Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение препаратов рибонуклеозидов и пуриновых оснований гидролизом микробной РНК
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Получение препаратов рибонуклеозидов и пуриновых оснований гидролизом микробной РНК"
?гв од
,ч На правах рукописи
О з ФЕЗ 1Я37
Королев Юрий Георгиевич
ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ РИБОНУКЛЕОЗИДОВ И ПУРИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ ГИДРОЛИЗОМ МИКРОБНОЙ РНК
(специальность 03.00.23 — биотехнология)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук'
Москва 1997
Работа выполненена на кафедре промышленной биотехнологии Российского химико—технологического университета им. Д.И. Менделеева. Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент
Крылов Игорь Алексеевич Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор
Ведущая организация: Государственный научно — исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (г. Москва, Б. Коммунистическая, 27)
диссертационного совета Д 053.34.13 в Российском химико— технологическом университете им. Д.И. Менделеева по адресу: Москва, Миусская пл., д. 9.
С диссертацией можно ознакомиться п научно — информационном центре РХТУ им. Д.И.Менделеева.
МГАХТ им. М.В Ломоносова Юркевич Александр Морисович; доктор химических наук, заведующий лабораторией Института молекулярной биологии РАН Михайлов Сергей Николаевич
1С
Защита состоится
часов на заседании
Автореферат разослан "
Ученый секретарь диссертационного совета Д 053.34.13, к.б.н.
<- / I
11.11. Гусспи
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы: Низкомолекулярние компоненты нуклеиновых кислот (КИК), к которым, прежде всего, можно отнести нуклеоэиды, 5'-нуклеотиды и основания нуклеиновых кислот, используются в синтезе современных лекарственных средств нуклеотидной природы, при получении пищевкусовых добавок и препаратов для сельского хозяйства. Их производство освоено большинством промышленно развитых стран. В России в промышленных масштабах выпускаются только инозин (рибоксин) - прямым микробиологическим синтезом и АТФ - из животного сырья. Сырьем для производства КНК могут быть микробные РНК - смесь полирибонуклеотидов средних и низких молекулярных масс, выделяемых из промышленных микроорганизмов - дрожжей и бактерий, • выпуск которых в виде препаратов кормового белка широко освоен в России.
Гидролиз РНК в промышленности осуществляется с применением химических агентов или технических ферментов. При получении очинённых кристаллических препаратов КНК гидролизом полинуклеотидов могут использоваться РНК разной степени .очистки, что предполагает различные схемы переработки гидролиэатов. Эффективность производства КНК определяется себестоимостью полинуклеотидов, получение и переработку которых целесообразно проводить на крупнотоннажных предприятиях, выпускающих кормовой белок. Такие заводы используют технологии, основанные на переработке больяих объемов водных суспензий микробных клеток; и не применяют органических растворителей, поэтому для них наиболее приемлемым должен быть один из возможных вариантов гидролиза РНК в водном растворе.
Цель» настоящей работы явилось изучение и сравнение различных способов гидролиза микробной РНК до КНК (иуклеозидов и пуриновых оснований нуклеиновых кислот) и разработка основ технологии переработки образующихся гидролизатов в очищенные препараты.
В задачи работы входило: 1. Изучение основных закономерностей: расщепления РНК до иуклеозидов под действием химических агентов РЬ(ОН)3, РЬО, Са(ОН)3, CH3C00NH4 и комплекса ферментов, продуцируемых микроорганизмом Streptomyces (Act.) coelicolor; химической трансформации РНК - в аденин и гуанин и некоторых иуклеозидов: аденозцна - в инозин, гуанозина - в гуанин и D-рибозу.
2. Разработка стадий разделения и очистки КНК с получением препаратов, содержащих не менее 97-98Х основного вещества;
3. Подготовка первичной НТД на производство иуклеозидов (лабораторный регламент; исходные цанные на проектирование опытно-, промышленной установки мощностью 10 т перерабатываемой РНК в год).
Научная новизна. Изучены основные закономерности гидролитического расщепления микробной РНК в КНК под действием химических агентов и ферментного комплекса Str.сое]icolur. Проведен сравнительный анализ промышленных способов гидролиза РНК до КИК и получения из гидролиэатов очищенных препаратов. Покачано, что наиболее перспективным источником сырья является микробная PIIK с содержанием белковых примесей не более 5%. Разрушение РНК
- J -
целесообразно проводить в водных растворах, что существенно упрощает процесс ионообменного разделения KHK.
Практическая значииость: Разработаны основы технологии препаратов KHK, применяемых для синтеза современных лекарственных средств. Апробация работы: отдельные материалы били представлены на конференциях :
1."Химия и технология лекарственных веществ" (С-Пб.28-30 июня 1994 г.);
2. ¿-ая Международная научно-техническая конференция молодых уче-ных( М., РХТУ им. Д.И.Менделеева (20-23 ноября 1996 г.). Публикации: по материалам работы опубликованы 2 статьи и подана авторская заявка N 93054225 на патент Р* "Способ получения нуклео-эидов".
Объем я структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, изложения экспериментальных результатов и их обсуждения и выводов. Работа изложена на /^ Г" стр. машинописного текста, проиллюстрирована таблицами и рисунками. Библиография
включает 200 наименований работ, из них 124 на иностранных языках.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ,
Материалы а методы В работе использовали препараты рибонуклеиновой кислоты: .РНК из дрожжей производства НП0"Биолар", ТУ-6-09-10-1048-75; РНК из паприна и гаприиа с опытных установок Кирииского БХЗ и Светлоярского завода БВК (РНК-"Оп"). Химреактнвы (соли, минеральные кислоты, щелочи, иониты) отечественного производства квалификации "ч" и "чда" и биохимреактлвн (рибонуклеоэиды, гуанин, аденин, D-рибоэу) фирм Merck и Sigma, •ериентиий хомплекс микроорганизма Str. coelicolor шт.А-165-25, полученный в ОПП Вышневолоцкого завода ФП и любезно предоставленный АО "Биотехнология".
Содержание нуклеозидов в растворах определяли спектрофотомет-рически после разделения методом двумерной тонкослойной хроматографии на пластинах "Silufol UV-254" с использованием элюентоп: 1) изопропанол-аммиак-вода 70:10:20 %об'.; 2) я-бутанол - ацетон -муравьиная кислота - вода 4.5:45:2:8 Лоб'.
Общее содержание нуклеиновых компонентов (в РНК-препарате, исходных растворах и гидролизатах) определяли по методу А.С.Спирина; белковых веществ - по методу Лоури. Концентрацию ионов свинца определяли комплексонометрическим титрованием (ЭДТА, Na}C4H406, буферный раствор pH 10, индикатор - эриохром черный Т). Активности нуклеаз и фосфатаз в ферментном комплексе Streptomyces coelicolor оценивали по методикам, разработанным АО "Биотехнология".
В очищенных препаратах нуклеозидов и пуриновых оснований определяли содержание основного вещества - спектрофотометрически и хроматографически (ТСХ и/или ЖХВД); подлинность и чистоту устанавливали по характеристикам УФ-спектра и хроматографически.
Спектрофотометрические измерения выполняли па спектрофотометре марки "SPEC0RD М-40".
Эксперименты по гидролизу РНК проводили в стеклянной (до 100°С) или в реакторе из нерхавеюцей стали (>100°С), снабженном пробоотборником, мешалкой и термостатируеиой рубашкой для обогрева. При изучении ионного обмена использовали стандартные лабораторные колонки объемом от 20 до 150 мл (Reanal, D/H=1:10—15).
Экспериментальные данные обрабатывали на IBH PC с применением стандартного ПО (Excel, Statgraphics, MathCAD и др.).
РЕЗУЛЬТАТЫ И И1 0БСУ1ДЕНИЕ
1. ПОЛУЧЕНИЕ НУКЛЕОЗИДОВ ГИДРОЛИЗОМ МИКРОБНОЙ РНК.
Анализ литературных данных показывает, что нуклеозиды можно получать гидролизом РНК с применением химических агентов (соединений тяжелых металлов; ацетата н формиата аммония или формамида; пиридина и др.) и микробных ферментов с нуклеазно-фосфатазной активностью.
Из числа возможных хицических агентов и ферментов мы выбрали те, которые, по нашему мвению, могут представлять практический интерес для промышленного гидролиза РНК. Это соединения свинца, гвдроксид кальция в ацетат аммония. Из ферментных препаратов мы исследовали возможности комплекса, продуцируемого микроорганизмом Str. coelicolor.
1.1. Основные закономерности образования нуклеози^ов при
гидролизе РНК щдроксидом свинца
При проведении экспериментов по гидролизу РНК гидроксидом свинца исследовали влияние следующих параметров процесса: температуры в интервале 95-140°С, мольного соотношения реагентов п=1.4-2.1 моль РЬ/моль НК и начальной концентрации РНК 37-100 г/л.
Из-за трудностей определения концентрации гуанозина методом ТСХ, обусловленных малой растворимостью Guo в применяемых элюен-тах, за ходом гидролиза следили по концентрациям 3-х других нукле-озидов. Определение Guo в гидролизатах проводили весовым методом.
Типичный вид квиетических кривых образования нуклеоэидов показан на рис.1. Вид зависимостей степени гидролиза х, от времени позволяет судить о соотношении скоростей образования каждого нукле-озида: Ado образуются с несколько большей скоростью, чем Urd и Cyd.
П() результатам исследования влияния параметров на процесс гидролиза РНК удалось найти оптимальные условия (температура 115°С, п=1.7, начальная концентрация РНК 40-75 г/л, время, гидролиза 1.53 ч), обеспечивающие максимальные выходы нуклеозндов (в t от содержания в РНК): Ado - 90-95, Guo и Urd - 85-90, Cyd - 82-85Z.
Следует отметить, что использование РЬ(ОН)3 в качестве гидро-лизуюшего агента практически не приводит к образованию иных продуктов гидролиза, кроме 4 нуклеозидов, УФ-поглощение последних составляет > 951 УФ-cneKtpa гидролизата.
Независимо от условий гидролиза ЮОХ-ного выхода нуклеозидов Не наблюдается, что можно объяснить наличием части KHK п объеме осадка образующейся нерастворимой соли свинца. Данный вывод подтверждается при обработке осадка минеральной кислотой.
Рис.1. Кинетика образования нухлеозцарв Рис. 2. Изменение рН и коцдешрадии
при гидролизе РНК гидроксидрм свинца нуклеиновых компонентов в растворе в
(С„к = 37 г/л, п = 1.6 -1.7 (рН'9), 115°С ходе гидролиза РНК гидроксидрм свинца • — Ado, А -итй, 0- Суа (Ст=37г/л. 11 = 1.6-1.7, 100°С).
С образованием нуклеозидов в ходе гидролиза РНК наблюдается изменение рП и концентрация иукленпових компонентов (НК) в жидкой фазе (рис.2). Согласно литературным данным и по результатам собственных исследований ход кривых на рис.2 можно объяснить нали--чием следующих превращений:
- в начале происходит быстрое образование нерастворимой свинцовой соли РНК: ок. 2/3 РНК связывается с поверхностью РЬ(0Н)3, а оставшаяся 1/3 РНК создает в растворе слабокислое значение рН;
в ходе расщепления фосфоди- и фосфомоноэфирных связей РНК образуются последовательно олиго-, мононуклеотиды и нуклеозиды;
- образующийся при дефосфорилировании слой основного ортофосфата свинца оказывается достаточно проницаемым для нуклеозидов и не оказывает влияния на взаимодействие растворенной РНК с РЬ(ОН)2, о чем свидетельствует увеличение концентрации КНК в растворе;
- в процессе гидролиза некоторый избыток РЬ(ОН)2 (при п>1.5) обеспечивает увеличение рН среды до некоего слабощелочного и стабильного в конце процесса значения - рН' . которое зависит от мольного соотношения реагентов п (рис. 3); это позволяет объяснить особенности гидролиза, наблюдаемые для различных п, и связать их с изменением показателя рН1 , поскольку от рН зависит скорость и выход образующихся нуклеозидов, процессы их деструкции и взаимодействия с твердой фазой.
Рис.3 показывает зависимость выхода нуклеозидов от соотношения реагентов п и значения рН'. Для всех нуклеозидов при п=1.6-1.7 (рН'8.7-9) наблюдается максимум их выхода. Для более высоких значений п (рН'>9) становится заметным снижение выхода каждого из нуклеозидов, которое связано с деструкцией аденозина в аденин, дезаминированпем цитидина и с образованием малорастворимой соли уридина. Чгс1 и Сио уже в слабощелочной среде становятся отрицательно-заряженными (рК -9.4) и в результате взаимодействия с РЬ(ОН)2 переходят в твер-
(50 46
2
* 42
38 34 30
1.4
—I—
1 S —I—
1.7 20 —I-1—
Ado .ed-05%
Urd^M-90%
5.5
6.5
7.5 PH'
95
дую фазу, что и объясняет резкое сннхение CUrd в растворе после гидролиза при рН'>9.0 (рис.3). О факте такого взаимодействия свидетельствуют и эксперименты по вытеснению Urd с осадка минеральной кислотой: коррекция до pH 5 приводит к -201-ному увеличению концентрации Urd в жидкой фазе (100°С и п=1.7). Эффект повыаения концентрации Urd и Guo в растворе наблюдается и при повыяении температуры. Так прогрев реакционной массы в конце гидролиза со 115 до
Рис.3. Влияние мольного соотношения реагемюв '35°С приводит к увеличению'С„г(1 в п и/или конечной рН среды на концентрации нуклеозидов в жидкой фазе (в % указаны max выходы нуклеозидов). Условия 115°С, Сш=75 г/л.
1,2 раза. "Вытеснение" нуклеозидов с осадка при коррекции рН'или прогреве реакционной массы можно использовать в технологическом процессе переработки гидролнзатов.
Установленное оптимальное соотношение реагентов п = 1.6-1.7 (.несколько виве стехиометрического) обеспечивает максимум выходов н максимальную скорость образования нуклеозидов, что согласуется с литературными данными о существовании некоей оптимальной рН среды для гидролиза фосфоэфнрных связей (например, при гидролизе модельных глицерофосфатов под действием соединений свинца).
Изменение, начальной концентрации ГНК в диапазоне 10-100 г/л при сохранении постоянными остальных параметров процесса не приводит к изменению скорости образования нуклеозидов и глубины гидролиза. Однако из-за увеличения объема твердой фазы при переходе от концентрации 45-50 г/л к технологически более приемлемой 90-100 г/л содержание каждого нуклеозида в гидролизате уменьшается в среднем
на 5% - за счет увеличения доли нуклеозидов в объеме осадка.
Исследование температурной зависимости скорости реакции гидролиза РНК в интервале 100-К0оС по начальным участкам кинетических кривых образования нуклеозидов показало, что в координатах Аррениуса наблюдаются линейные зависимости (рис.А), имеющие один и тот же тангенс угла наклона прямых к оси абсцисс. Расчетное значение энергии активации составило;
Е = 110+6 кДж/моль.
-6
Urd/Cyd
2.6 2.65 2 7 2.75
Ч/г-ю'к"1
Рис.4. Зависимость нач.скорости образования нуклеозидов от температуры при гидролизе РНК РЬ(ОН),
- е -
При изучения гидролиза препаратов РНК, полученных по разный технологиям и из разных источников, установлено, что скорости образования нуклеозидов несколько меняются. Это мохно объяснить различием в молекулярных массах гидролизуемых РНК. В случае более Высокомолекулярной РНК-"Оп", состоящей из двух фракций полирибонуклеотидов: 24 kD - 50Х и б kD - 50Х, время гидролиза при 115°С составляет более 3 ч, а для низкомолекулярной РНК-"Биолар", содержащей фактически одну фракцию б kD -2ч.
■ Кроме скорости гидролиза для различных типов РНК изменяется и количество образующихся нуклеозидов, т.к. относительное содержание различных нуклеозидов несколько меняется для разных РНК (выходы нуклеозидов неизменны). Так для РНК- "Оп" по сравнению с РНК- "Бнолар" характерно в 1.1 раза больнее содержание Urd.H несколько меньвее (в 1.12 раза) содержание Cyd при практически одинаковом содержании Ado и Guo.
Для технологии весьма важно знать влияние примесного белка в РНК на скорость гидролиза полирибонуклеотидов и выход нуклеозидов. В результате исследования гидролиза различных препаратов технической РНК удалось установить, что примесь белка в количестве 2-10Х не влияет на скорость образования и выход нуклеозидов; однако следует отметить, что с увеличением доли белка в полирибонуклеотидных препаратах нарастает окраска получаемых гидролизатов.
1.2. ГВДРОШ РНК ДО НУКЯЕОЗВДОЙ СОД ДЕЙСТВИИ ОКСВДОВ МЕТАЛЛОВ
Гидролизующий агент РЬ(0Н)3 необходимо готовить непосредственно перед гидролизом РНК, тогда как РЬО или оксиды др. металлов, выпускаемые промышленностью, мохно было бы исп9льз0вать непосредственно. Это упрощает технологический процесс и уменьиа^т количество стоков.
В работе были исследованы оксиды свинца различного строения и валентности {РЬО - тетрагональной (красный) и орторомбической (желтый) модификаций; РЬ304 - свинцовый сурик, смеианные оксиды -La303-4Pb0 и СаО'РЬО) и оксиды металлов, обычно применяемые для дефосфорилирования: ZnO, TiOj, Zr03, BaO, Sr-Ca'CuO.
В табл.1 представлены результаты экспериментов по гидролизу РНК в присутствии различных дефосфорилирующих агентов. Анализ экспериментальных данных показывает, что эффективность процесса гидролиза РНК до нуклеозидов связана со структурно-поверхностными характеристиками реагента. Из табл.1 из всех рассмотренных соединений специфичность» с точки зрения расцепления РНК до нуклеозидов обладают только Соединения, содержащие РЬ(II): РЬО(ж.), РЬО(кр-), La303-4Pb0. Модификация РЬО (ж.) менее активна, тогда как выходы при применении РЬО(кр.) и La303-4Pb0 близки к наблюдаемым в случае РЬ(0Н)3. Для La30,-4Pb0 достаточно высокий выход нуклеозидов мы связываем не с дефос ' "пирующим действием La303, отдельное применение которого не приводит к образованию нуклеозидов, а с развитой поверхностью, полученного эоль-гельным методом La203'4pb0.
При использовании другого сметанного оксида СаОРЬО, представляющего смесь оксидов СаО и четырехвалентного РЬ02 (Са2РЬ04), образования нуклеозидов не наблюдается. Pb(IV) не проявляет способности
к расщеплению РНК до нуклеозидов, что подтверждает и отрицательный результат гидролиза со свинцовым суриком РЬ304, представляющим собой смешанный оксид РЬ(1У) и РЬ(11), в котором ионы последнего пространственно оказываются недоступными для взаимодействия с РНК из-за структуры кристаллической решетки.
В случае применения для гидролиза РНК оксидов: гпО, ИО,, ВаО, Бг-Са-СиО, ггОа - образования нуклеозидов практически не наблюдается. Таблица. 1. Гидролиз РНК до нуклеозидов под действием различных дефосфорилирующих агентов
N п/п Реагент v ** экв см'/моль Урь3<ро4), v "экв. Удельн. поверхность, м2/г Выход нуклеозидов, 2
1. РЬ(ОН)2 21.5 0.9 50 85
2. РЬО (кр.) 11.7 1.8 1.7 72 .
3. РЬО (ж.) 11.6 1 .85 0.2 60 ц
4. РЬО (кр.) (из золь-геля) 11.7 1.8 7 84
5. РЬ304 18.8 1.14 0.2 -
6. Ьа203-4РЬ0 (из золь-геля) 9.7 2.2 7.0 83
7. 1.а203-4РЬ0 (из оксалатов) 9.7 2.2 1.0 15
8. 9. 10. 11. 12-14 1,аго, СаО'РЬО гпо Бг-Са-СиО ВаО; 2г02; ТЮ3 8. 27 10.8 7.2 2.6 0.2 Нуклеозидов в гидролнэа-тах РНК не обнаружено
*) Условия проведения процесса: 100°С, п = 2, Си1=37 г/л, Т = 5 ч **) Эквивалентный объем - отношение мол. массы к произведению плотности реагента, валентности металла и количеству атомов металла в реагенте: Уэкв-Мг/г'(I*)'к
Следует отметить, что наблюдаемые для оксидов свинца особенности процесса (вид кинетических кривых, соотношение выходов нуклеозидов, взаимодействие иг<1 и вио с тв. фазой и др.) аналогичны описанным выше для гндроксида свинца. Несколько различающиеся для разных соединений свинца скорости процесса и выходи нуклеозидов зависят, как и следовало ожидать для гетерогенной реакции, от величины поверхности твердой фазы. Действительно, большие выходы нуклеозидов при применения РЬО(кр,) - 72% по сравнению с 60% п случае РЬ0(ж.) - можно связать с заметно большей поверхностью РЬО (кр.) (табл.1). И для химически подобных реагентов, например Ьа103-4РЬ0 и РЬ0(кр.), гидролиз препаратами, полученными золь-гелышм методом и имеющими существенно большую удельную поверхность (7 м'/г), приводит к более высоким выходам нуклеозидоп - 83-84% против 15 и 72% - для препаратов с менее развитой поверхностью (1 и 1.7 м3/г).
Таким образом, из всех исследованных оксидов можно выделить только соединения РЬ(И), которые с иаибольвими выходами гидролизуют РНК до нуклеозидов, причем на скорость процесса существенно влияет величина поверхности твердофазного реагента.
1.3. Закономерности образования иукдеозядов при гидролизе РНК под действием гидрокснда кальция Са(ОН)2.
Из литературы известно, что в присутствии Са(ОН)з при 80°С и мольном соотновение реагентов п=2-2.5 за 1 ч происходит разрыв фосфодиэфирных связей в РНК и образование мононуклеотидов с 90%-иым выходом. Можно предположить, что при более высокой температуре будет происходить и разрыв фосфомоноэфиркых- связей с образованием нуклеозидов. Очевидно, что применение Са(0Н)2 вместо токсичного РЬ(ОН)а гораздо более предпочтительно с точки зрения экологической безопасности производства, а образующемуся при гидролизе фосфату кальция можно найти применение, что решает проблему захоронения твердых отходов.
При исследовании гидролиза РНК свехеосахденным гидроксидом кальция изучали влияние мольного соотновения реагентов п в пределах от 1 до 1.9 моль Са(ОН)]/моль НК, температуру от 100 до 130°С и концентрацию РНК от 30 до 80 г/л.
В экспериментах была подтверждена возможность получения нуклеозидов при гидролизе РНК под действием~гидроксида кальция. На рис.5 приведены кривые образования нуклеозидов в ходе гидролиза. Их вид подтверждает фактически те же закономерности, установленные выве для РЬ(ОН)]. Однако применение гидроксида кальция - более щелочного агента по сравнению с РЬ{ОН)а - вызывает существенную деструкцию нуклеозидов в ходе гидролиза. Это хорово иллюстрирует представленная на рис.б завасямость выхода нуклеозидов и рН в конце гидролиза (рН') от мольного соотпояейня реагентов п.
Ado
рН|0.в 9l3 рН-9.9 10.2 рН'11
0.9 1.1 1.3 1.5 1.7 1.Э
п
Рис.5. Кинетика образования Рис.6. Зависимость выхода нуклеозидов
нуклеозидов при гидролизе РНК и Ade от мольного соотношения
гндроксидом кальция. • реагентов п.
Условия: 120°С, 0^=37 г/л, п=1.2. Условия: 120°С, С„.=37 г/л, t = 5 ч
Наблюдаемые при п< 1.1 низкие выходы нуклеозидов (-30% > обусловлены малой скоростью гидролиза при рН'< 9.
Для аденозина максимум выхода (ок.80?) достигается при проведении процесса при п=1.2-1.4; при п>1.4 наблюдается резкое падение выхода Ado (40% при п=1.9). Это, видимо, связано с увеличением скорости разрыва N-гликоэидной связи в более щелочной среде, сопровождающемся образованием аденина (Ade). Его содержание растет с 8 до 30% при изменении рН'среды с pH 9.2 до 11.
Выход уридипа достигает максимальных значений (-70%) при п=1.5-1.6, а для цнтидина он монотонно падает с 50% (рН'9.2) до 7% (рН'11), что обусловлено его глубокой деструкцией.
Как оптимальное следует принять мольное соотноиение реагентов п=1.2-1.4, которому соответствует рН'9-9.5. В отличие от Pb(0H)j, где показатель n=1.6-1.7 (pH*-9.0) обеспечивает полное дефосфорилирова-ние, в случае Са(0Н)а этого дрстичь не удается, т.к. для образования фосфата кальция требуется п больше стехиометрического - п>1.5. При этом условии активность ОН-ионов в среде будет на порядок выше, что ведет к заметной деструкции Ado и Cyd. Поэтому невозможно, ожидать при использовании Са(0Н), выхода нуклеозидов больше, чем в случае РЬ(0Н)3.
Анализ экспериментальных кинетических кривых образования нуклеозидов, полученных при различных температурах, и соотношениях реагентов позволил найти оптимальные условия процесса гидролиза (130°С, п=1.25, время гидролиза 5 ч), обеспечивающие максимальный выход нуклеозидов: Guo - 81, Ado - 79, Urd - 74, Cyd - 53% при наличии примеси аденина до 9%. Помимо Аое, гндролизат содержит 1015% других обусловленных деструкцией УФ-погподающих соединений и заметное количество окрашенных продуктов (пигментов), что делает его переработку более сложной, чем в случае применения
соединений свинца.
Исследование температурной зависимости показало, что энергия активации, расчитанная по уравнению Аррениуса, составляет для разных нуклеозидов практически одинаковую величину: Е„т = 92+3 кДж/моль.
1.4.. Гидролиз РНК до пуклеозядов под действием ацетата аммоншя
Помимо оксидов и гидроксндов металлов, гидролиз РНК до нуклеозидов можно проводить в присутствии других химических агентов, среди которых практическое значение может иметь формиат или ацетат аммония. В основу данного исследования был положен способ гидролиза РНК, предложенный в патенте Японии! [СН3С00НН4] = 6 М, pH 6-8 , Срнк= 100-200 г/л, температура 125°С, время 'гидролиза 12-14 ч. Анализ состава гидролиэата показал наличие в нем всех 4-х нуклеозидов, выход которых срставил: Ado - 96, Guo - 90, Urd - 125 и Cyd - 45%. Аномально высокое значение выхода Urd связано с дезаииниропанием Cyd. Гндролизат отличает наличие взнеяенных (смолистые вещества) и большое количество пигментов.
1.5. Гидролиз РНК до нуклеозидов под действием ферментного препарата, видедепяого из культуральпой жидкости Str.(Act.)соеIiсоlor Альтернативным химическому гидролизу РНК до нуклеозидов является энзиматический гидролиз. Среди возможных ферментных препаратов, обладающих нуклеазно-фосфатаэной активностью, выделяемых из различных источников сырья, нами был выбран комплекс ферментов (5'-экзонуклеазы и щелочной фосфатазы) (ФП), продуцируемый микроорганизмом Str.(Act) coelicolor «т.А-165-25, опытно-промышленное производство которого было освоено > АО"Биотехнология" (Шаховой Т.В. с сотр.). В сухом виде готовый технический препарат имеет активность нуклеаз и фосфатаз 45 и 4.2 ед/мг соответственно. Согласно литературным данным оптимальными условиями гидролиза РНК вышеуказанным комплексом ферментов являются: t = 37-40°С, pH 8.79.1, СРН1=20 г/л, в среде, содержащей 0.01 И Mg**. Этими условиями мы воспользовались при изучении процесса гидролиза различных препаратов РНК. На предварительном этапе исследования была установлена зависимость начальной скорости образования кукле'оэидов от массового соотношения технического фермента к субстрату при постоянной исходной концентрации РНК. Типичный вид выдеуказанной зависимости представлен на рис.7. Он позволяет выбрать оптимальное соотношение ФП к субстрату равное 0.5, которое в дальней»ем было использовано нами для нахождения максимального выхода нуклеозидов. Ado и Urd показан вид кинетических кривых накопления нуклеозидов. Из приведенных зависимостей видно, что выходы Ado и Urd стабилизируются через 2-3 ч, достигая соответственно 52 и 34%. Из литературы известно, что торможение процесса может быть связано с ингибированием фосфатаз неорганическим фосфатом, образующимся в ходе гидролиза. Поэтому в результате внесения при t= 4 ч (рис.8а) дополнительного количества ферментного препарата, взятого в том же соотношении (ФП:РНК=0.5:1), выходы Ado и Urd увеличились до 80 и 55% соответственно. Этот прием мы использовали и в дальнейшем для интенсификации процесса гидролиза. На рис.86 приведены результаты оптимизации времени внесения ферментного препарата в гидролизат. Из полученных зависимостей видно, что 3-х кратное добавления свежего ферментного препарата взятого в одном и том же соотношении (ФП:РНК=0.5:1) в моменты времени 0, 1.5, 3 ч, обеспечивает технологически приемлемые выходы Ado и Urd 90 и 70% соответственно, за 6 ч гидролиза. При этом выходы -Guo и Cyd составили 78 и 70% соответственно.
Рис. 7. Зависимость начальной скорости образования нуклеозидов от соотношения масс ферментного препарата к РНК. . 37°С, рН 9, СНк=20 г/л, [Мдсу=0.01 М
На рис. 8 а на примере
7 t ч
6 t. ч
Рис. 8. Кривые образования нуклеоэидов при гидролизе РЙК техническим ФП Условия: 37°С, рН 9, Си1=20 г/л, 1 - время внесения (по ФП:РНК=0.5:1) рис.А (1) [Mg34=0.01 H; (2) без Mg2*
рис.Б (1) Дробное добавление ФП; (2) Доб-е ФП в начале (*п:рнк»1.5:1)
При этом достигаемый эффект глубокого гидролиза РНК предполагает большую норму расхода ФП (1.5 кг на 1 кг РНК), что свидетельствует о низкой концентрации в нем нуклеаз и фосфатаз. Образующиеся при этом гидролизаты содержат большое количество примесей, трудноотде-ляемых взвешенных частиц, солей и белковых веществ, что может серьезно осложнить проведение стадий переработки гидролйзатов. Для повышения их качества и, следовательно, выходов нуклеоэидов, исходный ФП был очищен от нежелательных примесей с применением стадий отделения взвешенных центрифугированием, ультрафильтрации (поло-волоконные мембраны ВПУ-15ПА) с последующим осаждением ферментов из водно-спиртового раствора и сушки. Общие потери активности составили до 60%. При этом очищенный ФП имел активность в 10 раз большую, чем исходный, что дало возможность в 10 раз сократить норму расхода ФП и существенным образом повысить качество получаемых гидролйзатов.
Установленные закономерности ферментативного гидролиза сохраняются фактически неизменными для РНК различных молекулярных масс (РНК-"0п" и РНК-"0лайне"): наблюдается совпадение кинетических кривых образования нуклеоэидов, что указывает на лимитирование реакции гидролиза скоростью расщепления ФМС под действием фосфатаз.
В табл. 2 приведены сравнительные данные разных способов получения нуклеоэидов из РНК и характеристика получаемых гидролйзатов, перерабатываемых в дальнейшем с получением очищенных кристаллических препаратов.
2. Гидролиз РНК под действием минеральных
кислот до пуриновых оснований Нуклеозиды, входящие в состав РНК, не являются единственной субстанцией для производства лекарственных средств. Наряду с ними не меньшее значение имеют основания нуклеиновых кислот, особенно адеикн и гуанин (Ade и Gua) , используемые в синтезе этадена, ацикловира и др. современных лекарственных препаратов.
Таблица 2. Параметры гидролиза РНК до нуклеозидов, характеристики гидролизатов и выходы готовых препаратов
Параметры Гидролиз с Гидролиз с Гидролиз в присутствии Гидролиз с применением
применением РЬ(ОН)2 применением Са(ОН)з ■ ацетата аммония ферментного комплекса
или РЬО Str. coelicolor A-165-2S
1. Параметры ..
Снх. г/л 80-100 50-80 100 (до 200) 20
t, °С 115 130 125 34-40
pH • рН 8—9 pH 9.2 рН 6—8 pH 9 (NH4OH)
Время гидролиза, ч 2-3 5 12-14 5-6
Соотношение [Mg5+] =0.01 M
реагентов, п 1.6-1.7 1J 23 1.5 t ФП/г HK
моль РЬ/иаль НК моль Ca/моль НК ноль AcAxnm/моль НК
2. Выход-НЗ в
. гидролизате, %
Ado 95 80 96 90
Urd 85-90 75 125 •70
Cyd 85 53 45 70
Guo 85 81 90 78
Средний 88% 72% 69* 78%
3. Характеристика Практически чистый Содержит заметное кол- Содержит значительное Содержит фосфат—ионы,
шдролизата раствор нуклеозидов. во продуктов деструкции количество неорг. ве- белковые вещества, ионы
Фосфат ионы отделяются (адешш. пигменты, др. ществ (>6М), пигменты аммония и магния
После отделения с осадком нерастворимых УФ-поглощающие при- и взвесь
твердой фазы солей свинца меси).
4. Выход препа-
ратов НЗ, %
Ado 76 64 Гидрализаты не 65
Urd 72 60 перерабатывалась 53
Cyd 71 45 54
Guo 75 70 67
Из литературы известно, что отщеплзние пуриновых оснований от РНК легко протекает в кислой среде. При этом, кроме разрыва N-гликоэидной связи в РНК, происходит ее деполимеризация. Как показали предварительные опыты на качество получаемых гидролизатов оказывают влияние как продукты деструкции рибозы, так и наличие в РНК белковых примесей, участвующих'в образовании высоких концентраций окрашенных соединений. Наличие последних сильно отражается на выходе и хачестве выделяемых препаратов Ade и Gua. Это потребовало количественного изучения процесса апуринизации РНК с целью нахождения оптимальных условий проведения процесса.
В качестве основных параметров исследуемого процесса образования Ade и, Gua из РНК были выбраны температура, вид и концентрация гндролнзуйщего агента и исходное содержание полирибонуклеотидов в реакционной среде, которые изменяли соответственно в интервалах: 60-90°С, 0.5-1.5 М (HCl, H3S04) и 25-200 г/л.
На рис.9 приведены типичные кинетические кривые накопления Ade и Gua, представленные в виде доли отщепивяегося от РНК пурино-вого основания (х), при гидролизе разных препаратов РНК и при различных начальных концентрациях полирибонуклеотидов. Совпадение кривых накопления Äde (или Gua), отвечающих разным СРШ1, и наличие линейной зависимости в координатах 1п{1/(1-х)},t свидетельствуют о 1-ом порядке реакции по концентрации гидролизуемой РНК) что дает возможность найти величину эффективной константы скорости процесса для ка*ДОй кинетической кривой.
При изучении влияния различных концентраций минеральной кислоты на скорость образования Ade и Gua в сериях опытов, выполненных при постоянной температуре, была установлена в обратных координатах линейная зависимость k^ от кислотности среды h0, создаваемой в растворе гндролизующим агентом (рис.10). Это согласуется с теорией специфического кислотно-основного катализа, что позволяет представить процесс образования пуринов из РНК в виде схемы превращений: К л к А + Н.,0* ^—> {АН*} -> В + Н* + др.пр-ты.
где: А, АН*, В - соответственно исходная РНК, ее протонированный ннтермедиат, свободное пуриновое основание.
Данная схема связывает значение k^ с константой протониро-вания гетероциклического основания Кь4, истинной константой скорости разрыва N-гликоэиднон связи в протонированном соединеяни к2 и кислотностью среды h„ уравнением:
k^, = - (1а) или k^ = к2' Кь■ h„ (16)
+ 1 (при Vho<<11
Тогда, как видно из рис.10, обработка экспериментальных данных в координатах 1/h„ - 1/k,^, для образующегося Ade позволяет
установить численные значения констант КЬА и к2 (при 80°С):
к2 = ( 2 . 9 + 0. 2 ) • 10"3 с"1 и Кь = 0.115+0.010-л'/моль, а
для Gua только их произведение: ("cu<v=i^--15) ■ Ю"4 л'моль/с (80°С)
t
0.8 0.6 0.4 02
Gua +'
/Уг Ade
30
60 t мин
90
0.5
1
1Д>
1.5
Рис 9. Кинетические кривые образования пурн-новых основашШ при кислотном гидролизе РНК. Условна: 80°С, 1H,S04] = 1 М. Для Ade: СН11 = 25(Л),
Рис. 10. Зависимость эффективной константы скорости образования Ade от кис — лотности среды (в обратных координатах)
75(-). 220 (J г/л и для препарата нуклеопротешюв, Условия; 80°С, = 25 г/л,
содержащ. 70%НК (о). Для Gua: Снк=-25 г/л (+)
М* HCl (о) и HjS04 (.)
Исследование влияния температуры на величину к.
опытов, выполненных гидролизующего агента линейные зависимости,
в сериях
при постоянных концентрациях РНК и в среде, в координатах Аррениуса дало что позволило найти значения энергии
активации, которые для образующихся Ade и Gua составляют (102+2) и (105+3) кДк/моль, соответственно.
Вышеустановленные закономерности оказываются справедливыми для начальных концентраций гидролизуюцих агентов до 0.5 М и содержании РНК в среде не выше 75 г/л. Для случая высокого содержания РНК в растворе на рис.11, на примере образования Ade пока-
I s ■ 2
Г
3.3 3.1 2.9 2.7 2.5
зана зависимость к^ от начальной концентрации полинуклеотидов. Это не противоречит теории кислотно-основного катализа, поскольку при сопоставимых концентрациях РНК и ионов гидро-ксония, истинная кислотность среды оказывается меньше Ь0 на величину суммы концентраций протонированных форм всех оснований ]. Используя известные из литературы значения констант протонирования оснований можно расчитать истинную кислотность среды: 1>=1>0-£[ХН*] (2).
Установленные количественные закономерности процесса апурини-зации РНК били использованы нами для нахождения оптимальных условий образования Лde и Сиа. Для >98Х-ной апуринизаиии необходимо вести гидролиз при 90°С, [Н^04]= 1 М и СР111£=200-250 г/л в течении 1 ч.
О 50 100 150 200 250 Снк. г/л
Рис.11. Зависимость эфф. константы скорости образования Ade от начальной концентрации гидролизу!.'« Ри'К. (температура 80°С, [H2bu4J= 1 моль/л)
3. ОСНОВЫ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ПУКЛЕОЗИДОВ Литературные данные и собственные исследования показывают, что гпдролизаты РНК, содержащие нуклеозиды, целесообразно перерабатывать по схеме двухстадийного ионного обмена с применением сильнокислотных катнонитов и сильноосновных анионитов. Такая схема позволяет перерабатывать любые гидролизаты РНК независимо от вида, гидролизующего агента. Ввиду наличия в гидролизатах различных по природе примесей, на этапе предварительной переработки должны быть стадии^ обеспечивающие отделение осадков и взвешенных, а также удаление компонентов, мешающих проведению эффективного ионного обмена.
Ниже приводятся схемы получения препаратов нуклеозидов из гидролизатов, содержащих различное количество примесей. Сначала рассматривается более простой случай переработки ~нуклеозидсодержа-щего раствора, полученного после гидролиза РНК гйдроксидом свинца, а более сложные сдучаи - на примере особенностей переработки гидролизатов от воздействия на РНК технического ФП и Са(0Н)2. 3.1. Получение нуклеозидов после гидролиза РНК гидрохсидом свища . В результате экспериментальных исследований предложена технологическая схема получения нуклеозидов (рис.12), которая предполагает:
На стадии предварительной подготовки осуществляют отделение осадка нерастворимых солей свинца горячим фильтрованием. Осадок на фильтре промывают горячей водой, промывные воды объ-единяют с фильтратом - получают нуклеозндсодержащий раствор.
Стадия кристаллизации техническбго гуаноэина. Раствор нуклеозидов охлаждают до 4°С и выдерживают при pH 6-7 и перемешивании в течении 12 ч. В осадок переходит ок. 8ÖX Guo. Кристаллы технического гуанозииа, отделенные фильтрованием, растворяют в горячей воде, раствор осветляют активированным углем, фильтруют горячим. После кристаллизации из осветленного фильтрата и суики - получают препарат, содержащий -98% основного вещества; Маточник после кристаллизации технического Guo, содержащий Ado, Cyd, Urd и остаточное количество Guo • направляют на стадии' ионообменного разделения нуклеозидов.
Стадии разделения нуклеозидов на катионите. При пропускании нуклеозидсодержащего раствора через колонну с катионитом КУ-2-8 (Н-форма) происходит сорбция протонированных в кислой среде Ado, Guo и Cyd; при этом незаряженный Urd выходит из свободного объема колонны. Таким образом получают уридинсодержащий раствор. На катионите также сорбируются мевающие примеси, в частности, пигменты и ионы свинца. Оптимальной является сорбция 0.6-0.7 ммоль нуклеозидов 1 см3 смолы, что указывает на высокую эффективность ионного обмена и малое содержание примесных- (по отношению к нуклеочидам ) веществ.
Десорбцию Ado, Guo и Cyd осуществляют 2%-ным раствором водного аммиака (2-3 с последующей промывкой катионнта водой.
Полученный аммиачный элюат направляют на колонну с анионитом. Регенерацию катионита проппдят 4%-ной соляной кпсютой (2.5-3
&ZZZ»' = сушка
Рнс.12. Принципиальная схема получения очищенных препаратов нуклеозидов после химического или ферментативного гидролиза РНК
Стадии разделения нуклеозидов на анионите. При пропускании аммиачного элюата через колонну с анионитом АВ-17-10п (в ОН-форме) сорбируются отрицательно заряженные в слабощелочной среде Guo, аденин и пигменты. Раствор Ado и Cyd, не взаимодействующих с активными группами анионита, выходит из свободного объема колонны. Т.о. получают очищенный раствор адевозипа-цитидипа. Для восстановления работоспособности анионита его последовательно обрабатывают 3.5%-ным раствором сульфата аммония, 0,4%-ной соляной кислотой, водой и переводят в ОН-форму при пропускании 2%-ного водного аммиака (4^=3 V.^).
Аденозин-цитидинсодержав(ий раствор концентрируют вакуум-выпариванием (70°С) до СД1)о-100 г/л. Ado кристаллизуют при 4°С за 10-12 ч на 85r90t. Осадок Ado отделяют фильтрованием, перекристаллизовывают из водного раствора, сушат и получают аденозин-препарат, содержащий >981 основного вещества.
Цитидин из маточника кристаллизации технич-Ado (Cc>ll=60 г/л и Сдаа=10-12 г/л ) можно выделить двумя способами:
Сюсоб-1. После концентрирования маточника вакуум-выпариванием (до Ссу(1-300 г/л) добавляют 4 объема спирта (изопропанола или этанола)-. Из водно-спиртового раствора Суй кристаллизуется на >85% при 4°С в течение 12-16 ч. После перекристаллизации из спиртово-водного раствора и сушки получают препарат, содержащий 97-98% Сус1. Способ-2 в отличие от предыдущего менее зависит, от наличия в растворе мешающих примесей и предполагает осаждение Сус! в виде соли (Су<1'1/2Н2304) из спиртового раствора (добавление к,маточнику 4-5 уд.объемов этанола) при добавлении Н^БО« до рН 3.3. Полученный цитидин-сульфат при необходимости может перерабатываться в цитидин с применением ионного обмена.
Полученный выше (на катионите) уридянсодержащий раствор подвергают очистке от мешающих примесей д применением ионного обмена. Для этого иге! сорбируют на колонне с анионитом (в ОН-т^орме) при пропускании щелочного (рН 11) уридинсодержащего раствора. Затем, Чгс5 десорбируют 0.5 М раствором уксусной кислоты. Наилучшие показатели процесса достигаются при применении анионита АРА-5п (емкость по 1)гс1 0.36 ммоль/см3) по сравнению с АВ-17-2п или АВ-17-8 (0.25 и
0.27 ммоль/см3).
Очищенный раствор уриднна подвергают вакуум-выпарному концентрированию до -1000 г/л. Уридин кристаллизуют из спиртово-водного (9:1) раствора при 4°С в течении 10-12 ч с выходом 93-95%.- Кристаллы уридина отделяют центрифугированием и после сушки получают уридин-препарат, содержащий 97-98% основного вещества.
Выходы кристаллических препаратов нуклеоэидов после проведения вышеуказанных стадий приведены в табл. 2.
Использование препаратов РНК, содержащих 5-10% примесных белковых веществ приводит (п основном!:
- к необходимости увеличения количества катионита (в 1.5-2 раза) и
- к уменьшению выхода кристаллизации уридина и увеличению примесей в уриднне-препарате (<96% осн.в-ва в препарате).
3.2. Особенности получения препаратов нуклеоэидов
из ферментативного гидролизата РНК. Для получения препаратов нуклеоэидов с приемлемыми выходами схема переработки ферментолизата РНК предусматривает (см.рис.13):
1, Проведение дополнительных стадий предварительной очистки: осветленный ферментолизат подвергают глубокому ультраконцентрированию для отделения мешающих ионному обмену белковых веществ. Полученный пермсат концентрируют вакуум-выпариванием п 5 раз, кристаллизуют технический йио и направляют на стадии и/о разделения. Переработка подготовленного т.о. ферментолизата требует по сравнению с вышеуказанным гидролипатом применения больвих количеств катионита (в 4-5 раз) и анионита (г 2 раза).
2. Из уридинсодержащего раствора (перед его ионообменной очисткой) удаляют мешающие фосфат-ионы, применяя обработку гидроксидом кальция;
В результате выходи препаратов нуклеоэидов (см.табл.2) по сравнению с Ёышеописанныч вариантом оказываются ниже (в 1.15 дня /Мо
и Сио; в 1.3-1.4 раза для и Су<1), что объясняется иеньщей степенью гидролиза, менее эффективным ионообменным разделением, и менее полной (из-за мешающих примесей) кристаллизацией нуклеозидов (особенно пиримидиновых).
3.3. Особенности получения препаратов нуклеозидов после гидролиза РНК с применением гидроксида кальция При сохранении общей схемы ионообменного разделения нуклеозидов, характерной для гидролиза РНК РЬ(0Н)3, для гидролиза РНК вод действием Са(ОН)3 из-за больпего содержания в гидролизате меааюцих примесей технологическая схема будет иметь следующие особенности:
- Для цитидина возможно выделение только в виде соли (Сус!• 1/а11а504), т.к. простая кристаллизация Су<1 из спиртового раствора не реализуема:
-г Увеличение количества ионитов: катионита - в 1,2 раза и анионнта для очистки уридинсодержащего раствора - в 1.3 раза. Выходы препаратов нуклеозидов см. табл.2.
4. Основы технологии получения иурииовых оснований (аденина и гуанина) кислотным гидролизом РНК
Предлагаемый способ получения пуриновых оснований основан на использовании зависимости растворимости аденина и гуанина от рН и температуры:
- После кислотного гидролиза (Сркк=200-250 г/л, [Н3304] = 1 И, 90°С, 1 ч) пурины совместно осаждают при коррекции рН гидроксидом натрия до |рН 3.2-3.5 (кристаллизация 98% выа к до 93% Ас1е при 4°С в течении 12 ч);
- Осадок отфильтровывают, суспендируют в воде, корректируют рН до рН 7, суспензию нагревают до 70-80°С и фильтруют горячей: из-за существенной разницы в растворимости Айе и Сиа в этих условиях в раствор переводит большая часть (-90Х) аденина и менее 1% гуанина.
- Из фильтрата (С4Ле-7 г/л) Ас1е выделяют с 91Х-Ш1И выходом после кристаллизации-1. (4°С, 6 ч), вакуум-выпарного 10-ти кратного концентрирования маточника и кристаллизации-2. После перекристаллизации техн.Айе из щелочной среды (рН11->рН7), промывки и су«кн получают препарат, содержащий не менее 97% основного вещества.
- Осадок, содержащий гуанин, растворяют при рН 12.5 и (^=15 г/л, обрабатывают гидроксидом кальция (освобождение от пигментных веществ).' Осветленный раствор нагревают до 70°С, нейтрализуют -образовавшийся осадок отделяют горячим фильтрованием (повышенная температура поаволяет уменьшить содержание примеси Ас1е в продукте до 1%), сушат и получают препарат, содержащий не менее 96% виа.
Таким образом, рассмотренная технологическая схема отличается от известных традиционных способов химического синтеза и гидролиза РНК простотой, не предполагает использования токсичных и пожароопасных веществ и позволяет получать пуриновые основания препаративной чистоты и с удовлетворительными выходами (68-73% и 85% для А(1е н виа соответственно).
5. Кислотный гидролиз гуаиозииа: количественные закономерности и основы получения гуанина и D-рябоэы.
Из нуклеозидов РНК гуанозин может быть переработан путем химической трансформации в диацетилгуанин и тетраацетилрибозу, используемые для синтеза таких медпрепаратов, как тиогуанин, ацикловнр, вираэол и др: Однако такой процесс трудноосуществим в производственных условиях. Более простым, по нашему Мнению, является кислотный гидролиз гуанозина до гуанина и D-рибозы,. которые в дальнейшем можно использовать в синтезе вышеуказанных лекарственных средств. Выбор оптимальных условий его проведения, обеспечивающих максимальный выход и качество этих препаратов, возможно осуществить на основе представлений о механизме й кинетике гидролиза N-гликозидной свяэн и деструкиий рибозы.
Исследование кинетики показало, что кислотный гидролиз N-гликозидпой свяэн в гуанозине подчиняется тем же закономерностям, что и процесс апуриниэации РНК. Значения полученных, при этом констант и энергии активаци соста пил»:
k2'Kb=(2. 18+0.06) ■ 10"4 л-моль-с"1 (60°С) и Е„=95 + 2 кДж/моль При исследовании кинетики процесса деструкции рибозы в кислой среде (образование фурфурола), была принята та же схема превращений, для которой удалось найти значения констант и энергии активации: Крь=0.010.0.002 л/моль; к»,= ( 26 . 7«0. 7 ) • 10"6 с'1 (90°С) и Е„^96±3 иДж/моль, что позволило определить оптимальные параметры гидролиза, обеспечивающие 100%-ный гидролиз Guo при минимальной деструкции рибозы, например: 85°С 0.5 М H2S04, время гидролиза 1 ч.
По результатам последующих исследований была предложена следующая схема переработки вышеуказанного гидролизата в очищенные препараты Gua и D-рибоэы:
- Из гидролизата (С0цо=30 г/л) за 8 ч (4"С) с выходом 91% кристаллизуется гуанин-сульфат, который отделяют фильтрованием; Gua переосаждают из горячего щелочного раствора, сушат и получают гуанин-препарат, содержащий 98% основного .вещества;
- Из маточного раствора, содержащего рибоэу, сначала при помощи Са(0И), удаляют основное количество сульфат-ионов; образующийся CaS04 отделяют фильтрованием. Фильтрат пропускают черрз колонны с катионитом КУ-2-8 (Н-форма) и анионитом (Oil-форма). Очищенный раствор рибозы (рН 7, С,уЬ=9 г/л) концентрируют вакуум-выпариванием до сиропообразной массы (0.9-1 кг/л), охлаждают и смешивают с 1-им объемом метанола и 2-мя объемами изопропанола. Из полученного растпора в течении 3-х дней (— 10°С) кристаллизуют рибозу. Технические кристаллы подпергают аналогичной перекрнеталлизацни. Высушенный препарат содержит- 96% основного вещества.
Выходы гуанина и О-рибоэн составляют - 85% и 65-70%, соответственно. 6. Получение инозина дезаминированием аденозина Р промышленных условиях аденозин может бить переработан в внизиц (Iпо) путем дезаминировапия под дрйгтпнрм азотистой кислоты. Поело гидролиза ( 5П°С , [Adol=0.25 М, f СН,СОО[Г ] = 1 . 5 М, fNaN'0,) = 1 М, время процесса 7 ч) 1по кристаллизуется из гидролизата на 60% (VC, 12 ч). Тополните льное количество tno -"поляпт ил
маточника после ионного обмена на катионихе, вакуум-выпаривания и кристаллизации. Полученные технические кристаллы перекристаллизо-вывают из водного раствора, суват и получают препарат, содержащий не менее 98Х основного вещества. Выход' Ino достигает 80Х от теории. Выводы.
1. Разработаны основы технологии гидролиза микробной РНК до КИК {нуклеозидов и пуриновых оснований) с получением очищенных препаратов, отвечающих качеству субстанций для синтеза лекарственных форм. Изучены основные закономерности гидролитического расщепления полинуклеотидов реагентами, способными найти применение в промышленности: РНК до нуклеозидов в присутствии. 1) гидроксида или оксидов свинца, 2) гидроксида кальция, 3) ацетата аммония, 4) ферментного препарата из Stf.(ActJcoelicolor; и РНК до пуриновых оснований под действием минеральных кислот. Установлены оптимальные условна проведения каждого из процессов.
2. Технологический процесс переработки нуклеозидсодержащих гидро-лизатов предусматривает разделение нуклеозидов двухступенчатым ионным обменом с применением сильнокислотного катионита и сильноосновного анионита, что в дальнейшем упрощает стадии получения очищенных препаратов.
3. Изучено влияние белковой примеси в РНК на разделение KHK методами ионного обмена и осаждения. Показано, что наиболее перспективным полинуклеотидным сырьем является РНК, содержащая не более 5Х белковой примеси. Показано, что на выход препаратов отрицательно влияют продукты деструкции KHK, количество которых обусловлено выбором гидролизующего агента.
4. На примере изучения кинетики образования гуанина и D-рибозы из гуэнозина, пуриновых оснований из РНК в ходе кислотного гидролиза разработаны подходи к количественному исследованию процессов гидролитического расщепления N-гликозидных связей в полинуклеоти-дах и индивидуальных нуклеозидах.
5. Разработаны' стадии химической трансформации нуклеозидов с получением очищенных препаратов: инозина из аденозииа, гуанина и D-рибозы из гуанозина.
6. По результатам работы подготовлена нормативно-техническая документация (регламент и исходные данные на проектирование опытно-промыиленной установхи по получению нуклеозидов мощностью 10 т перерабатываемой РНК в год).
Список публикаций
1. Королев 'Ю.Г образования пуриновых Биотехнология, 1493, N
2. Королев Ю.Г., закономерности кислот 1996, N 10, с. 60-64.
по теме диссертации
., Крылов H.A., Манаков М.Н. Кинетика оснований при кислотном гидролизе РНК.-11 -г1 2 , с. 57-60. Крылов H.A., Манаков H.H. Количественные ного гидролиза гуанознна.- Биотехнология,
' (2lCf
- Королев, Юрий Георгиевич
- кандидата химических наук
- Москва, 1997
- ВАК 03.00.23
- Основы комплексной переработки биомассы промышленных микроорганизмов
- Комплексные технологии фракционирования клеточных экстрактов и получение на их основе ферментов обмена нуклеиновых кислот, полинуклеотидов и их предшественников
- Новые методы получения высокоочищенных нуклеаз и нуклеотидов из животного и микробиального сырья
- Производные цитокининов
- Поиск и изучение транспортеров, осуществляющих экскрецию пуриновых соединений у штаммов Bacillus и Escherichia coli