Разработка химико-ферментативного способа получения модифицированных нуклеозидов

Фатеев, Илья Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка химико-ферментативного способа получения модифицированных нуклеозидов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка химико-ферментативного способа получения модифицированных нуклеозидов"

На правах рукописи

00345иы^

Фатеев Илья Владимирович

Разработка химико-ферментативного способа получения модифицированных нуклеозидов

03.00.23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

з о о;;т2с:з

Москва-2008

003450823

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова и в лаборатории биотехнологии Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель академик РАМН, доктор химических наук

профессор

Швец Виталий Иванович

Официальные оппоненты доктор химических наук

профессор

Юркевич Александр Морисович

кандидат химических наук Александрова Людмила Александровна

Ведущая организация Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится " 2008 года в ~7!Г часов

на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru

Автореферат разослан "ДУ " йо^лЭ^^к. 2008 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат химических наук

старший научный сотрудник —^ ,

Лютик А.И.

Общая характеристика работы*

Актуальность работы. В настоящее время в мировой клинической практике используется ряд современных препаратов, созданных на основе модифицированных нуклеозидов и обладающих широким спектром биологической активности -противоопухолевой (онкологические заболевания системы кровообращения), противовирусной (гепатит С, герпес и др.), иммуносупрессорной (рассеянный склероз, трансплантация костного мозга). Терапевтический эффект использования препаратов на основе модифицированных нуклеозидов при лечении злокачественных поражений системы кроветворения достигает 80% полных ремиссий после одного курса монохимиотерапии. Модифицированные нуклеозиды успешно сочетаются с препаратами последнего поколения на основе моноклональкых антител (Rituximab и САМРАТН-1Н). Ведутся работы по изучению комплексной терапии рассеянного склероза и опухолевых поражений системы кроветворения кладрибином и стволовыми клетками.

В России зарегистрированы для клинического использования множество препаратов на основе аналогов модифицированных нуклеозидов, например флудара** ("Fludara", Shering AG, Jonson&Jonson), рибавирин (ICN Pharma). Стоимость курса лечения кладрибином (50-70 мг) составляет 3500 долларов США, а курс лечения флударабином (1.31.5 г) обойдется пациенту в 6500 долларов США, поэтому в широкой клинической практике они практически не используются.

Все вышеперечисленные препараты получены методами многостадийного химического синтеза, имеющего ряд принципиальных недостатков - большие затраты сырья и реагентов, необходимость утилизации экологически небезопасных токсических отходов химического производства. Это не соответствует тенденциям современной биоиндустрии, особенно с учетом требований по охране окружающей среды.

Учитывая все вышеизложенное, очевидна крайняя необходимость создания современных отечественных технологий получения лекарственных препаратов на основе модифицированных нуклеозидов для широкого применения в практической медицине.

В руководстве работой принимала участие научный сотрудник ИБХ РАН, к.х.н. Константинова И. Д.

** Список сокращений: Ас-АТА - 3-ацетамидо-1,2,4-триазол; Ado - аденозин; Ага-А - 9-ß-D-apa6mro-фуранозиладенин (видарабин), Ara-U - l-ß-D-арабинофуранозилурацил; ATA — 3-амино-1,2,4-триазол; CdA - 2-хлор-2'-дезоксиаденозин (кладрибин); 1-Р-Ага - I-a-D-арабинозилфосфат; 2-ClAde - 2-хлораденин; 2-ClAdo - 2-хлораденозин; 2-С1-Ага-А - 9-р-0-арабинофуранозил-2-хлораденин; 2-FAde - 2-фтораденин; 2-FAdo - 2-фтораденозин; Flud - 9-Р-0-арабинофуранозил-2-фторадении (флударабин); Ino -инозин; Ме-ТКА - 5-метил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид; Thd - тимидин; ТКА - 1,2,4-триазол-З-карбоксамид; Vir - 1-р-0-рибофуранозил-1,2,4-триазолкарбоксамид (рибавирин); НФ -нуклеозидфосфорилазы; ПНФ - пуриннуклеозидфосфорилаза; ТФ - тимидинфосфорилаза; УФ -уридинфосфорилаза; ФСП - фармацевтическая статья предприятия; ТКА - 1,2,4-триазол-З-карбоксамид; Ме-ТКА - 5-метил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид; Guo - гуанозин; Suc-ATA - З-сукцинимидо-1,2,4-триазол; ДМСО - диметилсульфоксид; флудара - 5'-фосфат флударабина

Экспериментальные работы по теме диссертации осуществлялись при поддержке Федеральных целевых научно-технических программ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники» на 2002-2006 гг. (грант № 43.073.11.2516), «Национальная технологическая база» на 2007-2011 гг. (госконтракт № ГП/07/439/НТБ/К) и Российского фонда фундаментальных исследований (гранты РФФИ 04-04-08115, 05-0408013,07-04-13573).

Цель работы. Разработка химико-ферментативного способа синтеза как уже известных модифицированных нуклеозвдов, так и принципиально новых соединений с использованием генно-инженерных ферментов нуклеозидфосфорилаз.

Научная новизна. Созданы биотехнологии получения субстанций лекарственных препаратов 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (кладрибина) и 5'-фосфата 9-р-0-арабинофуранозил-2-фтораденина (флудары) с использованием генно-инженерных ферментов. Впервые синтезированы аналоги 1-р-В-рибофуранозил-1,2,4-триазолкарбоксамида (рибавирина) и 9-р-П-арабигофуранозиладенина (видарабина), модифицированные по гетероциклическим основаниям. Исследована субстратная специфичность нуклеозидфосфорилаз по отношению к ряду гетероциклических оснований с целью получения новых аналогов нуклеозидов и поиска новых ингибиторов ферментов нуклеинового обмена Впервые показана принципиальная возможность синтеза с помощью нуклеозидфосфорилаз нуклеозидов, замещенных по 6 положению пуринового основания.

Практическая значимость. В настоящей работе предлагается эффективный биотехнологический способ синтеза модифицированных нуклеозидов с использованием ферментов генно-инженерных нуклеозидфосфорилаз, что позволяет заменить стадию гликозилирования в химических технологиях синтеза нуклеозидов на ферментативную. Использование данного подхода значительно упрощает общую технологическую схему производства, повышает эффективность процесса. Разработашше биотехнологии синтеза нуклеозидов хорошо воспроизводятся, легко масштабируются и могут быть внедрены на предприятиях медико-биологического профиля.

Показана принципиальная возможность получения по разработанным технологиям новых модифицированных нуклеозидов, замещенных по гетероциклическим основаниям различного типа (пуринового, 1,2,4-триазола).

Синтезированы и переданы на биологическое тестирование аналоги известных противовирусных препаратов (рибавирина и видарабина).

Полученные предварительные данные по противовирусной активности синтезированных соединений позволили сделать заключение о взаимосвязи «структура-

биологическая активность», что необходимо для создания новых эффективных противовирусных и противоопухолевых соединений.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработка и оптимизация ферментативных способов получения субстанции кладрибина и флудары с помощью генно-инженерных нуклеозидфосфорилаз.

2. Синтез аналогов рибавирина и видарабина, модифицированных по гетероциклическим основаниям, для исследования их противовирусной активности.

3. Исследование субстратной специфичности нуклеозидфосфорилаз по отношению к ряду замещенных по 2-, б- и 8- положениям пурииовых оснований с целью получения новых модифицированных нуклеозидов и поиска новых ингибиторов ферментов нуклеинового обмена.

4. Проведение биологического тестирования синтезированных соединений на противовирусную активность.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008)

Публикации. По материалам работы опубликовано 2 статьи, тезисы доклада на конференции и подана заявка на получение патента РФ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 10 ? стр. машинописного текста, содержит рисунков, £ таблиц, схем, состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего '/-^ссылок.

Результаты работы и их обсуждение

Рост числа вирусных и онкологических заболеваний ставит перед исследователями вопросы о разработке современных эффективных технологий синтеза лекарственных препаратов на основе нуклеозидов. Известен ряд методов химического синтеза модифицированных нуклеозидов, но наиболее современным и технологичным считается ферментативный способ получения нуклеозидов, который заключается в переносе остатка рибозы (дезоксирибозы, арабинозы) с природного основания на химически модифицированное (2-хлораденин, 5-фторурацил и т.п.) (реакция трансгликозилирования). Этот процесс осуществляется при участии ферментов нуклеинового обмена - нуклеозидфосфорилаз (НФ).

Нуклеозидфосфорилазы бактериальных клеток: пуриннуклеозидфосфорилаза (ПНФ) и пиримидиннуклеозидфосфорилаза в присутствии неорганического фосфата, катализируют обратимый фосфоролиз нуклеозидов. Фосфорилазы бактериальных клеток обладают

довольно низкой субстратной специфичностью и широко используются в синтезе природных и модифицированных аналогов нуклеозидов. Предполагаемый процесс действия ферментов представлен на схеме 1.

Схема 1.

В = природные гетероциклические основания;

В1 = модифицированные гетероциклические основания;

Х = Н,ОН,Ридр.

Как правило, в качестве донора рибозы (дезоксирибозы) применяют природные нуклеозиды: гуанозин (Guo), тимидин (Thd), уридин, аденозин (Ado).

Этот подход к синтезу нуклеозидов обладает рядом существенных преимуществ в сравнении с химическими способами получения указанных соединений, а именно: а) стерео-и региоспецифичностью реакций, в результате которых образуются исключительно NH3-изомеры; б) доступностью биокатализатора; в) высокими выходами целевых соединений.

К положительным сторонам этого способа синтеза модифицированных нуклеозидов можно отнести его технологичность - нет необходимости вводить защитные группы в молекулу дезоксирибозы, рибозы или арабинозы и модифицированного основания для проведения реакции гликозшшрования (дополнительные 5-6 стадий синтеза), экономичность (отсутствие дорогих реактивов), масштабируемость, а также безопасность и экологичность.

Экспериментальные работы по теме диссертации можно подразделить на следующие основные разделы:

I. Разработка биотехнологии получения субстанций известных противоопухолевых препаратов кладрибина и флудары.

II. Синтез аналогов противовирусных препаратов рибавирина и видарабина, модифицированных по гетероциклическим основаниям, для исследования их противовирусной активности.

III. Исследование субстратной специфичности нуклеозидфосфорилаз по отношению к ряду модифицированных гетероциклических оснований с целью получения новых модифицированных нуклеозидов и поиска новых ингибиторов ферментов нуклеинового обмена.

IV. Проведение тестирования биологической активности синтезированных модифицированных нуклеозндов.

В работе использованы препараты генно-инженерных нуклеозидфосфорилаз, выделенных из штаммов-продуцентов, созданных в группе рекомбинантных белков Лаборатории биотехнологии ИБХ РАН.

1. Разработка биотехнологии получения субстанций фармпрепаратов кладрибнна н

флудары.

1.1 Синтез 2-хлор-2'-дсзоксиаденозина (кладрибина).

№Ь

Предварительные эксперименты по изученшо субстратной специфичности НФ Е. coli показали, что в отличие от ПНФ человека, бактериальные ферменты способны воспринимать 2-хлораденин и 2-хлораденозин в качестве субстратов, хотя и с очень низким сродством. Поэтому перед нами стояла задача подобрать условия проведения ферментативной реакции и оптимизировать параметры проведения процесса с целью разработки биотехнологического способа получения кладрибина с возможностью масштабирования процесса. Ранее проведенные эксперименты показали, что для проведения реакции ферментативного трансгликозилирования оптимальными являются: температура 40-60 °С, КНгРО^буферный раствор и pH 7-8.

Исходным соединением в синтезе кладрибина был выбран 2-хлораденозин, синтезированный ранее в Лаборатории биотехнологии ИБХ РАН.

Получение субстанции кладрибина осуществляли в две стадии (схема 2):

• на первой стадии проводили ферментативный гидролиз 2-хлораденозина (2) до 2-хлораденина (3),

• на второй стадии осуществляли синтез кладрибина (1) из 2-хлораденина (3) и тимидина (S) (в качестве донора дезоксирибозы).

НО

кладрибин, (1)

Схема 2

Стадия 1

ПНФ

НО

О—Р—ОН ОН ОН ¿н

Стадия 2

3 5 17

Синтез кладрибина оказалось нецелесообразно проводить в одну стадию, без промежуточного выделения 2-хлораденина, т.к. практически невозможно полностью очистить целевой продукт - 2-хлор-2'-дезоксиаденозин (1) от примеси исходного нуклеозвда (2), что значительно усложняет технологию получения и очистки субстанции фармпрепарата и приводит к повышению его себестоимости.

1.1.1. Синтез 2-хлораденина (2-С1А(1е).

Первую стадию процесса получения кладрибина проводили с использованием ферментного препарата - генно-инженерной пуриннуклеозидфосфорилазы (ферментативное расщепление гликозидной связи 2-хлораденозина с образованием 2-хлораденина (2-С1Ас1е) и 1 -сх-О-рибозилфосфата, стадия 1, схема 2). При проведении реакции продукт - 2-хлораденин выпадает в осадок, что смещает равновесие реакции в сторону образования целевого продукта. Время проведения процесса напрямую зависит от количества добавляемого ферментного препарата ПНФ и концентрации фосфатного буферного раствора.

Нами был проведен ряд экспериментов по изучению влияния количества фосфатного буферного раствора в реакции фосфоролиза 2-хлораденозина. Было показано, что

максимальная скорость реакции фосфоролиза наблюдалась при соотношении концентраций 2-С1Ас1о/КН2Р04 1:1, увеличение этого соотношения до 1:2 практически не оказывало влияния на ход реакции.

Проведенные нами эксперименты показали, что реакция ферментативного расщепления гликозидной связи 2-хлораденозина продолжается в среднем 4-5 суток, причем целесообразно периодически вносить фермент в реакционную смесь порциями 1 раз в сутки.

Далее были проведены работы по масштабированию реакции с целью наработки исходного соединения для синтеза кладрибина. Нами были выбраны следующие параметры проведения процесса: реакционная смесь содержала: 20 мМ 2-С1-Ас1о, 20 мМ КН2РО4, рН 7.0, объем 2000 мл, 60 °С, добавлено 7 мл ПНФ (удельная активность 27 ед/мг белка, концентрация по белку 11.0 мг/мл).

Образующийся 2-хлораденин выделяли из реакционной смеси фильтрованием. Продукт очищали от следов исходного 2-хлораденозина перекристаллизацией из воды: для его растворения рН доводили до 2.0 при 60 °С, затем увеличивали до рН 7.0. Выпавший в осадок 2-хлораденин отфильтровывали. Разработанная методика синтеза 2-хлораденина позволяет получать продукт с выходом 88 % и чистотой 99.5-99.9 % (по данным ВЭЖХ).

1.1.2. Выбор донора 2'-дезоксирнбозы в синтезе кладрибица.

В качестве донора дезоксирибозы можно использовать природные нуклеозиды тимидин или 2'-дезоксигуанозин. В первом случае трансгликозшшрование проводят с помощью двух ферментов: тимидинфосфорилазы (ТФ) и пургашуклеозидфосфорилазы. Первый фермент гидролизует гликозидную связь в тимидине, а второй образует ее из полученного 1-фосфата дезоксирибозы и 2-хлораденина. Эта реакция носит равновесный характер. Существуют методы, позволяющие сдвигать равновесие ферментативных реакций в сторону образования целевых продуктов: избыток одного из компонентов реакции, применение в синтезе в качестве субстрата нуклеозида, при фосфоролизе которого образуется нерастворимое основание (например - гуанин в случае дезоксигуанозина). Поэтому на первом этапе изучения синтеза кладрибина перед нами стоял вопрос о выборе оптимального субстрата.

Проведенные эксперименты показали, что через 1 час содержание кладрибина в реакции с тимидином было выше чем в реакции с 2'-дезоксигуанозином. Кроме того, субстрат - дезоксигуанозин - на порядок дороже тимидина, поэтому нецелесообразно было разрабатывать технологию синтеза кладрибина, используя дорогие исходные соединения.

Помимо этого, применять дезоксигуанозин в качестве донора дезоксирибозы не технологично, т.к. выпадающая в осадок смесь двух оснований: 2-хлораденина и гуанина не

позволяет регенерировать исходное основание - 2-хлораденин. Поэтому мы выбрали в качестве донора дезоксирибозы в ферментативной реакции тимидин.

Оптимальное время проведения реакции составило 1 час при температуре 60 °С.

Далее перед нами стояла задача оптимизировать условия проведения процесса получения кладрибина: установить оптимальное соотношение реагентов, количество ферментов, способы выделения целевого продукта.

1.1.3. Масштабирование реакции ферментативного синтеза кладрибина из 2-хлораденина и тимидина.

Объем реакционных смесей при оптимизации биотехнологического способа синтеза субстанции кладрибина обычно составлял 2 мл. При разработке лабораторного регламента были проведены работы по масштабированию процесса синтеза до объема 1000 мл. Показано, что оптимальными являются следующие параметры проведения процесса: реакционная смесь содержала по 2 мМ 2-ClAde, 2.8 мМ Thd, буферный раствор 2 мМ КН2РО4 с добавлением этанола (10% обьемн.), рН 7.0, 60 °С, добавлено по 2.5 мл ТФ (удельная активность 35 ед/мг белка, белок 14.6 мг/мл) и ПНФ (удельная активность 27 ед/мг белка, белок 11.0 мг/мл). Время проведения реакции - 30 мин.

По окончании процесса реакционную смесь концентрировали, выпавший 2-ClAde отфильтровывали. Наиболее технологично оказалось проводить последующее разделение компонентов реакционной смеси хроматографией на сорбенте DOWEXlx4, 200-400 mesh (2.0x27.0 см) в боратной форме. Кладрибин элюировали 20 % раствором этилового спирта в воде. Остаточное количество 2-ClAde элюировали раствором 10 % уксусной кислоты и возвращали в технологический процесс.

В целях разработки фармацевтической статьи предприятия (ФСП) и проведения работ по созданию готовой лекарственной формы кладрибина необходимо было получить субстанцию препарата фармакопейной чистоты (> 99.5 %). Основной примесью в препарате кладрибина, полученном по разработанной методике является 2-ClAde. Дополнительная кристаллизация препарата из смеси этанол-вода (5:1) позволила получить препарат чистотой > 99 % (по данным ВЭЖХ), причем следы 2-ClAde удалялись из образца вместе с механическими примесями до начала кристаллизации кладрибина. Разработанная технология очистки позволяет получать кладрибин с выходом 45.4 % (в пересчете на 2-хлораденин, с учетом возврата соединения по рециклу). Синтезированное соединение было охарактеризовано данными физико-химических анализов (17 показателей, в том числе данными 'Н-ЯМР, ИК-, УФ- спектров, ВЭЖХ, [а]о20), на основании которых был разработан проект ФСП.

Таким образом, в результате выполнения работы были отработаны условия ферментативного синтеза субстанции препарата кладрибина: подобраны донор 2'-дезоксирибозы, оптимальные соотношения субстрата и ферментов, условия разделения компонентов реакционной смеси и кристаллизации целевого продукта.

Показано, что процесс получения кладрибина с помощью генно-инженерных ферментов является эффективным и технологичным, легко поддается масштабированию. После проведения работ по масштабированию технологии создан лабораторный регламент получения субстанции кладрибина в соответствии с требованиями ОСТ 42-505-96.

1.2. Синтез 5'-фосфата 6-амшю-9-р-В-арабинофуранозил-2-фтор-9-Н-пурина (флудары).

5'-Фосфат флударабина (флудара, 8) - цитотоксический аналог такого внутриклеточного метаболита, как дезоксиаденозинмонофосфат, является новым противоопухолевым препаратом, высокоэффективным в качестве средства вспомогательной терапии у больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом.

В настоящее время препарат флудара широко применяется в терапии различных лимфопролиферативных заболеваний, и, кроме того, активно используется при трансплантации периферических стволовых клеток или костного мозга. Флудара с одинаковой активностью действует на покоящиеся и делящиеся клетки. Одним из звеньев механизма его действия является индукция апоптоза. После внутривенного введения препарат флудара перед транспортом через клеточные мембраны подвергается дефосфорилированию до флударабина (9), который и поступает в лимфоциты и ингибирует ряд участвующих в синтезе ДНК ферментов (рибонуклеотидредуктаза, ДНК- праймаза, ДНК- полимераза, ДНК- лигаза). Однако применение флударабина в клинической практике

ОН

флудара (8)

флударабин (Р1ис1,9)

невозможно из-за его низкой растворимости в воде, поэтому в виде лекарственного препарата используют его 5'-монофосфат.

Химико-ферментативный способ получения субстанции флудары включает в себя две стадии: синтез флударабина и его фосфорилирование.

1.2.1 Синтез 6-амино-9-р-В-арабинофуранозил-2-фтор-9-Н-пурина (флударабина).

Технологически возможны следующие подходы в выборе субстратов для синтеза флударабина (схема 3) с использованием:

• 2-фтораденина (10) и 1-а-О-арабинозилфосфата (1-Р-Ага, 11) в качестве донора арабинозы,

• 2-фтораденина (10) и 1 -Р-О-арабинофуранозилурацшта (Ага-11,12),

• 2-фтораденозина (13) и 1 -а-О-арабинозилфосфата (11),

• 2-фтораденозина (13) и Ага-и (12).

Донорами остатка арабинозы для ферментативной реакции могут быть 1-а-О-арабинозилфосфат и 1-р-Е)-арабинофуранозилзилурацил, химический синтез которых возможен из арабинозы и уридина, соответственно.

Схема 3.

МН;

ОН

Ага-и (12)

Одним из этапов работы по созданию технологии получения флударабина являлась разработка способа синтеза 1-р-О-арабиноурацила (12). Известно несколько методов синтеза Ага-Ц основанных на получении 2-2'-ангидро-1-(Р-0-арабинофуранозил)урацила. Нами была выбрана реакция уридина с дифенилкарбонатом. 2,2'-Ангидроцикл уридина образуется при внутримолекулярной атаке карбонильным кислородом при С-2 промежуточного 2'-0-фенилкарбоната. Последующее омыление 2,2'-ангидроурцдина водной щелочью при комнатной температуре приводит к образованию Ага-и с количественными выходами. В последующем все опытные партии Ага-и для наработки флударабина были получены по данному способу.

Для оценки возможности использования в технолог™ получения флударабина а-Г>-арабинозо-1-фосфата был разработан способ его получения из Э-арабинозы, которая в несколько раз дешевле уридина.

Ключевой стадией синтеза является получешге Р-аномера полного ацетата арабинозы в фуранозной форме, для чего арабиноза избирательно защищалась по 5-положению формильной группой с последующим ацетилированием уксусным ангидридом при основном катализе ацетатом натрия, что приводило к образованию полностью защищенного производного (16) в виде р-аномера, что существенно для следующей стадии. Сплавление производного (16) с фосфорной кислотой по методу Мак-Дональда с последующим омылением ЬЮН приводит к образованию целевого соединения (11), которое выделяли из реакционной смеси многократным переосаждением.

Схема 4.

СНО

СН20-С*

Ас20

АсО"

НСО—, ^ ОАс

ОАс

2) ЫОН

01л

По данным 1Н ЯМР спектра продукт представляет собой смесь двух соединений: а-0-арабинофуранозил-1-фосфата и а-0-арабинопиранозил-1 -фосфата в соотношении 1:5. Общий выход 46.6 %. Оказалось, что разделять эти два соединения не имеет смысла, т.к.

субстратом для нуклеозидфосфорилаз является только а-0-арабшюфуранозил-1-фосфат, причем а-Б-арабинопиранозил-1 -фосфат не влияет на процесс синтеза модифицированных нуклеозидов.

Исходное соединение для синтеза флударабина - 2-фтораденозин был синтезирован в Лаборатории биотехнологии ИБХ РАН.

Получение 2-фтораденина (10) проводили с использованием ферментного препарата: генно-инженерной ПНФ. Схема синтеза аналогична стадии 1 схемы 2 (получение 2-хлораденина); в качестве исходного соединения использовался 2-Р'Ас1о (13). В ходе реакции полученное основание 2-РАс1е (10) выпадает в осадок, что медленно смещает равновесие реакции в сторону образования целевого продукта Процесс проводили в течение 14 дней до исчезновения исходного 2-фтораденозина (аналогично реакции получения 2-хлораденина). 2-Фтораденин отфильтровывали, сушили в вакууме (5 мм. рт. ст), без дополнительной очистки использовали в синтезе флударабина. Выход: 82.6 %.

На следующем этапе работы подбирались оптимальные пары субстратов для ферментативной стадии получения флударабина (схема 3).

Изучение особенностей процесса синтеза флударабина из 2-РАс1е (10) и 1-Р-Ага (11) показало, что к положительным сторонам этого варианта можно отнести его высокую скорость (2 часа) и отсутствие необходимости в буферном растворе.

После оптимизации процесса ферментативного получения флударабина по основным параметрам (количеству добавляемого препарата ПНФ, соотношению субстратов, рН и температуре реакционной смеси) нам удалось получить продукт с выходом 47.2 % (в пересчете на 2-фтораденин).

Замена 1-Р-Ага (11) на Ага-и (12) привела к необходимости увеличить время проведения процесса и использовать бинарную систему ферментативных препаратов (ПНФ+УФ). Выход флударабина составил 61 %.

Одним из возможных вариантов получения Р1ис1 является его синтез из фосфата арабинозы 1-Р-Ага (11) и 2-фтораденозина (13). После оптимизации процесса ферментативного получения флударабина по основным параметрам (количеству добавляемого препарата ПНФ, соотношению субстратов) нам удалось получить продукт с выходом 79 % (в пересчете на 2-фтораденозин). Однако в данном случае реакцию пришлось проводить в течение 400 часов.

Очень важно, что замена донора основания - 2-фтораденина на 2-фтораденозин позволила проводить синтез флударабина при высоких концентрациях последнего в реакционной смеси (30 мМ вместо 1 мМ раствора для 2-РАёе). Время проведения реакции лимитировано процессом кристаллизации продукта - флударабина.

После оптимизации процесса ферментативного получения флударабина из 2-фторадепозипа (13) и 1-|Ы)-арабш103илурацила (12) по основным параметрам (количеству добавляемых препаратов ПНФ и УФ, соотношению субстратов, концентрации фосфатного буферного раствора, рН и температуре реакционной смеси) нам удалось получить продукт с выходом в среднем 84 % (в пересчете на 2-фтораденозин).

Суммарный выход флударабина в две стадии (через 2-фтораденин) составляет 39 %, тогда как средний выход при получении его из 2-РАс1о и Ага-и - 72 %, вследствие чего последний способ остается наиболее технологичным.

Таблица 1.

Реагенты Особенности процесса Выход, %

2-РА(1е (10)и 1-Р-Ага(11) 2 часа, не нужен буферный раствор, ПНФ, необходим ¡0-кратный избыток 1-Р-Ага к 2-РА<1е 47

2-РА<1е (10) и Ага-и (12) 100 часов, ПНФ+УФ; 2-кратный избыток Ага-и к 2-РАс1е 61

2-РАёо (13) и 1-Р-Ата (11) 400 часов, высокая концентрация 2-РАс1о по сравнению с 2-РА(1е, ПНФ, необходим 10-кратный избыток 1-Р-Ага 79

2-РАс1о (13) и Ага-и (12) 400 часов, высокая концентрация 2-РА<1о по сравнению с 2-РАёе, ПНФ+УФ 84

Таким образом, при сравнении четырех вариантов ферментативного синтеза флударабина был выбран в качестве оптимального способ синтеза из 2-фтораденозииа (13) и 1-|Н)-арабинозилурацила (12).

Пример оптимизации процесса ферментативного получения Флударабина по трём параметрам (температура, рН реакционной смеси, соотношение субстратов) представлены на рисунке 1.

Из представленных данных следует, что оптимальная температура в синтезе - +50-55 °С. Нуклеозидфосфорилазы оказались активными в широком диапазоне рН от 5 до 9. Однако, только при рН 6-7 наблюдалась кристаллизация продукта из реакционной смеси. На последнем рисунке видно, что скорость реакции при избытке Ага-и к 2-РАс1о 10:1 максимальна, однако, из-за его высокой себестоимости, мы снизили это соотношение до 2:1.

Рис. 1.

Зависимость скорости синтеза 1Ьн) от температуры

6 -

25 35 40 45 50 55 60 65 Температура, °С

Зависимость содержания П;н1 в реакционной смеси от рН (время реакции 60 минут)

I -1 I

ч 1 - 11II1II -

ш ,

3456789 10 II

РН

Влияние избытка Ага-и по отношению к

20 40 60

Время реакции, ч

Данный вариант синтеза был масштабирован для разработки метода фосфорюшрования флударабина с целью получения субстанции препарата флудары.

Объем реакционных смесей при оптимизации биотехнологичсского способа синтеза флударабина обычно составлял 2 мл. При разработке лабораторного регламента были проведены работы по масштабированию процесса синтеза до объема 2000 мл. Показано, что оптимальными являются следующие параметры проведения процесса: реакционная смесь содержала по 30 мМ 2-РА(1о, 60 мМ Ага-и, буферный раствор 60 мМ КН2Р04, рН 7.0, 50 "С, добавлено по 12 мл ПНФ (удельная активность 40 ед/мг белка, белок 15 мг/мл) и УФ (удельная активность 14 ед/мг белка, белок 10.0 мг/мл). Время проведения реакции - 400 ч.

По окончании процесса выпавший в осадок флударабин отфильтровывали, промывали водой и этанолом, сушили в вакууме. В среднем выход составляет 14.5 г продукта за один технологический цикл (84 %).

1.2.2. Синтез 5 -фосфата флударабина.

Флударабин плохо растворим в воде, поэтому для создания готовых лекарственных форм используется его 5'-монофосфат. Синтез фосфата флударабина проводили

селективным фосфорилированием нуклеозида (9) хлорокисыо фосфора в триэтилфосфате (схема 5):

Схема 5.

+ РОС13

(ЕЮ)зРО Н20

НС1

Целевое соединение в виде литиевой соли получено с выходом 55.6% и охарактеризовано данными Н'-ЯМР спектра.

Использование литиевых солей фармпрепаратов не разрешено МЗ РФ в силу их токсичности для организма, поэтому нуклеозид (8) в форме свободной кислоты получали с помощью ио1шого обмена на смоле DOWEX 50x8 (НГ-форма), 200-400 mesh (размер колонки 10.0x5.0 см). Общий выход флудары (8) составил 26.7%. Синтезированное соединение было охарактеризовано данными физико-химических анализов (16 показателей, в том числе данными 'Н-, 13С-, 31Р-ЯМР, ИК, УФ, ВЭЖХ, [а]о20), на основании которых был разработан проект ФСП.

После проведения работ по масштабированию технологии создан лабораторный регламент получения субстанции флдарабина фосфата в соответствии с требованиями ОСТ 42-505-96.

Таким образом, нами был разработан эффективный биотехнологический способ получения субстанции лекарственного препарата флудары с использованием генно-инженерных нуклеозидфосфорилаз на стадии трансгликозилирования. На разработанный способ получения флударабина подана заявка на получение патента РФ № 2008126081 от 27.06.2008 г.

2. Синтез аналогов рибавирина

Рибавирин - 1-р-0-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид (рис. 2) - хорошо известный противовирусный препарат с широким спектром действия в отношении множества РНК- и ДНК-вирусов. Применяется для системной терапии распространенных вирусных инфекций человека (вирусный гепатит С, респираторно-синцитиальная, аденовирусная инфекции и др.).

Рис. 2. Рибавирин (17).

но

но он

и н

Высокий интерес к созданию новых противовирусных препаратов обеспечивает постоянное внимание к синтезу и изучению биологической активности новых аналогов рибавирина, модифицированных либо по гетероциклическому основанию (1,2,4-триазол-З-карбоксамиду), либо по углеводному остатку.

Возможные направления модификации.

2.1 Синтез 5-метилрибавирина и 5-метил-2'-дезоксирибавирина

С целью получения структурных аналогов рибавирина были разработаны методы синтеза модифицированных нуклеозидов на основе 5-замещенных производных 1,2,4-триазол-3-карбоксамида (18) (рис. 3). Основания (19) и (20) были синтезированы на кафедре биотехнологии МИТХТ им. М.В.Ломоносова.

Было показано, что так же как и 1,2,4-триазол-З-карбоксамид (18), 5-метил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид (Ме-ТКА, 19) является субстратом для нуклеозидфосфорилаз. Соединение (20) имело очень низкую растворимость в реакционном растворе и субстратом не являлось. Для осуществления препаративного биотехнологического синтеза 5-метил замещенного аналога рибавирина нами использовались генно-инженерные ферменты: пуриннуклеозидфосфорилаза и тимидинфосфорилаза, нашедшие ранее применение в биотехнологическом синтезе субстанций рибавщнша.

После выбора оптимальных доноров рибозы и дезоксирибозы, были синтезированы два аналога рибавирина (21) и (22) (схема 6).

Обычно в качестве донора рибозы в реакции трансгликозилирования используют природные нуклеозиды гуанозин или инозин. Применение в качестве донора рибозы гуанозина (Оио) в нашем случае обусловлено большей глубиной протекания реакции за счет вывода из реакционной смеси малорастворимого побочного продукта - гуанина. Реакция с

5-(4-пиридил)-1,2,4-триазол-3-карбоксамид

1,2,4-триазол-З-карбоксамид (ТКА)

5-метил-1,2,4-триазол-3-карбоксамвд (Ме-ТКА) тр Рис. 3. Модифицированные основания.

участием инозина - процесс равновесный, в силу чего максимальное отношение количества продукта (21) к исходному основанию (19) не превышало значения 1.4, тогда как при использовании в качестве донора рибозы гуанозина это отношение составило 5.4.

Соотношение компонентов в реакционной смеси составляло Оио/Ме-ТКА - 3:1 и (}ио/КН2Р04 - 1:1 (по молям). Разделение компонентов реакционной смеси проводили колоночной хроматографией на обращено-фазовом сорбенте. Продукт кристаллизовали из метилового спирта Разработанная методика синтеза 5-метилрибавирииа (21) позволяет получать продукт с выходом 62 % и чистотой более 99 % (по данным ВЭЖХ).

Далее были проведены работы по созданию технологии получения дезоксирибозного аналога 5-метилрибавирина (22). Возможными донорами 2'-дезоксирибозы являются природные нуклеозиды тимидин и 2'-дезоксигуанозин. В первом случае трансгликозилирование проводят с помощью двух ферментов: тимидинфосфорилазы и пуриннуклеозидфосфорилазы. Первый фермент гцдролизует гликозидную связь в тимидине, а другой переносит 5-метил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид на остаток дезоксирибозы.

На первом этапе изучения реакции трансгликозилирования перед нами стоял вопрос о выборе оптимального субстрата. Как и в случае синтеза кладрибина, было показано, что соотношение продукт/исходное гетероциклическое основание выше в случае, когда донором дезоксирибозы является тимидин. Оптимальное время реакции трансгликозилирования составляет 20-30 минут, после чего количество продукта в реакционной смеси начинало уменьшаться.

Разделение компонентов реакционной смеси проводили колоночной хроматографией на обращено-фазовом сорбенте. После объединения фракций, содержащих целевой продукт, растворитель удаляли лиофилизацией. Разработанная методика синтеза 5-метил-2'-дезоксирибавирина (22) позволяет получать продукт с выходом 36 % и чистотой более 99 % (по данным ВЭЖХ).

В результате разработки биотехнологического способа синтеза аналогов рибавирина были синтезированы два новых модифицированных нуклеозида (21, 22) и наработаны их

Схема 6.

ОН ОН 21

ОН н 22

опытные партии для проведения биологического тестирования на противовирусную активность. Синтезированные соединения охарактеризованы данными 1Н ЯМР-, УФ-спектров и ВЭЖХ.

Таким образом, нами показано, что использование биологических систем на основе нуклеозидфосфорилаз делает возможным эффективный синтез новых перспективных аналогов модифицированных нуклеозидов, получать которые классическими химическими способами сложно или неэффективно.

2.2 Синтез аналогов рибавирина на основе 1,2,4-аминотриазола (23).

С целью получения структурных аналогов рибавирина нами были разработаны методы синтеза производных 3-амино-1,2,4-триазола и соответствующих рибо- и 2'-дезоксирибонуклеозидов (28-29 и 30-31 соответственно) (схема 7).

Производные 3-амино-1,2,4-триазола (Ас-АТА, 25 и Suc-ATA, 24) получали взаимодействием 3-амино-1,2,4-триазола (ATA, 23) соответственно с уксусным или янтарным ангидридом в пиридине. Оба соединения получены с хорошими выходами и охарактеризованы данными ВЭЖХ, масс- и 'Н-ЯМР-спектроскопии.

На следующем этапе мы пытались синтезировать новые аналоги рибавирина из 3-амино-1,2,4-триазола (23) и его производных (24) и (25). Было показано, что все три соединения являются субстратами нуклеозидфосфорилаз. Однако, ацетилированное производное (25) оказалось нестабильным в условиях реакции и постепенно гидролизовалось до исходного 3-амино-1,2,4-триазола (23). Так как реакция протекает длительное время, данный метод синтеза неэффективен из-за образования трудноразделимой смеси оснований и соответствующих нуклеозидов.

Сам исходный 3-амино-1,2,4-триазол (23), как показали эксперименты, является очень плохим субстратом; за неделю образовывалось всего 2-3 % продукта.

В связи с этим было решено нарабатывать рибо- и дезоксирибонуклеозиды только с основанием Suc-ATA (24). В случае использования в реакции трансгликозилирования в качестве донора рибозы инозина, максимальное соотношение содержания в смеси нуклеозида (28) к исходному основанию (24) составляло 1.2, тогда как при использовании в качестве донора рибозы уридина это соотношение достигало 5.7. Большая глубина протекания реакции достигнута за счет вывода из реакционной смеси урацила путем его осаждения из раствора при охлаждении. Вследствие этого, мы вели процесс получения нуклеозида (28) полунепрерывным способом, периодически отфильтровывая урацил и добавляя уридин и ферменты равными порциями в течение 65 суток. Разделение компонентов реакционной смеси проводили колоночной хроматографией на обращенно-

фазовом сорбенте, что позволило получить продукт с выходом 34 % и чистотой не менее 98 % (по данным ВЭЖХ).

Схема 7.

,ын2

Н-/

вис-АТА, (24)

О л

О N- II

Ру 1

НО

ПНФ, УФ

о.

N-У

АТА, (23) ПНФ

ПНФ

но

N-^

Ш2

ын

ОН Я' ШЬ-вис-АТА, К'=ОН (28) ¿ШЬ-Эис-АТА, Я'=Н (29)

НО

он я-

ШЬ-Лс-АТА, И'^ОН, (30) аИШ-Ас-АТА, 1Г=Н, (31)

он Я'

ШЬ-АТА, И'^ОН (26) <1ШЬ-АТА, К'=Н (27)

Далее, мы изучили возможность получения 2'-дезоксирибозного нуклеозида (29). Возможными донорами 2'-дезоксирибозы являются природные нуклеозиды тимидин, 2'-дезоксиуридин и 2'-дезоксигуанозин. Использование в качестве донора дезоксирибозы - 2'-дезоксиуридина оказалось предпочтительнее в силу того, что во-первых, образующийся в процессе фосфоролиза урацил выпадает в осадок и сдвигает равновесие процесса в сторону образования целевого продукта, во-вторых, использование 2'-дезоксиуридина обеспечивает более легкое разделение компонентов реакционной смеси, чем при применении 2'-дезоксигуанозина. Разделение компонентов реакционной смеси проводили так же, как и в предыдущем случае. После объединения фракций, содержащих целевой продукт, растворитель удаляли лиофилизацией. Разработанная методика синтеза производного (29) позволяет получать продукт с выходом 29 % и чистотой не менее 98 % (по данным ВЭЖХ).

Все синтезированные соединения охарактеризованы данными 'Н ЯМР-, масс-, УФ-спектров и ВЭЖХ.

Простота и универсальность данного подхода позволили наработать экспериментальные партии модифицированных нуклеозидов для проведения биологического

тестирования на противовирусную активность в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

2.2. Разработка методов синтеза аналогов вндарабпна

Одним из очень перспективных направлений синтеза новых

модифицированных нуклеозидов является получение аналогов известного препарата видарабина (9-бета-0-арабинофурано-

зиладенина, Ага-А) (рис 4).

ОН

Рис. 4. Видарабин (32).

Нами была разработана схема синтеза четырех новых арабинонуклеозидов исходя из флударабина и 2-хлораденозина (схема 8).

Схема. 8.

2-С1А<1о (2)

ОН

2-С1-Ага-А (36)

В процессе проведения экспериментальных исследовшшй были найдены оптимальные параметры реакций получения аналогов видарабина, которые приведены в таблице 2.

Разделите компонентов реакционных смесей проводили колоночной хроматографией на обращенно-фазовом сорбенте. Все синтезированные соединения охарактеризованы данными 'Н ЯМР-, масс-, УФ-спекгров и ВЭЖХ.

Таблица 2.

Субстраты для Концентрация Фермент Время Целевой Выход,

реакции компонентов, мМ реакции, ч продукт %

2-С1-Ас1о (2) ЗмМ ПНФ 150 2-С1-Ага-А 81

1-Р-Ага (11) КН2Р04 (52 "С, рН 7.0) 54 мМ 5 мМ (36)

БЫ (9) 4 мМ - 24 2-ОМе-Ага-А 52

ИаОН 8 мМ (35)

метанол 50 мл

БЫ (9) 4 мМ - 55 2-ОЕе-Ага-А 80

К'аОН 8 мМ (34)

этанол 50 мл

Иш! (9) 4 мМ 40 2-ОН-Ага-А 76

ЫаОН 8 мМ (33)

н-бутанол 50 мл

Простота и универсальность разработанного нами подхода позволили наработать экспериментальные партии модифицированных нуклеозидов - аналогов видарабина для проведения биологического тестирования на противовирусную активность в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН и для проведения оценки терапевтического потенциала нуклеозидов (33) и (36) в культурах мононуклеарных клеток крови больных различными формами рассеянного склероза на различных стадиях иммунопатологического процесса в ГОУ ВПО "Российский государственный медицинский университет" Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУ ВПО РГМУ Росз драва).

Структура и чистота всех синтезированных целевых соединений и компонентов технологии их получения подтверждены данными ИК-, 'Н ЯМР спектроскопии, масс-спектрометрии и ВЭЖХ.

3. Изучение субстратно-специфических свойств нуклеозидфосфорилаз.

На протяжении последних лет большое внимание уделяется созданию и изучению свойств новых модифицированных нуклеозидов, перспективных в качестве противоопухолевых и противовирусных соединений. Существует принципиальная

возможность получения новых модифицированных нуклеозидов по реакции трансгликозилирования.

Нами проведены исследования субстратной специфичности нуклеозидфосфорилаз по отношению к ряду модифицированных гетероциклических оснований с целью получения новых модифицированных нуклеозидов и поиска новых ингибиторов ферментов нуклеинового обмена.

В качестве исходных соединений нами выбраны несколько модифицированных оснований (производства компании Автех, Москва) и природные нуклеозиды - тимидин (донор дезоксирибозы) и инозин (донор рибозы). Структуры модифицированных оснований и результаты тестирования приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Соед. Из Результат тестирования

1 2 3 4 5

37 Н ш2 БН ни субстрат, ни ингибитор

38 ЫН2 ш2 БН ни субстрат, ни ингибитор

39 н ш2 V/ ни субстрат, ни ингибитор

40 н ын2 Б—V ^он ни субстрат, ни ингибитор

41 н ш2 8—V О он ни субстрат, ни ингибитор

42 н ш2 Б N—, О ни субстрат, ни ингибитор

43 н ш2 / N \ ни субстрат, ни ингибитор

44 н ж2 О ни субстрат, ни ингибитор

1 2 3 4 5

45 Н NH2 /~\ N^_0 ни субстрат, ни ингибитор

46 nh2 О t/ \ ни субстрат, ни ингибитор

47 Н 0 Г~\ N NH ни субстрат, ни ингибитор

48 Н 0 о^о 0 ни субстрат, ни ингибитор

49 н \ 0 S н субстрат

50 н о f-^OH S н субстрат

51 н F н субстрат

52 н ДнгО"* н субстрат

53 н >00 н субстрат

При изучении реакции трансгликозилирования с участием новых оснований обычно ожидают три возможных результата:

• соединение - ингибитор НФ,

• соединение - субстрат НФ,

• соединение - ни ингибитор, ни субстрат НФ.

Одновременно с реакцией проводили контрольный опыт, в котором отсутствовало модифицированное основание. Так как в реакционной смеси присутствует природный нуклеозид (Thd, Ino, Guo, Ado), ингибирование процесса его фосфоролиза по сравнению с

контрольной реакцией свидетельствует о том, что тестируемое основание - ингибитор нуклеозидфосфорялазы. Увеличение скорости фосфоролиза природного нуклеозида по сравнению с контрольной реакцией, говорит о протекании сопряженного процесса — переноса получившегося а-О-рибозил- (или дезоксирибозил)фосфата на основание-акцептор, о чем свидетельствовало и появление нового соединения в реакционной смеси. Практически одинаковые скорости фосфоролиза природного нуклеозида в контрольной и рабочей реакциях свидетельствуют о том, что тестируемое соединение не является ни субстратом, ни ингибитором процесса.

Стандартные реакционные смеси содержали:

• контрольная - 1 мМ природного нуклеозида в 2 мМ КН2РО4, 10 мкл р-ра ПНФ (или ТФ)

• рабочая - 1 мМ модифицированного основания, 1 мМ 1по (или ТМ) в 2 мМ КН2РО4, 10 мкл р-ра ПНФ (или ТФ).

Отсутствие различий в скорости фосфоролиза тимвдина в контрольной и рабочей (например, содержащей соединение 37, рис. 5) смесях свидетельствует о том, что оно не является ни субстратом, ни ингибитором нуклеозидфосфорилаз.

Рисунок 5. Рисунок 6.

Влияние основания (49) на фосфоролиз [по

\ {

—♦—Контроль —•—1по+49

-! 1

0 50 100 150

Время, мин

Иначе протекает на фосфоролиз инозина (1по) в присутствии соединения (49) (рис. 6). Приведенные данные свидетельствуют о том, что наряду с процессом фосфоролиза инозина в реакционной смеси проходила реакция синтеза нового модифицированного нуклеозида.

Результаты, приведенные в табл. 3 показывают, что введение заместителя в 8-положение модифицированного пуринового основания препятствует процессу нормального связывания данного субстрата с активным центром фермента Тогда как введение заместителя в 6-положение основания не является критичным, и данное основание может выступать акцептором остатка рибозы (дезоксирибозы) в процессе трансгликозилирования, о чем свидетельствует появление новых соединений в реакционных смесях (по данным ВЭЖХ).

Таким образом, нами впервые показана принципиальная возможность получения по разработанной технологии новых модифицированных нуклеозидов, замещенных по 6 положению пуринового основания. Показано, что при этом размер заместителя не влияет на способность субстрата связываться с активным центром фермента.

4. Изучение противовирусной активности синтезированных соединений.

Аналоги рибавирина (21) и (22) были переданы в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН для изучения их противовирусной активности. На первом этапе выполнения работ определяли цитотоксическое действие (ЦД50) рибавирина (контроль) и его аналогов: 5-метил-рибавирина и 5-метил-дезоксирибавирина. Все три изученных соединения обладают сравнительно низкой щпотоксичностью. Последующие вирусологические исследования осуществляли в концентрациях ниже ЦЦ50.

Установлено, что ранее полученные два 5-метил-замещенных аналога рибавирина (21 и 22) эффективно подавляют репродукцию вирусов Тягиня, Дхори и в меньшей степени репродукцию вирусов Долины Рифт и Крымско-Конго геморрагической лихорадки, вирусов осповакцины.

Также установлено, что не только рибавирин, но и его аналог 5-метил-2'-дезокси-рибавирин (22) эффективно подавляют репродукцию вируса осповакцины (Vaccinia Virus) в культуре клеток Vero, защищая клетки в результате предотвращения развития вирус специфического цитопатогенного действия (табл. 4)

Таблица 4.

Снижение инфекционного титра вируса, Ig ТЦИДзо/мл*

Концентрация препарата, мкг/мл

5 25 50 100

Рибавирин (17) 7.4 6.8 6.0 5.7

5-Метил-2'-дезоксирибавирин (22) 7.2 6.8 6.1 -

Видарабин (32) 7.2 5.8 4.7 токсич.

Флудара (8) 6.3 5.4 5.0 4.3

* Через 72 часа после введения препарата.

В настоящее время проводится оценка терапевтического потенциала новых модифицированных нуклеозидов (8, 9, 33, 36) в культурах мононуклеарных клеток крови больных различными формами рассеянного склероза на различных стадиях иммунопатологического процесса в ГОУ ВПО "Российский государственный медицинский университет" Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава).

Выводы.

1. Разработаны эффективные биотехнологии получения субстанций кладрибина и флудары с использованием генно-инженерных нуклеозидфосфорилаз, перспективные для внедрения на предприятиях медико-биологического профиля. Фармацевтические субстанции охарактеризованы данными физико-химических анализов, на основании которых были разработаны проекты ФСП в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи XI. Созданы лабораторные регламенты получения субстанций кладрибина и флудары в соответствии с требованиями ОСТ 64-02-003-2002.

2. Впервые с использованием реакции трансгликозилирования синтезированы восемь новых аналогов рибавирина и видарабина, модифицированных по гетероциклическим основаниям. Соединения переданы для проведения биологического тестирования на противовирусную активность на клеточных моделях и экспериментальных животных (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского) и для проведения оценки терапевтического потенциала при лечении различных форм рассеянного склероза (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава).

3. Исследована субстратная специфичности нуклеозидфосфорилаз по отношению к ряду модифицированных гетероциклических оснований с целью получения новых модифицировать« нуклеозидов. Впервые показана принципиальная возможность синтеза модифицированных нуклеозидов, имеющих объемные гетероциклические заместители в 6-положении пуринового основания с помощью пуриннуклеозцдфосфорилазы.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях

1. Фатеев И.В.. Константинова И.Д., Швец В.И. Биотехнологический способ синтеза новых аналогов рибавирина // Вестник МИТХТ. 2008. - Т.З., № 4. - С. 58-62.

2. Константинова И.Д., Фатеев И.В.. Музыка И.С., Галкина И.В., Бутенко А.М., Галегов Г.А., Белов A.B., Ларичев В.Ф., Дерябин П.Г., Швец В.И., Львов Д.К., Мирошников А.И. Биотехнологический способ получения и исследование противовирусной активности рибавирина и его 5-метил замещенных аналогов. // Биотехнология. 2008. - №4. - С. 69-79.

3. Константинова И.Д., Фатеев И.В.. Антонов К.В., Есипов P.C., Музыка И.С., Галегов Г.А., Мирошников А.И. Новые модифицированные нуклеозиды в терапии распространенных вирусных заболеваний. // Тезисы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск. - 2008. - С.352.

4. Константинова И.Д., Антонов К.В., Берзин В.Б., Дорофеева Е.В., Фатеев И.В.. Музыка И.С., Мирошников А.И. Способ получения 9-(Р-0-арабинофуранозил)-2-фтораденина. // Заявка на патент РФ № 2008126081 от 27.06.2008.

Подписано в печать 15.10.2008. Формат 60x84/16. Бумага писчая. Отпечатано на ризографе. Уч. изд. листов Тираж 100 экз. заказ №

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова. Издательско-полиграфический центр. 119571 Москва, пр. Вернадского 86.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Фатеев, Илья Владимирович

Список сокращений

1 Введение

2 Обзор литературы

2.1 Модифицированные нуклеозиды в терапии онкологических заболеваний

2.2 Химический синтез аналогов пуриновых нуклеозидов (кладрибина, флударабина)

2.2.1 Химический синтез кладрибина и его аналогов

2.2.2 Химический синтез флударабина

2.3 Нуклеозидфосфорилазы - ферменты нуклеинового обмена

2.3.1 Нуклеозидфосфорилазы пуринового типа

2.3.1.1 Высокомолекулярные пуриннуклеозидфосфорилазы

2.3.1.2 Низкомолекулярные пуриннуклеозидфосфорилазы

2.3.2 Нуклеозидфосфорилазы пиримидинового типа

2.3.2.1 Уридинфосфорилаза

2.3.2.2 Тимидинфосфорилаза Е. coli и пиримидиннуклеозидфосфорилаза 26 Bacillus stearothermophilus

2.4 Применение нуклеозидфосфорилаз в синтезе модифицированных нуклеозидов

2.5 Механизм биологической активности кладрибина, флударабина и рибавирина

2.5.1 Механизм противоопухолевого действия кладрибина

2.5.2 Механизм противоопухолевой активности флударабина в терапии 37 злокачественных заболеваний системы кроветворения

2.5.3 Биологическая аективность рибавирина

2.6 Новые ингибиторы нуклеозидфосфорилаз

2.6.1 Модификации оснований

2.6.2 Модификации пентозного кольца

2.6.3 Замена кольца пентозы циклическим или ациклическим заместителем

2.6.4 Бисубстратные аналоги ингибиторов

2.6.5 Ингибиторы переходного состояния

2.6.6 Ингибиторы высокомолекулярной ПНФ (Е. coli)

2.6.7 Ингибиторы нуклеозидфосфорилаз в терапии злокачественных 51 поражений системы кроветворения и иммунодефицитных состояний

3 Обсуждение результатов 53 3.1 Разработка биотехнологии получения субстанций фармпрепаратов кладрибина и 54 флудары

3.1.1 Синтез 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (кладрибина)

3.1.1.1 Синтез 2-хлораденина (2-С1 Ade)

3.1.1.2 Выбор донора 2' -дезоксирибозы в синтезе кладрибина

3.1.1.3 Масштабирование реакции ферментативного синтеза кладрибина из 60 2-хлораденина и тимидина

3.1.2 Синтез 5'-фосфата 6-амино-9-Р-Б-арабинофуранозил-2-фтор-9-Н-пурина 61 (флудары)

3.1.2.1 Синтез 6-амино-9-р-0-арабинофуранозил-2-фтор-9-Н-пурина 62 (флударабина)

3.1.2.2 Синтез 5'-фосфата флударабина

3.2 Синтез аналогов рибавирина и видарабина

3.2.1 Синтез 5-метилрибавирина и 5-метил-2'-дезоксирибавирина

3.2.2 Синтез аналогов рибавирина на основе 1,2,4-аминотриазола (23)

3.2.3 Разработка методов синтеза аналогов видарабина

3.3 Изучение субстратно-специфических свойств нуклеозидфосфорилаз

3.4 Изучение противовирусной активности синтезированных соединений

4 Экспериментальная часть

5 Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка химико-ферментативного способа получения модифицированных нуклеозидов"

В настоящее время в мировой клинической практике используется ряд современных препаратов, созданных на основе модифицированных нуклеозидов и обладающих широким спектром биологической активности - противоопухолевой (онкологические заболевания системы кровообращения), противовирусной (гепатит С, герпес и др.), иммуносупрессорной (рассеянный склероз, трансплантация костного мозга). Терапевтический эффект использования препаратов на основе модифицированных нуклеозидов при лечении злокачественных поражений системы кроветворения достигает 80% полных ремиссий после одного курса монохимиотерапии. Модифицированные нуклеозиды успешно сочетаются с препаратами последнего поколения на основе моноклональных антител (Rituximab и САМРАТН-1Н). Ведутся работы по изучению комплексной терапии рассеянного склероза и опухолевых поражений системы кроветворения кладрибином и стволовыми клетками.

В России зарегистрированы для клинического использования множество препаратов на основе аналогов модифицированных нуклеозидов, например флудара ("Fludara", Shering AG, Jonson&Jonson), рибавирин (ICN Pharma). Стоимость курса лечения кладрибином (50-70 мг) составляет 3500 долларов США, а курс лечения флударабином (1.3-1.5 г) обойдется пациенту в 6500 долларов США, поэтому в широкой клинической практике они практически не используются.

В настоящей работе предлагается эффективный биотехнологический способ получения субстанций лекарственных препаратов (кладрибина и флудары) и синтеза модифицированных аналогов нуклеозидов с использованием генно-инженерных нуклеозидфосфорилаз, что позволяет значительно упростить общую технологическую схему производства, повысить эффективность процесса. Разработанные технологии синтеза модифицированных нуклеозидов хорошо воспроизводятся, легко масштабируются и могут быть внедрены на предприятиях медико-биологического профиля.

Микробиологическое трансгликозилирование (т.е. перенос остатка рибозы с природного основания на химически модифицированное) нуклеозидфосфорилазами в составе целых клеток бактерий является эффективным методом синтеза модифицированных нуклеозидов. Этот подход к синтезу пуриновых нуклеозидов обладает рядом существенных преимуществ в сравнении с химическими способами получения указанных соединений, а именно: а) стерео- и региоспецифичностью реакций, в результате которых образуются исключительно N9-$-изомеры; б) доступностью биокатализатора, обусловленной использованием целых микробных клеток без выделения индивидуальных ферментов; в) высокими выходами целевых соединений [1-4].

Активно ведутся работы в области создания новых лекарственных препаратов, обладающих более высокой специфичностью и меньшей токсичностью: около 10 модифицированных нуклеозидов находятся на завершающих стадиях медико-биологических испытаний. Применение микробиологического трансгликозилирования возможно не только для разработки способа синтеза уже известных нуклеозидов, но и для получения принципиально новых соединений для последующего тестирования их биологической активности, что и является вторым направлением исследований диссертационной работы.

2 Обзор литературы

2.1 Модифицированные пуриновые нуклеозиды в терапии онкологических

Нуклеозиды с антиметаболической активностью составляют один из важнейших классов биологически активных веществ. Они нашли широкое применение в онкологии, вирусологии, энзимологии и в последние годы используются для генно-инженерных работ. На протяжении последних лет большое внимание уделяется созданию и изучению свойств новых модифицированных нуклеозидов, перспективных в качестве противоопухолевых и противовирусных соединений.

Цитотоксические аналоги нуклеозидов широко применяются в современной клинической практике в качестве препаратов первого выбора для терапии ряда злокачественных заболеваний человека. Нуклеозиды, обладающие противоопухолевыми свойствами, созданы на основе природных соединений пуринового и пиримидинового ряда. Они применяются в онкологии для терапии как солидных опухолей, так и для лечения злокачественных поражений системы кроветворения. Соединения данного типа нацелены на различные внутриклеточные процессы, действуют как антиметаболиты, заменяя природные нуклеозиды в процессе синтеза ДНК и РНК и как ингибиторы ряда клеточных ферментов. В настоящее время преимущественно используются пять пуриновых модифцированных нуклеозидов, одобренных FDA (кладрибин (1), монофосфат флударабина (флудара) (2), меркаптопурин (3), тиогуанин (4) и дезоксиформицин (5)): заболеваний

О II

НО— Р-О— но— он он он флудара, (2) кладрибин, (1) он

R = SH, Ri=R2=H, 6-меркаптопурин (3) дезоксиформицин (5)

R = SH, Ri=NH2, R2=H, б-тиогуанин (4)

На различных стадиях клинических испытаний находятся более десяти новых модифицированных нуклеозидов, среди которых необходимо упомянуть следующие наиболее перспективные: клофарабин (6), иммуциллин-Н (7), неларабин (8), 8-хлораденозин. Выяснение механизма действия аналогов нуклеозидов и синтез новых соединений создают основу для дальнейшего расширения спектра новых современных терапевтических препаратов для онкологии.

ОН он он он клофарабин, (6) иммуциллин H, (7) неларабин, (8)

Кладрибин (2-хлор-2'-дезоксиаденозин) (1) - препарат, обладающий противоопухолевой активностью по отношению к Т-клеткам лимфоцитов. Он применяется для лечения волосатоклеточного лейкоза, хронического лейкоза лимфоцитов и рассеянного склероза.

Кладрибин относится к новым антиметаболитам, активно применяемым в химиотерапии злокачественных опухолей. По сравнению со многими другими лекарствами, он обладает более выраженным терапевтическим эффектом (до 80% полных ремиссий после одного курса монохимиотерапии), также проявляет активность при остром миелолейкозе у взрослых и детей, макроглобулинемии Вальденстрема, Т-клеточных кожных лимфомах [5].

Довольно пристальное внимание уделяется кладрибину в исследованиях, посвященных разработке новых средств лечения рассеянного склероза - хронического прогрессирующего заболевания нервной системы. Оно возникает в молодом и среднем возрасте (15 - 40 лет). Особенностью болезни является одновременное поражение нескольких различных отделов нервной системы, что приводит к появлению у больных разнообразной неврологической симптоматики. Это довольно распространенное заболевание. В мире насчитывается около 2 млн больных рассеянным склерозом, в России - около 150 тыс [6].

Было показано, что иммунодепрессанты 2-го поколения, в том числе и кладрибин, способны селективно подавлять активность Т-лимфоцитов. У большинства пациентов не только замедлялось прогрессирование рассеянного склероза, но и уменьшалось количество активных очагов. Препараты хорошо переносятся и имеют по сравнению с другими лекарственными средствами этой же группы относительно низкую токсичность, хотя в ряде случаев наблюдаются побочные эффекты в виде угнетения функции костного мозга и тромбоцитопении, реже — токсического миокардита [7].

За последнее десятилетие был синтезирован ряд аналогов кладрибина, но по активности и селективности наиболее близкими к нему оказались 2-бром-2,-дезоксиаденозин (9) и 2-йод-Т-дезоксиаденозин (10), 8-бром-2-хлор-2'-дезоксиаденозин (11) [8]:

NH? хл> N но

0. он

Х=Вг (9), I (10)

NH-> N

С1 но

N -О.

N -N7

ОН 11

Вг

Высокой активностью обладает 6,6^^-диметил-2-8-метил-2>-дезоксиаденозин (12), в то время как 2-8-метил-6-К-метил-2,-дезоксиаденозин (13) малоактивен, а 2-8-метил-2л-дезоксиаденозин (14) почти неактивен.

HO—, П

X= NMe2 (12), NHMe (13), NH2 (14) Синтезирован также ряд аналогов нуклеозидов, с модифицированным гетероциклом [9]:

Структурные модификации кладрибина представляют интерес, как в определении их биологической активности, так и в изучении механизма действия модифицированных нуклеозидов, обладающих противоопухолевой активностью.

Разработка и введение в клиническую практику 5'-фосфата флударабина (2) (компании «Schering AG»), является перспективным и может служить базой для создания новых излечивающих программ [10, 11]. Высокая эффективность аналогов пуриновых нуклеозидов убедительно показана при лечении различных вариантов неходжкинских лимфом (НХЛ), в том числе высокоагрессивных и прогностически неблагоприятных форм [12, 13].

ОН

15)

Х=С, Y=N (16) X=N, Y=C (17)

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Фатеев, Илья Владимирович

Выводы.

3. Исследована субстратная специфичности нуклеозидфосфорилаз по отношению к ряду модифицированных гетероциклических оснований с целью получения новых модифицированных нуклеозидов. Впервые показана принципиальная возможность синтеза модифицированных нуклеозидов, имеющих объемные гетероциклические заместители в 6-положении пуринового основания с помощью пуриннуклеозидфосфорилазы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Фатеев, Илья Владимирович, Москва

1. Зинченко А.И., Барай В.Н., Брошевская Л. А., Бейгельман JI.H., Михайлов С.Н., Карпейский М.Я., Михайлопуло И.А. // 2'-, 3'- и 5'-С-метилпроизводные уридина в реакции микробиологического трансгликозилирования//Биохимия. 1988. С. 731-733.

2. Hennen W. J. and Wong С. H. // A new method for the enzymatic synthesis of nucleosides using purine nucleoside phosphorylase. // J. Org. Chem. 1989. V. 54. N 19. P. 4692-4695.

3. Krenitsky T.A., Koszalka G.W., Tuttle J.V. // Purine nucleoside synthesis, an efficient method employing nucleoside phosphorylases. // Bioschem N 20 P. 3615-3621.

4. Sircar. J.C., Gilbertsen. R.B.// Purine nucleoside phosphorylase (PNP) inhibitors: potentially selective immunosuppressive agents. // Drugs of the Future. 1988. V.13. N 7. P. 653-668.

5. Гершанович. М.П. // Новые антиметаболиты в химиотерапии злокачественных опухолей. // Материалы Второй ежегодной Российской онкологической конференции «Современные тенденции развития лекарственной терапии опухолей». 8-10 декабря 1998 г, М.

6. Гусев Е.И. Демина Т.Л. Бойко А.Н. // Рассеянный склероз. // М.: Нефть и газ, 1997. С. 463.

7. Siva A. et.al. (Eds.). // Frontiers in multiple sclerosis // London: Martin Dunitz, 1999. V. 2. P. 282.

8. Z. Kazimierczuk. J.A. Vilpo. F. Seela. // 2-Cloro-2'-deoxyadenosine: synthesys and antileukemic activity of 8-substrated derivates. // Nucleosides & nucleotides. 1995. V. 14. N 6. P. 1403-1414.

9. Z. Kazimierczuk. J.A. Vilpo. F. Seela. // Base-modified related to 2-chloro-2'-deoxyadenosine. // Helv. Chim. Acta. 1992. V. 75. P. 2289-2297.

10. Vargo F. Demeter J. // Progress in treatment of non-Hodgkin's lymphomas. // Magy Onkol. 2001. V. 45. P. 45-50.

11. Cheson B.D. // Perspectives on purine analogues. // Hematol. Cell. Ther. 1996. V. 38. N 2. P. 109-116.

12. Fidias P. Chabner B.A. Grossbard M.L. // Purine analogs for the treatment of low-Grade lymphopoliferative disorders.//Oncologist. 1996. V. l.P. 125-139.

13. Ogura M. // Recent progress in the treatment of malignant lymphoma. // Gun To Kagaku Ryoho, 2001. V. 28. P. 1213-1235.

14. Venner H. // Synthese der den naturlichen entsprechenden 2-deoxy-nucleoside des adenins. guanins und Hypoxanthins. // Chem. Ber. 1960. V. 93. P. 140-149.

15. Christensen L.F., Broom A.D., // Synthesis and biological activity of selected 2.6-Disubstituted-(2-deoxy-a- and -P-D-erythro-pentofuranosyl)purines. // J. Med. Chem. 1972. V. 15. N 7. P.324-356.

16. Ikehara M., Tada H.J. // Studies of nucleosides and nucleotides. // J. Amer. Chem. Soc. 1965. V. 87. P. 606-610.

17. Janeba Z., Francom P., Robins M.J. // Efficient Syntheses of 2-Chloro-2'-deoxyadenosine (Cladribine) from 2*-Deoxyguanosine. // J. Org. Chem. 2003. V. 68. N 3. P. 989 -992.

18. Montgomery J. and Hewson K. // Nucleosides of 2-Fluoroadenine // J. Med. Chem. 1969. V. 12. N 3-4. P. 498-504.

19. Reist E. Benitez A. Goodman L. Baker B. and Lee W. // Potential Anticancer Agents. LXXVI. Synthesis of Purine Nucleosides of p-D-Arabinofuranose // J. Org. Chem. 1962. V. 27. N 9. P. 32743279.

20. Bauman J.G. and Wirsching R.C. // Process for the Preparation of Fludarabine Phosphate from Guanosine. // US Patent № 5602246. 11.02.1997. Int. CI.6 C07H 1/00.

21. Nygaard P. // Utilization of preformed purine bases and nucleosides in metabolism of nucleotides, nucleosides and nucleobases in microorganisms. (Munch-Peterson A ed.) pp. 27-93, 95148, Academic Press, London 1983

22. Bzowska A,, Kulikowska E., Shugar D. // Purine nucleoside phosphorylases: properties,, functions and clinical aspects // Pharmacology and Therapeutics. 2000. V. 88. P. 349-425.

23. Friedkin M. // Deoxiribozide-1- phosphate: II. Theisolation of the crystalline deoxiriboze-1-phosphate//J. Biol Chem. 1950. V. 184. P. 449-459.

24. Friedkin M., Kalckar H.// Nucleoside phosphorilases.// Enzimes. 1961. V. 5. P. 237-256.

25. Williams S.R., Goddard J.M. and Martin D.W. Jr.// Human purine nucleoside phosphorylase cDNA sequence and genomie clone characterization.// Nucleic Acids Res. 1984. V. 12. P. 5779-5787.

26. Koellner G., Luic M., Shugar D., Saenger W., Bzowska A. // Crystal structure of calf spleen purine nucleoside phosphorylase in a complex with hypoxanthine at 2.15 A resolution. // J. Mol. Biol. 1997 Jan 17;265(2):202-16.

27. Kalccar H.M. // Differential spectrophotometry of purine com pounds by means of specific enzymes. Determination of hydroxypurine compounds. // J Biol Chem. 1947. V. 167. P. 429-443.33. http://arginine.chem.cornell.edu/Structures/UP.html

28. Avraham Y., Grossowicz N., Yashphe J. // Regulation of the synthesis and activity of thymidine phosphorylase in Lactobacillus casei. // Biochim. Biophys. Acta. 1990 Sep 3;1040(2):287-293.

29. Desgranges C., Razaka G., Rabaud M., Bricaud H. // Catabolism of thymidine in human blood platelets: purification and properties of thymidine phosphorylase. // Biochim. Biophys. Acta. 1981 Jul 27; 654(2):211-218.

30. Schwartz M. // Thymidine phosphorylase from Escherichia coli. Properties and kinetics. // Eur. J. Biochem. 1971 Jul 29;21(2): 191-198.

31. Krenitsky T.A., Tuttle J.V. // Correlation of substrate-stabilization patterns with proposed mechanisms for three nucleoside phosphorylases. // Biochim. Biophys. Acta. 1982 May 3;703(2):247-249.

32. Krenitsky T.A. // Pentosyl transfer machanisms of the mammalian nucleoside phosphorylase. // J. Biol. Chem. 1968 Jun 10;243(ll):2871-2875.

33. Iltzsch M.H., el Kouni M.H., Cha S. // Kinetic studies of thymidine phosphorylase from mouse liver. // Biochemistry. 1985 Nov 19;24(24):6799-807.

34. Hamamoto Т., Noguchi Т., Midorikawa Y. // Purification and characterization of purine nucleoside phosphorylase and pyrimidine nucleoside phosphorylase from Bacillus stearothermophilus TH 6-2. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1996 Jul;60(7):l 179-80.

35. Scocca J.J. // Purification and substrate specificity of pyrimidine nucleoside phosphorylase from Haemophilus influenzae. // J. Biol. Chem. 1971 Nov;246(21):6606-10.

36. Ashok K.P., Smriti Т., Virinder S.P. // Nucleoside sinthesis mediated by glycosyl transfering enzimes. //Bioorganic Chemistry. 1999. V. 27. P. 135-154.

37. Nasr M., Litterst, С. and McGowan J. // Computer-assisted structureactivity correlations of dideoxynucleoside analogs as potential anti-HW drugs. //Antivir. Res. 1990. V. 14. P. 125-148.

38. DeClercq E. // HIV inhibitors targeted at the reverse transcriptase. // AIDS Res. Human Retroviruses. 1992. V. 8. P. 119-134.

39. Schinazi R.F., Mead J.R. and Feorino P.M. // Insights into HIV chemotherapy. // AIDS Res. Human Retroviruses. 1992. V. 8. P. 963-990.

40. Бессмельцев С.С., Абдулкадыров К.М. // Место и роль флударабина в терапии больных неходжкинскими лимфомами. // РМЖ. 2002. V. 24. Р. 1119-1125.

41. Schinazi R.F., Liotta D.C., еа al. // 2'-Fluoronucleosides. // US Patent № 6348587. 25.02.1999. Int. CI.7 C07H 21/02.

42. Walker R.T., DeClercg E., and Eckstein F.// (Eds.) Nucleoside Analogues: Chemistry, Biology and Medicinal Applications. 1979. V. 26 NATO Advanced Studies Institutes Series, Plenum, New York.

43. Hutchinson D.W. // New approaches to the synthesis of antiviral nucleosides. // Trends Biotechnol. 1990. V. 8. P. 348-353.

44. Бокуть С.Б., B.H. Барай. А.И. Зинченко. // Использование бариевых солей пентозо-1-фосфорных кислот в ферментативном синтезе риботимидина и бромвинилдезоксиуридина. // Прикл. Биохим. Микробиол. 1995. Т. 31. Вып. 3. С. 308-310.

45. Дудчик Н.В., Барай В.Н., Бокуть С.Б. и др.// Докл. АН Беларуси.1992 V. 36. Р. 1030-1033.

46. Drueckhammer D.G., Hennen W.J., Pederson R.L., Barbas C.F., Gautheron C.M., Krach Т., and Wong C.-H. // Enzyme catalysis in synthetic carbohydrate chemistry. // Synthesis. 1991. P. 499525.

47. Utagawa Т. // Enzymatic preparation of nucleoside antibiotics. // J. Molec. Cat. B: Enzymatic. 1999. V. 6. P. 215-222.

48. Krenitsky H.A., Koszalka G.W., Tuttle J.V., Rideout J.L., and Elion G.B. // An enzymic synthesis of purine D-arabinonucleosides. // Carbohydr. Res. 1981. V. 97. P. 139-146.

49. Zinchenko A.I., Barai V.N., Bokut S.B., Kvasyuk E.I., and Mikhailopulo I.A. // Synthesis of 9-(P-D-arabinofuranosyl)guanine using whole cells of Escherichia coli. // Applied and Microbiology Biotechnology. 1990. V. 32. P. 658-661.

50. Komatsu H., Awano H., Fukazawa N., Ito K. // Process for selectively producing 1-phosphorylated sugar derivative anomer and process for producing nucleoside. // EP 1178051 A2, 13.02.2001. Int. CI.7: C07F 9/655.

51. Mikami Y., Matsumoto S., Yoshinaka S., Sunaga Y., Hasegawa A. // Method of preparing purine nucleoside compound. // European Patent № 0896065B1. 29.07.1998. Int. CI.7 C12P 19/40.

52. Barai V.N., Zinchenko A.I., Eroshevskaya L.A., Zhernosek E.V., De Clercq E., Mikhailopulo I.A. // Chemo-enzymatic synthesis of 3-deoxy-P-D-ribofuranosyl purines. // Helv. Chim. Acta. 2002. V. 85. P. 1893-1900.

53. Morris P.E. Jr., Elliot A.S., Walton S.P// Synthesis and biological activity of novel class of purine nucleoside phosphorylase inhibitors. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2000. V. 19. P. 379-404.

54. Utagawa Т., Morisawa H., Yoshinaga F., Yamazaki A., Mitsugi K., and Hirose Y. // Microbiological synthesis of adenine arabinoside. //Agric. Biol. Chem. 1985. V. 49. P. 1053-1058.

55. Kulikowska E., Bzowska A. and Shugar D. // Properties of two unusual, and fluorescent substrates of purine nucleoside phosphorylases: 7-methylguanosine and 7-methylinosine. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 874. P. 355-363.

56. Mikhailopulo I.A., Zinchenko A.I., Bokut S.B., Dudchik N.V., Barai V.N., Kalinichenko E.N., Rosemeyer H., and Seela F. // 1-Deaza and 3-deazapurines in the reaction of microbiological transglycosilation. //Biotechnol. Lett. 1992. V. 14. P. 885-890.

57. Shirae H., Yokozeki K., and Kubota K., // Enzymatic production of ribavirin. // Agric. Biol. Chem. 1991. V. 55. P. 605-607.

58. Averett D.R., Koszalka G.W., Fyfe J.A., Roberts G.B., Purifoy D.J.M., Krenitsky T.A., // 6-Methoxypurine arabinoside as a selective and potent inhibitor of varicella-zoster virus. // Antimicrob Agents Chemother, 1991, 35, P 851

59. Utagawa Т., Morisawa H., Yamanaka S., Yamazaki A., and Hirose Y. // Enzymatic synthesis of virazole by purine nucleoside phosphorylase of Enterobacter aerogenes. // Agric. Biol. Chem. 1986. V. 50. P. 121-126.

60. Kalinichenko E.N., Barai V.N., Bokut S.B., Romanova V.V., Zinchenko A.I., Hermann G., and Michailopulo I.A. // Microbiological synthesis of 5-ethyl- and (E)-5-(2-bromovinyl)-2'-deoxyuridine. //Biotechnol. Lett. 1989. V. 11. P. 621-626.

61. Utagawa Т., Morisawa H., Nakamutsu A., Yamazaki A., and Yamanaka S. // A new and facile synthesis of purine 2'-amino-2'-deoxyribosides by a combination of chemical and enzymatic reactions. //Nucleic Acids Symp Ser 1980. V. 119. P. 101-104.

62. Morisawa H., Utagawa Т., Yamanaka S., and Yamazaki A. // Microbial Synthesis of Purine 2'-Amino-2'-deoxyribosides // Chem. Pharm. Bull. 1981. V. 29. P. 3191-3195.

63. Komatsu H., Awano H., // First stereoselective synthesis of 2-deoxy-alpha-D-ribosyl-l-phosphate: novel application of crystallization-induced asymmetric transformation. // J. Org. Chem., 2002,67, 5419

64. Komatsu H., Ikeda I. // Synthesis of 2-deoxy-beta-D-ribose 1-phosphate, NMR comparison and its enzymatic activity for structural elucidation of synthetic alpha-isomer. // Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids, 2003,22, 1685

65. Komatsu H., Araki Т. // Chemo-enzymatic synthesis of 2\3'-dideoxy-3'-fluoro-b- -d-ribose 1-phosphate // Tetrahedron Lett., 2003,44, P 2899

66. Komatsu H., Araki T. // Efficient chemo-enzymatic syntheses of pharmaceutically useful unnatural 2'-deoxynucleosides. //Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2005, 24, P 1127

67. Araki Т., Ikeda I., Matoishi K., Ade R., Oikawa Т., Matsuba Y., Ishibashi H., Nagahara K., Fukuiri Y. // Method for producing cytosine nucleoside compounds // US Patent 6858721 (Mitsui Chemicals Inc.), Febrary 22, P 2005

68. Tsuboi, K.K., Hudson, P.B.// Enzymes of the human erythrocyte: purine nucleoside phosphorylase, specific properties. // J Biol Chem 1957. 234. P 889-897.

69. Holguin-Hueso J. and Cardinaud R. // Enzymic synthesis of 9- and 7-(2'-beta-D -deoxyribosyl) xanthine. // FEBS Lett. 1972. V. 20. P. 171-173.

70. Betbeder D., Hutchinson D.W. and Richards A.O'L. // The stereoselective enzymatic synthesis of 9-B-d-2'-deoxyribofuranosyl 1-deazapurine. //Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 4217-4222.

71. Slater M.J., Gowrie C., Freeman G.A. and Short S.A. // Enzymatic synthesis and antiviral activity of 2'-deoxy-2'-fluoro-ribavirin. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996. V. 6. P. 2787-2790.

72. Burns C.L., St. Clair M.H., Frick L.W., Spector Т., et al // Novel 6-alkoxypurine 2',3'-dideoxynucleosides as inhibitors of the human immunodeficiency virus. // J. Med. Chem. 1993. 36. P. 378-384.

73. Freeman G.A., Shaver S.R., Rideout J.L. and Short S.A. // 2-Amino-9-(3-azido-2,3-dideoxy-beta-D-erythro-pentofuranosyl)-6-substituted-9H-purines: synthesis and anti-HIV activity. // Bioorg. Med. Chem. 1995. V. 3. P. 447-458.

74. Carson D.A. and Wasson D.B. // Synthesis of. 2',3'-dideoxynucleosides by enzymatic transglycosylation. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. V. 155. P. 829-834.

75. Чудинов M.B., Константинова И.Д., Рыжова О.И., Есипов Р.С., Юркевич A.M., Швец В.И., Мирошников А.И. // Новый эффективный способ синтеза 5-замещенных производных 1,2,4-триазол-З-карбоксамида и рибавирина. //Химфарм журнал, 2005, 43, с.29-34.

76. Czuczman M.S., Fallon A., Mohr A. et al. // Rituximab in combination with CHOP or fludarabine in low-grade lymphoma. // Semin. Oncol. 2002. V. 29. N 2. P. 36—40.

77. Абдулкадыров K.M. Самускевич И.Г. Бессмельцев С.С. и др. // Диагностика и лечение больных неходжкинскими лимфомами низкой степени злокачественности. // Пособие для врачей. СПб. 2000.

78. Поддубная И.В. // Обоснование лечебной тактики при неходжкинских лимфомах. // Совр. Онкол. 2002. Вып. 1. С. 3-7.

79. Huang. P.; Sandoval. A.; Van Den Neste. Е.; Keating. М. J.; Plunkett. W. // Inhibition of RNA transcription: A biochemical mechanism of action against chronic lymphocytic leukemia cells by fludarabine. // Leukemia. 2000. V. 14. N. 8. P. 1405-1413.

80. Catapano С. V., Perrino F. W., Fernandes D., J. Primer // RNA chain termination induced by 9-p-D-arabinofuranosyl-2-fluoroadenine 5'-triphosphate. A mechanism of DNA synthesis inhibition. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. N. 10. P. 7179-85.

81. Li L., Liu X.-M., Glassman A.B., Keating M.J., Stros M., Plunkett W., Yang L.-Y. // Fludarabine triphosphate inhibits nucleotide excision repair of cisplatin-induced DNA adducts in vitro, // Cancer Research. 1997. V. 57. N. 8. P. 1487-1494.

82. Johnson S.A. and Thomas W. // Therapeutic potential of purine analogus combinations in the treatment of lymphoid malignancies. // Hematol. Oncol. 2000. V. 18. P. 141-153.

83. Волкова M.A. // Флударабин новая эра в терапии хронического лимфолейкоза. // Новое в онкологии: Сб. научных трудов. // Под ред. И.В. Поддубной. Н.А. Огнерубова. Воронеж (Воронежский Университет). 1998. Вып. 3. С. 6-11.

84. Adkins J.C., Peters D.H., Markham А. // Fludarabine. An update of is pharmacology and use in the treatment of haematological malignancies. // Drugs. 1997. V. 53. P. 1005-1037.

85. Tondini C., Balzarotti M., Rampinelli I. et al. // Fludarabine and cladribine in relapsed/refractory low-grade non-Hodgkin's lymphoma: a phase II randomized study. // Ann. Oncol. 2000. V. 11. P. 231-233.

86. Tinmouth A., Zanke В., Imrie K.R. // Fludarabine in alkylator-resistant follicular non-Hodgkin's lymphoma. // Leuk. Lymphoma. 2001. V. 41. P. 137-145.

87. Lazzarino M., Orlandi E., Montillo M. et al. // Fludarabine. cyclophosphamide, and dexamethasone (FluCyD) combination is effective in pretreated low-grade non-Hodgkin's lymphoma. //Ann. Oncol. 1999. V. 10. P. 59-64.

88. Alas S., Bonavida В., Emmanouilides С. // Potentiation of fludarabine cytotoxicity on non-Hodgkin's lymphoma by pentoxifylline and rituximab. // Anticancer Res. 2000. V. 20. N 5A. P. 29612966.

89. Keating M.J., Flinn I., Jain V. et al. // Therapeutic role of alemtuzumab (Campath-IH) in patients who have failed fludarabine: results of a large international study. // Blood. 2002. V. 99. P. 3554-3561.

90. Bocchia M., Bigazzi C., Marconcini S. et al. // Favorable impact of low-dose fludarabine plus epirubicin and cyclophosphamide regimen (FLEC) as treatment for low-grade non-Hodgkin's lymphomas. //Haematologica. 1999. V. 84. P. 716-720.

91. Wiedmann E., Boehrer S., Chow K.U. et al. // Treatment of aggressive, or progressing indolent peripheral T- and NK-cell neoplasias by combination of fludarabine. cyclofosphamide and doxorubicin// Onkologie. 2001. V. 24. P. 162-164.

92. Kazmers I.S., Mitchell B.S. and Dadonna P.E. // Inhibition of purine nucleoside phosphorylase by 8-aminoguanosine: selective toxicity for T lymphoblasts. // Science 1981. V. 214: P. 1137-1139.

93. Галегов Г. А., Львов H. Д., Петрова И. Г., Флорентьев В. Л. // Рибавирин как антивирусный химиопрепарат: химия, молекулярный механизм действия, возможности практического применения. // Вопросы медицинской химии. 1986. Т. XXXII, №1. С. 10-19.

94. Willis R.C., Robin R.K. and Seegmiller J.E. // An in vivo and in vitro evaluation of 1-P-D-ribofuranosil-1.2.4-triazole-3-carboxoamidine: An inhibitor of human lymphoblast purine nucleoside phosphorilase. //Mol Pharmacol 1980. V. 18: P. 287-295.

95. Stoeckler J.D., Cambor C., Kuhns V., Chu S.H., Parks R.E. Jr. // Inhibitors of purine nucleoside phosphorilase. C(8) and C(5') substitutions. // Biochem Pharmacol 1982. V. 31. P. 163171.

96. Montgomery J.A. // Purine nucleoside phosphorylase: a target for drug design. // Med Res Rev 1993. V. 13. P. 209-228.

97. Schramm V.L. // Enzymatic transiton-state analysis and transiton-state analogues. // Methods Enzymol 1999. V. 308. P. 301-355.

98. Evans G.B., Furneaux R.H., Gainsford G.J., Schramm V.L., Tyler P.C. // Synthesis of transition state analogue inhibitors for purine nucleoside phosphorilase and N-riboside hydrolases. // Tetrahedron 2000. V. 56. P. 3053-3062.

99. Giblett E.R., Ammann A.J.,Wara D.W., Sandman R. // Nucleoside-phosphorylase deficiency in a child with severely defective T-cell immunity and normal B-cell immunity. // Lancet. 1975 V. 19. P. 1010-1013.

100. Coben A., Doyle D., Martin. D.W. Jr. and Ammann A.J. // Abnormal purine metabolism and purineoverproduction in a patient deficient in purine nucleoside phosphorylase. // N Engl J Med. 1976. V. 295. P. 1449-1454.

101. Borel J.F., Karger.// Chemistry of the natural cyclosporin metabolites. // Progress in Allergy, Cyclosporin. 1986. V. 38. New York.

102. Weinblatt M.E., Coblyn J.S., Fraser P.A., Anderson R.J., Spragg J., Trentham D.E. and Austen K.F. // Ciclosporin A treatment of refractory rheumatoid arthritis. // Arthritis Rheum. 1987. V. 30. P. 11-17.

103. Dougados M. and Amor B. // Cyclosporin A in rheumatoid arthritis: Preliminary clinical results of an open trial. // Arthritis Rheum. 1987. V. 30. P. 83-87.

104. Assan R., Feutren G., Debray Sachs M., Quiniou Debrie M.C., Laborie C., Thomas G., Chatenoud L. and Bach J.F. // Metabolic and immunologic effects of с cyclosporine in recept ly Diagnosed type 1 diabetes mellitus. // Lancet. 1985. V. 1. P. 67-71.

105. Fox I.H., Pallella T.D. and Kelley W.N. // Hyperuricemia: A marker for cell energy crisis. // N Engl J Med. 1987. V.317. P. 111-112.

106. Schimandie C.M., Tanigoshi L., Mole L.A. and Sherman I.W. // Purine nucleoside phosphorylase of the malarial parasite, Plasmodium lophurae. // J Biol Chem. 1985. V. 260. P. 44554460.

Информация о работе

Фатеев, Илья Владимирович
кандидата химических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка химико-ферментативного способа получения модифицированных нуклеозидов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы