Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансгликозилирование гетероциклических оснований с использованием целых клеток Escherichia Coli

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Трансгликозилирование гетероциклических оснований с использованием целых клеток Escherichia Coli"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

Для служебного пользования

Экз. Л 19

КГОШЕВСКАЯ Лвдияла Анатольевна

УДК 577.113:577.15:579

ТРЛШ^ПЖОаИКРОЗАИКЕ ГЕТЕРОЩЗШИНШгХ ОСНОВАНИИ С ШЗОЛКЗОЗАНИ2,» ЦЕЛЫХ КЛЕТОК ЮИШИСНГА СОЫ

(специальность 03.00.0? - микробиология)

. А в т о р о ф о р а ? дассертяш на соискание ученой степени ка1Г."Д£тз скэлогкческгас каук

Минск, 1995

!' 5

Работа выполнена в лаборатории Микробиологической трансформации нуклеиновых кислот Института микробиологии АН Беларуси

Научный руководитель: кандидат биологических нзук, старший научннй сотрудник А.И.ЗИНЧЕНКО

ОЦпиа.гышб оппоненты: доктор биологических наук, профессор С.П.КОЕ'ШЕНКО •

' доктор химических наук, профессор Д.И.МЕТЕЛИЦА ■

Ведущая организация: Научно-исследовательский и проектно-коиструкторский медпко-биотохнологи-чэский институт (г. Минск)

Зацита состоится * 19Э2 г* в час на

заседании Спвциа.лзировакнсго совета К 005.09.01 по присуждению ученой степени кандидата наук при Института микробиологии АН Беларуси по адресу: 220Н1; Минск. Коданская, 2.

.. С диссертацией моюю ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН Ре-эруси. . '.'

Автореферат разослан

1992 г.

Ученый секретарь Специализированного соботэ, канд. Сиол. наук "

Н.В.ОБРАЗЦОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: Аналога природных нуклеозвдсв пред-зта^ляют значительный интерес для химиотерапии вируснах и онкологических заболеваний (Преображенская, Мельник, 1934). Кроме того, эни являются инструментом биохимических и молек^'лярко "биологических исследований. Однако, из-за серьезных трудностей, возникающих три химическом синтезе веществ этого класса, производство и, сле-цоват-льно, доступность их .уш за'.лтересованшх исследователей ограничена. По этой причине актуальным на сегодняшний день явля-зтся изучение возможности использования для синтеза биологически активных аналогов природных нуклесзидоз различиях фермея'-.в нуклеинового обмена, в том числе бактериальных нуклеозидфосфорилаз.

В литературе имеются данные . о. применении в ряде случаев в качеств; ферментных препаратов при синтезе нуклс-озидов покоящихся клеток бактерий (Morisawa et al., 1980; Utagav.a et al., 1935). В ?гязи с тем, что применение нефракционированных бактериальных сеток может гадать существенные технологические преимущества в зравнвкж с использованием ин-ивидуалыъх ферментов, представляется актуальным изучить отношение к тем или иным субстратам нуклеозидфосфорилаз непосредственно в составе целых ш.еток бактерий.

' Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы сило экспериментальное обоснование возможности использования клеток Escherichia coll для синтеза модифицированных аналогов природных туринозых нуклеозидов путем ферментативного трансгликозилирования зоответствующих гетероциклических оснований.

В соответствии с цель1.: работы в задачу.исследований входило:

1. Поиск и селекция.бактериальных штаммов с еысокой нуклео-зиАфосфорилазной активностью целых клеток.

2. Подбор питательной'среды л отработка условлй культивиро-закий продуцентов нуклеозидфосфорилаз,

3. Изучение субстратной специфичности клето-^ых уридин- и туржшуклеозидфо^рилаз и создание,на основе целых бактериаль"ых слеток Еасокоэффективного трансгликозилирукщего ферментного 1репа<;ата, пригодного для шогократного использования.

4. Реализация биокоталитического процесса получения модафа-шровапнкх нуклеозидов на примере препаративного синтеза противо-зирус:шх нуклео~::дов - 9-А-Е-арабщюфура1ГОЗштадеш:на (Ara-Ade) и 3-/з-1)-арабинофуранозилгугнина (Ara-Gut»).

Научная яов'изно. В результате прледэшшх исслэдозшпй св-текг.гоованы итгюлы бактерий Е. coll БМ-11 и Б!,1-21,. целые клетки

которых проявляют уридинфосфэрилазнук, пурянн. .слоозкдфосфорилаз-ную и цитил-ндезамдаг.зную активности и спососяы осуществлять высокоэффективное трансгликозилирОЕание пуркновых гетероциклических оснований. Изучены дана?,ска роста культуры и активности трансгли-козилирующего комплекса ферментов Е. coll БМ-11 в условиях глубинного культиЕированпя. Определена субстратная сгеш-фтость урияинфосфорилазы и пуршшуклеозидфосфорилазы в составе целых клеток бактерия. Получены данные с влшккд изменений структуры к. углеводной части уридана к а-э-рибофуренозо-1-фосфата на способность служить субстратами для у.'идинфосфорллазы v пурин-нуклеозидфосфорилазы, соответственно.

Впервые установлена возмозгность использования 1.^,9-диацетил-гуанина в качество исходного субстрата реакции фермзь'.-чтивного грансгликозилкрования, что позеолило применить его в методе микробиологического синтеза Ara-Gua.

Экспериментально обсснозано применение глутарового альдегвда для повшения операционной стабильности уридинфосфорллазы, пурин-нуклеозидфосфсрилазы и цптидиндезаминази в составе целых клеток Е. coli, кспо.изуицихсм в качества биокатализатора в реакции фор-ментагиг. чого трш;гллкозилировэния.

Практическая ценность работы. - Получены данные, расширяющие представление о .возможностях использования целых бактериальных клеток в качестве биокатализатсроз в реакциях ферментативного трансгликозялироЕания гетероциклических оснований.

На основе использования целых клеток бактерий Е. "oll БМ-Я1 разработаны препаратные способы получения противовирусных нук-леозидов - Ara-Ade (А. с. '120102) и Ara-Gua (А. с. 1483953).

Предложен эф!ективныЯ лолиферментный препарат, 'содержащий уридянфссфорилазу, пуршшуклесзядфосфорилазу и ццтадивдезэминазу и пригодный для многократного использования в реакциях гиктьза модифицированных нуклеозидов.

Апробация работы. • Материалы ди.еерташюнноЛ работ:; были представлены на VII Съезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1985); III Всесоюзной конференции ."Биосинтез ферментов микроорганизмами" ;Кобулети, 198t/; Конференции молодых ученых "Современные проблемы . биотехнологии • микроорганизмов" (Рига, 1987) и на V Всесоюзной конференции по-методам получения и анализа биохимических реактивов;(Олайне, 1987).

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных р--бот и получено 2 авторских свизе-

ельства на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 131 стр. ашинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, етырех глав экспериментальной части, выводов и списка исполь-ованной литературы, включающего 192 наименований, из них 162 -а иностранных языках. Работа иллюстрирована 18 рисунками и б таблица™.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методы исследований

Объектами исследований служили полученные селекционным путем таммы бактерий Escherichia coli ВМ-11 и БМ-21.

Микроорганизмы культивировали в колбах Эрленмейера на термостатированном (37°С) шюттель-аппарате (частота колебаний платфор-ы 170-190 об/мин), а тэюке в ферментерах АК-3 и АК-10 производства СКВ БП АН СССР (г. Пуото). Посевным материалом для колб лужили суспензии клеток, полученные путем смыва их со скошенного irapa. При использовании Лврментеров, инокул«мом служили ночные :ультуры в количестве 10-205 (об.). Анализ инокулюма на чистоту ,роводили при помощи микросксйхз- "Ampllval" ("Carl Zeiss", ГДР).

За ростом биомассы бактерий следили турбидгалетрически (ФЭК :ФК-2; х = 590 нм), используя соответствующую калибровочную кри-iy». Сухую массу микроорганизмов определяли, высушивая обрзгпы ¡иомасс при 105°С.

В качестве основных питательных сред для культивирования Е. ioli использовали коммерческий мясопептоншй бульон с 0,5% дрож-:евого экстракта, а также подобранную среду следующего состава, lagHPO^ - 0,6; КН2Р04 - 0,3; NaCl - 0,05; Ш4С1 - 0,1; IigS0.t -1,012; глюкоза - 0,3; ферментолизат БВК - 4,J.

Удельную скорость роста (»j) и :' дельную скорость синтеза ф>эр-юнтов (с) вычисляли по формулам: ij = dX-dtf1-X"1 и с -IE-dt-'-Х-1, где X - биомасса (мг/мл), Е - активность (ед/мл), dX ■ прирост биомассы, dE - пр1фост активности за промежуток времени Lt (Terui, 1973).

Ход биокаталитических синтезов контролировали методами 'онкослойной -хроматограф:®. (ТСХ) на пластинах "Silüiol-UV25i" Kavalier, Чехословакия) и УФ-спектроскоппи на спектрофотометре 'Specord UV-VIS" фирмы -Carl Zeiss" (ГДР).

После ТСХ вещества обнаруживали в УФ-свете, идентифицировали ¡равнением с образцами - свидетелями и элюировали буферными раст-

ворами. УФ-светопоглощеяие элюатов измеряли 'э спектрофотоиетръ СФ-46. Ко>.::знтращтл гещэстг-в элгатах рассчитывали, используя известные ко&Чицяенты молярной экстшщии (Бородавка и др., 1977).

йийвидуальность и строение чолекул синтезированных • соединений были подтверждены: данными ТСХ и УФ-спектроскопии. В некоторых экспериментах wm/этого привлекались также данные по определении температура плавления, КД- и -й-ЯМР- спектроскопии, элементного анализа; Последние, четыре .вида анализов -штолнялись сотрудниками лаборатории хшии нуклеотидов и яолшш'^отидов Института биоорганической химии АК Беларуси (заведующий лабораторией доктор химических наук *!.А.Кихайдолуло),

При определе1ши г Ara-Ade-синтсзирующвй активности daicrepa-зльных клеток реакционную смесь (1мл), содержащую 30 мк«оль Ага-Cyt, 10 мкколь яденина, 25 «М К-4осфатпый буфер (рН 7,0) и биомассу клеток Е, co.ll (4 мг в расчете на сухую массу), инкубировали при 60°С. Л.' '-'•'•'.••■'••''■• • '.* ''

Стандартными. условиями для проведения -реакции синтеза. Ага-Gua были следупда. Реакционна содержащую 1£ кле-

ток, 30 мМ К-фосфа-яьй буфер (р!1 е,75>), 10 мМ гуанин, гуакозин ила 2 • -зозсксигганозин. 30 Ara-Ura, инкубировали в .течение -40 : Ч при 6Cf°C. V. : • • Д; . ■ С-/^'' ' Г- '

аосфоролиз нуклеозвдов проводили путем инкубации- целых клеток бактерий, с субстрата«! в ICHjcoftsTHOM 6i*4iepe при 6(?С. Эффективность :фосфэролиза.;,определяли за время!, при котором "степень конверсии • нузелеезидов на, презышала 10-153, и рассчитывали как количество образуйте» эей;. азотистого. основания. в нмоль зь 1 млн реакции на 1 мг сухой Оисуассы.\' V-■

11ри определении. ktissEvCTh УРФ измерялась скорость. фэсфоро-диза уридива bjc< Ara-JJra> Анализ клеток на активность Ш9> проводили, используя реакцию синтеза Ara-Ade яли аденозинэ иг. аденлна и Ara-1-P или Н1Ъ-1-Р, соответствешо. Активность ЦД определяли по скорости дезаминирования цитидшп или Ara-Cyt. Sa единицу активности изучаемых СерментоЕ принимали такое количество препарата, которое обеспечивало трансформацию 1 нмоль соствгтствуюцего субстрата за 1 -мин.. За: единицу Ага-Айе-с^тезирущей активности принимали количество препарата, ^необходимое для. образования 1 нмоль Ara-Ade за 1 мин реакция. • .•'..'

Для стабилизации клеток В. coll глутаровш; вльдегадом 1%. суспензию бактерий обрабатывали щт^С 0,7551 раствором реагента в течение 15 мин.

б.

При статистической обработке результатов экспериментов (Ап-марин, Воробьев, 1962) проводили определение средних арифметических я их доверительных интервалов для уровня вероятности 25Х. Разность двух средних величин считалась достоверной при отсутствии перекрывания гас доверительных интервалов.

Использованные в работе модифицированные компоненты нуклеиновых кислот были любезно предоставлены д.х.н. МихаЯлспуло -К.А. (ИБОХ АН 13), д.х.н. (йкайловым С.Н. и чл.-кор. РАН Краевсккм А.А. (К.'З ЬАН), за что автор выражает им искренний признательность.

2. Отбор штамма микроорганизмов с сыссхог* Ar'.-Afle-синте-зируодей активностью и изучение его физиологических потребностей .

С цзльы отбора штамма микроорганизмов, цел^е клетки которых способны эффективно синтезировать Ara-Ade из оданина и Ai-a-Cyt. нами было обследовано Оолее ста бактериальных культур, принадлежащих, главным образом, к родам 2rwlnla и Escherichia (табл. 1).

Таблица 1

Эффективность синтеза. Ara-Ade клетками различных ттяммов

микрооргенизмов

Штаммы микро- источник . Выход реакции, %

опганизмов получения . -----

; ■ 6 чьз 24 час

Erv. herblcola 5/1 Белгосуниверситет 24,3 65,9

7/1 .28,2 73,9

9/9 25,2 69,4

9/12 23,6 64,3

18/2 24,6 67,4

48/5 24,3 .. 65,1

Escherichia coll В ЕКПМ (В-1) ' 16,6 54,2

Е. coll С-600 (ВИЗ) 18,1 58,3

НВ-101 (В-1313) 22,2 ' 71,4

W-3550 . (3-1557) 24.5 ., 74,3

И-3110 <В-1758) 35,1 ± 3,8 80,4 1 5,5

БМ-11 Данная работ? £6,8 ± 3,5 93,4 1 5,6

БМ-21 Данная работа . 65,1 ± 3,0 95,6 ± 5,9

Установлено, что среди изученных микроорганизмов наиболее эф^ек тивно синтезирующим Ara-Ade оказался штамм Е. coli W-3110.

На следующем этапе была предпринята попытка усилить интере оупцее нас свойство штамма Е. coll W-3110 путем отбора боле активных спонтанных мутантов .'С этой целью исходный штамм Е. col W-3110 многократно рассевался на мясо-пептонный агар с последую пц"м отбором наиболее активных вариантов. В результате был получены штаммы ВМ-11 и БМ-21, эффективность которых в реакци синтеза Ara-Ade достоверно превышала таковую исходной культур: Из схемы на рис. 1 видно, что в синтезе Ara-Ade принимаю1 участив три фермента: цитидиндезаминаза (ЦД; дезаминирует Ага-Су в Ara-Ura), уридинфосфорилаза (УРФ; разлагает Ara-Ura на урацил i Ага-1-Р) и пуриннукл^озидфосфорилаза (ПНФ; синтезирует це^ево! продукт из Ara-1-î и аденина). Поскольку динамика накопление указанных ферментов в бактериальных клетках могла быть различной представляло интерес сравненение их активности на различны; стадиях роста культуры. ,

Ura

Ara-Cyt-- Ara-Ura —Ara

ЦЦ УРФ

Рис. 1» Схема синтеза Ara-Ade ферментами в составе целыз клеток Е. coll.

При изучении динамики роста бактерий в ШБ с дрожжевым экстрактом установлено, что максимальное : зкопление всех трех "ферментов происходит одновременно к 12 часам культивирования. В случае ПНЬ фаза максимальной удельной скорости синтеза фермента совпадает с фззой ускоренного роста культуры. В случае а:е ЦД и Ж наСлвдаэтсл разобщение между этими фазами в 2 часа.

Продемонстрированные различия э динамике биосинтеза изученных формонтов можно объяснить, по ньшеыу мнения, если учесть, что гены Е. coll, ответственные за синтез ЦД и УР5, принадлежат к одному рагулопу, отличающемуся от регулона, в состав которого входит ген, направляюдий синтез ПК®. Кроме того, в отличие от nils, синтез ЦД и УРФ подвержен катаболитной репрессии Шзлтег-Jespersen, Nygaard, 1976).

Ade

-1-P

ПНФ

Ara-Ade

P

а

Далее, с цэлыо создания питательной среди аэ основе Солее оступннх ингридонтов, чем МПБ и дрокжевой экстракт, ш изучила лиянио разя пшх органический* добавок к минеральной среде МЭ с i,3» глюкозой на рост клеток и га Ага-Айе-синтезкрукдук актив-ость. При этом оказалось, что наиболее эффективно на лродук::ib-ость культуры влияют пептон и ферментолиз?-; БЬК. Так, напрсур, рада, содержащая 4% фермэнтолизата БВК, поаволяет достичь выхода .га-Айе-сш'.тезирущей активности почтя ь й раза большего, чем при .сяользовашги ранее подобранной среды на сснове МПБ.

Известно, что глюкоза в высоких концентрациях способна ингл-ировзть тост клеток Е. coli (Bauer, Shiloach, 1974). В наших кспершентах, начиная с концентрации 0,55, глюкоза отрицательно ;лияла не только ка выход биомассы, но и на уровень Ara-Ade-иитезирующей активности клеток, пр;я:ем наиболее реако это сказы-алось па величине второго параметра (табл.

Таблица 2

Влияние глккоеь! на виход биомассы клеток Е. coll БМ-11 и их

Ага-Айе-синтезирувдуь активность

Среда

Гликоза. %

Л,

мг/мл

Ara-Ade-синтвзирующая активность

од/мг

ед/мл

!1Швралы'0Я 0 0.59 182 107 i 5

:р"Да + птатоп 0,1 1.03 189 195 t 10

0,2 1,26 186 234 t 11

0,2 1 .¿6. 136 272 i 13

/ 0,4 1 ,53 177 280 ♦ 13

' 0.5 1,42 149 212 i 10

0,7 1,13 90 102 + 4

1.0 ! ,03 65 67 1 3

!шоральнал с i .54 193 297 * 14

:реда + <12 ^рленто/гн- 0.1 1 .79 224 399 * 19

:лт ЕВК 0.2 ¡.97 237 J. 67 ♦ 25

0,3 2,61 224 535 i 27

0,4 2.70 215 581 t 28

0,5 2.67 193 615 t 25

0.7 1,50 86 129 t 6

1.0 '.33 77 102 t 5

В нашем случае подавление роста клеток Z. ;oll при концентрг Ш!я:; глок^-ц 0,5" и выао, ю-видимому, обусловлено тем, что этих условi'n, как было показано Зиминой и Ляллевой (1-?74), также Dc-olle и Hollywood (1978), у этого микроорганизма начина« преобладать анаэробный путь метаболизма, что и сказывается i росте и активности клеток.

Свидетельством в пользу того, что анаэробные условия дейст Ентельно могут снижать продуктивность клеток Е. ссЛ, слух-: результаты экспериментов по изучению влияния повышенной лонцен: раита глмкозы ;; недостаточной азрицул среда на выход биомассы активности клеток Е. coll ЕМ-и. Так, из данных, представленных табл. 3, следует, что при недостаточной аэрации среды (инкубирс ванне культуры без встряхивания)'.происходит значительна сниже ние как степени накопления биомассы и Ага-Айе-синтезирувде активности, так и активности всех ферментов, принимающие учага в процессе синтеза целевого продукта.

; Таблица

Влияние глюкозы аэрации на рост -Е. coll БМ-11 и активное1] ферментоз чэтаболизма нуклаолщов

Глюкоза, % Встряхивание X. мг/ул Активно сть, ед/мг

цд УРФ ПНФ Ara-Ade-cm тезирующая

0,3 + 2.5 1910 1400 720 ?34 » л 6

0,3 - 0,6 1200 780 451 137 i 7

2,0 + 1,3 10*0 640 350 ' 124 i 7

2,0 - 0,5 740 430 270 8Ь г 5

Из полученных данных можно заключить, что би„синтез клетках изучаемых ферментов (и, как следствиэ, их Ага-Айе-синге зируюзая активность) снижаются в таких условиях роста, когда у I coll преобладает анаэробный метаболизм глккозц.

Диалогичные результаты были получены ^ри культивировании I coll БМ-11 в колбах с различной степень» их заполнения л в услс виях ферментеров. В обоих случаях недостаток аэрации отрицателы; влиял не только на выход биомассы, но и на активность клеток.

3. Синтез пуринеьнл зрабинозидов с использованием транс-rJHKQ3H.vzpoB3HH?: аденина и гуанина клетками Е. со'1

3.1. Синтез адеюшарабинозида

Аденккарабшюзид (Ara-Ade) прочвляет актиг':сс"ь ггроткз ряда Ш-ссдеггаэд-.х вирусов. Он входит в фармакопеи Ста и применяется ля хтютерапии заболеваний глаз (кератитов), мозга (энцефалх-ов) г- несяэталъных инфокций, -вызыва-.мых Еирусом герпеса.

Химические' методы синтеза Ara-Ade, разрабатываемые с'i960 ода, остаются пока весьма трудоемкими, многое тадий/тыми и. как езультат, нетехнологичнша. Кроме тога, они нь позволяв? полу-ать целевой продукт с достаточно еысоким быходсм по причине асходования субстратов на образование побочных стереоизомеров.

Цэ/ь денного раздела гзстоящего исследования состояла' с изу-ении возмозяоети- разработки метода получения Ara-Ade из гдеяина сравнительно легкодоступного пиримидиноього нуклеозида Ara-Cyt огласно схеме на рис. 1.

Результаты экспериментов по оптимизации таких параметров эакции трансгликозклирования аденина патентными бактериальным:! ль псами, как концентрация неорганического фосфата, рК среда, емпература реакции, концентрации клеток, аденина и А га-Су t, лог-¡1 в основу разработанного нами способа получения Ara-Ade (табл.

позволяющего получать этот нуклеозид с выходом изолированного родукта более 80-6 в раосчете на взятый в реакцию, адэнин.. При том- трансформация аденина в Ara-Ade составляет белое 90%.

3 табл. .4 представленк еще два разработанных. нами варианта посооа получения Ara-Ade. Согласно варианту II, вместо иктяктных üstok Е. coll Ш-11, используются клетки,' подвергнутые сиециаль-эй обработке глутарсвым альдегидов (ГА). Модифицированные подобен образом клетки.можно использовать, в отличие ^т интактных, зогократно. Это позволяет в несколько раз снизить затраты клеток а получение целевого продукта. ' . .

Вариант III - характеризуется тем, что исходные соединения ira-Cyt и аденин) берутся в реакционной смеси в обратном коли-зственном соотношении (не 3:1 в молях, а 1:2). Кроме того, в ка-зстве ферментного препарата используются интактные клетки Е. 511 штамма ЕМ-21, проявляющие себя наиболее эффективно по сравнив с Е. coll Бл!-11 именно в таком варианте синтеза Ara-Ade.

Важно отметить, что вариант III отл/мется более полной ути-яацаей Ara-Cyt по сравнению с другими вариантами, поэтому он

мокет представлять особый интерес в случае малой доступности этого субстрата. Дело в том, что избыток Ara-Cyt б вариантах I и II не изолируется . из реакционной смеси при выделении Ara-Ado, поскольку он количественно дезаминируется в Ara-Ura, а последний затем распадается на урацил и Ara-t-Г. В случао же варианта III избыток аденинв не претерпевает никаких изменений. После выделения он может бить использован для повторного синтеза Ara-Ade.

Таблица 4

Синтез нуклеозидсв с использованием целых клеток К. coll

Целевой Исходгше Конц. Ферментный Степень Выход про-продукт субстраты, реаген- препэрат конвео- дукта после тов, мМ сии, % выделения,Ж

Ага-А зариант I Адбнин + Ara-Cyt 10 30 Клетки Е. coli EM-11 93 82

Ага-А вариант II Адешш +. Ai-a-Cyt 10 30 Стабилизированные клетки Е. coli Ш-11 91 80

Ага-А вариант III Ara-Cyt + Аденин 10 го . Клетки Е. coil БМ-21 92 . 60

Ara-G вариант I 2 ' -dGuo -г Ara-Cyt • 5 15 Стабшкзиро-, ванные клетки Е. coli БМ-11 65 53

Ara-Guo вариант II K£-,9-Ac2Gua Ara-Ur.: 8,5 23 Клетки Е. coll ЕМ-21 63 50

3.2. 'Лшличение от?ра;коккой стабильности клеток Е. coll под. действием глутарового альдегида (ГА)

В хода упомянутых выше экспериментов по синтезу Ага-Айе, интактными метками Е. coll, сила вияглшг ja шикая опера^онная стабильность, т.е. быстрая потеря активности в случае повторного использования. Так рис. 2 свидетельствует, что после проведения трех циклов синтеза Ara-Ade клетшт сохраняют лишь около 10% от своей первоначальной активности.

Изучение поведения каздого кз трех ферментов в отдельности похазало, что основной причиной низкой операционной стабильности биокатализатора в виде интактных клэтох Е. coll ЕМ-11 являв кч выход да и ШН> из клеток с последующей потерей этих ферментов при смене реакционной среды.

Рис. 2. Изменение активности интактных (1) и обработанных ГА (2) клеток Е. coll БМ-11 при ш многократном использовании в реакции синтеза Ага-А(1е. А - активность в Ж от начальной.

Продолжительность цикла -24 часа.

2 4 0 8 10 Цикли

С целью повышения операционной стабильности клеток Е. coll в условиях реакции синтеза "Ara-Ade нага было гзучено влияние на этот показатель клеток предварительной обработки их ГА.

Таблица &

Рлияние обработки клеток 5. coll БМ-11 ГА на их фермонтатиЕяую актгшность

Активность, ед/?лг

Вид алтиьности

йнтактные клетки

Клеуки, обработанные глутаровым альдегидом

Выход активности, % от исходной

1Щ

УР5

ПНФ

Ara-Ade -

синтезирующая

активность

1,80 1,32 0,77 0.С042

4,80 1,21 0,79 0,0037

267 92 103 88

О

Согласно данным, приведенным в табл. 6, ь клетках, оорзботан-ш;х ГА, Ага-Аг^-синтезирундзя активность, а также активности обеих фосфсрилэз, изменяются незначительна. Активность же ЦД увеличивается в 2 с лишним раза. Кроне того, обработка клнток ГА приводит к значительному увеличению операционной стабильности биока-тыгазатора' (рис. 2, кривая 2). Это происходит, по нашему мнению, благодаря тому, что ГА за счет формирования поперечных сшибок мевду макромолекулами уЕвличивзот прочности клеточкой стенк-г. и, теч самым, предотвращает вьг.од ферментов в реакционную среду.

'Иц предположили, что обработанные ГА клетки Е. coll БМ-И мокко попользовать в качестве ферментного препарата, пригодного для многократного использования прл получении не только Ara-Afe, ко и других шдифацирсваннах нуклеозидов, в частности Ara-Gua.

3.3. Синтез гушинаряокнозида '

Гуакиаарабинозцд (Ara-Gua) таккв, как я Ara-Ade, обладает активностью 1[ротив вирусов -герпеса.: Фармакологические свойства Ara-Gua изучены в меньшей степени по сравнении с Ara-Ade. По-видимому, .это обусловлено его низкой доступностью для «"-.следователей. что, в свою очередь, выгвано значительной сложностью ческих и низкой эффективность» ферментативных способов получения этого модифицированного нуклеозада.

Мы сравнили эффективность синтора Ara-Gua из Ara-Cyt и ryfi-нина. Ara-Cyt и гуенозкна и Ara-Cyt и 2'-дёзокс. 'уацозина под действием интактшг и обработанных ГА клеток Е. со l ЕМ-11. Цепь Ферментативных реакций, приводящую к образованию Ai .i-Gua из Ai i-Cyt и гуанина (шти его нуклеозидов), иллюстрирует рис. 3.'

"'■••■ US " ./'':.•.•••'■ Ara-Cyt-:——* Ara-Ura Рис. 3. Схема бвдтеза Ага-

Ura

d-Hih-1-P ". 1

2 * -dGuo • >■ G ra

УК> Ara-trP

р . Gua Ферментами составе 11 -клеток Е. coll Ш-11.

р1: ГШ 1ШФ

Ara-Gui

Синтез Ara-Gua в наших экспериментах протекал эМюкгленро при использовании в реакции но гуанина, а его нукяеозидое. Это, по-ькдимсму, мсуно объяснить тем, что з силу очень плохой растворимости, гуанин не способен сгздать в pajTBope концентрация, достаточную для эффективного ферментзтивного катализа. В случае re использования в качестре субстратог нуклеозидов, гуанин, появляясь в с;.оде после их фосфоролиза под действием lit», создает поьшзылие концеhtpaitn: ге?ерощ:кличеексго основания непосредственно в aot:e активного центрэ (JepveiiTS.

Разработанная нами процедура выделения Ara-Gua из реакционной смеси при помоии ионообменной хроматограф™, позволяет получать целевой продукт с выходом 48-53% (табл. 4). Это свидетельствует о то*', что ттредлояеннчй б настоящем исследовании способ получени»' Ara-Gua ¡февосходит по эффективности ятестше юлоги.

В качестве еаз е.-чсго варианта vnocofla получения дга-Сиа нами била использоганэ схема, предусматривающая замену гуанина на его хороао растсоримсо прлизродное - доацетилгуанин (1<2,9-Ac?Gua). Это позволило поднять концентрацию азотистого основания а реакционней среде в несколько раз. В сятимизирсынннх условиях проведения процесса получения Ara-Gua выход целевого продукта в указанном варианте достигал 50™ в расчете на исходное гетероциклическое основан, о. Попытки использовать в рассматриваемом процессе в ".ячестве исходного субстрата гуанин приводили к образован!») Аг-.-Оиа с выходом, не ьрэвыш&ицим 5%.

4. Изучен:» субстратной специфичности УР5 и в составе кнтакткы?. клеток В. crll ЕМ-11

Ранее было установлено, что глубина фосфоролпга уридина по схеме:

Кунлеозид + Pj m — Пентозр-1-P + Азотистое основание ±

яд действие;.; yF5, изолированной ип клеток Е. coli, значительно превипзет степень распада лурнновьх нуклеозидов под действием ЛКЗ (Krenltsky et al., 1931; ütagawa et al., 1985). Для куклеь^идфос-форилаз изученного на;д! итамма Е. coli подобная закономерность сохраняется. Действительно, как следует, из рис. 4, равновесие реакции фосфоролиза уридкна устанавливается при более еысокой степени его распада, чем зто выявляете т для пуриновых нуклеози-дов. Именно такая особенность гфотекания реакций фосфоролиза

обеспечивает высокие выхода пурпковых нуклеозидов при получении их кз пнримидиновых нуклеозидов и пуриновых гетероциклических основания, что и Сило продемонстрировано нами выше при синтезе Ara-Ale и Ara-Gua.

Рис. 4. Кинотика действия нуклеозидфзсфорилаз Е. "oll БМ-11 на уридин (1), йно-зин (2), аденозин (3) и гу-ано:?ин (4).

А --степень фосфоролиза нуклеозидов.

30 60 90 120 Врыя инкубации, мин

Учитывая зга обстоятельства, субстратная специфичность УР5 била пчим из/чона на примере фосфоролияэ трими нових нуклчюзк-до& (производных уридпнз), а с^ецгфпчюсть ГО: - на пример-? синтеза пуриаошх нуклеозидов.

Анализ дзнних экспериментов по $осфоролизу уридйяа и его анзлого£ (табл. 6) показывает едчдуиичвг

а) При занзнс гилроуснлишх груш: у 2-гс г.лй 3-го атомов углерода рибозного фрагмента не друим атоми ила атс»ма хрупш; происходит заметное снижение активности препарата. Еде бол у о резко падает активность в случае перехода от 2'- и 3'- дезокси-уридиноз .- аианодезоксианалогам.

б) Ввздеппе в молекулу уридича вдтрльных групп в цогакения С-2'- и С-3'- вместо протоноз привод** к полной потере молекулой субстратной .итивпоста. Эю, пс-ввдиуому, объясняется стоически--ми препятст .мш, которые окззывлт ооъемные метч-тзйк группы связывают-! мадогов с 4с*рчэнт.';и. Аналоги уридшв о м^тиььноа группой ппи ■ ал атоме рядози озвзрудо&чт зктичюсте ка уъсанс

природного субстрата - уридина или несколько меньшую в случае последнего аналога.

Таблица в

Субстратная специфичность УР5 и ПКФ в 'составе интзктных клеток Е. coli БМ-11

Фосфоролиз аналогов уридина Синтез аналогов аденозкна

Субстрат Отн. активность УРФ, % Субстрат Отн. активность ГШ. %

Urd 100,0 ± 6,8 Rlb-1-P 100,0 t 12,0

21 -dUrd 35,5 ± 2,5 2-dRlb-1-P 78,8 ± 10,6

З'-dUrd 6,4 + 0.5 3-dHlb-1-P 4.8 ± 0,8

2'-NH2-2l-dUx4l 11 ,6 t 1.0 2-NH2-2-dHJb-1-P 2,7 t 0.4

З'-К^-З'-йиШ 0,6 t 0,1 3-4H2-3-dHib-1-P 0,2 t 0,03

З'-Р-З'-dUrd 0,1 0,02 - -

Ara-Ura 3(2 ± n « U, kv Al-a-l -? 1,6 i 0,2

Xylo-Ura 0,1 i 0,02 - -

2'-C-!ieUrd 0 - -

З'-C-iieUrd 0 ■ - -

5'-C-MeUrd- 5-C-!ieRib-1-P-

. c-L-talo 100,0 + 7,5 a-L-talo 92,0 t il,o

/з-D-allo 50,0 t 6,4 P-D-allo 41 ,0 i 4,6

UMP 0 - - '

Тот факт, что такой ■ объемный заместитель, как меишная группа, не уменьшает субстратную активность нуклеозида, а фосфатный остаток приводит к ее полной потере, может, на наш взгляд, свидетельствовать о слабом влиянии этого участка молекулы на проявление активности УР5 в том случае, если заместитель не заряжен. Анализ данных по синтезу нуклеозидов показывает, что изучаемый ферментный препарат предъявляет к структуре субстратов и в этом случае сходные требования.

В табл. 7 приведены результаты экспериментов по изучению субстратной специфичности ПНФ в составе клеток Е. coll БМ-11 также в реакции синтеза риС:.'Яуклеозидов, но уже из модифицированных азотистых оснований. Из таблицы видно, что подавляющее большинство модификаций снижает субстратную активность исходного гетероциклического основания. Менее ощутимо влияние замещений в полоке-киз 6, в то же время бром, метальный или морфолиновы,'; радикалы в положений 8 вызывают полную потерю субстратной активности.

Таблица 7

Специфичность ПНФ в составе клеток Е. coll БМ-11 по отношению к пуриновым основаниям в реакгда их рибозилированил

Су острзат-акцептор

Р

Bg

«3

Отн. активность. ПНФ, %

R,

Ж м

Ade . • .'iuig к . H : • 1CO.G i 12,0

г-ш^риг н ст2 ■ ' к 47,1 t 4,3

2-HHgAde - mz . , NH2' . H 185,0. ± 20,7

R^-MeAde. 0H3-KH- H П 89,2 i 8,0

N6-Ke2Ade . cv ■ снз .;'. H н 43,1 ± 3,4

Ade

i-&de

N -BalAde

-CH^-NH- . H

,-NH- H.

27,9 t 2,2 4?,8 t o.O

■?• 44,9 t 4,5

m л Ш ■ н . ; . Я ■ 42,0 t 4,2

G-CiPur CI ' я Й 4,4 ± 0,5

Kan ОН ■., ОН ■ Н 0

8-HeAde KHg : ; Н CV 0

8-Bi-iiyp он Н • Вт 0

в-Морфолин-АСе . КН, н сГЛ- 0 .

w

H

В заключение раздела еледуот отметить, что несмотря на снижение эФ5ективности реакций фосфоролиза и синтеза нукпеозкдов под действием УРФ и 1Ш при переходе от природных субстратов к их модифицированным аналогам, свойства указанных ферментов в составе целых клеток бактерий позволяют надеяться яа подбор таких экспериментальных услоекй, в которых может: быть осуществлен синтез пурино>,.'х нуклеозилов исходя из бслео доступных моди&шерованных. пиримидинозас нуклоозпьов даже ь i'SX случаях, когда они значительно уступает ь субстратной активности природные куклеозидам. Возможность реализация такого подхода бнла продемонстрирована нами в предыдущем разделе настоящего исследования на примерах препаративных синтезов таких модвфедировонгшх нукдвозидоз как ira-Avie и Arn-Gua.

OCEOEiffi РЕЗУЛЬТАТЫ И ЕИВООТ

1. Селектированы втаммч бактерий 2. coli БМ-11 и 5М-21, покоящийся клетки. которых проявляют при 60-в£Р С цитздяндэзаминаз-г-.ук, уридгшфосфорилазную к пурт^нуклеозадфзсфорйлазууп активности и,-в »•езультате чего, способны эффективно катализировать реакцию синтеза аденжараСкнозида (Лга-Ade) из его првдс^ственгахов.

. 2. Для глубин'тго культивирования Е. coli БМ-11 с целью получения высок:х выходов-Ага-АДе-синтезируицей активности подобрана питательная среда следующего, состава,*: Sai^P04 - 0,6; KHgF04 - 0,3; NaCl - 0,С5; КН4С1 - 0,1; KgSC4 - 0,012; глюкоза - 0,2-0,4; фэрментолизэт БЗК -2-4. Аэрация - 0,8-1,2 мив"1. Темперетура культивирования 37-ЗЭ°С.-.

3. Установлено, что при переходе от ааробных к подуанаэробным условиям роста ¡сеток Е. coll EM-* 1 (концентрация глюкозы > 0,5% или степень аэрации <0,1 мин"1 ) их Ага-А^е-синтезирулцая активность резко снижается. Выявлено разобщение, (в пределах 2 часов) фаз максимальной скорости роста культуры Е. coll ВЫ 1 и синтеза ЦЕТидиндезаминазв й уридик^осфорилазц и отсутствие такого разобщения в случае синтеза пуржнуклеозидйосфорилвзы.

4. Изучена субстратная специфичность уридинфосфорилазы и пу-ркЕнуклеози;фосфорил'аз:» в составе целых клеток. Е. coll В1-11 на примере фосфо^о-пиза ряда анрлогсл уридина я синтезе соответствующих аналогов адекозине. Показано, что: а) модя{икации при С-3' -атоме углерода вызывают Солее существенное, уменьшение субстратной активности в сравнении с аналогичными модификациями при С-2'; б)

Б случае модификации при С-2' субстратная активность изменяется следу шим образом - 0Н>Н»Ш2>0Н(ара)>»2'-С-метш1; В случае модификации при С-3' - ОН>Н>Ш2>0Н(ксило)+Г>>>3'-С-метил; в) Замена одного из протонов при атоме углерода 5'-СН,0Н группы на метильную группу существенным образом на изученных ферментативных реакциях не сказывается.

5. Разработан, способ синтеза противовирусного нуклеозида аденинарабинозида из цнтозинэрабинозида и адеюша с использованием в качестве ферментного препарата целых клеток Е. coli. Способ позволяет в оптимизированных условиях проведения процесса (20-40 мМ К-фосфатшЯ буфер, pH 6,75-7,25; 30 мМ цитозинарабино-зид; 10 мМ аденин; 1Ж клетки; время реакции 12 ч при 60°С) достигать выхода аденинарабинозида 90-95Ж в реакционной смеси и 79-82S после выделения в чистом виде.

в. Разработан способ синтеза противовирусного нуклеозида гуанкнарабинозида. Способ заключается в катализируемом целыми клетками Е. coll переноса арабинофуранозного остатка на гуаюш, где впервые вместо плохораствсримого , гуанина используются его более растворимые производные - Ц-.,9-диацетилгуанин или 2'-дезок-сигуанозкн. В экспериментально подобранных условиях проведения процесса (15-30 мМ К-фосфатшй буфер, pH.6,75-7,5; 30-92 мМ цито-зинараоикозид: 1-1,6% клетки; время реакции 30-45 ч при 60-65°С) способ позволяет получать гуашшарабинозид с выходом 63-65% (в расчете на введенное в реакцию соединение гуанина) до выделения и 48-53% - после его выделения из реакционной смеси.

7. Установлено, .что клетки Е. coll, обработан* зе ГА можно, в отличие от интактных клоток, многократно использовать в качестве ферментного препарата в реакциях синтеза аденинарабинозида и гуанина; збинозида.

Список публикация, отрагапцих основное содержание paöom

1. А. О.. 11207,2 СССР, МКК3 С 12 Р 19/40. СпосоО получения 9-ß-D-арабщюфуранозиладешша / В.Н.Барай, Л.А.Брошевская, А.И.Зин-ченко, Е.И.Кваснж, И.А.Михайлопуло, Г.А.Галегов, Г.Л.Линицкая, И,ЮчЛвдак, д.Е.Скуя.-.'б 3595478/28-13; Заяьл. 23.05.83; "ДСП".

2, Брошевская Л.А., Барай В.Н., Зинченко А.И., Квзсюк Е.И., Мщайлопуло И.А. , Использование иммобилизованных, клеток Escherichia coli для синтеза аденинарабинозида // Достижения микробиологии - практике: (Тез. докл. VII Съезда Всесоюз. микробиол. об-ва). - Алма-Ата: Наука, 1985. - Т. 4. - С. 44.

3. Ерошевская Л.Л., Барай В.Н., Зинченко А.И., Квасюк Е.И., Михайлопуло H.A. Препаративный сктез противовирусного пукле-зида Э-р-О-арабишфуранозиладотлна с помощью бактериэлышх клоток // Антибиотики и мед. биотехкол. - 1936. - Т. 31, .4 3.

- С. 174-178.

4. Ерсдаская Л.А., Бзрзй В.Н., Зинченко А.И., Квасюк Е.И., хайлспуло М.А. Применение бактериальных ферментов нухлеиновс-го обмена в пмжо- пнзиматическом cirareзе некоторых противовирусных пукле азидов ряда зрабинози // Тез. докг. III Бсзсоиз. кснф. "Биосинтез формэнтоз микроорганизмами", К.обулэти, лпр. 1S86 г. - Пуэдио, 1986. - С. 144-145.

5. Ерошевская Л.А. Применение бактериальной пуриннуклзозидфссфо-гчлазы zn синтеза модифицированных нупявозидоз // Тез. докл. Конф. молод, учешх "Современные проблемы биоте~нолопи микроорганизмов". - Гтгга: Б. и., 19Г-7. - с. 117.

6. Зипченко А.И., "зрай В.Н., Бокуть С.Б., Ерошевская Л.А., Ква-скк Е.И., Михайлопуло И.А. Применение чуклеозидфосфорилаз в составе интзктгах клеток бактерий для получения модифицированных нуклеозвдов // Тез. докл. V Всесоюз. кон.';. "Методы получения и анализа биохимических препаратов", Юрмала, 26-28 окт. 1937 Г. - Faira: Б. и., '1987. - С. 247.

7. А. с. 1463953 %СР, МКИ4 С12 Р 19/40. Способ получения 9-ß-D-арабинофу; энозилгуанира / В,Н.Барай. С.Б.Бокуть, Л.А.Ерошев-ская, А.И.Зинченко, Е.И.Кваскк, И.А.Михайлопуло.4239Э59; Заявл. 0-1.06.87; "ДСП".

8. Зинченко А.И., Барай В.Н., Ерошевская Л.А., Байгельман Л.Н., Михайлов С.Н., КарпэПский М.Я., Михайлопуло И.А. 2'-, 3'-, п 5 •-с-мотглпрсизБоднко yprc-'ima в реакции микробиологического трансглихозк^кровсьшя // Докл. АН СССР. - 1987. - Т. С97, В 3.

- С. 731-734.

9. Zlnchenko A.I., Eroshevskaya L.A., Baral V.N., Mikhailopulo I.A. Substrate specificity of uridine and purine nucleoside phoephorylases оГ the whole ceils of Escherichia coll // Nucl. Acids Res. Syrap. Str. - 1987. - Ho. 18. - P. 137-140.

10. Зинченко А.И., Ерогевекзя Л.А., Бзрай В.Н., Кихайлопуло И.А. Субстр&л'ая специфичность урздин- и пуриннуклооаидфссфорилаз з состав- целых клеток Escherichia coll '/ Биополимеры и клетка. - 19S8. - Т. 4, й 6..- С. 298-302.

11. Зинченко А.И., Барай B.Hi, Бокутъ С.В., Ерошевская Л.А., Квасюк Е.К.. Михайлопуло H.A. Синтез Э-р-О-арабинофуранозил-

гуанина с использованием целых клеток Escherichia coll / Ред-кол. яурн. "Изв. АН БССР, сор. хим. наук". - Минск, 1983. -15 с. - Деп. в ВИНИ!И 16.11.88, Ji И25-В 83. if:. Зинченко А.К., Ерошевская Л.А., Барай З.Н. Увеличение операционной стабильности клеток Escherichin coll, катализирующих реакцию синтеза адектаарабинозида. с помощью глутарового альдегида // Биотехнология. - 1990. - * 5. - с. 36-39.

Список зсновшд сокращений

ГА - глутаровый альдегид ПНФ - пуриннуклеозидфосфорилаза УР6 - ;/риошфосфорил,-j а ЦЦ - цитидиндезашшзза Айе - адешш

Ara-Ade, Ara-Cyt, Arä-Gua, Arä-Ura - /з-Ь-арабинофуранозида аденина, цитсзина, гуанина и урацила Ага-1~Р - арабгаофуранозшы-«-фосфат! Сиа - гуанин Kjjp - гипоксаяткн K-,9-Ac2Gua - диацетилгуанин Р^ - неорганический фосфат Rlb-1-P - рибофуравозозил-1-а-фосфат ÜMP - урцдин-5'-мопофосфат Ura, Urd - урацил и уридин Хап - ксантик

Xylo-Ura - -fl-D-ксилофуранозилурацил