возможно, что наличие редких кодонов сильно замедляет трансляцию белка и способствует неправильному фолдингу и агрегации молекул. Поэтому было принято решение произвести полный синтез оптимизированной последовательности гена PuNPII (всего около 100 нуклеотидных замен) с учетом предпочтений использования кодонов-синонимов для экспрессии в E.coli . Синтетический ген субклонировали в тот же экспрессионный вектор рЕТ28а(+) (Novagen) т.е. аналогично полученной ранее природной конструкции. Экспрессию природной pBstPuNPII и синтетической pBstPuNPIIs конструкций проводили в штамме E.coli BL2I(DE3).

По данным электрофореза (Рис.5) установлено, что в отличие от природной конструкции pPuNPIl, синтетическая pPuNPIIs, в условиях экспрессии в штамме E.coli BL21(DE3), обеспечивала содержание целевого белка в растворимой фракции на уровне более 60% от суммарного. Кроме того, при экспрессии конструкции pPuNPIIs в штамме E.coli C41(DE3) и инкубировании культуры при 30°С достигался еще больший выход PuNPII G.stearothermophilus ВКМ-2194 в растворимом активном состоянии, а после

1 2 3 4 5 6 kDa

_-j -j g Рис.5 Электрофоретический анализ

в 12% SDS-ПААГ белковых фракций PuNPII

— 66.2 G.stearothermophilus ВКМ-2194 в

ходе получения ферментного

_45 0 препарата с использованием

конструкций pBstPuNPII и фр pBstPuNPIIs в штамме E.coli

— 35.0 BL21(DE3):

1- тотальный клеточный лизат штамма E.coli BL21(DE3/

_25 0 PBstPuNPII через 6 часов после

индукции 0.2 мМ IPTG

2- нерастворимая фракция _g 4 клеточных белков (осадок),

конструкция pBstPuNPII

3- растворимая фракция клеточных белков (супернатант), конструкция pBstPuNPII

4- маркер молекулярных масс белков,

5- нерастворимая фракция клеточных белков (осадок), конструкция pBstPuNPIIs

6- растворимая фракция клеточных белков (супернатант), конструкция pBstPuNPIIs

28.2'

Рис.6 Электрофоретический анализ в 12% SDS-ПААГ белковых фракций PuNPII G.stearothermophilus ВКМ-2194 в ходе получения ферментного препарата с использованием конструкций pBstPuNPlIs в штамме E.coli C41(DE3): 1- клеточный лизат до индукции,

2,3 и 4- клеточный лизат через 1, 3 и 6 часов после индукции 0.2 мМ 1PTG,

5 - маркер молекулярных масс белков,

6- нерастворимая фракция клеточных белков,

7- растворимая фракция клеточных белков (супернатант),

8- супернатант после прогревания в течение 30 мин при 70°С и последующего осаждения термолабильных агрегатов (конечный ферментный препарат PuNPil).

прогревания супернатанта в течение 30 мин при 70 °С чистота ферментного препарата составляла около 90% (Рис.6).

Производительность полученного штамма-продуцента PuNPII составляла 364±43 мг белка ферментного препарата из 1 литра культуры. Характеристика конечного ферментного препарата PuNPII представлена в табл.2.

Таблица 2. Характеристика ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus, выделенных из рекомбинантных штаммов E.coli

Штамм Ферментный препарат Концентрация белка, мг/мл Удельная активность, ед/мг белка*

C41(DE3)/pBstPuNPIIs PuNPII 8.3±1.2 55±4

BL21 (DE3)/pBstPYNP PyNP 7.8±1.4 112±7

* Активность определена по реакции фосфоролиза соответствующих субстратов (для РиКРП - инозин, для РуЫР - тимидин); за 1 ед.акт. принимали такое количество фермента, которое превращает 1мкмоль нуклеозида за 1 мин при 37 °С

Таким образом, полученные генно-инженерные бактериальные штаммы, обеспечивают высокий уровень продукции рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз термофильных бактерий С.$1еаго1ЬегторЫ1т, что открывает широкие возможности для их использования в качестве подходящих источников нуклеозидфосфорилаз в биотехнологии получения природных и/или модифицированных нуклеозидов.

■•-•л

kDa I Z Ö 4 О О 1 ö

116 -

66.245.0- ¡3

w» -тт-

Ш§» -w» mm mm «рШ

35.0- у;

. —28.2

25.0— «•-«»

18.4—

Иммобилизация_рекомбннантных_нуклеозидфосфорилаз

G.stearotliermopliilus В-2194, исследование их свойств и использование в реакциях фосфоролиза и трансгликозилирования природных и модифицированных нуклеозидов

Охарактеризованные ферментные препараты рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus и E.coli иммобилизовали на аминопропилированном макропористом стекле AP-CPG-170, обработанном предварительно глутаровым альдегидом. В присутствии боргидрида натрия образуется ковалентная связь между альдегидными группами глутарового альдегида и аминогруппами сорбента и белка. В литературе описаны попытки иммобилизации нуклеозидфосфорилаз, выделенных из Bacillus stearothermophilus, обратимой сорбцией на анионообменной смоле [Hori N., 1991]. При малых потерях активности нуклеозидфосфорилаз в результате процесса иммобилизации, этот подход не позволил, тем не менее, создать биокатализатор, достаточно стабильный для синтеза, например дезоксигуанозина, требующего экстремальных условий температуры и pH. В то же время известны примеры того, что ковалентная иммобилизация нуклеозидфосфорилаз обеспечивает стабилизацию четвертичной структуры ферментных комплексов и способствует расширению диапазона условий применения иммобилизованных ферментных препаратов (ИФП) [Zuffi G., 2004, Ubiali D., 2004] в сторону более высоких температур и широких значений pH.

В настоящем исследовании предложены новые условия ковалентной иммобилизации нуклеозидфосфорилаз на твердом носителе путем добавления в реакцию стабилизирующих (инозин и тимидин, MgCl2) и адьювантных добавок (Twin-20, BSA), позволивших, с одной стороны, сохранить активность ферментов (около 70% исходной активности), а, с другой - обеспечить полное отсутствие десорбции белка с носителя (табл.3) при дальнейшем применении.

Таблица 3. Характеристика ИФП нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus

Иммобилизованный ферментный препарат Концентрация белка, мг/мл носителя Удельная активность, ед/мг белка

PuNPII 18.8±0.8 36±6*

PyNP 19.0±0.5 74±8*

(PuNPII+PyNP) 1:1 18.9±0.7 15±2**

(PuNPlI+PyNP) 2:1 18.4±0.7 12±2**

(PuNPII+PyNP) 1:2 19.1±0.9 19±3**

* Активность определена по реакции фосфоролиза соответствующих субстратов (см. примечание к табл. 2) ** Активность определена по способности катализировать реакцию трансгликозилирования при синтезе (1Ас1о из тимидина и аденина, за 1 ед.акт. в реакции трансгликозилирования принимали количество фермента в составе ИФП, обеспечивающего синтез 1мкмоль с1Ас1о за 1 ч при 75 °С

Кроме того, наличие индивидуальных ферментов, выделенных из штаммов-продуцентов, позволило получать как моноферментные, так и биферментные ИФГ1, и, в зависимости от условий синтеза определенных нуклеозидов, гибко варьировать соотношение активностей иммобилизованных ферментов при соиммобилизации белков на носитель.

В ходе работы были получены данные о стабильности ИФП нуклеозидфосфорилаз СМеагсяЬегторНИт в широком диапазоне значений рН и температуры. Оптимум рН для ИФП в реакции трансгликозилирования в целом совпадал с оптимумом неиммобилизованных нуклеозидфосфорилаз (рН 7.5-8.0), но область значений, при которой фермент сохранял полную стабильность, была шире (рН 6.5-11.5). Оптимум температуры при синтезе с1Ас1о варьировал от 80 °С (при соотношении по активности РиИРП к РуИР 2:1) до 86 "С (при соотношении по активности РиК'РП к РуМР 1:2), что на 5-10 °С выше температурного оптимума для неиммобилилизованных нуклеозидфосфорилаз СМеаго^егторЫЫз (Рис.7).

Рис.7 Влияние температуры на активность жидких (/) и иммобилизованных (2) ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus. За 100% принимали максимальную глубину синтеза dAdo (соотношения активности ферментных препаратов PuNPll к PyNP — 1:2). Реакционную смесь объемом 5 мл, содержащую 20 мМ аденин и тимидин, 1мМ К-фосфат рН 7.5, 0,5 ед ферментного препарата инкубировали в течение 30 мин при различной температуре. Образцы анализировали ВЭЖХ на колонке Fenomenex С18 5ц (3x150 мм). В качестве элюента использовали 5% MeCN в 10 мМ КН2Р04 рН3.5 при скорости 0.5 мл/мин.

Рис.8 Стабильность при 70 °С иммобилизованных (/. 3) и иеиммобилизованных жидких (2. 4) ферментных препаратов нуклеозидфоефорилаз G.slearothermopluhis: /. 2- PuNPII; 3, 4- PyNP. За 100% принимали максимальную глубину превращения субстрата (для PuNPII - инозин, для PyNP - тимидин) ферментом в начальный момент времени его температурной инкубации.

У ИФП также значительно увеличивалась температурная стабильность по сравнению с жидкими ферментными препаратами нуклеозидфоефорилаз (Рис.8). Температурная стабильность ИФП нуклеозидфоефорилаз G.siearolhermophiius была исследована в серии реакций трансгликозилирования с получением dAdo при 60 и 70°С в сравнении с ИФП нуклеозидфоефорилаз E.coli. Для каждого значения температуры использовали один и тот же образец биокатализатора с общим временем инкубирования около 340 ч (14 сут). Полученные результаты демонстрируют относительное убывание каталитической активности ИФП нуклеозидфоефорилаз G.stearothermophilus за 24 ч примерно на 1% при 60 и около 9% при 70 °С.

В то же время ИФП нуклеозидфоефорилаз E.coli в аналогичных условиях теряют 8 и 45% активности, соответственно (Рис.9). Эти данные подтверждают большую стабильность ферментных препаратов термофильных микроорганизмов в реакциях трансгликозилирования нуклеозидов. Особенно это очевидно для пиримидинспецифичных фосфорилаз, термостабильность которых является лимитирующим фактором в реакции биоконверсии.

Обеспечив высокую стабильность ИФП, в ходе исследования получали воспроизводимый выход dAdo при многократном использовании одного и того же образца ИФП нуклеозидфоефорилаз (более 20 циклов). Отделение ИФП от реакционной смеси производилось путем фильтрования через стеклянный фильтр и перенесения ИФП в следующие реакции биоконверсии.

Рис.9 Температурная стабильность PuNPII и PyNP G.stearothermophilus (соответственно / и 2), пуриннуклеозидфосфорилазы и тимидинфосфорилазы E.coli (соответственно 3 и 4) в реакции получения dAdo при 60 (/, 3) и 70 °С (2, 4). За 100% принят теоретически возможный выход целевого dAdo при полном превращении аденина, внесенного в реакцию.

Из полученных данных следует, что трансгликозилазная активность ферментного препарата при 20-кратном использовании снижалась приблизительно на 0.6-0.7% за цикл при 70 °С, что представляется достаточно хорошим показателем и обеспечивает технологическую перспективу для полученных ИФП. Кроме того, благодаря высокой удельной активности ИФП удалось достигнуть более 80% глубины превращения за 4-10 ч при содержании биокатализатора в реакционной смеси всего 1-5% (по объему). Это позволило эффективно использовать полученные ИФП для проведения реакций трансгликозилирования с широким спектром субстратов, в том числе, плохо растворимых, таких как гуанин, а также для синтеза фармацевтически значимых препаратов: 2-хлор-2'-дезоксиаденозин (2CldAdo), 9-ß-D-арабинофуранозил-2-фтораденин (2FaraA), 1 -ß-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида (Рибавирин) и ряда природных нуклеозидов (Табл.4). Некоторые модифицированные производные нуклеозидов могут быть получены с использованием моноферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз, например, в реакцию синтеза Рибавирина вносили только ИФП PuNPII. Простота и универсальность данного подхода позволяют масштабировать процесс и нарабатывать опытные партии модифицированных нуклеозидов в количествах достаточных для проведения биологического тестирования.

Таблица 4. Параметры реакции трансгликозилирования при синтезе природных и модифицированных нуклеозидов с использованием ИФП нуклеозидфосфорилаз Смеаго\НегторЫ1т*

Целевой продукт ИФП (активность Ри№11:РуЫР), объем мл Донор пентозы, мМ Основание, мМ KH;P04, мМ T, "C pH Время реакции ч Выход** %

dAdo (1:2), 0.1 dThd, 15 Ade, 5 5 75 7.5 2 89±0,9

dGuo (2:1), 0.5 dThd, 15 Gua, 5 5 70 10.0*** 10 96±1,2

2CldAdo (1:2), 0.2 dThd, 15 2ClAde, 5 5 75 7.5 4 86±0,7

AraA (1:2), 0.1 araU, 15 Ade, 5 5 75 7.5 4 88±0,7

2FaraA (1:1), 0.2 araU, 15 2FAde, 5 5 75 7.5 8 85±0,8

Ribavirin (1:0), 0.5 Guo, 60 TCA, 40 5 70 7.5 24 92±0,8

* объем реакции -10 мл, ** по данным ВЭЖХ, *** реакцию проводили в 50мМ глицин-№ОН буфер (рН 10.0 при 70°С

Таким образом, в результате проведенного исследования получены ферментные препараты нуклеозидфосфорилаз С. $1еаго1ЬегторЫ1и$ ковалентно иммобилизованные на аминопропилированном макропористом стекле АР-СРО-170. Эти новые препараты двух иммобилизованных термостабильных нуклеозидфосфорилаз характеризуются высокой ферментативной активностью и стабильностью, что делает их подходящими для многократного использования в качестве биокатализаторов в реакциях трансгликозилирования. Использование стабилизированных иммобилизацией нуклеозидфосфорилаз термофильных микроорганизмов, полученных из рекомбинантных штаммов-продуцентов, представляется наиболее оптимальным подходом к биотехнологическому синтезу нуклеозидов и их аналогов, необходимых для нужд отечественной медицины и других применений.

Синтез модифицированных нуклеозидов медицинского назначения. Синтез 2-хлор - 2'-дезоксиаденозина (Кладрибина) ферментативным трансгликозилированием с использованием препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз С^еагоЛеппорИИиз ВКМ-2194

2-хлор-2'-дезоксиаденозин (Кладрибин, 2СМАс1о) [Веи^ег Е., 1992] -устойчивый к дезаминированию цитотоксический аналог нормального внутриклеточного метаболита дезоксиаденозина (<1Ас1о). Кладрибин является новым противоопухолевым препаратом, достаточно эффективным в качестве средства вспомогательной терапии для больных некоторыми формами лейкемий и лейкозов (волосатоклеточная лейкемия, хроническая лимфоцитарная лейкемия, неходжкинские лимфомы, макроглобулинемия Вальдерстрема и др. [ОШтап Я.,. 1994; РкткеП 1996; СЬезоп В., 1996], а

также ревматоидных и иммунных заболеваний (прогрессирующий рассеянный склероз [Б1ре 1С., 1994].

Пригодность жидких и иммобилизованных ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз Смеаго1ЬегторЫ1т анализировали в реакциях трансгликозилирования, используя в качестве модели получение 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (2С1с1Ас1о). Одновременно отрабатывали схему его получения. В качестве субстратов были использованы тимидин, дезоксигуанозин (доноры дезоксирибозы), а также 2-хлораденин и 2-хлораденозин (источники модифицированного основания). В результате проведенной работы установлена наиболее оптимальная схема получения 2С1с1А(к), представленная на рис. 10.

2С1с1Ас1о

2С1Ас1е

Рис. 10 Оптимальная схема получения 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (2С1с1Ас1о).

Сокращения: РиКРП - пуриннуклеозидфосфорилаза; АР - щелочная фосфатаза; РуЫР - пиримидиннуклеозидфосфорилаза

В ходе экспериментов было определено, что наиболее подходящими субстратами для получения 2-хлор-2-дезоксиаденозина являются тимидин (в качестве донора дезоксирибозофосфата) и 2-хлораденин (2С1Аёе) (Рис. II, 13). В свою очередь 2С1А(1е может быть получен (выход реакции близок к 100%) из доступного 2-хлораденозина (2С1Аёо) с использованием пуриннуклеозидфосфорилазы (РиИРН) и щелочной фосфатазы (АР) (Рис. 12).

мин

Рис 11. Сравнение получения 2-хлордезоксиаденозина (2С1с1Ас1о) с использованием в качестве субстратов тимидина, 2-хлораденина (2ClAde) или 2-хлораденозина (2С1Аёо), а также ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз РиЫРП бМеашкегторЬИив

Использование в качестве субстрата 2-хлораденина (вместо 2-хлораденозина) позволяет значительно упростить реакцию трансгликозилирования при получении аналога препарата Кладрибин, а также избежать проблем с разделением рибо- и дезоксипроизводных, которые возникают при дальнейшей очистке целевого продукта. Еще одним достоинством такого подхода является возможность повторного использования 2-хлораденина не вступившего в реакцию трансгликозилирования и оставшегося в осадке т.е. экономии этого ценного субстрата. В целом можно отметить, что такой подход дает возможность проводить реакцию трансгликозилирования с глубиной около 80-90 процентов по отношению к внесенному в реакцию 2-хлораденину.

Вторым важным для технологии параметром является расход тимидина (донора дезоксирибозы). (Рис. 13). Из полученных данных видно, что при высоких концентрациях тимидина абсолютный выход целевого продукта 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (2CldAdo) увеличивается, но снижается удельный выход продукта получаемого из расчета на 1 моль затраченного тимидина.

Рис 12. Эффективный фосфоролиз 2-хлораденозина (2ClAdo) до 2-хлораденина (2ClAde) и рибозы с использованием PuNPII G.stearothermophilus и щелочной фосфатазы E.coli (АР). 2CIAde выпадает в осадок в ходе реакции и количественно собирается. В процентах выражено остаточное количество исходного 2ClAdo.

(В)

IdThd, мМ|

Рис. 13. Выбор оптимальной концентрации тимидина (донора дезоксирибозы).

Таким образом, целесообразно проводить реакцию при концентрации тимидина около 12-15 мМ. Оборотной стороной такого подхода является получение относительно низких концентраций конечного продукта, что

требует упаривания для дальнейшей очистки больших объемов реакционной смеси.

Кроме подбора основных субстратов была проведена оптимизация условий по концентрации фосфата (1мМ), значений рН (7.5-8), количества ферментного препарата, необходимого для реакции. Также подобраны условия хроматографического выделения целевого продукта при элюции его дистиллированной водой (Рис.14), что очень важно для соответствия фармакопейным нормам.

Вода, л

Рмс.14. Разделение продуктов реакции транспшкозилировапия. Колонка 100x5 см. сорбент Dowex2x8 (200-400 mesh), злюепт - дистиллированная вода, скорость элюции - 1-2 объем/ч. Производительность до 3-5 г 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (КладрибипаУл сорбента

В целом проведение технологического процесса и вариации концентраций субстратов и продуктов реакций при проведении модельных экспериментов по получению различных модифицированных нуклеозидов (Рибавирина, Флюдарабина) были сходным с аналогичными параметрами синтеза 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (Кладрибина). Полученные результаты указывают на возможность разработки в дальнейшем методологически обшей технологии получения этих вешеств, а также других аналогов нуклеозидной природы, являющихся субстратами нуклеозидфосфорилаз и позволяют прогнозировать принципиальную возможность создания эффективных современных технологических установок по синтезу ряда модифицированных нуклеозидов с применением ИФП нуклеозидфосфорилаз Geobacillus stearothermophilus.

выводы

1. Проведено клонирование и оптимизация последовательностей генов пуриннуклеозидфосфорилазы 11 (PuNPIl) и пиримидиннуклеозидфосфорилазы (PyNP) из Geobacillus stearothermophilus В-2194. Созданы рекомбинантные продуценты нуклеозидфосфорилаз на основе штаммов Е. coli BL21(DE3) и Е. coli C41(DE3).

2. Разработаны методы ферментации штаммов-продуцентов с уровнем продукции растворимых целевых ферментов до 40-60% от суммарного количества клеточных белков и получения ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз.

3. Показано, что ферментные препараты рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus, ковалентно иммобилизованные на аминопропилированном макропористом стекле AP-CPG-170, сохраняют высокую активность и стабильность при 20-кратном использовании в реакциях трансгликозилирования нуклеозидов при температуре 70°С. Выход целевых продуктов достигает 96%.

4. Впервые показано преимущество использования ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз по сравнению с ферментами или целыми клетками мезофильных микроорганизмов, что позволяет проводить синтез нуклеозидов при повышенной температуре (70-75°С), в широком диапазоне значений pH (6.5-11.5) и с высокими концентрациями субстратов.

5. Показана возможность эффективного применения ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз для биотехнологического получения ряда фармацевтических субстанций: 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (Кладрибин), 9-Р-£>-арабинофуранозил-2-фтораденина (Флударабин), 1 -ß-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-З-карбоксамида (Рибавирин), а также природных нуклеозидов.

6. Разработан лабораторный регламент синтеза 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (Кладрибин) и его выделения методом хроматографии на сорбентах Dowex2x8 и AB 17x2 с использованием экологически и технологически безопасных элюентов и реактивов.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах: Публикации в научных журналах

1. Таран С.А., Веревкина К.Н., Феофанов С. А., Мирошников А.И. Ферментативное трансгликозилирование природных и модифицированных нуклеозидов иммобилизованными термостабильными нуклеозидфосфорилазами из Geobacillus stearothermophilus! Биоорганическая химия 2009, т. 35, № 6, с. 822-829.

2. Таран С.А., Веревкина К.Н., Есикова Т.З., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Синтез 2-хлор-2'-дезоксиаденозина микробиологическим трансгликозилированием с использованием рекомбинантного штамма Escherichia coli / Прикладная биохимия и микробиология 2008, т. 44, № 2, с. 181-186.

3. Таран С.А., Микулинская Г.В., Феофанов С.А. Клонирование, выделение и некоторые свойства рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз Geobacillus stearothermophilus ВКМ-2194 / Бюллетень Московского Общества Испытателей Природы Отдел биологический (МГУ) 2009, т. 114, выпуск 2, с. 144-146.

4. Константинова И.Д., Леонтьева Н.А., Галегов Г.А., Рыжова О.И., Чувиковский Д.В., Антонов К.А., Есипов Р.С., Таран С.А., Веревкина К.Н., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Биотехнологический способ получения рибавирина. Действие рибавирина и некоторых его комбинаций на репродукцию вируса осповакцины (Vaccinia Virus) / Биоорганическая химия 2004, т. 30, №6, с. 613-620.

Патенты

5. Константинова И.Д., Есипов Р.С., Муравьева Т.И., Таран С.А., Веревкина К.Н., Гуревич А.И., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Способ получения 1-Ь-0-рибофуранозил-1,2-4триазол-3-карбоксамида (рибавирина). Патент РФ № 2230118 от 10.07.2004.

Материалы российских и международных конференций

6. Таран С.А., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Биотехнологический способ получения природных и модифицированных нуклеозидов, VII Всероссийская конференция "Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009" с Молодежной научной школой, 1-5 июля 2009 г., г. Уфа, сборник тезисов устных и стендовых докладов, с. 107.

7. Таран СЛ., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Синтез модифицированных нуклеозидов ферментативным трансгликозилированием с использованием термостабильных нуклеозидфосфорилаз, Материалы Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 28 сентября - 2 октября 2009 г.), сборник тезисов с. 369-371.

8. Таран С.А., Веревкина К.Н., Есипов P.C., Константинова И.Д., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Биотехнологический способ получения субстанций фармпрепаратов на основе модифицированных нуклеозидов с использованием бактериальных нуклеозидфосфорилаз, материалы VIII чтений памяти академика Ю.А.Овчинникова, 25-27 октября 2006, г. Москва.

9. Таран С.А., Веревкина К.Н., Есипов P.C., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Разработка биотехнологического способа препаративного синтеза фармакологического препарата 2-хлор-2'-дезоксиаденозина с использованием бактериальных нуклеозидфосфорилаз. Конференция ФИБХ РАН, 22 января 2004, г. Пущино.

10. Таран С.А., Микулинская Г.В., Феофанов С.А. Клонирование, выделение и некоторые свойства рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз Geobacillus stearothermophilus ВКМ-2194, материалы всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», 26-29 мая 2009 г., г. Москва.

11. Таран С.А., Микулинская Г.В. Ферментативное трансгликозилирование модифицированных гетероциклических оснований нуклеозидфосфорилазами из Geobacillus stearothermophilus в различных температурных режимах, материалы VI Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», 25-27 октября 2010 г., г. Москва.

Заказ № 16-Л/05/2011 Подписано в печать 05.05.2011 Тираж 75 экз. Усл. пл. 1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Таран, Сергей Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. НУКЛЕОЗИДЫ И НУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗЫ: 10 СТРУКТУРА, ФУНКЦИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

1-1 Природные и модифицированные нуклеозиды

1 -2 Нуклеозидфосфорилазы. Структура и механизмы катализа

1.2.1 Общие характеристики и особенности нуклеозидфосфорилаз

1.2.2 Бактериальные пуриннуклеозидфосфорилазы

1.2.3 Пиримидинспецифичные нуклеозидфосфорилазы

1.2.4 Тимидинфосфорилаза и пиримидиннуклеозидфосфорилаза 34 1-3 Биотехнология нуклеозидов

1.3.1 Использование нуклеозидфосфорилаз в синтезе 43 модифицированных нуклеозидов

1.3.2 Ферментативное трансгликозилирова!те нуклеозидов

1.3.3 Технологические подходы в биосинтезе нуклеозидов 49 1-4 Заключение

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы

2.1.1 Реактивы и ферменты

2.1.2 Олигодезоксирибонуклеотиды

2.1.3 Бактериальные штаммы и плазмиды

2.1.4 Лабораторное оборудование

2.1.5 Буферы и растворы

2.2 Методы

2.2.1 Приготовление компетентных клеток и трансформация

2.2.2 Выделение и очистка плазмидной ДНК методом щелочного 68 лизиса

2.2.3 Выделение и очистка хромосомной ДНК С?.$1еаго1\1егторЫ1и$

2.2.4 Амплификация фрагментов генов с хромосомной ДНК 70 ОМеаго^егторЫЫз

2.2.5 Выделение фрагмента ДНК из агарозного геля

2.2.6 Молекулярное клонирование

2.2.7 Электрофоретическое разделение белков

2.2.8 Экспрессия нуклеозидфосфорилаз & 81еагоШегторЫ1ш

2.2.9 Выделение нуклеозидфосфорилаз & ^МеагоЖегторИИт

2.2.10 Определение концентрации белка

2.2.11 Иммобилизация нуклеозидфосфорилаз С7. 81еаго1кегторЫ1ш

2.2.12 Синтез природных и модифицированных нуклеозидов

2.2.13 Спектрофотометрическое определение активности нуклеозидфосфорилаз

ГЛАВА 3. ТРАНСГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ ПРИРОДНЫХ И

МОДИФИЦИРОВАННЫХ НУКЛЕОЗИДОВ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫМИ

НУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗАМИ вЕОВАСШ иБ Б ТЕ А Я О ТНЕЯМОРШЬ Ш

3.1 Клонирование генов, экспрессия и выделение пуриннуклеозидфосфорилазы II и пиримидиннуклеозидфосфоралазы О. stearothermophilus В

3.2 Иммобилизация рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз СМеагоНпегторЫЫв В-2194, исследование их свойств и использование в реакциях фосфоролиза и трансгликозилирования природных и модифицированных нуклеозидов

3.3 Синтез модифицированных нуклеозидов медицинского назначения. Синтез 2-хлор — 2 '-дезоксиаденозина (Кладрибина) ферментативным трансгликозилированием с использованием препаратов термостабилъных нуклеозидфосфорилаз ОМеагоШегторкИт ВКМ

3.3.1 Оптимальная схема синтеза 2-хлор-2 '-дезоксиаденозина

3.3.2 Выбор источника модифицированного основания

3.3.3 Подбор оптимальных количеств донора дезоксирибозо-1-фосфата и проведение синтеза 2-хлор-2 '-дезоксиаденозина

3.3.4 Выделение и очистка 2-хлор-2 '-дезоксиаденозина

3.3.5 Анализ и сертификация целевого 2-хлор-2 '-дезоксиаденозина

Введение Диссертация по биологии, на тему "Трансгликозилирование природных и модифицированных нуклеозидов термостабильными нуклеозидфосфорилазами Geobacillus Stearothermophilus"

Традиционно для получения нуклеозидов и их модифицированных производных используется многостадийный химический синтез. Во многих случаях ключевой стадией процесса является формирование Ы-гликозидной связи. Химические способы образования этой связи дают удовлетворительные результаты в случае получения нуклеозидов рибо-ряда. Однако при синтезе 2'-дезоксирибонуклеозидов и Р-£)-арабинофуранозилнуклеозидов, как правило, образуются смеси регио- и стереоизомеров разделение которых требует использования дорогостоящих носителей, больших затрат сырья и реагентов, а также утилизации токсических отходов производства, что не отвечает экологическим требованиям современной биоиндустрии. Альтернативным способом образования М-гликозидной связи при получении природных нуклеозидов и их модифицированных аналогов является биосинтетический процесс, катализируемый Ы-дезоксирибозилтрансферазами (КФ 2.4.2.6) или нуклеозидфосфорилазами микроорганизмов [пуриннуклезидфосфорилаза (РиТч1Р; КФ 2.4.2.1), тимидинфосфорилаза (ТР; КФ 2.4.2.4) уридинфосфорилаза (ЦР; КФ 2.4.2.3)]. Из них, благодаря широкой субстратной специфичности, более подходящими биокатализаторами для промышленного применения признаны нуклеозидфосфорилазы.

В присутствии ортофосфата нуклеозидфосфорилазы катализируют обратимый фосфоролиз рибо-, арабино- и дезоксирибонуклеозидов до пентозо-1 -фосфата и соответствующих оснований, а также фосфатзависимый перенос пентозы между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями или нуклеозидами (трансгликозилирование) с образованием нуклеозидов, отличных от исходных, по схеме:

Нуклеозид + Пентозо-1-фосфат + Основание

Известные на сегодняшний день биотехнологические способы синтеза модифицированных нуклеозидов позволяют успешно получать целевые продукты при использовании ферментов или суспензий целых клеток мезофильных бактерий, но не лишены недостатков. Применение целых клеток приводит к тому, что конечный продукт может быть загрязнен бактериальным содержимым и требует тщательной очистки и мониторинга качества получаемой субстанции фармпрепарата. При том, что нуклеозидфосфорилазы мезофильных бактерий имеют температурный оптимум в районе 55-65°С, они не могут продолжительное время сохранять ферментативную активность при такой температуре вследствие низкой термостабильности. Такие функциональные ограничения биокатализаторов могут играть отрицательную роль в случаях, когда требуются особые условия реакции. Например, для обеспечения высокой концентрации малорастворимых пуриновых оснований, нуклеозидов и их модифицированных аналогов при проведении процессов трансгликозилирования в условиях повышенной температуры и/или экстремальных значений рН. Эти условия обычно приводят к дестабилизации четвертичной и третичной структур белка и, в конечном итоге, к потере ферментативной активности. Поэтому актуальной научно-практической задачей для разработки методологии синтеза нуклеозидов и их производных является изучение ферментов термофильных микроорганизмов, в том числе, стабилизированных иммобилизацией, поскольку они могут обеспечивать целый ряд преимуществ по сравнению с ферментами мезофильных микроорганизмов или их целыми клетками при использовании в качестве биокатализаторов:

• ферментативная реакция может протекать длительное время при высокой температуре;

• биореакторы, работающие на основе термостабильных ферментов, устойчивы к бактериальной контаминации.

Основной целью настоящего исследования являлась разработка эффективного биокаталитического процесса, основанного на ферментативном трансгликозилировании ряда природных, а также модифицированных нуклеозидов, с использованием ферментных препаратов генно-инженерных нуклеозидфосфорилаз из термофильных бактерий ОеоЬасШиБ stearothermophilus штамма В-2194.

Для достижения основной цели в ходе работы решались следующие задачи:

1. Клонирование генов пуриннуклеозидфосфорилазы II (РиМРН) и пиримидиннуклеозидфосфорилазы (РуИР) из С. 51еагойгегторЫ1и8ь оптимизация генетических конструкций, создание рекомбинантных штаммов-продуцентов и разработка методов получения ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз, в том числе иммобилизованных.

2. Сравнение каталитических свойств полученных ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз С^еагоНъегторкИт и родственных ферментов Е.соИ в реакциях трансгликозилирования и фосфоролиза нуклеозидов.

Работа выполнена в Группе технологии синтеза нуклеиновых кислот и компонентов нуклеиновых кислот филиала Института Био органической химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, в Пущинском научном центре РАН. Автор выражает искреннюю благодарность всем кто помогал и поддерживал его в выполнении и представлении диссертационной работы: А.И.Мирошникову и С.А.Феофанову — за руководство настоящей работой, организацию исследований и биотехнологического применения нуклеозидфосфорилаз и других ферментов нуклеинового обмена; К.Н.Верёвкиной за помощь в проведении экспериментов и отдельных технологических операций; P.C. Есипову за предоставленные препараты нуклеозидфосфорилаз E.coli, В.Б. Берзину за синтез 2С1-аденозина, 2Р-аденозина и К.В. Антонову за синтез 1-ß-D-арабинофуранозил-урацила, необходимых для выполнения экспериментальных работ; Г.В.Микулинской и Ю.С.Скоблову за плодотворное обсуждение результатов работы и помощь в оформлении. Отдельная благодарность И.Д. Константиновой и И.С.Музыка за получение части данных по синтезу рибавирина, помощь в проведении экспериментов и информационную поддержку. Спасибо всем моим соавторам, без Вашего участия эта работа была бы невозможна.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты РФФИ 08-04-12143, 08-04-01842) и Федерального агентства по образованию (Тематический план №1.1.09).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Таран, Сергей Анатольевич

ВЫВОДЫ

1. Проведено клонирование и оптимизация последовательностей генов пуриннуклеозидфосфорилазы II (РиКРП) и пиримидиннуклеозидфосфорилазы (Ру1\ГР) из ОеоЬасШш ^еагоШегторЫЫх В-2194. Созданы рекомбинантные продуценты нуклеозидфосфорилаз на основе штаммов Е. соИ ВЬ21(БЕЗ) и Е. соИ С41(БЕЗ).

3. Показано, что ферментные препараты рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз 0.81еагоИаегторЫ1и8, ковалентно иммобилизованные на аминопропилированном макропористом стекле АР-СРв-170, сохраняют высокую активность и стабильность при 20-кратном использовании в реакциях трансгликозилирования нуклеозидов при температуре 70°С. Выход целевых продуктов достигает 96%.

4. Впервые показано преимущество использования ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз по сравнению с ферментами или целыми клетками мезофильных микроорганизмов, что позволяет проводить синтез нуклеозидов при повышенной температуре (70-75°С), в широком диапазоне значений рН (6.5-11.5) и с высокими концентрациями субстратов.

5. Показана возможность эффективного применения ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз для биотехнологического получения ряда фармацевтических субстанций: 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (Кладрибин), 9-Р-£>-арабинофуранозил-2-фтораденина (Флударабин), 1 -(3-£)-рибофуранозил-1,2,4-триазол-З -карбоксамида (Рибавирин), а также природных нуклеозидов.

6. Разработан лабораторный регламент синтеза 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (Кладрибин) и его выделения методом хроматографии на сорбентах Бо\уех2х8 и АВ17х2 с использованием экологически и технологически безопасных элюентов и реактивов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе проведен анализ современных представлений о нуклеозидфосфорилазах микроорганизмов и их использовании в технологиях получения модифицированных нуклеозидов ферментативным трансгликозилированием. В экспериментальной части работы впервые показан ряд преимуществ использования ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз С. 81еаго1кегторЫ1и8 по сравнению с ферментами мезофильных микроорганизмов и/или целых клеток, применяемых в известных ферментативных технологиях получения нуклеозидов. В ходе работы проведены исследования по клонированию генов и получению штаммов-продуцентов пуриннуклеозидфосфорилазы II и пиримидиннуклеозидфосфорилазы из & 81еаго(кегторЫ1и$ В-2194. Разработан способ получения ферментных препаратов из созданных штаммов-продуцентов и охарактеризована их активность в реакциях фосфоролиза и трансгликозилирования природных и модифицированных нуклеозидов. Показана возможность эффективного применения ферментных препаратов иммобилизованных нуклеозидфосфорилаз для биотехнологического получения ряда фармацевтических субстанций: 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (субстанция препарата "Кладрибин"); 9-Р-£)-арабинофуранозил-2-фтораденина (субстанция препарата "Флударабин"); 1-Р-£>-рибофуранозил-1,2,4-триазол-З-карбоксамида (субстанция препарата "Рибавирин"), а также природных нуклеозидов. Разработаны методики и лабораторный регламент биотехнологического синтеза и выделения 2-хлор-2'-дезоксиаденозина из реакционной смеси ионообменной хроматографией на сорбентах отечественного и импортного производства (Бо\уех2х8, АВ17х2) с использованием экологически и технологически безопасных элюентов и реактивов. Наработаны опытные партии препарата 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (суммарно более 200 г) в соответствии с разработанным лабораторным регламентом и требованиями, предъявляемыми к субстанциям фармацевтических препаратов. Создан "биотехнологический инструментарий", который может использоваться для получения широкого спектра как уже исследованных, так и новых препаратов нуклеозидной природы для нужд медицины и других целей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Таран, Сергей Анатольевич, Москва

1. Бокуть СБ., Барай В. Н., Зинченко А. И. // Прикл. биохим. и микробиол. 1995. Т. 31, № 3. С. 308-310.

2. Галегов Г.А., Львов Н.Д., Петрова КГ., Флорентов В.Л. Рибавирнн как антивирусный химиопре парат: химия, молекулярный механизм действия, возможность практического применения // Вопр. мед. химии. 1986; 32(1):10-19.

3. Гуревич A.M., Качалина Т.А., Каюшин А.Л., Коростелева М.Д., Мирошников А.И. Клонирование повторяющейся последовательности гена окситоцина // Биоорган, химия. 1993; 19:629-32.

4. ДудчикН. В.: Автореф. дис. канд. биол. наук. Мн., 1992.

5. Брошевская Л. А., Барай ВН., Зинченко А. И. и др. // Антибиотики и мед. битехнол. 1986. Т. 31, № 3. С. 174-178.

6. Зинченко А. И., Барай ВН., Брошевская Л. А., Михайлопуло И. А.// Биополимеры и клетка. 1988. Т. 4, № 6. с. 298-302.

7. Зинченко A.M., Брошевская Л.А., Барай В.Н. Увеличение операционной стабильности клеток Escherichia coli катализирующих реакцию синтеза аденинарабинозида, в помощью глутарового альдегида//Биотехнология. 1990; 5:36-9.

8. Зинченко AM., Барай В.Н., Брошевская Л.А., Бельгельман Л.Н., Михайлов С.Н., Карпейский М.Я., Михайлопуло И.А. 2'-,3'- и 5'-С-Метилпроизводные уридина в реакции микробиологического трансгликозилирования // ДАН АН СССР. 1987; 297(3):731-4.

9. Зинченко А. И., Барай В. Н., Брошевская Л. А // Пробл. микробиол. и биотехнол.: Материалы междунар. конф. Мн., 1998. С. 118-120.

10. Константинова И.Д., Леонтьева H.A., Галегов Г.А., Рыжова О.И., Чувиковский Д.В., Антонов К.В., Есипов P.C., Таран С.А., Веревкина К.Н., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Биотехнологический способ13,14,15,16,17,18,19,20

Информация о работе

Таран, Сергей Анатольевич
кандидата химических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Трансгликозилирование природных и модифицированных нуклеозидов термостабильными нуклеозидфосфорилазами Geobacillus Stearothermophilus - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы