Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Субстратная специфичность нуклеозидфосфорилаз Escherichia coli

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Субстратная специфичность нуклеозидфосфорилаз Escherichia coli"

На правах рукописи

АЛЕКСЕЕВ Кирши Сергеевич

СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ НУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗ ESCHERICHIA COLI

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

- 8 НОЯ 1Ш

Москва 2012

005054593

005054593

Работа выполнена в Лаборатории стереохимии ферментативных реакций Федерального

государственного бюджетного учреждепия науки Института молекулярной биологии им. В.А.

Энгельгардта Российской академии наук.

Научный руководитель: заведующий Лабораторией стереохимии ферментативных реакций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии паук, доктор химических наук, профессор С.Н. Михайлов

Официальные оппоненты: главный научный сотрудник Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.ВЛомоносова» доктор химических наук, профессор М.Б. Готгих

ведущий научный сотрудник Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, доктор химических наук В.Л. Туницкая

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук

со

часов на заседаю

Защита диссертации состоится г. в

диссертационного Совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетным учрежден] науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук і адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения пауки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного сові кандидат химических наук

рицын

Актуальность исследования.

Настоящая работа посвящена изучению субстратной специфичности важной группы ферментов -клеозидфосфорилаз, которые осуществляют обратимый фосфоролиз нуклеозидов с образованием этветствующего гетероциклического основания и 1-фосфата моносахарида. К этим фермеотам носятся тимидинфосфорилаза (ТФ) (КФ 2.4.2.4), уридинфосфорилаза (УФ) (КФ 2.4.2.3) и риннуклеозидфосфорилаза (ПНФ) (КФ 2.4.2.1). Нуклеозидфосфорилазы играют важную роль в таболизме нуклеозидов. В опухолевых клетках наблюдается повышенный уровень активности этих рментов, которые могут быть использованы в качестве маркеров онкологических заболеваний. Эти риалы применяются в промышленности для синтеза лекарственных препаратов и практически жных нуклеозидов. В качестве примера можно привести известные ферментативные превращения клеозидов под действием УФ и ПНФ: P-D-арабинофуранозилурацил + УФ + неорганический фосфат урацил + а-£>-арабинофуранозил-1 -фосфат + ПНФ + аденин р-Д-арабинофуранозиладенин. кже эти ферменты используются для количественного определения неорганического фосфата.

Следует отметить, что субстратная специфичность этих ферментов исследована недостаточно mío. Это связано с отсутствием удобных методов определения кинетических параметров сфоролнза нуклеозидов. Несмотря на большое количество работ, посвященное этим ферментам, не ределена роль функциональных групп нуклеозидов при формировании продуктивного фермент-Зстратного комплекса. Практически отсутствуют данные о влиянии структуры нуклеозида и героциклического основания на положение равновесия реакции фосфоролиза, что важно для актического применение этих ферментов. Вышесказанное и определяет актуальность и большой терес к изучению субстратной специфичности и архитектуры активного центра этих ферментов.

Целью работы являлось изучение субстратной специфичности рекомбинантных клеозидфосфорилаз E.coli. ходе исследования решались следующие задачи:

разработка удобных методов определения констант равновесия, констант Михаэлиса и констант тлбирования для этих ферментов;

изучение фосфоролиза большой группы нуклеозидов, модифицированных как по углеводному татку, так и гетероциклическому основанию;

изучение роли гидроксильных групп нуклеозидов в связывании с ферментами; расширение возможностей использования ферментов для получения модифицированных клеозидов и гетероциклических оснований.

Научная новизна н практическая значимость работы

Для изучения пиримидиннуклеозидфосфорилаз предложены новые субстраты - 4-тиотимидин и 4-оуридин. Разработан удобный хроматографический метод определения констант равновесия

ферментативной реакции. Изучена реакция фосфоролиза более 50 производных нуклеозщу катализируемого нуклеозидфосфорилазами, определены константы Михаэлиса, констан-ингибирования, а также константы равновесия. Полученные данные сопоставлены с данньп рентгеноструктурного анализа и сделаны вьшоды об организации фермент-субстратного комгшск Результаты работы важны для оптимизации ферментативных методов создания N-гликозидной связ1 расширения возможностей использования ферментов для получения биологически важга нуклеозидов, гетероциклических оснований и их производных.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы были представлены на XII Международн конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологи (Гурзуф, Украина, 2004); International conference Biocatalysis-2005: fundamentals & applicatio: (StPetersburg, RF, 2005); XIX International Round Table "Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acic (Lyon, France, 2010); XV Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components (Czech Republic, Ces

Krumlov. 2011).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 5 тезисов докладов.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзс литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируем литературы ( наименований). Работа изложена на страницах, включает рисунк

схем и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Общая характеристика ферментов и методы изучения кинетики и констант равновесия.

Нуклеозидфосфорилазы обнаружены почти у всех организмов, при этом эволюционные разли* невелики и гомология между ферментами Е. coli и млекопитающих составляет > 25 % для УФ, > 33 для ТФ и > 20 % для ПНФ (M.J.Pugmire, S.E.Ealick, Biochem. J. 361, 1-25,2002).

Нуклеозидфосфорилазы участвуют в дополнительном пути биосинтеза нуклеозидов катализируют обратимую реакцию расщепления рибонуклеозидов и 2'-дезоксирибонуклеозидов образованием гетероциклического основания и (2-дезокси)рибозо-1-фосфата (схема Каталитический механизм этих ферментов не требует участия какого-либо кофермента или метал Характерной чертой нуклеозидфосфорилаз является механизм ферментативной реакции аналогичный механизму кислотного гидролиза нуклеозидов. В таблице 1 приведены известг базовые характеристики нуклеозидфосфорилаз Е. coli и человека.

H0-Los? о н0> о

Г/ + НО-Р-ОН в + у^о-р-он

HOR 0Н но R он

Схема 1. Реакция ферментативного фосфоролиза нуклеозидов, R = ОН, Н. В - гетероциклическое

основание

Таблица 1. Структурные особенности ТФ, УФ и ПНФ Е. coli и человека.

Характеристики ферментов НФ человека НФ Е. coli

ПНФ УФ ТФ ПНФ УФ ТФ

Субъедшшцы, кол-во 3 4 2 6 6 2

Аминокислотные остатки, кол-во 289 310 482 239 253 440

Молекулярный вес субъединицы, ГОа 32 34 50 26 27 47

рН оптимум 7,0 7,5 7,4 7,5 7,5 6,5

Наиболее специфичным ферментом является ТФ, субстратом которой является тимидин. УФ осуществляет фосфоролиз как тпмидина, так и уридина, а цитидин не является субстратом для обоих ферментов. Наименее специфична ПНФ Е. coli, субстратами которой являются все пуриновые нуклеозиды как рибо- так и 2'-дезоксирибо- ряда. Следует отметить, субстратная специфичность ПНФ человека существенно уже, этот фермент не расщепляет производные аденозина. УФ и ПНФ также используют в качестве субстратов 1-(р-£)-арабинофуранознл)пиримидины или -пурины.

В настоящее время для определения активности нуклеозидфосфорилаз используются спектрофотометрические методы. Большинство ранних работ по изучешпо ингибиторов выполнено с использованием "С-меченых по гетероциклическому основанию нуклеозидов. Спектрофотометрические методы основаны на разности экстиикций нуклеозидов и соответствующих гетероциклических оснований при определенной длине волны. В литературе имеются противоречивые данные по экепшкциям нуклеиновых оснований. Для их уточнения в настоящей работе использовался ферментативный фосфоролиз нуклеозида непосредственно в кювете спектрофотометра, что позволяет избежать ошибок при разбавлении растворов. В реакции использовали большой избыток неорганического фосфата, и полноту образовать нуклеинового основания контролировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В таблице 2 суммированы наши данные по УФ-спектрам природных нуклеозидов и нуклеиновых оснований. При выборе оптимальной длины волны, при которой проводилось определение кинетических характеристик нуклеозидов,

5

руководствовались значениями молярных коэффициентов экстинкций пар нуклеозид/основание, а также рабочими концентрациями субстратов, учитывая технические возможности и чувствительность измерительного прибора при различных значениях концентраций соединений, содержащих хромофор. На основании этих данных для каждого субстрата были выбраны оптимальные длины волн, при которых и определялись кинетические параметры фосфоролиза.

Таблица 2. Данные УФ-спекгров природных нуклеозидов и гетероциклических оснований при 25°С, 50 мМ буферный раствор КН2РО4, рН 7,0.

Нуклеозид, гетероциклическое основание Длина волны X, им Молярный коэффициент эксшнкции Е, М''-см"' Условия, длина волны X, їм (разность молярных коэффициентов экстинкции Дє, М"'см"')

^-тт ^тпах Епнп Етах

Асіо 226 259 2210 14902 275 (1008)

А(1е 225 260 2575 13450

ІПО 222 248 3597 12327 275 (926)

Нур 220 249 2586 10735

йцо 222 252 2844 13604 273 (964)

Оиа 225 245 6855 10810

игсі 230 261 2187 10095 280(2032)

№а 228 257 1823 8181

ТЬсі 234 267 2196 9675 290(1033)

ТЬу 233 264 1918 7872

4-81М 275 330 2276 21641 355 (3993)

4-5ига 275 328 1856 18669

4-5ТМ 278 336 1008 21535 355 (5354)

| 4-8ТЬу 280 333 1140 19592

Ошибка измерений не превышала 15%.

Был предложен новый спектрофотометрический метод определения активности УФ и ТФ использованием в качестве субстрата 4-тиоуридина и 4-тиотимидина. Отличительной особенность этих субстратов является наличие максимума поглощения в видимой области, причем разниі коэффициентов молярной окстиншии в паре 4-тиотимидин/4-тиотимин существенно больше, чем случае природных соединений (рисунок 1, таблица 2). В результате определения кинетичесю характеристик ферментативного фосфоролиза 4-тиоуридина оказалось, что он является хорош субстратом для УФ и реакцій подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. Аналогичные результат

были получены и в случае 4-тиотимидина и ТФ. Это позволяет использовать эти нуклеозиды для определения ингибиторных свойств гетероциклических соединений, включая производные нуклеозидов, имеющих максимум поглощения при 260-270 нм.

210 230 250 270 230 310 330 350 370 390

Л, нм

Рисунок 1. УФ-спектры тимидина, тимина, 4-тиотимидина и 4-тиотимина при 25° С и рН 7,0 (50 мМ буферный раствор КН2Р04).

Константу равновесия реакции фосфоролиза Нуклеозид + P¡ <-> Основание + (2-дезокси)рибозо-1-фосфаг определяли с помощью ВЭЖХ при различных рН и температуре 37°С, используя различные соотношения концентраций нуклеозида и фосфата: 1:10, 1:20 1:50, 1:125 и 1:250. Например, к раствору производного уридина (0,2 мкмоль) в 1 мл буфера Трис-НС1 (50 мМ, рН 7,5) добавляли 2 мкмоля фосфата калия и начинали реакцию добавлением 0,03-0,3 ед. акт. УФ. Количество добавляемого фермента зависело от скорости реакции: для медленно превращающихся субстратов фермента добавляли больше. Смесь инкубировали при температуре 37°С до установления равновесного состояния (1-2 часа). Реакцию анализировали методом ВЭЖХ (рисунок 2) и сигналы детектировали при длине волны 261 нм для производных уридина (267 нм для производных тимидина, 260 нм для производных аденозина и 330 нм для 4-тиоуридина). Константу равновесия рассчитывали по следующей формуле:

Равновесные концентрации определяли из интегралов сигналов гетероциклического основания и нуклеозида, учитывая их коэффициенты молярной экстинкции, и принимая [основание] = [Rib-p] . Этот удобный метод был использован для определения констант равновесия для большого числа различных нуклеозидов, модифицированных как по гетероциклическому основанию, так и по углеводному остатку. В работе были использованы рекомбинантные ТФ, УФ и ПНФ E.coli, любезно предоставленные старшим научным сотрудником ИБХ РАН к.х.н. P.C. Есиповым (Prot. Exprès. Purif. 24, 56-60, 2002).

£

25000

Кр = [основание] ■ [ЮЬ-р]/[нуклеозид] [p¡].

а) Исходное соединение уридин Аж:

0,4

0,2-

JL.

10 12 t, мин

в) Состояние равновесия, через 2 часа Аг»

0,4

0,2

12 t, мин

б) Реакция фосфоролиза уридина, через 30 мин

0,2

г) Контроль, урацил Аж

0,4-

0,2

10 12 t, Ь

Рисунок 2. ВЭЖХ-анализ реакции фосфоролиза уридина. Условия анализа: 0-15% ацетонитрила за t мин в 50 мМ буферном растворе ацетата натрия (рН 4,3) при 25°С, детекция при длине волны 261 н. колонка 4,6x150 мм (5 мкм, Nucleosil-Cig). Условия фосфоролиза: концентрация уридина 200 мк! Концентрация фосфата 4 мМ (1:20), 1 мл 50 мМ буферного раствора Tris-HCl (рН 7,5), 0,03 ед. ai УФ, 37'С. RTuni-3,7 мин, RTUrd-5,9 мин.

2. Субстратная специфичность ТФ.

Для изучения субстратной специфичности нуклеозидфосфорилаз была использована больц библиотека модифицированных нуклеозидов, синтезированная в ИМБ РАН. Были измере!:т кинетические параметры и константы равновесия реакции ферментативного фосфоролт. производных тимидина, модифицированных по углеводному остатку. На основе даннг рентгеноструктурного анализа и результатов молекулярной динамики выявлена роль гидроксильн_: трупп углеводного остатка нуклеозида в связывании субстрата с аминокислотами активного центр: уточнен механизм работы тимидинфосфорилазы Е.соИ.

ТФ является специфичным ферментом и не катализирует фосфоролиз других природа:-нуклеозидов (уридин, циггидин, аденозин, инозин, ксантозин и гуанозин). В этом ряду только урид является хорошим ингибитором ТФ. 4-Тиотимидин и 2'-дезоксиуридин. а также 5'-дезокситимид являются хорошими субстратами ТФ. Замена гидроксильной группы в 5'-положснии на объемна::

заместитель не препятствует связыванию нуклеозида с ТФ (Таблица 3). Однако скорость реакции значительно снижается при увеличении размеров заместителя. Дальнейшее увеличение Ван-дер-ваальсова радиуса заместителя (5'-бром-5'-дезокситимидин) приводит к тому, что нуклеозид вязывается с ферментом, но не подвергается фосфоролизу, а 5'-азидо-5'-дезокситимидин практически е связывается с ферментом. Замена 5'-гидроксильной на аминогруппу позволяет субстрату вязываться с ферментом с такой же константой, что и тимидин. При введении в 5'-положении имидина метальной группы или дополнительного метиленового звена наблюдается аналогичный ффект: константа связывания остается без изменений, а скорость фосфоролиза существенно меньшается. Очевидно, что гидроксильная группа в 5'-положении (и, вероятно, водородная связь, оторую она образует) не имеет принципиального значения ни для связывания, ни для реакции.

Нуклеозиды, в которых отсутствует З'-гидроксильная группа или обращена конфигурация при С', не являются субстратами ТФ, но ингибируют фермент с К„ близкой к Кт тимидина. З'-Амино-З'-езокситимидин не является субстратом ТФ при рН 6,5, однако при увеличении рН до 8,0 начинается го фосфоролиз. Уридин и 5-метилуридин не являются субстратами ТФ, однако эффективно нгибируют ее активность. Следует отметить, что диальдегидное производное уридина (уридин, кисленный периодатом натрия), также эффективно связывается с ТФ.

ТФ катализирует фосфоролиз тимидина в широком диапозоне рН. График зависимости рКт от рН ри действии ТФ на тимидин имеет форму колокола и узкий максимум, который находится в значении ,5 с перегибами в 6,1 и 6,8. В интервале рН 7,0-8,5 ^„меняется незначительно.

Для определения константы равновесия реакции ферментативного фосфоролиза тимидина гакционную смесь инкубировали при рН 6,5 и 8,2 и при разных температурах: 37°С и 4°С. При нкубировании реакционной смеси при рН 6,5 (37°С) на графике зависимости количества субстратов г времени равновесное плато четко не формировалось (рисунок 3), а среди продуктов зомато графически определялась дезоксирибоза. На основании литературных данных о ¡устойчивости 2-дезоксирибозофосфата в кислых и нейтральных средах был сделан вывод о том, что лещение равновесия обусловлено вкладом химического гидролиза этого продукта. Поскольку ¡вестно, что скорость неферментативного гидролиза значительно зависит от температуры, мы зстарались исключить вклад гидролиза и определяли константу равновесия реакции фосфоролиза шидина при рН 8,2 и температуре 4°С. В этих условиях равновесное плато было четко обозначено и шцентрации основания и нуклеозида оставались неизменными в течение нескольких часов (рисунок |. Увеличение концентрации фермента позволяет определить Кр 2'-дезоксинуклеозидов и при рН 7,5 м. данные для УФ и ПНФ).

%

80

4 - ТТ|у (37"С) 1 - ТИЙ (4°С)

60

40

20

2 - ТЬу (4'С)

3 - тиа (37'С)

О 30 60 90 120 150 180 210 240 1, мин

Рисунок 3. Зависимость количества субстрата и продукта от времени в реакции фосфороли: тимидина. Значения Кр измерены в 50 мМ Тле-буфере (рН 6,5) при соотношении нуклеозид:фосф; 1:10. Цифрами обозначено: 1 - фосфоролиз тимидина при рН 6,5 и 4°С; 2 - образование тимина при р 6,5 и 4°С; 3 - фосфоролиз тимидина при рН 6,5 и 37°С; 4 - образование тимина при рН 6,5 37°С.

Интересно отметить, что 2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидин является субстратом с такой ж. константой Михаэлиса, как и в случае тимидина (К,„ = 350 мкМ), но скорость реакции падает бол< чем в 100 раз и равновесие не устанавливается. Хорошо известно, что скорость кислотного гидроли. для 2',3'-дидегидро-2',3'-дидезоксипроизводных на два-три порядка выше скорости гидроли природных нуклеозидов. Очевидно, что скорость гидролиза 2,3-дидегидро-2,7 дидезоксирибозофосфата намного больше скорости обратной реакции образования нуклеозщ поэтому происходит смещение равновесия и определить константу равновесия невозможк Вероятность неспецифического гидролиза контролировали по инкубации без фермента. Все изученш константы равновесия лежат в диапазоне 0,04-0,1 и мало зависят от структуры субстрата.

Как видно из таблицы 3, любая модификация нуклеозида по углеводному остатку - удален! замещение гидроксильных групп или введение дополнительных групп в 3'- и 5'-положении практически не влияет на связывание субстрата (или ингибитора). В тоже время З'-ОН, но не 5'-0 играет ключевую роль в формировании продуктивного фермент-субстратного комплекса.

На основании рентгеноструктурных данных комплекса ТФ с тимидином и симулящ: молекулярной динамики предполагают, что формирование фермент-субстатного комплек происходит за счет взаимодействия аминокислотных остатков А^-178, Ьуз-190, Н13-85 карбонильными группами С4=0, С2=0, 8ег-186 с амидным протоном тимина и Т11г-123 и 8ег-113 фосфатом. Считают, что движение доменов, которое начинается при образовании комплекса, привод-к существенному сближению имидазольного кольца №з-85 и С2=0 тимидина. Вследствие тако сближения происходит протонирование карбонильной группы, ослабляется гликозидная связь подготавливается нуклеофильная атака фосфата на карбкатион.

Таблица 3. Кинетические параметры для ферментативного фосфоролиза ТФ тимидина и его производных, измеренные спектрофотометрически (50 мМ калий-фосфатный буфер, рН 6,5, температура 25°С. Значения Кр измерены в 50 мМ Трис-буфере, рН 8,2, температура 4°С, соотношение нуклеозид:фосфат 1:10).

субстрат КР{МКР) кт* (К,), мкМ 1г ** с"' ксаі/Кщ, мкМ-'/с-'

тимидин 0,07(14,3) 300 198 0,66 переносимые модификации субстрата

2'-дезоксиуридин 0,04 (25) 320 35 0,18

4-тиотимидин 0,07 (14,3) 280 63 0,25 но

5 '-дезокситимидин 0,05 (20) 400 260 0,64

5'-хлор-5'-дезокситимидин 0,07 (14,3) 300 1,7 0,006

5 '-бром -5'-дезокситамидин (400) -

5'-иод-5'-дезокситимидіш (400) -

5'-С-метил(0-алло)тимидин 0,14(7.0) 330 0,1 0,0003

5'-С-метил(Ь-тало)тимидин 0,1(10) 350 0,45 0,0013

5'-ГОМО-ТИМИДИП 0,068(14,6) 300 0,06 0,0018

З'-амино-З'-дезокситимидин (600) -

З'-амино-З'-дезокситимидин рН 8,0 нд 400 1.1 0,0027

5'-азидо-5'-дсзокситимидин - -

2',3'-дішегидро-3'-дезокси-тимшшн нд 350 0,4 0,0011 модификации, приводящие к потере субстратных свойств

З'-дезокситимвдин (850) -

2'-дезокси-Р-0-трео-пентафуранозилтимип (450) - Вг.1,М5 чХ \ ххн НО-, о » О сн>о„

р-д- арабинофуранозилуращш (1000) -

уридин (60) -

5'-дезоксиуридин (450) -

2-тиоуридин (800) -

5-метиридин (100) -

урацил (350) -

* «-» Практически не ингибирует при концентрации 1мМ.

** «-» Скорость реакции составляет менее 0,1% от скорости природного субстрата, нд - пет данных. Ошибка измерений К„ и кс„, не превышала 20%. Ошибка измерений Кр не превышала 10%.

Полученные в настоящей работе результаты сопоставлены с известными данным рентгеноструктурного анализа и молекулярной динамики и сделаны следующие выводы. Пр связывании нуклеозида в активном цапре ТФ за счет водородных связей гетероциклически основания, начинается движение а-домена, которое приводит к значительному сближению нуклеозщ и фосфата, и, вероятно, что это движение продолжается до тех пор, пока не образуется водородш связь З'-ОН группы с НЫ-группой основной цепи (№-123) и с атомами кислорода фосфат Образование этой связи завершает процесс формирования фермент-субстратного комплекса размещает нуклеозид и фосфат в позиции, удобной для осуществления нуклеофилыюй атаки.

С литературной моделью, хорошо согласуется тот факт, что модификации в 5'-положет тимидина не мешают связыванию нуклеозида в активном центре фермента и во многих случаях I влияют на фосфоролиз. В то же время, при наличии у 2'-углеродного атома гидроксяльной групп (рибопуклеозиды) возможно образование водородной связи с азотом 1^-85. Вероятно, что вследств. этой дополнительной связи увеличивается сродство нуклеозида к ферменту по сравнению природным субстратом. С другой стороны образование водородной связи блокирует участие П«-85 протонировании С2=0 и ингибирует реакцию.

3. Субстратная специфичность УФ.

УФ является менее специфичным ферментом по сравнению с ТФ. УФ катализирует фосфорол как уридина, так и тимидина (Таблица 4). В то же время пуршювые нуклеозиды, а также цитидин ; являются субстратами. В случае УФ для образования фермент-субстратного комплекса необходш образование водородных связей с гидроксильными группами в 2', 3' и 5'-положении. Фосфоролиз : дезоксиуридина и 5'-дезоксиуридина, катализируемый УФ, протекает на порядок медленнее, чем случае уридина. Введение метальной группы в 5-ое положение гетероцикла еще больше снижа эффективность реакции. Полученные данные важны для понимания механизма дискриминац природных уридина и тимидина пиримщшннуклеозидфосфорилазами. Тимидин превращается ТФ I раза эффективнее, чем 2'-дезоксиуридин.

Как и в случае ТФ, 4-тиопиримидиновые нуклеозиды являются хорошими субстратами для УФ то время как 2-тиоуридин практически не связывается с УФ. Все изученные константы равновес лежат в диапазоне 0,05-0,2 и практически не зависят от структуры субстрата. Исключение составл; 6-мегалуридин, который медленно превращается в 6-метилурацил. В данном случае обратная рсаки не идет, как и в случае фосфоролиза 7-метил-пуриновых нуклеозидов ПНФ.

Интересные результаты были получены при изучении субстратных свойств С-метилуридинов. этих соединениях сохраняются все функциональные группы природного уридина. При введен метальной группы в молекулу нуклеозидов изменяются конформащщнные свойства и реакционн способности соседних гидроксильных групп. Наличие объемных метильных групп может привесп

возникновению межмолекулярных и внутримолекулярных стерических затруднений при фиксировании субстрата в определенной конформашш в фермент-субстратном комплексе.

Рассмотрим два крайних случая применимости этого подхода, а) Аналог хорошо связывается и расформируется ферментом, следовательно для конформаций субстрата в фермент-субстратных комплексах выполняются условия Еанал)га ~ Е^^дн^ соединения- б) Аналог не связывается с ферментом, огда конформашш субстрата следует искать в областях, где Еа„ал0Пі » Е^^дито соединим при условии, что введение объемной метальной группы приводит к внутримолекулярным, а не межмолекулярным стерическнм затруднениям. Применение этой концепции позволило уточнить конформацшо субстрата в ходе его превращения некоторыми ферментами биосинтеза нуклеиновых кислот (С.Н.Михайлов, Ю.П.Лысов, Г.И. Яковлев. Молекулярная биология 33, 393-407, 1999).

5'-С-Метилуридины являются субстратами для УФ, причем эффективность фосфоролиза 5'-С-метилуридина с Ь-тало-конфигурацией совпадает с реакцией уридина. Второй диастереомер с О-алло-конфигурацией реагирует с фосфатом на порядок медленнее. 2'-С-Метилуридин и З'-С-метилуридин не являются субстратами УФ и практически не связываются с ферментом. По опубликованным данпым рентгеноструктурного анализа комплексов уридина с УФ в активном центре фермента нет аминокислотных остатков, которые могли бы контактировать с метилыюй группой. Согласно расчетным данным, в З'-С-метилнуклеозидах для Ы-конформеров наблюдаются энергетически запрещенные конформаций, в 8-конформерах не происходит внутримолекулярных наталкиваний. Введение в 2'-положение метальной группы приводит к значительному повышению энергетического барьера син-анти-перехода, связашюго с наталкиванием протона в 6-положении или карбонильной группы во 2-ом (для пуриновых нуклеозидов, протона в 8-положении или азота 3-положении гетероцикла) па 2'-С-метильную группу.

Дополнительным доказательством необычной конформации субстрата, когда карбонильная группа находится вблизи 2'-протона, являются следующие факты. Эффективность фосфоролиза (3-£)-арабинофуранозилурацила в 25 раз меньше по сравнению с 2'-дезоксиуридином. В то же время 2,2'-О-ангадро-Р-О-арабинофуранозплурацил, моделирующий сверх-сиц-конформацию субстрата, хорошо связывается с ферментом, несмотря на отсутствие протона в 3-положении гетероциклического основания, играющего важную роль в связывании субстрата.

Прямым доказательством необычной сверх-син-конформации субстрата являются рептгеноструктурные данные комплекса уридина и сульфата с УФ 5Ие\уапе11а опеійетіз. (рисунок 4). Этот фермент гомологичен УФ Е.соїі, а активный центр практически совпадает. Константы равновесия и кинетические характеристики этих ферментов в отношении уридина, тимидина и 5-метилуридина сходны. Необычная структура уридина характеризуется торсионным углом С2-Ы1-СГ-С2' равным 9,4', длина гликозидной связи N1-0' составляет 1,48 А, а расстояние между атомом СГ уридина и 04 Б04 равняется 3,58 А. Расстояние 02-С2' составляет 3,01 А, что свидетельствует о значительных стерических затруднениях в данной конформации уридина.

13

Таблица 4. Кинетические параметры для ферментативного фосфоролиза УФ уридина и еі производных, измеренные спеетрофотометрически (50 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7, температура 25°С. Значения Кр измерены в 50 мМ Трис-буфере, рН 7,5, температура 37°(

соотношение нуклеозид: фосфат 1:20).

субстрат КР(УКР) К,„*(КІ), мкМ t ** с' kcaJKiти mkM'Vc'1

уридин 0,05 (18,6) 80 98 1,22 переносимые модификации субстрата

4-тиоуридин 0,06 (16) 120 49 0,41

5 -метилуридші 0,06(16) 65 4,8 0,074 ^.......э Ме 5 НО^ О но он \„

2'-дезоксиуридин 0,07 (14,3) 133 14 0,1

5'-гомо-уридші 0,09(11,2) 174 97 0,56

5 '-дезоксиурвдин 0,06(16) 180 И 0,1

5 '-дезокситимидин >0,01 ** - -

тимидин 0,17(5,9) 270 5 0,02

5'-С-метил(Ь-тало)уридин 0,09(11,2) 280 360 1,28

5'-С-метил(0- алло)уридин 0,23 (4,1) 400 45 0,11

ß-D-арабино-фуранозилурашм 0,12(8,3) 500 2 0,004 модификащш, приводящие к потере субстратных свойств

2'-С-метилуридин - - но-1 о о Ме —у /—Ме но он

З'-С-метилуридин - -

2-тиоуридин - -

6-метилуридин ОО 1030 24 0,023

2,2'-0-ангидро-Р-0-арабииофуранозил-урацил (10) -

З'-дезокситимидин - -

* «-» Практически не ингибирует при концентрации 1мМ.

** «-» Скорость реакции составляет менее 0,1% от скорости природного субстрата. Ошибка измерений Кт и кса, не превышала 20%. Ошибка измерений Кр не превышала 10%.

!7(АКО

Г'исунок 4. Связывание уридина и сульфата в активном центре УФ 57?еи<аие//а опеіііетіз. Остатки Ніз5 и А^45 принадлежат соседней субъединице (данные получены ведущим научным сотрудником ИМБ РАН к.ф.-м.н. К.М.Поляковым) (разрешение 1,75 А).

4 Субстратная специфичность ПНФ.

ПНФ является наименее специфичным ферментом и катализирует фосфоролиз пуриновых -уклеозидов как рибо- так и 2'-дезоксирибо-ряда (таблица 5). В то же время пиримидиновые гуклеозиды не являются ее субстратами. ПНФ катализирует фосфоролиз 2-замещенных и N1-етилпроизводных. Все изученные константы равновесия лежат в диапазоне 0,005-0,02 и мало зависят :т структуры субстрата за исключением КП-метилпроизводных аденозина. В данном случае реакция ; осфоролиза, по сравнению с пиримидиннуклеозидфосфорилазами, существенно сильнее сдвинута в : горону образования нуклеозида.

Таблица 5. Кинетические параметры для ферментативного фосфоролиза ПНФ произво, нуклеозидов пуринового ряда, измеренные спектрофотометрически (50 мМ калий-фосфатный буфе рН 7,5 при температуре 25°С. Значения Кр измерены в 50 мМ Трис-буфере, рН 7,5 при температу]

37°С, соотношение нуклеозид: фосфат 1:20).

Субстрат КР(1/КР) Кт* (К,), мкМ 1- ** л-саі с-' мкМ"'/с"1

инозин 0,0274 (36,5) 40 325 8,8 переносимые модификащ субстрата

аденозин 0,013 (77) 50 343 6,86 СН2РИ Ме5,0=1 Ма . ' Ме \ XVй2 ы \ Ме у^ Р.СІ но он \н

гуанозин 0,013 (77) 45,6 260 5,72

2'-дезоксиаденозин 0,016(62,5) 13,2 202 15,33

2'-дезоксигуанозин 0,007 (143) 71,4 627 8,78

2'-дезоксиинозин 0,02 (50) 67 667 9,95

З'-дезоксиаденозин (850) -

2'-С-метиладенозин - -

З'-С-метиладенозин нд 250 8,4 0,034

З'-С-этиладенозин - -

2-хлораденозин 0,0082(121) 24,4 43,6 1,8

2-хлор-2'-дезоксиаденозин 0,0057(176) 29,4 31,2 1,06 модификации, приводящг к потере субстратных свойств

5'-С-метил(Ь-тало)-аденозин 0,0053 (189) 21,7 34,6 1,6 ЫНг Вгч 1 чт НО-, ОоМ N V У—ме но он

5'-С-метил(0-алло)-аденозин 0,0045 (222) 13,2 4,7 0,42

5'-гомо-аденозин 0,0124(81) 71,4 190 2,7

5',6'- дидезокси-5',6'- дидегидро-р-£)-аллофуранозиладенин нд 77 0,5 0,0066

2-фтораденозин 0,013 (77,5) 42 230 5,5

1-метиладенозин 0,053 (19) 28,6 23 0,80

1 -метил-2'-дезокси аденозин 0,05 (20) 62,5 42,7 0,68

7-метил-6-тиогуанозин 8,3 55,4 6,65

8-бромаденозин (760) -

8,2'-0-ангидро-Р-/)-арабинофуранозилгуанин (9) -

* «-» Практически не ингибирует при концентрации 1мМ.

** «-» Скорость реакции составляет менее 0,1% от скорости природного субстрата, нд - нет данных. Ошибка измерений Кт и кса, не превышала 20%. Ошибка измерений Кр не превышала 10%.

Как и в случае УФ, для образования фермент-субстратного комплекса необходимо образование дородных связей с гидроксильными группами в 3'- и 5'-положении. 2'-С-Метиладенозип не является бстрагом ПНФ и практически не связывается с ферментом. Введение объемной метальной группы в ■положение аденозипа приводит к существенному замедлению реакции, а фосфоролиз З'-С-иладенозина уже не идет. Согласно расчетным данным, в З'-С-метилнуклеозидах для Ы-конформеров бшодаются энергетически запрещенные конформашш, в Э-конформерах не происходит утримолекулярных наталкиваний. Наличие объемных заместителей в 8-ом положении гетероцикла кже приводит к потере субстратных свойств. В то же время 8,2'-0-ангидро-р-0-абинофуранозилгуанин, моделирующий сверх-анти-конформацию субстрата, хорошо связывается с рментом.

Суммируя полученные данные, можно предположить, что в продуктивном фермент-субстратном мплексе реализуется сверх-анти-конформация нуклеозида, в которой 8-ой протон пуринового нования находится в непосредственной близости к 2'- и З'-протонами углеводного остатка, которой ходится в Ы-конформации. Полученные и литературные данные указывают на сходство архитектуры гивных центров УФ и ПНФ при связывании субстрата в напряженной конформации, в которой оисходит внутримолекулярное наталкивание гетероциклического основания на протоны певодного остатка.

В последние годы развиваются новые методы синтеза производных нуклеиновых оснований, в горых в качестве исходных соединений используются природные нуклеозиды. Следует отметить, э стоимость этих соединений, как правило, существенно ниже стоимости нуклеиновых оснований, юме того, выделение и очистка производных нуклеозидов с помощью адсорбционной оматографии на силикагеле менее трудоемка. Использование этой методологии позволяет щественно расширить и дополнить, а в ряде случаев и значительно упростить схемы получения героциклов с гидрофобными группами. Для гидролиза М-гликозидной связи обычно используются льные кислоты, однако в случае получения кислотолабильных соединений целесообразнее пользовать нуклеозидфосфорилазы. Разработка этого подхода позволит расширить практическое именение 1гуклеозидфосфорилаз.

Недавно в ИМБ РАН разработан удобный метод получения Мб-замещенных аденозинов килированием М6-ацетил-2',3',5'-три-0-ацетиладенозина с последующим удалением ацетильных дитных групп. Был изучен фосфоролиз М^-замегценных аденозинов (таблица 6), кинетические раметры получены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. В этом случае стинкции Ы^-замещенных производных аденозина и соответствующих производных аденина актически совпадают и невозможно использовать спектрофотометрический метод. Как видно из Злицы 8, Ы6-производные аденозина являются хорошими субстратами для ПНФ, продукты их 1Сфоролиза - бензиламинопурин, кинетин и изопентеннладенин являются природными токининами. Как уже отмечалось выше, равновесие реакции фосфоролиза ПНФ сдвинуто в сторону

17

образования нуклеозида (а). Для сдвига равновесия в сторону искомых аденшюв к раствору нуклеозида и ПНФ при рН 7,5 и 30°С добавляли щелочную фосфатазу Е.соїі (Ь), которая гидролизует рибозо-1-фосфат до О-рибозы (схема 2). При охлаждении до 0°С М6-замещенные аденины кристаллизовались непосредственно из реакционной смеси с хорошими выходами (50-68%). Таким образом показано, что ПНФ и щелочная фосфатаза могут быть использованы для гидролиза М-гликозидной связи в мягких условиях.

Таблица 6. Кинетические параметры для ферментативного фосфоролиза ПНФ М6-производных аденозина, измеренные помощью ВЭЖХ (50 мМ калий-фосфатный буфер, РН 7,5 при температуре 25°С. Значения Кр измерены в 50 мМ Трис-буфере, рН 7,5 при, температуре 37°С, соотношение нуклеозид: фосфат 1:20).

Нуклеознд

аденозин

1\)6-фурфуриладепозин

N -бензиладенозіш

Ы"-изопренил аденозин

Кр (1 !КР)

0,013 (77)

0,0088(114)

0,011 (88)

0,0082 (122)

Кт(К,), цМ

45

28

47

15

301

165

283

135

ксЛ£т, с" / (іМ

6,7

5,9

6.0

Ошибка измерений Кт и ксМ не превышала 20%. Ошибка измерений К„ не превышала 10%

ЫН

<;я $

НО I 0 ^ N

ЫН

но-

О

НО-Р-ОН

но он он

ч+

нм"4^ ^ ¿н он

<-д ;

ЫН н0

НО ОН

о

НО-^-ОН

он

Схема 2. Получеіше Ыб-производных аденина. а. ПНФ; Ь. щелочная фосфатаза.

выводы

I. Для спектрофотометрического определения активности уридинфосфорилазы и шидинфосфорилазы и измерения констант ингибирования предложены новые субстраты: 4-юуридин и 4-тиотимидин. Разработан удобный метод определения констант равновесия реакции осфоролиза нуклеозидов, каталюируемой нуклеозидфосфорилазами E.coli.

Изучена субстратная специфичность тимидинфосфорилазы E.coli. Показано, что связывание /бстрата с ферментом за счет водородных связей с атомами основания и З'-ОН, но не 5'-ОН играет почевую роль в формировании фермент-субстратного комплекса в «закрытой» конформации ермента и осуществлении реакщш.

Для субстратной специфичности уридинфосфорилазы E.coli показана важная роль 3'- и 5'-щроксильных групп уридина и определена необычная конформация субстрата в активном центре ермента, в которой карбонильная группа во 2-ом положении находится вблизи 2'-протона -леводного остатка.

Выявлены функциональные группы субстрата, ответственные за связывание с уршшуклеозидфосфорилазой E.coli. Определено сходство архитектуры активных центров УФ и ПНФ зи связывании субстрата в напряженной конформации, в которой происходит наталкивание тероциклического основания на протоны углеводного остатка.

Разработан удобный метод получения Т^-замещенных аденинов исходя из соответствующих юизводных аденозина с использованием пуриннуклеозидфосфорилазы E.coli и щелочной фосфатазы coli.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях: Статьи

Н.Г. Панова, Е.В. Щевелева, К.С. Алексеев, В.Г. Мухортов, А.Н. Зуев, С.Н. Михайлов, P.C. Есипов, .В. Чувиковский, А.И Мирошников. Использование 4-тиоурид1ша и 4-тиотимидина для изучения фимцциннуклеозидфосфорилаз. // Молекулярная биология, 2004, т. 38, Х»5, 907-913. Н.Г. Панова, К.С. Алексеев, A.C. Кузьмичев, Е.В. Щевелева, С.А. Гаврюшов, K.M. Поляков, A.M. рицьш, С.Н. Михайлов, P.C. Есипов, А.И. Мирошников. Субстратная специфичность шидинфосфорилазы Escherichia coli. //Биохимия, 2007, т. 72, №1,27-35.

N.G. Panova, C.S. Alexeev, K.M. Polyakov, S.A. Gavryushov, A.M. Kritzyn, S.N. Mikhailov. Substrate jecificity of Thymidine Phosphorylase of E. Coli: Role of Hydroxyl Groups. // Nucleosides, Nucleotides and ucleic Acids, 2008, v. 27, №12, 1211-1214.

V. I. Tararov, S. V. Kolyachkina, C. S. Alexeev, S. N. Mikhailov. ;Vc-Acetyl-2',3',5'-tri-0-acetyladenosine-lonvenient, missed out substrate for regioselective TV'-alkylations. // Synthesis, 2011, №15, 2483-2489.

Тезисы и предварительные сообщения

5. Н.Г. Панова, Е.В. Щевелева, К.С. Алексеев, С.Н. Михайлов, P.C. Есииов, Д.В. Чувиковский, А.И. Мирошников «Изучение субстратной специфичности урияинфосфорилазы и пиримидинфосфорилазы E.coli». XII международная конференция «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (31 мая - 9 июня 2004, Гурзуф-Ялта, Украина). Секция «Достижения современной биоорганической химии и перспективы их применения». Материалы конференции, с.69-71.

6. N. G. Panova, C.S. Alexeev, A.S.Kuzmichev, S. N. Mikhailov. Effect of sugar modification of uridine and thymidine on the binding of nucleoside analogues to uridine Phosphorylase and thymidine Phosphorylase E. coli. International conference Biocatalysis-2005: fundamentals & applications. St.Petereburg, RF, June 19-23, 2005. Abstract p.33.

7. C.S. Alexeev, N.G. Panova, K.M. Polyakov, S.N. Mikhailov. Substrate specificity of E. coli uridine Phosphorylase. XIX International Round Table "Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids" Lyon, France, 29 August - 3 September 2010. Conference book, Abstract PA011, pages 94-95.

8. S.V.Kolyachkina, V.I.Tararov, C.S.Alexeev, S.N.Mikhailov. Synthesis of N6-substituted adenosines. Collection Symposium series, 12,405-407 (2011). XV международный симпозиум по химии компонентов нуклеиновых кислот (XV Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components), (Hotel Ruze, Cesky Krumlov, Czech Republic, June 5-10,2011).

9. Т.Н.Сафонова, К.М.Поляков, К.С.Алексеев, К.М.Бойко, В.О.Попов. Кристаллизация предварительное рентгеноструктурное исследование уридинфосфорилазы из SHEWANELL ONEIDENSIS. // Современные проблемы науки и образования, 2011, №6, с.13.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, программы Президиума РА] «Молекулярная и клеточная биология» и Министерства образования и науки РФ (государствешш контракт № 16.512.11.2239).

Напечатано с готового оригинал-макета

Подписано в печать 11.09.2012 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 337.

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г.

119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 527 к. Тел. 939-3890,939-3891. Тел./факс 939-3891.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Алексеев, Кирилл Сергеевич

Введение.

Глава 1.ктурные особенности нуклеозидфосфорилаз (Обзор литературы).

1.1. Общие характеристики ферментов.

1.2. Структура тимидинфосфорилаз.

1.3. Структура уридинфосфорилаз.

1.4. Структура пуриннуклеозидфосфорилаз.

Глава 2. Субстратная специфичность нуклеозидфофорилаз Е. coli.

2.1. Общая характеристика ферментов и методы изучения кинетики и констант равновесия.

2.2. Субстратная специфичность ТФ.

2.3. Субстратная специфичность УФ.

2.4. Субстратная специфичность ПНФ.

Глава 3. Экспериментальная часть.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Субстратная специфичность нуклеозидфосфорилаз Escherichia coli"

Большое количество ферментов катализирует реакции биосинтеза и деградации нуклеотидов. Одним из типов таких ферментов нуклеинового обмена являются нуклеозидфосфорилазы. Они участвуют в дополнительном пути биосинтеза нуклеозидов и катализируют обратимую реакцию расщепления нуклеозидов по гликозидной связи с образованием гетероциклического основания и 1-фосфата моносахарида. К нуклеозидфосфорилазам относятся тимидинфосфорилаза (ТФ) (КФ 2.4.2.4), уридинфосфорилаза (УФ) (КФ 2.4.2.3) и пуриннуклеозидфосфорилаза (ПНФ) (КФ 2.4.2.1). Эти ферменты обнаружены почти у всех организмов, при этом отличия их первичной структуры сравнительно невелики [1].

В опухолевых клетках наблюдается повышенный уровень активности нуклеозидфосфорилаз, которые могут быть использованы в качестве маркеров онкологических заболеваний [2]. Эти ферменты применяются в промышленности для синтеза лекарственных препаратов и практически важных нуклеозидов [3-5]. В качестве примера можно привести известные ферментативные превращения нуклеозидов под действием УФ и ПНФ: Р-£>-арабинофуранозилурацил + УФ + неорганический фосфат —> урацил + а-£)-арабинофуранозил-1 -фосфат + ПНФ + аденин —> (3-£>-арабинофуранозиладенин. Также нуклеозидфосфорилазы используются для количественного определения неорганического фосфата [6].

Следует отметить, что субстратная специфичность этих ферментов исследована недостаточно полно. Это связано с отсутствием удобных методов определения кинетических параметров фосфоролиза нуклеозидов. Несмотря на большое количество работ, посвященное рассматриваемым ферментам, не определена роль функциональных групп нуклеозидов при формировании продуктивного фермент-субстратного комплекса. Практически отсутствуют данные о влиянии структуры нуклеозида и гетероциклического основания на положение равновесия реакции фосфоролиза, что важно для практического применения нуклеозидфосфорилаз. Вышесказанное и определяет актуальность и большой интерес к изучению субстратной специфичности и архитектуры активного центра этих ферментов.

Целью работы являлось изучение субстратной специфичности рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз Е. соИ. В ходе исследования решались следующие задачи: разработка удобных методов определения констант равновесия, констант Михаэлиса и констант ингибирования для этих ферментов; изучение фосфоролиза большой группы нуклеозидов, модифицированных как по углеводному остатку, так и гетероциклическому основанию; изучение роли гидроксильных групп нуклеозидов в связывании с ферментами; расширение возможностей использования ферментов для получения модифицированных нуклеозидов и гетероциклических оснований.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Алексеев, Кирилл Сергеевич

выводы

1. Для спектрофотометрического определения активности уридинфосфорилазы и тимидинфосфорилазы и измерения констант ингибирования предложены новые субстраты: 4-тиоуридин и 4-тиотимидин. Разработан удобный метод определения констант равновесия реакции фосфоролиза нуклеозидов, катализируемой нуклеозидфосфорилазами E.coli.

2. Изучена субстратная специфичность тимидинфосфорилазы E.coli. Показано, что связывание субстрата с ферментом за счет водородных связей с атомами основания и 3'-ОН, но не 5'-ОН играет ключевую роль в формировании фермент-субстратного комплекса в «закрытой» конформации фермента и осуществлении реакции.

3. Для субстратной специфичности уридинфосфорилазы E.coli показана важная роль 3'- и 5'-гидроксильных групп уридина и определена необычная конформация субстрата в активном центре фермента, в которой карбонильная группа во 2-ом положении находится вблизи 2'-протона углеводного остатка.

4. Выявлены функциональные группы субстрата, ответственные за связывание с пуриннуклеозидфосфорилазой E.coli. Определено сходство архитектуры активных центров УФ и ПНФ при связывании субстрата в напряженной конформации, в которой происходит наталкивание гетероциклического основания на протоны углеводного остатка.

5. Разработан удобный метод получения ^-замещенных аденинов исходя из соответствующих производных аденозина с использованием пуриннуклеозидфосфорилазы E.coli и щелочной фосфатазы E.coli.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Алексеев, Кирилл Сергеевич, Москва

1. Pugmire M.J., Ealick S.E.// Structural analyses reveal two distinct families of nucleoside phosphorylases // Biochem. J., 2002, N 361, p. 1-25.

2. Pizzorno G., Cao D., Leffert J.J., Russell R.L., Zhang D., Handschumacher R.E. Homeostatic control of uridine and the role of uridine phosphorylase: a biological and clinical update. // Biochim. Biophys. Acta Rev., 2002,1587, p. 133-144.

3. Krenitsky T.A., Koszalka G.W., Tuttle J.V. Purine nucleoside synthesis, an efficient method employing nucleoside phosphorylases. // Biochemistry, 1981, 20, N12, p.3615-3621.

4. Utagawa T. Enzymatic preparation of nucleoside antibiotics. // J. Mol. Catal. B: Enzym., 1999, 6, p. 215-222.

5. Mikhailopulo I.A., Miroshnikov A.I. Biologically important nucleosides: modern trends in biotechnology and application. // Mendeleev Commun., 2011, 21, p. 57-68.

6. Webb M.R. A continuous spectrophotometric assay for inorganic phosphate and for measuring phosphate release kinetics in biological systems. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1992, 89, N11, p. 4884-4887.

7. Neuhard J. Utilization of preformed pyrimidine bases and nucleosides. In Metabolism of Nucleotides, Nucleosides, and Nucleobases in Microorganisms. // (Munch-Peterson, A., ed.), 1983, p. 95-148, Academic Press, London.

8. Nygaard P. Utilization of preformed purine bases and nucleosides. In Metabolism of Nucleotides, Nucleosides, and Nucleobases in Microorganisms. // (Munch-Peterson, A., ed.), 1983, p. 27-93, Academic Press, London.

9. Leer J.C., Hammer-Jespersen K., Schwartz M. Uridine phosphorylase from Escherichia coli. Physical and chemical characterization // Eur. J. Biochem., 1977, 75, p. 317-224.

10. Schwartz M. Thymidine phosphorylase from Escherichia coli. II Meth. Enzymology., 1978, 51, p. 442-445.

11. Bennett E.M., Li C., Allan P.W., Parker W.B., Ealick S.E. Structural Basis for Substrate Specificity of Escherichia coli Purine Nucleoside Phosphorylase. // J.Biol. Chem., 2003, 278, N47, p.47110-47118.

12. Liu M., Cao D., Russell R., Handschumacher R.E., Pizzorno G. Expression, Characterization, and Detection of Human Uridine Phosphorylase and Identification of Variant

13. Uridine Phosphorolytic Activity in Selected Human Tumors.// Cancer Res., 1998, 58, p.5418-5424.

14. Bose R., Yamada E.W. Uridine Phosphorylase, Molecular Properties and Mechanism of Catalysis. // Biochemistry, 1974,13, N10, p.2051-2056.

15. Jensen K.F., Nygaard P. Purine nucleoside phosphorylase from E.coli and 5. typhiurium. II Eur. J. Biochem. 1975, 51, p. 253-265.

16. Панова Н.Г., Алексеев К.С., Кузьмичев A.C., Щевелева Е.В., Гаврюшов С.А., Поляков K.M., Крицын A.M., Михайлов С.Н., Есипов P.C., Мирошников А.И. Субстратная специфичность тимидинфосфорилазы Escherichia coli. II Биохимия, 2007, т. 72, 27-35.

17. Алексеев К.С. Субстратная специфичность нуклеозидфосфорилаз Escherichia coli: диссертация кандидата химических наук 03.01.03. // Москва, 2012.

18. Manson L.A., Lampen J.О. Some chemical properties of desoxyribose nucleosides. // J. Biol. Chem., 1951,191, p.87-93.

19. Levene P.A., Medigreceanu F. On nucleases. // J. Biol. Chem., 1911, 9, p. 65-83.

20. Levene P.A., Yamagawa M., Weber I. On nucleosidases. I. General Properties. // J. Biol. Chem., 1924, 60, p. 693-706.

21. Levene P.A., Weber I. On nucleosidases. II. Purification of the enzyme. // J. Biol. Chem. 1924, 60, p. 707-720.

22. Klein W. Experimentelle Studien über den nucleinstoffwechsel. XXXVII. Über nucleosidase. HZ. Physiol. Chem., 1935, 231, p. 125-148.

23. Kalckar H.M. Enzymatic synthesis of nucleosides. II Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol., 1945, 4, p. 248-252.

24. Kalckar H.M. The enzymatic synthesis of purine ribosides. // J. Biol. Chem., 1947, 167, p. 477-486.

25. Kalckar H.M. Enzymatic synthesis of a nucleoside. II J. Biol. Chem., 1945,158, p. 723-724.

26. Paege L.M., Schlenk, F. Bacterial uracil riboside phosphorylase. II Arch. Biochem. Biophys., 1952, 40, p. 42-49.

27. Friedkin M., Roberts, D. The enzymatic synthesis of nucleosides. I.Thymidine phosphorylase in mammalian tissue. II J. Biol. Chem., 1954, 207, p. 245-256.

28. Friedkin M., Roberts, D. The enzymatic synthesis of nucleosides. II.Thymidine and related pyrimidine nucleosides. II J. Biol. Chem., 1954, 207, p. 257-266.

29. Galmarini C.M. Drug evaluation: forodesine-PNP inhibitor for the treatment of leukemia, lymphoma and solid tumor. // Drugs., 2006, 9, N10, p. 712-722

30. Sorscher E.J., Peng S., Bebok Z., Allan P.W., Bennett Jr. L. L. Parker W.B. Tumor cell bystander killing in colonic carcinoma utilizing the Escherichia coli DeoD gene to generate toxic purines. // Gene Ther. 1994,1, p. 233-228.

31. Stoeckler J. D. Purine nucleoside phosphorylase: a target for chemotherapy. // In Development in Cancer Chemotherapy (Glazer, R. E., ed.), CRC Press, Boca Raton, FL, 1984, p. 35-60.

32. Arpicco S, Dosio F, Stella B, Cattel L.Anticancer Prodrugs: An Overview of Major Strategies and Recent Developments.// Curr. Top. Med. Chem., 2011, 11, N18 ,p. 2346-2381.

33. Lee C.S., Jiménez B.M., O'Sullivan W.J. Purification and characterization of uridine (thymidine) phosphorylase from Giardia lamblia. II Mol. Biochem. Parasitol., 1988,. 30, N3, p. 271-277.

34. Beck D.A., O'Donovan G.A. Pathways of pyrimidine salvage in Pseudomonas and former Pseudomonas: detection of recycling enzymes using high-performance liquid chromatography. // Curr Microbiol., 2008, 56, N2, p. 162-167.

35. Bzowska A., Kulikowska E., Shugar D. Properties of purine nucleoside phosphorylase (PNP) of mammalian and bacterial origin. // Z. Naturforsch C., 1990, 45, N 1-2, p.59-70.

36. Miller R.L., Sabourin C.L., Krenitsky T.A. Trypanosoma cruzi adenine nucleoside phosphorylase: Purification and substrate specificity. // Biochem. Pharm., 1987, 36, N4, p. 553— 560.

37. Giblett E.R., Ammann A.J., Wara D.W., Sandman R., Diamond L.K. Nucleoside-phosphorylase deficiency in a child with severely defective T-cell immunity and normal B-cell immunity.//Lancet., 1975,1,N7914, p.1010-1013.

38. Mitchell B.S., Mejias E., Daddona P.E., Kelley W.N. Purinogenic immunodeficiency diseases: selective toxicity of deoxyribonucleosides for T cells. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1978, 75, N10, p. 5011-5014.

39. Takebayashi Y., Yamada K., Maruyama I., Fujii R., Akiyama S., Aikou T. The expression of thymidine phosphorylase and thrombomodulin in human colorectal carcinomas. // Cancer Lett., 1995, 92,Nl,p.l-7.

40. Toi M., Hoshina S., Taniguchi T., Yamamoto Y., Ishitsuka H., Tominaga T. Expression of platelet-derived endothelial cell growth factor/thymidine phosphorylase in human breast cancer. II Int. J. Cancer, 1995, 64, p.79-80.

41. Maehara Y., Sakaguchi Y., Kusumoto T., Kusumoto H., Sugimachi K. Species differences in substrate specificity of pyrimidine nucleoside phosphorylase. // J. Surg. Oncol., 1989, 42, N3, p.184-186.

42. Furukawa T., Yoshimura A., Sumizawa T., Haraguchi M., Akiyama S., Fukui K., Ishizawa M., Yamada Y. Angiogenic factor. //Nature., 1992, 356, (6371), p.668.

43. Usuki K., Saras J., Waltenberger J., Miyazono K., Pierce G., Thomason A., Heldin C.H. Platelet-derived endothelial cell growth factor has thymidine phosphorylase activity. Biochem. // Biophys. Res. Commun., 1992,184, N3, p. 1311-1316.

44. Miyadera K., Dohmae N., Takio K., Sumizawa T., Haraguchi M., Furukawa T., Yamada Y., Akiyama S. Structural characterization of thymidine phosphorylase purified from human placenta. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, 212, N3, p. 1040-1045.

45. Haraguchi M., Miyadera K., Uemura K., Sumizawa T., Furukawa T., Yamada K., Akiyama S., Yamada Y. Angiogenic activity of enzymes. // Nature, 1994, 368, (6468), p. 198.

46. Asai K., Hirano T., Kaneko S., Moriyama A., Nakanishi K., Isobe I., Eksioglu Y.Z., Kato T. A novel glial growth inhibitory factor, gliostatin, derived from neurofibroma. // J. Neurochem., 1992, 59, N1, p. 307-317.

47. Utagawa T., Morisawa H., Miyoshi T., Yoshinaga F., Yamazaki A., Mitsugi K. A novel and simple method for the preparation of adenine arabinoside by bacterial transglycosylation reaction. // FEBSLett., 1980,109, N2, p.261-263.

48. Morisawa H., Utagawa T., Miyoshi T., Yoshinaga F., Yamazaki A., Mitsugi K. A new method for the synthesis of some 9-P-arabinofuranosylpurines by a combination of chemical and enzymatic reactions. // Tetrahedron Lett., 1980, 21, p.479-482.

49. Verheyden J.P.H., Wagner D., Moffatt J.G. Synthesis of some pyrimidine 2D-amino-2D-deoxynucleosides. II J. Org. Chem., 1971, 36, N2, p. 250-254.

50. Utagawa T., Morisawa H., Nakamatsu T., Yamazaki A., Yamanaka S. Enzymatic synthesis of purine 2'-amino-2'-deoxyriboside. II FEBS Lett., 1980,119, N1, p. 101-104.

51. Krenitsky T.A., Koszalka G.W., Tuttle J.V., Rideout J.L., Elion G.B. An enzymic synthesis of purine D-Arabino nucleosides. // Carbohyd Res., 1981, 97, N1, p. 139-146.

52. Ferrero M., Gotor V. Chemoenzymatic Transformations in Nucleoside Chemistry. // Monat. Chemie, 2000,131, p. 585-616.

53. Ferrero M., Gotor V. Biocatalytic Selective Modifications of Conventional Nucleosides, Carbocyclic Nucleosides, and C-Nucleosides. // Chem. Rev., 2000,100, p. 4319-4347.

54. Tozzi M.G., Camicil M., Mascial L., Sgarrella F., Ipata P.L. Pentose phosphates in nucleoside interconversion and catabolism. // FEBSJ., 2006, 273, p. 1089-1101.

55. Mikhailopulo I.A. Biotechnology of Nucleic Acid Constituents State of the Art and Perspectives. // Curr. Org. Chem., 2007, 11, p. 317-335.

56. Patel R.N. Synthesis of chiral pharmaceutical intermediates by biocatalysis. // Coord. Chem. Rev., 2008, 252, p. 659-701.

57. Михайлопуло И.А., Мирошников А.И. Современные тенденции в биотехнологии нуклеозидов. // Acta Naturae, 2010, 2, №2 (5), стр. 38-61.

58. Li N., Smith T.J., Zong M.-H. Biocatalytic transformation of nucleoside derivatives. // Biotechnol. Adv., 2010, 28, p. 348-366.

59. Mikhailopulo I.A., Miroshnikov A.I. Biologically important nucleosides: modern trends in biotechnology and application. // Mendeleev Commun., 2011, 21, p. 57-68.

60. Ducati R.G., Breda A., Basso L.A., Santos D.S. Purine Salvage Pathway in Mycobacterium tuberculosis. II Curr. Med. Chem., 2011,18, p. 1258-1275.

61. Villela A.D., Sänchez-Quitian Z.A., Ducati R.G., Santos D.S., Basso L.A. Pyrimidine Salvage Pathway in Mycobacterium tuberculosis. II Curr. Med. Chem., 2011,18, p. 1286-1298.

62. Brown N.S., Bicknell R. Thymidine phosphorylase, 2-deoxy-D-ribose and angiogenesis. // Biochem. J., 1998, 334, p. 1-8.

63. Akiyama S.-i., Furukawa Т., Sumizawa Т., Takebayashi Y., Nakajima Y., Shimaoka S., Haraguchi M. The role of thymidine phosphorylase, an angiogenic enzyme, in tumor progression. // Cancer Sei., 2004, 95, N11, p. 851-857.

64. A.A. Дашков, H.E. Жухлистова, T.A. Серегина, А.Г. Габдулхаков, A.M. Михайлов // Уридинфосфорилаза в биомедицинском, структурном и функциональном аспектах: обзор. //Кристаллография., 2011, т. 56, № 4, стр. 604-634.

65. Edwards P.N. A kinetic, modeling and mechanistic re-analysis of thymidine Phosphorylase and some related enzymes. // J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 2006, 21, N5, p. 483-518.

66. Погосян Jl.Г., Нерсесова Л.С., Газарянц М.Г., Мкртчян 3. С., Меликосетян Г.О., Акопян Ж.И. Ингибиторы пуриннуклеозидфосфорилазы и их клиническое значение. // Укр. 6ioxiM. журн., 2008, т.80, № 5, стр. 95-104.

67. Bronckaers А., Gago F., Balzarini J., Liekens S. The Dual Role of Thymidine Phosphorylase in Cancer Development and Chemotherapy. // Med. Res. Rev., 2009, 29, N6, p. 903-953.

68. Nencka R. Thymidine Phosphorylase Inhibitors. Anti-Angiogenesis Drug Discovery and Development. // Bentham Science Publisher (Eds Atta-ur-Raman, M.I.Choudhary), 2011, Vol. 1, p.l 16-147.

69. Walter M.R., Cook W.J., Cole L.B., Short S.A., Koszalka G.W., Krenitsky T.A., Ealick S.E. Three-dimensional structure of thymidine Phosphorylase from Escherichia coli at 2.8 A resolution. H J. Biol. Chem., 1990, V.265, N23, p.14016-14022.

70. Pugmire M.J., Cook W.J., Jasanoff A., Walter M.R., Ealick S.E. Structural and theoretical studies suggest domain movement produces an active conformation of thymidine phosphorylase. II J. Mol. Biol., 1998, V.281, N2, p.285-299.

71. Devereux J., Haeberli P., Smithies O. A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. // Nucleic Acids Res., 1984,12 (1 Pt 1), p.387-395.

72. Walton L., Richards C.A., Elwell L.P. Nucleotide sequence of the Escherichia coli uridine phosphorylase (udp) gene. 11 Nucleic Acids Res. 1989. V.17, N16, p. 6741.

73. Kim B.K., Cha S., Parks R.E. Jr. Purine nucleoside phosphorylase from human erythrocytes. I. Purifications and properties. II J. Biol. Chem., 1968, 243, p. 1771-1776.

74. Price V.E., Otey M.C., Plesner P. Preparation of nucleoside phosphorylase from calf spleen. // Methods Enzymol., 1955, 2, p. 448-453.

75. Lewis A.S., Glantz M.D. Bovine brain purine-nucleoside phosphorylase purification, characterization, and catalytic mechanism. // Biochemistry, 1976,15, p.4451-4457.

76. Lewis A.S., Glantz M.D. Monomeric purine nucleoside phosphorylase from rabbit liver. Purification and characterization. II J. Biol. Chem., 1976, 251, p.407-413.

77. Senesi S., Falcone G., Mura U., Sgarrella F., Ipata P.L. A specific adenosine phosphorylase, distinct from purine nucleoside phosphorylase. // FEBSLett., 1976, 64, p.353-357.

78. Seeger С., Poulsen С., Dandanell G. Identification and characterization of genes (xapA, xapB, and xapR) involved in xanthosine catabolism in Escherichia coli. II J. Bacteriol., 1995, 177, p. 5506-5516.

79. Hori N., Watanabe M., Yamazaki Y., Mikami Y. Purification and characterization of a second thermostable purine nucleoside Phosphorylase in Bacillus stearothermophilus JTS 859. // Agric. Biol., 1989, 53, p.3219-3224.

80. Bicknell R., Harris A.L., Mechanisms and therapeutic implications of angiogenesis. // Curr. Opin. Oncol, 1996, 8, p. 60-65.

81. Kraut A., Yamada E.W. Cytoplsmic uridine phosphorylase of rat liver. Characterization and kinetics. II J. Biol. Chem., 1971, 246, p. 2021-2030.

82. Desgranges C., Razaka G., Rabaud M., Bricaud H. Catabolism of thymidine in human blood platelets: purification and properties of thymidine phosphorylase. // Biochim. Biophys. Acta., 1981,654, N2, p. 211-218.

83. Rick S.W., Abashkin Y.G., Hilderbrandt R.L., Burt S.K. Computational Studies of the Domain Movement and the Catalytic Mechanism of Thymidine Phosphorylase: // Proteins: Structure, Function and Genetic., 1999, 37, p. 242-252.

84. Mushegian A., Koonin E. Unexpected sequence similarity between nucleosidases and phosphoribosyltransferases of different specificity. // Protein Sei., 1994, 3, p. 1081-1088.

85. Pugmire J.M., Ealick S.E. The crystal structure of pyrimidine nucleoside phosphorylase in a closed conformation. // Structure., 1998, 6, N11, p. 1467-1479.

86. Zhou M., Pugmire M.J., Vuong B.Q., Ealick S.E. Cloning, expression and crystallization of pyrimidine nucleoside phosphorylase from Bacillus stearothermophilus. II Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 1999, 55, (Pt 1), p. 287-290.

87. Mao C., Cook W.J., Zhou M., Federov A.A., Almo S.C., Ealick S.E. Calf spleen purine nucleoside phosphorylase complexed with substrates and substrate analogues. // Biochemistry., 1998, 37, N20, p. 7135-7146.

88. Erion M.D., Stoeckler J.D., Guida W.C., Walter R.L., Ealick S.E. Purine nucleoside phosphorylase. 2. Catalytic mechanism. // Biochemistry., 1997, 36, N39, p. 11735-11748.

89. Saenger W. Structure and conformational properties of bases, furanose sugars and phosphate groups. // In Principles of Nucleic Acid Structure (Cantor C.R., ed.), 1984, SpringerVerlag, New-York, p.51-104

90. Schwartz M. Thymidine phosphorylase from Escherichia coli. Properties and kinetics. // Eur. J. Biochem., 1971, 21, N2, p.191-198.

91. Avraham Y., Grossowicz N., Yashphe J. Purification and characterization of uridine and thymidine phosphorylase from Lactobacillus casei. II Biochim. Biophys. Acta., 1990, 1040, N2, p. 287-293.

92. Krenitsky T. A. Pentosyl transfer mechanisms of the mammalian nucleoside phosphorylases. II J. Biol. Chem., 1968, 243, N11, p. 2871-2875.

93. А. А. Дашков, H.E. Жухлистова, А.Г. Габдулхаков, A.M. Михайлов II Кристаллография, 2009, т. 54, №2, стр. 291-302.

94. А.А. Дашков, Н.Е. Жухлистова, С.Е.Сотниченко, А.Г. Габдулхаков, A.M. Михайлов // Кристаллография, 2010, т. 55, №1, стр. 44-60.

95. Vita A., Amici A., Cacciamani T., Lanciotti M., Magni G. Uridine phosphorylase from Escherichia coli В. Enzymatic and molecular properties. II Int. J. Biochem., 18, N5, p. 431-435.

96. Burling F.T., Kniewel R., Buglino J.A., Chadha T., Beckwith A., Lima C.D. Structure of Escherichia coli uridine phosphorylase at 2.0Â. // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. II2003, 59, p. 73-76.

97. Kline P.C., Schramm V.L. Purine nucleoside phosphorylase. Cataytic mechanism and transition-state analysis of the arsenolysis reaction. // Biochemistry, 1993, 32, p. 13212-13219.

98. Kline P.C., Schramm V.L. Pre-steady-state transition-state analysis of the hydrolytic reaction catalyzed by purine nucleoside phosphorylase. // Biochemistry, 1995, 34, N4, p. 11531162.

99. Blow D.M., Birktoft J.J., Hartley B.S. Role of a buried acid group in the mechanism of action of chymotrypsin. // Nature., 1969, 221, N178, p. 337-340.

100. Jensen K.F., Nygaard P. Purine nucleoside phosphorylase from Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Purification and some properties. // Eur. J. Biochem., 1975, 51, N1, p.253-265.

101. Hori N., Watanabe M., Yamazaki Y. Purification and characterization of thermostable purine nucleoside phosphorylase of Bacillus stearothermophilus JTS 859. // Agric. Biol. Chem., 1989, 53, N8, p. 2205-2210.

102. Hutchinson E.G., Thornton J.M. Promotif: a program to identify and analize structural motifs in proteins. // Protein Sci. 1996, 5, p. 212-220.

103. Mao C., Cook W.J., Zhou M., Koszalka G.W., Krenitsky T.A., Ealick S.E. The crystal structure of Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase: a comparison with the human enzyme reveals a conserved topology. // Structure. 1997, 5, p. 1373-1383.

104. Sundaralingam M., Sekharadu Y.C. Water-inserted a-helical segments implicates reverse turns as folding intermediates. // Science. 1989, 244, p. 1333-1337.

105. Koellner G., Kryger G., Millard C.B., Silman I., Sussman J.L., Steiner T. Active-site and buried water molecules in crystal structures of acetylcholinesterase from Torpedo californica. II J. Mol. Biol. 2000, 296, p. 713-735.

106. Koellner G., Luic M., Shugar D., Saenger W., Bzowska A. Crystal structure of calf spleen purine nucleoside phosphorylase in a complex with hypoxanthine at 2.15 A resolution. II J. Mol. Biol., 1997, 265, p. 202-216.

107. Mikleusevic G., Stefanic Z., Narczyk M., Wielgus-Kutrowska В., Bzowska A., Luic M. Validation of the catalytic mechanism of Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase by structural and kinetic studies. // Biochimie, 2011, 93, N9, p. 1610-1622.

108. Schramm V.L. Enzymatic transition-state analysis and transition-state analogs. // Methods Enzymol., 1999, 308, p. 301-355.

109. Bzowska A., Kulikowska E., Shugar D. Purine nucleoside phosphorylases: properties, functions, and clinical aspects. // Pharmacol. Ther., 2000, 88, N3, p. 349-425.

110. Stein R.L., Cordes E.H. Kinetic alpha-deuterium isotope effects for Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase-catalysed phosphorolysis of adenosine and inosine. // .J. Biol. Chem., 1981; 256, N2, p.767-772.

111. Lehikoinen P.K., Sinnott M.L., Krenitsky T.A. Investigation of alpha-deuterium kinetic isotope effects on the purine nucleoside phosphorylase reaction by the equilibrium-perturbation technique. // Biochem. J., 1989, 257, N2, p. 355-359.

112. Erion M.D., Takabayashi K., Smith H.B., Kessi J., Wagner S., Honger S., Shames S.L., Ealick S.E. Purine nucleoside phosphorylase. 1. Structure-function studies. // Biochemistry., 1997,36, N39, p. 11725-11734

113. Stoeckler J.D., Poirot A.F., Smith R.M., Parks R.E. Jr, Ealick S.E., Takabayashi K., Erion M.D. Purine nucleoside phosphorylase. 3. Reversal of purine base specificity by site-directed mutagenesis. // Biochemistry., 1997, 36, N39, p. 11749-11756.

114. Сергеев П.В., Донцова О.А., Богданов А.А., , Изучение структуры прокариотической рибосомы биохимическими методами: судный день. // Молекуляр. Биология., 2001, т.35, стр. 559-583.

115. Rao T.V., Haber M.T., Sayer J.M., Jerina D.M. Incorporation of 4-thiothymidine into DNA by the Klenow fragment and HIV-1 reverse transcriptase. // Bioorg. Med. Chem., 2000, Lett. 10, p. 907-910.

116. Гиллер С.А., Жук P.A., Лидак М.Ю. Докл. АН СССР, 1967,176, стр. 332-335.

117. Mikhailov S.N. Synthesis and properties of C'-methylnucleosides and their phosphoric esters. II Nucleosides & Nucleotides, 1988, 7 (5&6), p. 679-682.

118. C.H. Михайлов, Н.Ш. Падюкова, К.И. Панов. Удобный синтез 5'-Метил-2'-дезоксиуридинов. И Химия гетероцикл. соедин., 1989, №7, стр. 246-248.

119. С.Н. Михайлов. Достижения и перспективы направленного поиска антивирусных веществ в ряду нуклеозидов и их производных. // Биоорганическая химия, 1992, 18, №8, стр.1033-1066.

120. С.Н.Михайлов, Ю.П.Лысов, Г.И. Яковлев. Применение функционально-компетентных аналогов нуклеозидов и нуклеотидов для изучения фермент-субстратных взаимодействий. // Молекулярная биология, 1999, 33, №3, стр. 393-407.

121. Диксон М., Уэбб Э. // Ферменты, 1982, Мир, Москва.

122. Oivanen М., Hovinen J., Lehikoinen P., Lonnberg H. Hydrolysis of the vV-glycosidic bond of nucleosides and nucleotides. // Trends Org. Chem., 1993. 4. p. 397-412.

123. Russel, A., and Cambillou, C. // Silicon Graphics Geometry Partner Directory, 1991, Silicon Graphics, MountainView, CA, USA, p. 81.

124. Verheyden J.P.H., Moffatt J.G. Halo sugar nucleosides. III. Reactions for the chlorination and bromination of nucleoside hydroxyl groups. II J. Org. Chem., 1972, 37, N14, p 2289-2299.

125. C.H. Михайлов, Ю.П. Лысов, Г.И. Яковлев. Применение функционально-компетентных аналогов нуклеозидов и нуклеотидов для изучения фермент-субстратных взаимодействий. // Молекулярная биология, 1999, т. 33, №3, с. 393-407.

126. Tararov V.I., Kolyachkina S.V., Alexeev C.S., Mikhailov S.N. Vi-Acetyl-2,,3,,5,-tri-0-acetyladenosine a convenient, missed out substrate for regioselective A^-alkylations. // Synthesis, 2011, N15, p. 2483-2489.

127. Романов Г. А. Как цитокинины действуют на клетку // Физиология растений, 2009, т. 56, стр.295-319.159. .Parker W.B. Enzymology of Purine and Pyrimidine Antimetabolites Used in the Treatment of Cancer. // Chem. Rev., 2009,109, p. 2880-2893.

128. De Clercq E. Anti-HIV drugs: 25 compounds approved within 25 years after the discovery of HIV. // Int. J. Antimicrobial Agents, 2009,33, p. 307-320.

129. Вейко В.П., Сипарашвили 3.3., Ратманова К.И., Гулько Л.Б., Миронов А.А., Андрюхина Р.В. Изучение структурно-функциональной организации уридинфосфорилазы из Escherichia Coli. II Докл. акад. Наук., 1994, 339, стр. 819-821.

130. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика., 1991, «Мир», Моевка.

131. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и Министерства образования и науки РФ (государственный контракт № 16.512.11.2239).

132. Отдельно автор благодарит A.B. Алексееву, Т.М. Алексееву, за понимание и поддержку, а также Т.Б. Герасимову, друзей и близких за поддержку во время выполнения настоящей работы.